JP2011047932A - エンプリンとs100a9の結合の阻害を指標とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとS100A9又はS100A8/A9との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法、を提供する。
【選択図】図12
Description
(1)慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとS100A9又はS100A8/A9との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
(2)慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質の存在下、エンプリンとS100A9又はS100A8/A9とをインキュベートし、エンプリンとS100A9又はS100A8/A9との結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選定することを含んで成る、(1)に記載の方法。
(3)エンプリンが固体支持体に固相化されている、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記結合の阻害がELISA法により決定される、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)エンプリンとS100A9との結合を阻害する薬剤を含んで成る、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
(6)前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、(6)に記載の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
(7)エンプリンとS100A9との結合を阻害する薬剤を被験者に投与することを含んで成る、慢性炎症又は癌転移の抑制方法。
(8)前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、(9)に記載の方法。
S100A8およびA9のアミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列は、例えばHum Genet (2002) 111:310-313(非特許文献10)に公開されている。本発明において使用できるS100A8およびA9は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。S100A8およびA9の組換タンパク質は、当業界で周知の方法に従い、例えば単離したまたはPCRにより合成したS100A8又はA9遺伝子 (cDNA) を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
培養ケラチノサイトから回収したタンパク質混合物とGST融合S100A9又はS100A8/A9タンパク質とを混合した後、このサンプルについてキャピラリーLC/MS/MSによるタンパク質の網羅的解析法を行った。
内径100μm、長さ120mmの未充填のキャピラリーカラム(New Objetive社製)のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が5μmのオクタデシル化シリカ型充填剤Aqua C18(Phenomenex社製)を、高さが100mmとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
エンプリンの発現抑制のために、RNAiMaxを用いて、エンプリンsiRNA(Santa Cruz: sc-35298)を、終濃度40 nM又は80 nMとなるように増殖期の培養ケラチノサイトにトランスフェクションした(図3中の「BSG」)。コントロールとして、何も添加していないもの(図3中の「NT」(non-treated control))およびヒト遺伝子のいずれの部分とも相同性を有していないcontrol siRNA-A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-3707)(図3中の「LF」)を使用した。尚、トランスフェクションは、培養培地を増殖因子を含まない基礎培地に交換してから行った。トランスフェクションから24時間後にS100A9で増殖ケラチノサイトを刺激し、さらに24時間経過後にRNAを採取した。その結果、図3に示すとおり、エンプリンsiRNAをトランスフェクションした場合、24、48、72時間後には、上記コントロールを用いた場合のエンプリンの発現量と比較して1〜3%まで発現が抑制された。
IL−8(CXCL−8)、TNFα、IL1−F9、CXCL−1は、S100A8/A9の添加により、ケラチノサイトでの発現が亢進されることが明らかとなっている(前掲J Cell Biochem. (2008) 104:453-464)(非特許文献8)。S100A9の添加によってもIL−8(CXCL−8)、TNFα、IL1−F9及びCXCL−1の発現が亢進されるか、また、エンプリンの発現抑制がこれらのサイトカインの発現にどのような影響を与えるかについてリアルタイム定量PCRにより検討した。同様の方法により、S100A9刺激がMMP−1及びMMP−10の発現に及ぼす影響についても検討した。
EpiLife(商標)-KG2(Cascade Biologies社)中で培養した増殖期のNHEKを、2 mMの塩化カルシウム、S100A8またはS100A9(各10μg/ml)を含有又は非含有の同培地に置換し、3時間にわたり曝露させ、MagNA(商標) Pure mRNA抽出キットおよびMagNA Pure(商標)機器(Roche Diagnostics社、日本国、東京都)を用いてmRNAを抽出した。得られたmRNAは、SuperScript(商標) II(Invitrogen Corporation社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド)を用いて逆転写させた。リアルタイム定量PCRは、製造業者の取扱説明書にしたがってLightCycler FastStart DNA master SYBR green Iキット(Roche Diagnostics社)を用いてLightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、10分間の活性化ステップ、それに続く95℃で15秒の変性、60℃で10秒のアニーリング、72℃で10秒の伸長からなるサイクル40回であった。使用したプライマーは、下記の表1に示す。各プライマーの最終濃度は20μlの総反応容量中で0.2〜0.25μMとした。グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)遺伝子を対照遺伝子として使用した。増幅させたフラグメントの特異性は融解曲線分析によって確認した。各遺伝子の発現レベルは、LightCycler分析用ソフトウエアを用いて定量分析した(非特許文献11:Morrison TB et al., Biotechniques (1998)24:954-958, 960, 962)。目的のmRNA量は、A8/control siRNA-A (santa Cruz: sc-37007)(A8/LF)のmRNAの量に対する比率として表した。
1)エンプリン細胞外ドメインの作製
[方法]
細胞: ヒト胎児腎細胞株 (HEK293) は ATCC 社より購入したものを使用し、 培養ヒト正常線維芽細胞 OUMS-24は、難波正義博士により単離されたものを使用した。 HEK293 と OUMS-24 は、 Gibco 社の DMEM/F12 培地 (最終濃度が 10% となるように牛胎児血清を添加) を用いて培養した。
CMV イントロンプロモーター (CMVi) を導入した PDNR 1r ベクター (プロモーターレスドナーベクター;Clontech 社) を構築し、CMVi の下流にヒトエンプリン細胞外ドメイン (C末にmyc-HA-Flag-6Hisタグが付加されている) をコードするcDNAを挿入した(pCMVi-exEmmp: エンプリン細胞外ドメイン発現ドナーベクター)。挿入cDNAの塩基配列は DNA シークエンサーにより正しいことを確認済みである。
pCMVi-exEmmp を、FuGENE-HD (Roche社) トランスフェクション試薬を用いて HEK293 に導入し、48時間後に培養上清を回収した。培養上清に Sigma 社の抗 HA tag 抗体共有結合担体を添加し、4℃で3時間振盪混和した。その後、5000 rpm、1分間の遠心分離を行い、沈降してきた担体結合タンパク質を酸性バッファーにより溶出した。溶出サンプルを12% の SDS-PAGE を用いて電気泳動した後、PVDF 膜にエレクトロブロットして、CST 社の抗 HA tag 抗体を用いてウエスタンブロットを行い、エンプリン細胞外ドメインが分泌されていることを確認した。
pCMVi-exEmmp のアデノウィルスベクターへの変換は、アデノウィルス作製キット(Adeno-X-expression system: Clontech 社)を使用して行った。
Ad-exEmmp (20 MOI)を培養ヒト正常線維芽細胞 OUMS-24 (10 cm dish x 20)に感染させた。感染させる時期は、OUMS-24 が高密度状態になった時とした。これは、高密度培養により接触阻止が惹起された細胞では細胞***が起こらず、細胞内に存在するアデノウィルス由来エピソーム含量の低下が抑制され、その結果、アデノウィルスによる標的遺伝子発現が極めて長期間(2-3週間)持続するからである。しかも、OUMS-24 は無血清培養が可能であることより、長期に渡って培養上清中に分泌された組み換えタンパク質を、血清を含まない状態で回収することができる。感染操作後、24時間培養して無血清培地 DMEM/F12 (フェノールレッド不含) に置換する。3日の間隔で液換えを行い、その度に培養上清を回収して4℃で保存する (タンパク質の安定性に応じて保存条件を変える)。この操作を30日間行った。約2Lの回収培養上清について、80%飽和硫安条件で得られた沈殿を50mlの純水に溶かし、その後、純水に対して透析することで硫安を除いた。 透析後、目的の組み換えタンパク質は、抗 HA tag 抗体共有結合担体充填カラム(sigma 社)を用いて回収した。
エンプリンがS100タンパク質の新規レセプターであることを確認するべく、免疫沈降及びウェスタンブロットによりエンプリン結合タンパク質の同定を行った。本実験において、エンプリンはC末にmyc-HA-Flag-6Hisタグが付加されているものを使用した。また、S100タンパク質としてS100A8及びS100A9タンパク質を使用した。これらのタンパク質がコードされているプラスミド(C末にHAタグが付加されている)をそれぞれHEK293細胞にトランスフェクションし、その培養上清からそれぞれのタンパク質を単離して使用した。
従来、MMPの発現亢進は、エンプリンの細胞外ドメインがMMPにより分解され、放出された可溶性のエンプリンが細胞表面に存在する受容体としてのエンプリンに結合し、MMPの産生を促すというエンプリンの自己分泌(オートクリン)に起因すると考えられていた。従って、可溶性エンプリンが実際にMMPの発現を亢進させるか否かについて検討した。
1)免疫染色
エンプリンがヒト表皮に存在するか、また、S100タンパク質と同一局在を示すかについて、免疫染色により確認した。結果を図8A〜Cに示す。エンプリンは、正常表皮、皮膚モデル、アトピー性皮膚炎(AD)の皮膚のいずれでも顆粒層で多く発現している。また、S100タンパク質もエンプリン付近で発現していた。
エンプリンとS100A9タンパク質とが、単に結合しているだけでなく、実際に相互作用していることをPLA (Proximity Ligation Assay) 法により確認した。PLA法によれば、DNAプローブで標識された2種類の抗体を用い、蛍光色素をラベルした相補的DNAをハイブリダイズさせることで、それらのタンパク質が相互作用しているか否かを明らかにすることができる。PLA法は、通常の免疫染色と比較してはるかに高感度である。
1)リコンビナントS100A8、S100A9の調製とビオチン化:
ヒトS100A8、S100A9をGST融合タンパク質として大腸菌で産生させ、グルタチオン共有結合担体によるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。その後、GSTを切断・除去した。精製したS100A8、S100A9タンパク質のビオチン化については次の方法をとる。各精製タンパク質濃度に対して3倍モル量の Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu (Dojindo社) を混合した。室温で 2 時間反応させた後に Nap-5 (GE Healthcare社) により未反応のビオチン化試薬を除いた。
リコンビナントエンプリン細胞外ドメイン(図1中のsignal peptideの後から、transmembrane domainの前に相当)を96 well プレート (Pierce社) のウェル上に結合させる。ウェルを洗浄後、非特異的吸着を抑えるため、各ウェルは5%BSAその他のブロッキング剤で処理する。次に試験する薬剤(対象としては、溶媒のみ)をウェル内に添加して室温で 1 時間インキュベートする。ウェルを洗浄後、リコンビナントS100A9w(エンプリンの全長配列)を加え室温で1時間インキュベートする。さらにHRP標識した抗 S100A9抗体を同ウェル内に添加して反応させる。再度洗浄し、発色基質 (オルソフェニレンジアミン) を添加して ELISAリーダーで吸光度 (O.D.492 nm)を測定する。この操作により、まずはエンプリンとS100A9(又はS100A8/A9)との結合における検量線を作製する。次にこの結合を阻害する分子のスクリーニングを行う。上記のアッセイ系に薬剤を添加し、吸光度の低下するものを候補薬剤とする。
Claims (8)
- 慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとS100A9又はS100A8/A9との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
- 慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤をスクリーニングする方法であって、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質の存在下、エンプリンとS100A9又はS100A8/A9とをインキュベートし、エンプリンとS100A9又はS100A8/A9との結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選定することを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- エンプリンが固体支持体に固相化されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記結合の阻害がELISA法により決定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- エンプリンとS100A9との結合を阻害する薬剤を含んで成る、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
- 前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項5に記載の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
- エンプリンとS100A9との結合を阻害する薬剤を被験者に投与することを含んで成る、慢性炎症又は癌転移の抑制方法。
- 前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項7に記載の方法。
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