ES2868247T3 - Receptor de antígeno quimérico y métodos de uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) heterodimérico y condicionalmente activo que comprende: un primer polipéptido que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende una región variable de anticuerpo monocatenario que se une específicamente a mesotelina, un primer miembro del par de dimerización y un primer dominio transmembrana; y un segundo polipéptido que comprende un segundo miembro de un par de dimerización, un segundo dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular; en donde un agente de dimerización dimeriza el CAR heterodimérico cuando una célula expresa los primero y segundo polipéptidos con el agente de dimerización unido entre los miembros del par de dimerización de los primero y segundo polipéptidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptor de antígeno quimérico y métodos de uso del mismo
Introducción
En la inmunoterapia adoptiva a base de células, pueden modificarse las células inmunitarias aisladas del paciente para que expresen proteínas sintéticas que permiten a las células llevar a cabo nuevas funciones terapéuticas después de que se hayan transferido de vuelta al paciente. Un ejemplo de dichas proteínas sintéticas es un receptor de antígeno quimérico (CAR). Un ejemplo de un CAR usado en la actualidad es una fusión de un dominio de reconocimiento extracelular (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno), un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular. Tras el acoplamiento con el antígeno, la parte de señalización intracelular del CAR puede iniciar una respuesta relacionada con la activación en una célula inmunitaria, tal como la liberación de moléculas citolíticas para inducir la muerte de células tumorales, etc. Sin embargo, no es posible controlar dichos CAR desde el punto de vista farmacológico. Existe la necesidad en la técnica de un CAR activable de manera condicional que pueda controlarse farmacológicamente.
Sumario
La presente divulgación proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) heterodimérico condicionalmente activo y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La presente divulgación proporciona células modificadas genéticamente para producir el CAR. Puede usarse un CAR de la presente divulgación en diversos métodos, que también se proporcionan.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 122.
Las figuras 2A y 2B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 123.
Las figuras 3A y 3B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 125.
La figura 4 proporciona secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 126. Las figuras 5A y 5B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 168.
Las figuras 6A-C proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 169.
Las figuras 7A y 7B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 170.
Las figuras 8A y 8B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 197.
Las figuras 9A-C proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 206.
Las figuras 10A y 10B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 207.
Las figuras 11A-C proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 199.
La figura 12 ilustra la producción de IL-2 desencadenada por cinco variantes de centro activo de CAR.
La figura 13 ilustra la producción de IL-2 por líneas de control Jurkat.
La figura 14 ilustra una comparación entre las construcciones de CAR "122 206" y "197 206".
La figura 15 ilustra los datos de citotoxicidad con el centro activo de CAR "197+206."
La figura 16 ilustra los datos de activación de linfocitos T usando las construcciones de CAR "122 199"; "197 199"; y "122 168".
La figura 17 es una representación esquemática de un centro activo de CAR.
Las figuras 18A y 18B ilustran diversos centros activos de CAR.
Las figuras 19A-G ilustran la producción de IL-2 desencadenada por 3 variantes diferentes de centro activo de CAR que reconocen a mesotelina humana.
Las figuras 20A-C ilustran la producción de IL-2 desencadenada por una variante de centro activo de CAR con un par de dimerización sensible al ácido giberélico.
Las figuras 21A-D ilustran centros activos de CAR a modo de ejemplo y CAR convencionales con diversos dominios coestimuladores.
Las figuras 22A y 22B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 270.
Las figuras 23A y 23B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 300.
Las figuras 24A y 24B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 336.
Las figuras 25A y 25B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 337.
Las figuras 26A y 26B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 357.
Las figuras 27A y 27B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 365.
Las figuras 28A y 28B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 366.
Las figuras 29A y 29B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 367.
Las figuras 30A y 30B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 398.
Las figuras 31A y 31B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 399.
Las figuras 32A y 32B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 400.
Las figuras 33A y 33B proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios de la construcción n.° 358.
Definiciones
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", que se usan de manera indistinta en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, pero sin limitación, ADN o ARN mono, bi o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que contiene bases púricas y pirimidínicas u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas.
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" incluyen anticuerpos o inmunoglobulinas de cualquier isotipo, fragmentos de anticuerpos que conservan unión específica al antígeno, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fv, scFv y Fd, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios y proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno de un anticuerpo y una proteína que no sea un anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, por ejemplo, la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y sigue siendo capaz de reticularse con el antígeno.
Los fragmentos de anticuerpo Fv monocatenarios o "sFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl, lo que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
Tal como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como una constante de disociación (Kd). La afinidad puede ser al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor o más, que la afinidad de un anticuerpo por secuencias de aminoácidos no relacionadas. La afinidad de un anticuerpo por una proteína diana puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nanomolar (nM) a aproximadamente 0,1 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 picomolar (pM) o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 femtomolar (fM) o más. Tal como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución. Las expresiones "inmunorreactivo" y "se une preferentemente" se usan de manera intercambiable en el presente documento respecto de anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno.
El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido a, por ejemplo, interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas e iónicas y/o de enlace de hidrógeno, incluyendo interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua. La afinidad inespecífica se referirá a una unión con una afinidad de menos de aproximadamente 10'7 M, por ejemplo, unión con una afinidad de 10'6 M, 10'5 M, 10'4 M, etc.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "región bisagra" se refiere a una región polipeptídica conectora flexible (también citada en el presente documento como "bisagra" o "espaciador") que proporciona flexibilidad y espaciado estructural a regiones polipeptídicas flanqueantes y puede consistir en polipéptidos naturales o sintéticos. Una "región bisagra" procedente de una inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1) se define generalmente como una serie de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana (Burton (1985) Molec. Immunol., 22:161-206). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando los restos de cisteína primero y último que forman enlaces disulfuro (S-S) entre cadenas pesadas en las mismas posiciones. La región bisagra puede ser de origen natural o de origen no natural, incluyendo, pero sin limitación, una región bisagra alterada como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.677.425. La región bisagra puede incluir una región bisagra completa procedente de un anticuerpo de una clase o subclase diferente a la del dominio CH1. La expresión "región bisagra" también puede incluir regiones procedentes de CD8 y otros receptores que proporcionan una función similar para proporcionar flexibilidad y espaciado a las regiones flanqueantes.
Un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, el polipéptido se purificará (1) en más de un 90 %, más de un 95 % o más de un 98 %, en peso de anticuerpo determinado mediante el método de Lowry, por ejemplo, más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones reductoras o no reductoras utilizando tinción de plata o de azul de Coomassie. Un polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ con células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del polipéptido. En algunos casos, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "células inmunitarias" incluye generalmente glóbulos blancos (leucocitos) que proceden de células madre hematopoyéticas (HSC) producidas en la médula ósea. Las "células inmunitarias" incluyen, por ejemplo, linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK)) y células de origen mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos y células dendríticas).
"Linfocito T" incluye todos los tipos de células inmunitarias que expresan CD3, incluyendo linfocitos T colaboradores (células CD4+), linfocitos T citotóxicos (células CD8+), linfocitos T reguladores (Treg) y linfocitos T gamma-delta.
Una "célula citotóxica" incluye linfocitos T CD8+, linfocitos citolíticos naturales (NK) y neutrófilos, siendo capaces estas células de mediar respuestas de citotoxicidad.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "célula madre" incluye generalmente células madre pluripotentes o multipotentes. Las "células madre" incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias (ES); células madre mesenquimales (MSC); células madre pluripotentes inducidas (iPS); y células progenitoras comprometidas (células madre hematopoyéticas (HSC); células procedentes de la médula ósea, etc.).
Tal como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que pueda tener predisposición a la enfermedad, pero al que aún no se le haya diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.
Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente", que se usan de manera indistinta en el presente documento, se refieren a un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, múridos (por ejemplo, ratas, ratones), lagomorfos (por ejemplo, conejos), primates no humanos, humanos, cánidos, félidos, ungulados (por ejemplo, équidos, bóvidos, óvidos, suidos, caprinos), etc.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un agente o a las cantidades combinadas de dos agentes, que, cuando se administran a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo de los agentes, la enfermedad y su gravedad y la edad, el peso, etc. del sujeto que se vaya a tratar.
Antes de describir en más detalle la presente invención, ha de comprenderse que la presente invención no se limita a las realizaciones concretas descritas, ya que estas obviamente pueden variar. También ha de entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene como único fin describir las realizaciones particulares y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
En los casos donde se proporciona un intervalo de valores, se entenderá que la presente invención abarca cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio dentro de dicho intervalo. Pueden incluirse independientemente los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños y también se encuentran incluidos en la presente invención, salvo cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. En los casos donde el intervalo indicado incluya uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyan uno cualquiera o ambos de los límites incluidos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto habitual en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque también pueden usarse en la puesta en práctica o la prueba de la presente invención cualquier método y materiales similares a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen los métodos y materiales preferidos.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un receptor de antígeno quimérico" incluye diversos dichos receptores de antígeno quiméricos y referencia al "par dimerizador de unión" incluye referencia a uno o más pares de unión a dimerizador y a equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia y así sucesivamente. Cabe destacar además que las reivindicaciones pueden redactarse de tal modo que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación pretende servir como fundamento para el uso de terminología excluyente tal como "únicamente", "solo" y similares en relación con la cita de los elementos de las reivindicaciones o para el uso de una limitación "negativa".
Se apreciará que determinadas características de la invención, que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por claridad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones que pertenecen a la invención están abarcadas específicamente por la presente invención y se divulgan en el presente documento como si se hubiesen divulgado de manera individual y explícita todas y cada una de las combinaciones. Además, también se encuentran abarcadas por la presente invención todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas y se divulgan en el presente documento como si se hubiesen divulgado de manera individual y explícita todas y cada una de dichas subcombinaciones.
Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe interpretarse que nada en el presente documento constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer dicha publicación por virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes a las fechas de publicación reales, lo que podría necesitar ser confirmado de manera independiente.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) heterodimérico condicionalmente activo y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La presente divulgación proporciona células modificadas genéticamente para producir el CAR. Puede usarse un CAR de la presente divulgación en diversos métodos, que también se proporcionan.
RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO HETERODIMÉRICO CONDICIONALMENTE ACTIVO.
La presente divulgación proporciona un receptor de antígeno quimérico heterodimérico condicionalmente activo, que, por simplicidad, se cita en el presente documento como "CAR".
En algunas realizaciones, un CAR de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende: i) un miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno); ii) un primer dominio modulador; iii) un primer miembro de un par de dimerización; e iv) un dominio transmembrana interpuesto entre el miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno) y el primer dominio modulador; y b) un segundo polipéptido que comprende: i) un dominio transmembrana; ii) un segundo dominio modulador; iii) un segundo miembro del par de dimerización; e iv) un dominio de señalización intracelular. El dominio modulador puede ser un dominio coestimulador.
En algunas realizaciones, un CAR de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende: i) un miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno); ii) un primer dominio coestimulador; iii) un primer miembro de un par de dimerización (por ejemplo, un par de unión a dimerizador); e iv) un dominio transmembrana interpuesto entre el miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno) y el primer dominio coestimulador; y b) un segundo polipéptido que comprende: i) un dominio transmembrana; ii) un segundo dominio coestimulador; iii) un segundo miembro del par de dimerización (por ejemplo, el par de unión a dimerizador); e iv) un dominio de señalización intracelular.
En algunas realizaciones, un CAR de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende: i) un miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno); ii) un dominio modulador; iii) un primer miembro de un par de dimerización (por ejemplo, un par de unión a dimerizador); iv) un dominio transmembrana interpuesto entre el miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno) y el dominio modulador; y b) un segundo polipéptido que comprende: i) un segundo miembro del par de dimerización (por ejemplo, el par de unión a dimerizador); e ii) un dominio de señalización intracelular. El dominio modulador puede ser un dominio coestimulador.
En algunas realizaciones, un CAR de la presente divulgación comprende: a) un primer polipéptido que comprende: i) un miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno); ii) un dominio coestimulador; iii) un primer miembro de un par de dimerización (por ejemplo, un par de unión a dimerizador); iv) un dominio transmembrana interpuesto entre el miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno) y el dominio coestimulador; y b) un segundo polipéptido que comprende: i) un segundo miembro del par de dimerización (por ejemplo, el par de unión a dimerizador); e ii) un dominio de señalización intracelular.
En la figura 17 se representa esquemáticamente un ejemplo de un CAR específico. Un CAR de la presente divulgación puede estar presente en la membrana plasmática de una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero, incluyendo entre las células de mamífero adecuadas, pero sin limitación, una célula citotóxica, un linfocito T, una célula madre, la descendencia de una célula madre, una célula progenitora, la descendencia de una célula progenitora y una célula NK. Cuando se encuentra presente en la membrana plasmática de una célula eucariota, un c Ar de la presente divulgación se encuentra activo en presencia de: 1) un agente de dimerización que se une a los miembros primero y segundo del par de unión a dimerizador en el CAR o induce de otro modo la dimerización de los miembros primero y segundo del dímero; y 2) un factor que se une al miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno), por ejemplo, un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR. El factor que se une al miembro del par de unión específica es un segundo miembro del par de unión específica. El segundo miembro del par de unión específica puede ser un factor soluble (por ejemplo, no unido a una célula); un factor presente en la superficie de una célula, tal como una célula diana; un factor presente sobre una superficie sólida; un factor presente en una bicapa lipídica; y similares. En los casos donde el miembro de un par de unión específica sea un anticuerpo y el segundo miembro del par de unión específica sea un antígeno, el antígeno puede ser un antígeno soluble (por ejemplo, no unido a una célula); un antígeno presente sobre la superficie de una célula, tal como una célula diana; un antígeno presente sobre una superficie sólida; un antígeno presente en una bicapa lipídica; y similares.
En algunos casos, un CAR de la presente divulgación, cando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un segundo miembro de un par de unión específica que se une al miembro del par de unión específica del CAR (por ejemplo, un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR) y un agente de dimerización, aumenta la expresión de al menos un ácido nucleico en la célula. Por ejemplo, en algunos casos, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, aumenta la expresión de al menos un ácido nucleico en la célula en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con el nivel de transcripción del ácido nucleico en ausencia del antígeno y/o el agente de dimerización.
Como un ejemplo, el segundo polipéptido de un CAR de la presente divulgación puede incluir un polipéptido de señalización intracelular que contiene un motivo de activación en inmunorreceptor basado en tirosina (ITAm ); en dichos casos, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, aumenta la transcripción dependiente del factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT). La transcripción dependiente NFAT incluye la transcripción inducida por cualquier miembro de la familia de NFAT, incluyendo, por ejemplo, NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, NFAT5; AP-1; Sp1; NKkB; y similares.
Un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, puede dar como resultado, en algunos casos, la producción aumentada de una o más citocinas por parte de la célula. Por ejemplo, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, puede aumentar la producción de una citocina por parte de la célula en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la cantidad de citocinas producidas por la célula en ausencia del antígeno y/o del agente de dimerización. Las citocinas cuya producción puede aumentarse incluyen, pero sin limitación, un interferón, por ejemplo, IL-2, interferón gamma (IFN-y), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), IL-15, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10; una quimiocina; un factor de crecimiento; y similares.
En algunos casos, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, puede dar como resultado tanto un aumento en la transcripción de un ácido nucleico en la célula como un aumento en la producción de una citocina por parte de la célula.
En algunos casos, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un agente de dimerización, da como resultado una actividad citotóxica por parte de la célula frente a una célula diana que expresa sobre su superficie un antígeno al que se une el dominio de unión a antígeno del primer polipéptido del CAR. Por ejemplo, en los casos donde la célula eucariota es una célula citotóxica (por ejemplo, una célula NK o un linfocito T citotóxico), un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de la célula y cuando se activa mediante un agente de dimerización, aumenta la actividad citotóxica de la célula frente a una célula diana que expresa sobre su superficie un antígeno al que se une el dominio de unión a antígeno del primer polipéptido del c A r . Por ejemplo, en los casos donde la célula eucariota es una célula NK o un linfocito T citotóxico, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de la célula y cuando se activa mediante un agente de dimerización, aumenta la actividad citotóxica de la célula en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la actividad citotóxica de la célula en ausencia del agente de dimerización.
En algunos casos, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, puede dar como resultado otros eventos relacionados con la activación del CAR, tales como proliferación y expansión (ya sea debida a un aumento en la división celular o a respuestas anti-apoptóticas).
En algunos casos, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula eucariota y cuando se activa mediante un antígeno que se une al dominio de unión a antígeno del CAR y a un agente de dimerización, puede dar como resultado otros eventos relacionados con la activación del CAR, tales como modulación de la señalización intracelular, diferenciación celular o muerte celular.
Un CAR de la presente divulgación puede estar presente en la membrana de una célula eucariota, donde los polipéptidos primero y segundo del CAR no se encuentran unidos covalentemente entre sí. Un CAR de la presente divulgación puede estar presente en la membrana de una célula eucariota en forma de un heterodímero individual que no está unido covalentemente a cualquier otro polipéptido en la membrana. Como alternativa, un primer CAR de la presente divulgación puede estar presente en la membrana de una célula eucariota en forma de un heterodímero que está unido de manera covalente o no covalente a un segundo CAR de la presente divulgación. En algunos casos, los CAR primero y segundo están unidos covalentemente a través de un enlace disulfuro formado entre las cisteínas presentes en una región bisagra presente tanto en el primer polipéptido del primer CAR como en el primer polipéptido del segundo CAR.
En algunos casos, un CAR de la presente divulgación puede estar presente en la membrana de una célula eucariota, donde los primeros polipéptidos del CAR comprenden un fragmento de anticuerpo y los segundos polipéptidos del CAR comprenden un dominio de transducción de señales procedente de un receptor de citocinas, de tal forma que, tras dimerizar, el CAR puede representar un CAR de cuerpo de señalización heterodimérico, por ejemplo, un cuerpo de señalización formado por al menos dos polipéptidos independientes. Un "cuerpo de señalización", tal como se conoce en la técnica, es una sola macromolécula quimérica formada por un fragmento de anticuerpo y un dominio de transducción de señales procedente de un receptor de citocinas. En determinados casos, un Ca R de cuerpo de señalización heterodimérico de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana celular de una célula eucariota, dimerizado por un dimerizador y activado por un antígeno, por ejemplo, un antígeno oligomerizado, puede inducir la oligomerización del CAR de cuerpo de señalización heterodimérico. Dicha oligomerización inducida por ligando de un CAR de cuerpo de señalización heterodimérico puede activar, por ejemplo, aumentar o perpetuar, por ejemplo, mantener, la transducción de señales, por ejemplo, la oligomerización inducida por ligando de un CAR de cuerpo de señalización heterodimérico puede transmitir una señal que desencadena una respuesta celular. En algunos casos, se puede emplear una serie de CAR de cuerpo de señalización heterodiméricos de manera combinatoria para desencadenar una respuesta celular deseada.
Miembro de un par de unión específica
Un CAR de la presente divulgación incluye un miembro de un par de unión específica. Los pares de unión específica incluyen, pero sin limitación, pares de unión de antígeno-anticuerpo; pares de unión de ligando-receptor; y similares. Por lo tanto, un miembro de un par de unión específica adecuado para su uso en un CAR de la presente divulgación incluye un antígeno; un anticuerpo; un ligando; y un receptor de unión a ligando.
Dominio de unión a antígeno
Un dominio de unión a antígeno adecuado para su uso en un CAR de la presente divulgación puede ser cualquier polipéptido de unión a antígeno, conociéndose en la técnica una amplia variedad de los mismos. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno es un Fv monocatenario (scFv). Son adecuados para su uso otros dominios de reconocimiento a base de anticuerpos (VHH de cAb (dominios variables de camélido) y versiones humanizadas, VH de IgNAR (dominios variables de anticuerpos de tiburón) y versiones humanizadas, VH de sdAb (dominios variables de anticuerpo de un solo dominio) y dominios variables de anticuerpo "camelizados". En algunos casos, también son adecuados para su uso dominios de reconocimiento a base de receptores de linfocitos T (TCR), tales como TCR monocatenarios (scTv, VaVp que contiene dos dominios de TCR monocatenarios).
Un dominio de unión a antígeno adecuado para su uso en un CAR de la presente divulgación puede tener diversas especificidades de unión a antígeno. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo presente en un antígeno que se expresa por (se sintetiza por) una célula cancerosa, es decir, un antígeno asociado a células cancerosas. El antígeno asociado a células cancerosas puede ser un antígeno asociado con, por ejemplo, una célula de cáncer de mama, un linfoma de linfocitos B, una célula de linfoma de Hodgkin, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, un mesotelioma, una célula de cáncer de pulmón (por ejemplo, una célula de cáncer microcítico de pulmón), una célula de linfoma no Hodgkin de linfocitos B (B-NHL), una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, una célula de mesotelioma, una célula de cáncer de pulmón (por ejemplo, una célula de cáncer microcítico de pulmón), una célula de melanoma, una célula de leucemia linfocítica crónica, una célula de leucemia linfocítica aguda, una célula de neuroblastoma, un glioma, un glioblastoma, un meduloblastoma, una célula de cáncer colorrectal, etc. Un antígeno asociado con células cancerosas también puede expresarse por una célula no cancerosa.
Los ejemplos no limitantes de antígenos a los que puede unirse el dominio de unión a antígeno de un CAR específico incluyen, por ejemplo, CD19, CD20, CD38, CD30, Her2/neu, ERBB2, CA125, MUC-1, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), molécula de adhesión superficial CD44, mesotelina, antígeno carcinoembrionario (CEA), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), EGFRvlII, receptor de factor de crecimiento endotelial vascular-2 (VEGFR2), antígeno asociado con melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2 y similares.
Ligando
En algunos casos, un miembro de un par de unión específica adecuado para su uso en un CAR específico es un ligando para un receptor. Los ligandos incluyen, pero sin limitación, citocinas (por ejemplo, IL-13, etc.); factores de crecimiento (por ejemplo, herregulina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf ); y similares); un péptido de unión a integrina (por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia Arg-Gly-Asp); y similares.
En los casos donde un miembro de un par de unión específica en un CAR específico sea un ligando, el CAR puede activarse en presencia tanto de un agente dimerizador como de un segundo miembro del par de unión específica, siendo en este caso el segundo miembro del par de unión específica un receptor para el ligando. Por ejemplo, en los casos donde el ligando es VEGF, el segundo miembro del par de unión específica puede ser un receptor de VEGF, incluyendo un receptor de VEGF soluble. A modo de ejemplo adicional, en los casos donde el ligando es herregulina, el segundo miembro del par de unión específica puede ser Her2.
Receptores
Como se ha indicado anteriormente, en algunos casos, el miembro de un par de unión específica que se incluye en un CAR específico es un receptor, por ejemplo, un receptor para un ligando, un correceptor, etc. El receptor puede ser un fragmento de unión a ligando de un receptor. Los receptores adecuados incluyen, pero sin limitación, un receptor de factores de crecimiento (por ejemplo, un receptor de VEGF); un polipéptido de receptor de tipo lectina de linfocitos citolíticos, subfamilia K, miembro 1 (NKG2D) (receptor para MICA, M iCb y ULB6); un receptor de citocinas (por ejemplo, un receptor de IL-13; un receptor de IL-2; etc.); Her2; CD27; un receptor de citotoxicidad natural (NCR) (por ejemplo, el polipéptido NKP30 (NCR3/CD337) (receptor para el transcrito 3 asociado a HLA-B (BAT3) y B7-H6); etc.); etc.
Región bisagra
En algunos casos, el primer polipéptido de un CAR concreto comprende una región bisagra (también citada en el presente documento como un "espaciador"), encontrándose la región bisagra interpuesta entre el dominio de unión a antígeno y el dominio transmembrana. En algunos casos, la región bisagra es una región bisagra de cadena pesada de inmunoglobulina. En algunos casos, la región bisagra es un polipéptido de región bisagra procedente de un receptor (por ejemplo, una región bisagra procedente de CD8).
La región bisagra puede tener una longitud de aproximadamente 4 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 4 aa a aproximadamente 10 aa, de aproximadamente 10 aa a aproximadamente 15 aa, de aproximadamente 15 aa a aproximadamente 20 aa, de aproximadamente 20 aa a aproximadamente 25 aa, de aproximadamente 25 aa a aproximadamente 30 aa, de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 40 aa o de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 50 aa.
Pueden seleccionarse fácilmente espaciadores adecuados y pueden tener cualquiera de una serie de longitudes adecuadas, tal como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, de 6 aminoácidos a 8 aminoácidos o de 7 aminoácidos a 8 aminoácidos y pueden ser de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos.
Los espaciadores a modo de ejemplo incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 37) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 38), siendo n un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos e la técnica. Pueden usarse polímeros de glicina y de glicina-serina; tanto Gly como Ser están relativamente desestructuradas y, por lo tanto, pueden servir como anclaje neutro entre componentes. Pueden usarse polímeros de glicina; la glicina tiene acceso a un espacio phi-psi significativamente mayor incluso que la alanina y está menos restringida que los restos con cadenas laterales más largas (véase Sheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Los espaciadores a modo de ejemplo pueden comprender secuencias de aminoácidos que incluyen, pero sin limitación, GGSG (SEQ ID NO:39), GGSGG (SEQ ID NO:40), GSGSG (SEQ ID NO:41), GSGGG (SEQ ID NO: 42), GGGSG (SEQ ID NO: 43), GSSSG (SEQ ID NO: 44), y similares.
En algunos casos, la región bisagra en el primer polipéptido de un CAR concreto incluye al menos una cisteína. Por ejemplo, en algunos casos, la región bisagra puede incluir la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys. Si está presente, puede estar disponible una cisteína en la región bisagra de un primer CAR para que forme un enlace disulfuro con una región bisagra en un segundo CAR.
Se conocen en la técnica secuencias de aminoácidos de regiones bisagra de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:162; y Huck et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:1779. A modo de ejemplos no limitantes, una región bisagra de inmunoglobulina puede incluir una de las siguientes secuencias de aminoácidos: DKTHT (SEQ ID NO: 45); CPPC (SEQ ID NO: 46); CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO: 47) (véase, por ejemplo, Glaser et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:41494); ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48); KSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 49); KCCVDCP (SEQ ID NO: 50); KYGPPCP (SEQ ID NO: 51); EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 52) (bisagra de IgG1 humana); ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 53) (bisagra de IgG2 humana); ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 54) (bisagra de IgG3 humana); s Pn MVPHAHHa Q (SEQ ID NO: 55) (bisagra de IgG4 humana); y similares.
La región bisagra puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. La región bisagra puede incluir una o más sustituciones y/o inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en comparación con una región bisagra de tipo silvestre (de origen natural). Por ejemplo, puede sustituirse His229 de la bisagra de IgG1 humana por Tyr, de tal forma que la región bisagra comprende la secuencia EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO: 52); véase, por ejemplo, Yan et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:5891.
La región bisagra puede comprender una secuencia de aminoácidos procedente de CD8 humano; por ejemplo, la región bisagra puede comprender la secuencia de aminoácidos: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 56), o una variante de la misma.
Dominio transmembrana
Los polipéptidos primero y segundo de un CAR de la presente divulgación incluyen dominios transmembrana para su inserción en una membrana de célula eucariota. El dominio transmembrana del primer polipéptido está interpuesto entre el dominio de unión a antígeno y el dominio coestimulador. En los casos donde el primer polipéptido incluye una región bisagra, el dominio transmembrana está interpuesto entre la región bisagra y el dominio coestimulador, de tal forma que el primer polipéptido comprende, en orden de extremo amino (extremo N-terminal) al extremo carboxilo (extremo C-terminal): un dominio de unión a antígeno; una región bisagra; un dominio transmembrana; un primer dominio coestimulador; y un primer miembro de un par de unión a dimerizador.
El dominio transmembrana del segundo polipéptido se encuentra en o próximo al extremo N-terminal del polipéptido, de tal forma que el segundo polipéptido comprende, en orden desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: un dominio transmembrana; un segundo dominio coestimulador; un segundo miembro del par de unión a dimerizador; y un dominio de señalización intracelular.
Es adecuado para su uso cualquier dominio transmembrana (TM) que posibilite la inserción de un polipéptido en la membrana celular de una célula eucariota (por ejemplo, de mamífero). Como un ejemplo no limitante, puede usarse la secuencia TM, IYIWAPLAGTCGVLLLs Lv ITLYC (SEQ ID NO: 30). Los ejemplos no limitantes adicionales de secuencias TM adecuadas incluyen: a) procedente de CD8 beta: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (SEQ ID NO: 57); b) procedente de CD4: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (SEQ ID NO: 58); c) procedente de CD3 zeta: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (SEQ ID NO: 59); d) procedente de CD28: WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 60); e) procedente de CD 134 (OX40): VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQ ID NO: 61); y f) procedente de CD7: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (SEQ ID NO: 62).
Enlazadores
En algunos casos, un primer polipéptido de un CAR específico incluye un enlazador entre cualesquiera dos dominios adyacentes. Por ejemplo, puede disponerse un enlazador entre el dominio transmembrana y el primer dominio coestimulador del primer polipéptido. A modo de ejemplo adicional, puede disponerse un enlazador entre el primer dominio coestimulador y el primer miembro de un par de unión a dimerizador del primer polipéptido. A modo de ejemplo adicional, puede disponerse un enlazador entre el dominio transmembrana y el segundo dominio coestimulador del segundo polipéptido. A modo de ejemplo adicional, puede disponerse un enlazador entre el segundo dominio coestimulador y el segundo miembro de un par de unión a dimerizador del segundo polipéptido. A modo de ejemplo adicional, puede disponerse un enlazador entre el segundo miembro del par de unión a dimerizador y el dominio de señalización intracelular del segundo polipéptido.
El péptido enlazador puede tener cualquiera de diversas secuencias de aminoácidos. Las proteínas pueden estar unidas mediante un péptido espaciador, generalmente de naturaleza flexible, aunque no se excluyen otros enlaces químicos. Un enlazador puede ser un péptido de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud o de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. Estos enlazadores pueden producirse usando oligonucleótidos sintéticos que codifican los enlazadores para acoplar las proteínas. Pueden usarse enlazadores peptídicos con cierto grado de flexibilidad. Los péptidos enlazadores pueden tener prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos, teniendo en cuenta que los enlazadores adecuados tendrán una secuencia que dé como resultado un péptido generalmente flexible. El uso de aminoácidos pequeños, tales como glicina y alanina, es útil para crear un péptido flexible. La creación de dichas secuencias es rutinaria para los expertos en la materia.
Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener una longitud cualquiera que sea adecuada, tal como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, de 6 aminoácidos a 8 aminoácidos o de 7 aminoácidos a 8 aminoácidos y pueden ser de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos.
Los enlazadores peptídicos a modo de ejemplo incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, GSGGSn (SEQ ID NO: 37) y GGGSn (SEQ ID NO: 38), siendo n un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos e la técnica. Son interesantes los polímeros de glicina y de glicina-serina ya que estos dos aminoácidos están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como anclaje neutro entre componentes. Los polímeros de glicina son particularmente interesantes dado que la glicina tiene acceso a un espacio phi-psi significativamente mayor incluso que la alanina y está menos restringida que los restos con cadenas laterales más largas (véase Sheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Los enlazadores flexibles a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, GGSG (SEQ ID NO: 39), GGSGG (SEQ ID NO: 40), GSGSG (SEQ ID NO: 41), GSGGG (SEQ ID NO: 42), GGGSG (SEQ iD NO: 43), GSs Sg (SEQ ID NO: 44) y similares. Un experto habitual en la materia reconocerá que el diseño de un péptido conjugado a cualquier elemento descrito anteriormente puede incluir enlazadores que son total o parcialmente flexibles, de tal forma que el enlazador pueda incluir un enlazador flexible, así como una o más porciones que confieran una estructura menos flexible.
Dominios moduladores
Los dominios moduladores adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación incluyen dominios coestimuladores.
En algunos casos, el dominio modulador del primer polipéptido de un CAR concreto tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el dominio modulador del segundo polipéptido del CAR. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio modulador del primer polipéptido de un CAR comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio modulador en el segundo polipéptido del CAR. El dominio modulador del primer polipéptido de un CAR concreto puede tener sustancialmente la misma longitud que el dominio modulador del segundo polipéptido de un CAR concreto; por ejemplo, los dominios moduladores primero y segundo pueden diferir entre sí en cuanto a su longitud en menos de 10 aminoácidos o menos de 5 aminoácidos. En algunos casos, los dominios moduladores primero y segundo pueden tener la misma longitud.
Un dominio modulador adecuado para su inclusión en el primer y el segundo polipéptido de un CAR concreto puede tener una longitud de aproximadamente 30 aminoácidos a aproximadamente 70 aminoácidos (aa), por ejemplo, un dominio modulador puede tener una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa. En otros casos, el dominio modulador puede tener una longitud de aproximadamente 70 aa a aproximadamente 100 aa, de aproximadamente 100 aa a aproximadamente 200 aa o de más de 200 aa.
Los dominios coestimuladores adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación son generalmente polipéptidos procedentes de receptores. En algunas realizaciones, los dominios coestimuladores se homodimerizan. Un dominio coestimulador concreto puede ser una porción intracelular de una proteína transmembrana (es decir, el dominio coestimulador puede proceder de una proteína transmembrana). Los ejemplos no limitantes de polipéptidos coestimuladores adecuados incluyen, pero sin limitación, 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, Cd 30, GITR y HVEM.
En algunos casos, el dominio coestimulador del primer polipéptido de un CAR concreto tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el dominio coestimulador del segundo polipéptido del CAR. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio coestimulador del primer polipéptido de un CAR comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio coestimulador en el segundo polipéptido del CAR. El dominio coestimulador del primer polipéptido de un CAR concreto puede tener sustancialmente la misma longitud que el dominio coestimulador del segundo polipéptido de un CAR concreto; por ejemplo, los dominios coestimuladores primero y segundo pueden diferir entre sí en cuanto a su longitud en menos de 10 aminoácidos o menos de 5 aminoácidos. En algunos casos, los dominios coestimuladores primero y segundo pueden tener la misma longitud.
Un dominio coestimulador adecuado para su inclusión en el primer y el segundo polipéptido de un CAR concreto puede tener una longitud de aproximadamente 30 aminoácidos a aproximadamente 70 aminoácidos (aa), por ejemplo, un dominio coestimulador puede tener una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa. En otros casos, el dominio coestimulador puede tener una longitud de aproximadamente 70 aa a aproximadamente 100 aa, de aproximadamente 100 aa a aproximadamente 200 aa o de más de 200 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana 4-1BB (también conocida como TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDw137; ILA; etc.). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 24). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana CD28 (también conocida como Tp44). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 63). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana ICOS (también conocida como AILIM, CD278 y CVID1). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98% o un 100% de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO: 64). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana OX-40 (también conocida como TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX40, TXGP1L). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 65). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana BTLA (también conocida como BTLA1 y CD272). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos:
CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPD
LCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVR
S (SEQ ID NO:66).
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana CD27 (también conocida como S152, T14, TNFRSF7 y Tp55). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98% o un 100% de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO: 67). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana CD30 (también conocida como TNFRSF8, D1S166E y Ki-1). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa o de aproximadamente 160 aa a aproximadamente 185 aa de la siguiente secuencia de aminoácidos:
RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLM S
QPLM ETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIM KA
DTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVM LSV
EEEGKEDPLPTAASGK (SEQ ID NO:68).
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana GITR (también conocida como TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, c D357 y GITR-D). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO: 69). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
En algunos casos, el dominio coestimulador procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana HVEM (también conocida como TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR y TR2). Por ejemplo, un dominio coestimulador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRS PNH (SEQ ID NO: 70). En algunas de estas realizaciones, el dominio coestimulador tanto del primer polipéptido como del segundo tiene una longitud de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa, de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 55 aa, de aproximadamente 55 aa a aproximadamente 60 aa, de aproximadamente 60 aa a aproximadamente 65 aa o de aproximadamente 65 aa a aproximadamente 70 aa.
Pares de dímero
Los pares de dímero adecuados para su uso en un CAR concreto incluyen pares de unión a dimerizador. Los pares de unión a dimerizador adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación son, en algunas realizaciones, polipéptidos que se unen a un sitio diferente de la misma molécula (citada en el presente documento como "dimerizador"). En presencia de un dimerizador, ambos miembros del par de unión al dimerizador se unen a un sitio diferente del dimerizador y, por lo tanto, se sitúan próximos entre sí. En algunas realizaciones, la unión al dimerizador es reversible. En algunas realizaciones, la unión al dimerizador es irreversible. En algunas realizaciones, la unión al dimerizador es no covalente. En algunas realizaciones, la unión al dimerizador es covalente.
Otros pares de dímero adecuados para su uso incluyen pares de unión a dimerizador que dimerizan tras la unión de un primer miembro de un par de dímeros a un agente de dimerización, induciendo el agente de dimerización un cambio conformacional en el primer miembro del par de dímeros y permitiendo este cambio conformacional que el primer miembro del par de dímeros se una (covalente o no covalentemente) a un segundo miembro del par de dímeros.
Otros pares de dímeros adecuados para su uso incluyen pares de dímeros en los que la exposición a la luz (por ejemplo, luz azul) induce la dimerización del par de dímeros.
Independientemente del mecanismo, el par de dímeros dimerizará tras exponerlo a un agente que induzca la dimerización, siendo el agente en algunos casos una molécula pequeña o, en otros casos, luz. Por lo tanto, por simplicidad, la descripción a continuación referente a los "pares de unión a dimerizador" incluye pares de dímeros que dimerizan independientemente del mecanismo.
Los ejemplos no limitantes de dímeros adecuados (por ejemplo, pares de unión a dimerizador) incluyen, pero sin limitación:
a) proteína de unión a FK506 (FKBP) y FKBP;
b) FKBP y la subunidad catalítica A de la calcineurina (CnA);
c) FKBP y ciclofilina;
d) FKBP y proteína asociada a rapamicina de FKBP (FRB);
e) girasa B (GyrB) y GyrB;
f) dihidrofolato reductasa (DHFR) y DHFR;
g) DmrB y DmrB;
h) PYL y ABI;
i) Cry2 y CIB1; y
j) GAI y GID1.
Un primer o un segundo miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) de un CAR concreto puede tener una longitud de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 300 aminoácidos o más; por ejemplo, un primer o un segundo miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) de un CAR concreto puede tener una longitud de aproximadamente 50 aa a aproximadamente 100 aa, de aproximadamente 100 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 200 aa, de aproximadamente 200 aa a aproximadamente 250 aa, de aproximadamente 250 aa a aproximadamente 300 aa o de más de 300 aa.
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) de un CAR concreto procede de FKBP. Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQE
VIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ
ID NO: 12).
En algunos casos, un miembro de un par de unión a dimerizador de un CAR concreto procede de la subunidad catalítica A de la calcineurina (también conocida como PPP3CA; CALN; CALNA; CALNA1; CCN1; CNA1; PPP2B; subunidad catalítica CAM-PRP; calcineurina A alfa; isoterma alfa de la subunidad A de calcineurina dependiente de calmodulina; proteína fosfatasa 2B, subunidad catalítica, isoterma alfa; etc.). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos (dominio PP2Ac):
LEESVALRIITEGASILRQEKNLLDIDAPVTVCGD1HGQFFDLMKLFEVGGSPANTRY
LFLGDYVDRGYFSIECVLYLWALKILYPKTLFLLRGNHECRHLTEYFTFKQECKIKY
SERVYDACMDAFDCLPLAALMNQQFLCVHGGLSPEINTLDDIRKLDRFKEPPAYGP
M CD IL W SD PLED FG N EK T Q EH FTH N T V R G C S YFY S Y P A V CEFLQHNNLLSILRAHE
A Q D A G Y RM Y R K SQ TTG FPSLITÍFSA PN Y LD V Y N N K A A V LK Y EN N V M N IR Q FN C SP
HPYWLPNFM (SEQ ID NO:71).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de ciclofilina (también conocida como ciclofilina A, PPIA, CYPa , CYPH, PPIasa A, etc.). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVNPTYFFDIAYDGEPLGRVSFELFADKYPKTAENFRALSTGEKGFGYKGSCFHRII
PGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPGILSMANAGPNTNGSQFFI
CTA K TEW LD G K H V V FG K V K EG M N IV EA M ER FG SR N G K TSK K ITIA D C G Q LE (SEQ
ID NO:72).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de MTOR (también conocido como proteína asociada a rapamicina-FKBP; proteína de unión a FK506 12-proteína asociada a rapamicina 1; proteína de unión a FK506 12-proteína asociada a rapamicina 2; proteína de unión a FK506 12-proteína asociada al complejo de rapamicina 1; FRAP; FRAP1; FRAP2; RAFT1; y RAPT1). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos (también conocido como "Frb": Fkbp-dominio de unión a rapamicina):
MILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQA
YGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISK (SEQ ID NO: 14).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de GyrB (también conocido como subunidad B de ADN girasa). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 200 aminoácidos (aa), de aproximadamente 200 aa a aproximadamente 300 aa, de aproximadamente 300 aa a aproximadamente 400 aa, de aproximadamente 400 aa a aproximadamente 500 aa, de aproximadamente 500 aa a aproximadamente 600 aa, de aproximadamente 600 aa a aproximadamente 700 aa o de aproximadamente 700 aa a aproximadamente 800 aa, de la siguiente secuencia de aminoácidos de GyrB de Escherichia coli (o con la secuencia de la subunidad B de ADN girasa de cualquier organismo):
MSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEWDNAIDEALAGH CK EIIV TIH A D N S YS V Q D D G R G IPTG 1H PEEG V S A A EV IM T V LH A G G K FD D N S Y K V S GGLHGVGYSVYNALSQKLELYIQREGK1HRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMV RFW PSLETFTN V TEFEY EILA K R LR ELSFLN SG V SIR LR D K R D G K ED H FH Y EG G IK A F VEYLNKNKTP1HPNIFYFSTEKDGIGVEVALQWNDGFQENIYCFTNNIPQRDGGTHL AGFRAAMTRTLNAYMDKEGY SKKAKV S ATGDD AREGLIAVV S VKVPDPKFSSQT
KDKL V S SEVKS AVEQQMNELL AEYLLENPTD AKIVV GKIIDAARAREAARRAREM TRRKGALDLAGLPGKLADCQERDPALSELYLVEGDSAGGSAKQGRNRKNQAILPL KGKILNVEKARFDKMLSSQEVATLÍTALGCGIGRDEYNPDKLRYHSIIIMTDADVDG SHIRTLLLTFFYRQMPEIVERGHVYIAQPPLYKVKKGKQEQYIKDDEAMDQYQISIA LD G ATLHTN AS AP AL AGE ALEKL V SE Y N A T Q K M IN RM ER RY PK A M LK ELIY QPTL TEADLSDEQTVTRWVNALVSELNDKEQHGSQWKFDVHTNAEQNLFEPIVRVRTHG VDTDYPLDHEFITGGEYRRICTLGEKLRGLLEEDAFIERGERRQPVASFEQALDWLV KESRRGLSIQRYKGLGEMNPEQLWETTMDPESRRMLRVTVKDAIAADQLFTTLMG DAVEPRRAFIEENALKAANIDI
(SEQ ID NO: 73). En algunos casos, un miembro de un par de unión a dimerizador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de los aminoácidos 1-220 de la secuencia de aminoácidos de GyrB citada anteriormente de Escherichia coli.
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de DHFR (también conocido como dihidrofolato reductasa, DHFRP1 y DYR). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKN GDLP WPPLRNEFRYF QRMTTTS S VEGKQNLVIMGK
KTWFSIPEKNRPLKGRJNLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDM
VWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLS
DVQEEKGIKYKFEVYEKND (SEQ ID NO:74).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede del dominio de unión a DmrB (es decir, el dominio de homodimerización DmrB). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MASRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLG
KQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
(SEQ ID NO :75).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de una proteína PYL (también conocido como receptor del ácido abscísico y como RCAR). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador concreto puede proceder de proteínas tales como aquellas de Arabidopsis thaliana: PYR1, RCAR1 (PYL9), PYL1, PYL2, PYL3, PYL4, PYL5, PYL6, PYL7, PYL8 (RCAR3), PYL10, PYL11, PYL12, PYL13. Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos:
PYL10:
MNGDETKKVESEYIKKHHRHELYESQCSSTLVKHIKAPLHLVWSIVRRFDEPQKYK
PFISRC VVQGKKLEVGS VREVDLKSGLP ATKSTE VLEILDDNEFÜLGIRIV GGDFIRLK
NYSSTISLHSETIDGKTGTLAIESFVVDVPEGNTKEETCFFVEALIQCNLNSLADVTE
RLQAESMEKKI (SEQ ID NO:76).
PYL11:
METSQKYHTCGSTLVQTIDAPLSLVWSILRRFDNPQAYKQFVKTCNLSSGDGGEGS
YREVTVVSGLPAEFSRERLDELDDESHVMMISIIGGDHRLVNYRSKTMAFVAADTE
EKTVVYESYVVDVPEGNSEEETTSFADTIVGFNLKSLAKLSERVAHLKL (SEQ ID
NO:77)
PYL12:
MKTSQEQHVCGSTWQTINAPLPLVWSILRRFDNPKTFKHFVKTCKLRSGDGGEGS
VREVTVVSDLPASFSLERLDELDDESHVMVISIIGGDHRLVNYQSKTTVFVAAEEEK
TVVVESYVVDVPEGNTEEETTLFADTIVGCNLRSLAKLSEKMMELT (SEQ ID
NO:78).
PYL13:
MESSKQKRCRSSWETIEAPLPLVWSILRSFDKPQAYQRFVKSCTMRSGGGGGKGG
EGKGSVRDVTLVSGFPADFSTERLEELDDESHVMVVSIIGGNHRLVNYKSKTKVVA
SPEDMAKKTVWESYWDVPEGTSEEDTIFFVDNIIRYNLTSLAKLTKKMMK (SEQ
ID NO:79).
PYL1:
MANSESSSSPVNEEENSQRISTLHHQTMPSDLTQDEFTQLSQSIAEFHTYQLGNGRC
S SLLAQRIHAPPET VW S VVRRFDRPQIYKEÍFIKSCNV SEDFEMRV GCTRD VNVISGL
PANTSRERLDLLDDDRRVTGFSITGGEHRLRNYKSVTTVHRFEKEEEEERIWTWLE
SYVVDVPEGNSEEDTRLFADTVIRLNLQKLASITEAMNRNNNNNNSSQVR (SEQ ID
NO:80).
PYL2:
MS S SP AVKGLTDEEQKTLEP VIKTYHQFEPDPTT CTSLIT QRIH AP AS V VWPLIRRFD
NPERYKHFVKRCRLISGDGDVGSVREVTVISGLPASTSTERLEFVDDDHRVLSFRVV
GGEHRLKN YKS YTS VNEFFN QD S GKV YT Y YFE S YT VDIPEGNTEEDTKMF VDT V V
KLNLQKLGVAATSAPMHDDE (SEQ ID N0:81).
PYL3:
MNLAPIHDPS S S STTTTSSSTPY GLTKDEFSTLD SIIRTHHTFPRSPNTCTSLIAHRVDA
PAHAIWRFVRDFANPNKYKHFIKSCTIRVNGNGIKEIKVGTIREVSVVSGLPASTSVE
ILEVLDEEKRILSFRVLGGEHRLNNYRSVTSVNEFWLEKDKKKRVYSWLESYIVD
IPQGNTEEDTRMF VDTVVKSNLQNL AVI ST ASPT (SEQ ID NO:82).
PYL4:
MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVI
QEIS APIST VW S VVRRFDNPQ AYKHFLKSC S VIGGDGDNVGSLRQ VHVVSGLPAAS
STERLDILDDERHVISFSYYGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNT
KEETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL (SEQ ID N O :83).
PYL5:
MRSP V QLQHGSD ATN GFHTLQPHDQTDGPIKRV CLTRGMHVPEHVAMHHTHD V G
PDQCCSSVVQM1HAPPESVWALVRRFDNPKVYKNFIRQCRIVQGDGLHVGDLREV
MVVSGLPAVSSTERLEILDEERHVISFSVVGGDHRLKNYRSVTTLHASDDEGTVVV
ESYIYDYPPGNTFFETLSFYDTIVRCNLQSLARSTNRQ (SEQ ID NO:84).
PYL6:
MPTSIQFQRSSTAAEAANATVRNYPHHHQKQVQKVSLTRGMADVPEHVELSHTHV
VGPSQCFSVVVQDVEAPVSTVWSILSRFEHPQAYKHFVKSCHVVIGDGREVGSVRE
YRY V S GLP AAF SLERLEIMDDDRH VISF S V Y GGDHRLMN YKS VTTYHF SEED SD GK
KRTRVVESYVYDYPAGNDKEETCSEADTIVRCNLQSLAKLAENTSKFS (SEQ ID
NO:85).
PYL7:
MEMIGGDDTDTEMYGALVTAQSLRLRHLHHCRENQCTSVLVKYIQAPVHLVWSL
VRRFDQPQKYKPFISRCTVNGDPEIGCLREVNVKSGLPATTSTERLEQLDDEEHILGI
NIIGGDHRLKNYSSILTVHPEMIDGRSGTMVMESFVVDVPQGNTKDDTCYFVESLIK
CNLKSLACVSERLAAQDITNSIATFCNASNGYREKNHTETNL (SEQ ID NO:86).
PYL8:
MEAN GIENLTNPN QEREFIRRHHKHEL VDNQC S STL VKHIN AP VHIV W SL VRRFDQ
PQKYKPFISRCVVKGNMEIGTVREVDVKSGLPATRSTERLELLDDNEHILSIRIVGGD
HRLKNYSSIISLHPETIEGRIGTLVIESFWDVPEGNTKDETCYFVEALIKCNLKSLAD
ISERLAVQDTTESRY (SEQ ID NO:87).
PYL9:
MMDGVEGGTAMYGGLETVQYVRTHHQHLCRENQCTSALVKHIKAPLHLYWSLV
RRFDQPQKYKPFVSRCTVIGDPEIGSLREVNVKSGLPATTSTERLELLDDEEHILGIKI
IGGDHRLKNY S SILTYHPEIIEGRAGTM VIE SFVVD VPQGNTKDET C YF VEALIRCNL
KSLADVSERLASQDITQ (SEQ ID NO:88).
PYR1:
MPSELTPEERSELKNSIAEFHTYQLDPGSCSSLHAQRIHAPPELVWSIVRRFDKPQTY
KHFIKSCSVEQNFEMRVGCTRDVIVISGLPANTSTERLDILDDERRVTGFSIIGGEHR
LTNYKSVTTVHRFEKENRIWTWLESYVVDMPEGNSEDDTRMFADTVVKLNLQKL
ATVAEAMARNSGDGSGSQVT (SEQ ID NO:89).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de una proteína ABI (también conocida como insensible al ácido abscísico). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador concreto puede proceder de proteínas tales como aquellas de Arabidopsis thaliana: ABI1 (también conocida como INSENSIBLE AL ÁCIDO ABSCÍSICO 1, Proteína fosfatasa 2C 56, AtPP2C56, P2C56y PP2C ABI1)y/o ABI2 (también conocida como P2C77, Proteína fosfatasa 2C 77, AtPP2C77, INSENSIBLE AL ÁCIDO ABSCÍSICO 2, Proteína fosfatasa 2C ABI2 y PP2C ABI2). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa, de aproximadamente 160 aa a aproximadamente 170 aa, de aproximadamente 170 aa a aproximadamente 180 aa, de aproximadamente 180 aa a aproximadamente 190 aa o de aproximadamente 190 aa a aproximadamente 200 aa de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos:
ABI1:
MEE Y SP AI AGPFRPF SETQMDFT GIRLGKG Y CNN Q Y SN QD SEN GDLM V SLPETSSCS
VSGSHGSESRKVLISRINSPNLNMKESAAADIVVVDISAGDEINGSDITSEKKMISRT
ESRSLFEFKSVPLYGFTSICGRRPEMEDAVSTIPRFLQSSSGSMLDGRFDPQSAAHFF
GVYDGHGGSQVANYCRERMHLALAEEIAKEKPMLCDGDTWLEKWKKALFNSFLR
VDSEIESVAPETVGSTSVVAVVFPSHIFVANCGDSRAVLCRGKTALPLSVDHKPDRE
DE AARIE AAGGKVIQ WN G ARVF G VL AM SRSIGDRYLKP SIIPDPE VT AVKRVKEDD
CLILASDGVWDVMTDEEACEMARKRILLWHKKNAVAGDASLLADERRKEGKDPA
AMSAAEYLSKLAIQRGSKDNISVVVVDLKPRRKLKSKPLN (SEQ ID NO:90).
ABI2:
MDEVSPAVAVPFRPFTDPHAGLRGYCNGESRVTLPESSCSGDGAMKDSSFEINTRQ
DSLTSSSSAMAGVDISAGDEINGSDEFDPRSMNQSEKKVLSRTESRSLFEFKCVPLY
GVTSICGRRPEMEDSVSTIPRFLQVSSSSLLDGRVTNGFNPHLSAHFFGVYDGHGGS
QVANYCRERMHLALTEEIVKEKPEFCDGDTWQEKWKKALFNSFMRVDSEIETVAH
APETVGSTSWAWFPTHIFVANCGDSRAVLCRGKTPLALSVDHKPDRDDEAARIE
AAGGKVIRW N G ARVF G VL AM SRSIGDRYLKP S VIPDPE VTS VRRVKEDD CLIL AS D
GLW D VM TNEE V CDL ARKRILL WHKKNAMAGEALLPAEKRGEGKDP AAM SAAE Y
LSKMALQKGSKDNISVVVVDLKGIRKFKSKSLN (SEQ ID NO:91).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de una proteína Cry2 (también conocida como criptocromo 2). Por ejemplo, un miembro de un dímero concreto (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) puede proceder de proteínas Cry2 de cualquier organismo (por ejemplo, una planta) tal como, pero sin limitación, aquellas de Arabidopsis thaliana. Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa, de aproximadamente 160 aa a aproximadamente 170 aa, de aproximadamente 170 aa a aproximadamente 180 aa, de aproximadamente 180 aa a aproximadamente 190 aa o de aproximadamente 190 aa a aproximadamente 200 aa de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos:
Cry2 (Arabidopsis thaliana)
M KM D KKTIV W FRRD LRIED NPA LAA AA HEG SVFPVFIW CPEEEGQ FYPGRASRW W
MKQSLAHLSQSLKALGSDLTLIKTHNTISAILDCIRVTGATKWFNHLYDPVSLVRD
HTYKEKLVERGISYQSYNGDLLYEPWEIYCEKGKPFTSFNSYWKKCLDMSIESVML
PPP WRLMPIT AAAE AI WAC SIEELGLENEAEKPSNALLTRAW SPGW SNADKLLNEFI
EKQLIDYAKNSKKWGNSTSLLSPYLHFGEISVRHVFQCARMKQIIWARDKNSEGE
ESADLFLRGIGLREYSRYICFNFPFTHEQSLLSHLRFFPWDADVDKFKAWRQGRTG
YPLVDAGMRELWATGWMHNRIRVIVSSFAVKFLLLPWKWGMKYFWDTLLDADL
ECDILGWQYISGSIPDGHELDRLDNPALQGAKYDPEGEYIRQWLPELARLPTEW1HH
P WD APLT VLKASGVELGTNY AKPIVDIDT ARELL AKAISRTREAQIMIGAAPDEI VA
DSFEALGANTIKEPGLCPSVSSNDQQVPSAVRYNGSKRVKPEEEEERDMKKSRGFD
ERELFSTAESSSSSSVFFVSQSCSLASEGKNLEGIQDSSDQITTSLGKNGCK (SEQ ID
NO:92).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de la proteína CIB1 de Arabidopsis thaliana (también conocida como factor de transcripción bHLH63). Por ejemplo, un dímero adecuado (por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador) puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximada aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadame identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadam aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproxi aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa, de aproximadamente 160
Figure imgf000020_0001
170 aa, de aproximadamente 170 aa a aproximadamente 180 aa, de aproximadamente 180 aa a ap aproximadamente 190 aa a aproximadamente 200 aa de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MNGAIGGDLLLNFPDMSVLERQRAHLKYLNPTFDSPLAGFFADSSMITGGEMDSYL
STAGLNLPMMYGETTVEGDSRLSISPETTLGTGNFKKRKFDTETKDCNEKKKKMT
MNRDDL VEEGEEEKSKITEQNN G STKSIKKMKHKAKKEENNF SND S SKVTKELEKT
DYIHVRARRGQATDSHSIAERVRREKISERMKFLQDLVPGCDKITGKAGMLDEIINY
VQSLQRQIEFLSMKLAIVNPRPDFDMDDIFAKEVASTPMTVVPSPEMVLSGYSHEM
VHSGYSSEMVNSGYLHVNPMQQVNTSSDPLSCFNNGEAPSMWDSHVQNLYGNLG
V (SEQ ID NO:93).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de la proteína GAI de Arabidopsis thaliana (también conocida como insensible al ácido giberélico y proteína GAI DELLA). Por ejemplo, un miembro de un par de unión a dimerizador adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos
0 aa, de 0 aa, de
Figure imgf000020_0002
0 aa, de
aproximadamente 190 aa a aproximadamente 200 aa de la siguiente secuencia de aminoácidos:
M KRDHHHHHHQDKKTM M M NEEDDGNGM DELLAVLGYKVRSSEM ADVAQKLEQ
LEYM M SNVQEDDLSQLATETYHYNPAELYTW LDSM LTDLNPPSSNAEYDLKAIPG
D AILN QFAIDSASSSNQ GGGGDT YTTNKRLKC SN G V VETTT AT AESTRH V VL VD S Q
EN GVRLVHALL AC AE AV QKENLT VAEALVKQIGFL AV SQIGAM RKVAT YFAE AL A
RRIYRLSPSQSPIDHSLSDTLQM HFYETCPYLKFAHFTANQAILEAFQGKKRVHVIDF
SMSQGLQWPALMQALALRPGGPPVFRLTGIGPPAPDNFDYLHEVGCKLAHLAEA1H
VEFEYRGFVANTLADLDASMLELRPSEIESVAVNSVFELHKLLGRPGAIDKVLGVV
NQIKPEIFTVVEQESNHNSPIFLDRFTESLHYYSTLFDSLEGVPSGQDKVMSEVYLGK
QICNVVACDGPDRVERHETLSQWRNRFGSAGFAAAHIGSNAFKQASMLLALFNGG
EG YRVEES DGCLMLGWHTRPLT ATS A WKLSTN (SEQ ID NO:94).
En algunos casos, un miembro de un dímero (por ejemplo, un par de unión a dimerizador) procede de una proteína GID1 de Arabidopsis thaliana (también conocida como receptor GID1 de giberelina). Por ejemplo, un miembro del dímero adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa, de aproximadamente 160 aa a aproximadamente 170 aa, de aproximadamente 170 aa a aproximadamente 180 aa, de aproximadamente 180 aa a aproximadamente 190 aa o de aproximadamente 190 aa a aproximadamente 200 aa de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos:
GID1A:
MAASDEVNLIESRTVVPLNTWVLISNFKVAYNILRRPDGTFNRHLAEYLDRKVTAN
ANPVDGVFSFDVLIDRRINLLSRVYRPAYADQEQPPSILDLEKPVDGDIVPVILFFHG
GSFAHSSANSAIYDTLCRRLVGLCKCVVVSVNYRRAPENPYPCAYDDGWIALNWV
NSRSW LKSKKDSKVHIFLAGDSSGGNIAHNVALRAGESGIDVLGNILLNPMFGGNE
RTESEKSLDGKYFVTVRDRDWYWKAFLPEGEDREHPACNPFSPRGKSLEGVSFPKS
LVVVAGLDLIRDWQLAYAEGLKKAGQEVKLMHLEKATVGFYLLPNNNHFHNVM
DEISAFVNAEC (SEQ ID NO:95).
GID1B:
M AGGNEVNLNECKRIVPLNTW VLISNEKLAYKVLRRPDGSFNRDLAEELDRKVPA
N SFPLDGVFSFDHVDSTTNLLTRIY QPASLLHQTRHGTLELTKPLSTTEIVPVLIFFHG
GSFTHSSANSAIYDTFCRRLVTICGVVVVSVDYRRSPEHRYPCAYDDGW NALNW V
KSRVW LQSGKDSNVYVYLAGDSSGGNIAHNVAVRATNEGVKVLGNILLHPM FGG
QERTQSEKTLDGKYFVTIQDRDW YW RAYLPEGEDRDHPACNPFGPRGQSLKGVNF
PKSLVVVAGLDLVQDW QLAYVDGLKKTGLEVNLLYLKQATIGFYFLPNNDHFHCL
M EELNKFVHSIEDSQSKSSPVLLTP (SEQ ID NO:96)
GID1C:
MAGSEEVNLIESKTWPLNTWVLISNFKLAYNLLRRPDGTFNRHLAEFLDRKVPAN
ANPVNGVFSFDVIIDRQTNLLSRVYRPADAGTSPSITDLQNPVDGEIYPVIVFFHGGS
FA HSSANSAIYDTLCRRLVGLCGAVVVSVNYRRAPENRYPCAYDDGW AVLKW VN
SSSWLRSKKDSKVRIFLAGDSSGGNIVHNVAVRAVESRIDVLGNILLNPMFGGTERT
ESEKRLDGKYFVTVRDRDWYWRAFLPEGEDREHPACSPFGPRSKSLEGLSFPKSLV
V V A G FD FIQ D W Q LK YA EGLKKA GQ EVK LFY LEQA TIGFY FLPN NN HFH TVM D EIA
AFVNAECQ (SEQ ID NO:97).
Dimerizadores
Los dimerizadores ("agentes de dimerización") que pueden posibilitar la dimerización de un primer miembro de un par de unión a dimerizador y un segundo miembro de un par de unión a dimerizador incluyen, por ejemplo (encontrándose el dimerizador entre paréntesis a continuación del par de unión a dimerizador):
a) FKBP y FKBP (rapamicina);
b) FKBP y CnA (rapamicina);
c) FKBP y ciclofilina (rapamicina);
d) FKBP y FRG (rapamicina);
e) GyrB y GyrB (coumermicina);
f) DHFR y DHFR (metotrexato);
g) DmrB y DmrB (AP20187);
h) PYL y ABI (ácido abscísico);
i) Cry2 y CIB1 (luz azul); y
j) g A i y GID1 (giberelina).
Como se ha indicado anteriormente, la rapamicina puede servir como dimerizador. Como alternativa, puede usarse un derivado o análogo de la rapamicina. Véase, por ejemplo, WO96/41865; WO 99/36553; WO 01/14387; y Ye et al. (1999) Science 283:88-91. Por ejemplo, los análogos, homólogos, derivados y otros compuestos relacionados estructuralmente con la rapamicina ("rapálogos") incluyen, entre otros, variantes de la rapamicina que tienen una o más de las siguientes modificaciones en relación con la rapamicina: desmetilación, eliminación o reemplazo del metoxi en C7, C42 y/o C29; eliminación, derivatización o reemplazo del hidroxi en C13, C43 y/o C28; reducción, eliminación o derivatización de la cetona en C14, C24 y/o C30; reemplazo del anillo de pipecolato de 6 miembros por un anillo de prolilo de 5 miembros; una sustitución alternativa en el anillo de ciclohexilo o el reemplazo del anillo de ciclohexilo por un anillo de ciclopentilo sustituido. Se ha presentado información adicional en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.525.610; 5.310.9035.362.718; y 5.527.907. Se ha descrito la epimerización selectiva del grupo hidroxilo C-28; véase, por ejemplo, el documento WO 01/14387. Los agentes de dimerización sintéticos adicionales adecuados para su uso como alternativa a la rapamicina incluyen aquellos descritos en la Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° 2012/0130076.
La rapamicina tiene la estructura:
Figure imgf000023_0001
Los rapálogos adecuados incluyen, por ejemplo,
Figure imgf000023_0002
También resulta útil como rapálogo un compuesto de fórmula:
Figure imgf000023_0003
donde n es 1 o 2; R28 y R43 son independientemente H o un resto alifático o de acilo sustituido o sin sustituir; uno de R7a y R7b es H y el otro es halo, RA, ORA, SRA, -OC(O)RA, -OC(O)NRARB, -NRARB, -NRBC(OR)RA, NRBC(O)ORA, -NRbSO2Ra o NRBSO2NRARB'; o R7a y R7b, tomados conjuntamente, son H en el resto de tetraeno:
Figure imgf000024_0001
donde RA es H o un resto alifático, heteroalifático, de arilo o de heteroarilo y donde RB y RB' son independientemente H, OH o un resto alifático, heteroalifático, de arilo o de heteroarilo sustituido o sin sustituir.
Como se ha indicado anteriormente, la coumermicina puede servir como agente dimerizador. Como alternativa, puede usarse un análogo de la coumermicina. Véase, por ejemplo, Farrar et al. (1996) Nature 383:178-181; y la patente de los Estados Unidos n.° 6.916.846.
Como se ha indicado anteriormente, en algunos casos, el agente dimerizador es metotrexato, por ejemplo, un dímero de metotrexato homobifuncional no citotóxico. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 8.236.925.
Dominio de señalización intracelular
Los dominios de señalización intracelular adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación incluyen cualquier dominio de señalización deseado que proporcione una señal distinta y detectable (por ejemplo, producción aumentada de una o más citocinas por parte de la célula; cambio en la transcripción de un gen diana; cambio en la actividad de una proteína; cambio en el comportamiento celular, por ejemplo, muerte celular; proliferación celular; diferenciación celular; supervivencia celular; modulación de respuestas de señalización celular; etc.) en respuesta a la activación del CAR (es decir, activado por un antígeno y un agente de dimerización). En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular incluye al menos uno (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc.) motivos ITAM como se describe más adelante. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular incluye cadenas de señalización de tipo DAP10/CD28. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular está unido de manera no covalente al CAR unido a la membrana, pero en cambio, se difunde en el citoplasma.
ITAM
Los dominios de señalización intracelular adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación incluyen polipéptidos de señalización intracelular que contienen un motivo de activación en inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). Un motivo ITAM es YX1X2L/I, donde X1 y X2son independientemente cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 130). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de un CAR concreto comprende 1, 2, 3, 4 o 5 motivos ITAM. En algunos casos, en un dominio de señalización intracelular, se repite un motivo ITAM dos veces, estando separadas entre sí las apariciones primera y segunda del motivo ITAM por de 6 a 8 aminoácidos, por ejemplo, (YX1X2L/I)(Xa)n(YX1X2L/I), donde n es un número entero de 6 a 8 y cada uno de los 6-8 X3 pueden ser cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 131). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de un CAR concreto comprende 3 motivos ITAM.
Un dominio de señalización intracelular adecuado puede ser una porción que contiene un motivo ITAM que procede de un polipéptido que contiene un motivo ITAM. Por ejemplo, un dominio de señalización intracelular adecuado puede ser un dominio que contiene un motivo ITAM procedente de una proteína que contiene cualquier motivo ITAM. Por lo tanto, no es necesario que un dominio de señalización intracelular adecuado contenga la secuencia completa de la proteína completa de la que procede. Los ejemplos de polipéptidos que contienen motivos ITAM adecuados incluyen, pero sin limitación: DAP12; FCER1G (cadena gamma I del receptor Fc épsilon); CD3D (CD3 delta); CD3E (Cd 3 épsilon); CD3G (CD3 gamma); CD3Z (CD3 zeta); y CD79A (cadena alfa de proteína asociada a complejo de receptor de antígeno).
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de DAP12 (también conocido como TYROBP; proteína de unión a proteína tirosina cinasa TYRO; KARAP; PLOSL; proteína de activación de DNAX 12; proteína asociada a KAR; proteína de unión a proteína tirosina cinasa TYRO; proteína asociada a receptor de activación de eliminación; proteína asociada a receptor de activación de eliminación; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de cualquiera de las secuencias de aminoácidos siguientes (4 isoformas):
MGGLEPC SRLLLLPLLL AV S GLR P V Q AQ AQ SDC S C STV S PG VL AGI VMGDL VLT VLI
ALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESPY O ELOGORSDVYSDLNTORPYY
K (SEQ ID NO:98);
MGGLEPC SRLLLLPLLL AV S GLRP V Q AQ AQ SDC S C STV S PGVL AGI VMGDL VLT VLI
ALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETESPY O ELOGQRSDVYSDLNTORPYYK
(SEQ ID NO:99);
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLV
PRGRGAAEAATRKQRITETESPY O ELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID
NO: 100); o
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLV
PRGRGAAEATRKORITETESPY Q ELQGQRSDVYSDLNTORPYYK (SEQ ID NO: 101),
donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de DAP12 de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: ESPYQELQGQRSDVYSDLNTQ (SEQ ID NO: 102), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de FCER1G (también conocido como FCRG; cadena gamma I del receptor Fc épsilon; cadena gamma del receptor de Fc; Fc-épsilon RI-gamma; FcRgamma; FceRI gamma; subunidad gamma del receptor épsilon de inmunoglobulina de alta afinidad; receptor E de inmunoglobulina, alta afinidad, cadena gamma; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSY EKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQ ID NO: 103), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de FCER1G de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: DGVYTGLSTRNQETYETLKHE (SEQ ID NO: 104), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de la cadena delta de la glucoproteína de la superficie de los linfocitos T CD3 (también conocido como CD3D; CD3-DELTA; T3D; antígeno CD3, subunidad delta; c D3 delta; antígeno CD3d, polipéptido delta (complejo TiT3); OKT3, cadena delta; cadena delta del receptor T3 de linfocitos T; cadena delta de la glucoproteína de la superficie de linfocitos T CD3; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 170 aa, de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (2 isotermas):
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFK1P1EELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRL
DLGKJRiLDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIAT
LLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVY O PL RDRDDAOY SH LGGNWAR
NK (SEQ ID NO: 105) o
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRL DLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQVYQPLRDRDD AQYSHLGGNWARNK (SEQ ID NO: 106), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 delta de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: DQVYQPLRDRDDAQYSHLGGN (SEQ ID NO: 107), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de la cadena épsilon de la glucoproteína de la superficie de los linfocitos T CD3 (también conocido como CD3e, cadena épsilon del antígeno T3/Leu-4 de la superficie de linfocitos T, cadena épsilon de la glucoproteína de la superficie de linfocitos T CD3, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 205 aa, de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSE ILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYL YLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAG AGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
(SEQ ID NO: 108), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo iTa M procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 épsilon de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (SEQ ID NO: 109), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de la cadena gamma de la glucoproteína de la superficie de los linfocitos T CD3 (también conocido como c D3G, cadena gamma del receptor T3 de linfocitos T, CD3-GAMMA, T3G, polipéptido gamma (complejo TiT3), etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98% o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 180 aa, de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWF KDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIEL NAATISGFLFAEIVSIFVLAYGVYFIAGQDGYRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDRE DDQYSHLQGNQLRRN (SEQ ID NO: 110), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo iTa M procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 gamma de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: DQLYQPLKDREDdQy SHLQGN (SEQ ID NO: 111), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de la cadena zeta de la glucoproteína de la superficie de los linfocitos T CD3 (también conocido como CD3Z, cadena zeta del receptor T3 de linfocitos T, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98% o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa, de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (2 isoformas):
M KW KALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRS
ADAPAYOOGONOLY N ELN LGRREEY P V L DKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYN
ELOKDKM AEA Y SEIGMKGERRRGKGHDGLY O G L STATKDTY D A LHMOALPPR
(SEQ ID NO: 112) o
m k w k a l f t a a il q a q l p it e a q s f g l l d p k l c y l l d g il f iy g v il t a l f l r v k f s r s
a d a p a y q q g q n q l y n e l n l g r r e e y d v l d k r r g r d p e m g g k p q r r k n p q e g l y NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ id NO: 113), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de cualquiera de las secuencias de aminoácidos siguientes:
RVKFSRSADAPAYOOGONOLY N ELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP
OEGLY N ELOKDKMAEAYSETGMKGERRRGKGHDGLY Q G L STATKDTYDALHMO
ALPPR (SEQ ID NO: 18);
NOLYNELNLGRREEYDVLDKR (SEQ id NO: 114);
EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (SEQ id NO: 115); o
DGLY0G LSTATKDTYDALHMQ (Se Q ID NO: 116), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular procede de CD79A (también conocido como cadena alfa de proteína asociada al complejo de receptor de antígenos de linfocitos B; antígeno CD79a (alfa asociado a inmunoglobulinas); glucoproteína de membrana MB-1; Ig-alfa; proteína asociada a inmunoglobulina unida a membrana; proteína de superficie asociada a IgM; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98% o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 200 aa o de aproximadamente 200 aa a aproximadamente 220 aa, de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (2 isoformas):
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDA
HFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLnQNVNKSHGGIYV
CRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLL
LFRKRWQNEKLGLD AGDEYEDENLYEGJLNLDDCSMYEDJSRGLQGTY QDV GSLN
TGDVQLEKP (SEQ TD N O : 117); o
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYT WPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNR NTAEGMLLFCAWPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYE DISRGLQGTYQDVGSL NIGDVQLE (SEQ ID NO: 118), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
Del mismo modo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD79A de longitud completa. Por lo tanto, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la siguiente secuencia de aminoácidos: ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (SEQ ID NO: 119), donde los motivos ITAM se encuentran en negrita y subrayados.
DAP10/CD28
Los dominios de señalización intracelular adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación incluyen una cadena de señalización de tipo DAP10/CD28.
Un ejemplo de una cadena de señalización de DAP10 es la secuencia de aminoácidos: RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 120). En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la secuencia de aminoácidos de longitud completa RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 120).
Un ejemplo de una cadena de señalización de CD28 es la secuencia de aminoácidos FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 121). En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de la secuencia de aminoácidos de longitud completa
FW VLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFW VRSKRSRLLHSDY M N M TPRRPGPTRKHYO
PYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 121).
ZAP70
Los dominios de señalización intracelular adecuados para su uso en un CAR de la presente divulgación incluyen un polipéptido ZAP70, por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o un 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de una serie contigua de aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 400 aminoácidos, de aproximadamente 400 aminoácidos a aproximadamente 500 aminoácidos o de aproximadamente 500 aminoácidos a 619 aminoácidos, de la siguiente secuencia de aminoácidos:
MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRF HHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPG VFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSL TREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIP EGTKFDTLWQLYEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHP QRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLELKRDNL LIADIELGCGNFGSVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQ LDNPYIVRLIGVCQ AE ALML VMEMAGGGPLHKFL V GK REEIP V SNV AELLHQ V SM GMKYLEEKNFYHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKW PLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQG KRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGS TQKAEAACA (SEQ ID NO:36).
Secuencias adicionales
El primer y/o el segundo polipéptido de un CAR concreto puede incluir además uno o más dominios de polipéptido adicionales, incluyendo dichos dominios, pero sin limitación, una secuencia de señal; una etiqueta epitópica; un dominio de afinidad; y un polipéptido que produce una señal detectable.
Secuencias de señal
Las secuencias de señal que son adecuadas para su uso en un CAR concreto, por ejemplo, en el primer polipéptido de un CAR concreto, incluyen cualquier secuencia de señal de eucariota, incluyendo una secuencia de señal de origen natural, una secuencia sintética (por ejemplo, producida por la mano del hombre), etc.
Etiqueta epitópica
Las etiquetas epitópicas adecuadas incluyen, pero sin limitación, hemaglutinina (HA; por ejemplo, YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 122); FLAG (por ejemplo, DYKDDDDK (SEQ ID NO: 123); c-myc (por ejemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 4) y similares.
Dominio de afinidad
Los dominios de afinidad incluyen secuencias peptídicas que pueden interactuar con un compañero de unión, por ejemplo, tal como uno inmovilizado sobre un soporte sólido, útiles con fines de identificación o purificación. Pueden usarse secuencias de ADN que codifican múltiples aminoácidos individuales consecutivos, tales como histidina, que cuando se fusionan a la proteína expresada permiten la purificación en una etapa de la proteína recombinante mediante unión de alta afinidad a una columna de resina, tal como níquel-sefarosa. Los dominios de afinidad a modo de ejemplo incluyen His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 124), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO: 125), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 4), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 123), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 126), hemaglutinina, por ejemplo, etiqueta Ha (YPYDVp DYa ) (SEQ ID NO: 122), GST, tiorredoxina, dominio de unión a celulosa, RYIRS (SEQ ID NO: 127), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO: 128), dominio de unión a quitina, péptido S, péptido T7, dominio SH2, etiqueta de Ar N de extremo C, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO: 129), dominios de unión a metal, por ejemplo, dominios de unión a cinc o dominios de unión a calcio, tales como aquellos de las proteínas de unión a calcio, por ejemplo, calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadena ligera de miosina, recoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frecuenina, caltractina, subunidad grande de calpaína, proteínas S100, parvalbúmina, calbindina D9K, calbindina D28K y calretinina, inteínas, biotina, estreptavidina, MyoD, Id, secuencias de cremallera de leucina y proteína de unión a maltosa.
Polipéptidos que producen señal detectable
Las proteínas productoras de señal detectable adecuadas incluyen, por ejemplo, proteínas fluorescentes; enzimas que catalizan una reacción que genera una señal detectable como producto; y similares.
Las proteínas fluorescentes adecuadas incluyen, pero sin limitación, proteína fluorescente verde (GFP) o variantes de la misma, variante fluorescente azul de GFP (BFP), variante fluorescente cian de GFP (CFP), variante fluorescente amarilla de GFP (YFP), GFP mejorada (EGFP), CFP mejorada (ECFP), YFP mejorada (EYFP), GFPS65T, Esmeralda, Topacio (TYFP), Venus, Citrina, mCitrina, GFPuv, EGFP desestabilizada (dEGFP), ECFP desestabilizada (dECFP), EYFP desestabilizada (dEYFP), mCFPm, Ceruleano, T-Zafiro, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, monómero de DsRed, J-Red, dimer2, t-dimer2(12), mRFP1, pociloporina, GFP de Renilla, GFP de Monster, paGFP, proteína Kaede y proteína kindling, ficobiliproteínas y conjugados de ficobiliproteína, incluyendo B-ficoeritrina, R-ficoeritrina y aloficocianina. Otros ejemplos de proteínas fluorescentes incluyen mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrape1, mRaspberry, mGrape2, mPlum (Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909) y similares. Es adecuado el uso de cualquiera de una serie de proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de antozoos, tal como se describe, por ejemplo, en Matz et al. (1999) Nature Biotechnol.
17:969-973.
Las enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, beta-N-acetilglucosaminidasa, p-glucuronidasa, invertasa, xantina oxidasa, luciferasa de luciérnaga, glucosa oxidasa y similares.
Recombinación de secuencias
En determinados casos, pueden reorganizarse o eliminarse las secuencias de los polipéptidos de un CAR, por ejemplo, dominios de CAR en una célula mediante el uso de la tecnología de recombinación de sitio específico. En determinadas realizaciones, puede cambiarse la respuesta relacionada con la activación celular frente a un CAR concreto mediante recombinación de sitio específico, por ejemplo, puede intercambiarse un primer dominio de señalización intracelular de un CAR que desencadena una primera respuesta relacionada con la activación por un segundo dominio de señalización intracelular que desencadena una segunda respuesta relacionada con la activación. En determinados casos, puede cambiarse la respuesta a un dimerizador concreto de un CAR mediante recombinación de sitio específico, por ejemplo, puede intercambiarse un primer par de unión a dimerizador que provoca la dimerización de un CAR en presencia de un primer dimerizador por un segundo par de unión a dimerizador que provoca la dimerización del CAR en presencia de un segundo dimerizador. Como será evidente para los expertos en la materia, puede usarse recombinación de sitio específico en una célula para intercambiar cualquier dominio o secuencia de un CAR por cualquier otro dominio o secuencia, tal como se divulga en el presente documento. Como también será evidente para los expertos en la materia, puede usarse recombinación de sitio específico en una célula para eliminar cualquier dominio o secuencia de un CAR. Dicho intercambio y extracción de secuencias y dominios se conoce en la técnica, véase, por ejemplo, el intercambio de dominios en cuerpos de señalización como se describe en Tone et al. (2013) Biotechnology and Bioengineering, 3219-3226. También se conocen en la técnica los mecanismos y requisitos para llevar a cabo la recombinación de sitio específico in vivo, véase, por ejemplo, Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 y Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA).
ÁCIDOS NUCLEICOS
La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación será ADN, incluyendo, por ejemplo, un vector de expresión recombinante. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación será ARN, por ejemplo, a Rn sintetizado in vitro.
En algunos casos, un ácido nucleico de la presente divulgación comprende una secuencia de nucleótidos que codifica únicamente el primer polipéptido (y no el segundo polipéptido) de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación. En algunos casos, un ácido nucleico de la presente divulgación comprende una secuencia de nucleótidos que codifica únicamente el segundo polipéptido (y no el primer polipéptido) de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación. En algunos casos, un ácido nucleico de la presente divulgación comprende una secuencia de nucleótidos que codifica tanto el primer polipéptido como el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación.
En algunos casos, un ácido nucleico concreto posibilita la producción de un CAR de la presente divulgación, por ejemplo, en una célula de mamífero. En otros casos, un ácido nucleico concreto posibilita la amplificación del ácido nucleico que codifica el CAR.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR de la presente divulgación puede unirse operativamente a un elemento de control transcripcional, por ejemplo, un promotor y un potenciador, etc.
Se conocen en la técnica elementos promotores y potenciadores adecuados. Para su expresión en una célula bacteriana, los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para su expresión en una célula eucariota, los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, el promotor del gen de la cadena ligera y/o pesada de inmunoglobulina y elementos potenciadores; el promotor temprano inmediato de citomegalovirus; el promotor de timidina cinasa del virus herpes simplex; los promotores temprano y tardío de SV40; el promotor presente en las repeticiones terminales largas de un retrovirus; el promotor de metalotioneína-I de ratón; y diversos promotores específicos de tejido conocidos en la técnica.
Se conocen en la técnica promotores reversibles adecuados, incluyendo promotores inducibles reversibles. Dichos promotores reversibles pueden aislarse y obtenerse de diversos organismos, por ejemplo, eucariotas y procariotas. Se conoce bien en la técnica la modificación de promotores reversibles procedentes de un organismo para su uso en un segundo organismo, por ejemplo, un primer procariota y un segundo eucariota, un primer eucariota y un segundo procariota, etc. Dichos promotores reversibles y los sistemas basados en dichos promotores reversibles pero que también comprenden proteínas de control adicionales incluyen, pero sin limitación, promotores regulados por alcohol (por ejemplo, el promotor del gen de alcohol deshidrogenasa I (alcA), promotores sensibles a proteínas transactivadoras del alcohol (AlcR), etc.), promotores regulados por tetraciclina, (por ejemplo, sistemas promotores que incluyen activadores Tet, TetON, TetOFF, etc.), promotores regulados por esteroides (por ejemplo, sistemas de promotor de receptor de glucocorticoides de rata, sistemas de promotor de receptor de estrógenos humano, sistemas de promotor de retinoides, sistemas de promotor de tiroides, sistemas de promotor de ecdisona, sistemas de promotor de mifepristona, etc.), promotores regulados por metales (por ejemplo, sistemas de promotor de metalotioneína, etc.), promotores regulados por patogénesis (por ejemplo, promotores regulados por ácido salicílico, promotores regulados por etileno, promotores regulados por benzotiadiazol, etc.), promotores regulados por temperatura (por ejemplo, promotores inducibles por choque térmico (por ejemplo, HSP-70, HSP-90, el promotor de choque térmico de la soja, etc.), promotores regulados por luz, promotores inducibles sintéticos y similares.
En algunos casos, el locus o la construcción o el transgén que contiene el promotor adecuado se activa de manera irreversible a través de la inducción de un sistema inducible. Se conocen bien en la técnica sistemas inducibles para la inducción de un centro activo irreversible, por ejemplo, la inducción de un centro activo irreversible puede emplear una recombinación mediada por Cre-lox (véase, por ejemplo, Fuhrmann-Benzakein, et al., PNAS (2000) 28:e99). Puede usarse cualquier combinación adecuada de recombinasa, endonucleasa, ligasa, sitios de recombinación, etc. conocidos en la técnica para generar un promotor activable de manera irreversible. Se conocen bien en la técnica métodos, mecanismos y requisitos para llevar a cabo la recombinación de sitio específico, descrita en otra parte del presente documento y son útiles para generar promotores activados de manera irreversible, véase, por ejemplo, Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 y Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA).
En algunos casos, el promotor es un promotor específico de células CD8, un promotor específico de células CD4, un promotor específico de neutrófilos o un promotor específico de NK. Por ejemplo, puede usarse un promotor del gen CD4; véase, por ejemplo, Salmon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7739; y Marodon et al. (2003) Blood 101:3416. A modo de ejemplo adicional, puede usarse un promotor del gen CD8. Puede lograrse la expresión específica en células NK mediante el uso de un promotor Ncr1 (p46); véase, por ejemplo, Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1565.
En algunas realizaciones, por ejemplo, para su expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo, tal como un promotor de ADH1, un promotor de PGK1, un promotor de ENO, un promotor de PYK1 y similares; o un promotor regulable, tal como un promotor de GAL1, un promotor de GAL10, un promotor de ADH2, un promotor de PHO5, un promotor de CUP1, un promotor de GAL7, un promotor de MET25, un promotor de MET3, un promotor de CYC1, un promotor de HIS3, un promotor de ADH1, un promotor de PGK, un promotor de GAPDH, un promotor de ADC1, un promotor de TRP1, un promotor de URA3, un promotor de LEU2, un promotor de ENO, un promotor de TP1 y AOX1 (por ejemplo, para su uso en Pichia). La selección del vector y el promotor adecuados se encuentra dentro de las capacidades básicas de un experto en la materia.
Los promotores adecuados para su uso en células hospedadoras procariotas incluyen, pero sin limitación, un promotor de ARN polimerasa de bacteriófago T7; promotor de trp; un promotor de operón lac; un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido de lac/tac, un promotor híbrido de tac/trc, promotor de trp/lac, promotor de T7/lac; un promotor de trc; un promotor de tac y similares; un promotor de araBAD; promotores regulados in vivo,, tales como un promotor ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° 20040131637), un promotor pagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), un promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), y similares (véase, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; y Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor de sigma70, por ejemplo, un promotor consenso sigma70 (véanse, por ejemplo, los n.° de referencia de GenBank AX798980, AX798961 y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo, un promotor dps, un promotor spv y similares; un promotor procedente de la isla de patogenia SPI-2 (véase, por ejemplo, el documento WO96/17951); un promotor actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); un promotor rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367); un promotor tet (véase, por ejemplo, Hillen, W. y Wissmann, A. (1989) en Saenger, W. y Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, Londres, Reino Unido, Volumen 10, págs. 143-162); un promotor SP6 (véase, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); y similares. Los promotores fuertes adecuados para su uso en procariotas, tales como Escherichia coli, incluyen, pero sin limitación, Trc, Tac, T5, T7 y PLambda. Los ejemplos no limitantes de operadores para su uso en células hospedadoras bacterianas incluyen un operador de promotor de lactosa (la proteína represora de Lacl cambia de conformación cuando entra en contacto con lactosa, impidiendo de este modo que la proteína represora Lacl se una al operador), un operador de promotor de triptófano (cuando se encuentra en complejo con triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que se une al operador; en ausencia de triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que no se une al operador) y un operador de promotor tac (véase, por ejemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25).
Una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR concreto puede estar presente en un vector de expresión y/o un vector de clonación. En los casos donde un CAR concreto comprenda dos polipéptidos separados, pueden clonarse las secuencias de nucleótidos que codifican los dos polipéptidos en el mismo vector o en vectores separados. Un vector de expresión puede incluir un marcador de selección, un origen de replicación y otras características que posibiliten la replicación y/o el mantenimiento del vector. Los vectores de expresión adecuados incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores víricos y similares.
Los expertos en la materia conocen grandes cantidades de vectores y promotores adecuados; muchos se encuentran disponibles comercialmente para generar construcciones recombinantes concretas. Los siguientes vectores se proporcionan a título enunciativo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., EE.UU.); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Los vectores de expresión tienen generalmente sitios de restricción convenientes ubicados próximos a la secuencia promotora para posibilitar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas heterólogas. Puede estar presente un marcador de selección operativo en el hospedador de expresión. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores víricos (por ejemplo, vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociados (véase, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de la inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); un vector retrovírico (por ejemplo, virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores procedentes de retrovirus, tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación será ARN, por ejemplo, a Rn sintetizado in vitro. Se conocen en la técnica métodos para la síntesis de ARN in vitro; puede emplearse cualquier método conocido para sintetizar ARN que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación. Se conocen en la técnica métodos para introducir ARN en una célula hospedadora. Véase, por ejemplo, Zhao et al. (2010) Cancer Res. 15:9053. La introducción de un ARN que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación en una célula hospedadora puede llevarse a cabo in vitro o ex vivo o in vivo. Por ejemplo, puede someterse a electroporación a una célula hospedadora (por ejemplo, una célula NK, un linfocito T citotóxico, etc.) in vitro o ex vivo con ARN que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique el primer y/o el segundo polipéptido de un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación.
CÉLULAS
La presente divulgación proporciona una célula de mamífero que se modifica genéticamente para producir un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación.
Las células de mamífero adecuadas incluyen células primarias y líneas celulares inmortalizadas. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de primate no humano, líneas celulares de roedor (por ejemplo, ratón, rata) y similares. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células HeLa (por ejemplo, Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) n.° CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC n.° CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, At CC n.° CRL-1573), células Vero, células NIH 3t 3 (por ejemplo, ATCC n.° CRL-1658), células Huh-7, células Bh K (por ejemplo, ATCC n.° CCL10), células PC12 (ATCC n.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC n.° CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC n.° CCLI.3), células de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC n.° CRL1573), células HLHepG2, líneas celulares Hut78, Jurkat, HL-60, NK (por ejemplo, NKL, NK92 e YTS) y similares.
En algunos casos, la célula no es una línea celular inmortalizada, sino que es una célula (por ejemplo, una célula primaria) obtenida de un individuo. Por ejemplo, en algunos casos, la célula es una célula inmunitaria obtenida de un individuo. Como un ejemplo, la célula es un linfocito T obtenido de un individuo. A modo de ejemplo adicional, la célula es una célula citotóxica obtenida de un individuo. A modo de ejemplo adicional, la célula es una célula madre o una célula progenitora obtenida de un individuo.
MÉTODOS PARA ACTIVAR UNA CÉLULA INMUNITARIA
La presente divulgación proporciona métodos para activar una célula inmunitaria in vitro, in vivo o ex vivo. Los métodos implican generalmente poner en contacto una célula inmunitaria (in vitro, in vivo o ex vivo) con un agente dimerizador y un antígeno, estando la célula inmunitaria modificada genéticamente para producir un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación. En presencia del agente dimerizador y del antígeno, el CAR heterodimérico condicionalmente activo se dimeriza y activa a la célula inmunitaria, produciendo de este modo una célula inmunitaria activada. Las células inmunitarias incluyen, por ejemplo, un linfocito T citotóxico, una célula NK, un linfocito T CD4+, un linfocito T regulador (Treg), etc.
La puesta en contacto de la célula inmunitaria modificada genéticamente (por ejemplo, un linfocito T, una célula NK) con un agente dimerizador y un segundo miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno, un ligando, un receptor) puede aumentar la producción de una citocina por parte de la célula inmunitaria en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la cantidad de citocina producida por la célula inmunitaria en ausencia del segundo miembro de un par de unión específica y/o del agente de dimerización. Las citocinas cuya producción puede aumentarse incluyen, pero sin limitación, IL-2 e IFN-y.
La puesta en contacto de la célula inmunitaria modificada genéticamente (por ejemplo, un linfocito T, una célula NK) con un agente dimerizador y un antígeno puede aumentar la producción de una citocina por parte de la célula inmunitaria en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la cantidad de citocinas producidas por la célula inmunitaria en ausencia del antígeno y/o del agente de dimerización. Las citocinas cuya producción puede aumentarse incluyen, pero sin limitación, IL-2 e IFN-y.
La puesta en contacto de una célula citotóxica modificada genéticamente (por ejemplo, un linfocito T citotóxico) con un agente dimerizador y un segundo miembro de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno, un ligando, un receptor) puede aumentar la actividad citotóxica de la célula citotóxica en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la actividad citotóxica de la célula citotóxica en ausencia del agente de dimerización.
La puesta en contacto de una célula citotóxica modificada genéticamente (por ejemplo, linfocito T citotóxico) con un agente de dimerización y un antígeno puede aumentar la actividad citotóxica de la célula citotóxica en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la actividad citotóxica de la célula citotóxica en ausencia del agente de dimerización.
En otras realizaciones, por ejemplo, dependiendo de la célula inmunitaria hospedadora, la puesta en contacto de una célula hospedadora modificada genéticamente con un agente de dimerización y un antígeno puede aumentar o reducir la proliferación celular, la supervivencia celular, la muerte celular y similares.
MÉTODOS PARA GENERAR UNA CÉLULA CONDICIONALMENTE ACTIVABLE
La presente divulgación proporciona un método para generar una célula condicionalmente activable. El método implica generalmente modificar genéticamente una célula de mamífero con un vector de expresión o un ARN (por ejemplo, ARN transcrito in vitro), que comprende secuencias de nucleótidos que codifican un CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación. La célula genéticamente modificada se puede activar condicionalmente en presencia de: a) un antígeno al que se une el primer polipéptido del CAR; y b) un dimerizador (un agente de dimerización). La modificación genética puede llevarse a cabo in vivo, in vitro o ex vivo. La célula puede ser una célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T o una célula NK), una célula madre, una célula progenitora, etc.
En algunos casos, la modificación genética se lleva a cabo ex vivo. Por ejemplo, se obtiene un linfocito T, una célula madre o una célula NK de un individuo; y la célula obtenida del individuo se modifica genéticamente para expresar un CAR de la presente divulgación. La célula genéticamente modificada se puede activar condicionalmente en presencia de: a) un antígeno al que se une el primer polipéptido del CAR; y b) un dimerizador. En algunos casos, la célula genéticamente modificada se activa ex vivo. En otros casos, la célula genéticamente modificada se introduce en un individuo (por ejemplo, el individuo del cual se obtuvo la célula); y la célula genéticamente modificada se activa in vivo, por ejemplo, administrando un dimerizador al individuo. Por ejemplo, en los casos donde el antígeno está presente sobre la superficie de una célula en el individuo, no hay necesidad de administrar el antígeno. La célula genéticamente modificada entra en contacto con el antígeno presente sobre la superficie de una célula en el individuo; y, tras la administración de un dimerizador al individuo, se activa la célula genéticamente modificada. Por ejemplo, en los casos donde la célula genéticamente modificada es un linfocito T, la célula genéticamente modificada puede mostrar citotoxicidad frente a una célula que presenta un antígeno sobre su superficie a la que se une el CAR.
MÉTODOS DE TRATAMIENTO
La presente divulgación proporciona diversos métodos de tratamiento usado un CAR concreto.
Métodos de citotoxicidad
Un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en un linfocito T o una célula NK, puede mediar la citotoxicidad hacia una célula diana. Un CAR de la presente divulgación se une a un antígeno presente en una célula diana, mediando de este modo la eliminación de una célula diana por medio de un linfocito T o de una célula NK genéticamente modificada para que produzca el CAR. El dominio de unión a antígeno del CAR se une a un antígeno presente sobre la superficie de una célula diana.
Las células diana incluyen, pero sin limitación, células cancerosas. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para eliminar o inhibir el crecimiento de una célula diana de cáncer, implicando el método poner en contacto una célula efectora inmunitaria citotóxica (por ejemplo, un linfocito T citotóxico o una célula NK) que está modificada genéticamente para producir un CAR concreto, de tal forma que el linfocito T o la célula NK reconoce un antígeno presente sobre la superficie de una célula de cáncer diana y media la eliminación de la célula diana.
La presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un individuo que tenga un cáncer, comprendiendo el método: i) modificar genéticamente linfocitos T obtenidos del individuo con un vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican el CAR heterodimérico condicionalmente activo de la presente divulgación, donde el dominio de unión a antígeno del CAR heterodimérico condicionalmente activo es específico para un epítopo en una célula cancerosa en el individuo y donde la modificación genética se lleva a cabo ex vivo; ii) introducir los linfocitos T genéticamente modificados en el individuo; e iii) administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente de dimerización, en donde el agente de dimerización induce la dimerización del CAR heterodimérico condicionalmente activo, en donde dicha dimerización posibilita la activación de los linfocitos T genéticamente modificados y la eliminación de la célula cancerosa, tratando de este modo el cáncer.
Los carcinomas que pueden ser susceptibles a la terapia mediante un método divulgado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basales (una forma de cáncer de piel), carcinoma de células escamosas (diversos tejidos), carcinoma de vejiga, carcinoma de células transicionales (una neoplasia maligna de la vejiga), carcinoma broncogénico, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma de pulmón, incluyendo carcinoma microcítico de pulmón y carcinoma no microcítico de pulmón, carcinoma adrenocortical, carcinoma de tiroides, carcinoma pancreático, carcinoma de mama, carcinoma ovárico, carcinoma de próstata, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma de células renales, carcinoma ductal in situ o carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, carcinoma de cuello de útero, carcinoma uterino, carcinoma testicular, carcinoma osteogénico, carcinoma epitelial y carcinoma nasofaríngeo.
Los sarcomas que pueden ser susceptibles a la terapia mediante un método divulgado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, cordoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma y otros sarcomas de tejidos blandos.
Otros tumores sólidos que pueden ser susceptibles a la terapia mediante un método divulgado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Las leucemias que pueden ser susceptibles a la terapia mediante un método divulgado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, a) síndromes mieloproliferativos crónicos (trastornos neoplásicos de células madre hematopoyéticas multipotentes); b) leucemias mielógenas agudas (transformación neoplásica de una célula hematopoyética multipotente o de una célula hematopoyética de potencial de linaje restringido; c) leucemias linfocíticas crónicas (CLL; proliferación clonal de linfocitos pequeños inmunológicamente inmaduros y funcionalmente incompetentes), incluyendo CLL de linfocitos B, leucemia prolinfocítica CLL de linfocitos T y tricoleucemia; y d) leucemias linfoblásticas agudas (caracterizadas por la acumulación de linfoblastos). Los linfomas que pueden tratarse usando uno de los presentes métodos incluyen, pero sin limitación, linfomas de linfocitos B (por ejemplo, linfoma de Burkitt); linfoma de Hodgkin; linfoma no Hodgkin y similares.
Otros cánceres que pueden ser susceptibles al tratamiento de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento incluyen el meningioma atípico (cerebro), carcinoma de células de islote (páncreas), carcinoma medular (tiroides), mesenquimoma (intestino), carcinoma hepatocelular (hígado), hepatoblastoma (hígado), carcinoma de células claras (riñón) y neurofibroma del mediastino.
Métodos inmunomoduladores
También puede usarse uno de los presentes métodos para tratar afecciones inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias. Para su uso en un método inmunomodulador, se expresa un CAR concreto en un linfocito T colaborador o en un Treg. Los métodos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, mejorar una respuesta inmunitaria en un sujeto mamífero frente a un patógeno; mejorar una respuesta inmunitaria en un sujeto que se encuentra inmunocomprometido; reducir una respuesta inflamatoria; reducir una respuesta inmunitaria en un sujeto mamífero frente a un autoantígeno, por ejemplo, para tratar una enfermedad autoinmunitaria; y reducir una respuesta inmunitaria en un sujeto mamífero frente a un órgano o tejido trasplantado, para reducir el rechazo del órgano o tejido.
En los casos donde el método implica reducir una respuesta inmunitaria frente a un autoantígeno, el antígeno usado para activar el CAR es un autoantígeno. En los casos donde el método implica reducir una respuesta inmunitaria frente a un órgano o tejido trasplantado, el antígeno usado para activar el CAR es un antígeno específico para el órgano trasplantado.
Formulaciones, dosis y vías de administración
Tal como se ha discutido anteriormente, un método de tratamiento de la presente divulgación implica la administración a un individuo que lo necesite de una cantidad eficaz de un agente dimerizador y también puede implicar la administración de un antígeno.
Una "cantidad eficaz" de un agente dimerizador es, en algunos casos, una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesite, aumenta el nivel de actividad citotóxica de un linfocito T que expresa un CAR concreto en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la actividad citotóxica del linfocito T en ausencia del agente de dimerización.
Una "cantidad eficaz" de un agente dimerizador es, en algunos casos, una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesite, aumenta el nivel de actividad citotóxica de una célula NK que expresa un CAR concreto en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la actividad citotóxica de la célula NK en ausencia del agente de dimerización.
Una "cantidad eficaz" de un agente dimerizador es, en algunos casos, una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un individuo que lo necesite, reduce el número de células cancerosas en el individuo y/o reduce l masa tumoral en el individuo, en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 % o en más del 75 %, en comparación con el número de células cancerosas y/o con la masa tumoral en ausencia del agente de dimerización.
En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un dimerizador es una cantidad que, cuando se administra sola (por ejemplo, en monoterapia) o en combinación (por ejemplo, en terapia combinada) con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en una o más dosis, es eficaz para reducir uno o más de la velocidad de crecimiento tumoral, el número de células cancerosas y la masa tumoral, en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, menos aproximadamente un 90 % o más, en comparación con la velocidad de crecimiento tumoral, el número de
células cancerosas o la masa tumoral en ausencia de tratamiento con el dimerizador.
Formulaciones
En los presentes métodos, puede administrarse al hospedador un dimerizador usando cualquier medio conveniente
capaz de dar como resultado el efecto terapéutico o el efecto diagnóstico deseado. Por lo tanto, el dimerizador puede incorporarse en diversas formulaciones para su administración terapéutica. Más particularmente, puede formularse un dimerizador en composiciones farmacéuticas combinándolo con vehículos o diluyentes adecuados farmacéuticamente aceptables y puede formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles.
En las formas de dosificación farmacéuticas, puede administrarse un dimerizador en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables o también puede usarse solo o en una asociación adecuada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son simplemente ilustrativos
y en modo alguno limitantes.
Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores del pH. Los métodos reales
para preparar dichas formas de dosificación se conocen o serán evidentes para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17a edición, 1985.
En cualquier caso, la composición o formulación que se vaya a administrar contendrá una cantidad de un dimerizador adecuada para lograr el estado deseado en el sujeto que se esté tratando.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, transportadores o diluyentes, se encuentran fácilmente accesibles al público. Además, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales
como agentes de ajuste de pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes
y similares, se encuentran fácilmente accesibles al público.
Para preparaciones orales, puede usarse un dimerizador solo o en combinación con aditivos adecuados para preparar comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa
sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes tamponadores, agentes humectantes, conservantes y agentes aromatizantes.
Puede formularse un dimerizador en preparaciones para inyección disolviendo, suspendiendo o emulsionándolo en
un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales, tales
como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un dimerizador se preparan mezclando el dimerizador que tiene
el grado de pureza deseada con vehículos, excipientes, estabilizantes, tensioactivos, tampones y/o agentes de tonicidad fisiológicamente aceptables. Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes no son tóxicos para los receptores
a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico, glutatión, cisteína, metionina y ácido cítrico; conservantes (tales como
etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-clor-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio o combinaciones de los mismos); aminoácidos, tales como arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, prolina y combinaciones
de los mismos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como gelatina o albúmina sérica; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como trehalosa, sacarosa, lactosa, glucosa, manosa, maltosa, galactosa, fructosa, sorbosa, rafinosa, glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina y ácido neuramínico; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween, Brij, Pluronics, Triton-X o polietilenglicol (PEG).
La composición farmacéutica puede estar en una forma líquida, una forma liofilizada o una forma líquida reconstituida
a partir de una forma liofilizada, en donde la preparación liofilizada se reconstituirá con una solución estéril antes de
su administración. El procedimiento convencional para reconstituir una composición liofilizada es añadir de nuevo un volumen de agua pura (normalmente equivalente al volumen eliminado durante la liofilización); sin embargo, pueden emplearse soluciones que comprenden agentes antibacterianos para la producción de composiciones farmacéuticas
para administración parenteral; véase también Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
La expresión "forma de dosis unitaria", tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un dimerizador calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para un dimerizador dado pueden depender del dimerizador concreto empleado y del efecto que se pretenda lograr y de la farmacodinámica asociada con cada dimerizador en el hospedador.
En algunas realizaciones, se formula un dimerizador en una formulación de liberación controlada. Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida usando métodos bien conocidos en la técnica. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el dimerizador en los que las matrices se encuentran en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, hidrogeles, polilactidas, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Puede prevenirse la posible pérdida de actividad biológica usando aditivos adecuados, controlando el contenido de humedad y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
Dosificaciones
Puede determinarse una dosis adecuada por un médico adjunto u otro personal médico cualificado, basándose en diversos factores clínicos. Como se sabe en la técnica médica, la dosis para un paciente cualquiera depende de diversos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial corporal, la edad, el dimerizador concreto que se vaya a administrar, el sexo del paciente, el tiempo y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que se estén administrando concurrentemente. Un dimerizador puede administrarse en cantidades de entre 1 ng/kg de peso corporal y 20 mg/kg de peso corporal por dosis, por ejemplo, entre 0,1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, entre 0,5 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal; sin embargo, se prevén dosis por encima y por debajo de este intervalo ilustrativo, teniendo en consideración especialmente los factores anteriormente mencionados. En caso de que el régimen sea una infusión continua, también puede encontrarse en el intervalo de 1 |jg a 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto.
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los niveles de dosificación pueden variar en función del dimerizador específico, de la gravedad de los síntomas y de la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Las dosis preferidas para un compuesto dado pueden determinarse fácilmente por los expertos en la materia por diversos medios.
Vías de administración
Un dimerizador se administra a un individuo usando cualquier método y vía disponible que sea adecuado para el suministro de fármacos, incluyendo métodos in vivo y ex vivo, así como vías de administración sistémicas y localizadas.
Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen las vías de administración intratumoral, peritumoral, intramuscular, intratraqueal, intracraneal, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica, intravenosa, intraarterial, rectal, nasal, oral y otras vías enterales y parenterales. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea o ajustarse dependiendo del dimerizador y/o del efecto deseado. Puede administrarse un dimerizador en una sola dosis o en múltiples dosis. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía oral. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por una vía inhalatoria. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía intranasal. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía local. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía intratumoral. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía peritumoral. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía intracraneal. En algunas realizaciones, se administra un dimerizador por vía intravenosa.
El agente puede administrarse a un hospedador usando cualesquiera métodos y vías disponibles convencionales para el suministro de fármacos convencionales, incluyendo vías sistémicas o localizadas. En general, las vías de administración contempladas por la invención incluyen, pero no se limitan necesariamente a, las vías enteral, parenteral o inhalatoria.
Las vías de administración parenteral distintas de la administración por inhalación incluyen, pero no se limitan necesariamente a, las vías tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intratumoral, peritumoral e intravenosa, es decir, cualquier vía de administración distinta de a través del canal alimentario. Puede llevarse a cabo administración parenteral para efectuar el suministro sistémico o local de un dimerizador. En caso de que se desee un suministro sistémico, la administración implica normalmente la administración invasiva o tópica o mucosal absorbida de manera sistémica de las preparaciones farmacéuticas.
También puede suministrarse un dimerizador al sujeto mediante administración enteral. Las vías de administración enterales incluyen, pero no se limitan necesariamente a, suministro oral y rectal (por ejemplo, usando un supositorio).
Por tratamiento se entiende al menos un alivio de los síntomas asociados con la patología que afecta al hospedador, usándose el término alivio en un sentido amplio para hacer referencia a al menos una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, síntoma, asociado con la patología que se esté tratando, tal como un cáncer. Como tal, el tratamiento también incluye situaciones en las que la patología o al menos los síntomas asociados con la misma, se inhiben completamente, por ejemplo, se impide que se produzcan o se detienen, por ejemplo, se terminan, de tal forma que el hospedador deja de padecer la patología o al menos los síntomas característicos de la patología.
En algunas realizaciones, un dimerizador se administra por inyección y/o suministro, por ejemplo, a un sitio en la arteria cerebral o directamente al tejido cerebral. También puede administrarse directamente un dimerizador a un sitio diana, por ejemplo, por inyección directa, por implante de un dispositivo para el suministro de fármacos, tal como una bomba osmótica o una partícula de liberación lenta, por suministro biolístico al sitio diana, etc.
Terapia de combinación
En algunas realizaciones, se administra un dimerizador como terapia adyuvante para una terapia convencional para el cáncer. Las terapias convencionales para el cáncer incluyen cirugía (por ejemplo, eliminación quirúrgica de tejido canceroso), radioterapia, trasplante de médula ósea, tratamiento quimioterapéutico, tratamiento con anticuerpos, tratamiento con modificadores de la respuesta biológica y determinadas combinaciones de los anteriores.
La radioterapia incluye, pero sin limitación, rayos X o rayos gama que se suministran a través de una fuente externa, tal como un haz o mediante implante de pequeñas semillas radiactivas.
Los anticuerpos adecuados para su uso en el tratamiento del cáncer incluyen, pero sin limitación, anticuerpos desnudos, por ejemplo, trastuzumab (Herceptin), bevacizumab (Avastin™), cetuximab (Erbitux™), panitumumab (Vectibix™), Ipilimumab (Yervoy™), rituximab (Rituxan), alemtuzumab (Lemtrada™), Ofatumumab (Arzerra™), Oregovomab (OvaRex™), Lambrolizumab (MK- 3475), pertuzumab (Perjeta™), ranibizumab (Lucentis™) etc. y anticuerpos conjugados, por ejemplo, gemtuzumab ozogamicina (Mylortarg™), Brentuximab vedotina (Adcetris™), ibritumomab tiuxetano marcado con 90Y (Zevalin™), tositumomab marcado con 131I (Bexxar™), etc. Los anticuerpos adecuados para su uso en el tratamiento del cáncer incluyen, pero sin limitación, anticuerpos generados contra antígenos asociados a tumores. Dichos antígenos incluyen, pero sin limitación, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, CEA, gpA33, mucinas, TAG-72, CAIX, PSMA, proteína de unión a folato, gangliósidos (por ejemplo, GD2, GD3, GM2, etc.), Le y, VEGF, VEGFR, integrina alfa-V-beta-3, integrina alfa-5-beta-1, EGFR, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, etc.
Los modificadores de la respuesta biológica adecuados para su uso en conexión con los métodos de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, (1) inhibidores de la actividad de tirosina cinasa (RTK); (2) inhibidores de la actividad de serina/treonina cinasa; (3) antagonistas de antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno tumoral; (4) agonistas de receptores de apoptosis; (5) interleucina-2; (6) interferón-a.; (7) interferón-Y; (8) factores estimulantes de colonias; (9) inhibidores de la angiogénesis; y (10) antagonistas del factor de necrosis tumoral.
Los agentes quimioterapéuticos son compuestos no peptídicos (es decir, no proteicos) que reducen la proliferación de las células cancerosas y abarcan agentes citotóxicos y agentes citostáticos. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, nitrosoureas, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides vegetales (vinca) y hormonas esteroideas.
Se conocen y emplean ampliamente en la técnica agentes que actúan reduciendo la proliferación celular. Dichos agentes incluyen agentes alquilantes, tales como mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo y triazenos, incluyendo, pero sin limitación, mecloretamina, ciclofosfamida (Cytoxan™), melfalano (L-sarcolisina), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU), estreptozocina, clorozotocina, mostaza de uracilo, clormetina, ifosfamida, clorambucilo, pipobromano, trietilenmelamina, trietilenotiofosforamina, busulfán, dacarbazina y temozolomida.
Los agentes antimetabolitos incluyen análogos del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa, incluyendo, pero sin limitación, citarabina (CYTOSAR-U), arabinósido de citosina, fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FudR), 6-tioguanina, 6-mercaptopurina (6-MP), pentostatina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato, 10-propargil-5,8-didesazafolato (PDDF, CB3717), ácido 5,8-didesazatetrahidrofólico (DDATHF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, y gemcitabina.
Los productos naturales adecuados y sus derivados, (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfocinas y epipodofilotoxinas), incluyen, pero sin limitación, Ara-C, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, azatioprina; brequinar; alcaloides, por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por ejemplo, etopósido, tenipósido, etc.; antibióticos, por ejemplo, antraciclina, clorhidrato de daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidina), idarrubicina, doxorrubicina, epirrubicina y derivados de morfolino, etc.; bisciclopéptidos defenoxizona, por ejemplo, dactinomicina; glucopéptidos básicos, por ejemplo, bleomicina; glucósidos de antraquinona, por ejemplo, plicamicina (mitramicina); antracenodionas, por ejemplo, mitoxantrona; azirinopirrolo indoldionas, por ejemplo, mitomicina; inmunosupresores macrocíclicos, por ejemplo, ciclosporina, FK-506 (tacrolimus, prograf), rapamicina, etc.; y similares.
Otros agentes citotóxicos antiproliferativos son navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, y droloxafina.
También es adecuado el uso de agentes que afectan a los microtúbulos que tienen actividad antiproliferativa e incluyen, pero sin limitación, alocolchicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de la colchicina (por ejemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®), derivados de Taxol®, docetaxel (Taxotere®), tiocolchicina (NSC 361792), tritil cisteína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, epotilonas naturales y sintéticas, incluyendo, pero sin limitación, epotilona A, epotilona B, discodermolida; estramustina, nocodazol y similares.
Los moduladores de hormonas y los esteroides (incluyendo análogos sintéticos) que son adecuados para su uso incluyen, pero sin limitación, adrenocorticosteoides, por ejemplo, prednisona, dexametasona, etc.; estrógenos y progestinas, por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, estradiol, clomifeno, tamoxifeno; etc.; y supresores adrenocorticales, por ejemplo, aminoglutetimida; 17aetinilestradiol; dietilestilbestrol, testosterona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, metilprednisolona, metiltestosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, flutamida (Drogenil), toremifeno (Fareston) y Zoladex®. Los estrógenos estimulan la proliferación y diferenciación, por lo tanto, los compuestos que se unen al receptor de estrógenos se usan para bloquear esta actividad. Los corticosteroides pueden inhibir la proliferación de los linfocitos T.
Otros agentes quimioterapéuticos incluyen complejos metálicos, por ejemplo, cisplatino (cis-DDP), carboplatino, etc.; ureas, por ejemplo, hidroxiurea; e hidrazinas, por ejemplo, N-metilhidrazina; epidofilotoxina; un inhibidor de topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur; etc. Otros agentes antiproliferativos de interés incluyen inmunosupresores, por ejemplo, ácido micofenólico, talidomida, desoxiespergualina, azasporina, leflunomida, mizoribina, azaspirano (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metoxi-6-(3-(4-morfolinil)propoxi)quinazolina); etc.
Los "taxanos" incluyen paclitaxel, así como cualquier derivado o profármaco activo de los taxanos. El "paclitaxel" (que debe entenderse que en el presente documento incluye análogos, formulaciones y derivados tales como, por ejemplo, docetaxel, TAXOL™, TAXOTERE™ (una formulación de docetaxel), análogos de 10-desacetil del paclitaxel y análogos de 3'N-desbenzoil-3'N-t-butoxicarbonilo del paclitaxel) pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia (véanse también los documentos WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534; 5.229.529; y el documento EP 590.267) o se obtienen de una serie de fuentes comerciales, incluyendo, por ejemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 de Taxus brevifolia; o T-1912 de Taxus yannanensis).
Debe entenderse que el paclitaxel se refiere no solo a la forma común químicamente disponible del paclitaxel, sino a análogos y derivados (por ejemplo, Taxotere™ docetaxel, como se ha indicado anteriormente) y a conjugados de paclitaxel (por ejemplo, paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano o paclitaxel-xilosa).
También se incluye dentro del término "taxano" una serie de derivados conocidos, incluyendo tanto derivados hidrófilos como derivados hidrófobos. Los derivados del taxano incluyen, pero sin limitación, los derivados de galactosa y manosa descritos en la Solicitud Internacional de Patente n.° WO99/18113; los derivados de piperazino y otros descritos en el documento WO 99/14209; los derivados del taxano descritos en los documentos W o 99/09021, WO 98/22451 y en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.869.680; los derivados de 6-tio descritos en el documento WO 98/28288; los derivados de sulfenamida descritos en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.821.263; y los derivados del taxol descritos en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.415.869. Además, incluye profármacos del paclitaxel incluyendo, pero sin limitación, aquellos descritos en los documentos WO 98/58927; WO 98/13059; y en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.824.701.
SUJETOS ADECUADOS PARA TRATAMIENTO
Hay varios sujetos adecuados para su tratamiento con uno de los presentes métodos para tratar el cáncer. Los sujetos adecuados incluyen cualquier individuo, por ejemplo, un ser humano o un animal no humano que tenga cáncer, al que se le haya diagnosticado un cáncer, que se encuentre en riesgo de desarrollar un cáncer, que haya tenido un cáncer o que tenga riesgo de recurrencia del cáncer, que haya sido tratado con un agente distinto de un dimerizador para el cáncer y que no haya tenido una respuesta a dicho tratamiento o que se haya tratado con un agente distinto de un dimerizador para el cáncer pero que haya tenido una recidiva después de una respuesta inicial a dicho tratamiento.
Los sujetos adecuados para el tratamiento con uno de los presentes métodos inmunomoduladores incluyen individuos que tengan un trastorno autoinmunitario; individuos que sean receptores de trasplantes de órganos o tejidos; y similares; individuos que se encuentren inmunocomprometidos; e individuos que estén infectados por un patógeno.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención y pretenden representar que los experimentos a continuación sean todos o los únicos experimentos llevados a cabo. Se han practicado esfuerzos para garantizar la precisión respecto de los números empleados (por ejemplo, cantidades, la temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es un peso molecular promedio, la temperatura está en grados Celsius y la presión es la atmosférica o próxima a esta. Pueden emplearse abreviaturas convencionales, por ejemplo, pb, pares de bases; kb, kilobases; pl, picolitros; s, segundos; min, minutos; h, horas; aa, aminoácidos; kb, kilobases; pb, pares de bases; nt, nucleótidos; i.m., por vía intramuscular; i.p., por vía intraperitoneal; s.c., por vía subcutánea; i.v., por vía intravenosa; y similares.
Ejemplo 1: Generación de CAR
MATERIALES Y MÉTODOS
Se seleccionó el scFv anti-CD19 humano como dominio de reconocimiento de antígenos en los CAR durante el proceso de optimización del diseño. Las figuras 18A y 18B resumen la estructura molecular de cada CAR que consiste en dos polipéptidos identificados numéricamente. Todos los polipéptidos anclados a membrana son homodímeros unidos por disulfuro. Los polipéptidos anclados a membrana se representan como monómeros por simplicidad gráfica.
Generación de las construcciones de CAR
Se clonó la secuencia que codifica el scFv anti-CD19 humano a partir de una construcción. Se clonaron las cadenas de coestimulación de 4-1BB y de señalización de ITAM CD3 zeta a partir de los ADNc suministrados por Open Biosystems. Las secuencias que codificaban FKBP y FRB se clonaron a partir de plásmidos suministrados por Addgene.
Se aplicaron técnicas de clonación molecular convencionales (reacción en cadena de la polimerasa (PRC), digestión de restricción, ligamiento, etc.) para generar plásmidos de expresión lentivíricos.
Condiciones de cultivo de células efectoras y diana
Se aislaron linfocitos T CD8+ humanos primarios de sangre de donantes anónimos tras su aféresis (restos de Trima de Blood Centers of the Pacific, San Francisco, CA) mediante selección negativa usando cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ humanos RosetteSep (STEMCELL Technologies n.° 15063) según fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad. Las células se cultivaron en medio para linfocitos T humanos, que consistía en X-VIVO15 (Lonza, n.° 04-418Q), suero AB humano al 5 % (Valley Biomedical Inc., n.° HP1022), N-acetil L-cisteína 10 mM (Sigma-Aldrich, n.° A9165) y 100 Ul/ml de IL-2 humana recombinante (Repositorio Preclínico NCI/BRB). Se mantuvo una línea de células Jurkat que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) tras la activación de NFAT en medio RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, penicilina y estreptomicina. Se cultivaron células diana K562 de la U. Penn en IMDM complementado con FBS al 10 %.
Modificación de células efectoras y diana con lentivirus
Se produjo lentivirus pseudotipado de VSV-G pantrópico en células Lenti-X 293T (Clontech Laboratories, n.° 632180) cotransfectadas con un vector de expresión para el transgén pHR'SIN:CSW, los plásmidos de empaquetado vírico pCMVdR8.91 y pMD2.G usando Lipofectamine LTX (Life Technologies, n.° 15338). El sobrenadante del medio de infección se recogió 48 horas después de la transfección y se usó directamente para la transducción.
Veinticuatro horas después antes de la transducción con virus, se activaron linfocitos T humanos usando Dynabeads activadoras de CD3/CD28-T humanos (Life Technologies, n.° 111-31D) a una relación de células:perlas de 1:3. Las células Jurkat y K562 se dividieron 1~2 días antes para asegurarse de que los cultivos se encontrasen en fase logarítmica en el momento de la transducción. Las células Jurkat y K562 transducidas se cultivaron durante al menos 7 días antes de llevar a cabo los experimentos. Los linfocitos T primarios se mantuvieron a ~10A6/ml en medio para linfocitos T humanos durante aproximadamente dos semanas hasta que las células regresaron al estado de reposo. Se cuantificaron los niveles de expresión de los CAR codificados en las construcciones lentivíricas detectando los anticuerpos conjugados al fluoróforo o las proteínas indicadoras fluorescentes usando un citómetro de flujo.
Cuantificación de la producción de IL-2 y de la actividad de NFAT
Los linfocitos T CD4+ Jurkat que expresaban los CAR se mezclaron con células diana afines o no afines K562 de la U. Penn a una relación de efectoras:diana de 1:2. Se diluyó en serie el heterodimerizador rapálogo A/C (Clontech Laboratories, n.° 635055) en medio y se añadió a las mezclas de reacción. Después de 20-24 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron con el set de ELISA para IL-2 humana BD OptEIA (BD Biosciences, n.° 555190). Se llevó a cabo una citometría de flujo para cuantificar la expresión indicadora de GFP dependiente de NFAT en células Jurkat como indicador separado de la actividad de CAR.
Ensayo de citotoxicidad redirigida basado en citometría de flujo
Se modificaron por ingeniería genética las células diana afines y no afines K562 para que expresasen diferentes proteínas fluorescentes, de tal forma que ambos tipos de células en una mezcla se cuantificasen por citometría de flujo. Los tipos de célula diana se mezclaron a una proporción de 1:1 y se incubaron conjuntamente con linfocitos T c D8+ efectores primarios humanos a una relación de efector:diana de 5:2. Se añadieron 100 Ul/ml de IL-2 humana y diversas cantidades del rapálogo (Clontech Laboratories, n.° 635055) a las mezclas de reacción. Después de 24 horas de incubación, se centrifugaron las muestras a 400g durante 5 minutos. El sedimento de células se resuspendió en tampón de lavado (PBS BSA al 0,5 % azida de sodio al 0,1 %) y se fijó con un volumen igual de BD Cytofix (BD, n.° cat. 554655) antes de la citometría de flujo. Se calcularon las proporciones de las células diana afines supervivientes a células diana no afines para cada muestra para enumerar las actividades citotóxicas redirigidas de las células efectoras.
RESULTADOS
Se evaluó la producción de IL-2 provocada por las diversas construcciones de CAR. Los datos se presentan en la figura 12.
Figura 12. Producción de IL-2 desencadenada por cinco variantes de centro activo de CAR. Efector = linfocitos T CD4+ Jurkat humanos modificados por ingeniería genética con CAR. Diana = líneas celulares K562 con o sin el antígeno afín CD19. Se cuantificaron las cantidades de IL-2 secretadas por las células efectoras mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Figura 13. Producción de IL-2 por líneas de control Jurkat en un experimento igual al descrito en la figura 12. La construcción "125" codifica un control convencional usado en la actualidad en ensayos clínicos.
Figura 14. Comparación entre "122 206" y "197 206" en un experimento separado en condiciones idénticas a aquellas descritas en la figura 12.
La figura 15 demuestra la citotoxicidad titulable desde el punto de vista farmacológico conferida por el centro activo de CAR "197+206". En presencia del rapálogo de molécula pequeña, el CAR media de manera eficaz la citotoxicidad redirigida frente a las células diana afines. A altas dosis de rapálogo, este centro activo de CAR puede señalizar con la misma fuerza que el CAR convencional "125". Efector = linfocitos T CD8+ humanos modificados con CAR o un vector de control. Diana = derivados fluorescentes de líneas celulares K562 que expresan el antígeno afín CD19 humano o el antígeno de mesotelina humano no afín.
La figura 16 representa datos para CAR construidos con la tirosina cinasa citoplasmática Zap70 de la vía del receptor de linfocitos T como dominio de señalización intracelular.
La figura 16 muestra datos de células Jurkat modificadas con diversas variantes de centros activos de CAR. Las células Jurkat se incubaron conjuntamente con células diana K562 con o sin el antígeno afín (CD19) y las concentraciones indicadas de rapálogo. Como componente de CAR, la Zap70 cinasa (estructuras primera y segunda por la izquierda que muestran un "199") fue eficaz como ITAM (tercera estructura desde la izquierda que muestra un "168") para activar la función de NFAT. La adición del dominio de señalización de 4-1BB aumentó la expresión superficial de la porción de reconocimiento de antígeno del receptor y dio lugar a una señalización más fuerte por "197+199". Se incluyó un CAR sin señalización (último por la izquierda) como control negativo.
Ejemplo 2: CAR que se dirigen a mesotelina
MATERIALES Y MÉTODOS
Se preparó y probó una serie de construcciones de receptor de antígeno quimérico. Las construcciones mostradas en el presente documento codifican tres scFv anti-mesotelina humana diferentes como dominios de reconocimiento de antígeno. Las figuras 19A, 19B y 19C resumen la estructura molecular de cada CAR anti-mesotelina humana, comprendiendo cada CAR dos polipéptidos. La porción intercelular de cada CAR anti-mesotelina humana comprende dos dominios coestimuladores 4-1BB, un par de unión al dimerizador FKBP y FRB y un dominio de señalización intracelular ITAM. Los tres dominios de reconocimiento de antígenos diferentes mostrados en este caso son scFv antimesotelina HN1, scFv SS1 y scFv m912. Todos los polipéptidos anclados a membrana son homodímeros unidos por disulfuro.
Generación de las construcciones de CAR
Las secuencias que codifican el anti-mesotelina se clonaron a partir de construcciones o se sintetizaron mediante ensamblaje génico mediante la PCR. Se clonaron las cadenas de coestimulación de 4-1BB y de señalización de ITAM CD3 zeta a partir de los ADNc suministrados por Open Biosystems. Las secuencias codificantes del scFv HN1, el scFv SS1 y el scFv m912 se sintetizaron mediante la PCR y, en algunos casos, se optimizaron por codones. Las secuencias que codificaban FKBP y FRB se clonaron a partir de plásmidos de Addgene.
Se aplicaron técnicas de clonación molecular convencionales (reacción en cadena de la polimerasa (PRC), digestión de restricción, ligamiento, etc.) para generar plásmidos de expresión lentivíricos.
Condiciones de cultivo de células efectoras y diana
Se mantuvo una línea de células Jurkat que expresan GFP tras la activación de NFAT en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina. Las células diana K562 se cultivaron en IMDM complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %.
Modificación de células efectoras y diana con lentivirus
Se produjo lentivirus pseudotipado de VSV-G pantrópico en células Lenti-X 293T (Clontech Laboratories, n.° 632180) cotransfectadas con un vector de expresión para el transgén pHR'SIN:CSW, los plásmidos de empaquetado vírico pCMVdR8.91 y pMD2.G usando Lipofectamine LTX (Life Technologies, n.° 15338). El sobrenadante del medio de infección se recogió 48 horas después de la transfección y se usó directamente para la transducción.
Las células Jurkat y K562 se dividieron 1~2 días antes para asegurarse de que los cultivos se encontrasen en fase logarítmica en el momento de la transducción. Las células Jurkat y K562 transducidas se cultivaron durante al menos 7 días antes de llevar a cabo los experimentos. Se cuantificaron los niveles de expresión de los CAR codificados en las construcciones lentivíricas detectando los anticuerpos conjugados al fluoróforo o las proteínas indicadoras fluorescentes usando un citómetro de flujo.
Cuantificación de la producción de IL-2
Los linfocitos T CD4+ Jurkat que expresaban los CAR se mezclaron con células diana afines o no afines K562 a una relación de efectoras:diana de 1:2. Se diluyó en serie el heterodimerizador rapálogo A/C (Clontech Laboratories, n.° 635055) en medio y se añadió a las mezclas de reacción. Después de 20~24 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron con el set de ELISA para IL-2 humana BD OptEIA (BD Biosciences, n.° 555190).
RESULTADOS
Se evaluó la producción de IL-2 provocada por las construcciones de CAR anti-mesotelina. Los datos se presentan en las figuras 19D-F.
Figura 19. Producción de IL-2 desencadenada por las variantes de centro activo de CAR scFv HN1 (Fig. 19D), scFv SS1 (Fig. 19E) y scFv m912 (Fig. 19F). Se midió la producción de IL-2 por un CAR convencional (Fig. 19G, construcción n.° 358) y se incluyó por comparación a los centros activos de CAR (Fig. 19D). Efector = linfocitos T CD4+ Jurkat humanos modificados por ingeniería genética con CAR. Diana = líneas celulares K562 con o sin el antígeno afín mesotelina. Se cuantificaron las cantidades de IL-2 secretadas por las células efectoras mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Ejemplo 3: Ácido giberélico como dimerizador de los centros activos de CAR
MATERIALES Y MÉTODOS
La figura 20A resume la estructura molecular del dimerizador de CAR de ácido giberélico objeto. La porción de unión a antígeno comprende el scFv anti-CD19 humano. La porción intracelular comprende dos dominios coestimuladores 4-1BB, un par de unión al dimerizador GID1 y GAI y un dominio de señalización intracelular ITAM. Todos los polipéptidos anclados a membrana son homodímeros unidos por disulfuro.
Generación de las construcciones de CAR
Las secuencias que codifican el CAR de dimerizador de ácido giberélico se clonaron a partir de construcciones. El scFv anti-CD19 se clonó a partir de un plásmido. Se clonaron las cadenas de coestimulación de 4-1BB y de señalización de ITAM CD3 zeta a partir de los ADNc suministrados por Open Biosystems. Las secuencias que codificaban GID1 y GAI se clonaron a partir de plásmidos de Addgene. Se aplicaron técnicas de clonación molecular convencionales (reacción en cadena de la polimerasa (PRC), digestión de restricción, ligamiento, etc.) para generar plásmidos de expresión lentivíricos.
Condiciones de cultivo de células efectoras y diana
Se mantuvo una línea de células Jurkat que expresan GFP tras la activación de NFAT en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina. Las células diana K562 se cultivaron en IMDM complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %.
Modificación de células efectoras y diana con lentivirus
Se produjo lentivirus pseudotipado de VSV-G pantrópico en células Lenti-X 293T (Clontech Laboratories, n.° 632180) cotransfectadas con un vector de expresión para el transgén pHR' SIN:CSW, los plásmidos de empaquetado vírico pCMVdR8.91 y pMD2.G usando Lipofectamine LTX (Life Technologies, n.° 15338). El sobrenadante del medio de infección se recogió 48 horas después de la transfección y se usó directamente para la transducción.
Las células Jurkat y K562 se dividieron 1~2 días antes para asegurarse de que los cultivos se encontrasen en fase logarítmica en el momento de la transducción. Las células Jurkat y K562 transducidas se cultivaron durante al menos 7 días antes de llevar a cabo los experimentos. Se cuantificaron los niveles de expresión de los CAR codificados en las construcciones lentivíricas detectando los anticuerpos conjugados al fluoróforo o las proteínas indicadoras fluorescentes usando un citómetro de flujo.
Cuantificación de la producción de IL-2
Los linfocitos T CD4+ Jurkat que expresaban los CAR se mezclaron con células diana afines o no afines K562 a una relación de efectoras:diana de 1:2. Se diluyó el 3-acetoximetil éster del ácido giberélico (ácido giberélico-3 AM) disuelto previamente en etanol (Toronto Research Chemicals, n.° G377500) en medio de crecimiento y se añadió a las mezclas de reacción. El ácido giberélico (ácido giberélico-3 AM) se usó a 10 mM. Después de 20-24 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron con el set de ELISA para IL-2 humana BD OptEIA (BD Biosciences, n.° 555190).
RESULTADOS
Se evaluó la producción de IL-2 provocada por la construcción de CAR de dimerizador de ácido giberélico. Los datos se presentan en la figura 20.
Figura 20. Producción de IL-2 desencadenada por la variante de CAR de dimerizador de ácido giberélico (Fig. 20B). Se midió la producción de IL-2 por un CAR convencional (Fig. 20C, construcción "125") y se incluyó por comparación a los centros activos de CAR. Efector = linfocitos T CD4+ Jurkat humanos modificados por ingeniería genética con CAR. Diana = líneas celulares K562 con o sin el antígeno afín CD19. Se cuantificaron las cantidades de IL-2 secretadas por las células efectoras mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Ejemplo 4: Centros activos de CAR con diversos dominios coestimuladores
MATERIALES Y MÉTODOS
Se preparó una serie de construcciones de receptor de antígeno quiméricos esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 1, salvo que se cambiaron varios dominios coestimuladores por los dominios coestimuladores 4-1BB. Las figuras 21A y 21B resumen la estructura molecular de los CAR descritos en este ejemplo.
Generación de las construcciones de CAR
Las secuencias que codifican el scFv anti-CD19 humano se clonaron a partir de un plásmido. Se clonaron las secuencias codificantes de la cadena de señalización de ITAM de CD3 zeta y los dominios coestimuladores humanos CD28 y OX-40 a partir de los ADNc suministrados por Open Biosystems. Las secuencias que codificaban FKBP y FRB se clonaron a partir de plásmidos de Addgene.
Se aplicaron técnicas de clonación molecular convencionales (reacción en cadena de la polimerasa (PRC), digestión de restricción, ligamiento, etc.) para generar plásmidos de expresión lentivíricos.
Prueba de las construcciones de CAR
Las células efectoras y diana se cultivaron y transfectaron de acuerdo con el ejemplo 1 usando las construcciones que contienen el centro activo de CAR CD28 y el dominio coestimulador OX-40 (Fig. 21A-B, construcciones "365+367" y "399+400", respectivamente) y los controles de CAR convencionales correspondientes (Fig. 21C-D, construcciones "366" y "398", respectivamente). Los ensayos de producción de IL-2, de actividad de NFAT y los ensayos basados en citometría de flujo también pueden llevarse a cabo con la construcción que contiene el dominio coestimulador de CD28 y la construcción que contiene el dominio coestimulador de OX-40, como se ha descrito para el ejemplo 1. Como

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) heterodimérico y condicionalmente activo que comprende:
un primer polipéptido que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende una región variable de anticuerpo monocatenario que se une específicamente a mesotelina, un primer miembro del par de dimerización y un primer dominio transmembrana; y
un segundo polipéptido que comprende un segundo miembro de un par de dimerización, un segundo dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular;
en donde un agente de dimerización dimeriza el CAR heterodimérico cuando una célula expresa los primero y segundo polipéptidos con el agente de dimerización unido entre los miembros del par de dimerización de los primero y segundo polipéptidos.
2. El CAR heterodimérico condicionalmente activo de la reivindicación 1, en donde el dominio de señalización intracelular es un dominio de señalización intracelular de CD3-zeta o un dominio de señalización intracelular de ZAP-70.
3. El CAR heterodimérico condicionalmente activo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el primer polipéptido, el segundo polipéptido, o ambos del primer polipéptido y el segundo polipéptido, comprende (o comprenden) un polipéptido coestimulador.
4. El CAR heterodimérico condicionalmente activo de la reivindicación 3, en donde el polipéptido (o polipéptidos) coestimulador se selecciona(n) del grupo que consiste en: 4-1BB, CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, CD30, GITR y HVEM.
5. El CAR heterodimérico condicionalmente activo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y el segundo miembros del par de dimerización se seleccionan de:
a) proteína de unión a FK506 (FKBP) y proteína asociada a FKBP-rapamicina (FRB);
b) una proteína insensible al ácido giberélico (GAI) y una proteína de receptor de giberelina (GID1);
c) FKBP y subunidad catalítica A de la calcineurina (CnA);
d) una proteína de receptor de ácido abscísico (PYL) y una proteína insensible al ácido abscísico (ABI);
e) FKBP y ciclofilina;
f) proteína de unión a FK506 (FKBP) y FKBP;
g) girasa B (GyrB) y GyrB;
h) dihidrofolato reductasa (DHFR) y DHFR; y
i) DmrB y DmrB.
6. Una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el CAR heterodimérico condicionalmente activo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. La una o más moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde las secuencias de nucleótidos están unidas a un promotor específico de linfocitos T o un promotor específico de células NK.
8. La una o más moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el ácido nucleico es ARN transcrito in vitro o está presente en un vector de expresión recombinante.
9. Una célula de mamífero in vitro o ex vivo genéticamente modificada para producir el CAR heterodimérico condicionalmente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10. La célula de la reivindicación 9, en donde la célula es una célula madre tal como una célula madre hematopoyética (HSC), una célula progenitora, una célula procedente de una célula madre o una célula progenitora, un linfocito T o una célula NK.
11. Un método de activación de un linfocito T in vitro o ex vivo, comprendiendo el método poner en contacto el linfocito T con un agente de dimerización y mesotelina, en donde el linfocito T se modifica genéticamente para producir un CAR heterodimérico condicionalmente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y en donde, en presencia del agente de dimerización y la mesotelina, el CAR heterodimérico condicionalmente activo se dimeriza y activa el linfocito T, produciendo de este modo un linfocito T activado.
12. Un método de fabricación de la célula de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula de mamífero in vitro o ex vivo con un vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican el CAR heterodimérico condicionalmente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o modificar genéticamente una célula de mamífero con un ARN que comprende secuencias de nucleótidos que codifican el CAR heterodimérico condicionalmente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Un CAR condicionalmente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer en un individuo, en donde el método comprende:
i) modificar genéticamente linfocitos T obtenidos del individuo con un vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican dicho CAR heterodimérico condicionalmente activo, en donde el dominio de unión a antígeno del CAR heterodimérico condicionalmente activo es específico para un epítopo de mesotelina en una célula cancerosa en el individuo, y en donde dicha modificación genética se lleva a cabo ex vivo, ii) introducir los linfocitos T genéticamente modificados en el individuo; y
iii) administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente de dimerización, en donde el agente de dimerización induce la dimerización del CAR heterodimérico condicionalmente activo, en donde dicha dimerización proporciona la activación de los linfocitos T genéticamente modificados y la eliminación de la célula cancerosa, tratando de este modo el cáncer.
14. El CAR condicionalmente activo para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el agente de dimerización es un rápalogo.
15. El CAR condicionalmente activo para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde el cáncer es mesotelioma, cáncer de mama o cáncer de pulmón.
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