JP6647302B2

JP6647302B2 - Ｓｆｒｐ５由来ペプチド断片およびそれを含有する皮膚美白用化粧料組成物

Info

Publication number: JP6647302B2
Application number: JP2017527690A
Authority: JP
Inventors: ハン，チャンヒ; イム，トンヨン
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: US20170073389A1; EP3225626A1; JP2017536375A; WO2016085208A1; KR101572606B1; US20170334965A1; EP3225626A4; US10626157B2; US9868775B2; EP3225626B1

Description

本発明は、Ｓｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）に由来するペプチド断片、ならびに該ペプチド断片を有効成分として含む皮膚美白用および／または皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物に関する。また、本発明は、前記ペプチド断片を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制を研究または分析するための試薬に関する。

メラニンは、目や皮膚、毛などに見られる暗褐色の色素であり、一定量以上の紫外線を吸収することによって紫外線の透過を遮断し、身体の保護または体温の維持において有益な役割を果している。しかし、過剰な紫外線に暴露されると、皮膚を透過する紫外線を遮断するためにメラニンが過剰に分泌され、皮膚が変色する原因となることが多い。メラニンは、メラニン生成酵素（例えばチロシナーゼ）とホルモンとが同時に作用することによって生成されることが知られている。

悪性黒色腫は、メラニン形成細胞（すなわちメラノサイト）の悪性化により形成される腫瘍である。悪性黒色腫は、メラノサイトが存在する身体部位のいずれにおいても発生しうるが、その発生率は皮膚で最も高い。また、その悪性度は、様々な皮膚腫瘍中でも著しく高いことが知られている。悪性黒色腫の発生率は、西洋諸国に比べて東洋諸国の方が相対的に低いが、年々上昇しており、２０歳から発生率の上昇が始まり、４０歳以上で急激に上昇する傾向を示す。悪性黒色腫は、遺伝的要因および／または紫外線暴露から主に発生すると考えられている。

Ｗｎｔは、様々な体細胞から分泌される細胞内シグナル伝達分子であり、３つの経路、すなわち、古典的Ｗｎｔ経路、非古典的平面内細胞極性経路、および非古典的Ｗｎｔ／カルシウム経路に関与することが知られている。正常条件下において、Ｗｎｔは、Ｗｎｔ阻害因子（ＷＩＦ）などのＷｎｔ拮抗物質と結合しているため、シグナル伝達に関与することはない。しかし、ＷＩＦなどのＷｎｔ拮抗物質を発現することができない特定の状況下では、Ｗｎｔは受容体であるFrizzledと結合してシグナル伝達を発生する。Ｓｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）は、分泌型タンパク質であり、ＷＩＦと同様にＷｎｔ拮抗物質の１つとして知られている。Ｓｆｒｐ５は、FrizzledのＷｎｔ結合部位と相同性を有する部位を含んでいるため、ＷｎｔとFrizzledタンパク質との結合を調節する。メラノサイトにおいてＷｎｔと受容体（Frizzled）とが結合すると、β−カテニンが活性化し、メラニンの生合成を調節するＭＩＴＦの発現が促進される。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達経路を調節することによってＭＩＴＦの発現が抑制され、それによって色素沈着を低減することができると期待される。

本発明者らは、Ｗｎｔと結合することによってＷｎｔとFrizzledとの結合を抑制する様々なＳｆｒｐ５由来ペプチド断片を設計し、その活性を評価した。驚くべきことに、本発明者らは、Ｓｆｒｐ５由来の特定のペプチド断片が、Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制を介して、皮膚細胞におけるメラニン生成および皮膚色素沈着に対する抑制活性を示すことを見出した。

したがって、本発明は、Ｓｆｒｐ５由来の特定のペプチド断片を提供することを目的とする。

また、本発明は、Ｓｆｒｐ５由来の特定のペプチド断片を有効成分として含む、皮膚美白用および／または皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、Ｓｆｒｐ５由来の特定のペプチド断片を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制を研究または分析するための試薬を提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片が提供される。

本発明の別の一態様によれば、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を有効成分として含む、皮膚美白用の化粧料組成物が提供される。

一実施形態において、本発明の化粧料組成物は、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を有効成分として含む、皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物であってもよい。前記皮膚色素沈着は、紫外線暴露によって誘導された皮膚色素沈着であってもよい。

本発明のさらに別の一態様によれば、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制を研究または分析するための試薬が提供される。

Ｓｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来の特定のペプチド断片、すなわち配列番号１〜９のペプチドが、メラノサイトにおいてメラニン生成を抑制することによって、皮膚美白活性および／または皮膚色素沈着抑制活性を示すことが本発明により見出された。したがって、前記ペプチド断片は、皮膚美白用の化粧料組成物、特に皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物に有用に適用することができる。また、前記ペプチド断片は、生物学的分野および／または医学分野において、研究用または分析用試薬、すなわちＷｎｔシグナル伝達経路の抑制剤として有用に使用することができる。

図１ａ〜図１ｃは、マウス悪性黒色腫細胞株において、ＭＩＴＦまたはＣＲＥＢとβ−カテニンとの結合に対する本発明のペプチドの効果を評価することによって得られた結果を示す。ヒト表皮メラノサイトにおいて、Ｗｎｔシグナル伝達経路と関連した分子の発現および活性化に対する本発明のペプチド断片の抑制効果を評価することによって得られた結果を示す。マウス悪性黒色腫細胞株におけるメラニン形成に対する本発明のペプチド断片の抑制活性を評価することによって得られた結果を示す。マウス悪性黒色腫細胞株におけるチロシナーゼ活性に対する本発明のペプチド断片の効果を評価することによって得られた結果を示す。ヒト表皮メラノサイトにおけるメラニン生成酵素の発現に対する本発明のペプチド断片の効果を評価することによって得られた結果を示す。ヒト表皮メラノサイトにおけるメラニン生成酵素の遺伝子発現に対する本発明のペプチド断片の効果を評価することによって得られた結果を示す。

本発明は、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を提供する。また、本発明は、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を有効成分として含む、皮膚美白用の化粧料組成物を提供する。

Ｓｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片、すなわち配列番号１〜９のペプチドが、メラノサイトにおいてメラニン生成を抑制することによって、表皮の色素沈着に対する抑制活性を示すことが本発明により見出された。したがって、前記ペプチド断片は、皮膚美白用の化粧料組成物、特に皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物に有用に適用することができる。

一実施形態において、本発明の化粧料組成物は、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を有効成分として含む、皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物であってもよい。「皮膚色素沈着」とは、内的要因および外的要因によって引き起こされる皮膚ケラチノサイトでの過剰な色素蓄積を意味し、好ましくは紫外線暴露によって誘導された皮膚色素沈着を含む。

本発明の化粧料組成物は、従来の方法に従って様々な形態で製造されてもよい。例えば、前記化粧料組成物は、化粧品、化粧水、クリーム、ローションなどの形態で製造されてもよく、これらは、クレンジングウォーター、収斂液、または保湿液で希釈して使用してもよい。また、前記化粧料組成物は、化粧料組成物の分野で通常使用されている、安定剤、溶解補助剤、ビタミン、顔料、着香剤などの通常の添加剤を含んでいてもよい。前記化粧料組成物において、前記ペプチド断片は、皮膚美白効果または皮膚色素沈着抑制効果をもたらすのに十分な量で含まれていてもよく、例えば組成物の全重量に対して、０．００１〜１０重量％の範囲の量で含まれていてもよく、好ましくは、０．０１〜１重量％の範囲の量で含まれていてもよい。

本発明はさらに、配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制を研究または分析するための試薬を提供する。本発明の試薬は、様々な研究分野、例えば生物学分野および／または医学分野において、研究用または分析用試薬として有用に使用することができる。前記研究用または分析用試薬は、ペプチド断片そのままの形態であってもよく、適切な担体（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））に溶解または分散した形態であってもよい。

以下、実施例および試験例により本発明をさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例および試験例は、本発明を例示することのみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：ペプチド断片の合成
自動ペプチド合成機（PeptrEx-R48、Peptron社製、テジョン、大韓民国）を用いて、配列番号１〜９のペプチド断片をＦＭＯＣ固相法で合成した。合成したペプチド断片は、Ｃ１８分析用ＲＰカラム（資生堂カプセルパック）を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）（Prominence LC-20AB、島津製作所製、日本）によって精製および分析し、質量分析装置（HP 1100シリーズ LC/MSD、Hewlett-Packard社製、ローズビル、米国）を使用して同定した。

実施例２：ペプチド断片を含有する組成物の製造
配列番号１〜９の前記ペプチド断片を、１Ｍの濃度になるようにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にそれぞれ溶解した。得られたタンパク質溶液を以下の試験例で使用した。

試験例１：マウス悪性黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１におけるＣＲＥＢまたはＭＩＴＦとβ−カテニンとの結合に対する本発明のペプチド断片の効果の評価
β−カテニンの活性化は、Ｗｎｔシグナル伝達経路において重要な役割を果たしているが、このβ−カテニンの活性化に対する本発明のペプチド断片の効果をin situ近接ライゲーションアッセイにより評価した。この評価は、市販キットであるDUOLINK II in situキット（Olink Bioscience社製、スウェーデン）を用いて行った。

１２ｍｍのガラス底を有する２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌのＤＭＥＭを入れ、マウス悪性黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１細胞（韓国細胞株バンク、ソウル）を加えた（１ウェル当たり５×１０^４個の細胞）。細胞を５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養して安定化させた。メラノサイト刺激ホルモンであるα−ＭＳＨ（Sigma社製、ミズーリ州、米国）（０．１μＭ）および本発明のペプチド断片（１μＭ）を各ウェルに加えた。細胞を５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養した後、４％パラホルムアルデヒドで固定した。１２ｍｍのガラス底上の細胞にブロッキング溶液を１滴加え、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｗｎｔ受容体が活性化されると、ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質）とβ−カテニンとの相互作用が増加する。これらの相互作用レベルを測定するために、抗ＣＲＥＢポリクローナル抗体（Santa Cruz社製、カリフォルニア州、米国）および抗β−カテニンマウスモノクローナル抗体（Santa Cruz社製、カリフォルニア州、米国）を用いて前記細胞を３７℃で処理した。３０分間インキュベートした後、細胞をＰＬＡプローブ溶液で３７℃で１時間処理し、次いでライゲーション溶液で３０分間処理し、次いで増幅溶液で１００分間処理した。洗浄緩衝液で細胞を洗浄した後、共焦点顕微鏡を用いて赤色のスポットの数を測定した。この結果を図１ａおよび図１ｂに示す。図１ａおよび図１ｂにおいて、対照群（Control）は非処理群を意味し、α−ＭＳＨはα−ＭＳＨのみで処理した群（すなわち、ペプチドによる処理を行わなかった群）を意味する。

図１ａおよび図１ｂに示すように、ＣＲＥＢとβ−カテニンとの結合は、配列番号１〜８のペプチドによって顕著に減少した。この結果から、本発明のペプチド断片は、メラノサイトにおいてβ−カテニンの活性化を効果的に抑制することによって、Ｗｎｔシグナル伝達経路を抑制することが示された。

また、前記と同様の方法によって、ＭＩＴＦとβ−カテニンとの結合に対する配列番号５、８または９のペプチドの抑制効果を調査した。ＭＩＴＦとβ−カテニンとの結合は、これらのペプチドを用いた処理によって顕著に減少した（図１ｃ参照）。この結果から、本発明のペプチド断片は、メラノサイトにおいてＭＩＴＦとβ−カテニンとの結合を効果的に抑制することによって、メラニンの形成を抑制することが示された。

実験例２：ヒト表皮メラノサイトにおけるβ−カテニンの発現およびＧＳＫ−３のリン酸化に対する本発明のペプチド断片の効果の評価
β−カテニンの発現およびＧＳＫ−３のリン酸化は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化において重要な役割を果たしているが、β−カテニンの発現およびＧＳＫ−３のリン酸化に対する本発明のペプチド断片の効果をウエスタンブロッティングアッセイにより評価した。６ウェルマイクロプレートの各ウェルに２ｍｌのＤＭＥＭを入れ、ヒト表皮メラノサイト（Cascade Biologics社製、#C-0245C；ポートランド、オレゴン州、米国）を加えた（１ウェル当たり１．５×１０^５個の細胞）。細胞を５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養して安定化させた。メラノサイト刺激ホルモンであるα−ＭＳＨ（Sigma社製、ミズーリ州、米国）と、所定の濃度の本発明のペプチド断片（配列番号８のペプチド）とを各ウェルに加えた。細胞を４８時間培養した後、細胞からタンパク質を抽出した。得られた抽出物を、抗β−カテニン抗体（Santa Cruz社製、カリフォルニア州、米国）および抗ｐＧＳＫ−３抗体（Cell Signaling Technology社製、マサチューセッツ州、米国）を用いたウエスタンブロッティングアッセイに供し、β−カテニンの発現レベルおよびＧＳＫ−３のリン酸化レベルを測定した。この結果を図２に示す。図２に示すように、β−カテニンの発現レベルおよびＧＳＫ−３のリン酸化レベルは、配列番号８のペプチドによって濃度依存的に減少した。したがって、本発明のペプチド断片は、メラノサイトにおいてＷｎｔシグナル伝達経路を抑制できることが分かる。

実験例３：マウス悪性黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０におけるメラニン形成に対する抑制活性の試験
６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、Ｂ１６Ｆ１０細胞（韓国細胞株バンク、ソウル）（１ウェル当たり１．５×１０^５個の細胞）と２ｍｌのＤＭＥＭとを加え、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養した。α−ＭＳＨ（Sigma社製、ミズーリ州、米国）（１００ｎＭ）を各ウェルに加え、最終濃度が０．１μＭ、１μＭまたは１０μＭとなるように配列番号８のペプチドを各ウェルに加えた。α−ＭＳＨ（１００ｎＭ）およびアルブチン（０．０１％）でそれぞれ処理した群を陽性対照群として用いた。細胞を２４時間さらに培養した後、各培養物の写真を撮影し、それぞれのメラニン形成量を比較した。

図３に示すように、配列番号８のペプチドで処理した群において、各細胞培養物の褐色はペプチドの濃度に依存して減少し、陽性対照群と類似した色を示した。この結果から、本発明のペプチド断片は、メラノサイトにおいてα−ＭＳＨの刺激によるメラニン色素の形成を抑制することが示された。

実験例４：マウス悪性黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０におけるチロシナーゼ活性に対する抑制活性の試験
本発明のペプチド断片がチロシナーゼ活性を抑制するかどうかを評価した。２４ウェルプレートの各ウェルに、Ｂ１６Ｆ１０細胞（韓国細胞株バンク、ソウル）（１ウェル当たり５×１０^４個の細胞）と１ｍｌのＤＭＥＭとを加え、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養して安定化させた。メラノサイト刺激ホルモンであるα−ＭＳＨ（Sigma社製、ミズーリ州、米国）と、所定の濃度の配列番号８のペプチドとを各ウェルに加えた。細胞を７２時間培養した後、細胞からタンパク質を抽出した。得られた抽出物を９６ウェルプレートの各ウェルに加え（１ウェル当たり３０ｇ）、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）溶液（１００μＬ）を用いて３７℃で２時間処理した。α−ＭＳＨ（１００ｎＭ）およびアルブチン（０．０１％）でそれぞれ処理した群を陽性対照群として用いた。２時間後、各培養物の写真を撮影し、マイクロリーダーを用いて培養物のチロシナーゼ活性を４９０ｎｍで測定した。

図４に示すように、α−ＭＳＨのみで処理した対照群において、チロシナーゼ活性は増加した。これに対して、α−ＭＳＨおよび配列番号８のペプチドの両方で処理した試験群では、チロシナーゼ活性は濃度依存的に減少した。この結果から、本発明のペプチド断片はチロシナーゼ活性に対する抑制活性を有することが示された。

実験例５：ヒト表皮メラノサイトにおけるメラニン生成酵素のタンパク質発現に対する抑制活性の試験
ヒト表皮メラノサイトにおけるメラニン生成酵素のタンパク質発現に対する本発明のペプチド断片の効果を、ウエスタンブロッティングアッセイを用いて評価した。６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、ヒト表皮メラノサイト（Cascade Biologics社製、#C-0245C；ポートランド、オレゴン州、米国）（１ウェル当たり１．５×１０^５個の細胞）と２ｍｌのＤＭＥＭとを加え、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養して安定化させた。メラノサイト刺激ホルモンであるα−ＭＳＨ（Sigma社製、ミズーリ州、米国）と、所定の濃度の本発明のペプチド断片（配列番号８のペプチド）とを各ウェルに加えた。細胞を２４時間培養した後、細胞からタンパク質を抽出した。得られた抽出物を、抗ＭＩＴＦ抗体（Abcam社製、マサチューセッツ州、米国）、抗チロシナーゼ抗体（Santa Cruz社製、カリフォルニア州、米国）、抗ＴＲＰ−１抗体（Santa Cruz社製、カリフォルニア州、米国）および抗ＴＲＰ−２抗体（Santa Cruz社製、カリフォルニア州、米国）を用いたウエスタンブロッティングアッセイに供し、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の発現レベルを測定した。この結果を図５に示す。図５に示すように、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の発現レベルは、配列番号８のペプチドによる処理によって濃度依存的に減少した。したがって、本発明のペプチド断片は、ヒト表皮メラノサイトにおいて、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の合成を抑制することが分かる。

実験例６：ヒト表皮メラノサイトにおけるメラニン生成酵素の遺伝子発現に対する抑制活性の試験
本発明のペプチド断片が、メラニン生成酵素の遺伝子発現を抑制するかどうかを評価した。６ウェルプレートの各ウェルに、ヒト表皮メラノサイト（１ウェル当たり１．５×１０^５個の細胞）と２ｍｌのＤＭＥＭとを加え、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養して安定化させた。メラノサイト刺激ホルモンであるα−ＭＳＨ（Sigma社製、ミズーリ州、米国）と、所定の濃度の配列番号８のペプチドとを各ウェルに加えた。細胞を７２時間培養した後、細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成は、Reverse Transcription Master Premix（Elpis Biotech社製、テジョン、大韓民国）を用いて行った。合成された各ｃＤＮＡを鋳型として使用し、ROTOR Q GENE装置を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーセットを以下の表２に示す。各ＲＴ−ＰＣＲ溶液は、１μｌのｃＤＮＡ、１０μｌのTOPreal qRT-PCR2X Premix（Enzynomics社製、テジョン、大韓民国）、２μｌのプライマーセット（１０ｐｍｏｌ）および７μｌの蒸留水を混合することによって調製した。ＲＴ−ＰＣＲは、最初に９４℃で１０分間；次いで、９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１分間を４０サイクルの条件で行った。

ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって得られた結果を図６に示す。

図６に示すように、α−ＭＳＨのみで処理した対照群において、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の遺伝子発現が増加した。これに対して、α−ＭＳＨおよび本発明のペプチド断片（すなわち配列番号８のペプチド）の両方で処理した試験群では、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の遺伝子発現が濃度依存的に減少した。この結果から、本発明のペプチド断片は、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の遺伝子発現を抑制することが示された。

Claims

配列番号１〜５および９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片。
配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を有効成分として含む、皮膚美白用の化粧料組成物。
配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を有効成分として含む、皮膚色素沈着抑制用の化粧料組成物。
前記皮膚色素沈着が、紫外線暴露によって誘導された皮膚色素沈着である、請求項３に記載の化粧料組成物。
配列番号１〜９のペプチドからなる群から選択されるＳｆｒｐ５（secreted frizzled protein 5）由来ペプチド断片を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制を研究または分析するための試薬。