JP6664006B2 - 観察装置 - Google Patents
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Description
本発明は、観察装置に関するものである。
従来、蛍光標識された細胞等の被写体の形状を観察する装置として、位相差観察法や微分干渉観察法を用いた観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
しかしながら、特許文献１の観察装置は、被写体を挟んで撮影光学系と照明光学系とを配置する必要があり、装置が大型化、複雑化するという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、蛍光標識された細胞等の被写体の蛍光像および被写体の形状を観察することができる観察装置を提供することを目的としている。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、蛍光標識された細胞等の被写体の蛍光像および被写体の形状を観察することができる観察装置を提供することを目的としている。
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光源部と、前記試料の上方から該試料に向けて励起光を射出する励起光源部と、前記照明光源部から射出された前記照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光、および、前記励起光源部から射出された前記励起光の照射によって前記試料において発生する蛍光を、前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える観察装置を提供する。
本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光源部と、前記試料の上方から該試料に向けて励起光を射出する励起光源部と、前記照明光源部から射出された前記照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光、および、前記励起光源部から射出された前記励起光の照射によって前記試料において発生する蛍光を、前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える観察装置を提供する。
本態様によれば、光源部から発せられた照明光は試料の下方から上方に向けて射出された後、試料の上方において反射されて試料を上方から下方に透過させられる。一方、光源部から発せられた励起光は試料に向けて照射され試料において蛍光を発生させる。試料を透過した透過光および試料において発生した蛍光は、試料の下方に配置されている撮影光学系によって撮影される。光源部および撮影光学系の両方を試料の下方に配置したので、装置を大型化させることなく、透過光を撮影することにより細胞等の被写体の形状を観察することができ、蛍光を撮影することにより試料の蛍光像を観察することができる。
本発明の参考例としての発明の参考態様においては、前記撮影光学系が、前記試料を透過した前記透過光および前記蛍光を集光する対物レンズを備え、前記光源部が、前記対物レンズの径方向外方から前記試料の上方に前記照明光および前記励起光を射出してもよい。
このようにすることで、試料の下方に配置された対物レンズの径方向外方に配置された光源部から試料の上方に向けて射出された照明光が、試料の上方においては反射されて、対物レンズの光軸に対して斜め上方から試料に入射し、試料を透過した透過光が撮影光学系により撮影される。試料への入射角度を適切に設定することにより、試料の像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができる。
このようにすることで、試料の下方に配置された対物レンズの径方向外方に配置された光源部から試料の上方に向けて射出された照明光が、試料の上方においては反射されて、対物レンズの光軸に対して斜め上方から試料に入射し、試料を透過した透過光が撮影光学系により撮影される。試料への入射角度を適切に設定することにより、試料の像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができる。
本発明の参考例としての発明の参考態様においては、前記撮影光学系が、前記試料を透過した前記透過光および前記蛍光を集光する対物レンズを備え、前記光源部が、前記対物レンズの径方向外方から前記照明光を照射し、前記対物レンズを経由して前記励起光を前記試料に照射してもよい。
このようにすることで、対物レンズを経由して強度の高い励起光を試料に照射し、試料の明るい蛍光像を観察することができる。
このようにすることで、対物レンズを経由して強度の高い励起光を試料に照射し、試料の明るい蛍光像を観察することができる。
上記態様においては、前記撮影光学系が、前記試料を透過した前記透過光および前記蛍光を集光する対物レンズを備え、前記照明光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から独立して前記照明光を射出可能であってもよい。
このようにすることで、光源部から射出される照明光の径方向位置を異ならせることで、試料の上方に配置された同一の反射面によって反射された反射光の試料への入射角度を変化させることができる。すなわち、対物レンズの径方向の近い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して小さい角度をなして試料に入射する一方、対物レンズの径方向に遠い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して大きな角度をなして試料に入射する。これにより、対物レンズの取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズの取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズの取り込み角と同等の入射角の場合は、試料が立体的に見える偏斜照明とすることができる。
このようにすることで、光源部から射出される照明光の径方向位置を異ならせることで、試料の上方に配置された同一の反射面によって反射された反射光の試料への入射角度を変化させることができる。すなわち、対物レンズの径方向の近い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して小さい角度をなして試料に入射する一方、対物レンズの径方向に遠い位置から射出された照明光の反射光は、光軸に対して大きな角度をなして試料に入射する。これにより、対物レンズの取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズの取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズの取り込み角と同等の入射角の場合は、試料が立体的に見える偏斜照明とすることができる。
本発明の参考例としての発明の参考態様においては、前記照明光源部が、前記対物レンズの周方向に異なる位置から同時に前記照明光を射出可能であってもよい。
このようにすることで、対物レンズの周方向に複数位置から同時に照明光が照射され、照明ムラを低減することができる。
このようにすることで、対物レンズの周方向に複数位置から同時に照明光が照射され、照明ムラを低減することができる。
上記態様においては、前記撮影光学系が、前記試料を透過した前記透過光および前記蛍光を集光する対物レンズを備え、前記光源部が、前記対物レンズの周囲に配列され、独立して点灯可能な複数の光源を備えていてもよい。
このようにすることで、複数の光源の内のいずれかを点灯させることにより、照明光および励起光の周方向位置を決定することができる。そして、点灯させる光源の周方向位置を切り替えることにより、異なる方向から照明された試料の像を撮影することができる。特に、偏斜照明の像においては、異なる陰影の付き方の像を撮影することができる。
このようにすることで、複数の光源の内のいずれかを点灯させることにより、照明光および励起光の周方向位置を決定することができる。そして、点灯させる光源の周方向位置を切り替えることにより、異なる方向から照明された試料の像を撮影することができる。特に、偏斜照明の像においては、異なる陰影の付き方の像を撮影することができる。
本発明の参考例としての発明の参考態様においては、前記光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から同時に前記励起光を射出可能であってもよい。
このようにすることで、より多くの励起光を試料に照射して、試料の明るい蛍光像を観察することができる。
このようにすることで、より多くの励起光を試料に照射して、試料の明るい蛍光像を観察することができる。
上記態様においては、前記照明光源部から射出される前記照明光および前記励起光源部から射出される前記励起光が同一の波長を有し、前記撮影光学系が、前記照明光または前記蛍光を選択的に透過する検出光切替部を備えていてもよい。
このようにすることで、照明光のみが透過されるように検出光切替部を切り替えることにより、試料における照明光の透過光を観察することができ、蛍光のみが透過されるように検出光切替部を切り替えることにより、試料の蛍光像を観察することができる。
このようにすることで、照明光のみが透過されるように検出光切替部を切り替えることにより、試料における照明光の透過光を観察することができ、蛍光のみが透過されるように検出光切替部を切り替えることにより、試料の蛍光像を観察することができる。
上記態様においては、前記撮影光学系が、前記照明光および前記蛍光を透過し前記励起光を遮断する波長特性を有するバリアフィルタを備えていてもよい。
このようにすることで、検出する必要のない励起光をバリアフィルタによって遮断し、試料における照明光の透過光および試料の蛍光像を鮮明に観察することができる。
このようにすることで、検出する必要のない励起光をバリアフィルタによって遮断し、試料における照明光の透過光および試料の蛍光像を鮮明に観察することができる。
上記態様においては、前記照明光を略平行光にする光学素子と、前記照明光を拡散させる拡散板とを備えていてもよい。
このようにすることで、光学素子と拡散板とによって照明光を略平行光でムラの無いロバスト性の高い照明に、励起光はムラ無く効率的に利用し照射することができる。
このようにすることで、光学素子と拡散板とによって照明光を略平行光でムラの無いロバスト性の高い照明に、励起光はムラ無く効率的に利用し照射することができる。
上記態様においては、前記励起光の波長帯域のみを透過させるバンドパスフィルタを備えていてもよい。
このようにすることで、広帯域の光源を用いることができ、バンドパスフィルタによって観察に必要な照明光および励起光の波長帯域のみを切り出して利用することができる。
このようにすることで、広帯域の光源を用いることができ、バンドパスフィルタによって観察に必要な照明光および励起光の波長帯域のみを切り出して利用することができる。
上記態様においては、前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射されてもよい。
このようにすることで、内部に試料を収容した天板を有する容器を光源部および撮影光学系の上方に配置するだけで、光源部から射出された照明光を容器の天板内面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
このようにすることで、内部に試料を収容した天板を有する容器を光源部および撮影光学系の上方に配置するだけで、光源部から射出された照明光を容器の天板内面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
上記態様においては、前記照明光が、前記試料の上方に配置された反射部材によって反射されてもよい。
このようにすることで、シャーレ（蓋なし）のように天板を有しない容器や細胞培養バッグ内に収容された試料を観察する場合において、試料の上方に反射部材を配置することにより、光源部から射出された照明光を反射部材において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
このようにすることで、シャーレ（蓋なし）のように天板を有しない容器や細胞培養バッグ内に収容された試料を観察する場合において、試料の上方に反射部材を配置することにより、光源部から射出された照明光を反射部材において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
上記態様においては、前記試料が、溶液内に浸されており、前記照明光が、前記溶液の上方の液面によって反射されてもよい。
このようにすることで、天板を有しない容器や、反射部材を配置できない容器内に収容された試料を観察する場合において、光源部から射出された照明光を溶液の液面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
このようにすることで、天板を有しない容器や、反射部材を配置できない容器内に収容された試料を観察する場合において、光源部から射出された照明光を溶液の液面において反射させ、容器内の試料に照射させることができる。
本発明の参考例としての発明の参考態様においては、前記撮影光学系が、前記照明光の撮影と前記蛍光の撮影とを切り替える撮影光切替部を備え、前記撮影光学系により取得された透過照明光画像と蛍光画像とを重ね合わせる画像処理部を備えていてもよい。
このようにすることで、画像処理部により重ね合わせられた透過照明光画像および蛍光画像により、細胞等の被写体の形状と、細胞内部の構造とを同時に観察することができる。
このようにすることで、画像処理部により重ね合わせられた透過照明光画像および蛍光画像により、細胞等の被写体の形状と、細胞内部の構造とを同時に観察することができる。
本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光源部と、前記試料の上方から励起光を射出する励起光源部と、前記照明光源部から射出された前記照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光および前記励起光源部から射出された前記励起光の照射によって前記試料において発生する蛍光を前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える。
このようにすることで、強度の高い励起光を試料に照射して、励起光の照射方向とは反対側に射出された明るい透過蛍光を試料の下方において撮影し、観察することができる。
本発明の他の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光射出ステップと、該照明光射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮像する透過光撮像ステップと、前記試料に向けて前記試料の上方から励起光を照明する励起光射出ステップと、該励起光射出ステップにより射出された励起光によって前記試料において発生した蛍光を前記試料の下方において撮像する蛍光撮像ステップとを含む観察方法である。
上記他の一態様においては、前記撮像ステップにおいて取得された透過照明画像と前記蛍光撮像ステップにおいて取得された蛍光画像とを重ね合わせる画像合成ステップとを含むこととしてもよい。
本発明の他の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光射出ステップと、該照明光射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮像する透過光撮像ステップと、前記試料に向けて前記試料の上方から励起光を照明する励起光射出ステップと、該励起光射出ステップにより射出された励起光によって前記試料において発生した蛍光を前記試料の下方において撮像する蛍光撮像ステップとを含む観察方法である。
上記他の一態様においては、前記撮像ステップにおいて取得された透過照明画像と前記蛍光撮像ステップにおいて取得された蛍光画像とを重ね合わせる画像合成ステップとを含むこととしてもよい。
本発明によれば、蛍光標識された細胞等の被写体の蛍光像および被写体の形状を観察することができるという効果を奏する。
本発明の参考例としての発明の一実施形態に係る観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、試料Ｘを収容した容器２を載置するステージ３と、該ステージ３の下方に配置され入射して来る光を集光する対物レンズ４を備え、該対物レンズ４により集光された光を撮影する撮影光学系６と、対物レンズ４の径方向外方に配置され、ステージ３を透過して上方に照明光および励起光を射出する光源部５とを備えている。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、試料Ｘを収容した容器２を載置するステージ３と、該ステージ３の下方に配置され入射して来る光を集光する対物レンズ４を備え、該対物レンズ４により集光された光を撮影する撮影光学系６と、対物レンズ４の径方向外方に配置され、ステージ３を透過して上方に照明光および励起光を射出する光源部５とを備えている。
ステージ３には、対物レンズ４および光源部５の上方を覆うように、光学的に透明な材質、例えば、ガラス板３ａが配置され、容器２はガラス板３ａの上面に載置されるようになっている。
容器２は、例えば、天板２ａを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。
容器２は、例えば、天板２ａを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。
光源部５は、図１および図２に示されるように、対物レンズ４の周囲に、周方向および径方向に間隔をあけて複数配置されたＬＥＤ光源（光源）７ａ，７ｂと、各ＬＥＤ光源７ａ，７ｂに対応して配置され、各ＬＥＤ光源７ａ，７ｂにおいて発生した照明光を略平行光にする複数のコリメートレンズ（光学素子）８ａおよび励起光を集光する複数の集光レンズ（光学素子）８ｂと、該コリメートレンズ８ａによりコリメートされた照明光および該集光レンズ８ｂにより集光された励起光を拡散させる拡散板９とを備えている。
また、ＬＥＤ光源７ａの拡散板９と照明光を略平行光にするコリメートレンズ８ａとを一体型にしたもの（例えば、フレネルレンズ等）を用いてもよい。
また、ＬＥＤ光源７ａの拡散板９と照明光を略平行光にするコリメートレンズ８ａとを一体型にしたもの（例えば、フレネルレンズ等）を用いてもよい。
ＬＥＤ光源（照明光源部）７ａは照明光を発生し、ＬＥＤ光源（励起光源部）７ｂは励起光を発生するようになっている。
光源部５は、特定のＬＥＤ光源７ａ，７ｂを独立して、または同時に、点灯させることができるようになっている（図１および図２は、点灯している照明光用のＬＥＤ光源７ａをハッチングによって示している。）。
すなわち、対物レンズ４の径方向に異なる位置の照明光用のＬＥＤ光源７ａのみを点灯させることで、図１に実線で示されるように、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過した後、容器２の天板２ａ内面において反射して、斜め上方から試料Ｘ、容器２の底面２ｂおよびガラス板３ａを透過して対物レンズ４に入射する照明光の角度を、破線で示されるように切り替えることができるようになっている。
光源部５は、特定のＬＥＤ光源７ａ，７ｂを独立して、または同時に、点灯させることができるようになっている（図１および図２は、点灯している照明光用のＬＥＤ光源７ａをハッチングによって示している。）。
すなわち、対物レンズ４の径方向に異なる位置の照明光用のＬＥＤ光源７ａのみを点灯させることで、図１に実線で示されるように、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過した後、容器２の天板２ａ内面において反射して、斜め上方から試料Ｘ、容器２の底面２ｂおよびガラス板３ａを透過して対物レンズ４に入射する照明光の角度を、破線で示されるように切り替えることができるようになっている。
また、対物レンズ４の周方向に特定位置の照明光用のＬＥＤ光源７ａのみを点灯させることにより、試料Ｘに対して周方向の特定の方向からのみ照明することができるようになっている。また、図２に示されるように、対物レンズ４の周方向に２以上の方向、特に、対物レンズ４の光軸Ｓに対して軸対称の方向に配置された照明光用のＬＥＤ光源７ａを点灯させることにより、照明ムラを低減した照明光を試料Ｘに対して照射することができるようになっている。
また、励起光用のＬＥＤ光源７ｂは、例えば、図２に二重の円で示されるように、対物レンズ４に最も近い位置に周方向に沿って配列されている。同じ径方向位置に配置されている照明光用のＬＥＤ光源７ａと比較して、励起光用のＬＥＤ光源７ｂの数を多くすることにより、励起光の強度を大きくして、蛍光の光量を大きくするようになっている。
これらの励起光用のＬＥＤ光源７ｂから発せられる励起光は、そのほぼ全部が、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から透過して、底面２ｂ上の対物レンズ４の視野範囲に配置されている試料Ｘに直接照射されるようにＬＥＤ光源７ｂ、集光レンズ８ｂおよび拡散板９が、照明光用のＬＥＤ光源７ａ等と比較して内向きに傾けられて設置されている。励起光の一部は、照明光と同様にして底面２ｂを透過し、容器２の天板２ａにおいて反射して試料Ｘに上方から照射されることにより、試料Ｘにおいて蛍光を発生させるようになっている。
照明光用のＬＥＤ光源７ａと、励起光用のＬＥＤ光源７ｂとは、異なる波長の照明光および励起光を射出するようになっている。
撮影光学系６は、ガラス板３ａと対物レンズ４との間に配置されたバリアフィルタ１０と、対物レンズ４により集光された照明光の透過光または蛍光を撮影する撮像素子１１とを備えている。
撮影光学系６は、ガラス板３ａと対物レンズ４との間に配置されたバリアフィルタ１０と、対物レンズ４により集光された照明光の透過光または蛍光を撮影する撮像素子１１とを備えている。
バリアフィルタ１０は、照明光用のＬＥＤ光源７ａから発せられた照明光および試料Ｘにおいて発生した蛍光を透過し、励起光用のＬＥＤ光源７ｂから発せられた励起光は遮断する波長特性を有している。
このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１を用いて細胞のように透明な試料Ｘの形状および蛍光像の観察を行うには、図１に示されるように、蛍光標識された試料Ｘを容器２内に収容し、底面２ｂに接着させた状態で、容器２を底面２ｂが下側になるようにステージ３のガラス板３ａ上に載置する。
本実施形態に係る観察装置１を用いて細胞のように透明な試料Ｘの形状および蛍光像の観察を行うには、図１に示されるように、蛍光標識された試料Ｘを容器２内に収容し、底面２ｂに接着させた状態で、容器２を底面２ｂが下側になるようにステージ３のガラス板３ａ上に載置する。
そして、この状態で、光源部５のいずれかのＬＥＤ光源７ａ，７ｂを作動させて照明光または励起光を発生させる。照明光用のＬＥＤ光源７ａを作動させた場合には、照明光用のＬＥＤ光源７ａにおいて発生した照明光は、該ＬＥＤ光源７ａに対応して配置されているコリメートレンズ８ａによって略平行光にされ、拡散板９によって拡散されてムラの無いロバスト性の高い状態で、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過し、容器２の天板２ａ内面において反射して試料Ｘに対して斜め上方から照射される。
試料Ｘに照射された照明光のうち、試料Ｘを透過した照明光の透過光が容器２の底面２ｂおよびガラス板３ａを上から下に向かって透過して、バリアフィルタ１０を透過し、対物レンズ４に入射する。この際、照明光は試料Ｘの形状や屈折率によって屈折、散乱され、あるいは、試料Ｘの透過率によって減光されることで、試料Ｘの情報を載せた透過光となって対物レンズ４により集光され、撮像素子１１によって撮影される。
一方、励起光用のＬＥＤ光源７ｂを作動させた場合には、ＬＥＤ光源７ｂにおいて発生した励起光は、ＬＥＤ光源７ｂに対応して配置されている集光レンズ８ｂによって集光され、拡散板９によって拡散された状態で、ガラス板３ａおよび容器２の底面２ｂを下から上に向かって透過し、容器２の底面２ｂに接着している試料Ｘに直接照射される。励起光の照射によって、試料Ｘにおいて発生した蛍光は、全方向に射出されるが、その内、底面２ｂおよびガラス板３ａを透過した蛍光の一部がバリアフィルタ１０を透過して対物レンズ４により集光され、撮像素子１１によって撮影される。試料Ｘ、底面２ｂおよびガラス板３ａにおいて反射した励起光は、バリアフィルタ１０によって下方に透過しないように遮断される。
このように、本実施形態に係る観察装置１によれば、試料Ｘの下方に光源部５および対物レンズ４を含む撮影光学系６を配置しているので、従来、試料を挟んだ両側に光源部と撮影光学系とを配置していた透過光の観察装置と比較すると、試料Ｘの片側のみに光源部５および撮影光学系６を集約し、装置を薄型化することができるという利点がある。また、そのように薄型化した観察装置１においても、透過光を撮影することにより細胞等の被写体の形状および被写体の蛍光像を観察することができるという利点がある。
また、光源部５からの照明光は、対物レンズ４の径方向外方から射出され容器２の天板２ａ内面において反射することにより、試料Ｘに対して斜め上方から照射されて対物レンズ４により集光されるので、試料Ｘへの入射角度を適切に設定することにより、試料Ｘの像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができるという利点がある。
また、本実施形態においては、光源部５が、対物レンズ４の周囲に径方向に配列され、独立して点灯可能な複数の照明光用のＬＥＤ光源７ａを備えているので、図１に破線で示されるように、点灯する照明光用のＬＥＤ光源７ａの径方向位置を異ならせることにより、試料Ｘに入射する照明光の照射角度を変化させることができる。これにより、対物レンズ４の取り込み角より小さい入射角の場合は、照明ムラの少ない明視野照明とし、また対物レンズ４の取り込み角より大きい入射角の場合は、微細構造が強調される暗視野照明とし、さらに対物レンズ４の取り込み角と同等の入射角の場合は、試料Ｘが立体的に見える偏斜照明とすることができる。
また、本実施形態においては、光源部５が、対物レンズ４の周囲に周方向に配列され、独立して点灯可能な複数の照明光用のＬＥＤ光源７ａを備えているので、点灯する照明光用のＬＥＤ光源７ａの周方向位置を異ならせることにより、試料Ｘに入射する照明光の照射方向を変化させることができる。これにより、形成される試料Ｘの像の陰影の方向を変化させ、見え方を変更することができる。
また、図２に示されるように、周方向に異なる位置の複数の照明光用のＬＥＤ光源７ａを同時に点灯させることにより、特に、軸対称に配置される複数の照明光用のＬＥＤ光源７ａを同時に点灯させることにより、照明ムラを低減してムラの少ない試料Ｘの画像を取得することができるという利点がある。
また、本実施形態においては、各ＬＥＤ光源７ａに対応して拡散板９が備えられているので、照明光用のＬＥＤ光源７ａから発せられた照明光が均一に拡散され，照明ムラの少ない均一な強度の照明光を試料Ｘに照射することができる。
また、本実施形態によれば、励起光用のＬＥＤ光源７ｂ、集光レンズ８ｂおよび拡散板９を、ほとんどの励起光が、試料Ｘに直接照射する方向に射出されるように傾けられているので、強度の高い励起光を試料Ｘに照射して、試料Ｘの明るい蛍光像を観察することができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、励起光用のＬＥＤ光源７ｂ、集光レンズ８ｂおよび拡散板９を内向きに傾けることで、発生した励起光が、試料Ｘに直接照射する方向に指向されるようにしたが、これに代えて、励起光用のＬＥＤ光源７ｂ等を傾けることなく、図示しないプリズムのような偏向素子を配置して励起光を試料Ｘに指向させることにしてもよい。
また、本実施形態においては、細胞培養フラスコのような天板２ａを有する容器２内に試料Ｘを収容し、容器２の天板２ａ内面において照明光および／または励起光を反射させることとしたが、これに限定されるものではない。例えば、容器として、シャーレ（蓋なし）のように天板を有しない容器１３に試料Ｘを収容した場合には、図３に示されるように、シャーレの上部開口を閉塞する位置にミラーのような反射部材１４を配置し、反射部材１４によって底面１３ｂを下から上に向かって透過した照明光および／または励起光を反射することにしてもよい。反射部材１４は、直動によりあるいは揺動により試料Ｘの上方位置に挿脱可能に設けられていてもよい。この場合、反射部材１４としては、再帰反射部材を採用してもよい。また、この反射部材１４は、遮光部材を兼ねており、外部からの外光が反射部材１４によって遮蔽されるため、外光が容器１３内に入射することを抑制し、効率的に観察を行うことができる。
また、容器として、シャーレ（蓋なし）のように天板を有しない容器１３に試料Ｘを収容した場合には、図４に示されるように、容器１３内に溶液（例えば、培養培地やリン酸緩衝液等）Ｌを入れて試料Ｘを溶液内に浸し、溶液上方の液面によって底面１３ｂを下から上に向かって透過した照明光を反射することにしてもよい。天板２ａを有する容器２に試料Ｘを収容した場合も、容器２内に溶液（例えば、培養培地やリン酸緩衝液等）Ｌを入れて試料Ｘを溶液内に浸してもよい。
また、本実施形態においては、図５に示されるように、天板２ａの上方に光を遮蔽する材質からなる遮光部材１５を備えていてもよい。
このようにすることで、外部からの外光が遮光部材１５によって遮蔽されるため、外光が天板２ａから容器２内に入射することを抑制し、効率的に観察を行うことができる。
このようにすることで、外部からの外光が遮光部材１５によって遮蔽されるため、外光が天板２ａから容器２内に入射することを抑制し、効率的に観察を行うことができる。
また、本実施形態においては、光源部５として、照明光用のＬＥＤ光源７ａ、コリメートレンズ８ａおよび拡散板９をガラス板３ａに沿うように略水平に配置したものを例示したが、これに代えて、図６に示されるように、照明光用のＬＥＤ光源７ａ、コリメートレンズ８ａおよび拡散板９についても光軸Ｓに向けて傾けて配置してもよい。
このようにすることで、照明光用のＬＥＤ光源７ａから発せられる照明光のロスを抑制し、効率的に照明光を試料Ｘに照射することができる。
また、本実施形態においては、光源部５として、コリメートレンズ８ａ（または、集光レンズ８ｂ）および拡散板９を備えるものを例示したが、コリメートレンズ８ａ（または、集光レンズ８ｂ）および拡散板９を備えていなくてもよい。また、コリメートレンズ８ａ（または、集光レンズ８ｂ）および拡散板９の配置が逆でもよい。
このようにすることで、照明光用のＬＥＤ光源７ａから発せられる照明光のロスを抑制し、効率的に照明光を試料Ｘに照射することができる。
また、本実施形態においては、光源部５として、コリメートレンズ８ａ（または、集光レンズ８ｂ）および拡散板９を備えるものを例示したが、コリメートレンズ８ａ（または、集光レンズ８ｂ）および拡散板９を備えていなくてもよい。また、コリメートレンズ８ａ（または、集光レンズ８ｂ）および拡散板９の配置が逆でもよい。
また、本実施形態においては、照明光用のＬＥＤ光源７ａと励起光用のＬＥＤ光源７ｂとが異なる波長の照明光と励起光とを射出することとしたが、これに代えて、広帯域の光を発生する共通のＬＥＤ光源（光源）７ｃを用い、励起光用のＬＥＤ光源７ｃには、図７に示されるように、ＬＥＤ光源７ｃから発せられた光から狭帯域の励起光を切り出す励起フィルタ１２を配置することにしてもよい。
また、本実施形態においては、対物レンズ４の径方向外方に配列された励起光用のＬＥＤ光源７ｂから励起光を射出する場合を例示したが、これに代えて、図８に示されるように、励起光用のＬＥＤ光源７ｂから発せられた励起光をダイクロイックミラー１６によって偏向して対物レンズ４の下方から対物レンズ４に入射させ、対物レンズ４を介して集光された励起光を試料Ｘに下方から照射することにしてもよい。これにより、試料Ｘにおいて発生した蛍光は対物レンズ４により集光され、ダイクロイックミラー１６およびバリアフィルタ１０を透過した部分が撮像素子１１により撮影される。
このようにすることで、対物レンズ４によって強度の高い励起光を試料Ｘに落射照明して、試料Ｘの明るい蛍光像を観察することができる。
このようにすることで、対物レンズ４によって強度の高い励起光を試料Ｘに落射照明して、試料Ｘの明るい蛍光像を観察することができる。
また、励起光用のＬＥＤ光源７ｂに、複数の異なる波長の励起光を切り出す励起フィルタ１２を配置し、異なる波長の蛍光を透過可能な複数のバリアフィルタ１０を択一的に、対物レンズ４とガラス板３ａとの間に挿脱することにしてもよい。異なる波長特性を有する励起フィルタ１２を択一的に点灯させることで、試料Ｘに照射する励起光の波長を切り替えることができる。また、バリアフィルタ１０を挿脱する方法としては、例えば、フィルタホイールを採用すればよい。これにより、複数の異なる波長の蛍光を観察することができる。
この場合に、例えば、図９に示されるように、バリアフィルタ１０として、照明光および蛍光を透過し、励起光を遮断する波長特性を有するバンドパスフィルタを採用すればよい。
また、照明光用のＬＥＤ光源７ａと励起光用のＬＥＤ光源７ｂとを択一的に作動させる撮影光切替部（図示略）を作動させて、撮像素子１１により別々に取得された透過照明画像と蛍光画像とを重ね合わせる画像処理部（図示略）を備えていてもよい。画像処理部により重ね合わせられた合成画像をモニタ等の表示部（図示略）に表示することにより、試料Ｘの形状と試料Ｘ内部の構造とを同時に観察することができる。
また、照明光と励起光とが異なる波長を有する場合について説明したが、これに代えて、同一波長の照明光および励起光を照射し、バリアフィルタ（検出光切替部）１０として、照明光と蛍光とを択一的に透過することができるものを採用してもよい。
ＬＥＤ光源７ａ、ＬＥＤ光源７ｂにかえ、レーザー等の光源を採用することができる。
また、本実施形態においては、照明光および励起光の両方を、ステージ３の下方に配置したＬＥＤ光源７ａ，７ｂから上方に向かって射出することとした。本発明の一実施形態に係る観察装置１は、図１０に示されるように、励起光については、遮光部材１５の上方からライトガイド等によって導いてきた光から励起フィルタ１７によって切り出した励起光を下方の試料Ｘに向けて照射する。これにより、強度の高い励起光を照射して、試料Ｘを透過する方向に発生した蛍光を撮影して、試料Ｘの明るい蛍光像を観察することができる。
１ 観察装置
２ 容器
２ａ 天板
４ 対物レンズ
５ 光源部
６ 撮影光学系
７ａ ＬＥＤ光源（光源、照明光源部）
７ｂ ＬＥＤ光源（光源、励起光源部）
７ｃ ＬＥＤ光源（光源）
８ａ コリメートレンズ（光学素子）
８ｂ 集光レンズ（光学素子）
９ 拡散板
１０ バリアフィルタ（検出光切替部、バンドパスフィルタ）
１４ 反射部材
Ｘ 試料
２ 容器
２ａ 天板
４ 対物レンズ
５ 光源部
６ 撮影光学系
７ａ ＬＥＤ光源（光源、照明光源部）
７ｂ ＬＥＤ光源（光源、励起光源部）
７ｃ ＬＥＤ光源（光源）
８ａ コリメートレンズ（光学素子）
８ｂ 集光レンズ（光学素子）
９ 拡散板
１０ バリアフィルタ（検出光切替部、バンドパスフィルタ）
１４ 反射部材
Ｘ 試料
Claims (12)
- 試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光源部と、
前記試料の上方から該試料に向けて励起光を射出する励起光源部と、
前記照明光源部から射出された前記照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光、および、前記励起光源部から射出された前記励起光の照射によって前記試料において発生する蛍光を、前記試料の下方において撮影する撮影光学系とを備える観察装置。 - 前記撮影光学系が、前記試料を透過した前記透過光および前記蛍光を集光する対物レンズを備え、
前記照明光源部が、前記対物レンズの径方向に異なる位置から独立して前記照明光を射出可能である請求項１に記載の観察装置。 - 前記撮影光学系が、前記試料を透過した前記透過光および前記蛍光を集光する対物レンズを備え、
前記照明光源部が、前記対物レンズの周囲に配置され、独立して点灯可能な複数の光源を備える請求項１に記載の観察装置。 - 前記照明光源部から射出される前記照明光および前記励起光源部から射出される前記励起光が同一の波長を有し、
前記撮影光学系が、前記照明光または前記蛍光を選択的に透過する検出光切替部を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の観察装置。 - 前記撮影光学系が、前記照明光および前記蛍光を透過し前記励起光を遮断する波長特性を有するバリアフィルタを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の観察装置。
- 前記照明光を略平行光にする光学素子と、前記照明光を拡散させる拡散板とを備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
- 前記励起光の波長帯域のみを透過させるバンドパスフィルタを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の観察装置。
- 前記試料が、光学的に透明な材質からなる容器内に収容され、
前記照明光が前記試料の上方に配置されている前記容器の天板内面によって反射される請求項１から請求項７のいずれかに記載の観察装置。 - 前記照明光が、前記試料の上方に配置された反射部材によって反射される請求項１から請求項７のいずれかに記載の観察装置。
- 前記試料が、溶液内に浸されており、
前記照明光が、前記溶液の上方の液面によって反射される請求項１から請求項７のいずれかに記載の観察装置。 - 試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光射出ステップと、
該照明光射出ステップにより射出された照明光を前記試料の上方において反射する反射ステップと、
該反射ステップにより反射された照明光を前記試料に透過させる透過ステップと、
該透過ステップにより前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において撮像する透過光撮像ステップと、
前記試料に向けて前記試料の上方から励起光を照明する励起光射出ステップと、
該励起光射出ステップにより射出された励起光によって前記試料において発生した蛍光を前記試料の下方において撮像する蛍光撮像ステップと、
を含む観察方法。 - 請求項１１に記載の観察方法において、
前記撮像ステップにおいて取得された透過照明画像と前記蛍光撮像ステップにおいて取得された蛍光画像とを重ね合わせる画像合成ステップと、
を含む観察方法。
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