JP6470967B2 - 変異キシラナーゼ - Google Patents
変異キシラナーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP6470967B2 JP6470967B2 JP2014262088A JP2014262088A JP6470967B2 JP 6470967 B2 JP6470967 B2 JP 6470967B2 JP 2014262088 A JP2014262088 A JP 2014262088A JP 2014262088 A JP2014262088 A JP 2014262088A JP 6470967 B2 JP6470967 B2 JP 6470967B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- xylanase
- position corresponding
- acid residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims description 227
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 110
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 106
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 70
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 63
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 39
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 37
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 12
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 49
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 25
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 15
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 102220558319 Olfactory receptor 2C3_R129S_mutation Human genes 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 12
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 11
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 8
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000135044 Thermobifida fusca YX Species 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 102220498322 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain_R40S_mutation Human genes 0.000 description 6
- 102220471613 Protein angel homolog 1_R56A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010335 hydrothermal treatment Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 3
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 3
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710166469 Endoglucanase Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000203780 Thermobifida fusca Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LMPDLIQFRXLCMO-UHFFFAOYSA-L dipotassium;hydrogen phosphate;phosphoric acid Chemical compound [K+].[K+].OP(O)(O)=O.OP([O-])([O-])=O LMPDLIQFRXLCMO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 2
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HBDJFVFTHLOSDW-DNDLZOGFSA-N (2r,3r,4r,5r)-2,3,5,6-tetrahydroxy-4-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanal;hydrate Chemical compound O.O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HBDJFVFTHLOSDW-DNDLZOGFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NAQWICRLNQSPPW-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C21 NAQWICRLNQSPPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 244000301850 Cupressus sempervirens Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 1
- 101710098246 Exoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001237728 Precis Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241001647802 Thermobifida Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241001105588 Xylanimonas Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 108010038658 exo-1,4-beta-D-xylosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003017 maltose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- -1 newspaper Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下:
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼを提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下:
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法を提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下:
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法を提供する。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman−Pearson法(Science,1985,227:1435−1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
糖化残渣吸着率(%)=100−相対比活性(%)
相対比活性(%)=(糖化残渣との反応後の酵素試料のキシラナーゼ活性/糖化残渣と未反応の酵素試料のキシラナーゼ活性)×100
上記相対比活性がより低いキシラナーゼほど、より高い糖化残渣吸着性を有する。糖化残渣としては、例えば、リグニン、又は公知のセルラーゼ若しくはセルラーゼ製剤(例えば、ノボザイムズ社製Cellic(登録商標)CTec2)を用いてアルカリ混合粉砕バガスを24時間50℃で糖化した後の固形残渣を用いることができる。糖化残渣とキシラナーゼとの反応には、例えば、50℃で1時間の処理を採用することができる。キシラナーゼの糖化残渣吸着性の測定のための具体的手順の例は、後述の実施例に詳述されている。
本発明は、糖化残渣吸着性が低減した変異キシラナーゼを提供する。本発明の変異キシラナーゼは、配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するキシラナーゼを改変して、所定の位置の塩基性アミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基に置換することによって製造することができる。
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、変異キシラナーゼを提供する。
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む。
配列番号2の10位に相当する位置;セリン
配列番号2の40位に相当する位置;セリン
配列番号2の56位に相当する位置;アラニン
配列番号2の129位に相当する位置;セリン
配列番号2の158位に相当する位置;セリン
本発明においては、親キシラナーゼのアミノ酸配列の上記に挙げた位置における塩基性アミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換する。これによって、親キシラナーゼの糖化残渣吸着性を低減することができる。
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む。上記アミノ酸置換に供されるべき親キシラナーゼ、上記置換すべき位置のうちの好ましい位置、上記置換すべき位置に加えて置換され得るさらなる位置、それらの位置における好ましい置換後のアミノ酸残基については、上述したとおりである。
本発明の変異キシラナーゼは、例えば、上記本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、当該変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。すなわち、当該変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有する本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドが発現して、本発明の変異キシラナーゼが生産される。生産された変異キシラナーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明の変異キシラナーゼを取得することができる。
本発明の変異キシラナーゼは、糖化残渣の吸着率が低いため、バイオマスを効率よく糖化することができる。したがって、本発明の変異キシラナーゼは、バイオマスの糖化のため、又はバイオマスからの糖の製造のために好適に使用することができる。
したがって、本発明はさらに、上記本発明の変異キシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマス糖化方法を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下:
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼ。
配列番号2の10位に相当する位置;
配列番号2の40位に相当する位置;及び
配列番号2の56位に相当する位置;
からなる群より選択される少なくとも1つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、上記<1>又は<2>記載の変異キシラナーゼ。
配列番号2の10位に相当する位置;セリン
配列番号2の40位に相当する位置;セリン
配列番号2の56位に相当する位置;アラニン
配列番号2の129位に相当する位置;セリン
配列番号2の158位に相当する位置;セリン
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下:
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法。
配列番号2の10位に相当する位置;
配列番号2の40位に相当する位置;及び
配列番号2の56位に相当する位置;
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、上記<8>又は<9>記載の方法。
配列番号2の10位に相当する位置;セリン
配列番号2の40位に相当する位置;セリン
配列番号2の56位に相当する位置;アラニン
配列番号2の129位に相当する位置;セリン
配列番号2の158位に相当する位置;セリン
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下:
配列番号2の129位に相当する位置;及び
配列番号2の158位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法。
配列番号2の10位に相当する位置;
配列番号2の40位に相当する位置;及び
配列番号2の56位に相当する位置;
からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、上記<14>又は<15>記載の方法。
配列番号2の10位に相当する位置;セリン
配列番号2の40位に相当する位置;セリン
配列番号2の56位に相当する位置;アラニン
配列番号2の129位に相当する位置;セリン
配列番号2の158位に相当する位置;セリン
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においては、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ)を使用し、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)又はPrimeSTAR GXL DNA Polymerase(タカラバイオ)と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センスプライマーとアンチセンスプライマーを各々20pmol、及びPrimeSTAR Max Premixを10μL添加して、反応液総量を20μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55〜60℃で10秒間及び72℃で10〜90秒間(目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり10秒)の3段階の温度変化を30回繰り返すことにより行った。
タンパク質の定量にはLowry法を用いた。酵素溶液は適切な濃度にイオン交換水で希釈した後、DCプロテインアッセイ(バイオラッド)を用いて定量した。Reagent A 1mLに対してReagent Sを20μLの割合で混合し、タンパク質5μLに対してこの混合液を25μL添加した。さらにReagent B(発色液)を158μL添加し、15分間室温で静置した。マイクロプレートリーダー(Versa max、Molecular Devices)で750nmの吸光度を測定し、BSAの検量線からタンパク質の濃度を定量した。
キシラナーゼ活性の測定は3,5−ジニトロサリチル酸(DNS)法にて、生成糖の還元末端を定量化した。終濃度可溶キシラン1%(w/v)(2%(w/v)xylan from beechwood(Sigma Aldrich)を1分間煮沸し、室温に静置後、遠心分離により得られた上清を可溶キシランとした)、50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)、酵素10μLを混合し、50℃で10分間反応させた。反応終了後、100μLのDNS溶液(水酸化ナトリウム(和光純薬工業)1.6%(w/v)、ジニトロサリチル酸(和光純薬工業)0.5%(w/v)、酒石酸ナトリウムカリウム(和光純薬工業)30.0%(w/v))を添加し、99.9℃で10分間反応させた。マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイスジャパン)で波長540nmの吸光度を測定することにより、生成糖の還元末端を定量化した。検量線にはキシロースを用いた。
(1)バガス調製
バガス(サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量71.3質量%、結晶化度29%、水分量7.0質量%)を減圧乾燥機VO−320(アドバンテック東洋)中に入れ、窒素流通下の条件で2時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量71.3質量%、結晶化度29%、水分量2.0質量%の乾燥バガスを得た。
(2)混合粉砕処理
得られた乾燥バガス100gと粒径0.7mmの粒状の水酸化ナトリウム「トーソーパール」(東ソー社製)8.8g(ホロセルロースを構成するAGU1モルに対し0.5モル相当量)を、バッチ式振動ミルMB−1(中央化工機:容器全容積3.5L、媒体としてφ30mm、長さ218mm、断面形状が円形のSUS304製ロッドを13本使用、ロッド充填率57%)に投入し、2時間粉砕処理することでバガス粉砕物(平均粒子径約16.6μm)を得た。
参考例4で調製したアルカリ混合粉砕バガス5%(w/v)、セルラーゼ製剤Cellic(登録商標)CTec2(ノボザイムズ社)5mg/g−バイオマス、30μg/mLテトラサイクリン塩酸塩(wako)、0.6μg/mLエリスロマイシン(wako)を含む10mLの液を、25mLの自立型遠沈管中で50℃、150rpm(タイテック:BR−40F)にて24時間反応させ、バガスを糖化させた。反応終了後、遠心分離(11000rpm×10分)により上清を除去し、50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)で2回洗浄し、固形分を回収した。得られた糖化残渣を(以下、CTec2糖化残渣という)を、以下のキシラナーゼ吸着性解析に用いた。
参考例5で調製した糖化残渣を基質として用い、キシラナーゼの吸着挙動を解析した。参考例5で調製した糖化残渣の質量を検量線より算出し、所定濃度の糖化残渣(基質)、50mM酢酸ナトリウムバッファー、キシラナーゼ50〜158μg/mLを含む0.5〜1mLの反応液を、2mLのエッペンドルフチューブ又は96穴ディープウェルプレート(Thermo SIENTIFIC)で、50℃、150rpmにて1時間振盪した。反応終了後、遠心分離(11000rpm、5分、4℃)にて上清を回収し、キシラナーゼ活性を前述のDNS法で測定した。下記式で示すように、基質濃度0mg/mLの場合の活性を100とし、基質と反応させた反応液の上清のキシラナーゼ相対比活性を算出した。得られた活性値を100から減算することでキシラナーゼの糖化残渣吸着率を算出した。
糖化残渣吸着率(%)=100−相対比活性(%)
相対比活性(%)=(糖化残渣を添加した反応液上清のキシラナーゼ活性/糖化残渣未添加の反応液上清のキシラナーゼ活性)×100
(1)キシラナーゼ遺伝子含有ベクターの作製
サーモビフィダ・フスカ YX株(Tfu)をTrypticase Soy Agar培地(3.0%Trypticase Soy、2.0%Agar)に植菌し、28℃にて1日間培養した。培養で得られた菌体から、UltraCleanTMMicrobial DNA Isolation Kit(Mo Bio Laboratories,Inc.)を用いてゲノムDNAを取得した。
キシラナーゼ触媒ドメイン(CD)をコードする遺伝子の発現ベクターを作製するために、上述のTfu−Xyn遺伝子が挿入された組み換えプラスミドを鋳型とし、表1に示したフォワードプライマーTfu−CD−Xyn F(配列番号12)とリバースプライマーTfu−CD−Xyn R(配列番号13)を用いたPCRにて、Tfu−XynのCDをコードする遺伝子を含む約5.6〜6.0kbp断片を増幅した。プライマーの作製はPrimeSTAR(登録商標)Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ)のマニュアルに従った。遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit(Roche製)にて精製した。精製したPCR断片2μLを用いてコンピテンとセルE.coli DH5α(タカラバイオ)20μLを形質転換した。以下において、Tfu由来キシラナーゼ触媒ドメインをTfu−CD−Xynということがある。
Tfu−CD−Xynの変異キシラナーゼを作製した。上記(2)のTfu−CD−Xynをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表2記載のプライマーを用いてPCRを行い、それぞれ、配列番号2の129位又は158位に相当する位置のアミノ酸の変異を含む変異キシラナーゼ(それぞれ、R129S及びR158Sと表記する)をコードするDNA断片を増幅した。すなわち、R129Sについては、配列番号3の511〜513番ヌクレオチドcgt(アルギニン;R)をtca(セリン;S)へ置換した。R158Sについては、配列番号3の598〜600番ヌクレオチドaga(アルギニン;R)をtca(セリン;S)へ置換した。
さらに、R129S及びR158Sの両変異を含む変異キシラナーゼ(R129S/R158S)をコードする遺伝子を含むDNA断片も作製した。
次いで、上記(2)と同様の方法で、各変異体をコードするDNAを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
表3記載のプライマーを用いて、上記(3)と同様の手順で、配列番号2の10位、40位、又は56位に相当する位置のアミノ酸の変異を含む変異キシラナーゼ(それぞれ、H10S、R40S、及びR56Aと表記する)をコードするDNA断片を増幅した。すなわち、H10Sについては、配列番号3の154〜156番ヌクレオチドcat(ヒスチジン;H)をtca(セリン;S)へ置換した。R40Sについては、配列番号3の244〜246番ヌクレオチドaga(アルギニン;R)をtca(セリン;S)へ置換した。R56Aについては、配列番号3の292〜294番ヌクレオチドcgg(アルギニン;R)をgca(アラニン;A)へ置換した。
次いで、上記(2)と同様の方法で、各変異体をコードするDNAを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
さらに、R129S/R158Sをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表3記載のプライマーを用いてPCRを行い、R129S及びR158Sとともに、H10S、R40S又はR56Aの変異を含む変異キシラナーゼ(それぞれ、R129S/R158S/H10S、R129S/R158S/R40S、及びR129S/R158S/R56Aと表記する)をコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。
次いで、上記(2)と同様の方法で、各変異体をコードするDNAを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
上記(3)〜(5)で精製したプラスミドを、プロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,168:111−115)に従って、宿主菌に導入した。宿主には、枯草菌168株から9つの菌体外プロテアーゼを欠損させたKA8AX、又は168株から8つの菌体外プロテアーゼを欠損させ、タンパク質のフォールディング効率を向上させたD8PA株を使用した。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有DM3再生寒天培地(バクトカザミノ酸(Difco)0.5%(w/v)、酵母エキス(Difco)0.5%(w/v)、コハク酸二ナトリウム六水和物(和光純薬工業)4.05%(w/v)、リン酸一水素二カリウム(和光純薬工業)0.35%(w/v)、リン酸二水素一カリウム(和光純薬工業)0.15%(w/v)、グルコース(和光純薬工業)0.1%(w/v)、塩化マグネシウム(和光純薬工業)20mM、牛血清アルブミン(和光純薬工業)0.01%(w/v)、トリパンブルー0.005%(w/v)(ACROS ORGANICS)、テトラサイクリン塩酸塩(和光純薬工業)0.005%(w/v)、カルボキシメチルセルロース1.0%(w/v)、寒天1.0%(w/v))を用いた。
実施例1で調製した変異キシラナーゼについて、参考例6記載の手順(糖化残渣濃度は10mg/mL)にて、糖化残渣に対する吸着率を解析した。結果を表4〜表6に示す。キシラナーゼ変異体R129S及びR158Sは、野生型(Tfu−CD−Xyn)と比較して、糖化残渣吸着率が大きく低減していた。また、両変異を組み合わせた二重変異体R129S/R158Sでは、糖化残渣吸着率はさらに低減した(表4)。キシラナーゼ変異体R40S及びR56Aも、野生型と比較して糖化残渣吸着率が低減していた(表5)。R40S又はR56Aと、R129S/R158Sとを組み合わせた多重変異体では、糖化残渣吸着率の低減がさらに顕著であった(表6)。一方、H10Sの単独変異体では、糖化残渣吸着率の低減は観察されなかった(表5)が、H10SとR129S/R158Sとを組み合わせた多重変異体では、糖化残渣吸着率が顕著に低減した(表6)。
Claims (15)
- 変異キシラナーゼであって、
配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下:
配列番号2の129位に相当する位置におけるセリン;及び
配列番号2の158位に相当する位置におけるセリン、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼ。 - 前記配列番号2の129位に相当する位置及び158位に相当する位置にセリンを有する、請求項1記載の変異キシラナーゼ。
- さらに、以下:
配列番号2の10位に相当する位置におけるセリン;
配列番号2の40位に相当する位置におけるセリン;及び
配列番号2の56位に相当する位置におけるアラニン;
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を有する、請求項1又は2記載の変異キシラナーゼ。 - さらに糖質結合モジュールを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の変異キシラナーゼ。
- 変異キシラナーゼの製造方法であって、
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下:
配列番号2の129位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換;及び
配列番号2の158位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、
方法。 - 前記配列番号2の129位に相当する位置及び158位に相当する位置におけるアミノ酸残基をセリンに置換することを含む、請求項5記載の方法。
- さらに、以下:
配列番号2の10位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換;
配列番号2の40位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換;及び
配列番号2の56位に相当する位置におけるアミノ酸残基のアラニンへの置換;
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、請求項5又は6記載の方法。 - キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下:
配列番号2の129位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換;及び
配列番号2の158位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、
方法。 - 前記配列番号2の129位に相当する位置及び158位に相当する位置におけるアミノ酸残基をセリンに置換することを含む、請求項8記載の方法。
- さらに、以下:
配列番号2の10位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換;
配列番号2の40位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換;及び
配列番号2の56位に相当する位置におけるアミノ酸残基のアラニンへの置換;
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、請求項8又は9記載の方法。 - 請求項1〜4のいずれか1項記載の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項11記載のポリヌクレオチド又は請求項12記載のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤。
- 請求項14記載のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014262088A JP6470967B2 (ja) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 変異キシラナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014262088A JP6470967B2 (ja) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 変異キシラナーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016119877A JP2016119877A (ja) | 2016-07-07 |
JP6470967B2 true JP6470967B2 (ja) | 2019-02-13 |
Family
ID=56326378
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014262088A Active JP6470967B2 (ja) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 変異キシラナーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6470967B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020203782A1 (ja) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 株式会社ヤクルト本社 | 食事由来の多糖の利用性が高い新規ビフィドバクテリウム属細菌 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2628795A1 (en) * | 2008-06-06 | 2013-08-21 | Danisco US Inc. | Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity to non-cellulosic materials |
JP2013243953A (ja) * | 2012-05-24 | 2013-12-09 | Kao Corp | キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 |
JP2015167552A (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-28 | 花王株式会社 | 変異キシラナーゼ |
-
2014
- 2014-12-25 JP JP2014262088A patent/JP6470967B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016119877A (ja) | 2016-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7007645B2 (ja) | 変異型bxl1遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法 | |
WO2016054176A1 (en) | Compositions comprising beta-mannanase and methods of use | |
US10550376B2 (en) | Xylanase | |
EP2928911A2 (en) | Compositions of beta-mannanase and methods of use | |
CN113234695A (zh) | Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸 | |
CN111770996B (zh) | 突变β-葡萄糖苷酶 | |
WO2015137334A1 (ja) | 変異キシラナーゼ | |
JP7208762B2 (ja) | 新規アラビノフラノシダーゼ | |
JP6470967B2 (ja) | 変異キシラナーゼ | |
WO2013176205A1 (ja) | キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 | |
WO2017217453A1 (ja) | セルラーゼ | |
CN111757939B (zh) | 突变β-葡萄糖苷酶 | |
JP6849749B2 (ja) | 新規キシラナーゼ | |
WO2016054185A1 (en) | Compositions comprising beta-mannanase and methods of use | |
EP2929023A1 (en) | Compositions and methods of use | |
WO2015076260A1 (ja) | 耐熱性キシラナーゼ | |
WO2016054163A1 (en) | Compositions comprising beta mannanase and methods of use | |
JP2023145205A (ja) | バイオマス糖化のための酵素組成物 | |
JP2023145206A (ja) | バイオマス糖化のための酵素組成物 | |
JP2013243953A (ja) | キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 | |
JP2013243954A (ja) | キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 | |
EP3201334A1 (en) | Compositions comprising beta-mannanase and methods of use | |
WO2016054205A1 (en) | Compositions comprising beta mannanase and methods of use | |
WO2016054168A1 (en) | Compositions comprising beta mannanase and methods of use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170925 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180828 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181022 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190108 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190121 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6470967 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |