JP6542124B2 - 胎児型ヘモグロビンの再誘導のためのbcl11a遠位調節エレメントの標的化 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年11月27日付で出願された米国仮特許出願第61/730,323号の、2012年11月27日付で出願された米国仮特許出願第61/730,369号の、2013年3月11日付で出願された米国仮特許出願第61/776,144号の、および2013年10月10日付で出願された米国仮特許出願第61/889,174号の米国特許法第119条(e)下での恩典を主張するものであり、その各々の内容の全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号5RO1HL032259の下で政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。
正常な成人型ヘモグロビンには、4つのグロビンタンパク質が含まれており、そのうちの2つは、アルファ(α)タンパク質であり、残りの2つは、ベータ(β)タンパク質である。哺乳類、特にヒトの胎児発達過程において、胎児は、胎児型ヘモグロビンを産生し、胎児型ヘモグロビンには、2つのβグロビンタンパク質の代わりに、2つのガンマ(γ)グロビンタンパク質が含まれている。新生児期には、胎児スイッチ(fetal switch)とも呼ばれるグロビンスイッチが起こり、この時、赤血球系前駆細胞は、主にγグロビンの産生から、主にβグロビンの産生へと切り替わる。主に胎児型ヘモグロビンすなわちHbF(α2γ2)の産生から成人型ヘモグロビンすなわちHbA(α2β2)の産生への発達期の切り替わりは、妊娠28から34週目頃に始まり、生後間もない時期まで続き、HbAが優勢となる。この切り替わりは、主に、γグロビン遺伝子の転写が低下し、βグロビン遺伝子の転写が活性化することによる。正常な成人の血液は、平均で1%未満のHbFを含むが、健康な成人に残存するHbFレベルには、20倍を超える変動幅が認められており、遺伝的に制御されている。
BCL11A発現をゲノムレベルで破壊することにより細胞中の胎児型β-グロビンレベルを増加させるための方法および組成物が本明細書において提供される。胎児型β-グロビンレベルの再誘導による異常ヘモグロビン症の処置に関する方法および組成物も本明細書において提供される。
[本発明1001]
減少したBCL11A mRNAまたはタンパク質の発現を有する前駆細胞を産生するための方法であって、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612 (UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の細胞ゲノムDNAに結合する薬剤と、単離された前駆細胞を接触させ、それによってBCL11AのmRNAまたはタンパク質の発現を低減させる段階を含む、方法。
[本発明1002]
DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼのコード配列を保有するベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、単離された細胞を接触させる段階であって、それによって該DNAを標的とするエンドヌクレアーゼが、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の細胞ゲノムDNAを切断し、その中に少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、段階を含む、少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト細胞を産生するための方法。
[本発明1003]
前記単離された前駆細胞または単離された細胞が、造血前駆細胞である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
造血前駆細胞が、赤血球系列の細胞である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記単離された前駆細胞または単離された細胞が、人工多能性幹細胞である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1006]
造血前駆細胞を、エクスビボまたはインビトロで接触させる、本発明1003の方法。
[本発明1007]
少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数のDNAse 1高感受性部位(DHS)の破壊を引き起こす、本発明1007の方法。
[本発明1009]
本発明1002〜1008の第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上に少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト細胞。
[本発明1010]
本発明1009の単離された遺伝子操作ヒト細胞を含む組成物。
[本発明1011]
以下の段階を含む、細胞における胎児型ヘモグロビンレベルを増加させる方法:第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の細胞ゲノムDNAを切断し、その中に少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼのコード配列を保有するベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、単離された細胞を接触させる段階であって、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、該接触の前の該細胞と比べて、該細胞またはその後代において増加される、段階。
[本発明1012]
前記単離された細胞が、造血前駆細胞である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
造血前駆細胞が、赤血球系列の細胞である、本発明1011または1012の方法。
[本発明1014]
前記単離された細胞が、人工多能性幹細胞である、本発明1011の方法。
[本発明1015]
造血前駆細胞を、エクスビボまたはインビトロで接触させる、本発明1012または1013の方法。
[本発明1016]
少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、本発明1011〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数のDNAse 1高感受性部位(DHS)の破壊を引き起こす、本発明1016の方法。
[本発明1018]
以下の段階を含む、それを必要とする哺乳類において胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるための方法:第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の細胞ゲノムDNAを切断し、その中に少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼのコード配列を保有するベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、該哺乳類において単離された造血前駆細胞を接触させる段階であって、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、該接触の前の発現と比べて、該哺乳類において増加される、段階。
[本発明1019]
それを必要とする哺乳類において胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるための方法であって、本発明1009の単離された遺伝子操作ヒト細胞または本発明1010の組成物を該哺乳類に移植する段階を含む、方法。
本明細書において記述される方法および組成物は、一部は、BCL11Aタンパク質の発現を調節できるBCL11A遺伝子上流の遠位調節領域の発見に関する。BCL11Aタンパク質は、γ-グロビン誘導を抑制することにより胎児型ヘモグロビン発現の発生段階特異的な調節因子として働く。したがって、本明細書において提供される方法および組成物は、赤血球系細胞におけるγ-グロビン発現の調節のための新規の方法である。より具体的には、BCL11A遺伝子産物の阻害を介したγ-グロビンの誘導によるβ異常ヘモグロビン症の処置のための方法において、これらの活性を利用することができる。
便宜上、本出願全体(明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む)で利用される特定の用語を、ここにまとめる。特に記載がなければ、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
胎児型ヘモグロビン(HbF)は、2本の成人型α-グロビンポリペプチドおよび2本の胎児型β-様γ-グロビンポリペプチドの四量体である。妊娠中、複製されたγ-グロビン遺伝子は、β-グロビン遺伝子座から転写される主要な遺伝子を構成する。出生後、γ-グロビンは成人型β-グロビンに次第に取って代わられるようになる。「胎児スイッチ」といわれるプロセスである(3)。このスイッチの根底にある分子機構は、主として不明確なままであり、集中的な研究の主題であった。主に胎児型ヘモグロビンすなわちHbF(α2γ2)の産生から成人型ヘモグロビンすなわちHbA(α2β2)の産生への発達期の切り替わりは、妊娠28から34週目頃に始まり、生後間もない時期まで続き、この時HbAが優勢となる。この切り替わりは、主に、γグロビン遺伝子の転写が低下し、βグロビン遺伝子の転写が活性化することによる。正常な成人の血液は、平均で約2%のHbFしか含まないが、健康な成人に残存するHbFレベルには、20倍を超える変動幅が認められている(Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001))。
1つの態様において、造血前駆細胞はエクスビボまたはインビトロで接触させる。具体的な態様において、接触させる細胞は、赤血球系列の細胞である。1つの態様において、細胞組成物は、減少したBCL11A発現を有する細胞を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記述される遺伝子操作ヒト細胞は、単離された多能性幹細胞から誘導される。iPSCを用いる利点は、前駆細胞が投与される対象と同じ対象から細胞を誘導できる点である。すなわち、体細胞を対象から得て、人工多能性幹細胞へとリプログラムした後、造血前駆細胞(例えば、自家細胞)へと再分化させて対象に投与することができる。前駆細胞が、本質的に自家起源から誘導されることから、生着の拒絶またはアレルギー反応のリスクは、別の対象または対象群からの細胞を用いる場合と比較して減少する。いくつかの態様において、造血前駆細胞は、非自家起源から誘導される。加えて、iPSCを用いることにより、胚起源から細胞を得る必要がなくなる。このように1つの態様において、開示される方法において用いられる幹細胞は、胚幹細胞ではない。
体細胞は、この用語が本明細書において用いられる場合、生殖系列細胞を除く、生物の体を形成する任意の細胞をいう。***および卵子、***および卵子が作製される元となる細胞(生殖母細胞)、ならびに未分化幹細胞を除く、哺乳類の体におけるあらゆる細胞タイプが、分化体細胞である。例えば、内部臓器、皮膚、骨、血液、および結合組織は全て、分化体細胞で構成される。
本明細書において用いられる場合、「ゲノム編集」という用語は、人為的に操作されたヌクレアーゼを用いて、ゲノム中の所望の位置で切断しかつ特定の二本鎖切断を生成し、これをその後、相同組み換え(HR)、相同組み換え修復(HDR)および非相同末端再結合(NHEJ)のような、細胞の内因性プロセスによって修復する、逆遺伝学的方法をいう。NHEJは二本鎖切断におけるDNA末端を直接連結するが、HDRは、切断点の、失われた配列を再生するための鋳型として相同配列を利用する。
本明細書において記述される、対象にヒト造血前駆細胞を投与する方法は、造血前駆細胞を含む治療用組成物を用いることを伴う。治療用組成物は、細胞組成物とともに生理的に許容される担体を含み、および任意で、活性成分としてその中に溶解または分散される、本明細書において記述される少なくとも1つのさらなる生物活性剤を含む。好ましい態様において、治療用組成物は、治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与した場合に、それが望ましい場合を除き、実質的に免疫原性ではない。
本明細書において用いられる場合、「投与する」、「導入する」および「移植する」という用語は、細胞、例えば本明細書において記述される造血前駆細胞を、所望の効果が得られるように、損傷部位または修復部位などの所望の部位で、導入した細胞の少なくとも部分的局在が得られる方法または経路によって対象に留置するという文脈において互換的に用いられる。細胞、例えば造血前駆細胞、またはその分化後代は、植え込まれた細胞もしくは細胞成分の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達が得られる任意の適切な経路によって投与されうる。対象に投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば24時間もの短時間から数日、数年もの長期間、すなわち長期間の生着でありうる。例えば、本明細書において記述される局面のいくつかの態様において、造血前駆細胞の有効量は、腹腔内または静脈内経路のような、全身投与経路によって投与される。
[A] 減少したBCL11A mRNAまたはタンパク質の発現を有する前駆細胞を産生するための方法であって、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612 (UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の細胞ゲノムDNAに結合する薬剤と、単離された前駆細胞を接触させ、それによってBCL11AのmRNAまたはタンパク質の発現を低減させる段階を含む、方法。
[B] DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼのコード配列を保有するベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、単離された細胞を接触させる段階であって、それによって該DNAを標的とするエンドヌクレアーゼが、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の細胞ゲノムDNAを切断し、その中に少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、段階を含む、少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト細胞を産生するための方法。
[C] 前記単離された前駆細胞または単離された細胞が、造血前駆細胞である、第[A]項または第[B]項に記載の方法。
[D] 造血前駆細胞が、赤血球系列の細胞である、第[C]項に記載の方法。
[E] 前記単離された前駆細胞または単離された細胞が、人工多能性幹細胞である、第[A]項または第[B]項に記載の方法。
[F] 造血前駆細胞を、エクスビボまたはインビトロで接触させる、第[C]項に記載の方法。
[G] 少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、第[A]〜[F]項のいずれか一項に記載の方法。
[H] 欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数のDNAse 1高感受性部位(DHS)の破壊を引き起こす、第[G]項に記載の方法。
[I] 第[B]〜[H]項に記載の第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上に少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト細胞。
[J] 第[I]項に記載の単離された遺伝子操作ヒト細胞を含む組成物。
[K] 以下の段階を含む、細胞における胎児型ヘモグロビンレベルを増加させる方法:第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の細胞ゲノムDNAを切断し、その中に少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼのコード配列を保有するベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、単離された細胞を接触させる段階であって、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、該接触の前の該細胞と比べて、該細胞またはその後代において増加される、段階。
[L] 前記単離された細胞が、造血前駆細胞である、第[K]項に記載の方法。
[M] 造血前駆細胞が、赤血球系列の細胞である、第[K]項または第[L]項に記載の方法。
[N] 前記単離された細胞が、人工多能性幹細胞である、第[K]項に記載の方法。
[O] 造血前駆細胞を、エクスビボまたはインビトロで接触させる、第[L]項または第[M]項に記載の方法。
[P] 少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、第[K]〜[O]項のいずれか一項に記載の方法。
[Q] 欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数のDNAse 1高感受性部位(DHS)の破壊を引き起こす、第[P]項に記載の方法。
[R] 以下の段階を含む、それを必要とする哺乳類において胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるための方法:第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の細胞ゲノムDNAを切断し、その中に少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼのコード配列を保有するベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、該哺乳類において単離された造血前駆細胞を接触させる段階であって、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、該接触の前の発現と比べて、該哺乳類において増加される、段階。
細胞培養
健常ドナーの動員末梢血由来のヒトCD34+細胞を、Centers of Excellence in Molecular Hematology at Yale University, New Haven, ConnecticutおよびFred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washingtonから入手した。細胞を既述のように、二相無血清液体培養プロトコルによるエクスビボでの赤血球系の成熟に供した(39)。末梢血単核細胞(PBMC)をボストン小児病院の健常ドナーから得た。PBMCからの赤血球系分化は、既述のように行った(40)。マウス赤白血病(MEL)細胞および293T細胞は、既述のように培養した(39)。安定的にv-Ablを形質転換されたプレBリンパ球マウス細胞(記述(41)のように得られた)を、2%ペニシリン-ストレプトマイシン、15% FCS、2% HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸ナトリウム、1% L-グルタミンおよび100 μM β-メルカプトエタノールを加えたRPMI中で培養した。
クロマチン免疫沈降および超並列配列決定を、記述のように行った(39)。以下の抗体を用いた: H3K27me3 (Millipore, 07-449)、H3K4me3 (Millipore, 04-745)、H3K4mel (Abcam, ab8895)、H3K27ac (Abcam, ab4729)、RNAポリメラーゼII (PolII, Santa Cruz, sc-899)、GATA1 (Abcam, ab11852)およびTAL1 (Santa Cruz, sc-12984)。DNase I切断密度を、既述のように実施し解析した(42)。ChIP-qPCRについては、ΔCt法で1%インプットクロマチンとChIP材料の増幅を比較することにより相対的濃縮度を決定した。GATA1およびTAL1によって占有されること、および占有されないことがこれまでに報じられた遺伝子座を、それぞれ陽性および陰性対照として用いた(39)。
下記を除き3C法を既述(39)のように行った。ホルムアルデヒド架橋された初代ヒト赤血球系前駆細胞の核を、ライゲーションおよび架橋の反転の前にHindIIIで消化した。iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880)を用いて定量的リアルタイムPCRを行った。BCL11Aプロモーターを含んだ断片を、アンカー領域として用いた。異なるプライマーの増幅効率を補正するため、完全ヒトBCL11A遺伝子座(RP11-606L8およびRP11-139C22)ならびに1つのヒトβ-グロビンクラスタ(CTD-3055E11)を含む2つの細菌人工染色体(BAC)の等モル混合物を消化およびライゲーションすることにより、対照の鋳型を調製した。ヒトβ-グロビン遺伝子座対照領域(LCR)のHS1/HS2およびHS3における断片間の相互作用を、陽性対照とした。相互作用頻度は、公知のLCR相互作用に対しての増幅として表し、BACの対照鋳型に対して正規化した。
3つのBCL11Aイントロン2 DHS +62 (chr2:60,717,492〜60,718,860)、+58 (chr2:60,721,411〜60,722,674)および+55 (chr2:60,724,802〜60,726,084)の中からマーカー(座標は全てhg19)を選択した。北ヨーロッパ系アメリカ人(CEU)、ナイジェリア系アメリカ人(YRI)およびアフリカ系アメリカ人(ASW)の参照集団を用いて1000人ゲノムプロジェクトデータベースから21個のマーカーを特定した(表S1)。38種類のさらなる変種がdbSNP135において存在していた(表2)。本発明者らはサンガー法による化学反応で、それぞれ、高い(8%超)および低い(2%未満) HbFレベルを有するCSSCDコホート由来の鎌状赤血球疾患(SCD)患者52名および36名のDNAにおける三種類のDHS範囲を配列決定した。この配列決定の努力から、7種の新規の配列変種が特定された(表3)。大部分のマーカーは小さなゲノム範囲に密集しているので、それらのいくつかのジェノタイピングアッセイをデザインすることは可能ではなかった。三種類のDHSにおいて特定された66個の非冗長変種のうち、ゲノムDNA (gDNA)が利用可能であり、かつHbFレベルが分かっているアフリカ系アメリカ人のSCDコホートであるCSSCD参加者1,263名において40個のマーカーのジェノタイピングアッセイを実施した(21)。Sequenom iPLEXプラットフォームを用いて、マーカーをジェノタイピングした。ジェノタイピング成功率が90%未満の個体およびDNA配列変種を除外した。三つ組から推定される全体的な遺伝子型一致は、100%であった。品質管理(QC; n = 38)を通過したSNPは、表2および3に記載されており、図11Aおよび11Bにおいて三種類のDHSの下に図式的に示されている。ジェノタイピングされたSNPのかなりの割合のものが参照集団において稀有であり、そのため驚くことではないが、CSSCD (n = 18)においては単型である。QC後、個体1,178名および20個の多型SNPが解析のために残った。HbFレベルを既述のようにモデル化した(9, 43)。単一の変種(MAF > 1%)の関連および条件付け解析を、相加的遺伝モデルの下で直線回帰を用いPLINK (44)で行った。一般的な変種(MAF > 1%)の解析から、DHS +62におけるrs1427407はHbFレベルと最も強い関連性を有することが明らかにされた(P = 7.23×10-50; 図11Aおよび3B)。条件付け解析から、rs1427407およびrs7606173に基づく条件付けの後、もはやSNPは有意でないことが実証された(図3B)。混合および他の交絡要因を考慮するためにゲノム規模のジェノタイピングデータが利用可能であった個体855名に関する主成分(PC)の調整から、類似の結果が得られた。
同じ染色体上の2つのヘテロ接合性SNPの場合には、可能な二相: A-B/a-b (モデル1)およびA-b/a-B (モデル2)が存在する。12 kbのBCL11Aイントロン2断片+52.0〜64.4 kb内のSNPについて、SNP対立遺伝子のPCR産物をクローニングし、SNP対立遺伝子の共分布を決定することにより、相の決定を行った。rs7569946およびrs1427407対立遺伝子(第2染色体上で30.1 kbだけ隔てられた)の相を決定するため、エマルジョンフュージョンPCRを、多少修正を加えて既述(24, 25)のように行った。フュージョンPCRは、同じ染色体の別々の部分から、関心対象の2つの領域を、単一の産物へ寄せ集める。油で囲まれた水性の微液滴を有するエマルジョン中で反応を行うことにより、圧倒的多数のアンプリコンが単一の鋳型分子に由来する。rs7569946およびrs1427407の両方についてヘテロ接合性であることが分かっている個体由来のゲノムDNAを、以下の100 μl反応(終濃度を記載した)における鋳型とした: KODホットスタートDNAポリメラーゼ(14 U, Novagen, 71086)、KOD緩衝液(1X)、MgSO4 (1.5 mM)、dNTP (各0.2 mM)、rs7569946-Fおよびrs1427407-Rプライマー(各1 μM)、rs7569946-Rプライマー(30 nM)、rs7569946-R-revcomp-rs1427407-F架橋内側プライマー(30 nM)、gDNA (200 ng)。100 μl水性反応液を撹拌しながら200 μl油相に滴下して、エマルジョンを作製した。2つの125 μlエマルジョンアリコットを以下の条件の下で増幅させた: 95℃で2分; 95℃で20秒、60℃で10秒、70℃で30秒を45サイクル; 70℃で2分。ヘキサン抽出されたフュージョンPCR産物を、次のように25 μlでのネステッドPCRに供した: KODホットスタートDNAポリメラーゼ(0.5 U)、KOD緩衝液(1X)、MgSO4 (1.5 mM)、dNTP (各0.2 mM)、rs7569946-ネステッド-Fおよびrs1427407-ネステッド-Rプライマー(各300 nM)、抽出されたフュージョンPCR産物(75 nl); 95℃で2分; 95℃で20秒、60℃で10秒、70℃で30秒を35サイクル; 70℃で2分。ネステッド産物はアガロースゲル電気泳動により、予想されたサイズの単一のバンドを構成することが確認された。精製された産物をZero Blunt PCR Cloningキット(Life Technologies, K2700-20)でクローニングした。フュージョンアンプリコンのサンガー法による配列決定により、可能な4配列: A-B、a-b、A-bおよびa-Bのクローンを数え上げた。各相の可能性を多項分布仮定に基づいて算出した(表6)。2つの配置の尤度比を、(モデル2と比べて)ハプロタイプモデル1に適合するデータの統計的有意性の指標として算出した。無限に迫る比率はモデル1を示唆し、1の比率は均衡を示唆し、ゼロに迫る比率はモデル2を示唆する。
健常CD34+細胞ドナーをスクリーニングし、rs1427407についてヘテロ接合性のドナー5名を特定した。これらのCD34+細胞をエクスビボでの赤血球系の分化に供した。クロマチンを単離し、ChIPをGATA1およびTAL1抗体で行った。GATA1またはTAL1沈降材料と比べてインプットクロマチンをパイロ配列決定に供して、rs1427407の対立遺伝子バランスを決定した。健常CD34+ドナーをスクリーニングし、rs1427407-rs7606173 G-C/T-Gハプロタイプについてヘテロ接合性のドナー3名を特定した。これらのCD34+細胞をエクスビボでの赤血球系の分化に供した。相補性DNA (cDNA)およびgDNAをパイロ配列決定に供して、rs7569946の対立遺伝子バランスを決定した。
エンハンサーレポーター構築物pWHERE-Destは、William Pu博士から入手した。既述(46)のようにpWHERE (Invitrogen, pwhere)から改変され、この構築物は、上流MCSの位置にGatewayデスティネーションカセットを有する最小のHsp68最小プロモーターによって駆動されるCpGを含まないlacZ変種に隣接するマウスH19インシュレーターを有する。エンハンサー断片は、マウスgDNAから増幅され、BPクロナーゼ(Invitrogen, 11789020)によりpDONR221ベクター(Invitrogen, 12536-017)へ組み入れられ、LRクロナーゼ(Invitrogen, 11791020)でpWHERE-Destへ組み入れられた。プラスミドをPacIで消化して、ベクター骨格を除去した。lacZエンハンサーレポーター断片をゲル電気泳動によって精製し、その後、Wizard DNA Clean-Up System (Promega, A7280)を用いて濃縮した。トランスジェニックマウスをFVB受精卵への前核注射により作製した。およそ10 ng/μlのDNA溶液を一連の注射に用いた。CD-1の雌を注射胚のレシピエントとして用いた。10.5〜14.5 dpcの胚を代理母から解剖し、既述のようにホールマウントおよび組織X-gal染色を行った(47)。X-gal染色されたサイトスピンをNuclear Fast Red (Vector Laboratories, H-3403)で対比染色した。尾部をPCRジェノタイピングに用いた。動物手順は、小児病院の動物実験委員会(Children's Hospital Instititutional Animal Care and Use Committee)によって承認された。
推定上のエンハンサーエレメントを含んだゲノムDNA断片を、記述のように、pLVX-Puro (Clontech, 632164)へ最小TKプロモーターおよびGFPレポーター遺伝子の上流にクローニングした(39)。FuGene 6試薬(Promega, E2691)を製造元のプロトコルにしたがって用い、293T細胞にトランスフェクションを行った。培地を24時間後に、2%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したSFEM培地に交換し、36時間後に、上清を回収し、ろ過した。CD34+細胞由来の赤血球系培養物に、既述のようにスピン感染法によって増殖4および5日目にレンチウイルスを形質導入した(39)。細胞を2回目の感染から24時間後に赤血球系分化培地に再懸濁した。ピューロマイシン1 μg/mlによる選択を感染から48時間後に始めた。形質導入された細胞を、GFP平均蛍光強度についてフローサイトメトリーにより分化培地中で5日後に解析した。
生細胞を7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD, BD Pharmingen, 559925)の排除によってゲーティングした。骨髄(赤芽球の場合)および脾臓(リンパ球の場合)懸濁物を若年成体トランスジェニックマウスから単離した。成熟赤血球の低張溶解後、生細胞(7-AAD-)をCD71-ビオチン(BD, 557416)、ストレプトアビジン-APC (BD, 554067)、Ter-119-PE (BD, 553673)、CD19-APC (BD, 550992)またはCD3-PE (BD, 100308)による染色に基づき選別した。CD71+Ter119+、CD19+およびCD3+選別集団をサイトスピンおよびRNA単離に用いた。
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、TSSに対して+50.4 kb (5'部位と名付けた)および+60.4 kb (3'部位)の部位でマウスBcl11aイントロン2に切断を生じるようにデザインされた。TALENは以下の配列を認識する。
Gを認識するようにNN RVDを用いGolden GateクローニングでTALENを合成した(48)。合成されたDNA結合ドメインを、既述されたFokIヌクレアーゼドメイン、A152 N末端ドメインおよび+63 C末端ドメインとともにpcDNA3.1 (Invitrogen, V790-20)へクローニングした(49)。pmaxGFP (Lonza) 0.5 μgとともに4つのTALENプラスミドのそれぞれ2.5 μgを、エレクトロポレーションにより製造元のプロトコル(Lonza, VCA-1005)にしたがって2×10 6 個のMELまたはプレB細胞に送達した。GFP陽性細胞を48時間後にフローサイトメトリーによって選別した。細胞を96ウェルプレート中に限界希釈によって播種し、個々のクローンを単離した。クローンをgDNAのPCRによりスクリーニングして、5'部位の上流および3'部位の下流からの短い産物の増幅を検出し、介在セグメントの欠失を示した。単一対立遺伝子性の欠失クローンを第2ラウンドのTALEN媒介性の欠失に供して、両対立遺伝子が欠失したクローンを得た。両対立遺伝子に欠失を有するクローンを、欠失された断片の中からの増幅がないことを検出することによって特定した。欠失頻度は対立遺伝子およそ50個につき1個であった。欠失をサザンブロッティングで確証した。ゲノムDNAをBmtIで消化した; 561 bpのプローブ(5'部位の上流のgDNAから増幅された)は野生型対立遺伝子由来の3.6 kbの断片およびΔ50.4〜60.4欠失対立遺伝子由来の8.9 kbの断片とハイブリダイズする。
RNeasyカラム(Qiagen, 74106)を用いたRNA単離、iScript cDNA合成キット(Bio-Rad, 170-8890)を用いた逆転写、iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880)を用いたqPCRおよび免疫ブロッティングを記述(39)のように行った。マウスβ-グロビンクラスタ遺伝子の場合、共通のプライマーペアは生体β-グロビンβ2およびβ1を認識するが、独立のプライマーは胎児型β-グロビンεyおよびβH1を認識する。以下の抗体を免疫ブロッティングに用いた: BCL11A (Abcam, ab19487)、GAPDH (Santa Cruz, sc-25778)。
ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、形質に共通して関連する種々の遺伝子変異が特定されてきた。そのような遺伝子変異は、多くの場合、調節DNA配列に局在している。調節配列の変異により実質的な遺伝性が説明可能であるとする仮説については、実験に基づく評価が殆ど行われてこなかった。本発明により、本発明者らは、胎児型ヘモグロビン(HbF)レベルと関連する一般的なBCL11A遺伝子変種が赤血球系エンハンサークロマチンシグナチャーを有する非コード配列であることを示す。この推定調節DNA配列に対して精細マッピングを行うと、モチーフを破壊する共通の変種が確認され、この変種により、転写因子結合能が低下し、BCL11A遺伝子発現が低下し、HbFレベルが上昇する。周囲の配列は、インビボにおいて、発達段階に特異的な、かつ、細胞系列に制限的なエンハンサーとして作用する。ゲノム工学により、このエンハンサーは、赤血球系BCL11Aの発現には必要であるが、赤血球系列以外では不要であることが示されている。このような結果から示されることは、GWASにより、適切な遺伝子発現に必須な原因エレメントに対し適度な影響を及ぼす機能的変種が明らかになることである。GWASにより特定したBCL11Aエンハンサーは、βグロビン障害に対して、有望な治療標的となる。
さまざまなGWASや精細マッピングによるフォローアップ研究が赤血球系細胞の形質(赤血球数や赤血球体積、ヘモグロビン濃度およびHbFレベルなどの表現型を含む)について行われた結果、ゲノムワイドな有意水準(p<5e-8)を満たす636種類の形質関連SNPが特定されている。これらのSNPは、ランダムSNPと比較して、プロモーター領域およびコード領域に多く認められたものの(図1)、SNPの大部分は、それ以外のゲノム領域に存在した。初代ヒト赤血球系前駆細胞に対して、包括的クロマチンプロファイリングを行った結果、特徴的なヒストン修飾およびDNaseI高感受性によって定義される遠位赤血球系エンハンサーの大規模なセットが特定された。非赤血球系形質関連SNP、一般的なジェノタイピングアレイにより見つかったSNPやランダムに並び替えを行ったSNPと比較して、GWASによる赤血球系SNPでは、エンハンサーとの共局在が認められた。赤血球系形質関連SNPの13.5%は、赤血球系エンハンサー内に直接入っており、これはランダムに並び替えを行ったエンハンサーの11.4倍(P<1×10-4)であり、それに対して非赤血球系形質関連SNPでは1.4%であり、1.4倍(P=0.0013)の頻度(enrichment)となっている。赤血球系形質関連SNPの多くは、赤血球系エンハンサーの近傍で発見されている(図1B)。赤血球系形質関連SNPの場合、赤血球系エンハンサーとの距離の中央値は、16.0キロ塩基(kb)であったのに対して、非赤血球系形質関連SNP、ジェノタイピングアレイSNPおよびランダムに並び替えを行ったSNPでは、それぞれ、238.0、392.6および482.4 kbであった。これらの結果からは、赤血球系形質に一般的に見られる変種は、かなりの割合で、赤血球系エンハンサー内またはその近傍に存在していることが示され、原因変種がコンテクストに依存した遺伝子調節に影響を及ぼすという仮説に合致した結果となっている。
ヨーロッパ、アフリカおよびアジア人の血統を含め、6件のGWAS研究がHbFレベル(あるいは、相関性が高い形質であるF-細胞数)に関して行われた。それぞれの研究により、BCL11A形質関連変種が特定された。BCL11Aの変種により、形質の変動の約15%が説明可能と推定されている。形質と最も関連性が強い四種類のSNP(rs1427407、rs11886868、rs4671393およびrs766432)が特定された。これらのいわゆる「センチネル」SNPは、BCL11Aイントロン2内に、お互いから3 kbの範囲内に集合していた(図2A)。このセンチネルSNPを含むハプロタイプは、個々のSNPよりも、HbFとの関連性を詳しく説明できると考えられる。BCL11A遺伝子座の50種類のSNPおよびイントロン2の27種類のSNPは、HbFレベルとの関連性において、ゲノムワイド有意性(P<5×10-8)を満たしていた。
重要な調節エレメントの調節を行うことにより、形質に関連する原因SNPが作用を及ぼしているとの仮説を立てた。そこで、三種類の赤血球系DHS +62、+58および+55について、鎌状赤血球疾患共同調査(CSSCD)から得られた1263件のDNAサンプルについて、詳細なSNPジェノタイピングを行った。この調査は、ゲノムDNAが利用可能であり、HbFレベルが既知であるアフリカ系アメリカ人鎌状赤血球疾患のコホートを対象としたものである。1000人ゲノムプロジェクトの参照集団であるCEU、YRIおよびASWから、および極度のHbF表現型を有するCSSCD個体88例のサンガー配列決定により、三種類のDHS内に位置する66個のDNA配列変種をdbSNPから特定した。26個のマーカーはジェノタイピングアッセイのデザインに適合せず、18個のマーカーは単型であった(表1および表2)。品質管理を行った後に残った1178例および20個の多型SNPについて、関連性試験を行った。一般的な変種(マイナー対立遺伝子頻度(MAF)>1%)の解析により、DHS+62のrs1427407がHbFレベルと最も強い関連性を示した(P=7.23×10-50、表1)。
調節形質に関連すると考えられるこれらのSNPが作用するコンテクストを理解する上で、シス調節エレメントが有する機能について研究を行った。本発明者らは、赤血球系DHSを含む約12 kbの領域(TSSから+52.0〜64.4 kb)のクローニングを行い、トランスジェニックレポーターアッセイによりエンハンサー能を調べた。このアッセイでは、インシュレーター配列で隔てた最小プロモーター(Hsp68)とレポーター遺伝子(lacZ)の上流に推定エンハンサー配列を配置した。構築物をマウス接合体に導入し、レポーター遺伝子の発現を発達期間中追跡した。内因性マウスBCL11Aは、発達段階にある中枢神経系において大量に発現したが、胎児肝臓における発現レベルは、これと比べてはるかに低かった。対照的に、トランスジェニック胚では、レポーター遺伝子の発現は、決定造血器官である胎児肝臓にほぼ限定され、中枢神経系においては、発現レベルは低かった(図4A)。
次いで、本発明者らは、BCL11Aおよびグロビン遺伝子が適切に発現する上で、これらの調節配列に必要となる要件を調べることとした。過去に発表されたマウス赤血球系細胞の包括的クロマチンプロファイリング結果に基づいて、Bcl11a遺伝子座を調べると、このイントロン2領域には、オルソロガスエンハンサーのシグナチャーであって、H3K4melおよびH3K27acが存在し、H3K4me3およびH3K27me3が存在せず、かつ、GATA1およびTAL1によって占められるシグナチャーがあることが確認された(図8)。さらに、これらの配列には、赤血球系細胞に特異的なDNaseI高感受性が認められた。ヒト赤血球系細胞のDHS +62、+58および+55のそれぞれについて、特に、DHS +62および+55には、進化に伴う配列保存を示す証左が認められた。これらのオルソロガスな調節配列に関し、BCL11Aの発現に必要とされる要件を定めるため、マウス赤白血病細胞系列(MEL)を用いた。これらの細胞は、適切な成体期グロビン遺伝子発現パターンのためにBCL11A発現に依存する。配列特異的なヌクレアーゼにより、染色体に小さな欠失を生じさせることができる。赤血球系エンハンサーのクロマチンシグナチャーを有する10 kbのオルソロガスBcl11aイントロン2配列を切断して、二重鎖の切れ目を作るために、TALENを合成した。クローンに対して、NHEJ修復のスクリーニングを行い、両対立遺伝子に切断が生じた三種類のクローンを分離した。PCRおよびサザンブロッティングにより、クローン内のイントロン断片に切断が生じたことが確認された(図9)。サンガー法による配列決定によって特定した切断点は、TALENによる切断の後にNHEJ修復が行われたことを表す特徴を示していた(図10)。
解析に利用可能なCSSCDからの個体1178人からのBCL11A DHS +62、+58または+55における一般的な(MAF > 1%)SNPの関連解析。DHS, DNase I高感受性部位。MAF, マイナー対立遺伝子頻度。
BCL11A DHS +62、+58または+55の範囲に入り、かつYRI、CEUおよびASW参照集団に対するdbSNPまたは1000 Genomesデータのいずれかに存在するSNP。ジェノタイピングを行ったSNPが特定されており、CSSCD内のMAFが記載されている。ゲノム座標hg19。
極度のHbF表現型を有するCSSCDからの個体88人は、BCL11A内の3つのDHSのサンガー法による再配列決定を受けた。特定された新規のマーカーが記載されている。ジェノタイピングを行ったSNPが特定されており、CSSCD内のMAFが記載されている。ゲノム座標hg19。
HbFレベルと以前に関連付けられた4つの一般的なセンチネルSNPの条件付け解析{{44;20;19;36;37;515}}。CSSCDからの個体728名において全4つのジェノタイピングを行った。rs4671393に基づく条件付けの場合にはrs766432のPを算出することは不可能であった(逆の場合も同じ)。というのは、これらの2つのマーカーが、かなり強い相関を有するからである(r2=0.997)。rs1427407とrs766432との間のr2=0.848; rs1427407とrs11886868との間のr2=0.709; rs1427407とrs4671393との間のr2=0.850; rs766432とrs11886868との間のr2=0.761; rs11886868とrs4671393との間のr2=0.758。
頻度が低いまれな変種の解析結果(MAF<5%)。解析は3つの異なるセットとして個々のDHS +62、+58および+55を用いたセットに基づくSKAT-Oアルゴリズムによって行った。最終行の「全部」は、3つの領域をともに壊した場合の試験の結果を示す。
rs7569946-rs1427407ハプロタイプのエマルジョンフュージョンPCR解析。フュージョンPCRを、rs7569946およびrs1427407の両方ともヘテロ接合性の3人の個々のドナー由来のエマルジョン中で行い、両方のSNPを包含するフュージョンアンプリコンを作製した。フュージョンアンプリコンをクローニングし、個々のクローンのサンガー法による配列決定を行った。各遺伝子型のクローンの数を記載してある。G-T/A-G相と比べてG-G/A-Tの尤度比を算出した。
エンハンサーレポーターアッセイにおけるクローニングされた推定上のエンハンサー断片の座標。第2染色体の座標をhg19およびBCL11A TSSに関連して記載してある。
Claims (28)
- 減少したBCL11A mRNAまたはタンパク質の発現を有する造血前駆細胞を産生するためのエクスビボまたはインビトロの方法であって、
単離されたヒト造血前駆細胞に、エクスビボまたはインビトロで、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼ、またはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを導入することを含み、
該DNAを標的とするエンドヌクレアーゼは、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612 (UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)で該ヒト造血前駆細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDNAse 1高感受性部位(DHS)+62、+58、または+55における少なくとも一つの遺伝的改変をもたらし、それによって該ヒト造血前駆細胞におけるBCL11AのmRNAまたはタンパク質の発現を低減させる、前記方法。 - DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを少なくとも含む組成物の有効量を、単離された造血前駆細胞にエクスビボまたはインビトロで導入する段階であって、それによって該DNAを標的とするエンドヌクレアーゼが、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の該細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55における少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、段階を含む、少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト造血前駆細胞を産生するためのエクスビボまたはインビトロの方法。
- 前記単離されたヒト造血前駆細胞またはその後代が、赤血球系列の細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記単離されたヒト造血前駆細胞が、人工多能性幹細胞由来である、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数の前記DHSの破壊を引き起こす、請求項5に記載の方法。
- 請求項2〜6に記載の、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上に少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト造血前駆細胞。
- 請求項7に記載の単離された遺伝子操作ヒト造血前駆細胞を含む組成物。
- 以下の段階を含む、細胞における胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるエクスビボまたはインビトロの方法:第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の該細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55における少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを少なくとも含む組成物の有効量を、単離されたヒト造血前駆細胞に、エクスビボまたはインビトロで導入する段階であって、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、該接触の前の該単離されたヒト造血前駆細胞と比べて、該単離されたヒト造血前駆細胞またはその後代において増加される、段階。
- 該単離されたヒト造血前駆細胞が、赤血球系列の細胞またはその後代である、請求項9に記載の方法。
- 前記単離されたヒト造血前駆細胞が、人工多能性幹細胞由来である、請求項9または10に記載の方法。
- 少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数の前記DHSの破壊を引き起こす、請求項12に記載の方法。
- ベータ異常ヘモグロビン症を有するヒトにおいて胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるのに使用するための単離された造血前駆細胞であって、
ここで、該単離されたヒト造血前駆細胞は、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612上の該単離されたヒト造血前駆細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55における少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを少なくとも含む組成物の有効量と、エクスビボまたはインビトロで接触されている、前記単離されたヒト造血前駆細胞。 - ベータ異常ヘモグロビン症を有するヒトにおいて胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるのに使用するための、請求項7に記載の単離された遺伝子操作ヒト造血前駆細胞または請求項8に記載の組成物。
- 単離されたヒト造血前駆細胞においてBCL11AのmRNAまたはタンパク質の発現を低減させ、減少したBCL11A mRNAまたはタンパク質の発現を有するヒト造血前駆細胞を産生するための薬学的組成物であって、
DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを含み、該エンドヌクレアーゼが第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612 (UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の該細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55における少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、前記薬学的組成物。 - 少なくとも1つの遺伝的改変を有する単離された遺伝子操作ヒト造血前駆細胞を産生するための、薬学的組成物であって、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを少なくとも含み、
該DNAを標的とするエンドヌクレアーゼが、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の該細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55の少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、前記薬学的組成物。 - 該単離されたヒト造血前駆細胞が、赤血球系列の細胞である、請求項16または17に記載の薬学的組成物。
- 前記単離されたヒト造血前駆細胞が、人工多能性幹細胞由来である、請求項16または17に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、請求項17〜19のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数のDHSの破壊を引き起こす、請求項20に記載の薬学的組成物。
- 細胞における胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるための薬学的組成物であって、
DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを少なくとも含み、該エンドヌクレアーゼは、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の該細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55の少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こし、
単離されたヒト造血前駆細胞を接触させ、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、該接触の前の該細胞と比べて、該細胞またはその後代において増加される、前記薬学的組成物。 - 単離されたヒト造血前駆細胞またはその後代が、赤血球系列の細胞である、請求項22に記載の薬学的組成物。
- 前記単離されたヒト造血前駆細胞が、人工多能性幹細胞由来である、請求項22または23に記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つの遺伝的改変が、欠失である、請求項22〜24のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 欠失が、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)の間の全領域を除去するか、または該領域の一部分を除去し、1つもしくは複数のDHSの破壊を引き起こす、請求項25に記載の薬学的組成物。
- ベータ異常ヘモグロビン症を有するヒトにおいて胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるのに使用するための、単離されたヒト造血前駆細胞を含む薬学的組成物であって、
ここで、該単離されたヒト造血前駆細胞は、第2染色体の位置60,716,189〜60,728,612(UCSCゲノムブラウザhg 19ヒトゲノムアセンブリによる)上の該細胞のゲノムDNAに結合して切断し、その中のDHS+62、+58、または+55の少なくとも1つの遺伝的改変を引き起こす、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、DNAを標的とするエンドヌクレアーゼまたはDNAを標的とするエンドヌクレアーゼをコードするベクターを少なくとも含む組成物の有効量と接触されている、前記薬学的組成物。 - ベータ異常ヘモグロビン症を有するヒトにおいて胎児型ヘモグロビンレベルを増加させるための、請求項7に記載の単離された遺伝子操作ヒト造血前駆細胞または請求項8に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
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