JP7138505B2 - 改変プロモーター - Google Patents

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Description

特許法第３０条第２項適用 （１）平成３０年２月７日 「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０２（６），ｐｐ ２７３７－２７５２，Ｍａｒｃｈ ２０１８，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３－０１８－８７６３－５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ」に発表
本発明は、改変プロモーター及びその製造方法、ならびに該改変プロモーターを含有するベクター及び形質転換体に関する。
バイオマス材料（以下、「バイオマス」ということがある）中のセルロースから糖を製造し、それを発酵法などでエタノールなどの燃料や化学品へ変換する技術が知られている。この技術については、近年の環境問題への関心を背景に様々な技術開発が進んでおり、またこの技術による燃料や化学品の大規模製造も展開され始めている。
バイオマスは、セルロース繊維と、それを取り巻くキシランを主に含むヘミセルロース及びリグニンとから構成されている。バイオマスを原料とした糖の製造では、セルロースやヘミセルロースを加水分解する酵素が必要となる。セルラーゼによるバイオマス糖化や、ヘミセルラーゼやリグニナーゼによるバイオマスの酵素分解は、従来から行われている。例えば、特許文献１には、セルラーゼと、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来キシラナーゼやアラビノフラノシダーゼなどのヘミセルラーゼを含むバイオマスを糖へ変換するための酵素組成物が開示されている。また、特許文献２には、バガス堆肥に存在する微生物群由来のキシラナーゼ活性を有するタンパク質とセルラーゼとをバイオマス資源に反応させることによる糖の製造方法が開示されている。
糸状菌であるトリコデルマ・リーセイは、キシラナーゼを効率的に生産する菌であり、従来、キシラナーゼ生産に利用されている。トリコデルマ・リーセイ由来のキシラナーゼとして、現在までに３つのキシラナーゼ（Ｘｙｎ１、Ｘｙｎ２、及びＸｙｎ３）が報告されている。これらキシラナーゼのうち、Ｘｙｎ１及びＸｙｎ２は、グリコシドヒドラーゼファミリー１１（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １１：ＧＨ１１）に区分されているが、Ｘｙｎ３は、グリコシドヒドラーゼファミリー１０（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １０：ＧＨ１０）に区分されており、Ｘｙｎ１及びＸｙｎ２とは別のファミリーに属している。Ｘｙｎ３は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株から派生した数あるトリコデルマ・リーセイ変異株のなかで、ＰＣ－３－７株でのみ高い発現を示している。ＰＣ－３－７株におけるＸｙｎ３の発現量は、他の２つのキシラナーゼＸｙｎ１及びＸｙｎ２と比べて高い。
またＸｙｎ３は、Ｘｙｎ１及びＸｙｎ２とは異なる制御機構で発現される。Ｘｙｎ１及びＸｙｎ２の発現が、キシラン及びセルロースによって誘導されるのに対して、Ｘｙｎ３の発現は、キシラン（酵素基質）では誘導されず、セルロース及びその誘導体によって誘導される（非特許文献１及び２）。これらキシラナーゼの発現制御機構の解明のため、それらの遺伝子のプロモーターの解析が行われてきた。Ｘｙｎ３の発現に必須な領域としては、Ｘｙｎ３をコードする遺伝子のプロモーター領域上の、Ｘｙｒ１（リグノセルラーゼ生産に必須な転写調節因子）の結合ドメイン（５’－ＧＧＣＴＡＴ－３’と５’－ＧＧＣＡＡＡ－３’）と１６ｂｐのスペーサー配列により構成されるシスエレメントが報告されている（非特許文献３）。一方、Ｘｙｎ１の発現に必須な領域としては、Ｘｙｎ１をコードする遺伝子のプロモーター領域上の、Ｘｙｒ１の結合ドメイン（５’－ＧＧＣＴＡＡ－３’）と１０ｂｐのスペーサー配列により構成されるシスエレメントが報告されている（非特許文献４）。このように、Ｘｙｎ１のプロモーターとＸｙｎ３のプロモーターは互いによく似た構造のシスエレメントを有しているが、その誘導物質は異なる。これらのプロモーターの間で、シスエレメントのセルロース及びキシランに対する応答性が異なる理由は明らかになっていない。
特表２０１１－５１５０８９号公報 特開２０１２－０２９６７８号公報
Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，４９：７１８－７２４ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，７２：９９５－１００３ Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ，２００９，４６（８）：５６４－５７４ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｃｅｌｌ，２００６，５（３）：４４７－４５６
本発明は、キシラナーゼプロモーター由来の改変プロモーター、及びその製造方法の提供に関する。本発明はまた、該改変プロモーターを含有するベクター及び形質転換体の提供に関する。
本発明者らは、キシラナーゼＸｙｎ３をコードする遺伝子のプロモーターのシスエレメントを他のキシラナーゼプロモーターのシスエレメントをもとに改変することで、バイオマス中での該Ｘｙｎ３をコードする遺伝子のプロモーターの発現誘導能が向上することを見出した。
したがって、一態様において本発明は、改変プロモーターであって、
配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチドを含む、Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドからなり、
該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
であり、
該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなり、かつ
該１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない、
改変プロモーターを提供する。
別の一態様において、本発明は、上記改変プロモーターを含有するベクターを提供する。
別の一態様において、本発明は、目的遺伝子と、該遺伝子の上流に上記改変プロモーターとを含む、ＤＮＡ断片を提供する。
別の一態様において、本発明は、上記ベクター又は上記ＤＮＡ断片を含む形質転換体を提供する。
さらなる態様において、本発明は、改変プロモーターの製造方法であって、
Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドにおいて、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含むポリヌクレオチドを置換又は挿入することを含み、
該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
であり、
該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなり、かつ
該１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない、
方法を提供する。
本発明の改変プロモーターは、ソフォロース、セルロースに対する誘導能が向上しており、さらにはキシラン系物質による誘導能を有することがある。本発明によれば、キシラナーゼや、その他バイオマスの分解又は糖化に関わる酵素の微生物学的製造の効率を向上させることができる。
実施例２で作製したＧＵＳレポーターカセット中の改変プロモーターに含まれるシスエレメント領域の配列。黒枠：Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメント、黒地白抜き文字：ＸＹＲＩ結合サイト。 １２時間誘導培養後の改変プロモーター導入細胞の抽出液におけるＧＵＳ活性。Ａ：グルコース、ソルボース又はソフォロース存在下での培養後のＧＵＳ活性。Ｂ：キシロース又はキシラン存在下での培養後のＧＵＳ活性。 実施例４で使用した形質転換体中のＧＵＳレポーターカセット。Ｂｏｘ：Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメント。 誘導培養後の改変プロモーター導入細胞の抽出液における相対ＧＵＳ活性。Ａ：ソフォロース存在下での培養後のＧＵＳ活性。Ｂ：キシラン存在下での培養後のＧＵＳ活性。 ＰＣ－３－７株及びＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株の培養上清のウエスタンブロッティング解析。左：１％アビセル（登録商標）含有培地からの培養上清、右：１％アビセル（登録商標）及び０．５％キシラン含有培地からの培養上清。 ０．０１％ソフォロース誘導下でのＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株及びＰＣ－３－７株におけるｃｂｈ１、ｘｙｒ１、ｘｙｎ３及びａａｂｇｌ１遺伝子の発現。白色バー：Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株、黒色バー：ＰＣ－３－７株。 ０．１％キシラン誘導下でのＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株及びＰＣ－３－７株におけるｘｙｎ１、ｘｙｒ１、ｘｙｎ３及びａａｂｇｌ１遺伝子の発現。白色バー：Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株、黒色バー：ＰＣ－３－７株。 ＱＭ９４１４株及びＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株の培養上清のウエスタンブロッティング解析。左：１％アビセル（登録商標）含有培地からの培養上清、右：１％アビセル（登録商標）及び０．５％キシラン含有培地からの培養上清。 ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株及びＱＭ９４１４株におけるａａｂｇｌ１遺伝子の発現。Ａ：０．０１％ソフォロース誘導下、Ｂ：０．０１％キシラン誘導下。白色バー：ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株、黒色バー：ＱＭ９４１４株。 Ｅ１ＡＢ１株の培養上清（ＪＮ１３）及びＥ１ＡＢ１＿Ｘ３－２ＲＢＸ３株の培養上清（ＪＮ２４）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９５％の同一性」とは、９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応してアラインされた目的配列の位置又は領域は、当該任意の領域に「相当する位置」又は「相当する領域」とみなされる。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
本明細書において、プロモーターと遺伝子との「作動可能な連結」とは、該プロモーターが該遺伝子の転写を誘導し得るように連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、「プロモーター活性」とは、その下流に位置する遺伝子の発現を促進する活性、より詳細には、下流に位置する遺伝子のＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を促進する活性を意味する。プロモーター活性は、適当なレポーター遺伝子を用いることにより確認することができる。例えば、プロモーターの下流に検出可能なタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、レポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の発現産物の生産量を測定することにより、プロモーター活性を確認可能である。レポーター遺伝子の例としては、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、などが挙げられる。あるいは、プロモーター活性は、レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ等で測定することによっても確認することができる。
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
本明細書において、「Ｘｙｎ３プロモーター」とは、キシラナーゼＸｙｎ３をコードする遺伝子のプロモーター、及びそれと同等なプロモーターをいう。Ｘｙｎ３プロモーターの例としては、以下のポリヌクレオチドからなるプロモーターが挙げられる：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２；Ｎは任意のヌクレオチド）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド。
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列の好ましい例としては、配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列が挙げられる。配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列の好ましい例としては、配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列が挙げられる。これらの配列は、配列番号１の３７２番～３９９番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２；Ｎは任意のヌクレオチド）で示される配列を含み、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する。したがって、本発明のＸｙｎ３プロモーターのさらなる例としては、以下のポリヌクレオチドからなるプロモーターが挙げられる：
配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２；Ｎは任意のヌクレオチド）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド。
該ＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）は、Ｘｙｎ３プロモーターのシスエレメントである。当該配列番号２で示される配列の好ましい例としては、ＧＧＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号３）で示される配列が挙げられる。
好ましくは、該Ｘｙｎ３プロモーターは、既存のキシラナーゼプロモーターが有するモチーフ（非特許文献２、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ，２００８，４５：１０９４－１１０２）を保有している。該モチーフの例としては、ＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＣＲＥＩ結合部位、ＡＣＥＩ結合部位、ＡＣＥＩＩ結合部位、ＣＡＡＴモチーフなどが挙げられる。より詳細には以下の領域が挙げられる：
配列番号１の８６０番～８６３番ヌクレオチド及び８８９番～８９２番ヌクレオチドに相当する領域におけるＴＡＴＡ ｂｏｘ（例えばＴＡＴＡ）；
配列番号１の５３番～５８番ヌクレオチド、１２４番～１２９番ヌクレオチド、２４９番～２５４番ヌクレオチド、４５６番～４６１番ヌクレオチド、５０９番～５１４番ヌクレオチド、及び８１１番～８１６番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＲＥＩ結合部位（例えば、ＣＴＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＡＣ、ＣＣＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＧＧ、ＣＴＣＣＧＣ及びＣＴＧＧＧＧからなる群より選択される配列）：
配列番号１の３５０番～３５４番ヌクレオチドに相当する領域におけるＡＣＥＩ結合部位（例えばＴＧＣＣＴ、ＡＧＧＣＡなど）；
配列番号１の５９４番～５９９番ヌクレオチド及び８４５番～８５０番ヌクレオチドに相当する領域におけるＡＣＥＩＩ結合部位（例えばＧＧＣＴＡＡ、ＴＴＡＧＣＣ、及びＧＧＣＴＡＡからなる群より選択される配列）；ならびに
配列番号１の５８３番～５８７番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＡＡＴモチーフ（例えばＣＣＡＡＴ）。
本明細書において、「Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメント」とは、キシラナーゼＸｙｎ１をコードする遺伝子のプロモーター上に存在するシスエレメント、及びそれと同等なシスエレメントをいう。Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントの例としては、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４；Ｎは任意のヌクレオチド）で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４で示される配列の好ましい例としては、ＧＧＣＴＡＡＡＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号５）で示される配列が挙げられる。
本発明は、改変プロモーターを提供する。本発明の改変プロモーターは、Ｘｙｎ３プロモーターの改変プロモーターである。代表的には、本発明の改変プロモーターは、Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドにおけるシスエレメント領域に対して、Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメント又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドを置換又は挿入することによって得られたものである。Ｘｙｎ３プロモーターは、本発明の改変プロモーターの親プロモーターである。
本発明において、所定のヌクレオチド配列からなるシスエレメント（又はその相補鎖）、又はそれを含むポリヌクレオチドの、Ｘｙｎ３プロモーターへの置換又は挿入は、該プロモーターのＤＮＡセンス鎖に連結される側の鎖に、該所定のヌクレオチド配列（又はその相補鎖）が配置するように行われる。同様に、本発明の改変プロモーターが所定のヌクレオチド配列からなるシスエレメント（又はその相補鎖）、又はそれを含むポリヌクレオチドを含有する場合、該所定のヌクレオチド配列（又はその相補鎖）は、該プロモーターのＤＮＡセンス鎖に連結される側の鎖に存在する。
好ましい実施形態において、本発明は、改変プロモーターであって、
配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチドを含む、Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドからなり、
該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
であり、かつ
該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなる、
改変プロモーターを提供する。
好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドは、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である。
より好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドは、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号３）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である。
さらに好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドは、
配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である。さらに好ましい実施形態において、該ＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列は、ＧＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号３）で示される配列である。
さらに好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドは、
配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である。さらに好ましい実施形態において、該ＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列は、ＧＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号３）で示される配列である。
好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドは、ＧＧＣＴＡＡＡＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号５）で示されるヌクレオチド配列からなる。
本発明の改変プロモーターにおいては、Ｘｙｎ３プロモーター（親プロモーター）のポリヌクレオチドにおける配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域（以下の本明細書において、「３７４番～４０１番領域」ともいう）に、１つ以上の該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチド（以下の本明細書において、「Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメント」ともいう）が置換又は挿入されている。該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントに含まれる該Ｘｙｎ１シスエレメント又はその相補鎖の数は、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは１、２、３又は６個である。
好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントは、配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは１、２、３又は６個含むポリヌクレオチドである。よって好ましい実施形態において、本発明の改変プロモーターは、配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは１、２、３又は６個含む。
さらに好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは１、２、３又は６個含むポリヌクレオチドである。別のさらに好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖を１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは１、２、３又は６個含むポリヌクレオチドである。なお好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを２個含むポリヌクレオチドであるか、又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖を１個又は２個含むポリヌクレオチドである。別のなお好ましい実施形態において、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを３個含むポリヌクレオチドであるか、又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖を３個又は６個含むポリヌクレオチドである。
該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントが配列番号４又は５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を２個以上含む場合、好ましくは、それらの各々の間にスペーサー配列を有する。該スペーサー配列は、５～２０個の塩基からなる配列であって、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントが有する遺伝子発現制御機能を阻害しないものであればよい。該スペーサー配列の例としては、ＴＣＡＡＧＡ、ＴＣＴＡＧＡなどが挙げられる。
したがって、該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントの好ましい例としては、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又はその相補鎖；ならびに、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又はその相補鎖の下流に該スペーサー配列が連結された配列の、２個以上、好ましくは２～１０個、より好ましくは２～８個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは３～６個、さらに好ましくは２、３又は６個の繰り返しからなるポリヌクレオチドが挙げられる。これらのＸｙｎ１シスエレメント含有フラグメントには、その最上流及び最下流に、上述した該スペーサー配列が配置されていてもよい。
該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントの好ましい例としては以下：
配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；及び、
配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
が挙げられる。
したがって、好ましい実施形態において、本発明の改変プロモーターは、Ｘｙｎ３プロモーター（親プロモーター）と比べて、該３７４番～４０１番領域に、以下のポリヌクレオチドを含む：
配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、
配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
Ｘｙｎ１遺伝子のプロモーターには、そのシスエレメントに隣接してＨＡＰ２／３／５結合サイト（転写促進因子、５’－ＣＣＡＡＴ－３’）及びＣＲＥＩ結合サイト（炭素源異化抑制因子、５’－ＳＹＧＧＲＧ－３’、５’－ＣＣＣＣＡＧ－３’）が存在する（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１６，８０（９）：１７１２－１７２９）。一方、該親プロモーターに置換又は挿入される該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントは、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まないものが好ましい。また好ましくは、本発明の改変プロモーターは、置換又は挿入されたＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントの近傍にＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない。Ｘｙｎ３プロモーターの該３７４番～４０１番領域にＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントを置換又は挿入すれば、置換又は挿入されたＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントの近傍にＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトは配置されない。ＨＡＰ結合サイト又はＣＲＥＩ結合サイトを含むＸｙｎ１プロモーターのシスエレメンを置換又は挿入した場合、改変プロモーターのプロモーター活性が低下したことが報告されている（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８，１０２（６）：２７３７－２７５２）。
親プロモーターから本発明の改変プロモーターを製造する場合、Ｘｙｎ３プロモーターの該３７４番～４０１番領域の全体を該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントで置換してもよく、又は該３７４番～４０１番領域のヌクレオチドを全て残したまま、該領域の内部に該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントを挿入してもよい。あるいは、該３７４番～４０１番領域の一部を該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントで置換するように、該３７４番～４０１番領域の内部に該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントを挿入してもよい。言い換えると、本発明の改変プロモーターにおいて、該３７４番～４０１番領域は、その全体が欠失していても、又はその一部が欠失していてもよく、あるいは該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントで分断されていてもよい。好ましくは、本発明の改変プロモーターにおいては、Ｘｙｎ３プロモーターの該３７４番～４０１番領域の全体が該Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントで置換されており、該３７４番～４０１番領域の全体が欠失している。
本発明の改変プロモーターの取得方法は、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、本発明の改変プロモーターは、人工合成することができる。ＤＮＡの人工合成には、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。あるいは、本発明の改変プロモーターは、Ｘｙｎ３プロモーター（親プロモーター）を遺伝子工学的に改変することによって製造することができる。
本発明の改変プロモーターの親プロモーターは、上述した手段で人工合成してもよいが、微生物からクローニングすることもできる。例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドは、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株からクローニングすることができる。
あるいは、本発明の改変プロモーターの親プロモーターは、突然変異導入したトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株からクローニングすることができる。例えば、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株におけるＸｙｎ３プロモーターのＤＮＡに突然変異を導入し、得られた変異ＤＮＡの中から、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを選択することができる。突然変異導入の手法としては、例えば、紫外線照射及び部位特異的変異導入法が挙げられる。変異ＤＮＡのプロモーター活性は、例えば、変異導入したＤＮＡの下流に目的遺伝子を作動可能に連結し、該目的遺伝子の発現量解析を行うことにより、測定することができる。これらの変異導入及び目的とする変異ＤＮＡの選択は、当業者の慣用手段である。
親プロモーターの３７４番～４０１番領域に対するＸｙｎ１シスエレメント含有フラグメントの置換又は挿入は、ＰＣＲを用いたフラグメントの構築や、ライゲーションなどの当業者に周知の手順に従って行うことができる。例えば、ＰＣＲにより親プロモーター（Ｘｙｎ３プロモーター）の該３７４番～４０１番領域の上流断片及び下流断片と、Ｘｙｎ１シスエレメント含有フラグメントを調製し、これらを連結して該上流断片と下流断片の間にＸｙｎ１シスエレメント含有フラグメントを配置することで、該３７４番～４０１番領域の代わりにＸｙｎ１シスエレメント含有フラグメントを含む本発明の改変プロモーターを含むＤＮＡ断片を調製することができる。
本発明の改変プロモーターは、その下流に配置された遺伝子の発現を制御する機能を有する。本発明の改変プロモーターを利用することによって、転写活性に優れた発現制御領域を有するＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、目的遺伝子と、その上流に作動可能に連結された本発明の改変プロモーターとを含むＤＮＡ断片を構築することができる。あるいは、本発明の改変プロモーターを含むＤＮＡ断片を、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することができる。該制限酵素認識配列を使用して、本発明の改変プロモーターをベクターに導入することができる。すなわち、公知のベクターを制限酵素で切断し、そこに、本発明の改変プロモーターを含み端部に制限酵素切断配列を有するＤＮＡ断片を添加することによって、本発明の改変プロモーターをベクターに導入することができる（制限酵素法）。
したがって、本発明の改変プロモーターは、ベクターに含有され得る。本発明の改変プロモーターを、目的遺伝子の発現を可能とするベクターに組み込むことで、当該目的遺伝子の発現を転写レベルで向上させることができる発現ベクターが得られる。該発現ベクターにおいては、本発明の改変プロモーターは、目的遺伝子をコードするＤＮＡの上流に作動可能に連結され得る。本発明のプロモーターを有するベクターは、宿主細胞の染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態のいずれであってもよい。またあるいは、目的遺伝子とその上流に作動可能に連結された本発明の改変プロモーターとを有するＤＮＡ断片を構築し、それを宿主細胞のゲノムに直接導入してもよい。
本発明の改変プロモーターを組み込むベクターとしては、宿主細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであるならば特に限定されず、例えば、アスペルギルス属（Aspergillus）微生物で自立複製因子として働くＡＭＡ１を含むプラスミド等が挙げられる。
本発明の改変プロモーターは、親プロモーターであるＸｙｎ３プロモーターが有していたセルロース又はその誘導体によるプロモーター活性誘導能が向上している。好ましくはさらに、キシラン又はその誘導体によるプロモーター活性誘導能を獲得している。したがって、本発明の改変プロモーターは、セルロース及びキシランが存在する環境下での使用に好適である。例えば、本発明の改変プロモーターは、バイオマスの分解又はバイオマス糖化の過程で使用される酵素のプロモーターとして好適である。
したがって、本発明の改変プロモーターを含むベクターやＤＮＡ断片において該プロモーターと作動可能に連結される目的遺伝子としては、バイオマス分解又はバイオマス糖化の過程で使用される酵素、例えば、セルラーゼ（例えばβ－エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ等）、ヘミセルラーゼ（例えばエンドキシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、マンナナーゼ、β－マンノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ等）、キシラナーゼなどをコードする遺伝子が好ましい。あるいは、該目的遺伝子としては、本来セルロース又はキシランでは発現が誘導されないプロモーターに制御される遺伝子が好ましい。本発明の改変プロモーターと作動可能に連結される目的遺伝子のより好ましい例としては、配列番号３８で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼＸｙｎ３をコードするポリヌクレオチド、配列番号３８と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるキシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、などが挙げられる。目的遺伝子の他の好ましい例としては、配列番号４０で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼＰｓｐＸｙｎ（ＷＯ２０１６／２０８４９２）をコードするポリヌクレオチド、配列番号４０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるキシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、配列番号３９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、などが挙げられる。しかし、本発明のプロモーターと作動可能に連結され得る目的遺伝子の種類は、これらに限定されない。
本発明の改変プロモーターを含むベクター又はＤＮＡ断片を、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いて宿主細胞に導入することによって、本発明の形質転換体を得ることができる。
上記ベクターやＤＮＡ断片を導入する宿主細胞の例としては、その細胞内で、本発明のプロモーターがプロモーターとして機能し得るものであれば特に限定されないが、通常は真核生物、好ましくは真菌、より好ましくは糸状菌が挙げられる。好ましい糸状菌としては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられ、このうち、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌が好ましく、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ及びその変異株がより好ましい。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ及びその変異株の例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株及びその変異株、例えば、リコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株などが挙げられる。
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕改変プロモーターであって、
配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチドを含む、Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドからなり、
該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
であり、
該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなり、かつ
該１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない、改変プロモーター。
〔２〕前記Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、
好ましくは、ＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＣＲＥＩ結合部位、ＡＣＥＩ結合部位、ＡＣＥＩＩ結合部位、及びＣＡＡＴモチーフからなる群より選択される１つ以上を含有し、
より好ましくは、ＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＣＲＥＩ結合部位、ＡＣＥＩ結合部位、ＡＣＥＩＩ結合部位、及びＣＡＡＴモチーフを含有する、〔１〕記載の改変プロモーター。
〔３〕好ましくは、前記ＴＡＴＡ ｂｏｘが、配列番号１の８６０番～８６３番ヌクレオチド及び８８９番～８９２番ヌクレオチドに相当する領域におけるＴＡＴＡ ｂｏｘ（例えばＴＡＴＡ）である、〔２〕記載の改変プロモーター。
〔４〕前記ＣＲＥＩ結合部位が、
好ましくは、配列番号１の４５６番～４６１番ヌクレオチド、５０９番～５１４番ヌクレオチド、及び８１１番～８１６番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＲＥＩ結合部位（例えば、ＣＴＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＡＣ、ＣＣＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＧＧ、ＣＴＣＣＧＣ及びＣＴＧＧＧＧからなる群より選択される配列）であり、
より好ましくは、配列番号１の５３番～５８番ヌクレオチド、１２４番～１２９番ヌクレオチド、２４９番～２５４番ヌクレオチド、４５６番～４６１番ヌクレオチド、５０９番～５１４番ヌクレオチド、及び８１１番～８１６番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＲＥＩ結合部位（例えば、ＣＴＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＡＣ、ＣＣＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＧＧ、ＣＴＣＣＧＣ及びＣＴＧＧＧＧからなる群より選択される配列）である、
〔２〕又は〔３〕記載の改変プロモーター。
〔５〕好ましくは、前記ＡＣＥＩ結合部位が、配列番号１の３５０番～３５４番ヌクレオチドに相当する領域におけるＴＧＣＣＴ又はＡＧＧＣＡである、〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔６〕好ましくは、前記ＡＣＥＩＩ結合部位が、配列番号１の５９４番～５９９番ヌクレオチド及び８４５番～８５０番ヌクレオチドに相当する領域におけるＡＣＥＩＩ結合部位（例えばＧＧＣＴＡＡ、ＴＴＡＧＣＣ、及びＧＧＣＴＡＡからなる群より選択される配列）である、〔２〕～〔５〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔７〕好ましくは、前記ＣＡＡＴモチーフが、５８３番～５８７番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＡＡＴモチーフ（例えばＣＣＡＡＴ）である、〔２〕～〔６〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔８〕好ましくは、前記Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔９〕好ましくは、前記Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１０〕好ましくは、前記配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列が、ＧＧＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号３）で示される配列である、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１１〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、なお好ましくは１、２、３又は６個含む、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１２〕好ましくは、前記配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１１〕記載の改変プロモーター。
〔１３〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドがＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まず、
該ＨＡＰ２／３／５結合サイトがＣＣＡＡＴであり、かつ該ＣＲＥＩ結合サイトがＳＹＧＧＲＧ又はＣＣＣＣＡＧである、
〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１４〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、
配列番号５で示されるヌクレオチド配列又はその相補鎖であるか、
配列番号５で示されるヌクレオチド配列又はその相補鎖の下流にスペーサー配列が連結された配列の、２個以上、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～８個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは３～６個、なお好ましくは２、３又は６個の繰り返しからなるポリヌクレオチドである、
〔１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１５〕好ましくは、前記スペーサー配列がＴＣＡＡＧＡ又はＴＣＴＡＧＡである、〔１４〕記載の改変プロモーター。
〔１６〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、以下：
配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、
配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
である、〔１〕～〔１５〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１７〕好ましくは、前記配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域の全部もしくは一部が欠失しているか、又は、前記配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域が、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドで分断されている、〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の改変プロモーター。
〔１８〕改変プロモーターの製造方法であって、
Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドにおいて、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含むポリヌクレオチドを置換又は挿入することを含み、
該Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
であり、
該Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなり、かつ
該１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない、
方法。
〔１９〕前記Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、
好ましくは、ＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＣＲＥＩ結合部位、ＡＣＥＩ結合部位、ＡＣＥＩＩ結合部位、及びＣＡＡＴモチーフからなる群より選択される１つ以上を含有し、
より好ましくは、ＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＣＲＥＩ結合部位、ＡＣＥＩ結合部位、ＡＣＥＩＩ結合部位、及びＣＡＡＴモチーフを含有する、〔１８〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記ＴＡＴＡ ｂｏｘが、配列番号１の８６０番～８６３番ヌクレオチド及び８８９番～８９２番ヌクレオチドに相当する領域におけるＴＡＴＡ ｂｏｘ（例えばＴＡＴＡ）である、〔１９〕記載の方法。
〔２１〕前記ＣＲＥＩ結合部位が、
好ましくは、配列番号１の４５６番～４６１番ヌクレオチド、５０９番～５１４番ヌクレオチド、及び８１１番～８１６番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＲＥＩ結合部位（例えば、ＣＴＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＡＣ、ＣＣＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＧＧ、ＣＴＣＣＧＣ及びＣＴＧＧＧＧからなる群より選択される配列）であり、
より好ましくは、配列番号１の５３番～５８番ヌクレオチド、１２４番～１２９番ヌクレオチド、２４９番～２５４番ヌクレオチド、４５６番～４６１番ヌクレオチド、５０９番～５１４番ヌクレオチド、及び８１１番～８１６番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＲＥＩ結合部位（例えば、ＣＴＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＡＣ、ＣＣＣＣＡＧ、ＣＴＣＣＧＧ、ＣＴＣＣＧＣ及びＣＴＧＧＧＧからなる群より選択される配列）である、
〔１９〕又は〔２０〕記載の方法。
〔２２〕好ましくは、前記ＡＣＥＩ結合部位が、配列番号１の３５０番～３５４番ヌクレオチドに相当する領域におけるＴＧＣＣＴ又はＡＧＧＣＡである、〔１９〕～〔２１〕のいずれか１項記載の方法。
〔２３〕好ましくは、前記ＡＣＥＩＩ結合部位が、配列番号１の５９４番～５９９番ヌクレオチド及び８４５番～８５０番ヌクレオチドに相当する領域におけるＡＣＥＩＩ結合部位（例えばＧＧＣＴＡＡ、ＴＴＡＧＣＣ、及びＧＧＣＴＡＡからなる群より選択される配列）である、〔１９〕～〔２２〕のいずれか１項記載の方法。
〔２４〕好ましくは、前記ＣＡＡＴモチーフが、５８３番～５８７番ヌクレオチドに相当する領域におけるＣＡＡＴモチーフ（例えばＣＣＡＡＴ）である、〔１９〕～〔２３〕のいずれか１項記載の方法。
〔２５〕好ましくは、前記Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である、〔１８〕～〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２６〕好ましくは、前記Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号１の３番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
である、〔１８〕～〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２７〕好ましくは、前記配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列が、ＧＧＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号３）で示される配列である、〔１８〕～〔２６〕のいずれか１項記載の方法。
〔２８〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは１、２、３又は６個含む、〔１８〕～〔２７〕のいずれか１項記載の方法。
〔２９〕好ましくは、前記配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔２８〕記載の方法。
〔３０〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドがＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まず、
該ＨＡＰ２／３／５結合サイトがＣＣＡＡＴであり、かつ該ＣＲＥＩ結合サイトがＳＹＧＧＲＧ又はＣＣＣＣＡＧである、
〔１８〕～〔２９〕のいずれか１項記載の方法。
〔３１〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、
配列番号５で示されるヌクレオチド配列又はその相補鎖であるか、
配列番号５で示されるヌクレオチド配列又はその相補鎖の下流にスペーサー配列が連結された配列の、２個以上、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～８個、さらに好ましくは２～６個、さらに好ましくは３～６個、さらに好ましくは２、３又は６個の繰り返しからなるポリヌクレオチドである、
〔１８〕～〔３０〕のいずれか１項記載の方法。
〔３２〕好ましくは、前記スペーサー配列がＴＣＡＡＧＡ又はＴＣＴＡＧＡである、〔３１〕記載の方法。
〔３３〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、以下：
配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、
配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
である、〔１８〕～〔３２〕のいずれか１項記載の方法。
〔３４〕好ましくは、前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、前記配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域の全部もしくは一部と置換されているか、又は、前記配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に挿入されている、〔１８〕～〔３３〕のいずれか１項記載の方法。
〔３５〕〔１〕～〔１７〕のいずれか１項記載の改変プロモーターを含有するベクター。
〔３６〕好ましくは、前記改変プロモーターが目的遺伝子の上流に連結されている、〔３５〕記載のベクター。
〔３７〕前記目的遺伝子が、
好ましくは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子であり、
より好ましくは、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドであるか、又は配列番号３９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドである、
〔３６〕記載のベクター。
〔３８〕目的遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された〔１〕～〔１７〕のいずれか１項記載の改変プロモーターとを含む、ＤＮＡ断片。
〔３９〕前記目的遺伝子が、
好ましくは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子であり、
より好ましくは、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドであるか、又は配列番号３９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドである、
〔３８〕記載のＤＮＡ断片。
〔４０〕〔３５〕～〔３７〕のいずれか１項記載のベクター又は〔３８〕又は〔３９〕記載のＤＮＡ断片を含む形質転換体。
〔４１〕トリコデルマ属菌である、〔４０〕記載の形質転換体。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ 改変Ｘｙｎ３プロモーターの作製
（１）Ｘｙｎ３プロモーターのクローニング
トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株由来のキシラナーゼＸｙｎ３をコードする遺伝子（ｘｙｎ３）の上流を含む遺伝子領域を鋳型とし、プライマーｘｙｎ３－ＥｃｏＲＩ－Ｕ（配列番号９）およびプライマーｘｙｎ３－ＮｃｏＩ（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより、両端にプライマー断片を含むＸｙｎ３プロモーター領域（配列番号１）を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入し、プラスミドｐＴｘｙｎ３ＰＤ０を取得した。レポーターカセット構築のため、プラスミドｐＴｘｙｎ３ＰＤ０をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにより切断して増幅したプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を獲得し、これをｐＫＦ１８Ｋプラスミド（Ｔａｋａｒａ）に導入して、Ｘｙｎ３プロモーター含有プラスミドｐＫＦｘｙｎ３ＰＤ０を取得した。
（２）Ｘｙｎ３プロモーターからのシスエレメント除去
ｐＫＦｘｙｎ３ＰＤ０に対して、プライマーｘｙｎ３Ｐ＿ｃｉｓ＿ｉｎｖ＿Ｆｗ（配列番号１１）、プライマーｘｙｎ３Ｐ＿ｃｉｓ＿ｉｎｖ＿Ｒｖ（配列番号１２）を用いたＰＣＲにより、Ｘｙｎ３プロモーターのシスエレメント（配列番号３）の除去およびＸｂａＩ制限酵素サイトを付加した。このＰＣＲ産物をセルフライゲーションすることにより、プラスミドｐＫＦｘｙｎ３Ｐ－Δｃｉｓを得た。
（３）Ｘｙｎ１プロモーターシスエレメント含有断片の作製
Ｘｙｎ１をコードする遺伝子のプロモーターのシスエレメント（配列番号５）を含むＤＮＡ断片を構築した。トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株由来のキシラナーゼＸｙｎ１をコードする遺伝子（ｘｙｎ１）の上流を含む遺伝子領域から、プライマー１Ｂｏｘ＿Ｆｗ（配列番号１３）及びプライマー１Ｂｏｘ＿Ｒｖ（配列番号１４）を用いて、配列番号５で示される配列を１つ含み、両端にＸｂａＩサイトを含むＤＮＡ断片（１Ｂｏｘ；配列番号６）、及びその相補鎖（１ＲＢｏｘ）を構築した。さらに、配列番号５で示される配列又はその相補鎖を２つ含み、両端にＸｂａＩサイトを含むＤＮＡ断片（２Ｂｏｘ及び２ＲＢｏｘ；配列番号７及び８）を合成した。
（４）改変Ｘｙｎ３プロモーター含有プラスミドの作製
（３）で作製したそれぞれのＤＮＡ断片をＸｂａＩで切断したｐＫＦｘｙｎ３Ｐ－Δｃｉｓへと導入し、改変プロモーター含有プラスミドｐＫＦｘｙｎ３－１Ｂｏｘ、ｐＫＦｘｙｎ３－１ＲＢｏｘ、ｐＫＦｘｙｎ３－２Ｂｏｘ、及びｐＫＦｘｙｎ３－２ＲＢｏｘを構築した。
実施例２ 改変プロモーターを含むレポーターカセットの作製
（１）ＧＵＳレポーター含有プラスミドの作製
実施例１で作製した改変Ｘｙｎ３プロモーターの誘導能を評価するため、それぞれのプロモーターの制御下にレポーターであるＧＵＳ（β－グルクロニダーゼ）をコードする遺伝子（ｇｕｓ）を導入したレポーターカセットを構築した。プライマーｘｙｎ３－ＳｐｅＩ（配列番号１５）及びプライマーｘｙｎ３－ＥｃｏＲＩ－Ｄ（配列番号１６）により増幅させた０．８ｋｂｐのｘｙｎ３の下流領域を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと導入し、ｐＴｘｙｎ３Ｔを得た。また、ｐＢＡＣｇｕｓ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を鋳型とし、プライマーｇｕｓ－ＮｃｏＩ（配列番号１７）及びプライマーｇｕｓ－ＳｐｅＩ（配列番号１８）を用いてｇｕｓ遺伝子を増幅させ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－Ｔへと導入し、ｐＴｇｕｓ－１を得た。ｐＴｘｙｎ３Ｔ及びｐＴｇｕｓ－１をＳｐｅＩにより切断し、ライゲーションしてｐＴｇｕｓ－２（ｇｕｓ遺伝子の終止コドン後にｘｙｎ３下流領域を有する）を構築した。
（２）プロモーター－ＧＵＳ断片の作製
実施例１で作製したｐＫＦｘｙｎ３ＰＤ０、ｐＫＦｘｙｎ３Ｐ－Δｃｉｓ、及び改変プロモーター含有プラスミドをＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで切断してＤＮＡ断片を得た。（１）で作製したｐＴｇｕｓ－２をＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで切断してＤＮＡ断片を得た。ｐＫＦｘｙｎ３ＰＤ０断片とｐＴｇｕｓ－２断片をライゲーションして、プラスミドｐＴｘｙｎ３－ＰＤ０を作製した。ｐＫＦｘｙｎ３Ｐ－Δｃｉｓ断片とｐＴｇｕｓ－２断片をライゲーションして、プラスミドｐＴｘｙｎ３－Δｃｉｓを作製した。また改変プロモーター含有プラスミド断片とｐＴｇｕｓ－２断片をライゲーションして、それぞれプラスミドｐＴｘｙｎ３－１Ｂｏｘ、ｐＴｘｙｎ３－２Ｂｏｘ、ｐＴｘｙｎ３－１ＲＢｏｘ、及びｐＴｘｙｎ３－２ＲＢｏｘを作製した。得られたプラスミドをそれぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで切断し、プロモーター－ＧＵＳを含む断片を得た。
（３）ｘｙｎ３－ａｍｄＳ断片の作製
トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株から、ｘｙｎ３のＯＲＦを含む７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片（３．１ｋｂｐのｘｙｎ３上流領域、１．４ｋｂｐのｘｙｎ３ ＯＲＦ、３．２ｋｂｐのｘｙｎ３下流領域を含む）をクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をＥｃｏＲＩで切断後、平滑化を行い、ｐＢＥ（ＥｃｏＲＩサイトを欠損）を構築した。ｐＢＥをＳａｌＩにより切断し、上記７．７ｋｂｐ断片とライゲーションし、ｐＢｘｙｎ３Ｓ’を得た。このプラスミドをＥｃｏＲＩにて部分切断し、平滑化することで下流領域に存在するＥｃｏＲＩサイトのみを欠損させたｐＢｘｙｎ３ＳＥ’を構築した。ｐ３ＳＲ２（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９８３，３（８）：１４３０－１４３９）を、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩで切断し、ａｍｄＳ遺伝子を含む３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｃｅｔｏａｍｉｄａｓｅ遺伝子ａｍｄＳ、ならびにその上流及び下流領域を含む）を得た。ｐＢｘｙｎ３ＳＥ’をＮａｒＩにて切断し、該３．５ｋｂｐＤＮＡ断片とライゲーションすることでｐＢｘｙｎ３ａｍｄＳを獲得した。得られたプラスミドをｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで切断し、ｘｙｎ３－ａｍｄＳを含む断片を得た。
（４）プロモーター解析用ＧＵＳレポーターカセットの作製
（３）で作製したｘｙｎ３－ａｍｄＳ断片に、（２）で作製したプロモーター－ＧＵＳ断片を導入し、ＧＵＳレポーターカセットを含むプロモーター解析用プラスミドｐＢｘｙｎ３ａｇ－Ｄ０Ｃ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－Δｃｉｓ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－１Ｂｏｘ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－１ＲＢｏｘ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－２Ｂｏｘ、及びｐＢｘｙｎ３ａｇ－２ＲＢｏｘを作製した。得られたプラスミドについて、Ｇｅｎｏｍｅ ＬａｂTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ ｋｉｔ、及びＣＥＱTM ２０００ＸＬ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、改変Ｘｙｎ３プロモーター、ｇｕｓ遺伝子、ａｍｄＳ遺伝子の配列を確認した。作製したレポーターカセット中の改変プロモーターに含まれるシスエレメント領域の配列を図１に示す。
実施例３ 形質転換体の作製及びプロモーターの誘導能の評価
（１）形質転換体の取得
実施例２で作製した改変プロモーターを含むレポーターカセットを有する形質転換体を作製した。まず、実施例２の（４）で作製したＧＵＳレポーターカセットを含むプラスミドをＳａｌＩにより切断した。得られた断片を、プロトプラストＰＥＧ法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，Ｊａｎ；１０９（１）：９２－９９）にてトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株に導入した。
形質転換体は、アセトアミドを単一窒素源とした選択培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．６ｍｇ／ｍＬ ＭｇＳＯ4、０．６ｍｇ／ｍＬ ＣａＣｌ2、１２．５ｍＭ ＣｓＣｌ2、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）、０．００５ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１６ｍｇ／ｍＬ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．００１４ｍｇ／ｍＬ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００２ｍｇ／ｍＬ ＣｏＣｌ2、２％（ｗ／ｖ）アガー）にて選抜した。選抜した形質転換体候補株は、アセトアミドを添加した最少培地にて２回培養し、安定化した。形質転換体における相同組換え及び導入コピー数は、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）を用いてサザン解析にて確認した。結果、ゲノム上のｘｙｎ３遺伝子の位置にレポーターカセットが１コピーで相同組換えされていることを確認した。ｐＢｘｙｎ３ａｇ－Ｄ０Ｃ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－Δｃｉｓ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－１Ｂｏｘ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－１ＲＢｏｘ、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－２Ｂｏｘ、及びｐＢｘｙｎ３ａｇ－２ＲＢｏｘが導入された形質転換体を、それぞれ、Ｄ０Ｃ株、Δｃｉｓ株、１Ｂｏｘ株、１ＲＢｏｘ株、２Ｂｏｘ株、及び２ＲＢｏｘ株として取得した。
（２）細胞抽出液の調製とＧＵＳ活性測定
１×１０6個の形質転換体の分生子を、５０ｍＬの０．３％（ｗ／ｖ）グルコース含有培養培地にて２８℃、２２０ｒｐｍで４８ｈ培養し、ろ過により菌体を回収した。集めた菌体を、プロモーターに対する誘導因子を唯一の炭素源とした誘導培地（０．００７５％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．００７５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ*1)、５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４．０））５０ｍＬに移して培養した。誘導因子には、０．１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０５％（ｗ／ｖ）ソルボース、０．０１％（ｗ／ｖ）ソフォロース、０．１％（ｗ／ｖ）キシロース、又は０．１％（ｗ／ｖ）ｂｉｒｃｈ ｗｏｏｄ ｘｙｌａｎのいずれかを用いた。
* 1）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ組成：０．００６％（ｗ／ｖ）Ｈ3ＢＯ3、０．０２６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ2４・４Ｈ2Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、０．４％（ｗ／ｖ）ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．００８％（ｗ／ｖ）ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．２％（ｗ／ｖ）ＺｎＣｌ2
誘導１２ｈ後、ミラクロスを用いて菌糸を回収し、すぐに液体窒素にて凍結させた。凍結菌糸をマルチビーズショッカーにより粉末化し、ＧＵＳ抽出液（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）に懸濁し、１３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心した。得られた上清をＧＵＳ抽出液とした。ＧＵＳ抽出液におけるβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性及びタンパク質量を測定し、タンパク質量当たりのＧＵＳ活性を求めた。ＧＵＳ活性は、４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（４－ＭＵＧ）を基質として３７℃で１０分間反応後、蛍光測定することで定量した。タンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりウシ免疫グロブリンを標準として定量した。
（３）結果
ＧＵＳ活性の測定結果を図２に示す。図２Ａは、グルコース、ソルボース、又はセルロース系基質であるソフォロースの存在下で培養した細胞の抽出液におけるＧＵＳ活性を表す。Ｄ０Ｃ株（コントロール）では、ソルボース又はソフォロース存在下でＧＵＳ活性が検出された。Δｃｉｓ株は、ソルボース及びソフォロースのいずれの存在下でも、Ｄ０Ｃ株と比べて極めて低いＧＵＳ活性を示した。１Ｂｏｘ株及び１ＲＢｏｘ株（Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメント又はその相補鎖を１つ挿入した改変プロモーターの導入株）では、ソフォロース存在下でのＧＵＳ活性が、Ｄ０Ｃ株と比べてそれぞれ２．３倍及び２．６倍に増加していた。２Ｂｏｘ株（Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントを２つ挿入した改変プロモーターの導入株）では、ソフォロース存在下でのＧＵＳ活性が３．２倍に増加した。一方、２ＲＢｏｘ株（Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントの相補鎖を２つ挿入した改変プロモーターの導入株）のソフォロース存在下でのＧＵＳ活性は、１Ｂｏｘ株と同等であった。
図２Ｂは、キシラン系基質（キシロース又はキシラン）存在下で培養した細胞の抽出液におけるＧＵＳ活性を表す。キシラン系基質で誘導した場合、Ｄ０Ｃ株及び１Ｂｏｘ株ではＧＵＳ活性を検出できなかった。一方で、１ＲＢｏｘ株、２Ｂｏｘ株及び２ＲＢｏｘ株はキシロース及びキシランのいずれの存在下でもＧＵＳ活性を示した。
図２の結果から、Ｘｙｎ１プロモーターのシスエレメントを導入した改変Ｘｙｎ３プロモーターが、セルロース系基質による誘導能を向上させること、及びさらにはキシラン系基質による誘導能をも獲得し得ることが示された。
実施例４ プロモーターの誘導能の評価（１）改変Ｘｙｎ３プロモーター ３Ｂｏｘ、３ＲＢｏｘ及び６ＲＢｏｘの作製
実施例１（３）の手順で、Ｘｙｎ１をコードする遺伝子のプロモーターのシスエレメント（配列番号５）又はその相補鎖を３つ含み、両端にＸｂａＩサイトを含むＤＮＡ断片（３Ｂｏｘ及び３ＲＢｏｘ；配列番号４１及び４２）を構築した。さらに、配列番号５で示される配列の相補鎖を６つ含み、両端にＸｂａＩサイトを含むＤＮＡ断片（６ＲＢｏｘ；配列番号４３）を合成した。これらのＤＮＡ断片をそれぞれ用いて、実施例１（４）の手順で改変Ｘｙｎ３プロモーター含有プラスミドを作製した。
（２）プロモーターの誘導能の評価
実施例２の手順で、上記（１）で作製した改変Ｘｙｎ３プロモーターを含むＧＵＳレポーターカセット（図３）を構築し、次いで該ＧＵＳレポーターカセットを含むプロモーター解析用プラスミドを作製した。作製したプラスミドを用いて、実施例３の手順で、形質転換体３Ｂｏｘ株、３ＲＢｏｘ株及び６ＲＢｏｘ株を作製した。作製した形質転換体を用いて、ソフォロース（図４Ａ）もしくはキシラン（図４Ｂ）存在下で培養した細胞の抽出液におけるＧＵＳ活性を測定した。野生型（Ｄ０Ｃ株）のＧＵＳ活性を１００としたときの相対ＧＵＳ活性を求めた。
（３）結果
図４に、各形質転換体についての相対ＧＵＳ活性を表す。図４には、実施例３で測定した２ＲＢｏｘ株のデータも示す。ソフォロース及びキシランいずれの存在下においても、ＧＵＳレポーターの発現は、２ＲＢｏｘ株と比べて３Ｂｏｘ株及び３ＲＢｏｘ株で向上しており、６ＲＢｏｘ株ではさらに向上していた。これらの結果より、導入したＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントの数に従って、改変Ｘｙｎ３プロモーターのプロモーター活性が増加することが示唆された。
実施例５ 改変Ｘｙｎ３プロモーターを用いた酵素発現の評価
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ ｂｇｌ１（ａａｂｇｌ１）発現カセットの構築
ｐＡＢＧ７（Ｂｉｏｓｃｉ ｂｉｏｔｅｃｈ ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６２（８）：１６１５－１６１８）を鋳型として、ｘｙｎ３の上流配列を付加したプライマーａａｂｇｌ１＿ｘｙｎ３Ｐ（配列番号１９）およびｘｙｎ３の下流配列を付加したプライマーａａｂｇｌ１＿ｘｙｎ３Ｔ（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、両端にｘｙｎ３の上流及び下流配列が付加されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓのβ－グルコシダーゼ（ＡａＢＧＬ１）をコードする遺伝子（ａａｂｇｌ１）断片を得た。また、ｐＢｘｙｎ３ａｇ－Ｄ０Ｃを鋳型にプライマーａＸ３ｉｎｖｅｒｔ（配列番号２１）及びプライマーｓＸ３ｉｎｖｅｒｔ（配列番号２２）を用いて、ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。これらＰＣＲ産物をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ ａｄｖａｎｃｅｄ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａＢｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いてクローニングし、ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇｌ１を得た。ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇ１は、ｘｙｎ３の上流領域の制御下にａａｂｇｌ１遺伝子を、及び選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を下流領域のＮａｒＩサイトに持つ。マーカーをリサイクルするため、ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇｌ１を鋳型として、プライマーｒｅｃｙｉｎｖｅｒｔ３ａ（配列番号２３）及びプライマーｒｅｃｙｉｎｖｅｒｔ３ｓ（配列番号２４）を用いて、ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇｌ１のｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ産物（ａｍｄＳマーカーを除去）を構築した。
ＰＣ－３－７株のゲノムを鋳型として、プライマーｘｙｎ３ｒｅｐｓ（配列番号２５）及びｘｙｎ３ｒｅｐａ（配列番号２６）を用いてｘｙｎ３の下流領域７４８ｂｐを増幅し、ｐＵＣ１１８（Ｔａｋａｒａ）のＨｉｎｃＩＩサイトへと導入した（ｐＵｘｙｎ３ＤＲ）。ｐＵｘｙｎ３ＤＲをＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩにより切断し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＢｐｙｒ４（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトリコデルマ・リーセイ由来のｐｙｒ４遺伝子及びその上流、下流領域を含むＤＮＡ断片をクローニングしたプラスミド）をＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩにて切断し、ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をライゲーションして、ｐＢｐｙｒ４ＲＭ（ｐｙｒ４選択マーカーの下流にｘｙｎ３の下流領域が挿入された断片）を得た。ｐＢｐｙｒ４ＲＭを鋳型とし、ｘｙｎ３の下流領域の配列をそれぞれ付加したプライマーｒｅｃｙｃｌｅｘ３ｓ（配列番号２７）及びプライマーｒｅｃｙｃｌｅｘ３ａ（配列番号２８）にて増幅させた。得られた増幅断片と、ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇｌ１とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎすることで、ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇｌ１ｐｙｒ４ＲＭを獲得した。
ｐＢｘｙｎ３ａａｂｇｌ１ｐｙｒ４ＲＭをプライマーｘｙｎ１＿２Ｂｏｘ＿ｉｎｖ＿Ｒｖ（配列番号２９）及びＡａｂｇｌ１＿Ｆｗ（配列番号３０）にてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより増幅した。また、ｐＫＦｘｙｎ３－２ＲＢｏｘをプライマーｘｙｎ１＿２ｂｏｘ＿Ｆｗ（配列番号３１）およびプライマーｘｙｎ１＿２ｂｏｘ＿Ｒｖ（配列番号３２）にて増幅し、２ＲＢｏｘ領域（配列番号８）を含むＤＮＡ断片を取得した。これらＰＣＲ産物をライゲーションすることにより、ｘｙｎ３の上流領域が２ＲＢｏｘ領域を含むプロモーターに置き換えられたｐＢｘｙｎ３＿２ＲＢａａｂｇｌ１ｐｙｒ４ＲＭを得た。
（２）形質転換体の取得
上記（１）で構築したベクターｐＢｘｙｎ３＿２ＲＢａａｂｇｌ１ｐｙｒ４ＲＭをＳｓｐＩ及びＮｏｔＩにより切断し、これを宿主株に導入して形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，Ｊａｎ；１０９（１）：９２－９９）で行った。宿主株には、ＰＣ－３－７株を用いた。形質転換体は、ウリジン要求性に基づいた選抜のため、ウリジンを除いた最少培地にて培養した。形質転換体候補株は、アセトアミドを添加またはウリジンを除いた最少培地にて２回培養し、安定化した。相同組換え及び導入コピー数は、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）を用いてサザン解析にて確認した。得られた形質転換体を、Ｘ３＿２ＲＢ＿ＡＢ１と称した。
（３）培養
宿主株及び形質転換体は、ＤｉｆｃｏTM Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ（以下、ＰＤＡ）培地で生育させ、分生子は０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール溶液にて－８０℃で保管した。セルラーゼ生産のために、分生子１×１０7個を１％（ｗ／ｖ）アビセル（登録商標）（微結晶セルロース）、又は１％（ｗ／ｖ）アビセル（登録商標）及び０．５％（ｗ／ｖ）キシランを炭素源とした培地（０．１４％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％（ｗ／ｖ）ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢａｃｔｏTM Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢａｃｔｏTM Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（上述）、５０ｍＭ酒石酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０））５０ｍＬに植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍで５日間培養した。培養上清はミラクロスでのろ過により回収し、酵素標品として使用した。
（４）酵素分析
Ｘ３＿２ＲＢ＿ＡＢ１株（改変プロモーター導入によるＢＧＬ活性強化株）及びＰＣ－３－７株（宿主）の培養上清について、酵素活性及びタンパク質量を測定した。培養上清は１２．５％のポリアクリルアミドによりＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０にて染色した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分子量決定のために使用した。タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ法によりウシ免疫グロブリンを標準として求めた。
アビセラーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅ）、及びキシラナーゼ活性は、酵素反応で得られた還元糖量を３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定することで算出した。アビセラーゼ活性測定の酵素反応は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）に終濃度１％（ｗ／ｖ）アビセル（登録商標）を懸濁させた反応液を用いて５０℃で３０分間行った。ＣＭＣａｓｅ活性測定の酵素反応は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーに４０ｍＭカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を溶解させた反応液を用いて５０℃で１５分間行った。キシラナーゼ活性測定の酵素反応は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーに１％（ｗ／ｖ）ｂｉｒｃｈ ｗｏｏｄ ｘｙｌａｎを溶解させた反応液を用いて５０℃で１０分間行った。１Ｕの活性は、グルコース（又はキシロース）１μｍｏｌ相当を１分で作り出す酵素量と定義した。セロビアーゼ活性測定では、５０ｍＭ酢酸バッファーに終濃度２０ｍＭセロビオース（シグマ）を添加した反応液中で酵素を５０℃、１０分間反応させた後、Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃ２ ｋｉｔ（和光）によりグルコース濃度を測定した。セロビアーゼ活性の１Ｕはグルコース２μｍｏｌを１分間に作り出す酵素量とした。
培養上清サンプル中のａａＢＧＬの発現を抗ＢＧＬ抗体によるウエスタンブロッティング法を用いて観察した。ウエスタンブロッティングは、セミドライ式ブロッティング装置（ＡＴＴＯ社）を用いて行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質分離後、タンパク質をイモビロン－Ｐ メンブレン（メルクミリポア）に転写した。タンパク質の検出は、ＥＣＬ ｓｅｌｅｃｔ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア）を用いた。抗ａａＢＧＬ抗体は、精製したａａＢＧＬを抗原にウサギ免疫による抗体を作成したものを使用した。また、ＨＲＰ標識二次抗体は、ＧＥヘルスケアのものを使用して検出した。ウエスタンブロッティング解析の結果、Ｘ３＿２ＲＢ＿ＡＢ１株ではＡａＢＧＬ１のバンドが１３０ｋＤａ付近に観察され、ＰＣ－３－７株（宿主）では観察されなかった。（図５）。Ｘ３＿２ＲＢ＿ＡＢ１株で１３０ｋＤａ付近のバンドが２本観察されたが、これらは、いずれもＰＣ－３－７株（宿主）では観察されていないことから、非特異バンドではなく、ＡａＢＧＬへの糖鎖修飾により泳動時の分子量サイズが変化したために生じたものであると考えられた。
Ｘ３＿２ＲＢ＿ＡＢ１株及びＰＣ－３－７株におけるタンパク質量、ならびにアビセラーゼ、ＣＭＣａｓｅ、セロビアーゼ、及びキシラナーゼ活性の測定結果を表１に示す。ＣＭＣａｓｅ活性とキシラナーゼ活性は、Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株とＰＣ－３－７株で同等であったが、セロビアーゼ活性は、Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株において３５．０Ｕ／ｍＬ（アビセル（登録商標）含有培地）及び１７．７Ｕ／ｍＬ（アビセル（登録商標）＋キシラン含有培地）であり、これらは、ＰＣ－３－７株よりもそれぞれ約１２０倍及び約８５倍増加していた。またアビセラーゼ活性も、Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株は、宿主株よりも約３０％高い活性を示した。これらの結果から、セルロースやセルロースおよびキシラン存在下での培養において、２ＲＢｏｘプロモーターが下流に連結したＡａＢＧＬ１の遺伝子を効率的に発現させたことが示唆された。
Figure 0007138505000001
（５）転写解析
改変Ｘｙｎ３プロモーターの転写レベルでの評価を行うため、ＰＣ－３－７株とＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株の転写解析を行った。ＰＣ－３－７株とＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株を０．３％（ｗ／ｖ）グルコース含有培地で２日間培養し、休止菌体を獲得した。得られた菌体を０．０１％（ｗ／ｖ）ソフォロース（セルロース系基質、強いセルラーゼ誘導物質）又は０．１％（ｗ／ｖ）キシラン（キシラン系基質）を唯一の炭素源とした誘導培地にて１、３、６、及び９時間培養した後、転写解析を行って遺伝子発現を調べた。転写解析のターゲット遺伝子として、主要なセルラーゼ遺伝子ｃｂｈ１、主要なキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ１、セルラーゼ生産に必須な転写活性化因子ｘｙｒ１、キシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３、及びａａｂｇｌ１を解析した。遺伝子発現は定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し、β－ａｃｔｉｎ （ａｃｔ１）の発現レベルを１としたときの相対発現レベルを求めた。
結果を図６及び図７に示す。ソフォロース誘導下、ｃｂｈ１、ｘｙｒ１、及びｘｙｎ３の発現レベルはＰＣ－３－７株及びＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株で同等であった（図６）。また従来知られているとおり、ソフォロース誘導下ではｘｙｎ１は発現しなかった（データ示さず）。一方で、キシラン誘導下では、ＰＣ－３－７株、Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株ともに、ｘｙｎ３は発現せず、ｘｙｎ１は高い発現レベルであった（図７）。これらの結果は、これらの遺伝子のプロモーター活性に関する従来の知見と一致する。一方、Ｘ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株では、ソフォロース誘導下及びキシラン誘導下ともにａａｂｇｌ１の発現がみられ、これらの誘導物質が改変Ｘｙｎ３プロモーターを活性化させていることが示された。
実施例６ ＱＭ９４１４株（Ｘｙｎ３非発現株）における改変Ｘｙｎ３プロモーターによるＡａＢＧＬ１の発現
Ｘｙｎ３はトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株で本来発現するが、その先祖に当たるトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株では本来発現しない。本実施例では、改変Ｘｙｎ３プロモーターがＱＭ９４１４株で機能する可能性を検討した。
実施例５と同様の手順で、ただし形質転換体の宿主としてＱＭ９４１４株を用いて、２ＲＢｏｘ領域（配列番号８）を含む改変Ｘｙｎ３プロモーターの制御下にａａｂｇｌ１を導入した発現カセットを含むプラスミドであるｐＢｘｙｎ３＿２ＲＢａａｂｇｌ１ｐｙｒ４ＲＭを導入した形質転換体ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１を作製した。さらに、ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株及び宿主ＱＭ９４１４株における酵素活性を、実施例５（４）と同様の手順で測定した。ただし誘導培地中のキシランの濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）とした。さらに、実施例５（５）と同様の手順でａａｂｇｌ１の転写活性を調べた。
ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株の培養上清のウエスタンブロッティング解析において、ＡａＢＧＬ１のバンドが観察された（図８）。さらに、ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株は、タンパク質量、ならびにアビセラーゼ活性、及びセロビアーゼ活性が、ＱＭ９４１４（宿主）よりも高い値を示した（表２）。また転写解析の結果、ＱＭＸ３－２ＲＢ＿ＡＢ１株では、ソフォロース（セルロース系基質）誘導下（図９Ａ）及びキシラン（キシラン系基質）誘導下（図９Ｂ）の両方でａａｂｇｌ１の転写が確認され、改変プロモーター制御下でａａｂｇｌ１の転写が促進されたことが示された。
Figure 0007138505000002
実施例７ 改変Ｘｙｎ３プロモーターを用いたＸｙｎ３発現の評価
（１）トリコデルマ・リーセイＸｙｎ３発現カセットの構築
ＰＣ－３－７株ゲノムを鋳型とし、プライマーｐｙｒ４＿Ｆｗ（配列番号３３）及びプライマーｐｙｒ４＿Ｒｖ（配列番号３４）を用いて、ｐｙｒ４の上流領域２，２７４ｂｐ及び下流領域１，２４４ｂｐ、ならびにｐｙｒ４ ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をＨｉｎｃＩＩにて線上化したｐＵＣ１１８に挿入し、ｐＵΔｐｙｒ４を作製した。
実施例５で作製したｐＢｘｙｎ３＿２ＲＢａａｂｇｌ１ｐｙｒ４ＲＭを鋳型とし、プライマーａＸ３ｉｎｖｅｒｔ（配列番号２１）及びプライマーｓＸ３ｉｎｖｅｒｔ（配列番号２２）を用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。また、ＰＣ－３－７株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーｘｙｎ３＿Ｆｗ（配列番号３５）及びプライマーｘｙｎ３＿Ｒｖ（配列番号３６）を用いてｘｙｎ３ ＯＲＦを増幅させ、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）にてリン酸基付加を行った。これらＤＮＡ断片をライゲーションすることで、ｐＢｘｙｎ３＿２ＲＢｘｙｎ３ｐｙｒ４ＲＭを作製した。
（２）形質転換体の取得
（１）で作製したｐＵΔｐｙｒ４をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩにて消化した断片を調製し、これを宿主にプロトプラスト－ＰＥＧ法にて導入した。宿主株としては、Ｅ１ＡＢ１株（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，８２：８９－９５）を用いた。１０ｍＭ ＦＯＡおよび２０ｍＭウリジンを添加した最少培地にて選抜を行い、Ｅ１ＡＢ１株Δｐｙｒ４株を取得した。次いで、Ｅ１ＡＢ１株Δｐｙｒ４に、（１）で作製したｐＢｘｙｎ３＿２ＲＢｘｙｎ３ｐｙｒ４ＲＭをＡｐａＩ及びＮｏｔＩで消化した断片を導入した。ウリジンを含まない最少培地にて選択された形質転換体候補株のうち、最も高い糖化能を示した形質転換体をＥ１ＡＢ１＿Ｘ３－２ＲＢＸ３株として取得した。
（３）形質転換体の培養
形質転換体の酵素生産性は、以下に示す培養により評価した。前培養として５００ｍＬフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、１×１０５個／ｍＬとなるよう胞子を植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りである：１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．１４％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトンＮ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）。なおＴｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２の組成は以下の通りである：６ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、２６ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ２を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。
２日間の前培養後、ジャーファーメンター（バイオット社製ＢＴＲ－２５ＮＡ１Ｓ－８Ｍ）を用いて本培養を行った。上記前培養液を１０％（ｖ／ｖ）植菌し、５日間培養した。炭素源として１０％（ｗ／ｖ）アビセル（登録商標）＋２％（ｗ／ｖ）キシランとし、その他の培地成分は、０．４２％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％（ｗ／ｖ）ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトンＮ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（上述）、０．２％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｆｏａｍ ＰＥ－Ｌである。ジャーファーメンターの設定は以下の通りである：温度２８℃、ｐＨ４．５、撹拌数はＤＯ＝３．０ｐｐｍを一定に保つよう変動。
実施例５（３）と同様の手順で培養上清を回収し、タンパク質の濃度をｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。ｂｒａｄｆｏｒｄ法では、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質とした検量線をもとにタンパク質量を計算した。その際、Ｅ１ＡＢ１株培養上清（ＪＮ１３）中のタンパク質量を１としたときの、Ｅ１ＡＢ１＿Ｘ３－２ＲＢＸ３株の培養上清（ＪＮ２４）中のタンパク質量の相対比を求めた。その結果、ＪＮ２４は、ＪＮ１３株に比べてタンパク質生産性が２３％向上していた。
各培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を行った結果、ＪＮ２４では、元株の培養上清であるＪＮ１３と比べて、Ｘｙｎ３のバンドのみが非常に増加していることが観察された（図１０）。このＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドの濃淡をＩｍａｇｅ Ｌａｂ（バイオラット）を用いて数値化し、各酵素のタンパク質量比を算出した。その算出値と上清のタンパク質量からＪＮ１３とＪＮ２４それぞれに含まれる酵素量を算出し比較した結果、ＪＮ１３とＪＮ２４ではほとんどの酵素が同等量であったのに対し、Ｘｙｎ３だけがＪＮ２４で４倍以上増加していた。よって、ＪＮ２４で生産向上したタンパク質のほとんどはＸｙｎ３であることがわかった。このことから、改変Ｘｙｎ３プロモーターが、ジャーファーメンター培養においてもタンパク質を高発現させることが可能なプロモーターであることが示された。
以上の実施例に用いたプライマーの配列を以下の表３～４に示す。
Figure 0007138505000003
Figure 0007138505000004

Claims (19)

  1. 改変プロモーターであって、
    該改変プロモーターは、Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドにおける配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチドが置換又は挿入されているポリヌクレオチドからなり、
    該置換又は挿入前のＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
    であり、
    該改変プロモーターに置換又は挿入されたＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなり、かつ
    該１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない、
    改変プロモーター。
  2. 前記置換又は挿入の前のＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
    である、請求項１記載の改変プロモーター。
  3. 前記置換又は挿入の前のＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
    である、請求項１記載の改変プロモーター。
  4. 前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を１～１０個含む、請求項１～３のいずれか１項記載の改変プロモーター。
  5. 前記配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、請求項４記載の改変プロモーター。
  6. 前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖；
    配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、
    配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    である、請求項４又は５記載の改変プロモーター。
  7. 請求項１～６のいずれか１項記載の改変プロモーターを含有するベクター。
  8. 前記改変プロモーターが目的遺伝子の上流に連結されている請求項７記載のベクター。
  9. 前記目的遺伝子が、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドであるか、又は配列番号３９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドである、請求項８記載のベクター。
  10. 目的遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された請求項１～６のいずれか１項記載の改変プロモーターとを含む、ＤＮＡ断片。
  11. 前記目的遺伝子が、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドであるか、又は配列番号３９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなりキシラナーゼをコードするポリヌクレオチドである、請求項１０記載のＤＮＡ断片。
  12. 請求項７～９のいずれか１項記載のベクター又は請求項１０もしくは１１記載のＤＮＡ断片を含む形質転換体。
  13. トリコデルマ属菌である、請求項１２記載の形質転換体。
  14. 改変プロモーターの製造方法であって、
    Ｘｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドにおいて、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に、１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含むポリヌクレオチドを置換又は挿入することを含み、
    該置換又は挿入の前のＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域にＧＧＣＴＡＴ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＴＧＣＣ（配列番号２）で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
    であり、
    該改変プロモーターに置換又は挿入されたＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチドが、ＧＧＣＴＡＡ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＴＴＡＧＣＣ（配列番号４）で示されるヌクレオチド配列からなり、かつ
    該１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有するポリヌクレオチドが、ＨＡＰ２／３／５結合サイト及びＣＲＥＩ結合サイトを含まない、
    方法。
  15. 前記置換又は挿入の前のＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０８４番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
    である、請求項１４記載の方法。
  16. 前記置換又は挿入の前のＸｙｎ３プロモーターのポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    配列番号１の３～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１の３５０番～１０７３番ヌクレオチドで示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であって、配列番号１の３７４番～４０１番ヌクレオチドに相当する領域に配列番号２で示される配列を含むヌクレオチド配列からなり、かつセルロースに誘導されるプロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
    である、請求項１４記載の方法。
  17. 前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチドが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を１～１０個含む、請求項１４～１６のいずれか１項記載の方法。
  18. 前記配列番号４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１７記載の方法。
  19. 前記１つ以上のＸｙｎ１プロモーターのシスエレメントのポリヌクレオチド又はその相補鎖、を含有するポリヌクレオチドが、以下：
    配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖；
    配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号８で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、
    配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    である、請求項１７又は１８記載の方法。
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