JP6760562B2 - 卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報提供方法 - Google Patents

Description

本発明は、組織因子経路インヒビター２（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２；ＴＦＰＩ２）を測定対象として卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報提供方法に関する。

日本における卵巣癌の罹患数・死亡数は共に増加傾向にあり、国立がん研究センターの２０１５年がん統計予測では罹患数１０，４００人、死亡数４，８００人とされ、婦人科悪性腫瘍の中で最も死亡数が多い疾患である。卵巣癌は漿液性、類内膜、粘液性、そして明細胞と主に４つの組織型に分類される。その中でも、明細胞癌は他の組織型と比べて抗癌剤が効きにくく予後不良例が多く（非特許文献１）、５０歳以下の若年層では最も頻度の高い組織型であり、子宮内膜症を発生母地として高頻度に発生することから（非特許文献２）、本邦主導で卵巣明細胞癌診療の改善に向けた検討が進んでいる。

従来、全血、血球、血清、血漿などの血液成分から卵巣癌を検出する方法として、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ １２５、ＣＡ１２５）が有用とされ、卵巣癌のスクリーニング、卵巣癌の治療効果の評価、治療後の経過観察などに有効な検査として広く利用されている。

しかし、ＣＡ１２５は卵巣癌全般の検出には優れるものの、（１）組織型の鑑別性能を有していない、（２）明細胞癌の陽性率が低い、（３）良性腫瘍である子宮内膜症で高値となり内膜症からの明細胞癌発症を正確に診断することができないといった問題がある。その結果、明細胞癌症例の対応の遅れや疾患の偽陽性判定による良性疾患の過剰治療、それに伴う患者のＱＯＬの低下が喫緊の問題となっている。従って、卵巣明細胞癌を的確に管理するために、診断のみならず予後をも推測可能なバイオマーカーが創製されれば、術前にリンパ節郭清や他臓器合併切除等の拡大術式を念頭に置いて手術体制を整えることが可能となる等、卵巣癌診療への貢献が期待される。

組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ２）は、胎盤タンパク質５（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５；ＰＰ５）と同一のタンパク質であり、３つのクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインを含む胎盤由来セリンプロテアーゼインヒビターである。ＴＦＰＩ２は本発明者の宮城らにより胎盤の分泌型セリンプロテアーゼインヒビターとして報告され（非特許文献３）、ヘパリン結合性を有し胎盤で発現亢進することから周産期における血液凝固系への関与が考察されている（非特許文献４）。ＴＦＰＩ２と癌との関連に関しては、多くの癌種でＴＦＰＩ２遺伝子プロモーターがメチル化修飾を受けていることから、メチル化修飾を指標とした遺伝子診断ターゲットとしてリキッドバイオプシー分野で臨床研究が盛んに進められている（非特許文献５〜７）。

一方、本発明者の荒川らはＴＦＰＩ２が卵巣癌では明細胞癌細胞株から特異的に産生されること、卵巣癌患者組織における遺伝子発現は明細胞癌患者のみで特異的に向上することを明らかにし（特許文献１）、血中ＴＦＰＩ２は健常人及び子宮内膜症例と比較して明細胞癌で有意に向上していることを見出した（特許文献２、非特許文献８）。また、ＴＦＰＩ２の測定を行うことにより卵巣明細胞癌を検出する方法も開示されている（特許文献３）。
しかし今日まで、ＴＦＰＩ２と卵巣明細胞癌罹患者の予後との関連は不明であった。

特許第５２２４３０９号 特開第２０１３−６１３２１号公報 国際公開第２０１６／０８４９１２号パンフレット

Ｃａｎｃｅｒ，８８（１１），２５８４−２５８９（２０００） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ， １７（１），３７−４３（２００７） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，９３９（１９９４） Ｐｌａｃｅｎｔａ，２３（２），１４５−１５３（２００２）． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．，１９７，１６（２０１０） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３０，１２０５（２０１０） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１，６４２２（２００５） Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．， ２０１３， １２ （１０）， ｐｐ ４３４０−４３５０

本発明は、卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。

本発明者らは鋭意検討し、ＴＦＰＩ２と卵巣明細胞癌患者の生存期間を含む臨床情報を照合した結果、両者に一定の相関関係があることを見出し、ＴＦＰＩ２が卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報を提供しうることに想到し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、
前記患者由来の検体中のＴＦＰＩ２量を測定すること、及び
前記ＴＦＰＩ２量の測定値と前記患者の予後との関連付けをすること、を含む方法。
［２］前記関連付けにおいて、前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、当該患者に予後不良の可能性があると関連付ける、［１］に記載の方法。
［３］前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、［４］に記載の方法。
［６］質量分析法を用いて測定を行う、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［７］配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための試薬。

本発明により、検体中のＴＦＰＩ２量から卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報が提供され、術前にリンパ節郭清や他臓器合併切除等の拡大術式を念頭に置いて手術体
制を整えることが可能となる等、明細胞癌のより的確な管理ができるようになると期待できる。

卵巣明細胞癌の臨床病期（ＦＩＧＯ分類）と（ａ）ＴＦＰＩ２及び（ｂ）ＣＡ１２５のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示した図。横軸は臨床病期（ＦＩＧＯ分類）、縦軸は血中量を表す。 ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を示した図。横軸はＴＦＰＩ２量、縦軸はＣＡ１２５量表す。 卵巣明細胞癌の生存群または死亡群における（ａ）ＴＦＰＩ２及び（ｂ）ＣＡ１２５測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示した図。縦軸は血中量を表す。 （ａ）ＴＦＰＩ２と（ｂ）ＣＡ１２５による、卵巣明細胞癌の生存群と死亡群のＲＯＣ曲線を示した図。縦軸は感度、横軸は１００％−特異度を表す。 術後生存日数と（ａ）ＴＦＰＩ２又は（ｂ）ＣＡ１２５の相関を示した図。縦軸は術後生存日数、横軸は血中量を表す。 ＴＦＰＩ２またはＣＡ１２５の生存曲線を示した図。縦軸は生存率、横軸は術後生存日数を表す。

＜１＞本発明の卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法
本発明の卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法は、前記患者由来の検体中のＴＦＰＩ２量を測定すること、及び前記ＴＦＰＩ２量の測定値と前記患者の予後との関連付けをすること、を含む。
これは、ＴＦＰＩ２量と卵巣明細胞癌患者の予後との間に相関関係があることに基づく方法である。
本発明の方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた腫瘍マーカーであるＣＡ１２５を測定した場合に比べて、卵巣明細胞癌患者の予後をより的確に予測するための情報が提供される。医師は、提供された情報等を参照して、卵巣明細胞癌患者の予後を予測する。すなわち、本発明の方法自体は、予後の予測に関する最終的な判断行為は含まず、医師に判断材料を提供する段階までを含む。
なお、本明細書において「予後」とは、例えば患者の今後の生存期間（日数）、生存率や、生存／死亡の見通しの鑑別などをいう。

本発明において測定されるＴＦＰＩ２は、特に限定はなく、例えばインタクトＴＦＰＩ２（以降、「Ｉ−ＴＦＰＩ２」とも記す）、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド（以降、「ＮＴ−ＴＦＰＩ２」とも記す）、又はそれらの両方であってもよい。

配列番号１に、ヒトＴＦＰＩ２のｃＤＮＡに基づくアミノ酸配列を示す。配列番号１において、開始メチオニンから２２残基目のグリシンまではシグナルペプチドである。
「インタクトＴＦＰＩ２」とは、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目から２３５残基目で表されるペプチドをいう。
また、「ＮＴ−ＴＦＰＩ２」は、特許文献３に記載されるように、インタクトＴＦＰＩ２のＮ末端側に位置するクニッツドメイン１を含むペプチド断片をいう。より具体的には、ＮＴ−ＴＦＰＩ２は、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの配列を少なくとも含むペプチド、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、このポリペプチドは、前記配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、数個とは、好
ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個をいう。また、前記配列の両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよいが、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を認識する抗体の抗原決定基を有しないことが好ましい。

本発明における患者由来の検体（被検試料）は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液などが挙げられる。また、卵巣組織生検を検査対象としてもよいが、その場合は生検試料の培養上清を検体とする。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、簡便かつ非侵襲的に行うことができるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよい。

また、本発明における検体の採取時期は、特に限定されない。例えば、画像診断等で卵巣癌疑いとなって精密検査が施行される術前時から、術後の病理検査により卵巣明細胞癌と確定診断後の経過観察時にかけていつでもよく、確定診断前後、治療開始前後など、いずれの段階で採取した検体であっても、本発明の方法に供することができる。これは、後述する実施例で示すように、血中ＴＦＰＩ２量が、患者の予後と一定の相関関係を有するのに対し、患者における癌の進行度とは明確な関係が認められなかったことによって支持される。

測定されたＴＦＰＩ２量と患者の予後との関連付けは、例えば、インタクトＴＦＰＩ２量、ＮＴ−ＴＦＰＩ２量、又はインタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ−ＴＦＰＩ２量の合計が、予め設定した基準値を超えた場合に、患者に予後不良の可能性があると関連付けることによって行われる。関連付けによって示された予後の可能性は、通常、医師に予後を予測するための判断材料となり得る情報として提供される。
判定に用いる基準値は、測定値もしくは換算濃度値のいずれでもよい。なお、換算濃度値は、ＴＦＰＩ２を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。

予後を判定する基準値は、例えば、初回手術後に再発せずに生存している卵巣明細胞癌患者由来の検体と、初回手術後に死亡した卵巣明細胞癌患者由来の検体とをそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を行うことによって最適な感度と特異度を示す値に適宜設定することができる。例えば、具体的にはＮＴ−ＴＦＰＩ２量とインタクトＴＦＰＩ２量の合計の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は４００ｐｇ／ｍＬと設定してもよく、また後述の実施例で示すように４３０ｐｇ／ｍＬと設定してもよい。

以降、ＴＦＰＩ２の測定方法について説明する。
本発明において、検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２量又はインタクトＴＦＰＩ２量を個別に測定してもよく、またその値を合計して合計量としてもよい。また、検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の合計量を１度に測定できる測定系で測定してもよい。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトＴＦＰＩ２単独の測定量とから間接的にＮＴ−ＴＦＰＩ２量を測定してもよい。
本発明の方法において、ＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。

ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法として、例えば特許文献３に記載の方法が挙げられ、具体的には、以下のものが挙げられる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。

抗原抗体反応を利用してＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は、具体的に以下のものが挙げられる。
（Ａ）ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１に抗原決定基を有する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用いる。

（Ｂ）ＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法（Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３に抗原決定基を有する抗体であること好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用い、うち少なくとも１種類はＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、もう１種類はＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体であってもＮＴ−ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体であってもよい。

（Ｃ）（Ａ）のＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量から、（Ｂ）のＩ−ＴＦＰＩ２測定系で測定したインタクトＴＦＰＩ２単独量を減じることにより、ＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を算出する方法。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ−ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１に抗原決定基を有する抗体を検出抗体とする。

本発明においては、前述した（Ｃ）や（Ｄ）の方法で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２単独の量を判定の基準に用いてもよいが、（Ａ）の方法で測定したＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を判定の基準に用いても十分な感度と特異度が得られるうえ、抗体の取得しやすさや測定が一段階で簡便なことから、後者がより好ましい。

ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＮＴ−ＴＦＰＩ
２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質そのもの、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチド、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。

なお、免疫原として、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質そのもの、またはＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチドを用いることができる。しかし、前記タンパク質または前記オリゴペプチドは生体内のＴＦＰＩ２の立体構造を反映していない、あるいは調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の生体内のＴＦＰＩ２に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、本抗体を用いて測定系を構築しても結果として検体中に含まれるＴＦＰＩ２濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、ＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内で構造変化を受けない導入した通りのＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域が発現されるため、検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２に対し、高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるため好ましい。

更に、血中にはＴＦＰＩ２の相同体として知られるＴＦＰＩ１も存在する。従って、ＴＦＰＩ１と交叉せずＴＦＰＩ２のみを特異的に認識する抗体を用いることが望ましい。

ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。

本発明で用いる、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体、例えば、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＴＦＰＩ２または分泌型ＴＦＰＩ２に対する親和性に基づいて行えばよい。
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＮＴ−ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。

本発明で用いられる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。

なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。

本発明の方法において、質量分析法を利用してＮＴ−ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法について、以下に具体的に説明する。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等の主要タンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。または、抗ＴＦＰＩ２抗体を用いた免疫的手法によりＴＦＰＩ２のみを特異的に回収することも可能である。

測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）等により行うことができる。

＜２＞本発明の卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための試薬
本発明の卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための試薬は、配列番号１で表されるアミノ酸配列ＴＦＰＩ２の２３残基目のアミノ酸から１３１残基目又は１３０残基目のアミノ酸までの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む。前記抗体は好ましくは、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である。これらの抗体はＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識することができる。

本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが好ましい。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。

本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。

なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）〜（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を定量する。

本発明の試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、測定の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として血清や血漿を２０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＮＴ−ＴＦＰＩ２量及びインタクトＴＦＰＩ２量の測定を行う場合、当該検体２０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。

本発明の試薬は、用手法での測定にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた測定にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた測定は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく測定が可能で、かつ短時間に検体中のＮＴ−ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２が定量可能であるため、好ましい。

以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞ ＤＮＡ免疫用のＴＦＰＩ２発現プラスミドの構築
特許文献２の方法に従い、ＤＮＡ免疫用のＴＦＰＩ２発現プラスミドを構築した。
（１）下記（ａ）のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８）の７３から７０５塩基からなるポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ａ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号２、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７３か
ら８７番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号３、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の６９１から７０５番目の塩基配列に相当）

（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカーのコード領域とＦＬＡＧタグのコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）で得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を挿入し、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にＧＰＩアンカーがそれぞれ付加されたＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２の発現プラスミドを構築した。

＜実施例２＞ 抗血清の評価
特許文献２の方法に従い、ＴＦＰＩ２発現プラスミドをマウスおよびラットに免疫した。ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた細胞酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＳＡ）、並びに、分泌型ＴＦＰＩ２溶液を用いたＥＬＩＳＡによりＴＦＰＩ２特異的な抗体価の上昇を確認した。

＜実施例３＞ ハイブリドーマの選定と抗原決定基の同定
特許文献２の方法に従い、ＴＦＰＩ２に対する抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。各抗体の抗原決定基を、ＴＦＰＩ２の各クニッツドメインであるＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３のバリアント発現細胞により同定した。各バリアント発現用プラスミドの具体的調製方法を以下に示す。
（１）下記（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）記載のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２のＫＤ１領域、ＫＤ２領域及びＫＤ３からＣ末端領域に相当するポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ｃ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ１用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号４、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７３から８７番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔａｔｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号５、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の２５９から２７３番目の塩基配列に相当）
（ｄ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ２用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｔｔｃｃｃａａａｇｔｔｔｇｃ−３’（配列番号６、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の２７４から２８８番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｇｇｔｇｃｇｃａ−３’（配列番号７、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の４４５から４５９番目の塩基配列に相当）
（ｅ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２−ＫＤ３用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔａｔｔｃｃａｔｃａｔｔｔｔｇｃ−３’（配列番号８、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の４６０から４７４番目の塩基配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号９、５’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の６９１から７０５番目の塩基配列に相当）

（２）実施例１（２）記載の方法でＴＦＰＩ２発現プラスミドを構築した。
（３）（２）で構築した３種のＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドに挿入されているポリヌクレオチドにより発現されるＴＦＰＩ２が、想定通り細胞表面に局在していることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）（２）で構築したＧＰＩ型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを常法に従い２９３Ｔ細胞株へ導入した。
（３−２）前記発現プラスミドが導入された２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ_２インキュベータにて、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養し、ＴＦＰＩ２を一過性発現させた。（３−３）（３−２）で得られた培養細胞に、ＦＬＡＧタグと特異的に結合するＳＩＧＭＡ社製マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体、または、陰性対照としてＦＬＡＧタグとは結合しないマウス抗ＢＮＣ抗体を添加し、３０分静置した。なお、ＢＮＣとは、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるペプチドである（特開２００９−２４０３００号公報）。
（３−４）静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し、さらに３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行ない、１０種のモノクローナル抗体の抗原決定基を同定した。
ＦＡＣＳ解析の結果から判明した各抗体の抗原決定基を表１に示す。

＜実施例４＞ ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
固相側をクニッツドメイン１に抗原決定基を有するＴＳ−ＴＦ０４抗体、検出側にクニッツドメイン１に抗原決定基を有するＴＳ−ＴＦ０１抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２及びＮＴ−ＴＦＰＩ２を包括的に測定対象とする「ＮＴ＋Ｉ−ＴＦＰＩ２測定系」の測定試薬を以下の通り調製した。
（１）水不溶性フェライト担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ−ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて５３℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ−ＴＦ０１）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、アルカリフォスファターゼ標識抗ＴＦＰＩ２抗体を調製した。

（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。

＜実施例５＞ 臨床検体の評価
本実施例で使用した卵巣明細胞癌１８例は２００３年から２０１４年にかけて横浜市立大婦人科にて同一プロトコルにて収集された血清検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けている。

評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−２０００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００９）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−２０００によるＴＦＰＩ２の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例４で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４−メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、
単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とし、市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。
ＣＡ１２５の測定はＥテストＴＯＳＯＨＩＩ ＣＡ１２５測定試薬（東ソー社製、承認番号２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。

＜実施例６＞ 臨床病期（ＦＩＧＯ分類）との関連
卵巣明細胞癌検体（２００３年から２０１４年に収集された計１８症例）の臨床病期（ＦＩＧＯ分類）におけるＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５を図１に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５の中央値はいずれも臨床病期（ＦＩＧＯ分類）との明瞭な相関性は認められず、癌の進行に伴う血中濃度向上傾向は認められなかった。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５の相関解析結果を図２に示す。今回の解析では、ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５には全く相関が認められないことから、ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の血中動態は相関関係にないことが示唆された。

＜実施例７＞ 生存群と死亡群の比較
卵巣明細胞癌検体（２００３年から２０１０年に収集された計１１症例）に対し、２０１４年１２月の調査研究結果に基づいて生存群（ｎ＝４）と死亡群（ｎ＝７）に分け、双群における血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値を図３に示す。また、生存群と死亡群の比較におけるＲＯＣ解析の結果を図４に示す。ＴＦＰＩ２は、生存群に比して死亡群にて有意に高値を示すことが明らかとなった（マン＝ホイットニーのU検定、ｐ＝０
．０４２４）。さらに、ＲＯＣ解析を行った結果（図４）、ＡＵＣ（曲線下面積）の値が０．８９２９、カットオフ値（基準値）を４３７ｐｇ／ｍＬとした場合では、感度１００％、特異度７５％となり、ＴＦＰＩ２は明瞭に生存群と死亡群の鑑別できることが明らかとなった。一方、ＣＡ１２５は生存群と死亡群との間に統計的有意差は認められず（ｐ＝０．４８４８）、ＲＯＣ解析においてもTFPI2のような鑑別性能は認められなかった。

＜実施例８＞術後生存日数との関連
卵巣明細胞癌検体（２００３年から２０１０年に収集された計１１症例）の術後生存日数と血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値の関係を図５に示す。血中ＴＦＰＩ２値は術後生存日数に対して高い負の相関を示したが（スピアマン順位相関係数、ｒ_s＝−
０．７６）、ＣＡ１２５値には相関性は認められなかった（ｒ_s＝−０．２３６）。

＜実施例９＞生存曲線との関連
卵巣明細胞癌検体（２００３年から２０１０年に収集された計１１症例）を対象に、血中ＴＦＰＩ２が４３０ｐｇ／ｍＬ未満（４例）、および以上の群（７例）に分け、カプランマイヤー法を用いた生存曲線を図６に示した。血中ＴＦＰＩ２が４３０ｐｇ／ｍＬ以上の患者群において著しい生存率の低下傾向が認められ、それは、３５Ｕ／ｍＬ（臨床現場で用いられる基準値）以上（１０例）の血中ＣＡ１２５値を持つ患者群よりも低かった。

本発明により、血液検査で卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報が提供される。これは、術前にリンパ節郭清や他臓器合併切除等の拡大術式を念頭に置いて手術体制を整えることが可能となる等、卵巣癌診療への貢献が期待されるため、産業上非常に有用である。

Claims (7)

1. 卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、
   前記患者由来の検体中のＴＦＰＩ２量を測定すること、及び
   前記ＴＦＰＩ２量の測定値と前記患者の予後との関連付けをすること、を含む方法。
2. 前記関連付けにおいて、前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、当該患者に予後不良の可能性があると関連付ける、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 質量分析法を用いて測定を行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための試薬。

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