JP6722331B2 - 細胞培養培地及びそれを用いた培養方法 - Google Patents
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Description
(1)成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)を含有し、血清を含まない細胞培養培地。
(2)培地中に含まれる成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)の濃度が2ng/ml以上100ng/ml以下である、(1)に記載の細胞培養培地。
(3)さらに、デコリン(Decorin)、マトリックスメタロプロテアーゼ-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、オステオポンチン(Osteopontin(OPN))、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子受容体(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、インスリン様成長因子結合タンパク質2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、ガレクチン1(galectin 1(LGALS1))、及びインスリン様成長因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))からなる群より少なくとも1つ以上を含有する、(1)又は(2)に記載の細胞培養培地。
(4)アルブミンを含まない、(1)から(3)の何れか一に記載の細胞培養培地。
(5)細胞が、マウス由来の細胞またはヒト由来の細胞である、(1)から(4)の何れか一に記載の細胞培養培地。
(6)細胞が多能性幹細胞である、(1)から(5)の何れか一に記載の細胞培養培地。
(7)多能性幹細胞がiPS細胞(induced pluripotent stem cells)である、(6)に記載の細胞培養培地。
(9)基本培地が、Essential 8(登録商標)培地である、(8)に記載の細胞用培地キット。
(10)さらに、デコリン(Decorin)、マトリックスメタロプロテアーゼ-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、オステオポンチン(Osteopontin(OPN))、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子受容体(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、インスリン様成長因子結合タンパク質2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、ガレクチン1(galectin 1(LGALS1))、及びインスリン様成長因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))からなる群より少なくとも1つ以上を含有する、(8)又は(9)に記載の細胞用培地キット。
(12)細胞が多能性幹細胞である、(8)から(11)の何れか一に記載の細胞用培地キット。
(13)多能性幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、(12)に記載の細胞用培地キット。
(14)(a)(1)から(7)の何れか一に記載の細胞培養培地又は(8)から(13)の何れか一に記載の細胞用培地キットと、(b)細胞培養装置とを含む、細胞培養システム。
(15)(1)から(7)の何れか一に記載の細胞培養培地、(8)から(13)の何れか一に記載の細胞用培地キット、又は(14)に記載の細胞培養システムのいずれかを用いて細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
(17)細胞外マトリックスでコーティングされていない表面を有する培養基材上において細胞を培養する、(15)又は(16)に記載の培養方法。
(18)細胞外マトリックスでコーティングされている培養基材上において細胞を培養する(15)又は(16)に記載の培養方法。
(19)細胞外マトリックスが、ゼラチン、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫から産生される単離した基底膜成分であるマトリゲル、胎盤マトリクス、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグレカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ラミニン(ラミニン-511、ラミニン-111、ラミニン-332)、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、E-カドヘリン、デコリン、合成ペプチド、合成ポリマー、MEF又はヒト血清又は脱落膜間葉系細胞由来の細胞外マトリクスからなる群のいずれか一つ以上である、(17)又は(18)に記載の培養方法。
(20)細胞が、マウス由来の細胞またはヒト由来の細胞である、(15)から(19)の何れか一に記載の培養方法。
(21)細胞が多能性幹細胞である、(15)から(20)の何れか一に記載の培養方法。
(22)多能性幹細胞がiPS細胞(induced pluripotent stem cells)である、(21)に記載の培養方法。
(24)フィーダー細胞が、MEF(mouse embryonic fibroblast)、STO細胞株(ATCC寄託番号 CRL−1503)、線維芽細胞、胎盤細胞、骨髄細胞、及び子宮内膜細胞の群より選ばれる、(23)に記載の培養方法。
(25)細胞が、マウス由来の細胞またはヒト由来の細胞である、(23)又は(24)に記載の培養方法。
(26)細胞が多能性幹細胞である、(23)から(25)の何れか一に記載の培養方法。
(27)多能性幹細胞がiPS細胞(induced pluripotent stem cells)である、(26)に記載の培養方法。
(29)フィーダー細胞が、MEF(mouse embryonic fibroblast)、STO細胞株(ATCC寄託番号 CRL−1503)、線維芽細胞、胎盤細胞、骨髄細胞、及び子宮内膜細胞の群より選ばれる、(28)に記載のフィーダー細胞。
(30)培地中に含まれる成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)を検出又は定量することを含む、細胞を培養するための培地を評価する方法。
(32)GAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤が、
BMS777607[N-(4-((2-アミノ-3-クロロピリジン-4-イル)オキシ)-3-フルオロフェニル)-4-エトキシ-1-(4-フルオロフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボキサミド]、
R428[1-(6,7-ジヒドロ-5H-ベンゾ [2,3]シクロヘプタ [2,4-d]ピリダジン-3-イル)-3-N-[(7S)-7-ピロリジン-1-イル-6,7,8,9-テトラヒドロ-5H-ベンゾ [7]アンヌレン-3-イル]-1,2,4-トリアゾール-3,5-ジアミン]、及び
UNC569[1-((トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル)-N-ブチル-3-(4-フルオロフェニル)-1H-ピラゾロ [3,4-d]ピリミジン-6-アミン]
から選ばれる1種以上である、(31)に記載の増殖抑制剤。
(33)多能性幹細胞が、iPS細胞(induced pluripotent stem cells)である、(31)又は(32)に記載の増殖抑制剤。
(35)(31)から(33)の何れか一に記載の増殖抑制剤と、基本培地とを含有する細胞用培地キット。
(36)(a)(34)に記載の細胞培養培地又は(35)に記載の細胞用培地キットと、(b)細胞培養装置とを含む、細胞培養システム。
(37)(34)に記載の細胞培養培地、(35)に記載の細胞用培地キット、又は(36)に記載の細胞培養システムのいずれかを用いて細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
(39)GAS6の作用を抑制する条件下で多能性幹細胞を培養する工程が、抗GAS6抗体及び/又はGAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の存在下で多能性幹細胞を培養する工程である、(38)に記載の培養方法。
(40)GAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤が、
BMS777607[N-(4-((2-アミノ-3-クロロピリジン-4-イル)オキシ)-3-フルオロフェニル)-4-エトキシ-1-(4-フルオロフェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-カルボキサミド]、
R428[1-(6,7-ジヒドロ-5H-ベンゾ [2,3]シクロヘプタ [2,4-d]ピリダジン-3-イル)-3-N-[(7S)-7-ピロリジン-1-イル-6,7,8,9-テトラヒドロ-5H-ベンゾ [7]アンヌレン-3-イル]-1,2,4-トリアゾール-3,5-ジアミン]、及び
UNC569[1-((トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル)-N-ブチル-3-(4-フルオロフェニル)-1H-ピラゾロ [3,4-d]ピリミジン-6-アミン]
から選ばれる1種以上である、(39)に記載の培養方法。
(42)多能性幹細胞を培養する培地がBMS777607を含む場合、培地中に含まれるBMS777607の濃度が2ng/ml以上20ng/ml以下であり、多能性幹細胞を培養する培地がR428を含む場合、培地中に含まれるR428の濃度が8ng/ml以上80ng/ml以下であり、多能性幹細胞を培養する培地がUNC569を含む場合、培地中に含まれるUNC569の濃度が1ng/ml以上10ng/ml以下である、(40)に記載の培養方法。
(43)多能性幹細胞が、iPS細胞(induced pluripotent stem cells)である、(38)から(42)の何れか一に記載の培養方法。
(44)多能性幹細胞が、アルブミンを含まない培地で培養される、(38)から(43)の何れか一に記載の培養方法。
(45)多能性幹細胞が、血清を含まない培地で培養される、(38)から(44)の何れか一に記載の培養方法。
(46)多能性幹細胞が、GAS6を含む培地で培養される、(38)から(45)の何れか一に記載の培養方法。
(47)多能性幹細胞が、MEFで馴化した培地で培養される、(38)から(46)の何れか一に記載の培養方法。
本発明の細胞培養培地は、成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)を含有し、血清を含まないことを特徴とする培地である。成長停止特異的タンパク質6(GAS6)を添加することにより、血清及びフィーダー細胞を用いることなくヒト多能性幹細胞の増殖を促進することができる。これにより、動物細胞、若しくは動物細胞により馴化された培養液のどちらにも暴露されていないヒト多能性幹細胞の培養が容易になる。
本発明の細胞培養培地には、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、又は3-チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。
本発明の培地は、また、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば、非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。例えば、2-メルカプトエタノールは、幹細胞の培養に適する濃度で使用される限り限定されないが、例えば約0.05〜1.0mM、好ましくは約0.1〜0.5mMの濃度で使用できる。
細胞培養装置としては、上記した細胞培養培地又は細胞用培地キットを用いて細胞を培養できる装置であれば限定されないが、例えば、特開2008−92811号公報、特開2008−92882号公報及び特開2010−148391号公報(上記公報に記載の内容は本明細書の開示の一部として本明細書中に援用されるものとする)に記載されている細胞培養装置を使用することができる。
本装置を用いた動作の詳細は、特開2008−92882号公報の段落番号0029〜0053に記載の通りである。
本発明で培養される細胞の種類は特に限定されず、多分化能と自己複製能を併せ持つ幹細胞又は分化細胞の何れもでもよいが、好ましくは幹細胞であり、さらに好ましくは多能性幹細胞である。本発明において、「多能性幹細胞」とはインビトロにおいて培養することが可能で、かつ生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。具体的には、胚性幹細胞(ES細胞)、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞(EG細胞:Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95:13726-13731)、精巣由来の多能性幹細胞(GS細胞:Nature. 2008, 456:344-349)、体細胞由来人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells;iPS細胞)等が挙げられる。また、培養する細胞の由来する動物種は特に限定されず、任意の哺乳類などに由来する細胞を使用することができ、例えば、マウス由来の細胞またはヒト由来の細胞などを使用することができる。なお、細胞の培養は、通常の細胞培養の条件下で行うことができる。
多能性幹細胞などをフィーダー細胞を使用することなく培養する場合、細胞の足場となる培養基質でコートした培養容器を用いて培養を行うことができる。細胞の足場となる培養基質としては、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫から産生される単離した基底膜成分であるマトリゲル、胎盤マトリクス、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグレカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ラミニン(ラミニン-511、ラミニン-111、ラミニン-332)、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、E-カドヘリン、デコリン、合成ペプチド、合成ポリマー、MEF又はヒト血清又は脱落膜間葉系細胞由来の細胞外マトリクスなどが挙げられる。
本発明によればさらに、多能性幹細胞の増殖抑制剤の製造のための抗GAS6抗体の使用、並びに多能性幹細胞の増殖抑制剤の製造のためのGAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の使用が提供される。
R428を使用する場合における培地中に含まれるR428の濃度は、一般的には1ng/ml以上500ng/ml以下であり、好ましくは8ng/ml以上80ng/ml以下である。UNC569を使用する場合における培地中に含まれるUNC569の濃度は、一般的には0.5ng/ml以上100ng/ml以下であり、好ましくは1ng/ml以上10ng/ml以下である。
GAS6の作用を抑制する条件下で多能性幹細胞を培養する場合、多能性幹細胞は、アルブミンを含まない培地で培養する態様、血清を含まない培地で培養する態様、GAS6を含む培地で培養する態様、MEFで馴化した培地で培養する態様が好ましく、これらの態様を組み合わせてもよい。
馴化培地(CM)は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞)を用いて無血清培地から調製した。マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞)を、MEF用培地(10%FBSを添加したDMEM培地)中に約500,000 細胞/直径60mmディッシュの細胞密度で播種した。細胞を少なくとも16時間培養した後、PBS(−)、次いで、Essential8培地(インビトロジェン)(以下、この無血清培地をE8培地とも称する)で洗浄し、培地を同じ無血清培地に置換した。
(2−1)馴化していない無血清培地又は馴化した無血清培地の場合
実験に供したヒトiPS細胞(201B7)は、iPSアカデミアジャパンより入手した。ヒトiPS細胞の調製は、フィーダー細胞としてマイトマイシン処理で不活性化したマウス胎児線維芽細胞を播いたプラスチック培養ディッシュの上で維持培養した。培地は、D-MEM/F12(Sigma D6421)に終濃度20%のKNOCKOUTTM SR、0.1 mM NEAA(non-essential amino acids)、2 mM L-グルタミン、5 ng/ml ヒト basic FGF及び0.1 mM 2-メルカプトエタノールを添加したものを用い、37℃にてCO2インキュベーター内で培養した。継代は6〜7日毎に行い、解離液(コラゲナーゼ溶液)を用いて、ヒトiPS細胞のコロニーをフィーダー層から解離し、ピペット操作で20〜50個程度の小塊にした後、新しいフィーダー細胞層の上に播いた。フィーダー細胞上で維持培養したヒトiPS細胞を、解離液で解離し、ピペット操作で20から50個程度の小塊にし、300rpmで5分間遠心処理によりiPS細胞を回収した後、ゼラチンでコートした培養ディッシュ上で30分インキュベートすることによりMEF除去した後、マトリゲル(登録商標)(BD社)でコーティングされた培養ディッシュに、4分の1に分割して播種した。培地は、MEFで馴化していない無血清培地(E8培地)と、その培地をMEFで馴化した培地を用いて比較した。
Decorin、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)、Osteopontin(OPN)、TWEAK R、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)、galectin 1(LGALS1)、又はinsulin-like growth factor-1(IGF-1)を2ng/ml又は100ng/mlの濃度で、無血清培地(E8培地)に添加し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。
GAS6を2ng/ml又は100ng/mlの濃度で、無血清培地(E8培地)に添加し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。増殖性を比較した結果を表1に示し、アルカリフォスファターゼで染色して観察した結果を図2に示す。その結果、GAS6のヒトiPS細胞の増殖促進効果が確認できた。
GAS6、Decorin、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)、Osteopontin(OPN)、TWEAK R、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)、galectin 1(LGALS1)、insulin-like growth factor-1(IGF-1)の全部を各々2ng/ml又は100ng/mlの濃度で、無血清培地(E8培地)に添加し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。GAS6のみを添加した培地に対して増殖性を比較した結果を表1に示し、アルカリフォスファターゼで染色して観察した結果を図2に示す。GAS6のみを添加した培地と比較してさらにヒトiPS細胞の増殖促進効果が認められた。
培地として、以下の培地を使用し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。
上記E8培地をMEFで馴化した培地(E8CM);
Decorin(100ng/ml)、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、Osteopontin(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)(2ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(2ng/ml)、insulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)又はBSA(100ng/ml) の何れか1種を添加したE8培地;
Decorin(100ng/ml)、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、Osteopontin(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)(2ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(2ng/ml)、及びinsulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)の全てを添加したE8培地(E8+8);
E8培地をMEFで馴化した培地に、Decorin(100ng/ml)、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、Osteopontin(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)(2ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(2ng/ml)、及びinsulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)の全てを添加した培地(E8CM+8);
Decorin(100ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、Osteopontin(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)(2ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(2ng/ml)、及びinsulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)を添加したE8培地(E8+8−MMP3);
Decorin(100ng/ml)、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)(2ng/ml)、GAS6(2ng/ml)、TWEAK R(2ng/ml)、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)(2ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(2ng/ml)、及びinsulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)を添加したE8培地(E8+8−OPN);
培地として、以下の培地を使用し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。
上記E8培地をMEFで馴化した培地(E8CM);
Decorin(100ng/ml)、GAS6(100ng/ml)、Osteopontin(OPN)(100ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(100ng/ml)、insulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)又はBSA(100ng/ml) の何れかを添加したE8培地;
Decorin(100ng/ml)、Matrix Metalloproteinase-3(MMP3)(100ng/ml)、GAS6(100ng/ml)、Osteopontin(OPN)(100ng/ml)、TWEAK R(100ng/ml)、Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2)(100ng/ml)、galectin 1(LGALS1)(100ng/ml)、及びinsulin-like growth factor-1(IGF-1)(100ng/ml)の全てを添加したE8培地;
マトリゲル(登録商標)(BD社)でコーティングされた培養ディッシュの代わりに、マトリゲル(登録商標)(BD社)でコーティングされていない培養ディッシュを用いて、上記(2−1)と同様に、馴化していない無血清培地又は馴化した無血清培地を用いて、ヒトiPS細胞の増殖性を比較した。細胞をアルカリフォスファターゼで染色して観察した結果を図6に示す。馴化した培地では、マトリゲルでコーティングされていない培養ディッシュを用いた場合でも、細胞は増殖できた。
マトリゲル(登録商標)(BD社)でコーティングされた培養ディッシュを用いて、MEFで馴化した無血清培地(E8培地)に100ng/mlの抗GAS6抗体(R&D Systems社)を添加し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。細胞をアルカリフォスファターゼで染色し、細胞数を計測した。MEFで馴化した培地を用いた場合の細胞数を100として、他の培地を用いた場合の細胞数の比率を求めた結果を図7に示す。抗GAS6抗体を添加することにより、MEFで馴化した培地での細胞の増殖性は低下した。
マトリゲル(登録商標)(BD社)でコーティングされた培養ディッシュを用いて、MEFで馴化した無血清培地(E8培地)に、10ng/ml又は100ng/mlの抗GAS6抗体(R&D Systems社)、あるいは各種GAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、BMS777607(Santa Cruz Biotechnology社)(2ng/ml又は20ng/ml)、R428(Synkinase社)(8ng/ml又は80ng/ml)、UNC569(Calbiochem社)(1ng/ml又は10ng/ml)を添加し、上記(2−1)と同様にヒトiPS細胞の増殖への影響を調べた。いずれも、DMSOに溶解した後、0.22μmのフィルターによりフィルター滅菌処理を行い培地量に対し1/1000量添加した。細胞をアルカリフォスファターゼで染色し、細胞数を計測した。MEFで馴化した培地を用いた場合の細胞数を100として、他の培地を用いた場合の細胞数の比率を求めた結果を図8に示す。抗GAS6抗体又は各種GAS6受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を添加することにより、MEFで馴化した培地での細胞の増殖性は低下した。
Claims (15)
- 単離した成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)を含有し、フィーダー細胞で馴化されていない多能性幹細胞培養培地。
- 培地中に含まれる成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)の濃度が2ng/ml以上100ng/ml以下である、請求項1に記載の多能性幹細胞培養培地。
- さらに、デコリン(Decorin)、マトリックスメタロプロテアーゼ-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、オステオポンチン(Osteopontin(OPN))、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子受容体(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、インスリン様成長因子結合タンパク質2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、ガレクチン1(galectin 1(LGALS1))、及びインスリン様成長因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))からなる群より少なくとも1つ以上を含有する、請求項1又は2に記載の多能性幹細胞培養培地。
- 多能性幹細胞がiPS細胞(induced pluripotent stem cells)である、請求項1から3の何れか一項に記載の多能性幹細胞培養培地。
- 血清を含まない、請求項1から4の何れか一項に記載の多能性幹細胞培養培地。
- 単離した成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)と、フィーダー細胞で馴化されていない基本培地とを含有する多能性幹細胞用培地キット。
- さらに、デコリン(Decorin)、マトリックスメタロプロテアーゼ-3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、オステオポンチン(Osteopontin(OPN))、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子受容体(TNF-related Weak Inducer of Apoptosis Receptor(TWEAK R))、インスリン様成長因子結合タンパク質2(Insulin-like growth factor-binding protein 2(IGFBP2))、ガレクチン1(galectin 1(LGALS1))、及びインスリン様成長因子-1(insulin-like growth factor-1(IGF-1))からなる群より少なくとも1つ以上を含有する、請求項6に記載の多能性幹細胞用培地キット。
- 多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項6又は7に記載の多能性幹細胞用培地キット。
- (a)請求項1から5の何れか一項に記載の多能性幹細胞培養培地又は請求項6から8の何れか一項に記載の多能性幹細胞用培地キットと、(b)細胞培養装置とを含む、多能性幹細胞培養システム。
- フィーダー細胞で馴化されていない培地に単離した成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)を添加し、多能性幹細胞培養培地を調製する工程、及び
前記多能性幹細胞培養培地を用いて多能性幹細胞を培養する工程を含む、
多能性幹細胞の製造方法。 - 前記フィーダー細胞で馴化されていない培地に、デコリン(Decorin)、マトリックスメタロプロテアーゼ−3(Matrix Metalloproteinase-3(MMP3))、オステオポンチン(Osteopontin(OPN))、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子受容体(TNF-related Weak Inducer of Apotosis Receptor(TWEAK R))、インスリン様成長因子結合タンパク質2(Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2))、ガレクチン1(galectin1(LGALS1))、及びインスリン様成長因子−1(insurin-like growth factor-1(IGF-1))からなる群より少なくとも1つ以上を添加する工程を含む、請求項10に記載の製造方法。
- 前記フィーダー細胞で馴化されていない培地に添加された成長停止特異的タンパク質6(Growth arrest-specific 6;GAS6)の濃度が、2ng/ml以上100ng/ml以下である、請求項10又は11に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞をフィーダー細胞の非存在下において培養する、請求項10から12の何れか一項に記載の製造方法。
- 細胞外マトリックスでコーティングされていない表面を有する培養基材上において多能性幹細胞を培養する請求項10から13の何れか一項に記載の製造方法。
- 細胞外マトリックスでコーティングされている培養基材上において多能性幹細胞を培養する請求項10から14の何れか一項に記載の製造方法。
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