CN107001437A

CN107001437A - 卵巢透明细胞腺癌的检查方法及检查药

Info

Publication number: CN107001437A
Application number: CN201580064765.4A
Authority: CN
Inventors: 荒井宪昭; 平野久; 宫城悦子; 大竹则久
Original assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Tosoh Corp
Current assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Tosoh Corp; Yokohama City University
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: US20190170754A1; EP3225630B1; EP3225630A4; JP6737504B2; EP3225630A1; JPWO2016084912A1; US11193936B2; US20170322218A1; WO2016084912A1; CN107001437B

Abstract

本发明的课题在于，提供在具有多样的组织型的良性或恶性卵巢肿瘤中，以高灵敏度和特异度检测恶性度极高的卵巢透明细胞腺癌的方法、及可以用于上述方法的试剂。本发明提供新的组织因子途径抑制物2加工多肽即NT‑TFPI2作为卵巢透明细胞腺癌的新的检测标志物。通过测定NT‑TFPI2的量、或NT‑TFPI2及完整TFPI2的总计量来检测卵巢透明细胞腺癌。此外，在卵巢透明细胞腺癌的检测试剂中，含有特异性识别NT‑TFPI2及完整TFPI2的抗体。

Description

卵巢透明细胞腺癌的检查方法及检查药

技术领域

本发明涉及用于在卵巢肿瘤中检测恶性度极高的卵巢透明细胞腺癌的、组织因子途径抑制物2(Tissue Factor Pathway Inhibitor 2；TFPI2)蛋白的新的加工多肽(以下称为“NT-TFPI2”)，以及以NT-TFPI2为测定对象的卵巢透明细胞腺癌检测方法。更详细而言，涉及利用计算NT-TFPI2和完整TFPI2的总计量的测定法来检测卵巢透明细胞腺癌的方法、及用于检测卵巢透明细胞腺癌的试剂。

背景技术

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤，在日本，每年罹患人数为约7000～8000人，每年死亡人数为约4000人，预期其数量将逐年增加。卵巢癌中，卵巢表层上皮性的恶性肿瘤约占85％，进而根据组织型分为浆液性、类内膜型、粘液性、透明细胞、未分化型。其中，关于透明细胞腺癌，有报道指出存在如下倾向：欧美人的罹患率为5％左右，而日本人的罹患率则高达20％～30％。卵巢透明细胞腺癌的特征是：Stage I期病症约占一半，对使用顺铂、紫杉醇等的化学疗法具有抵抗性，恶性度极高。

目前，作为检测卵巢癌的方法，使用的是经***超声波法、CT、MRI等。

此外，作为由全血、血细胞、血清、血浆等血液成分检测卵巢癌的方法，通常已知以癌抗原125(Cancer Antigen 125、CA125)为检测对象的方法。CA125是被1981年Bast等人以卵巢癌细胞株(OVCA433)为免疫原建立的单克隆抗体(OC125)所识别的抗原，血液成分中检测CA125时，以高阳性率显示为卵巢表层上皮性卵巢癌。因此，作为对卵巢癌的筛选、卵巢癌治疗效果的评价、治疗后的后续观察等有效的检查，而得到广泛利用(非专利文献1及2)。

但是，在全部卵巢癌中，CA125的阳性率为约80％左右，存在为假阴性的情况，因此约20％左右的卵巢癌不能通过CA125来判别。在恶性卵巢癌中的各组织型间进行比较的结果是，浆液性癌中的CA125阳性率显示为90％以上，而透明细胞腺癌中的CA125阳性率则极低，为约65％(非专利文献3)。CA125还被用作属于良性肿瘤的子宫内膜异位症的辅助标志物，但难以明确区分良性卵巢肿瘤和恶性卵巢肿瘤，也难以鉴定恶性肿瘤的组织型。

如果能够通过血液检查，在具有多样的组织型的卵巢肿瘤中仅鉴定恶性度极高的卵巢透明细胞腺癌，则不仅有助于卵巢癌筛选及提高后续观察时的诊断精度，而且可期待未来有助于开发出包括术前化学疗法在内的透明细胞腺癌特征性的术前治疗法。进而，提出了卵巢透明细胞腺癌以卵巢子宫内膜异位症为发生土壤的恶变学说，为了阐明卵巢子宫内膜异位症的后续观察用途和其癌发生机制，也迫切需要鉴定卵巢透明细胞腺癌特征性标志物分子以及该分子的检测方法。

另外，组织因子途径抑制物2(TFPI2)与胎盘蛋白5(Placental Protein 5；PP5)为同一蛋白，为含有3个Kunitz型蛋白酶抑制结构域的来自胎盘的丝氨酸蛋白酶抑制剂(非专利文献4)。据报道，TFPI2在各Kunitz结构域(KD)中具有3个二硫键，根据Kunitz结构域2及3所附加的天冬酰胺结合型糖链的结构差异，在分子量30000Da～35000Da附近分级出多个种类(非专利文献5)。

关于TFPI2与妇科疾病的关系，已经获得了如下知识：在先兆子痫中，子宫内胎儿生长迟缓(IUGR)增加，与正常孕妇相比，血中TFPI2量增加(非专利文献6)；子宫内膜异位症患者中，血中TFPI2量增加(专利文献1)等。关于与癌的关系，正在广泛进行基因水平的研究，已经报道了：在子宫内膜癌及卵巢癌中，透明细胞腺癌包含于基因表达上调一定水平的组中(非专利文献7)；在胃癌中基因表达上调(专利文献2)；在癌中，作为TFPI2的剪接变体的asTFPI2的基因表达上调(非专利文献8)等。进而，近年在各种癌中发现TFPI2启动子部CpG岛发生过度甲基化，因此正在广泛进行表观遗传学标志物的研究(专利文献3、非专利文献9、10、11、12及13)。

另一方面，本发明的发明人荒川等已经阐明：卵巢癌中，TFPI2由透明细胞腺癌细胞株特异性产生，在卵巢癌患者中，仅透明细胞腺癌患者组织中的基因表达特异性上调(专利文献4)；对健康人及子宫内膜异位症例中的血中TFPI2进行比较，发现在透明细胞腺癌中显著上调(专利文献5、非专利文献14)。

但是，迄今为止，并不知晓TFPI2加工多肽的存在，从而以该多肽作为测定对象来检测卵巢透明细胞腺癌的方法、其效果也当然是未知的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表2007-506965号

专利文献2:日本特开2008-118915号

专利文献3:WO2008/084219号

专利文献4:日本专利公开2013-79979号

专利文献5:日本专利公开2013-61321号

非专利文献

非专利文献1:J.Clin.Invest.,68,1331(1981)

非专利文献2:Human Reproduction,4,1(1989)

非专利文献3:日本分子肿瘤标志物研究会志,20,98(2005)

非专利文献4:J.Biochem.,116,939(1994)

非专利文献5:Int.J.Cancer.May 29；76(5)：749-56(1998)

非专利文献6:Placenta,28,224(2007)

非专利文献7:Clin.Cancer Res.,11,6422(2005)

非专利文献8:Mol.Cancer.Mar 12；6：20.(2007)

非专利文献9:Cancer Genet.Cytogenet.,197,16(2010)

非专利文献10:Anticancer Res.,30,1205(2010)

非专利文献11:Gynecol.Oncol.,130(i)：132-9(2013)

非专利文献12:J.Invest.Dermatol.,133(5)：1278-85(2013)

非专利文献13:Dig.Dis.Sci.,58(4)：1010-5(2013)

非专利文献14:J.Proteome Res.,2013,12(10),pp.4340-4350

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于，提供在具有多样的组织型的良性或恶性卵巢肿瘤中，以高灵敏度和特异度检测恶性度极高的卵巢透明细胞腺癌的方法，及可以用于上述方法的试剂。

用于解决问题的方案

为此，本发明人等进行了深入研究，建立了对来自哺乳动物细胞的重组TFPI2蛋白及来自癌细胞的TFPI2蛋白显示高亲和性的抗体群并进行了各抗体的性状解析，结果发现，透明细胞腺癌细胞培养上清中存在完整TFPI2和新的TFPI2加工多肽(NT-TFPI2)。进而，本发明人等发现，在卵巢肿瘤及子宫肿瘤中，使用识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体测定完整TFPI2及NT-TFPI2时，与仅测定完整TFPI2时相比，卵巢透明细胞腺癌的检测特异度提高，因此NT-TFPI2可以成为卵巢透明细胞腺癌的检测标志物，从而完成了本发明。

即，本发明含有以下方式。

(1)一种组织因子途径抑制物2(TFPI2)加工多肽，其具有以下(i)～(iii)的特征。

(i)含有序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止的氨基酸序列、或与其具有80％以上的同源性的序列。

(ii)通过还原SDS-PAGE，在分子量约16000处被分级出。

(iii)通过还原SDS-PAGE，天冬酰胺结合型糖链切断处理后的肽片段在分子量约12000处被分级出。

(2)一种检测卵巢透明细胞腺癌的方法，其包括测定检体中(1)所述的TFPI2加工多肽量的步骤。

(3)根据(2)所述的方法，其包括进一步测定上述检体中完整TFPI2量的步骤。

(4)根据(3)所述的方法，其中，在上述TFPI2加工多肽量和上述完整TFPI2量的总计超过由对照计算出的基准值时，判定为检测出卵巢透明细胞腺癌。

(5)根据(2)～(4)中任一项所述的方法，其中，使用利用抗体的抗原抗体反应来进行上述测定，所述抗体与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止区域内的抗原决定簇结合。

(6)根据(5)所述的方法，其中，上述抗体为识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。

(7)根据(2)～(4)中任一项所述的方法，其中，使用质谱法进行上述测定。

(8)一种用于检测卵巢透明细胞腺癌的试剂，其含有与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止区域内的抗原决定簇结合的抗体。

发明的效果

根据本发明，提供一种卵巢透明细胞腺癌的新的检测标志物，此外，提供一种在具有多样的组织型的良性卵巢肿瘤及恶性卵巢肿瘤中、以高灵敏度和特异度将恶性度极高的卵巢透明细胞腺癌检测为阳性、将良性卵巢肿瘤及透明细胞腺癌以外的其它恶性卵巢肿瘤检测为阴性的方法。

附图说明

图1为示出导入有GPI锚定型TFPI2表达质粒的细胞的利用(a)抗FLAG抗体或者(b)作为阴性对照的抗BNC抗体的FACS解析结果的图。

图2为示出分泌型TFPI2的ELISA解析结果的图。纵轴表示吸光度，横轴表示每个孔的各溶液的添加量。

图3为示出分泌型TFPI2的蛋白质印迹(Westen blotting)解析结果的图(照片)。

图4为示出基于利用了GPI锚定型TFPI2的CELISA解析的各小鼠血清抗体效价测定结果的图。纵轴表示吸光度。

图5为示出基于利用了分泌型TFPI2的ELISA解析的各小鼠血清抗体效价测定结果的图。纵轴表示吸光度。

图6为示出基于利用了GPI锚定型TFPI2的CELISA解析的各单克隆抗体解析结果的图。纵轴表示吸光度，横轴表示抗体添加浓度。

图7为示出基于利用了3种卵巢癌细胞培养上清的免疫沉淀-蛋白质印迹(IP-WB)解析的各单克隆抗体解析结果的图(照片)。图表纵轴表示每单位面积的信号强度。

图8-1为示出使用了2种卵巢癌细胞培养上清的3种单克隆抗体的IP-WB解析结果的图(WB像)(照片)。

图8-2为示出使用了2种卵巢癌细胞培养上清的3种单克隆抗体的IP-WB解析结果的图(Ruby染色像)(照片)。

图8-3为示出使用了2种卵巢癌细胞培养上清的3种单克隆抗体的IP产物的氨基酸序列解析结果的图。

图9为示出利用2种AIA测定试剂的各种卵巢癌培养上清解析结果的图。纵轴的Rate表示每单位时间的4-甲基伞形酮的生成量[nmol/(L·s)]。

图10-1为示出有/无N型糖链消化处理的3种卵巢癌培养上清的AIA解析结果的图。

图10-2为示出有/无N型糖链消化处理的3种卵巢癌培养上清的免疫沉淀回收率的图。

图10-3为示出有/无N型糖链消化处理的3种卵巢癌培养上清的WB像的图。

图11-1为示出2种卵巢癌培养上清中的TFPI2的经时变化的AIA解析结果的图。

图11-2为示出2种卵巢癌培养上清中的TFPI2的经时变化的IP-WB解析结果的图(照片)。

图12-1为示出5种卵巢癌细胞内的TFPI2的AIA解析结果的图。

图12-2为示出5种卵巢癌细胞内的TFPI2的IP-WB解析结果的图(照片)。

图13为示出与妊娠周期相伴随的TFPI2经时变化的AIA解析结果的图。

图14为示出各种妇科肿瘤板的TFPI2及CA125的AIA解析结果的图。横棒表示各疾病组的中位数。

图15为示出各种妇科肿瘤板的TFPI2及CA125测定值的箱线图(Box Plot)。

图16为示出TFPI2及CA125的CCA及非CCA卵巢肿瘤检体的ROC曲线的图。

图17-1为示出NT-TFPI2多肽的C末端序列解析结果的图。A：抗体柱结合级分的SYPRO-Ruby染色像(照片)，B：由条带#1～#3鉴定出的序列信息的、定位(mapping)于TFPI2氨基酸序列上的结果。

图17-2为示出NT-TFPI2多肽的C末端序列解析结果的图。C：由条带#3检测出的代表性的来自TFPI2肽的前体离子的质谱图。

具体实施方式

＜1＞本发明的组织因子途径抑制物2(TFPI2)加工多肽

本发明的多肽为组织因子途径抑制物2(TFPI2)加工多肽。

如后述实施例所示，NT-TFPI2不存在于癌细胞的细胞内级分中，而仅存在于细胞培养上清中，因此推测：其是完整TFPI2被分泌到癌细胞外后局部存在在细胞外基质中、经过某些特征性加工而出现的TFPI2的片段多肽。

NT-TFPI2是含有位于完整TFPI2的N末端侧的Kunitz结构域1的片段。更具体而言，序列号1为基于人TFPI2的cDNA的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸至第22个残基的甘氨酸为信号肽。NT-TFPI2至少含有连接在信号肽之后的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止的序列，或含有与上述序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。上述同源性优选90％以上、更优选95％以上。此外，本发明的多肽也可以是由在上述序列中缺失、置换、***、和/或添加1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽。需要说明的是，数个是指优选2～20个、更优选2～10个、进一步优选2～5个。

NT-TFPI2也可以含有序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至比第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸更接近C末端侧的氨基酸序列，例如还优选具有作为第131个残基的氨基酸的组氨酸或作为第132个残基的氨基酸的精氨酸。此外，优选不含TFPI2的Kunitz结构域3部分。

此外，NT-TFPI2还可以在上述序列的两侧具有其它肽片段，优选不具有识别TFPI2的Kunitz结构域3的抗体的抗原决定簇。

需要说明的是，完整TFPI2为序列号1的氨基酸序列的第23个残基～第235个残基所示的肽。

此外，通过还原SDS-PAGE，在分子量约16000处分级出NT-TFPI2。更具体而言，例如使用10～20质量％梯度的聚丙烯酰胺凝胶按照常规方法在还原条件下实施SDS-PAGE时，在与分子量标志物、优选Full Range Rainbow Molecular Weight Marker(GE Healthcare公司制)的分子量17000相当的条带位置的稍低分子量侧检测。

进而，通过还原SDS-PAGE，在分子量约12000处分级出NT-TFPI2的、天冬酰胺结合型糖链切断处理后的肽片段。天冬酰胺结合型糖链切断处理可以通过N-聚糖酶等来进行，对由此使天冬酰胺结合型糖链游离的多肽使用例如10～20质量％的梯度的聚丙烯酰胺凝胶按照常规方法在还原条件下实施SDS-PAGE时，在与分子量标志物、优选Full RangeRainbow Molecular Weight Marker(GE Healthcare公司制)的分子量12000相当的条带位置检测。

需要说明的是，NT-TFPI2中，在序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的N末端起第116个残基的天冬酰胺上附加有天冬酰胺结合型糖链。

＜2＞本发明的检测卵巢透明细胞腺癌的方法

本发明的检测卵巢透明细胞腺癌的方法包括测定检体中NT-TFPI2量的步骤。这是基于与其它组织型相比、在卵巢透明细胞腺癌细胞的细胞外特征性存在NT-TFPI2的方法。通过该方法，如后述实施例所示，与测定目前已知的肿瘤标志物(CA125)、单独测定完整TFPI2的情况相比，可以以高灵敏度和特异度特异性检测出卵巢透明细胞腺癌。

本发明的检测方法中，除了测定检体中NT-TFPI2量以外，还可以进一步测定完整TFPI2量。原因在于，即使基于检体中的NT-TFPI2和完整TFPI2的总计量来进行卵巢透明细胞腺癌的检测判定，也可以得到充分的灵敏度和特异度。原因或者还在于，如后所述，由测定两者而得的总计量和单独的完整TFPI2测定量来间接地测定NT-TFPI2量，从而也可以进行卵巢透明细胞腺癌的检测。

在本发明的检测方法中，对测定NT-TFPI2量和/或完整TFPI2量的方法没有特别限定。例如，可以例示出使用利用了识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体的抗原抗体反应的方法；利用质谱法的方法。

作为利用了使用识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体的抗原抗体反应的测定方法的具体例子，可以列举以下方法。

(a)使用识别标记后的测定对象及测定对象的抗体，利用标记后的测定对象及检体中所含的测定对象与上述抗体竞争性结合的竞争法。

(b)使用表面等离子体共振的方法，所述表面等离子体共振使检体与固定有识别测定对象的抗体的芯片接触，对依赖于该抗体和测定对象的结合的信号进行检测。

(c)使用荧光标记后的识别测定对象的抗体，利用该抗体和测定对象结合而使荧光偏振度上升的原理的荧光偏振免疫测定法。

(d)使用表位不同的2种识别测定对象的抗体(其中1个为标记后的抗体)，形成该2个抗体和测定对象这3者的复合体的夹心法。

(e)作为前处理，通过识别测定对象的抗体而将检体中的测定对象浓缩后，通过质谱仪等检测作为其结合蛋白的多肽的方法。

(d)、(e)的方法简便且通用性高，在处理多检体方面，(d)的方法的试剂及装置的相关技术已经充分建立，因此更为优选。

关于利用抗原抗体反应测定NT-TFPI2量和/或完整TFPI2量的方法，具体可以列举以下方法。

(A)使用识别NT-TFPI2和完整TFPI2两者的抗体来测定NT-TFPI2及完整TFPI2的总计量的方法(NT+I-TFPI2测定体系)。需要说明的是，上述识别NT-TFPI2和完整TFPI2两者的抗体优选与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体，进一步优选具有识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗原识别位点的抗体。此外，在该方法中使用上述夹心法时，通常使用表位不同的2种上述抗体。

(B)使用不识别NT-TFPI2、但识别完整TFPI2的抗体来测定完整TFPI2单独的量的方法(I-TFPI2测定体系)。需要说明的是，上述不识别NT-TFPI2、但识别完整TFPI2的抗体优选为具有识别TFPI2的Kunitz结构域3的抗原识别位点的抗体。此外，在该方法中使用上述夹心法时，通常使用表位不同的2种上述抗体，其中至少1种使用不识别NT-TFPI2、但识别完整TFPI2的抗体，另一种可以是不识别NT-TFPI2、但识别完整TFPI2的抗体，也可以是识别NT-TFPI2和完整TFPI2两者的抗体。

(C)从通过(A)的NT+I-TFPI2测定体系测定的NT-TFPI2及完整TFPI2的总计量中，减去通过(B)的I-TFPI2测定体系测定的完整TFPI2单独量，从而计算NT-TFPI2单独的量的方法。

(D)使用不识别完整TFPI2、但识别NT-TFPI2的抗体来测定NT-TFPI2单独的量的方法。需要说明的是，上述不识别完整TFPI2、但识别NT-TFPI2的抗体可以列举例如特异性识别NT-TFPI2的C末端部分的肽序列的抗体。在使用上述夹心法时，例如将该抗体作为固定抗体、将具有识别Kunitz结构域1的识别位点的抗体作为检测抗体。

在本发明的检测卵巢透明细胞腺癌的方法中，可以使用通过上述(C)、(D)的方法测定的NT-TFPI2单独的量作为判定的基准，使用通过(A)的方法测定的NT-TFPI2及完整TFPI2的总计量作为判定的基准时也可得到充分的灵敏度和特异度，并且从抗体的容易取得程度、以一个阶段来进行测定从而简便的角度出发，更优选后者。

识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体可以如下获得：NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质本身、由NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的部分区域构成的寡肽、编码NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的完整或部分区域的多核苷酸等作为免疫原并对动物进行免疫，从而获得。

免疫中使用的动物只要具有抗体产生能力则没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、兔等通常在免疫中使用的哺乳动物，也可以使用鸡等禽类。

需要说明的是，使用NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质本身、或由NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的部分区域构成的寡肽作为免疫原时，在上述蛋白质或上述寡肽的制备过程中，其结构有可能发生变化。因此，得到的抗体有可能对于期望的抗原没有高特异性、结合力，结果有可能无法准确地对检体中所含的TFPI2浓度进行定量。另一方面，使用含有编码NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的完整或部分区域的多核苷酸的表达载体作为免疫原时，在免疫后的动物体内，不发生结构变化而是与导入一致的NT-TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的完整或部分区域被表达出，因此可得到对检体中的NT-TFPI2多肽或完整TFPI2具有高特异性及结合力(即高亲和性)的抗体，因此是优选的。

识别TFPI2的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，优选为单克隆抗体。

关于产生识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体的杂交瘤细胞的建立，从技术已经建立的方法中适当选择来进行即可。作为一例，从用上述方法免疫的动物采集B细胞，用电或者在聚乙二醇存在下使上述B细胞和骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基选择产生期望抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行单克隆化，从而可以建立产生识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的卵巢透明细胞腺癌检测方法中使用的、识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体、例如识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的单克隆抗体的选择，可以基于对来自宿主表达体系的GPI(糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol))锚定型TFPI2或分泌型TFPI2的亲和性来进行。

需要说明的是，作为上述宿主，没有特别限定，从本领域技术人员通常用于蛋白质表达的大肠杆菌、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、动物细胞中适当选择即可，优选使用能够通过二硫键或糖链附加这样的翻译后修饰而能够表达具有与天然型的NT-TFPI2和/或完整TFPI2接近的结构的蛋白质的哺乳细胞作为宿主。作为哺乳细胞的一例，可以列举目前使用的来自人胚肾的细胞(HEK)293T细胞株、猴肾细胞COS7株、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或由人分离出的癌细胞等。

关于本发明的卵巢透明细胞腺癌检测方法中使用的抗体的纯化，从技术已经确立的方法中适当选择进行即可。作为一例，可以在培养通过上述方法建立的产生抗体的杂交瘤细胞后，回收其培养上清，根据需要通过硫酸铵沉淀而进行抗体浓缩后，通过使用固定有蛋白A、蛋白G、或蛋白L等的载体的亲和层析和/或离子交换色谱来进行抗体的纯化。

需要说明的是，上述夹心法中，进行抗原抗体反应时使用的标记后的抗体可以是将通过上述方法纯化后的抗体用过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶进行标记，该标记还可以使用技术已充分建立的方法来进行。

以下，对在本发明的检测方法中利用质谱法测定NT-TFPI2量和/或完整TFPI2量的方法进行具体说明。

在检体为血液时，作为前处理工序，优选通过Agilent Human 14等除去血液中所大量包含的白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白等蛋白后，进一步通过离子交换、凝胶过滤或反相HPLC等进行分级。

测定可以通过串联质谱(MS/MS)、液相色谱·串联质谱(LC/MS/MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry、MALDI-TOF/MS)、表面增强激光解吸电离质谱(surfaceenhanced laser desorption ionization mass spectrometry、SELDI-MS)等来进行。

在本发明的检测方法中，优选在测得的NT-TFPI2量超过由对照计算的基准值(Cutoff值)时，判定为检测出卵巢透明细胞腺癌。或者，优选在测得的NT-TFPI2量和完整TFPI2量的总计超过由对照计算的基准值(Cutoff值)时，判定为检测出卵巢透明细胞腺癌。

判定中使用的NT-TFPI2量及完整TFPI2量可以为测定值或换算浓度值中任一者。需要说明的是，换算浓度值是指基于以TFPI2为标准试样制作的标准曲线由测定值换算的值。

关于基准值(Cutoff值)，可以对透明细胞腺癌以外的卵巢肿瘤、子宫肿瘤或健康人等非卵巢透明细胞腺癌的检体、和卵巢透明细胞腺癌检体分别进行测定，通过受试者工作特征(ROC)曲线解析来适宜设定显示出最佳灵敏度和特异度的测定值。例如，具体而言，使用血清作为检体时的NT-TFPI2量和完整TFPI2量的总计基准值(Cutoff值)可以设为由每单位时间内碱性磷酸酶所致4-甲基伞形酮生成浓度计算的测定值(rate：nmol/(L·s))1.9。

＜3＞本发明的用于检测卵巢透明细胞腺癌的试剂

本发明的卵巢透明细胞腺癌检测用的试剂含有与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的由第23个残基的氨基酸～第131个残基或第130个残基的氨基酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体。上述抗体优选为识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。这些抗体可以识别NT-TFPI2及完整TFPI2两者。

在将本发明的试剂用于上述夹心法时，优选含有表位不同的2种抗体作为上述抗体。

本发明的卵巢透明细胞腺癌检测试剂还可以进一步含有包含识别卵巢癌的肿瘤标志物的抗体的、卵巢癌的肿瘤标志物的检测试剂。作为卵巢癌的肿瘤标志物，可以列举例如CA125等。

本发明的试剂中所含的抗体可以是抗体本身，也可以进行了标记，还可以固定在固相上。

以下具体说明本发明的试剂中用于作为上述夹心法的方式之一的2步夹心法的情况。但本发明不受该方法限定。

首先，可以通过以下(I)～(III)所示的方法制作本发明的试剂。

(I)首先，使在夹心法中使用的、识别NT-TFPI2及完整TFPI2的、表位不同的2种抗体(以下记作“抗体1”及“抗体2”)中的抗体1与免疫板、磁性颗粒等能够进行B/F(Bound/Free)分离的载体结合。结合方法可以是利用疏水结合的物理结合，也可以是使用能够使两物质间交联的接头试剂等的化学结合。

(II)使上述抗体1与载体结合后，为了避免非特异性结合，将载体表面用牛血清白蛋白、脱脂奶粉、市售的免疫分析用封闭剂等进行封闭处理，将其作为初级试剂。

(III)对另一抗体2进行标记，准备含有所得到的标记抗体的溶液作为2次试剂。作为对抗体2进行标记的物质，优选：过氧化物酶、碱性磷酸酶之类的酶，荧光物质、化学发光物质、放射性同位素等能够通过检测装置检测的物质，或针对生物素的抗生物素蛋白等存在特异性结合对象的物质等。此外，作为二级试剂的溶液，优选可良好地进行抗原抗体反应的缓冲液，例如磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。

通过这种方式制作的本发明的试剂可以根据需要进行冷冻干燥。

需要说明的是，在1步夹心法的情况下，可以与上述(I)～(II)同样地制作使抗体1与载体结合并进行封闭处理的试剂，进而对上述抗体固定化载体添加含有标记后的抗体2的缓冲液，从而制作试剂。

然后，使用通过上述方法得到的试剂以2步夹心法来检测、测定NT-TFPI2及完整TFPI2时，可以通过以下(IV)～(VI)所示的方法来进行。

(IV)使(II)所制作的初级试剂和检体在一定温度下接触一定时间。关于反应条件，可以在温度4℃～40℃的范围反应5分钟～180分钟。

(V)将未反应物质通过B/F分离而除去，然后与(III)所制作的二级试剂在一定温度下接触一定时间，形成夹心复合体。关于反应条件，可以在温度4℃～40℃的范围反应5分钟～180分钟。

(VI)将未反应物质通过B/F分离而除去，对标记抗体的标记物质进行定量，通过以已知浓度的TFPI2溶液为标准制作的标准曲线，来定量检体中的人NT-TFPI2及完整TFPI2浓度。

上述关于TFPI2的检测试剂的说明也可以适用到卵巢癌的肿瘤标志物的检测试剂中。卵巢癌的肿瘤标志物的检测试剂可以与上述本发明的试剂同样制作，还可以是现有的市售试剂。

检测试剂中所含的抗体等试剂成分的量可以根据检体量、检体的种类、试剂的种类、检测手法等诸条件适当设定。具体而言，例如，如后述那样使用稀释了2.5倍的血清、血浆50μL作为检体并通过夹心法进行NT-TFPI2量及完整TFPI2量的测定时，在抗体与50μL该检体反应的反应体系中，与载体结合的抗体量可以为100ng～1000μg，标记抗体量可以为2ng～20μg。

本发明的卵巢透明细胞腺癌检测试剂可以用于手动方法的检测中，也可以用于使用自动免疫诊断装置的检测中。特别是，使用自动免疫诊断装置的检测可以不受检体所含的内源性测定妨碍因子、竞争酶影响地进行检测，且能够在短时间内进行检体中的NT-TFPI2及完整TFPI2以及卵巢癌的肿瘤标志物的浓度的定量，因此是优选的。

关于成为本发明的卵巢透明细胞腺癌检测方法及本发明的检测试剂的对象的检体(被检试样)，可以列举全血、血细胞、血清、血浆等血液成分；细胞或组织的提取液、尿、脑脊髄液等。此外，还可以将卵巢组织活检作为检查对象，此时以活检试样的培养上清作为检体。在使用血液成分、尿等体液作为检体时，可以简便且非侵袭地检测卵巢透明细胞腺癌，因此是优选的；考虑到检体采集的容易性、在其它检查项目中的通用性，特别优选使用血液成分作为检体。检体的稀释倍率可以根据所使用的检体的种类、状态从未稀释～稀释100倍中适当选择，例如，在血清、血浆的情况下，可以使用50μL的2.5倍稀释的检体。

实施例

以下示出实施例，以具体地说明本发明，但这些实施例是示出本发明的一例，本发明不受实施例限定。

＜实施例1＞DNA免疫用载体的构建

为了通过DNA免疫有效地诱导体液免疫，优选使对象抗原蛋白以膜结合型蛋白形式局部存在于细胞表面上。TFPI2本来是分泌蛋白，因此为了使TFPI2局部存在于细胞表面上，构建能够表达在TFPI2的C末端侧附加有GPI(glycosylphosphatidylinositol，糖基磷脂酰肌醇)锚的蛋白(以下记作GPI锚定型TFPI2)的质粒载体。

(1)使用下述(a)的引物，按照常规方法通过RT-PCR法对由TFPI2cDNA(GenBankNo.NM＿006528)的73～705碱基所构成的多核苷酸进行扩增。

(a)GPI锚定型TFPI2表达质粒用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca-3’(序列号2，3’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第73～87位的碱基序列相当)

反向：

5’-catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg-3’(序列号3，5’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第691～705位的碱基序列相当)

(2)在含有胎盘碱性磷酸酶(Placental Alkaline phosphatase)的GPI锚的编码区域和FLAG标签的编码区域的质粒pFLAG1(SIGMA公司制)的HindIII-EcoRI位点，使用In-fusion(Clonetech公司制)按照说明书***(1)所得到的RT-PCR扩增产物，构建分别在N末端侧附加有FLAG标签肽、C末端侧附加有GPI锚的GPI锚定型TFPI2的表达质粒。

(3)为了确认***到(2)所构建的表达质粒中的多核苷酸所表达的TFPI2是否按照设想局部存在于细胞表面，使用作为瞬时表达细胞的293T细胞株通过下述方法进行检验。

(3-1)将(2)所构建的GPI锚定型TFPI2表达质粒按照常规方法导入到293T细胞株。

(3-2)将导入了上述表达质粒的293T细胞株在5％CO₂培养箱中用添加了10％FBS(胎牛血清)的D-MEM培养基(和光纯药公司制)在37℃培养24小时，使TFPI2瞬时表达。

(3-3)在(3-2)所得到的培养细胞中，添加与FLAG标签特异性结合的SIGMA公司制小鼠抗FLAG M2抗体、或作为阴性对照的不与FLAG标签结合的小鼠抗BNC抗体，并静置30分钟。需要说明的是，BNC是由BNP(脑钠尿肽)的C末端侧7个氨基酸构成的肽(日本特开2009-240300号)。

(3-4)静置后添加荧光标记后的抗小鼠IgG抗体(BECKMAN COULTER公司制)，进一步静置30分钟后，进行FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting，荧光激活细胞分选术)解析。

将FACS解析的结果示于图1。解析的结果是，作为阴性对照的添加了抗BNC抗体的情况下(图1的(b))，未确认到由荧光标记细胞所引起的信号增加、即所谓的位移(shift)。另一方面，添加抗FLAG抗体的情况下(图1的(a))，确认到由荧光标记细胞所引起的位移。该结果表明：所表达的附加有FLAG标签肽的GPI锚定型TFPI2局部存在于细胞表面上。

＜实施例2＞免疫及采血

对小鼠的免疫如下进行：将按照以DNA量计含有40μg实施例1的(2)所构建的GPI锚定型TFPI2表达质粒的方式制备的PBS溶液100μL对4只Balb/c小鼠进行给予。在首次免疫起7天后、14天后、21天后、28天后及35天后追加给予，在首次免疫开始后第42天采血，采集抗血清，分别作为抗血清A-1～A-4。

＜实施例3＞GPI锚定型TFPI2稳定表达细胞的制作

作为抗血清评价用，通过以下方法制作能够稳定表达GPI锚定型TFPI2的来自中华仓鼠卵巢的CHO-K1细胞株。

(1)将实施例1的(2)所构建的TFPI2表达质粒按照常规方法对CHO-K1细胞株进行基因导入后，在5％CO₂培养箱中使用添加了10％FBS的Hams F12培养基(和光纯药公司制)在37℃培养24小时。

(2)培养后，按照250μg/mL的量添加抗生素遗传霉素溶液(Invitrogen公司制)，进一步培养3周。

(3)使用抗FLAG抗体，通过细胞分选仪获得稳定表达GPI锚定型TFPI2的CHO-K1细胞。

＜实施例4＞分泌型TFPI2表达质粒的构建

在实施例1的(2)所构建的TFPI2表达质粒中，在所***的TFPI2基因与存在于其3’末端侧的GPI锚的编码区域之间进一步***编码由BNP(脑钠尿肽)的C末端侧7个氨基酸所构成的BNC肽(专利文献5)的寡核苷酸，从而制备能表达分别在N末端侧附加有FLAG肽、C末端侧附加有BNC肽且不具有GPI锚的分泌型TFPI2的质粒。以下示出具体制备方法。

(1)使用下述(b)的引物，按照常规方法通过RT-PCR法对TFPI2cDNA的除起始密码子及终止密码子之外的完整(GenBank No.NM＿006528的第148～第780位的区域)的、在3’末端侧附加有编码BNC肽的寡核苷酸的多核苷酸进行扩增。

(b)分泌型TFPI2表达质粒用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca-3’(序列号4，3’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第73～87位的碱基序列相当)

反向：

5’-agcatcagtggtgaattctcattagtggcgacgcagaactttgcaaaattgcttcttccg-3’(序列号5，5’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第691～705位的碱基序列相当)

(2)在含有胎盘碱性磷酸酶的GPI锚定区域的质粒pFLAG1(SIGMA公司制)的HindIII-EcoRI位点，使用In-fusion(Clonetech公司制)按照说明书***(1)的RT-PCR扩增产物，构建分泌型TFPI2表达质粒。

(3)为了确认***到质粒pFLAG1中的多核苷酸所表达的分泌型TFPI2在N末端侧附加有FLAG标签、在C末端侧附加有BNC标签这一点，使用作为瞬时表达细胞的293T细胞株通过下述方法进行检验。

(3-1)与实施例1的记载同样地将(2)所构建的分泌型TFPI2表达质粒导入至293T细胞株并使其瞬时表达分泌型TFPI2，对培养72小时后的培养液进行离心分离，回收上清并将其作为分泌型TFPI2溶液。

(3-2)使用分泌型TFPI2溶液作为试样，进行(A)酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、及(B)蛋白质印迹(WB)法。

(A)ELISA法

(A-1)将兔抗FLAG多克隆抗体(ROCKLAND公司制)用碳酸盐缓冲液(pH9.8)稀释，以成为100ng/孔，固定化于MaxiSorp96孔板(NUNC公司制)。

(A-2)在4℃反应一晚后，用TBS(Tris-Buffered Saline)洗涤3次，在各孔中添加250μL/孔的含有3％牛血清白蛋白(BSA；Bovine Serum Albumin)的TBS溶液，室温下放置2小时。

(A-3)用TBS洗涤3次，添加50μL/孔的分泌型TFPI2溶液、及作为阴性对照的未导入表达质粒的293T细胞株的培养上清，室温下放置1小时。

(A-4)用含有0.5％Tween 20的TBS(TBS-T)洗涤3次后，添加50μL/孔的用含有1％BSA的TBS-T(1％BSA/TBS-T)稀释为1μg/mL的小鼠抗BNC单克隆抗体溶液，室温下放置1小时。

(A-5)用TBS-T洗涤3次后，添加50μL/孔的用1％BSA/TBS-T稀释10000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠免疫球蛋白G-Fc抗体(SIGMA公司制)溶液，室温下放置1小时。

(A-6)用TBS-T洗涤4次，添加TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL公司制)后，用1mol/L磷酸溶液终止反应，用吸光测定酶标仪测定450nm的吸光值。

(B)蛋白质印迹法

(B-1)将(3-1)所得到的分泌型TFPI2溶液、及作为阴性对照的未导入表达质粒的293T细胞株的培养上清按照常规方法用SDS-PAGE展开，转印于PVDF膜(GE Healthcare公司制)。

(B-2)用含有5％脱脂奶粉的TBS-T(封闭溶液)在室温下反应2小时而封闭后，在封闭溶液中以1μg/片添加碱性磷酸酶标记抗BNC抗体，在4℃反应一晚。

(B-3)用TBS-T洗涤后，使用Western Lightning CDP-Star(PerkinElmer公司制)通过感光膜对所得到的化学发光进行检测。

将ELISA法的解析结果示于图2。分泌型TFPI2溶液(分泌型TFPI2培养上清)中，与阴性对照(293T培养上清)相比，可确认到明显的添加量依赖性信号，表明培养上清中产生了分泌型TFPI2。

将蛋白质印迹法的解析结果示于图3。分泌型TFPI2溶液(分泌型TFPI2培养上清)在分子量约35kDa附近检测到了明显的条带，表明培养上清中产生了N末端具有FLAG标签、C末端具有BNC标签的分泌型TFPI2。

＜实施例5＞小鼠抗血清的评价

使用实施例3所制作的GPI锚定型TFPI2表达CHO-K1细胞通过细胞酶联免疫吸附测定法(CELISA)对实施例2所采集的小鼠抗血清进行解析，及使用实施例4所得到的分泌型TFPI2溶液通过ELISA对实施例2所采集的小鼠抗血清进行解析。需要说明的是，为了研究特异性，基于公知的基因序列，与上述TFPI2表达质粒同样地构建分别以GPI锚定型(N末端侧具有FLAG标签、C末端侧具有GPI锚)及分泌型(N末端侧具有FLAG标签、C末端侧具有BNC标签)表达与TFPI2不同的蛋白质的表达质粒，并导入293T细胞株、CHO-K1细胞中而利用。以下也将该与TFPI2不同的蛋白质称为对照蛋白质。

(1)CELISA解析

(1-1)在96孔板的每孔中，添加5×10⁴个实施例3所制作的GPI锚定型TFPI2表达CHO-K1细胞、及作为阴性对照细胞的以GPI锚定型表达上述对照蛋白质的CHO-K1细胞，使用添加了10％FBS的Hams F12培养基(和光纯药公司制)，在5％CO₂培养箱中、37℃下培养24小时。

(1-2)对于GPI锚定型TFPI2表达细胞及阴性对照细胞，分别添加2000倍稀释的抗血清(A1～A4)或小鼠抗FLAG M2抗体(SIGMA公司制)作为一级抗体，室温下反应1小时。

(1-3)反应后洗涤板，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠免疫球蛋白G-Fc抗体(SIGMA公司制)作为二级抗体，室温下反应1小时。

(1-4)反应后洗涤板，添加TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL公司制)后，用1mol/L磷酸溶液终止反应，用吸光测定酶标仪测定450nm的吸光值。

(2)ELISA解析

除了使用作为阴性对照的以分泌型表达上述对照蛋白质的293T细胞株的培养上清(以下也称为分泌型对照蛋白质溶液)以外，通过与实施例4的(A)同样的方法评价各小鼠抗血清。

将CELISA解析的结果示于图4。在阴性对照细胞的情况下，任意的抗血清都几乎未确认到信号，TFPI2表达细胞则确认到明显的信号。结果表明：通过实施例2中实施的DNA免疫，得到特异性高的抗TFPI2抗血清。

将ELISA解析的结果示于图5。与CELISA的结果同样地，在使用抗血清(A1～A4)的情况下，仅对于TFPI2确认到明显的信号，该方法也表明：通过实施例2中实施的DNA免疫，得到特异性高的抗血清。

总结图4及图5的结果可知，实施例2所得到的小鼠抗血清无论是GPI锚定型TFPI2还是分泌型TFPI2，均为特异性高的抗血清。

＜实施例6＞杂交瘤的建立

通过以下方法建立能够产生针对TFPI2的抗体的杂交瘤。

(1)从实施例2中已经确认由于DNA免疫而抗体效价上升的小鼠采集脾脏细胞并回收脾细胞。

(2)用所回收的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0在聚乙二醇存在下按照常规方法实施细胞融合。

(3)用HAT(Sigma-Aldrich公司制)/GIT培养基(和光纯药公司制)培养约10天，从而选择抗体产生细胞杂交瘤。

(4)将所选择的抗体产生细胞杂交瘤的培养上清供于实施例5的(1)中记载的CELISA及实施例4的(A)中记载的ELISA，进行能够产生针对TFPI2的抗体的杂交瘤的筛选。

(5)将通过筛选而选择的孔中的细胞通过有限稀释法进行单克隆化，进行由HT(Sigma-Aldrich公司制)/GIT培养基到GIT培养基的驯化培养，最终建立10种杂交瘤(TS-TF01～TS-TF10)。

＜实施例7＞抗原识别位点的鉴定

通过作为TFPI2的各Kunitz结构域的KD1、KD2及KD3的变体表达细胞来鉴定各抗体的抗原识别位点。以下示出各变体表达用质粒的具体制备方法。

(1)使用下述(c)、(d)及(e)记载的引物，按照常规方法通过RT-PCR法对TFPI2的与KD1区域、KD2区域及KD3～C末端区域相当的多核苷酸进行扩增。

(c)GPI锚定型TFPI2-KD1用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca-3’(序列号6，3’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第73～87位的碱基序列相当)

反向：

5’-catcagtggtgaattctttttctatcctcca-3’(序列号7，5’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第259～273位的碱基序列相当)

(d)GPI锚定型TFPI2-KD2用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgttcccaaagtttgc-3’(序列号8，3’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第274～288位的碱基序列相当)

反向：

5’-catcagtggtgaattctttctttggtgcgca-3’(序列号9，5’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第445～459位的碱基序列相当)

(e)GPI锚定型TFPI2-KD3用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttattccatcattttgc-3’(序列号10，3’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第460～474位的碱基序列相当)

反向：

5’-catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg-3’(序列号11，5’末端侧15个碱基与GenBank No.NM＿006528的第691～705位的碱基序列相当)

(2)通过实施例1的(2)记载的方法构建3种GPI型TFPI2表达质粒。

(3)通过实施例3记载的方法制备上述3种瞬时表达细胞，鉴定实施例6记载的10种单克隆抗体的抗原识别位点。

将由FACS解析结果判明的各抗体的抗原识别位点示于表1。

[表1]

表1

＜实施例8＞单克隆抗体制备和利用纯化抗体的CELISA解析

由实施例6所建立的10种杂交瘤，通过以下方法制备针对TFPI2的单克隆抗体(抗TFPI2单克隆抗体)并实施CELISA解析。

(1)将实施例6所建立的杂交瘤培养上清300mL用50％硫酸铵分级，用TBS(Tris-Buffered Saline；10mM Tris-HCl+150mM NaCl(pH7.4))透析后，使用HiTrap Protein GHP(GE Healthcare公司制)通过以下方法进行单克隆抗体的纯化。

(1-1)将上述柱预先用PBS(Phosphate Buffer Saline；10mM磷酸+150mM NaCl(pH7.4))进行缓冲液置换后，使杂交瘤培养上清以流速10mL/min通过。

(1-2)用柱容量5倍以上的PBS充分洗涤柱，从而进行未结合蛋白质的除去。此时，确认从柱中通过的缓冲液的OD280下的吸光度为0.01以下，从而判断没有残留未结合蛋白质。

(1-3)洗涤柱后，用洗脱液(100mM甘氨酸(pH2.5))将结合抗体洗脱。需要说明的是，对于洗脱抗体，迅速添加1/10体积的1M Tris(pH8.0)使其呈中性并利用TBS迅速进行透析，通过吸光度计定量各纯化抗体的蛋白浓度。

(2)对于作为阳性对照的小鼠抗FLAG M2抗体(SIGMA公司制)、作为比较对照的抗TFPI2P-2抗体(Santa Cruz公司制)及上述10种抗TFPI2抗体，按照抗体添加量为200ng/孔～2.5ng/孔的方式用1％FBS/PBS溶液制备抗体稀释溶液。

(2-1)对上述抗体稀释溶液用实施例5的(1)记载的方法实施CELISA解析。需要说明的是，仅在各抗体200ng/孔的情况下，用TFPI2表达细胞和对照细胞进行解析，在66.6ng/孔以下的抗体稀释溶液的情况下，仅用TFPI2表达细胞进行解析。将CELISA解析结果示于图6。关于作为阳性对照的抗FLAG抗体，在TFPI2表达细胞及阴性对照细胞两者中都确认到明显的信号。关于作为比较对照的抗TFPI2P-2抗体，在TFPI2表达细胞中完全未确认到信号，但该抗体为WB用途、即所谓的变性蛋白检测用，因此在使用具有天然型的高级结构的TFPI2的本解析体系中未确认到反应性也是理所当然的。另一方面，上述10种抗TFPI2抗体虽然确认到抗体间差异，但总体上对TFPI2表达细胞确认到特异性且浓度依赖性信号。

＜实施例9＞利用各种单克隆抗体固定化磁珠进行的免疫沉淀性能评价

制备实施例8所制备的10种抗TFPI2单克隆抗体的抗体固定化磁性微粒，通过以下方法鉴定与各抗体特异性结合的卵巢透明细胞腺癌细胞培养上清中的蛋白质。需要说明的是，使用OVISE、OVMANA及OVSAYO这3种作为卵巢透明细胞腺癌细胞。

(1)将实施例8所得到的纯化单克隆抗体的一部分按照常规方法固定于DynabeadsM-280Tosylactivated磁性微粒(Invitrogen公司制)后，用含有0.5％BSA的PBS封闭，制备抗体固定化磁性微粒。

(2)免疫沉淀-蛋白质印迹法(IP-WB法)

(2-1)将上述3种癌细胞用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基(和光纯药公司制)在100％铺满状态下培养3天。

(2-2)对培养上清进行离心后，对上清0.1mL分别添加通过实施例8记载的方法制备的10种抗体固定化磁性微粒，在室温下搅拌、反应1小时。

(2-3)用PBST-NP40(0.1％Tween 20、1％NP40)洗涤2次后，用不含表面活性剂的PBS洗涤3次。

(2-4)对结合于各抗体固定化磁性微粒的蛋白质通过实施例4的(B)记载的蛋白质印迹进行解析。需要说明的是，分子量标志物使用Full-Range Rainbow Molecular WeightMarkers(GE公司制)，SDS-PAGE用凝胶使用10-20％梯度凝胶(Marisol公司制)。关于蛋白质印迹的检测用抗体，将横浜市立大妇科建立的识别完整TFPI2的N末端的抗TFPI2肽抗体(参照非专利文献6)用碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学公司制)标记，通过实施例4记载的方法进行检测。WB数据的解析用Chemi-Stage附带的Labo1D软件(kurabo公司制)进行，将确认到各抗体的强信号的A或B中的每单位面积的信号强度数值化。需要说明的是，本研究实施3次，关于面积Labo1D软件解析结果，计算3次实验结果中的信号平均值及标准误差。

将IP-WB法的解析像及WB信号的Labo1D软件解析结果示于图7。从培养上清中，在分子量约28000附近和分子量约16000附近检测到了明显信号。由于该WB解析中使用了TFPI2的N末端识别抗体，因此，分子量约28000附近的信号(A)与完整TFPI2相当，推测分子量约16000附近的信号(B)为由于某种原因而低分子化的TFPI2片段多肽。此外，确认其每单位面积的信号在抗体间存在差异，确认到具有识别Kunitz结构域1的抗原识别位点的TS-TF01抗体及TS-TF04抗体中该信号高的倾向。将含有Kunitz结构域1的该TFPI2片段多肽设为NT-TFPI2。

＜实施例10＞通过质谱法进行的单克隆抗体结合蛋白质的鉴定

使用实施例9中确认了与NT-TFPI2亲和性高的TS-TF01抗体及TS-TF04抗体、以及作为对照的TS-TF05抗体的共计3种抗体固定化磁性微粒，进行IP-WB的再检验。此外，对与TS-TF01抗体及TS-TF04抗体结合的NT-TFPI2多肽，通过质谱法进行解析。作为卵巢癌细胞培养上清，使用实施例9所制备的OVISE及OVMANA这2种，使用通过实施例9记载的方法制备的样品实施IP-WB。仅对OVMANA样品如下制备样品并用于质谱。

(1)将OVMANA样品溶液用蒸发器浓缩后，用SDS-PAGE展开，通过Ruby染色(Invitrogen公司制)将所分离的蛋白质染色。

(2)将确认染色的分子量约16000附近的3种片段及未确认染色的周边的1种共计4种片段(TS-TF01：图8的Ruby染色的A及B中记载的片段、TS-TF04：图8的Ruby染色的C及D中记载的片段)切出，使用二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化后，用胰蛋白酶实施凝胶内消化。

(3)将通过胰蛋白酶消化生成的肽片段，通过使用C18反相柱的1D纳米LC***(Ultimate3000、ThermoFisherScientific公司制)进行分离，通过LTQ Orbitrap质谱仪(ThermoFisherScientific公司制)进行MS/MS测定。得到的数据使用Protein Discoverer1.3软件(ThermoFisherScientific公司制)进行解析，相对于Swiss-Prot数据库中的氨基酸序列进行检索，鉴定蛋白质。

将由WB像及Ruby染色像及OVMANA的分子量约16000附近的IP产物鉴定出的蛋白质示于图8。WB像中，在OVISE及OVMANA两者中，通过TS-TF01抗体及TS-TF04抗体两者在分子量约16000附近确认到推定为NT-TFPI2多肽的明显信号。Ruby染色像中，虽然确认到推定为低分子化的TFPI2片段多肽的明显条带的分子量有一定上升，但推测是由于样品浓缩使盐浓度上升的影响，干扰了电泳。OVMANA IP产物的质谱数据证明，确认明显染色的A、B及C共3种分子量约16000附近的蛋白为NT-TFPI2。此外，根据其C末端侧的鉴定肽信息(FFSGGCH；序列号12)及N末端识别抗体的结果，表明NT-TFPI2多肽是至少含有序列号1所示的TFPI2蛋白质的氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸残基的多肽。

需要说明的是，由于本实施例中通过特征性消化精氨酸或赖氨酸残基的胰蛋白酶实施凝胶内消化，从而可以充分地认为，本多肽也可以含有比第131个残基的组氨酸更靠后的TFPI2蛋白质的C末端侧序列。即，本实施例不限于NT-TFPI2多肽的C末端序列。

＜实施例11＞TFPI2测定试剂的制备

在实施例9及实施例10已经确认到在透明细胞腺癌培养上清中存在完整TFPI2及NT-TFPI2两者，因此按照下述制备了：作为固相侧使用具有识别Kunitz结构域1的抗原识别位点的TS-TF04抗体、作为检测侧使用具有识别Kunitz结构域1的抗原识别位点的TS-TF01抗体、从而总括地以完整TFPI2和NT-TFPI2为测定对象的“NT+I-TFPI2测定体系”的测定试剂。此外，按照下述制备了：作为固相侧使用具有识别Kunitz结构域1的抗原识别位点的TS-TF04抗体、作为检测侧使用具有识别Kunitz结构域3的抗原识别位点的TS-TF05抗体且仅以完整TFPI2为测定对象的“I-TFPI2测定体系”的测定试剂。

(1)使水不溶性铁素体载体在室温下物理性吸附抗TFPI2单克隆抗体(TS-TF04)一昼夜而达到100ng/载体，然后用含有1％BSA的100mM Tris缓冲液(pH8.0)在40℃进行4小时封闭，从而制备抗TFPI2抗体固定化载体。

(2)对于抗TFPI2单克隆抗体(TS-TF01或TS-TF05)，用碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学公司制)制备2种抗TFPI2标记抗体。

(3)在透磁性容器(容量1.2mL)中加入(1)所制备的12个抗体固定化载体后，添加含有0.5μg/mL的(2)所制备的标记抗体的缓冲液(含有3％BSA的Tris缓冲液、pH8.0)50μL，实施冷冻干燥，从而制作测定试剂A(使用了TS-TF04抗体/TS-TF01抗体的NT+I-TFPI2测定试剂)及测定试剂B(使用了TS-TF04抗体/TS-TF05抗体的I-TFPI2测定试剂)这2种TFPI2测定试剂。需要说明的是，所制作的TFPI2测定试剂在氮气填充下实施密闭密封，在4℃下保管直至测定前。

＜实施例12＞TFPI2测定试剂的性能评价

将实施例4所制作的重组TFPI2上清、实施例9所制备的OVISE及OVMANA分别用FBS稀释10倍而作为含有TFPI2的样品，仅FBS作为不含TFPI2的样品，分别制备共计4种模拟检体样品，使用实施例11所制作的2种TFPI2测定试剂进行5个点的测定，从而对上述试剂进行评价。

评价用装置使用了全自动酶免疫分析装置AIA-1800(东曹公司制：制造销售申报编号13B3X90002000002)。利用全自动酶免疫分析装置AIA-1800的测定如下进行：

(1)将稀释样品20μL和含有表面活性剂的稀释液80μL自动分注到收容有实施例11所制作的TFPI2测定试剂的容器中，

(2)在37℃恒定温度下进行10分钟的抗原抗体反应，

(3)用含有表面活性剂的缓冲液进行8次洗涤，

(4)添加4-甲基伞形酮磷酸盐，

将每单位时间内碱性磷酸酶所致的4-甲基伞形酮生成浓度作为测定值(nmol/(L·s))。

将各种模拟检体样品的测定值示于表2。除FBS以外的任意模拟检体样品的5个点测定的变异系数均显示为3％以下，这证明利用实施例11所制作的TFPI2测定试剂得到的结果是可以信赖的。

[表2]

表2

＜实施例13＞通过各种卵巢癌细胞培养上清板进行的TFPI2测定试剂的检验

发明人荒川等对于透明细胞性、浆液性及粘液性的各种卵巢癌培养细胞板，通过质谱法解析培养上清，通过RealtimePCR解析细胞中的基因表达，鉴定了TFPI2为仅在透明细胞性中特征性产生的分子(专利文献4)。因此，如果实施例11记载的TFPI2测定试剂也同样地仅在透明细胞腺癌培养上清的情况下TFPI2测定值显示高值，则可以判断本试剂的测定对象为TFPI2。通过TFPI2测定试剂解析了荒川等所使用的各种卵巢癌细胞培养上清板。

1)用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基(和光纯药公司制)，将以下细胞群在100％铺满状态下培养3天。

透明细胞性：OVISE、OVTOKO、OVMANA、OVSAYO

浆液性：OVKATE、OVSAHO

粘液性：RMUG-S、MCAS

2)通过实施例12记载的方法，将总计8种培养上清用2种TFPI2测定试剂进行解析。

将解析结果示于图9。透明细胞性中，除OVTOKO以外的3种均显示高信号，而在浆液性及粘液性中则几乎确认不到信号。此外显示，测定试剂间的相关性非常高。该结果表明，TFPI2测定试剂以TFPI2为测定对象。

＜实施例14＞通过N-聚糖酶处理进行的NT-TFPI2多肽的分子量检验

根据UniProt等一般的数据库及文献等目前为止的公知信息可知，TFPI2中在序列号1所示的氨基酸序列的第116个残基及第170个残基这两处天冬酰胺附加有天冬酰胺结合型糖链。因此，根据实施例10的结果可预测：NT-TFPI2多肽为含有第116个残基的天冬酰胺结合型(N型)糖链的糖蛋白，因此使用实施例10记载的3种抗体以及N-聚糖酶处理区或未处理区的实施例9记载的OVISE、OVMANA及OVSAYO上清进行IP-WB，来检验使用了N-聚糖酶的糖链消化处理所引起的NT-TFPI2多肽的分子量变化。同时，通过使用实施例11所制作的测定试剂计算的IP-AIA，来检验上清中TFPI2的IP效率。

(1)对400μL的OVISE、OVMANA及OVSAYO上清设置2个试验区，一个试验区中添加1000U的PNGaseF(NEB公司制)作为N-聚糖酶处理区，剩余的一个试验区作为未处理区。两试验区均在37℃下反应16小时。

(2)使用每1抗体区100μL的(1)中处理后的上清，设置作为对照的仅添加磁性微粒的添加区、和3种抗体固定化磁性微粒添加区，总计4试验区，通过实施例9记载的方法实施IP。通过磁体将反应后的溶液分离为上清及磁性微粒级分。

(3)用实施例10记载的2种测定试剂测定上清级分，计算N-聚糖酶处理对TFPI2测定值的影响及3种抗体的IP效率。IP效率(回收率(％))由100-((2)记载的上清的测定值/抗体未固定的磁性微粒反应溶液测定值)计算。

(4)对于磁性微粒级分，通过实施例9记载的方法实施WB，检测其发光信号。

将N-聚糖酶处理对TFPI2测定值的影响及IP回收率、以及WB像示于图10。

TFPI2的测定值及IP效率在有无N-聚糖酶处理的情况下均没有变动，未确认到N-聚糖酶处理引起的反应体系的抑制。关于IP效率，TS-TF04及TS-TF01IP区中，3种上清和2种测定体系的任一结果中，回收率均高达97％以上，表明几乎完全回收了TFPI2分子。另一方面，TS-TF05IP中，A)NT+I-TFPI2测定试剂的4点平均回收率为74.3％，而B)I-TFPI2测定试剂的4点平均回收率为91.3％，确认到显著性差异。表明TS-TF05识别不同于TS-TF04及TS-TF01的TFPI2的区域。

根据WB结果，在N-聚糖酶未处理的情况下，TS-TF01抗体及TS-TF04抗体两者对于3种培养上清均在分子量约16000附近确认到推定为NT-TFPI2多肽的明显信号。另一方面，在N-聚糖酶处理区的情况下，3种培养上清中均在分子量约12000附近确认到推定为NT-TFPI2多肽的明显信号。推定为与TS-TF01抗体及TS-TF04抗体亲和性高的、NT-TFPI2多肽的信号，由于糖链消化，分子量明显减少，因此表明NT-TFPI2多肽受到N型糖链修饰。

＜实施例15＞NT-TFPI2多肽的经时变化的检验

以阐明NT-TFPI2多肽的产生机制为目标，通过实施例9记载的IP-WB或实施例14记载的IP-AIA法来检验培养上清中的TFPI2的经时性动态。

(1)在15cm培养皿中对OVISE、OVMANA及OVSAYO细胞进行前培养，直至达到铺满状态。

(2)在各培养皿中加入新鲜培养基20mL，对培养24、48、72、及144小时后的培养上清分别进行经时回收。

(3)对于(2)所回收的上述4个点的上清，每种抗体使用100μL的上清，通过实施例9记载的方法实施IP，通过磁体将3种含有抗体固定化磁性微粒的溶液分离成上清及磁性微粒级分。

(4)用实施例11记载的2种测定试剂对上清级分进行测定，测定培养上清中的TFPI2量的经时变化。

(5)由于TFPI2随着培养时间而经时提高，因此实施WB时需要将回收时间不同的总计4个点的TFPI2量平均化。因此，以(4)的24小时后的培养上清中的TFPI2测定值为基础，对此后3个点的磁性微粒级分的SDS-PAGE添加量进行适当稀释而调整各泳道的TFPI2添加量，实施实施例9记载的WB。将经时回收的培养上清的TFPI2测定值及WB像示于图11。

在NT+I-TFPI2测定体系及I-TFPI2测定体系两者中，确认到培养上清中的TFPI2经时增加的倾向。根据WB结果，就培养144小时后回收的上清而言，在OVISE及OVMANA培养上清中，通过TS-TF01抗体及TS-TF04抗体两者在分子量约16000附近确认到推定为NT-TFPI2多肽的明显信号。还明确了：该信号在OVISE及OVMANA两者中均经时增加；该信号在OVMANA中从24小时后开始存在。

＜实施例16＞癌细胞内TFPI2分子的检验

实施例13及14表明：培养上清中产生了完整TFPI2及NT-TFPI2多肽，还认为该分子也局部存在于细胞内。因此，通过IP-WB法对细胞内的TFPI2分子进行了检验。

1)通过实施例13记载的方法培养作为透明细胞性的OVISE、OVMANA及OVSAYO以及作为浆液性的OVKATE及OVSAHO。

2)制备2M硫脲、7M脲、3％CHAPS、1％TritonX-100溶液作为细胞增溶剂，从细胞培养板除去培养基并用PBS洗涤3次后，将细胞增溶剂添加于培养板。

3)通过细胞刮取器剥离细胞，以15000rpm离心分离20分钟后，将其上清级分作为细胞提取液。

4)使用上述细胞提取液，实施利用实施例11记载的2种TFPI2测定试剂的测定、及实施利用实施例9记载的3种抗体的IP-WB。

将利用TFPI2测定试剂的解析结果及WB像示于图12。表明即便在细胞内，TFPI2的表达特异性也表现出与培养上清同样的透明细胞性特异性。此外，细胞内的情况下，在分子量24000到31000之间确认到2条明显信号。根据分子量，推测该信号为附加有糖链的完整TFPI2及未附加糖链的完整TFPI2。另一方面，与NT-TFPI2相当的分子量16000附近的信号在检测限以下。该结果表明：细胞内存在大量的完整TFPI2分子，但NT-TFPI2则可能是极微量的或不存在。

实施例14、15、16表明：NT-TFPI2多肽为由透明细胞腺癌产生的具有N型糖链的在分子量约16000附近分级出的糖蛋白多肽，产生到培养上清中并随着时间而蓄积，在癌细胞内与完整TFPI2相比极微量或者不表达。可以认为，NT-TFPI2的产生机制是分泌到细胞外后由于某些原因而受到加工。

＜实施例17＞孕妇血清检体的TFPI2测定

本实施例中使用的62例孕妇血清检体(由PROMEDDX公司购买的检体)为包括孕早期～孕晚期的妊娠5周～40周的检体，任一检体均为签订了书面的知情同意书的欧美人血清检体。

使用全自动酶免疫分析装置AIA-1800(东曹公司制)作为评价用装置，使用实施例11所制作的A)NT+I-TFPI2测定试剂及B)I-TFPI2测定试剂这2种进行测定。

将TFPI2测定值的箱线图(Box Plot)示于图13，将各测定试剂的孕早期、孕中期及孕晚期的最小值、25％、中位数、75％、最大值、95％置信区间的浓度范围示于表3。TFPI2测定值与妊娠周数和血中浓度显示高相关性，因此表明：实施例11所制作的2种测定试剂均以检体中的TFPI2为测定对象。

[表3]

表3

＜实施例18＞卵巢癌检体的TFPI2测定

将本实施例中使用的检体板(123例)示于表4。该检体为横浜市立大妇科按照同一程序收集的血清检体，均得到了知情同意且得到横浜市立大学伦理委员会的许可。

[表4]

表4

使用全自动酶免疫分析装置AIA-1800(东曹公司制)作为评价用装置，使用实施例11所制作的2种TFPI2测定试剂及CA125测定试剂(东曹公司制、许可编号20700AMZ00504000)进行测定。

将NT+I-TFPI2测定体系及I-TFPI2测定体系的TFPI2测定值及CA125测定值示于图14。CA125在全部卵巢恶性肿瘤中均显示为高值倾向，而NT+I-TFPI2测定体系及I-TFPI2测定体系的测定值在透明细胞腺癌中显示高值倾向。

将该板解析结果分为良性卵巢肿瘤、子宫内膜异位症、交界恶性肿瘤、透明细胞腺癌、其它恶性卵巢肿瘤这5类的结果示于图15，将2种TFPI2测定值及CA125测定值的各组中的最小值、25％、中位数、75％、最大值、95％置信区间的浓度范围示于表5。与良性卵巢肿瘤相比，CA125在子宫内膜异位症中显示高值，进而在全部恶性肿瘤中显示出明显的高值倾向。CA125为子宫内膜异位症的辅助标志物，因此在作为良性肿瘤的子宫内膜异位症中显示高值是合理的。由于在透明细胞腺癌和其它恶性卵巢肿瘤之间中位数几乎相等，因此可以说CA125不能区分透明细胞腺癌。另一方面，NT+I-TFPI2测定体系及I-TFPI2测定体系的测定值仅在透明细胞腺癌中确认到高值倾向，NT+I-TFPI2测定体系的测定值显示出更高值倾向。

[表5-1]

表5-1

[表5-2]

表5-2

将卵巢透明细胞腺癌组及其它卵巢肿瘤组间的NT+I-TFPI2测定体系、I-TFPI2测定体系及CA125测定数据的受试者动态特征(ROC)曲线解析的结果示于图16；将AUC(AreaUnder the Curve、ROC曲线下面积)及差异显著性检验中的P值示于表6。卵巢透明细胞腺癌组及其它卵巢肿瘤组间的2种TFPI2测定值的差异显著性均显示为p＜0.0002，确认到统计学上的显著性差异，因此表明2种TFPI2测定试剂与CA125相比在卵巢透明细胞腺癌的检测中有用。此外表明：包括地测定完整TFPI2及NT-TFPI2的NT+I-TFPI2测定体系的P值以及AUC均超过仅测定完整TFPI2的I-TFPI2测定体系。

[表6]

表6

然后，将TFPI2基准值(Cutoff值)设为由上述ROC解析所得到的值、且将CA125的基准值设为一般基准值附近的36U/mL，将这种情况下的卵巢透明细胞腺癌组及其它卵巢肿瘤组间的灵敏度(sensitivity)及特异度(specificity)示于表7。虽然对于CA125为不利条件，但至少在以透明细胞腺癌的特异性诊断为目的的情况下，TFPI2的有用性是明确的。此外表明：A)NT+I-TFPI2测定试剂的特异度高于B)I-TFPI2测定试剂。

[表7]

表7

将TFPI2设为上述基准值且将CA125设为作为一般基准值的35U/mL，将这种情况下的实施例17记载的全部临床检体的阳性率示于表8。A)NT+I-TFPI2测定试剂在该板中假阳性极低，且能够以高的概率判断透明细胞腺癌阳性，表明具有作为透明细胞腺癌诊断标志物的性能。

[表8]

表8

＜实施例19＞通过质谱法进行的NT-TFPI2多肽的C末端序列解析

通过使用了重氧水的质谱法，对NT-TFPI2多肽的C末端序列进行解析。

使用实施例9所制备的OVMANA作为卵巢癌细胞培养上清，使用TS-TF01抗体柱，按照下述方式制备质谱用样品。

(1)使用HiTrap NHS柱(GE Healthcare公司制)和TS-TF01抗体，按照常规方法制作TS-TF01抗体结合柱。

(2)用注射器使OVMANA培养上清10mL通入抗体柱3次，用TBS进行3次洗涤。

(3)使0.1M甘氨酸(pH2.0)溶液1mL通入抗体柱3次，回收抗体柱结合级分溶液。

(4)将抗体柱结合级分溶液用三氯乙酸浓缩后，用SDS-PAGE展开，通过SYPRO-Ruby染色(Invitrogen公司制)进行染色。

(5)将确认了染色的总计3种(图17A：SYPRO-Ruby染色的#1～#3中记载的片段)的凝胶片段切出，用乙腈脱水后，用V8蛋白酶(Sigma公司制)进行凝胶内消化。此时，为了由质量信息区分所得到的C末端序列是通过凝胶内消化产生的、还是通过细胞的加工作用产生的，在将通常的超纯水(H₂O¹⁶)和重氧水(H₂O¹⁸)以1：1的比例混合而成的10mM碳酸氢铵水溶液中进行凝胶内消化反应。

(6)将肽消化物用与C18反相纳米LC***相连的三重TOF5600质谱仪(ABSciex公司制)进行分析。测定数据使用Protein Pilot软件(AB Sciex公司制)相对于Swiss-Prot数据库上的氨基酸序列进行检索，从而鉴定氨基酸序列。

将抗体柱结合级分的SYPRO-Ruby染色像示于图17A，将由条带#1～#3鉴定的序列信息定位于TFPI2氨基酸序列上的结果示于图17B，将由条带#3检测的代表性的来自TFPI2的肽的前体离子的质谱示于图17C，将对应的离子鉴定信息示于表9。表明抗体柱结合级分的在SYPRO-Ruby染色像中显示强信号的28kDa(#1)、24kDa(#2)、及17.5kDa(#3)的条带均为TFPI2肽。关于置信值99以上、且N末端的最前方具有谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)残基的肽(不包括紧接着分泌信号序列的₂₃DAAQEPTGNNAE₃₄(序列号13))中，仅从#3检出了₁₂₄KFFSGGCH₁₃₁(序列号15)、及₁₂₄KFFSGGC₁₃₀(序列号16)。

[表9]

表9

在目的在于鉴定C末端序列的本实施例中，在利用V8蛋白酶进行的凝胶内消化的实验体系中，使用将超纯水(H₂O¹⁶)和重氧水(H₂O¹⁸)以1：1混合的水溶液。在凝胶内进行了蛋白酶消化的肽的C末端以同等程度被O¹⁶和O¹⁸标记，而细胞培养时通过加工作用产生的C末端则未被O¹⁸标记。

根据本实施例中检出的肽的前体离子的质谱的代表例(图17C)、及对应的离子鉴定信息(表9)而设想为内部肽的₂₃DAAQEPTGNNAE₃₄(序列号13)、₈₁ACDDACWRIE₉₀(序列号14)中，同时检测、鉴定了C末端被O¹⁸标记的生成肽和通常的由O¹⁶生成的肽。例如图17C所示，关于₂₃DAAQEPTGNNAE₃₄(序列号13)，分别检测了被O¹⁶及O¹⁸标记的m/z 608.76及m/z 609.76的2价离子的单同位素离子，以它们所对应的同位体混在的形式检出了前体离子。₈₁ACDDACWRIE₉₀(序列号14)时也同样，该数据表明这些肽并非为C末端，证明了主旨在于鉴定C末端序列的本解析体系的妥当性。

另一方面，作为用O¹⁶标记而生成的肽，检测、鉴定了₁₂₄KFFSGGCH₁₃₁(序列号15)、₁₂₄KFFSGGC₁₃₀(序列号16)、及₂₀₃DCKRACAKALK₂₁₂(序列号17)，但未检测用O¹⁸标记而生成的肽。因此，强烈暗示NT-TFPI2多肽的C末端序列为His131或Cys130。

由本说明书的实施例综合考察，通过蛋白质印迹而检测的全长TFPI2相当于条带#1和条带#2，N末端为Asp23、C末端为Lys212，Lys212之后的序列由于某些理由而被切断。条带#1和条带#2在SDS-PAGE上的移动度不同这一点，可能起因于TFPI2的糖链结构的差异。另一方面明确了：通过WB检测的17.5kDa的NT-TFPI2多肽相当于条带#3，N末端与全长TFPI2相同为Asp23，C末端为His131或Cys130。

此外，由条带#3还检测了位于全长TFPI2的C末端侧的₂₀₃DCKRACAKALK₂₁₂(序列号17)，因此表明：条带#3中，NT-TFPI2和具有从Arg132起的C末端序列的多肽、即所谓的CT-TFPI2是混在的。但是，NT-TFPI2多肽的C末端序列是由利用重氧水法的质量信息定义的，并不否定该结论的妥当性。

产业上的可利用性

根据本发明，提供一种卵巢透明细胞腺癌的新的检测标志物，此外，提供一种在具有多样的组织型的良性卵巢肿瘤及恶性卵巢肿瘤中，以高灵敏度和特异度仅检测卵巢透明细胞腺癌的方法。这些适合用于卵巢透明细胞腺癌的筛选及术后后续观察、或子宫内膜异位症的后续观察等用途，在产业上非常有用。

序列表

<110> 公立大学法人横滨市立大学(Public University Corporation YokohamaCity University)

东曹株式会社(TOSOH Corporation)

<120> 卵巢透明细胞腺癌的检查方法及检查药

<130> 15450

<150> JP2014-239433

<151> 2014-11-27

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 1

Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu

35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe

50 55 60

Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu

65 70 75 80

Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys

85 90 95

Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys

100 105 110

Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly

115 120 125

Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr

130 135 140

Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser

145 150 155 160

Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe

165 170 175

Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly

180 185 190

Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys

195 200 205

Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala

210 215 220

Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe

225 230 235

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2 正向引物

<400> 2

cgatgacgac aagcttgctc aggagccaac a 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2 反向引物

<400> 3

catcagtggt gaattcaaat tgcttcttcc g 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌 TFPI2 正向引物

<400> 4

cgatgacgac aagcttgctc aggagccaac a 31

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分泌 TFPI2 正向引物

<400> 5

agcatcagtg gtgaattctc attagtggcg acgcagaact ttgcaaaatt gcttcttccg 60

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2-KD1 正向引物

<400> 6

cgatgacgac aagcttgctc aggagccaac a 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2-KD1 反向引物

<400> 7

catcagtggt gaattctttt tctatcctcc a 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2-KD2 正向引物

<400> 8

cgatgacgac aagcttgttc ccaaagtttg c 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2-KD2 反向引物

<400> 9

catcagtggt gaattctttc tttggtgcgc a 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2-KD3 正向引物

<400> 10

cgatgacgac aagcttattc catcattttg c 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPI 锚定型 TFPI2-KD3 反向引物

<400> 11

catcagtggt gaattcaaat tgcttcttcc g 31

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 12

Phe Phe Ser Gly Gly Cys His

1 5

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 13

Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 14

Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu

1 5 10

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 15

Lys Phe Phe Ser Gly Gly Cys His

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 16

Lys Phe Phe Ser Gly Gly Cys

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类(Homo Sapiens)

<400> 17

Asp Cys Lys Arg Ala Cys Ala Lys Ala Leu Lys

1 5 10

Claims

1.一种组织因子途径抑制物2(TFPI2)加工多肽，其具有以下(i)～(iii)的特征，

(i)含有序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止的氨基酸序列、或与其具有80％以上的同源性的序列；

(ii)通过还原SDS-PAGE，在分子量约16000处被分级出；

2.一种检测卵巢透明细胞腺癌的方法，其包括测定检体中的权利要求1所述的TFPI2加工多肽量的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其包括进一步测定所述检体中的完整TFPI2量的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述TFPI2加工多肽量和所述完整TFPI2量的总计超过由对照计算出的基准值时，判定为检测出卵巢透明细胞腺癌。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，使用利用抗体的抗原抗体反应来进行所述测定，所述抗体与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止区域内的抗原决定簇结合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述抗体为识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。

7.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，使用质谱法进行所述测定。

8.一种用于检测卵巢透明细胞腺癌的试剂，其含有与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23个残基的天冬氨酸至第131个残基的组氨酸或第130个残基的半胱氨酸为止区域内的抗原决定簇结合的抗体。