JP6689024B2 - 皮膚外用剤 - Google Patents
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ボタン科ボタン属のシャクヤクの根を刻んだ後乾燥し、乾燥物50gを精製水250gに浸漬した後、1,3−ブチレングリコールを250g添加した。添加後、4℃で抽出を行った。そして、抽出液をろ過し、褐色透明のシャクヤク抽出物溶液442gを得た(固形分濃度3.57%)。また、バラ科サクラ属のモモの種子(トウニン)を乾燥後粉砕し、粉砕物50gを精製水250gに浸漬した後、1,3-ブチレングリコールを250g添加した。添加後4℃で抽出を行った。そして、抽出液をろ過し、淡黄色透明のトウニン抽出物溶液493gを得た(固形分濃度1.74%)。また、シソ科シソ属のシソの葉を乾燥し、乾燥物25gを精製水250gに浸漬し、1,3-ブチレングリコールを250g添加した。添加後、4℃で抽出を行った。そして、抽出液をろ過し、褐色透明のシソ抽出物溶液448gを得た(固形分濃度1.02%)。以上の3種の植物抽出物を混合後、不溶物を濾過し、褐色透明の抽出物混合溶液1230gを得た(固形分濃度1.54%)。
[A成分] 部
オリーブ油 1.0
ポリオキシエチレン(5.5)セチルアルコール 5.0
ブチルパラベン 0.1
[B成分] 部
製造例1の混合物溶液 5.0
エタノール 5.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
香料 適量
A成分及びB成分をそれぞれ80℃以上に加温後、A成分にB成分を加えて攪拌し、さらにヒスコトロン(5000rpm)で2分間ホモジナイズを行った。これを50℃まで冷却した後、C成分を加えて攪拌混合し、さらに30℃以下まで冷却して化粧水を得た。
[A成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
大豆レシチン 1.5
[B成分] 部
製造例1の混合物溶液 3.0
L−アスコルビン酸−2−グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
グリセリン 3.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
香料 適量
上記のA成分とB成分をそれぞれ80℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを50℃まで冷却した後、C成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
処方例2のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてトラネキサム酸2.0部を用いるほかは処方例2と同様にして乳液を得た。
処方例2のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてアルブチン3.0部を用いるほかは処方例2と同様にして乳液を得た。
[A成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
大豆レシチン 1.5
[B成分] 部
製造例1の混合物溶液 5.0
L−アスコルビン酸−2−グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
アルブチン 3.0
グリセリン 3.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
エタノール 2.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
メチルパラベン 0.1
ヒアルロン酸 0.1
製造例1の混合物溶液 5.0
クエン酸 0.3
クエン酸ナトリウム 0.6
精製水 全量が100部となる量
精製水にヒアルロン酸を溶解させた後、残りの原料を順次加えて攪拌溶解させ、透明のエッセンスを得た。
[A成分] 部
ステアリン酸 2.4
モノステアリン酸プロピレングリコール 2.0
セトステアリルアルコール 0.2
液状ラノリン 2.0
流動パラフィン 3.0
ミリスチン酸イソプロピル 8.5
プロピルパラベン 0.05
[B成分] 部
製造例1の混合物溶液 5.0
カルボキシメチルセルロースナトリウム 0.2
ベントナイト 0.5
プロピレングリコール 4.0
トリエタノールアミン 1.1
メチルパラベン 0.1
精製水 全量が100部となる量
[C成分] 部
酸化チタン 8.0
タルク 4.0
着色顔料 適量
上記のA成分とB成分をそれぞれ加温した後混合攪拌した。これを再加温し、上記のC成分を添加して型に流し込み、室温になるまで攪拌してリキッドファンデーションを得た。
[成分] 部
l−メントール 0.8
製造例1の混合物溶液 2.0
1,3−ブチレングリコール 10.0
フェノキシエタノール 0.2
エタノール 20.0
精製水 全量が100部となる量
上記の成分を十分攪拌混合して育毛料を得た。
DPPH2.4部をエタノール20部に溶解し、これに精製水20部を加えてDPPH溶液を調製した。このDPPH溶液24部に対して、18v/v%エタノール溶液を19.2部、2M酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を4.8部加えて、DPPH添加溶液として調製した。また、抽出液そのものの色調が試験に及ぼす影響を差し引くため、DPPH溶液の代わりに50v/v%エタノール溶液を用いて、18v/v%エタノール溶液と2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を混合した液を対照液とした。次に、製造例1の混合物溶液を精製水で希釈して試料溶液を調製した。ここで、試料溶液は、当該混合物溶液の終濃度(溶液としての濃度)がそれぞれ0.1%、0.2%、0.6%となるように調製した3種の濃度のものを使用した。この試料溶液とDPPH添加溶液又は対照液とを1:3の割合で混合し、室温で10分静置後、各試験溶液をDPPH添加溶液と混合した場合の550nmにおける吸光度と、同じく各試験溶液を対照液と混合した場合の550nmにおける吸光度との差を測定し、DPPHラジカルの残存量を確認した。また、同時にコントロール(Control)として製造例1の混合物溶液の代わりに、50%1,3-ブチレングリコール水溶液を用いて上記と同様の操作を行い、ここに得られる DPPHラジカル残存率に対する各試料添加時のDPPHラジカル残存率の相対値を求めた。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として水溶性ビタミンEであるTrolox(終濃度5μM)を添加した場合についても、同様の試験を行った。
[表1]
0.2Mトリス塩酸緩衝液50μL、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム溶液20μL、0.75mMニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)溶液10μL、1mMキサンチン溶液20μL、0.06U/mLキサンチンオキシターゼ溶液50μL、製造例1の抽出物溶液50μLを混合して試料溶液を調製した。ここで、試料溶液は、当該混合物溶液の終濃度(溶液としての濃度)が0.1%、0.2%、0.6%になるように調製したものを用いた。この試料溶液を37℃、3分間インキュベートし、スーパーオキシドを発生させた。そして、NBTがスーパーオキシドによって還元されて生成するホルマザン量を570nmにおける吸光度を測定した。また、コントロール(Control)として、製造例1の混合物溶液の代わりに30%1,3−ブチレングリコール水溶液を用いて調製した溶液に対して同様の操作を行い、ここに得られる値を100として、各試料添加時のホルマザン量の相対値を求めた。また、陽性対照として、SOD(10unit)についても同様の操作を行った。
[表2]
本発明に係る混合物溶液の抗炎症効果をPEG2の生成抑制試験により評価した。ここで、PGE2は、皮膚の炎症を惹起する炎症性のケミカルメディエーターであって、紫外線や化学物質等の外的要因によりダメージを受けた皮膚細胞内で分泌される物質である。よって、本発明においては、このPGE2の生成抑制効果試験により、抗炎症効果を評価した。
ウサキ角膜由来細胞(SIRC)を、10%FBS含有イーグル最少必須培地に懸濁して96穴プレートに5.0×103個ずつ播種し、37℃で4日間培養した後、培養器の底面から100mJ/cm2の紫外線B波を照射し、その培養液に製造例1の混合物溶液(試料溶液)を添加した。ここで、試料溶液は、上記培養液全量に対する溶液としての終濃度が0.1%の濃度となるように添加した。添加後、2日間培養し、培養上清に分泌されたPGE2の量を、PGE2測定キット(カイマンケイミカル社製)を用いて測定した。また、試料溶液の代わりに50%1,3-ブチレングリコール水溶液を添加したものコントロールとし、上記と同様の操作によりPEG2の量を測定した。また、試料溶液の代わりに陽性対照としてインドメタシン10μMを用いた場合のPGE2の量も同様に測定した。さらに、試料溶液の代わりに50%1,3-ブチレングリコール水溶液を添加し24時間培養後、紫外線を照射しない対照区についてもPGE2の量を測定した。
[表3]
ヒト表皮細胞PHK16−0bを、HKGS(クラボウ社製)含有MCDB153培地(SIGMA社製)を入れた96穴マイクロプレートに1×104個/穴播種し、37℃,5.0%CO2の条件下に3日間プレ培養した後、製造例1の混合物溶液(試料溶液)を0.1%、0.5%の濃度(培地に対する溶液としての最終濃度)となるように培地に添加し、同条件でさらに4日間培養した。次に、培地を除去し、1mM Phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF)、1%Triton−X含有PBS(‐)溶液を20μL添加して5分間室温で静置して細胞を破砕し、粗酵素液とした。1mM 4−methylumbelliferyl−β−Glucopyranoside、10mM sodium taurocholate、0.1%Triton−Xin 0.1M citrate phosphate buffer (pH5.6)20μL添加して37℃条件下で1時間反応させた。反応終了後、0.2M carbonate bicarbonate buffer (pH10.5)を200μL添加して反応を停止させた。その後、反応液のEx355/Em460における蛍光強度を測定してβ-グルコセレブロシダーゼ活性値とした。また、試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加の場合(対照)についても上記と同様の操作を行い、ここに得られたβ-グルコセレブロシダーゼ活性値(100)に対する各試料添加区のβ-グルコセレブロシダーゼ活性の相対値を求め、この値をβ−グルコセレブロシダーゼ活性率(%)とした。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として0.005%ガラクトセレブロシド(GalCer)を添加した場合についても同様の試験を行った。
[表4]
リパーゼキットS(DSファーマバイオメディカル)を用いて、以下の測定を行った。1検体につき、ガラス製試験管を2本用意し、1本を検体用(A),他の1本は盲検用(B)とした。A、B両試験管に、発色液(5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)含有)1mL、製造例1の混合物溶液を含む試料溶液40μL(当該混合物溶液の溶液としての終濃度が1.0%)、リパーゼ(Sigma社製)液40μLを入れて混和した後、試験管Aにのみ基質液(三酪酸ジメルカプロール(BALB)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)含有)100μLを加え、混和後直ちに30±1℃で正確に30分間インキュベートした。インキュベーション終了後、直ちに試験管Aに反応停止液2mLを添加した。次いで、試験管Bに反応停止液2mLを添加し、さらに試験管Bにのみ基質液100μLを加えてもう一度混和した。検体(A)及び盲検(B)の吸光度を、波長415nmで測定した。検体(A)の波長415nmにおける吸光度から盲検(B)の波長415nmにおける吸光度を差し引いた値をリパーゼ活性とした。さらに、各試料溶液の代わりに精製水を用いて同様に試験を行い、ここに得られたリパーゼ活性を100としたときの各試料溶液のリパーゼ活性の相対値を求めた。
[表5]
アンドロゲン依存性増殖を示すマウス由来乳がん細胞SC‐3を、2%FBS(チャコールデキストリン処理)含有イーグル最少必須培地を入れた96穴マイクロプレートに5×103個/穴播種し、37℃,5.0%CO2の条件下に1日間プレ培養した後、製造例1の混合物溶液(試料溶液)を0.6%の濃度(溶液として終濃度)となるようにHMB培地(HAM培地:イーグル培地=1:1)を使って調製し、細胞培養系の培地と交換した。また、試料と併用して10nMのDHT(ジヒドロテストステロン[高活性型アンドロゲン])を添加する区としない区を設定した。同条件でさらに3日間培養した。次に、培地を除去し、0.03%のMTTを添加して37℃に1時間保持した後、生成したホルマザンをイソプロパノールで抽出し、マイクロプレートリーダー(Model 680、バイオラッド社製)を用いて波長570−630nmでMTT値を測定した。試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加(Control)の場合についても上記と同様の操作を行い、DHT添加区のControlにおいて得られたMTT値に対する各試料添加時のMTT値、及びDHT無添加区のControlにおいて得られたMTT値の相対値を求め、SC−3細胞の増殖率(%)とした。
[表6]
健常な被験者に対し、市販の洗顔料を用いて洗顔、さらに75%エタノールにて両頬部を清拭した後、室温20℃、湿度50〜60%の部屋に入室してもらった。30分間の安静の後、Sebumeter(登録商標)SM815(Courage+Khazaka(ドイツ)社製)を用いて両頬の皮脂量を測定し、これを各被験者の初期値とした。製造例1の混合物溶液(試料溶液)を溶液としての終濃度が2%となるように添加したローション(A)と試料の代わりに精製水を含むローション(B)「Control」を用意し、Aを左頬、Bを右頬に1日2回朝夜塗布してもらった(塗布時は被験者にはどちらが試料ローションか分からない様に、所謂ブラインドの状態で塗布してもらった)。2週間後、4週間後に、初期値の測定と同様の方法で各被験部(両頬)の皮脂量を測定した。
[表7]
本試験例8では、正常皮膚において表皮角層の剥離を促し、表皮角層のターンオーバーの正常化に影響を与えるキモトリプシン型セリンプロテアーゼ(カリクレイン−7)の活性亢進について評価した。
[試験方法]
正常ヒト表皮角化細胞を増殖添加剤含有HuMedia-KB2[登録商標](クラボウ社製)にて2×105個/mLに調製し、96穴マイクロプレートに100μLを播種して、5%炭酸ガス、飽和水蒸気下、37℃で培養した。24時間後、本発明の製造例1に係る混合物溶液(試料溶液)を含んだ培養液を追添加して培養した。ここで、試料溶液は、培養液全量に対して溶液として終濃度が0.5%,1.0%となるように調製した。また、終濃度が1.0%となるように50%1,3−ブチレングリコールを含んだ培養液を追添加した試験区をコントロール(control)として設定した。72時間後、それぞれの試験区の細胞培養上清を除去し0.14M塩化ナトリウムおよび0.1%Tween20を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)20μLを用いて細胞を破砕したものを粗酵素液とした。粗酵素液に対し、バッファーとして0.1% Tween20を含む100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.8)30μL、基質として100mMのSuc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを含む上記バッファー50μLを加え、撹拌しながら37℃で1時間反応させた。反応終了後、蛍光プレートリーダ―(フルオロスキャン アセント、Thermo Labsystems社製)を用いて蛍光強度(励起波長:355nm、蛍光波長:460nm)を測定し、これをカリクレイン-7活性とした。また、同様の培養操作を行った別プレートを用意し、培養上清を除去した後、Hoechst33342溶液100μLを添加し、37℃で1時間反応させた。反応終了後、蛍光プレートリーダーを用いて蛍光強度(励起波長:355nm、蛍光波長:460nm)を測定し、DNA量とした。得られた数値を用いて、DNA当たりのカリクレイン-7活性を算出した。
[表8]
Claims (1)
- ボタン科(Paeoniaceae)ボタン属(Paeonia)に属するシャクヤクの根の抽出物、バラ科(Rosaceae)サクラ属(Prunus)に属するモモの種子の抽出物、及びシソ科(Lamiaceae)シソ属(Perilla)に属するシソの葉の抽出物を含有する皮膚外用剤。
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