JP6562735B2 - 新規キシラナーゼ - Google Patents
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Description
(a)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman−Pearson法(Science,1985,227:1435−1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
本発明のキシラナーゼは、下記(a)、(b)又は(c)で表されるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり得る。
(a)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
(i)pH依存性
本発明のキシラナーゼのキシラナーゼ活性は、反応温度60℃、pH4〜5.5の範囲において最大活性の70%以上であることが好ましく、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、なお好ましくは90%以上である。ここで、「最大活性」とは、反応温度60℃での最適反応pHにおけるキシラナーゼ活性をいう。
本明細書において、「キシラナーゼ活性における最適反応pH」とは、60℃においてキシランを分解したときの活性が最大となるpHを意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。本発明のキシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応pHは、pH3.8〜6.0の範囲であることが好ましく、より好ましくはpH4.0〜5.5である。
本明細書において、「キシラナーゼ活性における最適反応温度」とは、至適pHにおいてキシラナーゼ活性が最大となる温度を意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定される。本発明のキシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応温度は、好ましくは65〜80℃、より好ましくは70〜78℃である。
本明細書において、キシラナーゼの「最大活性」とは、60℃、至適pHにおけるキシラナーゼ活性の比活性をいう。本発明のキシラナーゼの「最大活性」は、好ましくは400U/mgタンパク質以上、より好ましくは450U/mgタンパク質以上、さらに好ましくは500U/mgタンパク質以上である。
したがって、本発明はまた、上記(a)、(b)又は(c)で表されるアミノ酸配列のN末端側に、配列番号2の第1位から22位で示されるアミノ酸配列をさらに含むアミノ酸配列からなるキシラナーゼのプレタンパク質を提供する。
あるいは、本発明は、下記(a')、(b')又は(c')で表されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼのプレタンパク質を提供する。
(a')配列番号2で示されるアミノ酸配列;
(b')配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c')配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
好ましくは、上記(a')、(b')又は(c')で表されるアミノ酸配列における、配列番号2の第1位から22位に相当する領域は、分泌シグナル配列としての機能を有する。
本発明のキシラナーゼは、例えば、上記本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明のキシラナーゼは、本発明のキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のキシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドから本発明のキシラナーゼが生産される。生産されたキシラナーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のキシラナーゼを取得することができる。
(i)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列;
(ii)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列において、1又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
(i')配列番号1で示されるヌクレオチド配列;
(ii')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii')配列番号1で示されるヌクレオチド配列において、1又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
好ましくは、上記(i')、(ii')又は(iii')で表されるヌクレオチド配列における配列番号1の1位から66位に相当する領域は、分泌シグナル配列をコードする。
上記本発明のキシラナーゼは、後述の実施例に示すとおり、従来公知のキシラナーゼやキシラナーゼ製剤と比較してバイオマスを糖化する活性が顕著に高い。したがって、本発明のキシラナーゼは、バイオマスの糖化のため、又はバイオマスからの糖の製造のために好適に使用することができる。したがって、本発明はさらに、上記本発明のキシラナーゼを含有するバイオマス糖化剤を提供する。さらに本発明は、上記本発明のキシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマス糖化方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明のキシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
本発明によるバイオマス糖化方法、及びバイオマスからの糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明のキシラナーゼ又はバイオマス糖化剤で糖化する工程を含む。該方法で用いられるバイオマスの例としては、(1.定義)の章で前述したとおりである。入手容易性、原料コスト、及び糖化効率向上の観点からは、該バイオマスとしては、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉又は果房などが好ましく、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)、エリアンサスがより好ましく、バガスがさらに好ましい。該バイオマスは、単独で又は2種以上を混合して使用してもよい。また該バイオマスは乾燥されていてもよい。
(a)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
反応温度60℃、pH4〜5.5の範囲において最大活性の70%以上;
最適反応pHがpH3.8〜6.0;
最適反応温度が65〜80℃;
最大活性が400U/mgタンパク質以上。
(a')配列番号2で示されるアミノ酸配列;
(b')配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c')配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
(i)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列;
(ii)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列において、1又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
(i')配列番号1で示されるヌクレオチド配列;
(ii')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii')配列番号1で示されるヌクレオチド配列において、1又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
Penicillium sp.由来キシラナーゼPspXynを製造した。
土壌より単離された糸状菌Penicillium sp.をキシランによる誘導条件下で培養した。培養4日後、Miracloth(メルクミリポア)を用いてろ過することにより菌糸及び培養上清を得た。得られた菌糸は、液体窒素中にて速やかに凍結後、マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて破砕した。得られた破砕細胞から、RNeasy Mini Kit(キアゲン)を用いてRNA溶液を得た。RNA溶液から、SuperScript II Reverse Transcriptase(ライフテクノロジーズ)を用いてcDNAを合成した。
pUC118(タカラバイオ)のHincII制限酵素切断点に由来のセロビオハイドロラーゼcbhIの上流から下流領域(配列番号3)を導入したプラスミドpUC−cbh1を鋳型として、表1に示したフォワードプライマー1(配列番号5)とリバースプライマー1(配列番号6)を用いてPCRすることで、約8.8kbp断片(A)を増幅した。また、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidurans)由来のアセトアミダーゼamdS(配列番号4)を鋳型として、表1に示したフォワードプライマー2(配列番号7)とリバースプライマー2(配列番号8)を用いてPCRすることで、約3.1kbp断片(B)を増幅した。得られたDNA断片(A)及び(B)は、In−Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)のプロトコルに従って処理し、コンピテントセルE.coli HB101(タカラバイオ)へと形質転換した。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体をLB寒天培地を用いて培養し(37℃、1日間)、得られた細胞からHigh Pure Plasmid Isolation kit(Roche)を用いてプラスミドを回収、精製した。得られたベクターを、pUC−cbh1−amdSと名付けた。
トリコデルマ・リーゼ PC−3−7株に対して上記(2)で構築したベクターの形質転換を行った。導入はプロトプラストPEG法で行った。形質転換体はアセトアミドを単一窒素源とした選択培地(2% グルコース、1.1M ソルビトール、2% アガー、0.2% KH2PO4(pH5.5)、0.06% CaCl2・2H2O、0.06% CsCl2、0.06% MgSO4・7H2O、0.06% アセトアミド、0.1% Trace element1;%はいずれもw/v%)にて選抜した。Trace element1の組成は以下のとおりである:0.5g FeSO4・7H2O、0.2g CoCl2、0.16g MnSO4・H2O、0.14g ZnSO4・7H2Oを蒸留水にて100mLにメスアップ。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーPCRにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。
アビセル培地(1% アビセル(シグマアルドリッチ)、0.14%(NH4)2SO4、0.2% KH2PO4、0.03% CaCl2・2H2O、0.03% MgSO4・7H2O、0.1% Bacto Polypepton、0.05% Bacto Yeast extract、0.1% Tween 80、0.1% Trace element2、50mM 酒石酸バッファー(pH4.0);%はいずれもw/v%)に、上記(3)で選択した菌株の胞子を2×105個/mLとなるよう植菌し、28℃にて5日間振とう培養を行った。Trace element2の組成は以下のとおりである:6mg H3BO3、26mg(NH4)6Mo7O24・4H2O、100mg FeCl3・6H2O、40mg CuSO4・5H2O、8mg MnCl2・4H2O、200mg ZnCl2を蒸留水にて100mLにメスアップ。得られた培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、PspXynを含む培養上清を得た。
上記(4)で得た培養上清5mLを脱塩カラムEcono−Pac 10DG(BioRad)を用いて20mM Tris−HCl(pH8)へとバッファー交換を行った。その後、下記条件にて陰イオン交換による精製を行った。
装置:HPLC分取システムPLC−561(GLサイエンス)
カラム:POROS HQ 20μmカラム 4.6×100mm(ライフテクノロジーズ)
溶離液A:0mM Tris−HCl バッファー(pH8)
溶離液B:20mM Tris−HCl バッファー(pH8)1M NaCl
流速:1mL/min
モニター波長:280nm
リニアグラジエント:5min A:B=100:0、15min A:B=20:80。13分ごろに溶出するピークに大部分の純粋なキシラナーゼが含まれることが確認されたことから、13分〜15分までのフラクションを分取し、濃縮・脱塩したサンプルをPspXyn粗酵素液とした。
装置:HPLC分取システムPLC−561(GLサイエンス)
カラム:TSKgel G2000SW 21.5x300mm(東ソー)
溶離液:20mM 酢酸バッファー(pH5)、
流速:4mL/min、
モニター波長:280nm。20分ごろに溶出するピークに大部分の純粋なキシラナーゼが含まれることが確認されたことから、20分〜21分までのフラクションを分取し、濃縮・脱塩したサンプルをPspXyn精製酵素液とした。
PspXynは、キシラナーゼプレタンパク質のアミノ酸配列(配列番号2)から推定シグナル配列(1−22位)を除いた成熟キシラナーゼ(配列番号2の23−404位で示されるアミノ酸配列)である。なお、シグナル配列の予測にはsignalP(Bendtsenら,J.Mol.Biol.340:783−795,2004)を用いた。
酵素液中のタンパク質の濃度は、UV法又はbradford法にて測定した。UV法では、OD280nmを測定することによりタンパク質濃度を決定した。PspXynは、12個のTrp残基及び18個のTyr残基を含み、算出されたモル吸光係数は92820M−1・cm−1、分子量は40519g/molであることから、1mg/mLでのOD280nmは1.931であった。bradford法では、Quick Startプロテインアッセイ(BioRad)を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質とした検量線をもとにタンパク質量を計算した。
(1)アラビノキシラン分解活性
実施例1(5)で調製したPspXyn精製酵素液のコムギアラビノキシラン分解活性(XPU)を測定した。1XPUは、pH5.0、60℃で15分間、基質であるコムギアラビノキシランから還元糖を生成させた場合において、1分間当たり1マイクロモルの還元糖を遊離させるのに必要な酵素量として定義した。適当な濃度に希釈したPspXyn精製酵素液100μLを、基質溶液(0.35%コムギアラビノキシラン(Megazyme)を含む0.1M酢酸バッファー(pH5.0))400μLと混合し、反応させた。反応前に、基質溶液の入った試験管を60℃で5分間プレインキュベーションし、これに酵素希釈液を添加した。15分後に0.5mLのDNS試薬(1.6%水酸化ナトリウム、0.5%3,5−ジニトロサリチル酸、30%酒石酸ナトリウムカリウム)を添加することで酵素反応を停止させ、次いで100℃にて5分間加熱した後、氷上で急冷した。その後、2mLの純水を加え、540nmの吸光度を測定した。酵素希釈液のかわりに100μLの50mM酢酸バッファーを添加したものをブランクとして使用した。測定した吸光度を、D(+)キシロースを用いて作成した検量線により校正し、次いでXPUを算出した。測定範囲は0.01〜0.1XPU/mLであった。
実施例1(5)で調製したPspXyn精製酵素液のビーチウッドキシラン分解活性(U)を測定した。1Uは、pH5.0、60℃で15分間、基質であるビーチウッドキシランから還元糖を生成させた場合において、1分間当たり1マイクロモルの還元糖を遊離させるのに必要な酵素量と定義した。適当な濃度に希釈したPspXyn酵素溶液100μLを、基質溶液(1%ビーチウッドキシラン(シグマアルドリッチ)を含む0.1M酢酸バッファー(pH5.0))900μLと混合し、反応させた。反応前に、基質溶液の入った試験管を60℃で5分間プレインキュベーションし、これに酵素希釈液を添加することで反応を開始した。15分後に1mLのDNS試薬を添加することで酵素反応を停止させ、次いで100℃にて5分間加熱した後、氷上で急冷した。その後、4mLの純水を加え、540nmの吸光度を測定した。酵素溶液のかわりに100μLの50mM 酢酸バッファーを添加したものをブランクとして使用した。測定した吸光度を、D(+)キシロースを用いて作成した検量線により校正し、次いで酵素活性(U)を算出した。測定範囲は0.01〜0.1U/mLであった。
異なるpH及び温度におけるPspXynのアラビノキシラン分解活性を調べた。pH4での異なる温度条件、又は60℃での異なるpH条件において、実施例2と同様の方法によりPspXynのアラビノキシラン分解活性を測定し、最大の活性を示した条件を100%とした際の各条件での相対活性を求めた。結果を表3及び表4に示す。表3に示すとおり、PspXynの至適温度は約75℃であった。また表4に示すとおり、PspXynは、至適pHがpH4.5とpH5の間にあり、かつpH4からpH5.5にかけて至適pHの90%以上の活性を有していた。この結果から、PspXynが弱酸性領域で使用可能であることが示された。
(1)バイオマスの調製
バイオマスとしてバガスを用いた。バガスを1%NaOH水溶液中で120℃、20分間処理し、洗浄することで、アルカリ処理バガス(組成:グルカン62.7%、キシラン17.9%)を得た。得られたアルカリ処理バガスを、糖化反応の基質として使用した。
セルラーゼとしてJN11を使用した。JN11は、J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2012)1741−9に示されるX3AB1株を実施例1(4)と同様の手順でアビセル培地にて培養することで調製した。
蓋つきスクリュー管(株式会社マルエム製、No.3、φ21×45mm)に、基質として上記(1)で調製したアルカリ処理バガスを乾燥原料換算で50mgと、0.1mLの1M酢酸ナトリウムバッファー(pH5)を添加し、ここに上記(2)で調製したJN11(酵素タンパク量として2mg/g−基質)、及び実施例1(5)で調製したPspXyn粗酵素液(酵素タンパク量として0.1mg/g−基質)を添加後、基質濃度が5wt%になるように水を添加して反応液を調製した。比較のため、JN11と、Cellic(登録商標)HTec、又は後述の比較例1で調製したトリコデルマ・リーゼ由来XYN1若しくはXYN2(いずれも0.1mg/g−基質)とを添加した反応液を調製した。対照としては、酵素としてJN11のみを添加した反応液を調製した。各反応液は、50℃、150rpmで往復振とうしながら3日間糖化反応させた。なお、各酵素の量はbradford法にて測定したタンパク質量を基準にした。反応終了後、遠心分離(15000rpm、5min、4℃)にて上清を回収し、DX500クロマトグラフィーシステム(日本ダイオネクス社製)にて上清中のグルコース、セロビオース、キシロース、キシロビオース及びキシロトリオースの濃度を測定し、以下の式によりグルカン糖化率、キシラン糖化率、及び全体糖化率を算出した。
グルカン糖化率=(上清中のグルコース+セロビオース量)×0.9/(基質中
のセルロース量)
キシラン糖化率=(上清中のキシロース+キシロビオース+キシロトリオース量)
×0.88/(基質中のキシラン量)
全体糖化率={(上清中のグルコース+セロビース量)×0.9+(上清中のキシ
ロース+キシロビオース+キシロトリオース量)×0.88}/(基
質中のセルロース+キシラン量)
(1)発現用ベクターの作製
実施例1(2)で構築したpUC−cbh1−amdSを鋳型とし、表7に示したフォワードプライマー5(配列番号15)と表1に示したリバースプライマー3(配列番号10)を用いてPCRすることで約10kbp断片(E)を増幅した。実施例1(2)と同様の手順で、トリコデルマ・リーゼ由来のキシラナーゼxyn1(配列番号13)を導入したプラスミドpUC−xyn1を鋳型として、表7に示したフォワードプライマー6(配列番号16)とリバースプライマー6(配列番号17)を用いてPCRすることで約0.8kbp断片(F)を増幅した。次いで、得られたDNA断片(E)及び(F)を用いて既に示した方法によりxyn1遺伝子を含む発現ベクターpUC−Pcbh1−xyn1H−amdSを作製した。同様の手順で、トリコデルマ・リーゼ由来のキシラナーゼxyn2(配列番号14)を導入したプラスミドpUC−xyn2を鋳型として、表7に示したフォワードプライマー7(配列番号18)とリバースプライマー7(配列番号19)を用いて約0.8kbp断片(G)を増幅した。次いで、得られたDNA断片(E)及び(G)を用いてxyn2遺伝子を含む発現ベクターpUC−Pcbh1−xyn2H−amdSを作製した。
実施例1(3)と同様の手順で、トリコデルマ・リーゼ PC−3−7株に対して上記(2)で構築したベクターを形質転換した。実施例1(4)と同様の手順で、得られた形質転換体を培養してXYN1及びXYN2をそれぞれ生産させた。XYN1又はXYN2を含む培養上清から、cOmplete His−Tag Purification Resin(ロシュ)の簡易プロトコルに従ってXYN1及びXYN2を精製した。キシラナーゼ活性測定により、精製されたXYN1及びXYN2がキシラナーゼ活性を有していることを確認した。
Claims (12)
- 下記(a)、(b)又は(c)で表されるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有し、キシラナーゼ活性の最適反応温度が65〜80℃であるタンパク質:
(a)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号2の23位から404位で示されるアミノ酸配列において、1個以上20個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 下記(a')、(b')又は(c')で表されるアミノ酸配列からなる、キシラナーゼのプレタンパク質であって、該キシラナーゼの活性の最適反応温度が65〜80℃であるプレタンパク質:
(a')配列番号2で示されるアミノ酸配列;
(b')配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列;
(c')配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1個以上20個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 該キシラナーゼ活性の最適反応温度が70〜78℃である請求項1記載のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、又は請求項2記載のプレタンパク質。
- 以下の酵素学的性質を有する請求項1若しくは3記載のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、又は請求項2若しくは3記載のプレタンパク質:
反応温度60℃における最適反応pHがpH3.8〜6.0;
反応温度60℃、該最適反応pHにおけるキシラナーゼ活性が400U/mgタンパク質以上;
反応温度60℃、pH4〜5.5の範囲におけるキシラナーゼ活性が、反応温度60℃、該最適反応pHにおけるキシラナーゼ活性の70%以上。 - 請求項1、3若しくは4記載のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、又は請求項2〜4のいずれか1項記載のプレタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記(i)、(ii)又は(iii)で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項5記載のポリヌクレオチド:
(i)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列;
(ii)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii)配列番号1の67位から1212位で示されるヌクレオチド配列において、1個以上60個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。 - 下記(i')、(ii')又は(iii')で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項5記載のポリヌクレオチド:
(i')配列番号1で示されるヌクレオチド配列;
(ii')配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii')配列番号1で示されるヌクレオチド配列において、1個以上60個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。 - 請求項5〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項5〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、又は請求項8記載のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
- 請求項5〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、又は請求項8記載のベクターを導入された形質転換体。
- 請求項1、3又は4記載のキシラナーゼ活性を有するタンパク質を含有する、バイオマス糖化剤。
- 請求項1、3若しくは4記載のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、又は請求項11記載のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
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