JP6592505B2 - インターロイキン−2のスーパーアンタゴニスト、パーシャルアゴニスト及びアンタゴニスト - Google Patents
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Description
本明細書で引用された全ての参考文献は、完全に記載されているかのように、その全体が参照により組み込まれる。別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons(New York,NY 2001);March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 5th ed.,J. Wiley & Sons(New York,NY 2001);及びSambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2001)は、当業者に、本開示で使用される多くの用語に対する一般的指針を提供する。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、別途記載のない限り、製造業者の定めたプロトコール及び/またはパラメータに従って、一般的に実施される。
配列番号1
配列番号2
配列番号3
配列番号4
IL−2ムテインパーシャルアゴニスト及びアンタゴニスト
一態様では、パーシャルアゴニスト及びアンタゴニストであるIL−2ムテインが、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、野生型IL−2(例えば、ヒトIL−2、配列番号2)と比較して、IL−2ムテインのIL−2Rγc受容体に対する結合親和性を低減させる1つ以上の変異を含有するIL−2ムテインが、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「共通γ鎖」、「γc」、「IL−2Rγc」、「Yc」、「IL−2Rγ」、「IL−2受容体サブユニットγ」、及び「IL−2RG」(Genbank受託番号:NM_000206及びNP_000197(ヒト)ならびにNM_013563及びNP_038591(マウス))という用語は全て、IL−2、IL−4、IL−7、IL−9、IL−15、及びIL−21受容体を含むが、これらに限定されない少なくとも6つの異なるインターロイキン受容体のための受容体複合体に対するサイトカイン受容体サブユニットであるI型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーを指す。IL−2Rγcは、IL−2Rβと相互作用して、主にメモリーT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞上に中程度の親和性IL−2受容体を形成し、IL−2Rα及びIL−2Rβと相互作用して、活性化されたT細胞及び制御T細胞(Tregs)上に、高親和性IL−2受容体を形成する。特定の動作理論に束縛されるものではないが、このようなムテインは、IL−2Rβ+/IL−2Rγc+細胞(例えば、休止T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞)上のIL−2Rβと結合する際に、IL−2β/IL−2γcヘテロ二量化及びシグナル伝達を減弱させる、または、阻害することにより、IL−2パーシャルアゴニストまたはアンタゴニストとして機能できると考えられている。
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(式中、各nは、0または1から個別に選択され;
X1は、L(野生型)またはRであり;
X2は、Q(野生型)またはEであり;
X3は、I(野生型)またはVであり;
X4は、P(野生型)またはHであり;
X5は、Q(野生型)、R、H、N、またはSであり;
X6は、L(野生型)、F、またはVであり;
X7は、R(野生型)、I、T、またはDであり;
X8は、L(野生型)またはVであり;
X9は、I(野生型)またはVであり;
X10は、I(野生型)またはVであり;
X11は、I(野生型)またはFであり;
X12は、V(野生型)またはIであり;
X13は、A(野生型)またはTであり;
X14は、S(野生型)またはRである(配列番号50))。
種々の実施形態では、本発明の実施に際して使用されるポリペプチドは、合成ポリペプチドであるか、または、組換え核酸分子の発現により産生される。ポリペプチドが、キメラ(例えば、少なくとも変異体IL−2ポリペプチド及び異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質)である場合、変異体IL−2の全部または一部をコードする1つの配列、及び、異種ポリペプチドの全部または一部をコードするもう1つの配列、を含有するハイブリッド核酸分子によりコードできる。例えば、本明細書に記載される主題のIL−2ムテインは、細菌で発現させたタンパク質の精製を容易にするために、ヘキサヒスチジンタグに融合されても良く、または、真核細胞で発現させたタンパク質の精製を容易にするために、赤血球凝集素タグに融合されても良い。
前述したように、例示的な主題のIL−2ムテインは、主題のIL−2ムテイン及び異種ポリペプチド(すなわち、IL−2またはその変異体でないポリペプチド)(例えば、米国特許第6,451,308号を参照のこと)を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製できる。例示的な異種ポリペプチドは、インビボで、キメラポリペプチドの循環半減期を増加させることができ、それ故、変異体IL−2ポリペプチドの特性をさらに強化することがある。種々の実施形態では、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、または、IgGの重鎖可変領域を欠く抗体のIgGサブクラスのFc領域であることがある。例示的なFc領域は、補体固定及びFc受容体結合を阻害する変異を含むことができるか、または、溶解性があっても良く、すなわち、補体と結合することができるか、若しくは、抗体依存性補体溶解(ADCC;1994年12月12日に出願されたUSSN08/355,502)などの別の機構で細胞を溶解させることができる。
一部の実施形態では、主題のIL−2ムテインは、単独で、または、上述したようなキメラポリペプチドの一部として、核酸分子の発現により得ることができる。IL−2ムテインが、野生型IL−2ポリペプチドとの同一性の観点から記載できることと同様に、それらをコードする核酸分子も、野生型IL−2をコードするものと一定の同一性を必然的に有することになる。例えば、主題IL−2ムテインをコードする核酸分子は、野生型IL−2(例えば、配列番号2)をコードする核酸と少なくとも50%、少なくとも65%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも95%(例えば、99%)同一であることができる。
上記核酸分子は、例えば、ベクターが形質導入されている細胞において、核酸分子の発現を指示することができるベクター内に含まれる可能性がある。従って、主題のIL−2ムテインに加えて、主題のIL−2ムテインをコードする核酸分子も含有する発現ベクター、及び、これらのベクターがトランスフェクションされた細胞は、好ましい実施形態の1つである。
一部の実施形態では、主題のIL−2ムテイン及び/またはそれらを発現する核酸は、対象に投与して、異常なアポトーシスまたは分化プロセスと関連する障害(例えば、能動または受動免疫を生成することにより、例えば、癌などの細胞増殖障害または細胞分化障害)を治療できる。このような疾患の治療では、開示されるIL−2ムテインは、血管漏出症候群の低減などの有利な性質を有することがある。
一部の実施形態では、主題のIL−2ムテイン及び核酸は、医薬組成物を含む組成物に組み込むことができる。このような組成物は通常、ポリペプチドまたは核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む。
IL−2は既にバクテリオファージ上にディスプレイされている(Buchli et al.,Arch. Biochem. Biophys.339:79−84,1997)が、従来の系は、指向的進化に従わず、それ故、IL−2Rのサブユニットに対する結合が改善されたIL−2の変異体を得るのに好適でない。これを克服するため、IL−2を、酵母細胞の表面に発現させた。ヒトIL−2DNAを、酵母ディスプレイベクターであるpCT302にクローニングした。Saccharomyces cerevisiaeの株EBY100を、pCT302_IL−2ベクターで形質転換し、SD−CAAプレート上30℃で3日間成長させた。IL−2酵母の個別のコロニーを、SD−CAA中30℃で一晩成長させ、次に、20℃で2日間SGCAAに導入した。酵母を、ビオチン化γの存在下で、四量体化ビオチン化IL−2Rβ、ビオチン化γ、またはビオチン化IL−2Rβで染色した。IL−2Rβ及びγの外部ドメインを、C末端でビオチン化し、染色及び選別試薬として使用されるフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジンに連結させた。氷上で15分間、2μΜのビオチン化IL−2Rβを、470nMのストレプトアビジン−フィコエリトリン(SA−PE、Invitrogen)とインキュベーションすることにより、IL−2Rβ四量体を形成した。これらの受容体「四量体」は、低親和性単量体外部ドメイン(ECD)のIL−2との相互作用の結合活性を強化して、ライブラリからのIL−2多様体の最大限の回収を可能にした。溶体の野生型IL−2と同様に、IL−2Rβ単独に弱く結合する、酵母により提示されるIL−2は、γ単独には全く結合しないが、フローサイトメトリー(データは示さない)により見られる対角染色(diagonal staining)で証明されるように、IL−2Rβの存在下ではγに結合した。従って、酵母ディスプレイされるIL−2は、可溶性のIL−2に見られる、細胞上におけるヘテロ二量体受容体複合体の協調的アセンブリを繰り返し、それ故、ライブラリ選択のためのプラットフォームとして適する。
第1世代のインビトロ戦略は、IL−2遺伝子全体のエラープローンPCRライブラリを作成することであった。第1世代の変異体IL−2ライブラリは、次のように構築した。野生型ヒトインターロイキン2(IL−2)を、製造者の使用説明書に従い、GeneMorph(登録商標)IIランダム変異誘発キットを使用するエラープローン変異誘発にかけた。次のプライマーを、エラープローンPCRのために使用した:5’−GCACCTACTTCAAGTTCTAC−3’(IL−2_errprone_for)及び5’−GCCACCAGAGGATCC−3’(IL−2_errprone_rev)。次に、次のプライマー:5’AGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCACCTACTTCAAGTTCTAC−3’(配列番号33)及び5’ACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTCGCCACCAGAGGATCC−3’(配列番号34)を使用して、エラープローンPCR反応の生成物を増幅して、約130μgのDNAを得た。酵母ディスプレイベクターpCT302を、制限酵素NheI及びBamHIでダブル消化し、ゲル精製した。エレクトロコンピテントEBY100酵母と、IL−2DNA及びpCT302DNAを、5:1のμg比で共に混合した。酵母を電気穿孔して、ライブラリDNAの酵母への移入を容易にした。この電気穿孔を約20回繰り返し、最終ライブラリサイズ1×108の形質転換体を得た。
第1世代のIL−2ライブラリの選択:
ライブラリは、IL−2Rβに対する選択に6回かけた(図2A)。第1回では、ライブラリを470nMの四量体のIL−2Rβで標識した。これは、2μMのビオチン化IL−2Rβを470nMのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート(SAV−PE)と15分間混合することにより形成した。ライブラリを、IL−2Rβと1.5時間インキュベーションし、PBS−BSA緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水+ウシ血清アルブミン)で洗浄し、Miltenyi 抗PE MicroBeadsと4℃で20分間インキュベーションした。細胞を再度洗浄し、選択用の磁気カラムに流した。IL−2Rβの濃度(2回目:1μM、3回目:1μM、4回目:300nM、5回目:300nM、6回目:100nM、全て単量体IL−2Rβ)のみを変更して、この選択方法をさらに5回反復することに成功した。選択の終わりに、5回目及び6回目の酵母培養物をSD−CAAプレート上に塗布し、これが、個別の酵母コロニーを生じた。得られる18の酵母コロニーを、500nMのIL−2Rβへの結合について試験した。これらの18の酵母コロニーから単離されたIL−2DNAを、配列決定した。これらの18個の酵母コロニー間の、野生型IL−2の対応する残基と比較したアミノ酸の差異を、表1に示す。
第2世代のIL−2ライブラリのライブラリ構築:
L85Vを含有する高い割合のクローンに基づき、第2のIL−2ライブラリを、主に疎水性のコア残基に焦点を当てて構築した。Q74、L80、R81、L85、I86、I89、I92、V93に変異を有する部位特異的IL−2ライブラリを構築した。Q74を、H/K/N/Q/R/Sとして変化させた。R81は、NNK縮重コドンを伴う20アミノ酸の全てで変化させた。ここで、Nは、アデニン、チミン、グアニン、及びシトシンヌクレオシドのそれぞれ25%の混合物を表し、Kは、グアニンまたはチミンのいずれかである。残りの残基を、F/I/L/Vとして変化させた。ライブラリを、次のオリゴを使用するアセンブリPCRにより構築した。
IL−2_affmat_ass01
(配列番号35)
IL−2_affmat_ass02
(配列番号36)
IL−2_affmat_ass03
(配列番号37)
IL−2_affmat_ass04B
(配列番号38)
IL−2_affmat_ass05B
(配列番号39)
IL−2_affmat_ass06
(配列番号40)
IL−2_affmat_ass07
(配列番号41)
IL−2_affmat_ass08
(配列番号42)
IL−2_affmat_ass09
(配列番号43)
IL−2_affmat_ass10
(配列番号44)
IL−2_affmat_ass11
(配列番号45)
IL−2_affmat_ass12
(配列番号46)
IL−2_affmat_ass13
(配列番号47)
部位特異的PCRを、次のオリゴで増幅した。
PCR増幅オリゴ(50bp相同性を含む)
IL−2_site2_assFor:
第2世代IL−2ライブラリの選択:
ライブラリを、IL−2Rβに対する選択に5回かけた(図2B)。使用されるIL−2Rβの濃度(1回目:1μM、2回目:100nM、3回目:30nM、4回目:30nM、5回目:10nM、全て単量体IL−2Rβ)のみを変更して、この選択方法を、第1世代ライブラリと全く同様に、実施した。選択の終わりに、4回目及び5回目の酵母培養物をSD−CAAプレート上に塗布し、これが、個別の酵母コロニーを生じた。両方の回からの48の個別の酵母クローンを、96ウェルブロックフォーマットで成長させ、5nMのIL−2Rβ、次に、SAV−PEで標識することによりスクリーニングした。スクリーニングにより、IL−2Rβへの7つの高親和性結合物が生じた(図3及び表2)。野生型IL−2の対応する残基と比較した、これらの7個の高親和性結合物間のアミノ酸の差異を、IL−2Rβに対する結合親和性と共に表2に示す。
ヒトIL−2多様体(アミノ酸1〜133)、IL−2Rβ外部ドメイン(アミノ酸1〜214)、及びγc(アミノ酸34〜232)を、N末端gp67シグナル配列及びC末端ヘキサヒスチジンタグとインフレームでpAcGP67−Aベクター(BD Biosciences)にクローニングし、バキュロウイルス発現系を使用して生成した。SF900II培地(Invitrogen)中で成長したSpodoptera frugiperda(Sf9)細胞におけるトランスフェクション及び増幅により、バキュロウイルスストックを調製し、BioWhittaker(登録商標)Insect−XPRESS(商標)培地(Lonza)中で成長したTrichoplusia ni(High Five(商標))細胞懸濁液中で、タンパク質発現を実施した。タンパク質を発現させ、ニッケルアガロース(QIAGEN)により48〜60時間後のHigh Five(商標)上清から捕捉し、10mMのHEPES(pH7.2)及び150mMのNaCl中で平衡化されたSuperdex(商標)200カラム(GE Healthcare)のサイズ排除クロマトグラフィーで濃縮及び精製した。SPR及び細胞系アッセイに使用されるIL−2多様体を、完全にグリコシル化させて発現させた。ビオチン化受容体発現の場合、IL−2Rβ及びγcを、C末端ビオチンアクセプタペプチド(BAP)LNDIFEAQKIEWHE及びヘキサヒスチジンタグと、pAcGP67−Aベクターにクローニングした。受容体タンパク質を、過剰なビオチン(100uM)を有するBirAリガーゼと共に共発現させた。
10%のウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミン、最小限の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、25mMのHEPES、及びペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)が補充されたRPMI1640培地中で、YT−1細胞及びCD25+YT−1細胞を培養した。CD25+YT−1細胞を、次のように精製した:1×107個の細胞をFACS緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水+2%のウシ血清アルブミン)で洗浄し、4℃で20分間、FACS緩衝液1mL中、PEとコンジュゲートした抗ヒトCD25(1:20;Biolegend,San Diego,CA)で染色した。染色された細胞を、抗PE IgGへと連結された常磁性マイクロビーズで標識し、製造者(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)の使用説明書に従い、LS MACS(登録商標)分離カラムにより分離した。溶出された細胞を、完全RPMI培地中に1×105個の細胞濃度で再懸濁させ、後続の実験のために増殖させた。Accuri(登録商標)C6フローサイトメーターを使用して、FL−2チャネルでのフローサイトメトリーで、細胞の濃縮をモニタリングした。
ヒト及びマウスのCD4T細胞を、PBMC(Stanford Blood Bank)ならびにBALB/Cマウスの脾臓及びリンパ節から、それぞれ、抗体でコーティングされたCD4 T細胞単離磁気ビーズ(Stem Cell Technologies及びMiltenyi Biotec)を使用して調製した。ナイーブ細胞刺激アッセイの場合、細胞を即座に使用した。「経験のある(experienced)」T細胞のインビトロ生成の場合、100ng/mLの抗CD3(ヒトの場合OKT3、マウスの場合2C11、eBiosciences)でプレートをコーティングする前に、ウェルを、pH9.6の重炭酸緩衝液中の二次抗体(Vector Labs)でプレコーティングした。T細胞を、可溶性の抗CD28(ヒトの場合CD28.2、マウスの場合37.51、eBiosciences)と、0.1×106個の細胞/ウェルで播種した。細胞を、刺激された完全TCRと3日間培養した後、馴化培地中に2日間静置し、新鮮な培養培地中に2日間静置した。使用前に、生細胞を、Lympholyte−M(Cederlane)遠心分離で回収し、計数した。
EGFR(内皮成長因子受容体)発現扁平上皮癌細胞株(SCC6)及びEGFRモノクローナル抗体セツキシマブを使用して、ナチュラルキラー細胞の機能、特に、自発的な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)におけるD10 IL−2ムテインの効果を評価した。ヒトEGFR+扁平上皮癌細胞株SCC6を、J.Sunwoo研究室(Stanford,CA)から供与された。10%の加熱不活性化したFCS(HyClone Laboratories)、100U/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシン(いずれもInvitrogen Life Technologies製)が補充されたDMEM/F12培地(Invitrogen Life Technologies)中で、SCC6細胞株を培養した。細胞を、5%CO2中37℃で、培養液中に付着させて成長させた。セツキシマブ(マウスキメラIgG1抗ヒト上皮成長因子受容体−EGFR、IMC−C225、Erbitux(登録商標))を、Bristol−Myers Squibbから入手した。
低レベルのCD25を発現するが、高レベルのIL−2Rβγを発現するメモリー表現型CD8+T細胞の増殖におけるIL−2ムテインH9の効能を、インビボで評価した。C57B1/6マウスは、PBS、20μgのIL−2、20μgのH9、または1.5μgのIL−2/抗IL−2モノクローナル抗体複合体のいずれかを投与され、脾臓のCD3+CD4+CD44highメモリー表現型T細胞の全細胞数を、フローサイトメトリーで評価した。脾臓細胞懸濁液を調製し、蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体CD3(クローン145−2C11、eBioscience)、CD4(クローンRM4−5、Caltag Laboratories)、CD8a(クローン53−6.7、BD Biosciences)、CD25(クローンPC61、BD Biosciences)、CD44(クローンIM7、eBioscience)NK1.1(クローンPK136、BD Biosciences)、及びThy1.1(クローンHIS51、eBioscience)で染色した。少なくとも100,000個の生存細胞を、BD FACSCanto(商標)IIフローサイトメーターを使用して取得し、FlowJoソフトウェア(TriStar, Inc.)を使用して解析した。図10Aに示されるように、開示されるIL−2ムテインでの治療は、CD3+CD4+CD25highT細胞である制御性T細胞の増殖は制限されながら、他の治療法と比較して、メモリー表現型T細胞のより大きい増殖をもたらした(図10B)。
IL−2治療は、急性肺浮腫などの重度の有害な影響をもたらす可能性があることが知られており、これは、現時点では、IL−2の有効な使用を妨げる制約となっている。従って、IL−2と比較した、開示されるIL−2ムテインの毒性を評価した(図11A)。C57B1/6マウスは、PBS、IL−2 20μg、H9 20μg、または1.5μgのIL−2/抗IL−2モノクローナル抗体複合体の毎日の腹腔内注射を、5日間連続して受けた。養子細胞移入の6日後、肺を取り出し、真空下58℃で一晩乾燥する前後で計量した。肺の湿潤重量は、脱水後の肺重量から初期の肺重量を差し引くことにより計算した。
開示されたIL−2ムテインの腫瘍細胞に対する効能を、インビボで試験した。100μlのRPMI中の106個のB16F10黒色腫細胞を、マウス(群当たり3〜4匹のマウス)の背部の真皮上層に注射した。治療は、PBS、20μgのIL−2、20μgのH9、または1.5μgのIL−2/抗IL−2モノクローナル抗体複合体(IL−2/mAb)のいずれかの毎日の注射5回からなり、腫瘍小塊が約15mm2のサイズではっきりと目に見え、かつ触知できた1日後に開始した。開示されるIL−2ムテインは、図11Bで実証されるように、インビボでの抗腫瘍活性の強化をもたらした。
表面プラズモン共鳴(SPR)により、IL−2ムテインのIL−2Rβに対する結合親和性及び反応速度を測定するために、IL−2ムテインのうちのいくつかを組換え発現させた。IL−2及びIL−2Rβ間の親和性は、KD=280nMであった。IL−2ムテインを、低親和性、中親和性、及び高親和性のクラスにクラスタリングした。低親和性IL−2ムテイン(5−2及び6−6)は、それぞれ、50〜70nMのKDでIL−2Rβと結合し、野生型IL−2の4〜6倍の親和性の獲得は、ほぼ完全にL85V置換によるものであった。第2の部位特異的ライブラリから選択された中親和性及び高親和性変異体は、それぞれ、10〜15nM(C5、H4)及び1.2〜1.7nM(B1、D10、E10、G8、H9)のKDを有した。親和性の増加は、オフレートの減少に一様に現れ、高親和性のIL−2ムテインは、L80F/R81D/L85V/I86V/I92Fのうちの無作為の位置にコンセンサス配列を含有した。
IL−2Rβに対する結合親和性の強化により、作用が増大するIL−2「スーパーカイン」は、以前に開発された(Levin et al.,Nature 484:529(2012))。この高親和性スーパーカイン/IL−2Rβ複合体が、内因性のシグナル伝達を遮断する「受容体シグナル伝達クランプ」を生成するドミナントネガティブなスカフォールドとして役立つことができると仮定された。γcへの結合を減少させる、これらのスーパーIL−2「完全アゴニスト」の定方向変異は、IL−2Rβγcのヘテロ二量化を減弱させ、作用機序に基づいたIL−2パーシャルアゴニスト、及び、内因性サイトカインを遮断し、それ自身の作用はなんら発揮しないことによりアンタゴニストとして機能的に作用する非シグナル伝達(ニュートラル)分子の新しいクラスを表すであろう(図1の概略図を参照のこと)。
インビトロのIL−2/IL−15アンタゴニストとしてのH9−RETRの有効性を前提として、発明者らは、インビボでの内因性サイトカインの効果に拮抗する能力を調べた。IL−2が、短い血清半減期を有するので(Boyman et al.,Nature Reviews Immunology 12:180(2012))、H9−RETRを、抗体依存性細胞傷害/食作用(ADCC/ADCP)が減少したアイソタイプであるヒトIgG4のFcフラグメント(Fc4)に融合させた(Strohl,Current Opinion in Biotechnology 20:685 (2009))。驚くべきことに、CD25に対する抗Tac mAb及びIL−2Rβに対するMikβ1 mAb(Morris et al.,Proc Natl Acad Sci USA 103:401(2006))と比較された場合、H9−RETR−Fc4は、予め活性化されたヒトCD8+T細胞において、IL−2媒介性(図18C)及びIL−15媒介性(図18D)pSTAT5誘導を非常により強力に遮断し、ヒトCD8+T細胞のIL−2誘導性(図18E)及びIL−15誘導性(図18F)増殖を遮断した。重要なことに、H9−RETR−Fc4は、IL−2増殖を遮断することにおいて、抗Tac及びMikβ1の組み合わせと同程度の有効性があり(図18E)、IL−15誘導性増殖を阻害することにおいて、Mikβ1よりもより強力であった(図18F)。
タンパク質発現及び精製
ヒトIL−2(アミノ酸1〜133)及びその多様体、ヒトIL−2Rβ外部ドメイン(アミノ酸1〜214)、ならびにγc外部ドメイン(アミノ酸34〜232)を、上述のように、バキュロウイルス発現系を使用して分泌及び精製した(Morgan et al.,Science 193:1007(Sep 10,1976))。簡単に言うと、全ての構築物配列を、N末端gp67シグナルペプチド及びC末端ヘキサヒスチジンタグを有するpAcGP67Aベクター(BD Biosciences)にクローニングした。SF900II SFM培地(Invitrogen)中28℃で培養されたSpodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞を、プラスミド構築物とトランスフェクションして、高力価組換えウイルスを樹立し、続いて増幅した。Insect−XPRESS(商標)培地(Lonza)中28℃で成長したTrichopulsia ni(High−Five(商標))昆虫細胞(Invitrogen)を、抗力価ウイルスに感染させて、組換えタンパク質を発現させた(Zhu et al.,Annual Review of Immunology 28:445(2010)及びW. Liao et al.,Nat Immunol 9:1288(2008))。組換えウイルスに感染した3日後に、タンパク質をNi−NTA(Qiagen)アフィニティークロマトグラフィーで抽出し、濃縮し、10mMのHEPES(pH7.3)及び150mMのNaCl中で平衡化されたSuperdex200サイジングカラム(GE Healthcare)で>98%の均質性までさらに精製した。Fc4及びFc4−RETR融合タンパク質も、ヒトIgG4 Fcドメイン(Fc4)またはヒトIL−2RETR多様体、続いて、C末端ヒトIgG4 Fcドメイン(Fc4−RETR)を、N末端gp67シグナルペプチド及びC末端ヘキサヒスチジンタグを含有するpAcGP67Aベクターにクローニングすることにより、このバキュロウイルス発現系を使用して分泌及び精製した。ヒトIgG4 Fcドメインを、改変されたSer228Pro変異を有する変性pFUSE−hIgG4−Fcベクター(Invivogen)から得た(Liao et al.,Nat Immunol 12:551(2011))。インビボの実験の場合、内毒素を、上述したように、Triton X−114を使用して調製されたタンパク質から除去した(Cheng et al.,Immunol Rev 241:63(2011))、内毒素除去をLAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit(Thermo Scientific)で確認した。
Biacore T100機器でBiacore SAセンサーチップ(GE Healthcare)を使用する結合相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)研究により特性決定した。γcを、低密度でチップ表面に固定し(RUmax<100応答単位)、及びH9:IL−2RβまたはH9−RET:IL−2Rβ複合体の系列希釈液を、60秒間表面に曝露した。次に、解離を200秒間追跡した。無関係なビオチン化タンパク質を、参照チャネル内に固定して、非特異的結合を測定値から差し引いた。実験を、25℃で、0.2%のBSAが補充されたHBS−P+緩衝液(GE Healthcare)中で実施した。全ての結合研究を、30mL/分の流速で実施して、物質輸送の寄与を最小限にし、検体の再結合を防止した。測定値については、データ解析ならびに平衡及び動態パラメータの決定を、1:1のラングミュア結合モデルを想定した、BiacoreT100評価版ソフトウェア バージョン2.0を使用して実施した。
未変性YT9(Zhu et al.,Annual Review of Immunology 28:445(2010))及びCD25+YT−1ナチュラルキラー様細胞(Liao et al.,Nat Immunol 9:1288(2008))を、RPMI完全培地(10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、最小限の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、25mMのHEPES、及びペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)が補充されたRPMI1640培地)中で培養した。両方の細胞株を、5%のCO2の加湿雰囲気中、37℃で維持した。
約2×105個のYT細胞またはCD25+YT−1細胞を、96ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、FACS緩衝液で洗浄し、IL−2、H9、H9−RET、またはH9−RETRの系列希釈液を含有するFACS緩衝液で再懸濁させた。細胞を、37℃で20分間刺激し、1.5%までのホルムアルデヒドの添加により直ちに固定し、続いて、室温で10分間インキュベーションした。次に、細胞を、4℃30分間100%の氷冷メタノールで透過処理して、細胞内シグナルエフェクターの検出を可能にした。固定及び透過処理された細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄し、室温で2時間、FACS緩衝液で希釈されたAlexa488コンジュゲート抗STAT5 pY694(BD Biosciences)またはAlexa488コンジュゲート抗ERK1/2 pT202/pY204(BD Biosciences)とインキュベーションした。次に、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄し、平均蛍光強度(MFI)を、Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences)で定量化した。刺激されていない細胞のMFIを差し引き、サイトカイン刺激により誘導された最大シグナル強度に正規化した後に、用量−反応曲線を生成し、EC50及びEmax値を、グラフパッドプリズムデータ解析ソフトウェアを使用して計算した。
バフィーコートを、NIH Blood Bankの健康なドナーから得、リンパ球分離培地(Mediatech, Inc.,VA)を使用して、末梢血単核球細胞(PBMC)を、勾配遠心分離により単離した。ヒトCD8+T細胞アイソレーションキットI(Miltenyi Biotec,Germany)を使用して、細胞を単離した。細胞を予め活性化する場合、6ウェルプレートを、2μg/mlのプレート結合抗CD3 mAb(BD Biosciences)でプレコーティングした。細胞を、3日間1μg/mlの可溶抗CD28 mAb(BD Biosciences)を有する完全培地(グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び10%のFBSが補充されたRPMI培地)に1×106個の細胞/mlで播種して、次に、新鮮な培地中に48時間置いた。初代ヒトCD8+T細胞における用量−反応実験を、上述したように実施した(Liao et al.,Immunity 38:13(2013));簡単に言うと、細胞を、IL−2、H9、H9−RET、H9−RETRの系列希釈液で処理し、次に、10分間室温で、Phosflow Fix Buffer I(BD Biosciences)で固定し、FACS緩衝液で1回洗浄した。次に、冷BD Phosflow(商標)Perm Buffer IIIを徐々に加えることにより、細胞を、透過処理し、氷上で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、暗所で30分間室温で、PEコンジュゲート抗STAT5 pY694(BD Biosciences)またはAPCコンジュゲート抗ホスホ−S6リボソームタンパク質(Ser235/236)(クローンD57.2.2E)で染色し、FACS緩衝液で再度洗浄し、データを、FACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得し、FlowJo(Tree Star)を使用することにより解析した。
C57BL/6マウスを、Jackson実験室から入手した。動物プロトコールは、NHLBI Animal Care and Use Committeeから承認を得、NIHのガイドライン「Using Animals in Intramural Research」に従った。STAT5リン酸化を、製造者のプロトコール(BD Bioscience)を使用してアッセイした。簡単に言うと、IL−2またはIL−15を、C57BL/6マウスに腹腔内注射し、全脾細胞を単離し、BD Phosphoflow(商標)Lyse/Fix緩衝液を使用して直ちに固定し、氷冷PBSで2回洗浄し、抗CD4及び抗CD25抗体(Biolegend)を使用して染色し、次に、暗所の氷上で30分間、BD PhosFlow Perm Buffer IIIを使用して透過処理した。次に、細胞を氷冷FACS緩衝液で2回洗浄し、製造者のプロトコール(eBioscience)により、抗FoxP3で染色し、氷冷FACS緩衝液で2回洗浄し、暗所で30分間室温で、抗ホスホ−STAT5−PE(1:30)(BD)で染色した。細胞を、FACS緩衝液で3回洗浄して、データをFACSCantoフローサイトメーター(BD)で取得し、FlowJo(Tree Star)を使用して解析した。
IL−2、H9、H9−RET、またはH9RETR(1μM)を、2、5、10、15、30、60、90、120、180、または240分間、96ウェルプレート中で、3×105個のYT−1細胞とインキュベーションした。さらなる受容体の内在化を防ぐために、細胞を直ちに氷に移し、氷冷PBSA緩衝液(PBS中0.1%のBSA)で2回洗浄した。細胞を、氷上で30分間、PBSA緩衝液中で、アロフィコシアニンコンジュゲート抗ヒトIL−2Rβ抗体(TU27;Biolegend)及びフィコエリトリンコンジュゲート抗ヒトIL−2Rγ抗体(TUGh4;Biolegend)の1:50の希釈液で同時染色した。氷冷PBSA緩衝液でさらに2回洗浄した後に、細胞を、PBSA中1.5%のパラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、最後に1回洗浄し、PBSA緩衝液中で再懸濁した。平均細胞蛍光を、Accuri C6フローサイトメーターで定量化した。内在化データを、Prismソフトウェアパッケージ(GraphPad)の非線形最小二乗回帰法を使用して、単一指数減衰モデルに適合させた。
新たに単離されたヒトCD8+T細胞及び予め活性化されたヒトCD8+T細胞を、H9−RETまたはH9−RETRIL−2の不存在下または存在下で、IL−2で刺激し、pSTAT5のレベルを評価した。細胞を、抗Tac若しくはMikβ1またはFc4−H9−RETRを用いてまたは用いずに1時間インキュベーションし、次に、30分間広範な用量のIL−2またはIL−15で刺激し、pSTAT5のレベルをフローサイトメトリーで測定した。NK細胞実験の場合、新たに単離されたヒトNK細胞(NK細胞アイソレーションキットII、Miltenyi Biotech)を、示されたIL−2多様体の存在下または不存在下で、IL−15の系列希釈液で刺激し、pSTAT5を評価した。
サイトカインを用いてまたは用いずに刺激された細胞を、1%のIGEPAL CA−630(Sigma)を含有するRIPA緩衝液に溶解させた。等量の溶解物を、4〜12%のBis−Tris NuPAGEゲル(Invitrogen)上で分離させ、膜に転写し、この膜を、pSTAT5(Y694)に対する抗体(Cell Signaling Technology, Inc.,Beverly,MA)またはSTAT5 (BD Transduction Laboratories,San Diego,CA)と室温で1時間インキュベーションした。結合された抗体を、ヤギ抗ウサギIgG(H+L)−HRPコンジュゲート(1:5,000希釈)及びヤギ抗マウスIgG(H+L)−HRPコンジュゲート(1:10,000希釈)(Biorad)で検出した。増強化学発光(ECL,GE healthcare)を使用して、免疫ブロットを可視化した。一部の実験では、室温で15分間ストリッピング緩衝液(Millipore)中でインキュベーションした後に、膜を再利用した。
新たに単離されたCD8+T細胞または予め活性化されたCD8+T細胞(20×106個/ml)を、7分間室温で、PBS中の2.5μMのCFSE(Molecular Probes)で標識して、100%FBS(2ml/試料)で1回すぐに洗浄して、次に完全RMPI中で洗浄した。2×106個/mlのCFSE標識細胞を、野生型IL−2、H9、H9−RET、H9−RETR、またはH9−RETRを加えたIL−2の不存在下または存在下で培養した。示された時点でのCFSE希釈物をフローサイトメトリー分析することにより、細胞増殖を評価した。EdU増殖アッセイの場合、上記のように予め活性化されたCD8+T細胞を培養した。採取の16時間前に、製造者のプロトコール(BD Biosciences)に従い、10mMのEdUを添加し、細胞を、示されるような表面抗原について染色し、次に、細胞内EDUについて染色した。細胞増殖を、フローサイトメトリーで評価した。
IL−2依存性ED40515(+)(Lenardo,Nature 353:858(1991))細胞を、PBSで2回洗浄した。細胞を、IL−2を用いてまたは用いずに、かつ、試薬を用いてまたは用いずに、RPMI1640培地の1×104個の細胞/100μl/ウェルで96ウェルプレートに播種し、次に、3日間37℃でインキュベーションした。
末梢血単核細胞(PBMC)を、24時間、1μg/mLのIL−2類似体の存在下で培養した。次に、細胞を、APCコンジュゲート抗CD56(BD Biosciences)、パシフィックブルーコンジュゲート抗CD3(BioLegend)、及びFITCコンジュゲート抗CD69(BD Biosciences)で染色した。試料を、FACSAria II (BD Biosciences)を使用してフローサイトメトリーで分析した。NK細胞を、CD3陰性、CD56陽性としてゲーティングした。
ナイーブCD4+C57BL/6T細胞を、示されたサイトカインの不存在下または存在下で、異なるTヘルパーの分極条件下で分化させた。4日後、細胞をまず、示されるような発現抗原について染色し、次に、製造者のプロトコールに従い、BD cytofix及びcytopermまたはeBioscience FoxP3 staining buffer kit中で、IFNγ(eBioscience)、IL−17A(eBioscience)、IL−4(BioLegend)、IL−9(BioLegend)、またはFoxP3(eBioscience)対する抗体で染色した。染色された細胞を、FlowJoソフトウェア(Tree Star,Inc)を使用して、FACSCanto IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)で分析した。全てのマウスサイトカインは、Peprotech製であった。
予め活性化されたヒトCD8+T細胞を、完全培地中で2日間休ませ、1μg/mlの野生型IL−2、H9、H9−RET、またはH9−RETRで24時間刺激し、5×106個の細胞からの全RNAを単離した(RNeasy kit,Qiagen,Valencia,CA)。5人のドナー由来のRNAをプールし、1μgのプールされたRNAを使用して、cDNAを合成した。RNA−Seqライブラリを、上述のように作成した(Liao et al.,Immunity 38:13(2013)。PCR増幅された産物を、バーコード付けし、Illumina HiSeq2000プラットフォームを使用して配列決定した。配列決定されたリードを、Bowtie 0.12.4を使用して、ヒトゲノム(hg18、NCBIビルド36.1)に対してアラインした(Leonard,Nature Reviews.Immunology 1:200(2001))。独自にマッピングされたリードを維持し、デジタル発現レベルの遺伝子を、RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)を使用して計算した。RパッケージedgeRを使用して、特異的に発現させた遺伝子を同定し、倍数変化(log2スケールで)の差を、治療されていない細胞、または、24時間IL−2多様体で治療された細胞の間で比較した。
予め活性化されたCD8+T細胞を、90分間異なるサイトカインで治療し、次に、1%のパラホルムアルデヒドで化学的に架橋した。1000〜2000万個の細胞からのクロマチンを、250〜500bpのフラグメントになるように超音波処理し、抗STAT5B(Invitrogen)で免疫沈降し、上述のように、配列決定のために処理した(Noguchi et al.,Cell 73:147(1993))。全てのリードを、Bowtie 0.12.4を使用して、ヒトゲノム(hg18、NCBIビルド36.1)に対してアラインした(Leonard,Nature Reviews. Immunology1:200(2001)。独自にマッピングされたリードをブラウザ拡張可能なデータ(browser extensible data)(BED)ファイルに変換し、重複リード(同じゲノム位置の複数のリード)をフィルタする。次に、フィルタされた(非重複)BEDファイルを、バイナリデータ(.tdf)に変換し、Integrative Genome Viewer(Broad Institute)を使用して可視化した。
全RNAを、RNeasy Plus mini kit(Qiagen)を使用して単離し、200ngを、オリゴdT(Invitrogen)及びOmniscript reverse transcription kit(Quiagen)と共に使用して、cDNAを合成した。定量的RT−PCRを、ABI 7900 HD Sequence Detection Systemで実施した。RTプライマー及びプローブは、Applied Biosystems製であった。発現レベルを、RPL7に正規化した。
NCI−Frederick Cancer Research Facilityからの7週齢の雌のC57BL/6(H2Kb)及びBALB/c(H2Kd)マウスを、特定の病原体フリーの施設で飼育し、NCI Animal Care and Use Committeeにより承認された、承認動物プロトコールに従い治療した。BALB/cマウスを、950cGyの全身照射で条件付けし、次に、C57BL/6マウス由来の1000万個のT細胞枯渇骨髄細胞単独か、または、それと200万個のTreg枯渇汎T細胞と共に、再構成した。T細胞枯渇を、Miltenyi Biotec製キットを使用して、抗CD90[Thy1.2]マイクロビーズ(全T細胞枯渇)または抗CD25(Treg枯渇)で実施した。汎T細胞を投与されているマウスを、Fc4またはH9−RETR−Fc4(10日間、1日2回100μgの腹腔内投与)でさらに治療した。飲み水に、全身照射の前日〜14日目までシプロフロキサシンを補充した。生存及び体重減少をモニタリングした。生存を、カプラン・マイヤー法に従い分析し、ログランク検定を使用して、生存曲線を比較した。GraphPad Prism 4ソフトウェアを使用して、統計分析を実施した。
本発明を、その発明を実施するための形態と共に記載しているが、上述の記載は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を例示するものであって、これを限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、IL−2は、本明細書の全体にわたって言及されているが、当業者であれば、本明細書に記載される方法及び組成物が、他のサイトカイン、例えば、この特性を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、IL−2、IL−3、IL−5、IL−6、またはIL−15、に等しく適用可能であることを理解するであろう。従って、本発明は、野生型と比較して、それぞれの受容体に対する結合親和性が増加したGM−CSF、IL−2、IL−3、IL−5、IL−6、及びIL−15の変異体、ならびにそれらの変異体を同定及び使用するための方法も含む。
Claims (16)
- 野生型ヒトIL−2(hIL−2)と比較して、IL−2Rβに対する結合親和性がより大きく、IL−2Rγc受容体に対する結合親和性がより小さいIL−2ムテインであって、
L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T及びS130Rのアミノ酸置換を含む、IL−2ムテイン。 - IL−2Rβ+T細胞におけるSTAT5リン酸化を刺激する能力が、野生型hIL−2と比較して、低減している、請求項1に記載のIL−2ムテイン。
- 前記T細胞が、CD8+T細胞である、請求項2に記載のIL−2ムテイン。
- IL−2Rβ+細胞におけるpERK1/ERK2シグナル伝達を刺激する能力が、野生型hIL−2と比較して、低減している、請求項1に記載のIL−2ムテイン。
- IL−2及び/またはIL−15アンタゴニストである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIL−2ムテイン。
- CD8+T細胞におけるIL−2及び/またはIL−15 STAT5リン酸化の阻害剤である、請求項5に記載のIL−2ムテイン。
- CD8+T細胞のIL−2及び/またはIL−15誘導性増殖の阻害剤である、請求項5に記載のIL−2ムテイン。
- IL−2依存性TCR誘導性細胞増殖の阻害剤である、請求項5に記載のIL−2ムテイン。
- IL−2依存性Th1、Th9、及び/またはTreg分化の阻害剤である、請求項5に記載のIL−2ムテイン。
- Th17分化のプロモーターである、請求項5に記載のIL−2ムテイン。
- NK細胞のIL−2依存性活性化の阻害剤である、請求項5に記載のIL−2ムテイン。
- ヒトFc抗体フラグメントに連結する、請求項1に記載のIL−2ムテインを含むIL−2ムテイン融合タンパク質。
- 請求項1に記載のIL−2ムテイン、または、請求項12に記載のIL−2ムテイン融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 移植片対宿主病(GVHD)を治療するための医薬組成物であって、請求項1に記載のIL−2ムテイン、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 成人T細胞白血病を治療するための医薬組成物であって、請求項1に記載のIL−2ムテイン、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項1に記載のIL−2ムテイン、及び異種ポリペプチドを含む、IL−2ムテイン融合タンパク質。
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