CN106103738A - 利用超大规模平行测序仪进行简便的hla基因的dna分型方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用超大规模平行测序仪进行HLA基因的DNA分型的方法和试剂盒。本发明涉及HLA基因的DNA分型方法,该方法的特征在于包括以下步骤:(1) 准备对人基因组碱基序列中的选自HLA‑DRB1、HLA‑DRB3、HLA‑DRB4、HLA‑DRB5、HLA‑DQB1和HLA‑DPB1的至少1个靶基因的包含外显子2和外显子3的内含子1和外显子4分别特异性地退火的引物组的步骤;(2) 使用上述引物组通过PCR法对被测试样(DNA)进行扩增的步骤;(3) 确定所扩增的PCR产物的碱基序列的步骤;以及(4) 任选地,实施与数据库的同源性检索的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及使用超大规模平行测序仪(超並列高速シークエンサー)进行HLA基因的DNA分型的方法和试剂盒。
背景技术
人白细胞抗原(Human leukocyte antigen;HLA)在免疫学的自身、非自身的识别中发挥重要的作用,该识别是T细胞经由T细胞受体识别在HLA上提呈了来自自身或非自身的肽的HLA・肽复合体。T细胞通过识别下述细胞,而引起免疫细胞的活化、或已提呈的细胞的破坏,所述细胞为:其表面上表达有在自身的HLA上提呈了来自非自身(病毒、细菌等病原性微生物或花粉等外来抗原)的肽的HLA・肽复合体的细胞;或者其表面上表达有由于移植、输血而进入体内的与自身不同的HLA等位基因(对立基因)的细胞。
这些免疫细胞的活化或已提呈的细胞的破坏,在以输血、骨髓移植为代表的移植医疗、使用iPS细胞或ES细胞的再生医疗中,引起排斥反应或移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease:GVHD)。在血小板多次输血患者中,产生针对与自身不同的HLA的抗体,导致血小板输血效果的显著降低。在给药的一部分中,也存在与特定HLA结合的药物(和肽)被识别为非自身,而导致以***反应为中心的严重的药物副作用的情形。
因此,在移植医疗或再生医疗中,有必要使患者与捐赠者(提供者)的HLA一致。在产生针对特定等位基因的抗HLA抗体的血小板输血患者中,也有必要输入使HLA一致的“HLA配型血小板”的输血。关于药物副作用,在报道了预定给予的药物与特定的HLA等位基因具有相关性的情形下,给药前检测HLA也尤为重要。实际上,在部分药物的附带说明书中,明确记载了推荐对HLA进行检测。在癌症的肽疫苗疗法中,为了预测肽疫苗是否可与患者HLA结合,也有必要对HLA进行检测。
已知有6种抗原作为主要的HLA。即,几乎在所有细胞中表达的I类分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和主要在免疫***细胞中表达的II类分子(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP)。
HLA-I类抗原由显示高度多态性的α链和几乎不显示多态性β2-微球蛋白组成,HLA-II类抗原由存在高度多态性的β链和多态性低的α链组成。I类分子的α链由HLA-A、HLA-B、HLA-C的各基因编码,II类抗原的β链由HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1、HLA-DPB1、α链由HLA-DRA1、HLA-DQA1、HLA-DPA1基因编码。在基因水平,在HLA-I类抗原中,编码α链的基因的外显子2和外显子3显示高度多态性,在HLA-II类抗原中,编码β链的基因的外显子2显示高度多态性。
有报道称:编码HLA的基因区域位于人6号染色体短臂6p21.3,从端粒侧朝向着丝粒侧,以I类区域(HLA-A、HLA-C、HLA-B等)、III类区域、II类区域(HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1等)的顺序排列,许多基因以非常高的密度编码,这些基因与输血、移植和各种疾病具有关联性。在III类区域中不存在HLA基因,存在补体成分、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor; TNF)等的基因。
在编码HLA-DR抗原的β链的HLA-DRB基因区域中,确认到5种结构多态性。在DR1型和DR10型中,在同一染色体上,除了HLA-DRB1之外还定位HLA-DRB6和HLA-DRB9等假基因。在DR2型中,在同一染色体上,除了HLA-DRB1之外还定位HLA-DRB5 (DR51)基因、HLA-DRB6和HLA-DRB9等假基因。在DR3、DR5和DR6型中,在同一染色体上,除了HLA-DRB1之外还定位HLA-DRB3 (DR52)基因、HLA-DRB2和HLA-DRB9等假基因。在DR4、DR7和DR9型中,在同一染色体上,除了HLA-DRB1之外还定位HLA-DRB4 (DR53)基因、HLA-DRB7、HLA-DRB8和HLA-DRB9等假基因。相对于这些,在DR8型中,在同一染色体上,没有定位HLA-DRB1之外的HLA-DRB基因(参见图1)。
在各等位基因的外显子中存在显示多态性的多个区域,在许多情况下,某多态性区域的碱基序列(氨基酸序列)在多个等位基因中也是共同的。即,各HLA等位基因通过多个的多态性区域的组合而规定。在HLA-II类抗原中,不仅外显子内的多态性区域、而且具有同一碱基序列的外显子2或外显子3有时也在多个等位基因中是共同的。
由于HLA中存在高度多态性,已知对立基因(等位基因)的种类也极多,它们的表示法也得到确定。即,辨别血清学HLA型的第1区域(2位数水平)、辨别同一血清学的HLA型内伴有氨基酸取代的等位基因的第2区域(4位数水平)、辨别被认为不伴有氨基酸突变的碱基取代的等位基因的第3区域(6位数水平)、以及辨别编码HLA分子的基因区域外(内含子)中伴有碱基取代的等位基因的第4区域(8位数水平) (参见图2)。
在医疗的各种情形中,检测HLA等位基因(HLA基因的DNA分型)是重要的。但是,在以往常常使用的SBT法(Sequence-based typing )、Luminex法(PCR-sequence-specificoligonucleotide probes (SSOP)-Luminex method)中,在等位基因之间存在不同的多个多态性区域的情形下,难以鉴定该多态性区域是处于顺式位置(同一的染色体上)、还是处于反式位置(不同的染色体上)的关系,因此存在被称为相位模糊(phase ambiguity)的暧昧性,有不能正确地鉴定等位基因的情形。
因此,我们使用下一代测序仪(超大规模平行测序仪)开发了没有相位模糊的方法。但是,在该方法中,为了扩增含有启动子区域~3’UTR的较长的区域,保存状态差且片段化的DNA有难以分型的情形。特别是,在HLA-II类基因中,内含子1较长,扩增I类基因的2倍程度的长度的区域,因此在片段化增加的DNA样品中难以进行分型。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平11-216000号公报;
非专利文献
非专利文献1:Lind C.等,Human Immunology,第71卷,1033-1042页(2010年);
非专利文献2:Shiina T.等,Tissue Antigens,第80卷,305-316页(2012年)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于,提供即使使用保存状态差、片段化的DNA样品的情形也可以进行分型、可以在同一PCR条件下使用多个引物组同时进行各HLA基因的PCR的使用超大规模平行测序仪进行HLA基因的DNA分型的方法、引物组和试剂盒。
用于解决课题的手段
本发明人开发了:扩增引起等位基因之间的差异的多态性较多、而且编码抗体或识别T细胞受体的细胞外结构域的HLA-II类基因的包含外显子2~部分外显子4的区域,利用下一代测序仪进行DNA分型的体系。
具体而言,分别重新设计可以同时扩增作为HLA-II类基因的HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5基因的PCR引物,以及可以特异性地扩增HLA-DQB1和HLA-DPB1基因的PCR引物,设定适合的PCR条件,基于驱使超大规模平行测序技术的新的着想,为了解决上述课题,努力研究的结果,完成了本发明。
即,本发明提供包括以下步骤的HLA基因的DNA分型方法。
(1) 准备对人基因组碱基序列中的选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1的至少1个靶基因的包含外显子2和外显子3的内含子1区域和外显子4区域分别特异性地退火的引物组的步骤;
(2) 使用上述引物组利用PCR法对被测试样(DNA)进行DNA扩增的步骤;
(3) 确定利用PCR法扩增的产物的碱基序列的步骤;以及
(4) 实施与数据库的同源性检索的步骤。
在某一实施方式中,上述靶基因选择选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5的至少一个基因,上述引物组为分别具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示碱基序列的寡核苷酸。在其它实施方式中,上述靶基因为HLA-DQB1基因,上述引物组为分别具有SEQID NO: 3和4的任一者或两者、以及SEQ ID NO: 5所示碱基序列的寡核苷酸。在另外的实施方式中,上述靶基因为HLA-DPB1基因,上述引物组为分别具有SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO:7所示碱基序列的寡核苷酸。
并且,在其它方案中,本发明涉及可利用PCR法同时DNA扩增选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5的至少1个基因的包含外显子2和外显子3的区域的引物组。在某一实施方式中,提供选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5的至少一个基因的DNA分型用引物组,该引物组包含分别具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示碱基序列的寡核苷酸。在其它实施方式,提供HLA-DQB1基因的DNA分型用引物组,该引物组包含分别具有SEQID NO: 3和4的任一者或两者、以及SEQ ID NO: 5所示碱基序列的寡核苷酸。在另外的实施方式中,提供HLA-DPB1基因的DNA分型用引物组,该引物组包含分别具有SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7所示碱基序列的寡核苷酸。
发明效果
本发明的方法获得对来自1分子的HLA基因进行DNA分型所必需的全部碱基序列,因此为排除了顺式、反式位置关系的不清楚的相位模糊的最终DNA分型法。通过该方法,可以扩增多态性较多、而且编码抗体或识别T细胞受体的细胞外结构域的HLA-II类基因的包含外显子2~部分外显子4的区域,实现了利用下一代测序仪进行的DNA分型。
而且,由于缩短了扩增区域,因此即使在使用保存状态差的DNA样品的情形下也比较容易地进行HLA基因的DNA分型。并且,所扩增的区域的长度与己发表的I类基因的扩增区域几乎相同,通过使用本发明的引物组,可在同一PCR条件下对多个HLA基因同时进行PCR,因此可缩短PCR所耗费的时间。并且,数据量也变少,因此也可缩短数据分析的时间。
附图简述
图1是显示HLA-DR基因区域的图。引用自Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki和Takeo Juuji编辑“Transplantation/transfusion Examination”,Kodan-shaScientific,2004年,第48页。
图2是显示HLA等位基因的分类法的图。引用自IMGT-HLA数据库(www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)。
图3 (a)是显示HLA-I类基因结构和分子结构的关联性的图。(b)是显示HLA-I类基因的启动子区域的结构的图。引用自Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki和Takeo Juuji编辑,“Transplantation/transfusion Examination”,Kodan-sha Scientific,2004年,第35页。
图4是显示各HLA基因的结构的示意图。
图5显示在HLA-II类基因上设计的引物的位置和根据参考序列预想的PCR产物的长度。
图6显示使用新规开发的引物的琼脂糖凝胶电泳图像。
图7显示利用多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图像。
图8显示利用多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图像。
具体实施方式
以下,对本发明的DNA分型方法按步骤进行详细地说明。
(1) 引物组准备步骤
在本发明的DNA分型方法中,首先,准备可在同一条件下进行退火的引物组,其为可以分别特异性地退火选自人基因组碱基序列中的HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1的至少1个靶基因的包含外显子2和外显子3的内含子1和外显子4的引物组。
包含HLA基因存在的区域的人6号染色体(6p21.3)的基因组碱基序列已经阐明,其基因结构与表达产物(HLA抗原)的结构的相关性也是已知的(参见图3和4)。
在本发明中,调制可以将经典II类抗原(HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1)的包含外显子2和外显子3的区域一并进行PCR的引物组(参见图5),将使用所述引物组而扩增的PCR产物供于后述的高通量测序,因此可以排除相位模糊等的不确定性,无效(null)等位基因的有无也可以正确检测。
表1中的SEQ ID NO: 1和2是特异性地扩增作为MHC-II类β链的HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因和HLA-DRB5基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-DRB1基因、HLA-DRB5基因;人基因组碱基序列(参考序列:6_cox_hap2)中HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因;人基因组碱基序列(参考序列:mann_hap4)中HLA-DRB1基因、HLA-DRB4基因的各外显子2和外显子3从上游侧和下游侧夹入。
SEQ ID NO: 1具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第32552643位~第32552667位和第32490446位~第32490470位、人基因组碱基序列(参考序列:6_cox_hap2)中的第4003862位~第4003886位和第3939870位~第3939894位、人基因组碱基序列(参考序列:mann_hap4)中的第4000197位~第4000221位和第3851785位~3851809位的碱基序列。
SEQ ID NO: 2具有与相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第32548609位~第32548631位和32486419位~32486441位、人基因组碱基序列(参考序列:6_cox_hap2)中的第3999861位~第3999883位和第3935840位~3935862位、人基因组碱基序列(参考序列:mann_hap4)中的第3996203位~第3996225位和3847267位~第3847289位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约4,000~约4,500个碱基(bp)。
表1中的SEQ ID NO: 3~5是特异性地扩增作为MHC-II类β链的HLA-DQB1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-DQB1基因的外显子2和外显子3从上游侧和下游侧夹入。
SEQ ID NO: 3具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第32633103位~第32633128位的碱基序列。
SEQ ID NO: 4具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第32633103位~第32633127位的碱基序列。
SEQ ID NO: 5具有与相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第32629214位~第32629237位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约3,900个碱基(bp)。
表1中的SEQ ID NO: 6和7是特异性地扩增作为MHC-II类β链的HLA-DPB1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-DPB1基因的外显子2和外显子3从上游侧和下游侧夹入。
SEQ ID NO: 6具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第33048187位~第33048207位的碱基序列。
SEQ ID NO: 7具有与相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第33053563位~第33053591位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约5,400个碱基(bp)。
这些引物可以通过在该领域中常规使用的方法进行调制。而且,表1中记载的引物组是最优选的例子,本发明的方法中,只要是在将HLA的各基因的外显子2和外显子3从上游侧和下游侧夹入的位置退火的正向(Sense)引物和反向(Anti-Sense)引物的组即可,可以同样地进行使用。
需要说明的是,在该说明书中,即使是相当于参考序列的同一位置的碱基序列(或与其互补的碱基序列),对于1个~数个碱基不同的引物,也分别赋予了个别的序列编号(SEQ ID NO)。这些的1个~数个碱基的不同是由于多态性导致的。
[表1]
而且,在本发明中,向上述经典的II类抗原中加入特异性的引物组,在作为经典I类抗原的HLA-A、HLA-B和HLA-C的各基因中,可以组合使用用于将已知多态性高的包含外显子2和3的区域进行PCR的引物组。HLA-A、HLA-B和HLA-C的各基因特异性引物组可以示例如下。
表2中的SEQ ID NO: 8~10是特异性地扩增作为MHC-I类α链的HLA-A基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-A基因的全部区域(包含启动子、外显子和内含子)从上游侧和下游侧夹入。
SEQ ID NO: 8和9具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第29909483位~第29909514位的碱基序列。
SEQ ID NO: 10具有与相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第29914925位~第29914954位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约5,500个碱基(bp)。
表2中的SEQ ID NO: 11和12是特异性地扩增作为MHC-I类α链的HLA-B基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-B基因的全部区域(包含启动子、外显子和内含子)从上游侧和下游侧夹入。
SEQ ID NO: 11具有与相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第31325796位~第31325824位的碱基序列互补的碱基序列。
SEQ ID NO: 12具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第31321210位~第31321235位的碱基序列。
使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约4,600个碱基(bp)。
表2中的SEQ ID NO: 13~15是特异性地扩增作为MHC-I类α链的HLA-C基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-C基因的全部区域(包含启动子、外显子和内含子)从上游侧和下游侧夹入。
SEQ ID NO: 13和14具有与相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第31240868位~第31240896位的碱基序列互补的碱基序列。
SEQ ID NO: 15具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第31236075位~第31236114位的碱基序列。
使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约4,800个碱基(bp)。
[表2]
本说明书中记载的一个或多个引物组,例如在多重PCR法等中为了使各HLA基因进行PCR扩增可在同一容器内使用。
(2) PCR步骤
在本发明的方法中,使用上述步骤(1)中准备的引物组,利用PCR法对被测试样(DNA)进行DNA扩增。
PCR可按照通常的操作规程进行实施。具体而言如下所示。
1. 根据被测试样的形态,从该试样中提取DNA。
2. 将提取的DNA进行定量,设定适宜引物浓度,调制反应液。
3. 设定反应条件实施PCR。
例:热变性步骤(通常为92~98℃)
退火步骤(通常为55~72℃)
延伸步骤(通常为65~80℃)
在本发明的方法中,优选将上述退火和延伸步骤的温度设为约65~70℃。更优选设为65℃~68℃。通过在约65~70℃下进行退火和延伸,能够以等比例(均匀)生成HLA等位基因。
4. 将所得PCR产物进行纯化,供于接下来的确定碱基序列的步骤。
对本发明中使用的酶(DNA聚合酶)没有特别限定,例如还可以使用市售品。例如,可以举出:TaKaRa Bio株式会社制造的PrimeSTAR (注册商标) GXL DNA聚合酶、Tks Gflex(注册商标) DNA聚合酶、TaKaRa LA Taq (注册商标)等。
(3) 确定碱基序列的步骤。
其次,确定在上述步骤(2)中生成的PCR产物(扩增DNA)的碱基序列。该步骤优选使用被称为所谓高通量测序(或超高速测序、大规模平行测序)的方法进行实施。关于高通量测序,参见例如“Experimental Medicine”,第27卷,第1号,2009年(Yodo-sha)等。
作为超大规模平行测序仪,有Roche社的454 GS***、Life Technologies社的基因组测序仪Ion Torrent PGMTM***和Illumina社的MiSeq***等,在本说明书中,基于Roche社的454 GS***进行序列确定的方法在下文记载。
1. 将上述步骤(2)中获得的PCR产物通过雾化器片段化为约500个碱基左右。
2. 在该片段化的DNA片段的末端附加DNA衔接头。
3. 将附加了DNA衔接头的DNA片段制成单链DNA片段后,使其经由衔接头与珠子结合,将所得的珠子包埋到油包水型乳液中。由此,形成1个珠子上结合有1个DNA片段的微反应器环境。
4. 实施乳液PCR以扩增各DNA片段。利用乳液PCR,各DNA片段在各微反应器内克隆扩增,因此可以不与其它序列竞争、同时平行地实施多数片段的扩增。随后,破坏乳液且回收结合有所扩增的DNA片段的珠子。
5. 浓缩珠子,将珠子装载在PicoTiter板中。PicoTiter板是1个孔中加入1个珠子的尺寸。
6. 对于各珠子,以一定顺序加入4种核酸(A、C、G、T),所添加的核酸由于聚合酶而掺入到DNA序列中时产生焦磷酸,通过荧光素酶的荧光反应检测所产生的焦磷酸,基于其信号强度与位置信息的组合确定碱基序列。
(4) DNA分型步骤
其次,将上述步骤(3)中获得的sff file分为各MID tag后,与已知HLA等位基因的碱基序列数据库的数据进行比较,从而确定被测试样中所含的DNA的第3区域水平或第4区域水平的HLA等位基因(6位数或8位数水平)。
本发明的方法以上述表1中记载的引物组作为代表例。具有下述特征:在夹入HLA-II类的各基因的外显子2和外显子3的位置设定引物,确定跨越几乎全部区域扩增的DNA的序列,由此排除相位模糊(不确定性),可以获得与无效等位基因相关的信息。
在本发明中,通过重新设定使各HLA基因的PCR时的退火温度同一的引物组,可以在1台PCR装置中同时进行多个基因的PCR扩增。
而且,在本发明中,通过设定上述的新的引物组,可以进行在1~2管内同时扩增多个HLA基因的多重PCR。
并且,确认到:本发明中所使用的引物组和酶的组合也可以适宜高速PCR装置。因此,与以往相比,可以迅速且高精度地进行PCR。
实施例
以下,列举具体例对本发明进行更详细地说明,但本发明不限于这些实施例。
(实施例1) [目的]
确认HLA-II类各基因中的扩增情况。
[方法]
使用PrimeSTAR (注册商标) GXL DNA聚合酶(TaKaRa Bio株式会社)作为酶,以已提取的基因组DNA作为模板,使用HLA-II类的各基因特异性引物组(表1的SEQ ID NO: 1~7)进行了PCR。具体顺序如下所示。
(1) 向25ng的基因组DNA溶液中加入4μL的5xPrimeSTAR (注册商标) GXL缓冲液、1.6μL的dNTP溶液、各1μL (4pmol/μL)的PCR引物、0.8μL的Prime STAR (注册商标) GXL聚合酶,用灭菌水将反应液的总量调整至20μL。
(2) 将(1)的调制物在94℃下保温2分钟后,接着将在98℃下10秒钟、在70℃下3分钟的2步骤作为1个循环,将该循环重复30次进行了PCR。需要说明的是,在该PCR中,使用了GeneAmp (注册商标) PCR System9700 (Life Technologies社)。PCR后,利用琼脂糖凝胶电泳法确认了PCR产物的扩增情况。
[结果和讨论]
利用PrimeSTAR (注册商标) GXL DNA聚合酶可以进行HLA基因的PCR。使用所扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果示于图6。显示出:泳道1为相当于HLA-DRB1、HLA-DRB4和HLA-DRB5的包含外显子2和3的区域的PCR产物,泳道2为相当于HLA-DQB1的包含外显子2和3的区域的PCR产物,泳道3为相当于HLA-DPB1的包含外显子2和3的区域的PCR产物。在图6中泳道M表示DNA大小标记物。通过使用这些引物,对于HLA-II类的各基因,可以在目标分子量位置获得单一的PCR产物。
(实施例2)
[目的]
除了实施例1的HLA-II类之外,还验证包含HLA-A、HLA-B、HLA-C的HLA6座位中的多重PCR法的可能性。
[方法]
1. 以已提取且明确为HLA型、按照以往的DNA分型法观察到相位模糊的包含等位基因组合的6检体(表3的样品1~6)的基因组DNA作为模板,使用PrimeSTAR (注册商标) GXLDNA聚合酶(TaKaRa Bio株式会社),使用HLA-I类和HLA-II类的各基因特异性引物组(表2的SEQ ID NO: 8~15和表1的SEQ ID NO: 1~7)进行了PCR。具体顺序如下所示。
(1) PCR分为2本的0.2ml管来进行。即,使HLA-A、HLA-B、HLA-C在1本管中扩增,使HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1在1本管中扩增。
(2) 向25ng的基因组DNA溶液中加入4μL的5xPrimeSTAR (注册商标) GXL缓冲液、1.6μL的dNTP溶液、各3.2~5μL (10pmol/μL)的PCR引物、0.8μL的Prime STAR (注册商标)GXL聚合酶,用灭菌水将反应液的总量调整至20μL。
(3) 将(2)的调制物在94℃下保温2分钟后,接着将在98℃下10秒钟、在70℃下3分钟的2步骤作为1个循环,将该循环重复30次进行了PCR扩增。需要说明的是,在该PCR中使用了GeneAmp (注册商标) PCR System9700 (Life Technologies社)。PCR后,利用琼脂糖凝胶电泳法确认了PCR产物的扩增情况。
2. 确定了PCR产物的碱基序列。具体而言,如下进行。
(1) 将PCR产物按照AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter株式会社)的标准方案进行了纯化。
(2) 按照PicoGreen (注册商标) dsDNA定量试剂盒(Invitrogen社)的标准方案测定了浓度。
(3) 将纯化的来自I类基因的PCR产物和来自II类基因的PCR产物各等量进行了混合。
(4) 调整至500ng/100μL的浓度,按照GS Junior (Roche社)的标准方案,快速进行文库的制作,进行乳液PCR、测序,获得每1个样品解读1万5千个的碱基序列。
(5) 将这些序列与IMGT HLA数据库中注册的全HLA等位基因数据在全部解读之间进行同源性解析,选择了候补HLA等位基因序列。
(6) 将该候补HLA等位基因序列作为参考序列,使用GS Reference Mapper(Roche社),使参考序列和解读在100%一致的条件下进行制图,通过肉眼确认制图情况,鉴定了HLA等位基因。
[结果和讨论]
1. 使用已扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果示于图7中。在图7中,泳道1~6相当于使用表3的样品ID 1~6的PCR产物。泳道M是DNA大小标记物。从图7可知,在每一试样中,若对于HLA-I类和HLA-II类的各基因的PCR产物使用表1和表2所示的引物,也可以在目标分子量位置获得单一的扩增产物。而且,通过Sanger法确定PCR产物的碱基序列,结果获得了与已知不矛盾的HLA等位基因。因此,利用使用了表1和表2所示引物的PCR***可以进行HLA基因的DNA分型。
2. 使用按照以往的DNA分型法观察到相位模糊的包含等位基因组合的6个检体,利用GS Junior对来自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1的包含外显子2和外显子3的区域的各基因的PCR产物进行了HLA基因的DNA分型。其结果,所有的基因均可进行6位数水平的DNA分型(表3)。因此,利用本法,可以无相位模糊地在6位数水平以上进行HLA基因的DNA分型,同时可以高效检测也包含于内含子内的、成为无效等位基因的原因的碱基取代、***、缺失。
[表3]
(实施例3)
[目的]
验证HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5的HLA7座以及HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1的HLA9座中的多重PCR法的可能性。
[方法]
1. 以已提取且明确为HLA型、按照以往的DNA分型法观察到相位模糊的包含等位基因组合的4个检体(表4的样品1~4)的基因组DNA作为模板,使用PrimeSTAR (注册商标) GXLDNA聚合酶(TaKaRa Bio株式会社),使用HLA-I类和HLA-II类的各基因特异性引物组(表2的SEQ ID NO: 8~15和表1的SEQ ID NO: 1~5)进行了PCR。
关于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1,使用了表2的SEQ ID NO: 8~15和表1的SEQ ID NO: 1~5,关于HLA-DPB1,使用了DPB1-F2(5'- CTCAGTGCTCGCCCCTCCCTAGTGAT -3':SEQ ID NO: 16)和DPB1-R2 (5'-GCACAGTAGCTTTCGGGAATTGACCA -3':SEQ ID NO: 17)。DPB1-F2(SEQ ID NO: 16)和DPB1-R2(SEQ ID NO: 17)是特异性地扩增作为MHC-II类β链的HLA-DPB1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列,其将人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中HLA-DPB1基因的外显子2至3’非翻译区从上游侧和下游侧夹入。SEQ ID NO: 16具有相当于人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第33048182位~第33048207位的碱基序列。SEQ ID NO: 17具有相当于与人基因组碱基序列(参考序列:hg19)中的第33055428位~第33055453位的碱基序列互补的碱基序列。使用这些引物组时的根据参考序列预想的PCR产物的长度为约7,300个碱基(bp)。
PCR的具体方法如下所示。
(1) PCR分为2本的0.2ml管来进行。即,使HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5在1本的管中扩增。而且,使HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1在1本的管中扩增。
(2) 向25ng的基因组DNA溶液中加入4μL的5xPrimeSTAR (注册商标)GXL缓冲液、1.6μL的dNTP溶液、各3.2~5μL (10pmol/μL)的PCR引物、0.8μL的Prime STAR (注册商标)GXL聚合酶,用灭菌水将反应液的总量调整至20μL。
(3) 将(2)的调制物在94℃下保温2分钟后,接着将在98℃下10秒钟、在70℃下3分钟的2步骤作为1个循环,将该循环重复30次进行了PCR扩增。需要说明的是,该PCR中使用了GeneAmp (注册商标) PCR System9700 (Life Technologies社)。PCR后,利用琼脂糖凝胶电泳法确认了PCR产物的扩增情况。
2. 确定了PCR产物的碱基序列。具体而言,如下进行。
(1) 将PCR产物按照AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter株式会社)的标准方案进行了纯化。
(2) 按照PicoGreen (注册商标) dsDNA定量试剂盒(Invitrogen社)的标准方案测定了浓度。
(3) 将纯化的来自I类基因的PCR产物和来自II类基因的PCR产物各等量地进行了混合。
(4) 调整至500ng/100μL的浓度,按照Ion PGM (Life Technologies社)的标准方案,进行文库的制作,进行乳液PCR、测序,获得了每1个样品解读40万个的碱基序列。
(5) 将这些序列与IMGT HLA数据库中注册的全HLA等位基因数据在全部解读之间进行同源性解析,选择了候补HLA等位基因序列。
(6) 将该候补HLA等位基因序列作为参考序列,使用GS Reference Mapper(Roche社),使参考序列和解读在100%一致的条件下进行制图,通过肉眼确认制图情况,鉴定了HLA等位基因。
[结果和讨论]
1. 使用已扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果示于图8中。在图8中,泳道1~4相当于使用表3的样品ID 1~4的PCR产物。最左侧的泳道是DNA大小标记物。从图8可知,在HLA7座和HLA9座的每一试样中,若对各基因的PCR产物使用上述的引物,也可以在目标分子量位置获得单一的扩增产物。
2. 使用按照以往的DNA分型法观察到相位模糊的包含等位基因组合的4个检体,利用Ion PGM对来自各基因的PCR产物进行了HLA分型。其结果,所有的基因均可进行6位数水平的分型(表4)。因此,利用本法,可以无相位模糊地在6位数水平以上进行HLA分型,同时可以高效检测也包含在内含子内的、成为无效等位基因的原因的碱基取代、***、缺失。
[表4]
Claims (7)
1. HLA基因的DNA分型方法,该方法包括以下步骤:
(1) 准备对人基因组碱基序列中的选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1和HLA-DPB1的至少1个靶基因的包含外显子2和外显子3的内含子1区域和外显子4区域分别特异性地退火的引物组的步骤;
(2) 使用上述引物组通过PCR法对被测试样DNA进行DNA扩增的步骤;
(3) 确定所扩增的PCR产物的碱基序列的步骤;以及
(4) 任选地,实施与数据库的同源性检索的步骤。
2. 权利要求1所述的方法,其中,上述靶基因为选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5的至少一个基因,上述引物组为分别具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示碱基序列的寡核苷酸。
3. 权利要求1所述的方法,其中,上述靶基因为HLA-DQB1基因,上述引物组为分别具有SEQ ID NO: 3和4的任一者或两者、以及SEQ ID NO: 5所示碱基序列的寡核苷酸。
4. 权利要求1所述的方法,其中,上述靶基因为HLA-DPB1基因,上述引物组为分别具有SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7所示碱基序列的寡核苷酸。
5. 选自HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5的至少一个基因的DNA分型用引物组,该引物组包含分别具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示碱基序列的寡核苷酸。
6. HLA-DQB1基因的DNA分型用引物组,该引物组包含分别具有SEQ ID NO: 3和4的任一者或两者、以及SEQ ID NO: 5所示碱基序列的寡核苷酸。
7. HLA-DPB1基因的DNA分型用引物组,该引物组包含分别具有SEQ ID NO: 6和SEQ IDNO: 7所示碱基序列的寡核苷酸。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1231129 Country of ref document: HK |
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GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |