BR112015011995B1

BR112015011995B1 - Método para a produção de uma célula progenitora hematopoiética tendo bcl11a diminuído ou para aumentar seus níveis de hemoglobina fetal, composição e uso das mesmas

Info

Publication number: BR112015011995B1
Application number: BR112015011995-6A
Authority: BR
Inventors: Stuart H. Orkin; Daniel E. Bauer; Jian Xu
Original assignee: Children's Medical Center Corporation
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2023-02-07
Also published as: US20230348887A1; MX361412B; DK2925864T3; SA515360489B1; US9822355B2; US20150307867A1; JP6542124B2; US20200087651A1; PT2925864T; CN109554350B; SG10202110062SA; SG11201504038XA; AU2021218012A1; EP3502240B1; CA2892860C; IL238949A0; AU2018278850A1; EP3502240A1; CA2892860A1; JP6633602B2

Abstract

ELEMENTOS REGULATÓRIOS DISTAIS DE DIRECIONAMENTO DE BCL11A PARA REINDUÇÃO DE HEMOGLOBINA FETAL. São aqui proporcionados métodos e composições para o aumento dos níveis de hemoglobina fetal em uma célula através da ruptura da expressão de BCL11A ao nível genômico. São aqui proporcionados também métodos e composições relacionados com o tratamento de hemoglobinopatias por reindução de níveis de hemoglobina fetal.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/730,323 depositado em 27 de Novembro de 2012, e do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/730,369 depositado em 27 de Novembro de 2012, do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/776,144 depositado em 11 de Março de 2013, e do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/889,174, depositado em 10 de Outubro de 2013, os conteúdos de cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

APOIO DO GOVERNO

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do Governo sob Concessão n° 5RO1HL032259, concedida pelos Institutos Nacionais de Saúde. O Governo tem certos direitos sobre a invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A hemoglobina de adulto normal compreende quatro proteínas de globina, duas das quais são proteínas alfa (α), e duas das quais são proteínas beta (β). Durante o desenvolvimento fetal de mamíferos, particularmente em seres humanos, o feto produz hemoglobina fetal, que compreende duas proteínas gama (g)-globina, em vez das duas proteínas de globina β. Durante o período neonatal, uma troca de globina ocorre referida como a “troca fetal”, neste ponto, precursores eritróides trocam da produção de Y-globina predominantemente para a produção de β-globina predominantemente. A troca de desenvolvimento da produção de hemoglobina fetal predominantemente ou HbF (α2Y2) para a produção de hemoglobina adulta ou HbA (α2β2) começa em cerca de 28 a 34 semanas de gestação, e continua logo após o nascimento até HbA torna-se predominante. Esta troca resulta essencialmente da diminuição da transcrição dos genes da gama-globina e aumento da transcrição dos genes da beta- globina. Em média, o sangue de um adulto normal contém menos de 1% de HbF, embora os níveis de HbF residuais tenham uma variação de mais de 20 vezes em adultos saudáveis, e sejam geneticamente controlados.

[004] As hemoglobinopatias abrangem um número de anemias de origem genética, em que há uma diminuição da produção e/ou aumento da destruição (hemólise) de glóbulos vermelhos (RBCs). Estas também incluem defeitos genéticos que resultam na produção de hemoglobinas anormais com uma capacidade diminuída para manter a concentração concomitante de oxigênio. Alguns desses transtornos envolvem a incapacidade de produzir β-globina normal em quantidades suficientes, enquanto outros envolvem o fracasso para produzir β-globina normal, inteiramente. Estas desordens associadas com a proteína β- globina são referidas geralmente como β-hemoglobinopatias. Por exemplo, β-talassemias resultam de um defeito parcial ou completo da expressão do gene da β-globina, levando à HbA deficiente ou ausente. Anemia falciforme resulta de uma mutação pontual no gene de β-globina estrutural, que conduzem à produção de uma hemoglobina anormal (falciforme) (HbS). HbS é propensa à polimerização, particularmente em condições desoxigenadas. RBCs com HbS são mais frágeis do que os RBCs normais e submetidos à hemólise mais facilmente, levando eventualmente à anemia.

[005] Recentemente, a busca de tratamento visando a redução do desequilíbrio da cadeia de globina ou predisposição para a polimerização da hemoglobina em pacientes com β-hemoglobinopatias tem incidido sobre a manipulação farmacológica de hemoglobina fetal (α2Y2; HbF). O potencial terapêutico de tais abordagens é sugerido pelas observações do fenótipo benigno de indivíduos com co- hereditariedade de ambas β-talassemia homozigótica e persistência hereditária de hemoglobina fetal (HPFH), assim como por aqueles pacientes com β-talassemia homozigótica que não sintetizam hemoglobina adulta, mas nos quais um requisito reduzido para transfusões é observado na presença de concentrações elevadas de hemoglobina fetal. Além disso, observou-se que certas populações de pacientes adultos com anormalidades na cadeia β têm níveis acima do normal de hemoglobina fetal (HbF), e foram observados para ter um curso clínico mais suave da doença do que os pacientes com níveis normais de adultos de HbF. Por exemplo, um grupo de pacientes com anemia falciforme da Arábia Saudita que expressam 20 a 30% de HbF têm apenas manifestações clínicas leves da doença. Aceita-se agora que os distúrbios de hemoglobina, como a anemia falciforme e as β-talassemias, são melhorados pelo aumento da produção de HbF.

[006] Como mencionado anteriormente, a mudança de hemoglobina fetal para a hemoglobina adulta (α2Y2; HbA) prossegue geralmente dentro de seis meses após o parto. No entanto, na maioria dos pacientes com β-hemoglobinopatias, os genes da Y-globina a montante estão intactos e completamente funcionais, de modo que estes genes se tornam reativados, a síntese de hemoglobina funcional poderia ser mantida durante a vida adulta, e, assim, melhorar a severidade da doença. Infelizmente, os mecanismos moleculares in vivo subjacentes à troca de globina não são bem compreendidos.

[007] As evidências suportando a viabilidade de reativação da produção de hemoglobina fetal vieram de experiências nas quais foi mostrado que o sangue periférico, contendo células clonogênicas, quando foi dada a combinação adequada de fatores de crescimento, produz colônias eritróides e rupturas em cultura semissólida. As células individuais nessas colônias podem acumular hemoglobina fetal (HbF), hemoglobina adulta (HbA) ou uma combinação de ambas. Em culturas de sangue adulto, eritrócitos nucleados acumulam ou HbA (F-A+) apenas, ou uma combinação de HbF e HbA (F+A+). Importante, as colônias individuais contêm ambas as células F+ e F-, indicando que ambos os tipos são progênie a partir das mesmas células estaminais circulantes. Assim, durante os primeiros estágios de desenvolvimento em cultura, as células executam uma opção, por meio de mecanismos ainda desconhecidos, se devem ou não expressar HbF. A proporção de células adultas F+ em desenvolvimento em cultura não parece ser pré-programada in vivo, mas parece depender das condições de cultura: Um deslocamento na via de expressão de HbF e HbA combinadas pode, por exemplo, ser conseguido in vitro por concentrações elevadas no soro, devido à atividade de um composto não identificado que pode ser absorvido sobre carvão activado.

[008] Em geral, a identificação de moléculas que têm um papel na troca de globina é importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que interferem com a hemoglobina adulta e induzem a síntese de hemoglobina fetal. Tais moléculas forneceriam novos alvos para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para uma variedade de hemoglobinopatias, em que a reativação da síntese de hemoglobina fetal melhoraria significativamente a severidade da doença e morbidade.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] São aqui proporcionados métodos e composições para o aumento dos níveis de β-globina fetal em uma célula através da ruptura da expressão de BCL11A ao nível genômico. Além disso, proporcionam-se aqui métodos e composições relacionadas com o tratamento de hemoglobinopatias por reindução de níveis de β-globina fetal.

[010] Um aspecto aqui descrito refere-se a um método para a produção de uma célula progenitora tendo mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos, o método compreendendo o contato de uma célula progenitora isolada com um agente que se liga ao DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), reduzindo, assim, o mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A

[011] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um método para a produção de uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética que compreende o contato de uma célula isolada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no mesmo

[012] Também aqui proporcionado, em outro aspecto é uma célula humana projetada genética isolada que possui pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação genética é uma deleção no DNA genômico no local especificado. Em uma modalidade, a célula humana projetada genética isolada reduziu ou diminuiu mRNA ou proteína de expressão de BCL11A em comparação com uma célula de controle que não tem uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 .

[013] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 aqui descrito, para a finalidade de aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero.

[014] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 aqui descrito para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero.

[015] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 aqui descrito para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero, em que os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero são aumentados.

[016] Outro aspecto aqui descrito é uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2. Em uma modalidade, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[017] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 com a finalidade de aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero.

[018] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero.

[019] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero, em que os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero são aumentado.

[020] Outro aspecto aqui descrito uma composição compreendendo pelo uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico de uma célula humana na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior. Em uma modalidade, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[021] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma composição compreendendo pelo uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico de uma célula humana na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, com a finalidade de aumentar os níveis de hemoglobina em um mamífero.

[022] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma composição compreendendo pelo uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico de uma célula humana na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero.

[023] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um uso de uma composição compreendendo pelo uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico de uma célula humana na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero, em que os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero são aumentados.

[024] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de um agente que se liga ao DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero, ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero, ou para reduzir a expressão de mRNA ou de BCL1 Ia, em que a expressão de mRNA ou proteína BCL11A é reduzida.

[025] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero ou para reduzir o mRNA ou a expressão de BCL11A, em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico de uma célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior

[026] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero ou para reduzir o mRNA ou a expressão de BCL11A, em que a enzima de direcionamento de DNA produz pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, o que afeta o mRNA ou a expressão de BCL11A. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação epigenética está na localização 60,716,189-60,728,612. Em outra modalidade, o efeito de uma modificação epigenética está reduzindo a expressão de mRNA ou proteína de BCL11A. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2 direta ou indiretamente afeta a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2.

[027] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de quaisquer células isoladas aqui descritos para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero.

[028] Em uma modalidade, é aqui proporcionada um uso de uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero, em que as células têm pelo menos uma modificação genética sobre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) feita pelo processo de contato das células com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), provocando, pelo menos, uma modificação genética no mesmo.

[029] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero, em que as células têm pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2 é a localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome). Em outra modalidade, pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2 é feita pelo processo de contato das células com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, em que a enzima de direcionamento de DNA produz pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômica da célula no cromossomo 2, que afeta a localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) causando no mesmo.

[030] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de quaisquer células isoladas aqui descritas ou de qualquer uma das composições aqui descritas para a fabricação de um medicamento para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero em necessidade do mesmo, ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero.

[031] Outro aspecto aqui descrito é um método de aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula, o método compreendendo as etapas de: contatar uma célula isolada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada na referida célula, ou a sua descendência, em relação à referida célula antes do referido contato.

[032] Outro aspecto aqui descrito é um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero em necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de contato de uma célula progenitora hematopoiética isolada no referido mamífero com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do referido contato.

[033] Outro aspecto aqui descrito é um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero em necessidade do mesmo, o método compreendendo transplantar uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética na localização 60716,189-60,728,612 do cromossomo 2 no mamífero .

[034] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero em necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de proporcionar uma população isolada de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero em ex vivo, e contatar a população de células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando, pelo menos, uma modificação genética no mesmo, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[035] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero em necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de proporcionar uma população isolada de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero, e contatar em ex vivo a população de células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando, pelo menos, uma modificação genética no mesmo, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[036] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de proporcionar o isolamento de uma população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas a partir do mamífero e a exclusão do DNA genômico das células na localização 60,716, 189-60,728,612 no cromossomo 2, causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[037] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de isolamento de uma população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero e a deleção ex vivo do DNA genômico das células na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[038] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero que compreende as etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas ou iPSCs; (b) contatar as células ex vivo ou in vitro com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato; e (c) administrar a etapa (b) no mamífero.

[039] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero que compreende as etapas de: (a) isolamento de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas a partir do mamífero; (b) contatar as células ex vivo ou in vitro com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato; e (c) administrar a etapa (b) no mamífero.

[040] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero que compreende as etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas ou iPSCs; (b) a deleção ex vivo do DNA genômico das células na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato; e (c) administrar as células da etapa (b) no mamífero.

[041] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero que compreende as etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas ou iPSCs; (b) a deleção ex vivo do DNA genômico das células na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato; e (c) administrar as células da etapa (b) no mamífero.

[042] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero (por exemplo, um ser humano) que compreende a introdução de uma composição aqui descrita que compreende células projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189- 60,728,612 do cromossomo 2, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero.

[043] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero (por exemplo, um ser humano) que compreende o aumento da expressão da hemoglobina fetal no mamífero por um método aqui descrito.

[044] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula isolada ou população isolada de células é/são células(s) humanas.

[045] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula isolada ou população isolada de células é/são células(s) de células progenitoras.

[046] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana é uma célula progenitora hematopoiética.

[047] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana é uma célula estaminal pluripotente induzida.

[048] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula estaminal pluripotente induzida é célula progenitora hematopoiética.

[049] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o progenitor hematopoiético é uma célula da linhagem eritróide.

[050] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula progenitora hematopoiética ou isolada é contatada ex vivo ou in vitro ou in vivo.

[051] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a pelo menos uma modificação genética é uma deleção.

[052] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, ou remove uma porção da região resultando em ruptura de um ou mais locais hipersensitivo de DNAse-1 (DHS).

[053] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais locais de hipersensibilidade de DNAse I (DHS) +62, +58, e +55, tais como aqui descritos na seção de Exemplos.

[054] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos marcadores SNP descritos na Tabela 2.

[055] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7.

[056] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 ou remove uma porção da região resultando em ruptura de um ou mais locais de hipersensibilidade de DNase I (DHS). Em uma modalidade, tal como é aqui utilizado, o termo “porção” no contexto da deleção genômica é, pelo menos, 20% a 80% da região especificada.

[057] Em outra modalidade de qualquer método de tratamento, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir o progenitor hematopoiético endógeno ou células estaminais no mamífero.

[058] Em uma modalidade de qualquer método, as células postas em contato com pelo menos uma modificação genética podem ser criopreservadas e armazenadas até as células serem necessárias para a administração a um mamífero.

[059] Em uma modalidade de um método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou células isoladas podem ser substituídas com iPSCs aqui descritas.

[060] Em uma modalidade de um método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs ou células isoladas são autólogas para o mamífero, ou seja, as células são derivadas do mesmo mamífero. Em outra das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs ou células isoladas são não-autólogas ao mamífero, ou seja, as células não são derivadas do mesmo mamífero, mas de um outro mamífero da mesma espécie. Por exemplo, o mamífero é um ser humano.

[061] Em uma modalidade de qualquer método de tratamento, o método compreende ainda a seleção de um mamífero na necessidade de um aumento da expressão da hemoglobina fetal.

[062] Em uma modalidade de qualquer método de tratamento, o método compreende ainda a seleção de um mamífero em necessidade de tratamento de uma hemoglobinopatia.

[063] Em qualquer modalidade de qualquer método de tratamento descrito, a hemoglobinopatia é uma β- hemoglobinopatia.

[064] Em qualquer modalidade de qualquer método de tratamento descrito, a hemoglobinopatia é β-talassemia.

[065] Em qualquer modalidade de qualquer método de tratamento descrito, a hemoglobinopatia é a anemia falciforme.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[066] A FIG. 1A mostra a distribuição de 636 SNPs anteriormente publicados para serem associado com características eritróides em P < 5 x 10-8, com respeito às sequências promotoras, exônicas, intrônicas, 3'UTR, e intergênicas. Para efeitos de comparação, a distribuição genômica destas regiões é apresentada.

[067] A FIG. 1B é um gráfico que representa a distribuição cumulativa das distâncias dos 636 SNPs associados à característica de eritróides em relação ao potenciador eritróide mais próximo. Potenciadores eritróides foram definidos por sequências de mais do que 2 kb a partir de TSSs de genes anotados com RefSeq com hipersensibilidade para DNAse I, presença de H3K4mel, ou H3K27ac ou H3K9ac, e ausência de H3K4me3 e H3K27me3. A distância da média ± DP de 50 conjuntos de 636 SNPs associados à característica não eritróides permutados aleatoriamente (a partir de base de dados GWAS), SNPs da matriz de genotipagem Affy 6.0, ou SNPs aleatórios também foram representados graficamente.

[068] A FIG. 2A mostra ChIP seguido de sequenciamento paralelo em massa realizado a partir de precursores eritróides derivados de células CD34+ com anticorpos para H3K27me3, H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, GATA1, TAL1, e PolII. Núcleos isolados a partir de precursores eritróides, cérebro fetal, e linfócitos T e B submetidos ao tratamento de DNAse I com locais de clivagem determinados por sequenciamento maciçamente paralelo. SNPs associados com HbF incluem aqueles associados com o nível de HbF ou número de célula F na P < 5 x 10-8 e SNPs sentinelas, aqueles com maior associação de HbF ou número de células F em um determinado GWAS. Três eritróides adjacentes DHS são rotulados como +62, +58, e +55 com base na distância em kb de BCLllA TSS.

[069] A FIG. 2B mostra ChIP-qPCR de precursores eritróides humanos primários em BCLllA íntron-2, normalizados para 1% de cromatina de entrada. DHS +62, +58, e +55 a partir da Figura 2A sombreada. Enriquecimento no lócus de controle negativo (GAPDH, OCT4) e controle positivo (β-globina LCR HS3 e α-globina HS-40) exibidos para comparação.

[070] A FIG. 2C mostra a captura de conformação de cromossomo realizada em precursores eritróides humanos primários através do lócus BCLllA usando promotor BCLllA como âncora. Frequência de interação é normalizada para interação LCR-HBB.

[071] A FIG. 3A mostra doadores anônimos saudáveis de quem as células estaminais hematopoiéticas/progenitoras estavam disponíveis foram genotipadas em rsl427407 para identificar indivíduos heterozigotos. Foram identificados cinco doadores. As células estaminais hematopoiéticas/progenitoras foram submetidas à cultura de diferenciação eritróide. Cromatina foi isolada a partir de eritroblastos, e imunoprecipitadas por GATA1 ou TAL1. DNA ChIP ou DNA de entrada foi submetido a uma reação de pirosenquenciamento para quantificar a abundância relativa dos rs1427407 alelo G.

[072] A FIG. 3B mostra dados de doadores anônimos saudáveis de quem as células estaminais hematopoiéticas/progenitoras estavam disponíveis foram genotipadas em rsl427407, rs7606173, e rs7569946 para identificar os indivíduos heterozigotos para o haplótipo rsl427407-rs7606173, bem como rs7569946. Foram identificados três doadores. Haplotipagem revelou que o rs7569946 alelo G estava no mesmo cromossomo, bem como o rsl427407 alelo G e rs7606173 alelo C em cada um. As células estaminais hematopoiéticas/progenitoras foram submetidas à cultura de diferenciação eritróide. RNA e DNA genômico foram isolados, e o cDNA foi produzido através de transcrição reversa. As amostras de gDNA e cDNA emparelhadas foram submetidas a uma reação de pirosenquenciamento para quantificar a abundância relativa do alelo G 7569946.

[073] FIG.3C mostra o meio HbF para haplótipos rsl427407-rs7606173 na coorte CSSCD. O nível de HbF no médio foi de 4,05% (SD 3,10) em 213 indivíduos rs1427407-rs7606173 G-C, 7,08% (SD 4,50) em 254 heterozigotos rs1427407- rs7606173 T-G/G-T, e 11,21% (SD 4,37) em 60 indivíduos rs1427407-rs7606173 T-G. Os valores de P correspondem a testes t de student de uma cauda. As frequências de haplótipos em CSSCD são: TG: 24,5%, TC 0,085%, GC 42,3%, GG 33,1%.

[074] As FIGs. 4A-4C mostram os dados a partir de um fragmento de 12,4 kb de BCL11A íntron-2 englobando o DHSS +62, +58 e +55 (englobando + 52,0-64,4 kb de TSS) clonado a montante de um promotor mínimo Hsp68 e gene repórter lacZ flanqueado por elementos isoladores H19. Embriões murinos transgênicos transientes gerados por injeção nuclear na fase de uma célula.

[075] A FIG. 4A mostra um embrião transgênico transitório E12,5 corado com X-gal.

[076] A FIG. 4B mostra suspensões de células isoladas a partir de sangue periférico e do fígado fetal de embriões E12,5 transgênicos estáveis. Citospinas foram coradas com X-gal e contrastadas com Nuclear Red.

[077] A FIG. 4C mostra dados de eritroblastos da medula óssea (CD71+/Ter119+) e linfócitos do baço (CD19+ para linfócitos B e CD3+ para linfócitos T) que foram isolados e classificados a partir de transgênicos estáveis jovens adultos. As células foram submetidas à coloração com X-gal ou isolamento de RNA seguido por RT-qPCR. A expressão de genes normalizou para GAPDH e expressou relativamente para linfócitos T, que expressam nem BCL11A nem lacZ.

[078] As FIGs. 5A-5C mostram células de eritroleucemia de camundongos (MEL) e células linfóides pró- B transfectadas com dois pares de TALENs cada uma concebida para gerar uma DSB em cada extremidade do potenciador de eritróide de íntron-2 de BCL11A de 10 kb ortólogo de +50,4+60,4 kb. Clones (chamados Δ50,4-60,4) foram isolados com deleção bialélica do segmento de 10 kb.

[079] A FIG. 5A mostra RT-qPCR realizada de Bcl11a com os pares de primers reconhecendo sequências a montante, abrangendo, e a jusante do íntron 2.

[080] A FIG. 5B mostra uma imunotransferência de Δ50,4-60,4 com anti-BCL11A.

[081] A FIG. 5C mostra a expressão do gene de globina em clones Δ50,4-60,4 MEL. Um par de primers comum reconhece as β-globinas adultas β2 e β1, enquanto primers independentes reconhecem β-globinas εy e βH1.

[082] A FIG. 6 mostra pronúcleos de zigoto de camundongos injetados com construto repórter lacZ. Embriões transgênicos foram isolados em E12,5. Os embriões foram genotipados por lacZ PCR. A fração de embriões transgénicos com coloração com X-gal de fígado fetal é relatada.

[083] A FIG. 7 mostra fragmentos de sequência de um a dois kb clonados em construtos potenciadores com promotor mínimo TK e GFP. Os construtos repórter potenciadores foram entregues por vetores lentivirais para precursores eritróides humanos primárias. As células transfectadas foram selecionadas por resistência a puromicina. A intensidade de fluorescência de meio GFP foi medida.

[084] A FIG. 8 mostra os dados relativos ao perfil da cromatina de células eritróides de camundongos que revela uma assinatura de potenciador ortólogo no íntron 2 de Bcl11a. Faixas de camundongos obtidas a partir do perfil global de cromatina eritroide de camundongo publicadas anteriormente, com modificações de histonas e clivagem de DNase-I de e GATA1 e TALI ChlP-seq a partir de. Retângulo pontilhado circunda a assinatura de potenciador ortólogo definindo o elemento de Δ50,4-60,4 direcionado para a deleção mediada por TALEN.

[085] A FIG. 9A é uma vista esquemática de uma estratégia de engenharia de genoma mediada por TALEN aqui utilizada. TALENs são nucleases específicas para a sequência. Dois pares de TALENs foram projetados para gerar rupturas dos filamentos duplos, um em Bcl11a +50,4 e o outro em +60,4. Os clones foram isolados que tinham reparado os dois DSBs por NHEJ com excisão do segmento de 10 kb de intervenção. Os clones foram rastreados por PCR com os primers 5', 3', internos e abrangendo a deleção de 10 kb.

[086] A FIG. 9B mostra Southern blotting de DNA genômico digerido com HindIII de clones Δ50,4-60,4 corroborados, em que estes clones esperaram alelo de excisão e careciam de um alelo de não-excisão.

[087] A FIG. 10 mostra sequenciamento de Sanger de produtos de PCR a partir de clones de Δ50,4-60,4. 5'(+50,4) e 3'(+60,4) para as sequências de reconhecimento de TALEN esquerda e direita com espaçadores intervenientes é mostrado. Alguns alelos mostraram evidência de ligação final diretamente a partir de cada sequência espaçadora digerida, ao passo que outros alelos mostraram perda de centenas de nucleotídeos adicionais. Apenas um alelo cada foi isolado a partir do clone MEL #1 e clone pró-B #2.

[088] A FIG. 11A mostra os dados dos genótipos obtidos em 1178 indivíduos de CSSCD para 38 variantes dentro de BCL11A +62, +58 ou +55 DHSS. A maioria das associações altamente significativas para nível de HbF entre SNPs comuns (MAF> 1%) (n = 10) antes de (rsl427407) ou seguinte (rs7606173) à análise condicionada a rsl427407. SNP coordenadas de cromossomo 2, construção l9.

[089] A FIG. 11B analisa a associação de HbF em BCL11A. Dados de genótipos obtidos em 1178 indivíduos de CSSCD para 38 variantes dentro de BCL11A 62+, 58+ ou 55+ DHSS. SNPs sentinelas são aqueles com a mais alta associação para nível de HbF ou número de célula F em GWAS anterior (712). Estes SNPs são mostrados com respeito ao íntron 2 de BCL11A com 3 a DHSs +62, +58 e +55 indicados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[090] Os métodos e composições aqui descritos referem-se, em parte, para a verificação de uma região reguladora a montante distal do gene BCL11A que pode regular a expressão da proteína BCL11A. A proteína BCL11A age como um regulador específico de fase da expressão de hemoglobina fetal reprimindo a indução de g-globina. Assim, os métodos e composições aqui proporcionados são novos métodos para a regulação da expressão da g-globina em células eritróides. Mais especificamente, estas atividades podem ser aproveitadas em métodos para o tratamento de b- hemoglobinopatias por indução de g-globina através da inibição do produto do gene BCL11A.

[091] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um método para produzir uma célula progenitora isolada tendo mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos, o método compreendendo o contato de uma célula progenitora isolada com um agente que se liga ao DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), reduzindo, assim, o mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A.

[092] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um método para produzir células progenitoras isoladas tendo mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos , o método compreendendo proporcionar uma célula progenitora isolada e o contato da célula progenitora isolada com um agente que se liga ao DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), reduzindo, assim, o mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A.

[093] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um método para produzir uma célula progenitora isolada tendo mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos, o método compreendendo o contato de uma célula progenitora isolada com um agente que se liga, produz uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, reduzindo desse modo a expressão de mRNA ou de proteína de BCL11A. Em uma modalidade, a modificação epigenética no DNA genômico é na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome).

[094] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um método para produzir uma célula progenitora isolada tendo mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos, o método compreendendo proporcionar uma célula progenitora isolada e o contato da célula progenitora isolada com um agente que produz uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, reduzindo assim a expressão de mRNA ou de proteína de BCL11A. Em uma modalidade, a modificação epigenética no DNA genômico é na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome).

[095] A descrição aqui descrita, numa modalidade preferida, não se refere a um processo de clonagem de seres humanos, os processos para modificação da identidade genética da linhagem germinal de seres humanos, a utilização de embriões humanos ou para fins de processos industriais ou comerciais para modificação da identidade genética de animais que são suscetíveis de lhes causar sofrimentos sem utilidade médica substancial para o homem ou animal, bem como os animais obtidos por esses processos.

[096] Um aspecto aqui descrito refere-se a um método para a produção de uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética, que compreende o contato de uma célula isolada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), causando pelo menos uma modificação genética no mesmo.

[097] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula isolada, o método compreendendo a diminuição do mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína na célula. Em um aspecto, a diminuição do mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína é alcançada, causando pelo menos uma modificação genética no DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome). Em outro aspecto, a diminuição do mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína é alcançada, causando pelo menos uma modificação genética no DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, que resulta em modificação epigenética da função genética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2. Neste aspecto, a atividade potenciadora de BCL11A situada dentro desta localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, é reduzida. Por redução neste aspecto, a atividade potenciadora no reforço da expressão de mRNA de BCL11A ou da proteína na célula é de pelo menos 5% inferior, pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50% inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais em comparação com uma célula de controle que não é tratada com qualquer método aqui descrito. Por redução neste aspecto da expressão de mRNA de BCL11A ou da proteína na célula ,significa que a expressão de proteínas é de pelo menos 5% inferior, pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos, 50 % inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais em comparação com uma célula de controle que não é tratada com qualquer método aqui descrito.

[098] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula isolada, o método compreendendo proporcionar uma célula humana isolada ou célula progenitora e diminuir o mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína na célula.

[099] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula, o método compreendendo as etapas de: contatar uma célula isolada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada na célula, ou a sua descendência, em relação à célula antes do contato.

[100] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula, o método compreendendo as etapas de: proporcionar uma célula humana isolada ou célula progenitora, contatar uma célula humana isolada ou célula progenitora com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada na célula, ou a sua descendência, em relação à célula antes do contato.

[101] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo a diminuição de mRNA de BCL11A ou expressão de proteína em uma célula progenitora hematopoiética no mamífero. Em um aspecto, a diminuição do mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína é alcançada, causando pelo menos uma modificação genética no DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome). Em outro aspecto, a diminuição do mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína é alcançada, causando pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2. Em outro aspecto, a diminuição do mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína é alcançada, causando pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2.

[102] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo proporcionar uma célula humana isolada ou célula progenitora a partir de um mamífero e diminuir mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína na célula. Em um aspecto, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de aumentar os níveis de hemoglobina fetal no mesmo.

[103] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de contato de uma célula progenitora hematopoiética isolada no mamífero com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vector que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que a endonuclease de direcionamento DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[104] Outro aspecto aqui descrito refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de proporcionar uma célula humana isolada ou célula progenitora ou uma população isolada de células progenitoras hematopoiéticas a partir do contato no mamífero de uma célula humana ou célula progenitora ou célula hematopoiética progenitora com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que a endonuclease de direcionamento DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[105] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo transplantar uma célula humana projetada genética tal como aqui descrita no mamífero.

[106] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o método compreende ainda o fornecimento de uma célula isolada ou uma célula progenitora isolada ou uma população isolada de células que podem ser células progenitoras ou células progenitoras hematopoiéticas.

[107] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula isolada é uma célula progenitora isolada.

[108] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula progenitora isolada é uma célula humana isolada.

[109] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana isolada é uma célula progenitora hematopoiética.

[110] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula hematopoiética é uma célula da linhagem eritróide. Os métodos de isolamento de células progenitoras hematopoiéticas são bem conhecidos na técnica, por exemplo, por purificação por citometria de fluxo de células CD34+ ou CD133+, micropérolas conjugadas com anticorpos contra CD34 ou CD133, marcadores de células progenitoras hematopoiéticas. Kits comerciais também estão disponíveis, por exemplo, MACS® Technology CD34 MicroBead Kit, humano, e CD34 MultiSort Kit, humano, e STEMCELL™ Technology EasySep™ Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Enrichment Kit.

[111] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana é uma célula estaminal pluripotente induzida (IPSC).

[112] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o contato de qualquer célula aqui descrita pode ser ex vivo ou in vitro ou in vivo.

[113] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o contato de qualquer célula aqui descrita compreende o contato com um agente que se liga ao DNA genômico da célula no cromossomo 2, e produz uma modificação epigenética no genoma da célula no cromossomo 2, reduzindo, assim, a expressão de mRNA ou de proteína de BCL11A. Em uma modalidade, a modificação epigenética está na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome).

[114] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2 afeta direta ou indiretamente a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2.

[115] Tal como aqui utilizado, “afeta indiretamente a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2” refere- se a efeitos de longa distância de modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2.

[116] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o contato de qualquer célula aqui descrita compreende o contato com um agente que liga o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), e produz uma modificação epigenética no cromossomo 2, reduzindo assim o mRNA ou a expressão da proteína de BCL11A.

[117] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o contato de qualquer célula aqui descrito compreende o contato com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, em que a enzima de direcionamento de DNA produz uma modificação epigenética no cromossomo 2, reduzindo, assim, a expressão de mRNA ou de proteína de BCL11A.

[118] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o contato de qualquer célula aqui descrito compreende o contato com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, em que a enzima de direcionamento de DNA produz uma modificação epigenética na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), reduzindo, assim, a expressão de mRNA ou de proteína de BCL11A. Em um aspecto, a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[119] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula hematopoiética progenitora, célula humana isolada, ou célula isolada é posta em contato ex vivo ou in vitro.

[120] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a pelo menos uma modificação genética é uma deleção. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a pelo menos uma modificação epigenética.

[121] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende essencialmente de um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos. Em outra modalidade, a deleção compreende um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos.

[122] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética compreende ou afeta um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos. Tal como aqui utilizada, a frase “afeta um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1” significa a função natural destes locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 são reduzidas, por exemplo, o acesso aos fatores de transcrição ou enzimas de degradação de DNA, tais como a DNase I. Em geral, os locais hipersensíveis de DNase I (DHSS) são regiões de cromatina que são sensíveis à clivagem pela enzima DNase I. Nestas regiões específicas do genoma, a cromatina perdeu a sua estrutura condensada, expondo o DNA, e tornando-o acessível. Isto aumenta a disponibilidade do DNA à degradação por enzimas, como a DNase I. Estas zonas de cromatina acessíveis são funcionalmente relacionadas com a atividade de transcrição, uma vez que este estado reformado é necessário para a ligação de proteínas, tais como fatores de transcrição. Assim, a modificação aqui contemplada epigenética resulta em menor acesso à enzimas de degradação de DNA, que é pelo menos 5% inferior, pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50% inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais em comparação com uma célula de controle que não é tratada em qualquer método aqui descrito.

[123] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste essencialmente de um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste em um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2.

[124] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética compreende ou afetar um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2. Tal como aqui utilizado, a frase “afetar um ou mais dos marcadores de SNP” significa a função natural(s) destes SNPs são reduzidas, por exemplo, o acesso a fatores de transcrição. Por exemplo, a metilação desses SNPs reduziria a ligação de fatores de transcrição, conduzindo ao mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos.

[125] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste essencialmente de um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste em um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção é a partir de 60,716,189 a 60,728,612, a partir de 60,716,189 a 60,723,870, a partir de 60,722,992 a 60,728,612, a partir de 60,717,236 a 60,719,036, a partir de 60,722,006 a 60,723,058, a partir de 60,724,917 a 60,726,282, a partir de 60,616,396 a 60,618,032, a partir de 60,623,536 a 60,624,989, a partir de 60,626,565 a 60,628,177, a partir de 60,717,236 a 60,719,036, a partir de 60,721,212 a 60,722,958, a partir de 60,724,780 a 60,726,471, a partir de 60,739,075 a 60,740,154, a partir de 60,748,003 a 60,749,009, a partir de 60,826,438 to 60,827,601, ou a partir de 60,831,589 a 60,833,556.

[126] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética compreende ou afetar um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Tal como aqui utilizada, a frase “afeta um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7” significa a função(s) natural destes fragmentos são reduzidas, por exemplo, acesso aos fatores de transcrição. Por exemplo, a metilação desses fragmentos reduziria a ligação de fatores de transcrição, conduzindo à redução do mRNA ou a expressão da proteína de BCL11A.

[127] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética é a partir de 60,716,189 a 60,728,612,a partir de 60,716,189 a 60,723,870, a partir de 60,722,992 a 60,728,612, a partir de 60,717,236 a 60,719,036, a partir de 60,722,006 a 60,723,058, a partir de 60,724,917 a 60,726,282, a partir de 60,616,396 a 60,618,032, a partir de 60,623,536 a 60,624,989, a partir de 60,626,565 a 60,628,177, a partir de 60,717,236 a 60,719,036, a partir de 60,721,212 a 60,722,958, a partir de 60,724,780 a 60,726,471, a partir de 60,739,075 a 60,740,154, a partir de 60,748,003 a 60,749,009, a partir de 60,826,438 a 60,827,601, ou a partir de 60,831,589 a 60,833,556.

[128] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 ou remove uma porção da região resultando em ruptura de um ou mais locais de hipersensibilidade de DNAse 1 (DHS). Tal como aqui utilizado, o termo “ruptura” refere- se a uma diminuição da transcrição eritróide de BCL11A em uma célula, compreendendo uma interrupção de um ou mais locais hipersensíveis à DNAse-1, pelo menos 10% (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30% , pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mesmo 100% (isto é, transcrição eritróide não detectável )) em comparação com uma célula não possuindo uma tal perturbação. Em uma modalidade, a interrupção compreende uma incapacidade de um local de hipersensibilidade de DNAse-1 modificado para ligar aos seus fatores de transcrição nativos (por exemplo, GATA1 e TAL1).

[129] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética que interfere com o estabelecimento e/ou manutenção da assinatura epigenética na região potenciadora na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), levando assim a expressão de mRNA ou proteína de BCL11A reduzidos, e aumento da expressão de hemoglobina fetal no mamífero.

[130] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética que interfere com o estabelecimento e/ou manutenção da assinatura epigenética na região potenciadora na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) inclui, mas não está limitada a modificações epigenéticas que afetam a sensibilidade de DNase I, modificações epigenéticas que afetam modificações de histonas, modificações epigenéticas que afeta a ligação de GATA1/TAL1, e modificações epigenéticas que afetam a interação do promotor de longo alcance do promotor de BCL11A.

[131] Por exemplo, a modificação epigenética que interfere com o estabelecimento e/ou manutenção da assinatura epigenética na região potenciadora na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, inclui, mas não se limita a, pelo menos, uma deleção dentro da localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, tal que a função global desta região é afetada por meio do mRNA e expressão de BCL11A é reduzida ou diminuída. Por exemplo, a deleção está em regiões de sensibilidade de DNAse I, localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, por exemplo, +62, +58, e +55. A deleção pode ser no+ 62 ou +58 ou +55 ou uma combinação destes. Por exemplo, em +62 e +58, +58 e +55, +62 e +55, ou em todos os três +62, +58, e +55.

[132] Como outro exemplo, uma modificação epigenética que interfere com o estabelecimento e/ou manutenção da assinatura epigenética na região potenciadora na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 inclui, mas não se limita a alterações nas modificações das histonas no cromossomo 2, que não estão na posição 60,716,189-60,728,612, ou mudanças nas modificações de histonas no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, ou ambas as modificações de histona no cromossomo 2 sem ser na localização 60,716,189-60,728,612, bem como na localização 60,716,189-60,728,612, de tal forma que a função global desta região é afetada, em que o mRNa e expressão de BCL11A é reduzida ou diminuída.

[133] Em outra modalidade, uma modificação epigenética que interfere com o estabelecimento e/ou manutenção da assinatura epigenética na região potenciadora na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 inclui, mas não se limita a uma inserção de pelo menos uma sequência de repressor específico projetado que muda as características epigenéticas de elementos não-codificadores na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 e, portanto, resultam na repressão da expressão do gene alvo. O primeiro é especificamente focado em potenciadores individuais epigeneticamente reprimidos. Em outras palavras, a inserção de sequências repressoras específicas projetadas no cromossomo 2 interfeririam prospectivamente com a modificação epigenética no potenciador eritróide BCL11A que eventualmente conduz à expressão do gene BCL11A reduzida.

[134] Quaisquer métodos conhecidos na técnica podem ser usados para produzir a modificação epigenética contemplada. Por exemplo, tal como descrito em Mendenhall EM et al., Nat. Biotechnol. 08 de setembro de 2013, e Maeder ML et al., Nat Biotechnol. 09 de outubro de 2013.

[135] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a inserção de pelo menos uma sequência repressora específica projetada em qualquer localização do cromossomo 2 resulta em, mas não está limitada a regiões de sensibilidade reduzida a DNaseI no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, por exemplo, +62, +58, e +55; aumento das modificações de histonas no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612; fatores de transcrição reduzidos que se ligam ao GATA1/TAL1 da região potenciadora no cromossomo 2 na localização 60,716,18960,728,612; e interação reduzida ou enfraquecida entre o cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, com o promotor BCL11A.

[136] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, os efeitos globais da inserção de pelo menos uma sequência de repressor específico projetado em qualquer localização do cromossomo 2 é mRNA e expressão de BCL11A reduzidou ou enfraquecidos.

[137] Em algumas modalidades, tal como utilizado no contexto de mRNA e expressão de BCL11A, a interação entre o cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 ou potenciador de BCL11A com o promotor BCL11A, e ligação de fatores de transcrição para GATA1/TAL1 da região estimuladora, o termo “reduzida” ou “diminuída” refere-se a pelo menos 5% inferior, pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50% inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos100 vezes inferior , pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais em comparação com a situação de controle que está na ausência da modificação epigenética ou inserção de sequências modificadas aqui descritas. Por decréscimo de mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína na célula significa que a expressão de proteínas é de pelo menos 5% inferior, pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50 % inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais em comparação com uma célula de controle que não tem a alteração epigenética ou inserção de sequências modificadas aqui descritas.

[138] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a inserção de pelo menos uma sequência de repressor específico projetada ocorre dentro das regiões de sensibilidade de DNaseI do cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, por exemplo,+62, +58, e +55. A inserção pode ser na extremidade 5' de +62 ou +58 ou +55 ou na extremidade 3' de +62 ou +58 ou +55, ou entre +62 e +58, ou entre +58 e +55, ou entre +55 e +62.

[139] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a inserção de pelo menos uma sequência repressora específica projetada altera as regiões de sensibilidade de DNase I do cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612.

[140] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as modificações epigenética alteram as regiões de sensibilidade de DNaseI na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2.

[141] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as modificações epigenéticas alteram as modificações de histonas na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2.

[142] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a inserção de pelo menos uma sequência repressora específica projetada altera as modificações de histonas na localização 60,716,18960,728,612 do cromossomo 2.

[143] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as modificações epigenéticas mudam da ligação a GATA1/TAL1 da região potenciadora do cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, de tal modo que a função global desta região é afetada por meio do mRNA e a expressão de BCL11A é reduzida ou diminuída. Por exemplo, a ligação de fatores de transcrição para GATA1/TAL1.

[144] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a inserção de pelo menos uma sequência repressora específica projetada ocorre dentro de GATA1/TAL1, tal como aqui descrito. A inserção pode ser na extremidade 5' ou extremidade 3' de GATA1 ou TAL1. A inserção pode ser entre GATA1 e TAL1. A inserção altera a ligação GATA1/TAL1 da região potenciadora do cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, de tal modo que a função global desta região é afetada por meio do mRNA e a expressão de BCL11A é reduzida ou diminuída. Por exemplo, a ligação de fatores de transcrição para GATA1/TAL1.

[145] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a modificação epigenética altera a interação entre o potenciador de BCL11A e o promotor de BCL11A. Em uma modalidade, a interação é reduzida ou enfraquecida de modo que a função global desta região é afetada, por meio do que mRNA e a expressão de BCL11A é reduzida ou diminuída.

[146] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as modificações epigenética alteram a interação entre o cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, com o promotor BCL11A. Em uma modalidade, a interação é reduzida ou enfraquecida de modo que a função global desta região é afetada, por meio do que mRNA e a expressão de BCL11A é reduzida ou diminuída.

[147] Também aqui proporcionado, em outro aspecto está uma célula humana projetada genética isolada possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) produzida pelo processo de contatar a célula com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no mesmo.

[148] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana projetada genética isolada possui pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2. Em outro aspecto deste e de todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana projetada genética isolada possui pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612.

[149] Em alguns aspectos de qualquer uma dessas células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação epigenética, as células são transplantadas para um mamífero para utilização no aumento da hemoglobina fetal no mamífero.

[150] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana projetada genética isolada possuindo pelo menos uma modificação genética no DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 é transplantada para um mamífero para utilização no aumento da fetal hemoglobina no mamífero.

[151] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana projetada genética isolada possuindo pelo menos uma modificação genética no DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 é armazenada para uso posterior por criopreservação.

[152] Em alguns aspectos de qualquer uma dessas células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação epigenética, as células são guardadas para uso posterior por criopreservação.

[153] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula humana projetada genética isolada possuindo pelo menos uma modificação genética no DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 é criopreservada, descongelada e transplantada no mamífero para uso no aumento da hemoglobina fetal no mamífero.

[154] Em alguns aspectos de qualquer dessas células humanas projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação epigenética, criopreservadas, descongeladas e transplantadas em mamífero para utilização no aumento da hemoglobina fetal no mamífero.

[155] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas, em que as células têm pelo menos uma modificação genética no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) produzida pelo processo de contatar as células com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) causando pelo menos uma modificação genética no mesmo.

[156] Outro aspecto aqui fornecido refere-se a uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas modificadas, em que as células têm pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2 está na localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome). Em outra modalidade, pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2 é feita pelo processo de contato das células com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, segundo o qual a enzima de direcionamento de DNA produz pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, que afeta a localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) causando na mesma

[157] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a composição causa um aumento no mRNA de hemoglobina fetal ou a expressão da proteína na célula de contato.

[158] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as células de todas as composições descritas são autólogas ao mamífero, que é o receptor das células em um procedimento de transplante, isto é.,as células da composição são derivadas ou colhidas a partir do mamífero, antes de qualquer modificação descrita.

[159] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as células de todas as composições descritas são não-autólogas para o mamífero que é o receptor das células em um procedimento de transplante, isto é, as células da composição não são derivadas ou colhidas a partir do mamífero, antes de qualquer modificação descrita.

[160] Em modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as células de todas as composições descritas são para o tipo de HLA combinado com o mínimo para o mamífero que é o receptor das células em um procedimento de transplante.

[161] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as células de todas as composições descritas são células progenitoras isoladas antes de qualquer modificação descrita.

[162] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as células de todas as composições descritas são células progenitoras hematopoiéticas isoladas, antes de qualquer modificação descrita.

[163] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, as células de quaisquer composições descritas são células estaminais pluripotentes isoladas induzidas antes de qualquer modificação descrita.

[164] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende essencialmente de um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos. Em outra modalidade, a deleção compreende um ou mais dos locais de hipersensibilidade de DNAse-1 (DHS) +62, +58, e +55 , tal como aqui descrito na seção de Exemplos. Em uma modalidade, tal como é aqui utilizado, o termo “porção” no contexto da deleção genômico é, pelo menos, 10% até cerca de 100% da região especificada. Em outras modalidades, a porção deletada é pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mesmo 100% da região especificada.

[165] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste essencialmente de um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste em um ou mais dos marcadores de SNP descritos na Tabela 2.

[166] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção compreende um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste essencialmente de um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção consiste em um ou mais dos fragmentos listados na Tabela 7. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção é a partir de 60,716,189 a 60,728,612, a partir de 60,716,189 a 60,723,870, a partir de 60,722,992 a 60,728,612, a partir de 60,717,236 a 60,719,036, a partir de 60,722,006 a 60,723,058, a partir de 60,724,917 a 60,726,282, a partir de 60,616,396 a 60,618,032, a partir de 60,623,536 a 60,624,989, a partir de 60,626,565 a 60,628,177, a partir de 60,717,236 a 60,719,036, a partir de 60,721,212 a 60,722,958, a partir de 60,724,780 a 60,726,471, a partir de 60,739,075 a 60,740,154, a partir de 60,748,003 a 60,749,009, a partir de 60,826,438 a 60,827,601, ou a partir de 60,831,589 a 60,833,556.

[167] Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) ou remove uma porção da região que resulta na ruptura de um de mais locais hipersensíveis de DNAse I (DHS).

[168] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de aumentar a hemoglobina fetal.

[169] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o mamífero foi diagnosticado com uma hemoglobinopatia.

[170] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o mamífero em necessidade de aumentar a hemoglobina fetal foi diagnosticado com uma hemoglobinopatia.

[171] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a hemoglobinopatia é uma □hemoglobinopatia.

[172] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a hemoglobinopatia é a doença das células falciformes.

[173] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a hemoglobinopatia é a □talassemia.

[174] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a célula em contato, células humana, células progenitoras hematopoiéticas ou a sua progênie é administrada ao mamífero.

[175] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de proporcionar uma população isolada de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero em ex vivo, e o contato da população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,18960,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato. Em outra modalidade deste método, a população de células progenitoras contatadas ou estaminais hematopoiéticas tendo uma expressão aumentada de hemoglobina fetal é criopreservada e armazenada ou reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade, a população de células criopreservadas ou hematopoiéticas progenitoras ou estaminais tendo uma expressão aumentada de hemoglobina fetal pode ser descongelada e, em seguida, reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais podem ser substituídas com uma iPSCs aqui descrita.

[176] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de isolamento de uma população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero, e o contato ex vivo na população de células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato. Em outra modalidade deste método, a população contatada ex vivo ou de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais possuindo uma expressão aumentada de hemoglobina fetal é criopreservada e armazenada ou reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade, a população de células criopreservadas ou hematopoiéticas progenitoras ou estaminais tendo uma expressão aumentada de hemoglobina fetal pode ser descongelada e, em seguida, reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, o progenitor hematopoiético ou as células estaminais podem ser substituídos com uma iPSCs derivada do mamífero. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero com necessidade de um aumento da expressão de hemoglobina fetal.

[177] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de proporcionar o isolamento de uma população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero e a deleção do DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do referido contato. Em outra modalidade deste método, a população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais com DNA genômico deletado e tendo uma expressão de hemoglobina fetal aumentada é criopreservada e armazenada ou reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade, a população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais com DNA genômico deletado e tendo uma expressão de hemoglobina fetal aumentada pode ser descongelada e, em seguida, reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais podem ser substituídas com uma iPSCs aqui descrita. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são análogas ao mamífero, ou seja, as células são derivadas do mesmo mamífero. Em outra modalidade do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs não são análogas ao mamífero, ou seja, as células não são derivadas do mesmo mamífero, mas de um outro mamífero da mesma espécie. Por exemplo, o mamífero é um ser humano. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero com necessidade de um aumento da expressão de hemoglobina fetal.

[178] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero com necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de isolamento de uma população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas de mamífero ex vivo e a deleção do DNA genômico das células no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do referido contato. Em outra modalidade deste método, a população de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais com DNA genômico deletado e tendo uma expressão de hemoglobina fetal aumentada é criopreservada e armazenada ou reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade, a população de células criopreservadas ou hematopoiéticas progenitoras ou estaminais tendo uma expressão aumentada de hemoglobina fetal pode ser descongelada e, em seguida, reintroduzida no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, o progenitor hematopoiético ou as células estaminais podem ser substituídos com uma iPSCs derivada do mamífero. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero com necessidade de um aumento da expressão de hemoglobina fetal.

[179] Em uma modalidade de qualquer método descrito, o método compreende ainda selecionar um mamífero com necessidade de um aumento da expressão da hemoglobina fetal. Exemplos de mamífero em necessidade de um aumento da expressão da hemoglobina fetal é um que foi diagnosticado com uma hemoglobinopatia.

[180] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero que compreende as etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas ou iPSCs; (b) contatar as células ex vivo ou in vitro com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do referido contato; e (c) administrar a etapa (b) no mamífero.

[181] Em uma modalidade de qualquer método, as células após a etapa (b) podem ser criopreservadas até que elas são necessárias para a administração no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são autólogas para o mamífero, ou seja, as células são derivadas do mesmo mamífero. Em outra modalidade do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são não-autólogas ao mamífero, ou seja, as células não são derivadas do mesmo mamífero, mas de um outro mamífero da mesma espécie. Por exemplo, o mamífero é um ser humano.

[182] Em uma modalidade de qualquer método descrito, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de tratamento de uma hemoglobinopatia.

[183] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero que compreende as etapas de: (a) isolamento de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas a partir do mamífero; (b) contatar as células ex vivo ou in vitro com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do referido contato; e (c) administrar a etapa (b) no mamífero.

[184] Em uma modalidade, as células após a etapa (b) podem ser criopreservadas até que elas sejam necessárias para a administração no mamífero. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de tratamento de uma hemoglobinopatia.

[185] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero, que compreende as etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas ou iPSCs; (b) a deleção ex vivo do DNA genômico das células no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do referido contato; e (c) administrar as células da etapa (b) no mamífero.

[186] Em uma modalidade, as células após a etapa (b) podem ser criopreservadas até que elas sejam necessárias para a administração no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer uma das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são análogas ao mamífero, ou seja, as células são derivadas do mesmo mamífero. Em outra das modalidades do método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são não análogas a um mamífero, ou seja, as células não são derivadas do mesmo mamífero, mas de um outro mamífero da mesma espécie. Por exemplo, o mamífero é um ser humano. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de tratamento de uma hemoglobinopatia.

[187] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero, que compreende as etapas de: (A) isolamento de células progenitoras hematopoiéticas ou células estaminais hematopoiéticas a partir do mamífero; (b) a deleção ex vivo do DNA genômico das células no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do referido contato; e (c) administrar as células da etapa (b) no mamífero.

[188] Em uma modalidade, as células após a etapa (b) podem ser criopreservadas até que elas sejam necessárias para a administração no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de tratamento de uma hemoglobinopatia.

[189] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero (por exemplo, um ser humano) que compreende a introdução de uma composição aqui descrita que compreende células projetadas genéticas isoladas possuindo pelo menos uma modificação genética no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, em que a expressão da hemoglobina fetal é aumentada no mamífero. Em outra modalidade do presente método, o método compreende a quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar ou reduzir as células progenitoras hematopoiéticas endógenas ou células estaminais no mamífero. Em qualquer modalidade do método, o método compreende ainda selecionar um mamífero em necessidade de tratamento de uma hemoglobinopatia.

[190] Em uma modalidade, esta invenção proporciona um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um mamífero (por exemplo, um ser humano) que compreende o aumento da expressão da hemoglobina fetal no mamífero por um método aqui descrito.

[191] Em qualquer modalidade de qualquer método de tratamento descrito, a hemoglobinopatia é uma β- hemoglobinopatia.

[192] Em qualquer modalidade de qualquer método de tratamento descrito, a hemoglobinopatia é β-talassemia.

[193] Em qualquer modalidade de qualquer método de tratamento descrito, a hemoglobinopatia é a anemia falciforme.

[194] Em uma modalidade de qualquer método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são autólogas para o mamífero, ou seja, as células são derivadas do mesmo mamífero. Em outra modalidade de qualquer método descrito, as células progenitoras hematopoiéticas ou estaminais ou iPSCs são não- autólogas ao mamífero, ou seja, as células não são derivadas do mesmo mamífero, mas de um outro mamífero da mesma espécie. Por exemplo, o mamífero é um ser humano.

[195] Em uma modalidade de qualquer método descrito, o contato de qualquer célula aqui descrita pode ser ex vivo ou in vitro ou in vivo.

[196] Em outra modalidade de qualquer método descrito, o contato de qualquer célula aqui descrita compreende o contato com um agente liga o DNA genômico da célula no cromossomo 2 e produz uma modificação epigenética no genoma da célula no cromossomo 2, reduzindo assim o mRNA ou a expressão da proteína de BCL11A. Em uma modalidade, a modificação epigenética está na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome).

[197] Em outra modalidade de qualquer método descrito, o contato de qualquer célula aqui descrita compreende o contato com um agente que liga o DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,18960,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), e produz uma modificação epigenética no cromossomo 2, reduzindo, assim, a expressão de mRNA ou proteína de BCL11A.

[198] Em outra modalidade de qualquer método descrito, o contato de qualquer célula aqui descrita compreende o contato com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, segundo a qual o DNA de direcionamento de enzima produz uma modificação epigenética no cromossomo 2, reduzindo, assim, a expressão de mRNA ou proteína de BCL11A.

[199] Em outra modalidade de qualquer método descrito, o contato de qualquer célula aqui descrito compreende o contato com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, segundo o qual a enzima de direcionamento de DNA produz uma modificação epigenética na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) reduzindo, assim, a expressão de mRNA ou proteína BCL11A. Em um aspecto, a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no mamífero, em relação à expressão antes do contato.

[200] Em outra modalidade de qualquer método descrito, a células hematopoiéticas progenitoras, células humanas isoladas, ou células isoladas é posta em contato ex vivo ou in vitro.

[201] Em outra modalidade de qualquer método descrito a pelo menos uma modificação genética é uma deleção. Em outra modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, a pelo menos uma modificação epigenética.

[202] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de um agente que se liga ao DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero, ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero ou para reduzir mRNA ou a expressão de BCL11A, em que a expressão de mRNA ou proteína de BCL11A é reduzida.

[203] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero, ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero ou para reduzir mRNA ou a expressão de BCL11A, em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico da célula no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612 causando, pelo menos, uma modificação genética no mesmo.

[204] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero, ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero ou para reduzir mRNA ou a expressão de BCL11A, em que a enzima de direcionamento de DNA produz pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, o que afeta o mRNA ou a expressão de BCL11A. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação epigenética está na posição 60,716,189-60,728,612. Em outra modalidade, o efeito de uma modificação epigenética é reduzir o mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A.

[205] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de quaisquer células isoladas aqui descritas para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero.

[206] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma composição contendo as células humanas projetadas genéticas isoladas para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero, em que as células têm, pelo menos, uma modificação genética no cromossomo 2 na localização 60,716,18960,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), feita pelo processo de contato de células com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que a endonuclease de direcionamento de DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no mesmo.

[207] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de uma composição que compreende células humanas projetadas genéticas isoladas para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero, em que as células têm pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2 está na localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome). Em outra modalidade, pelo menos uma modificação epigenética no cromossomo 2 é feita pelo processo de contato das células com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma enzima de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma enzima de direcionamento de DNA, segundo o qual a enzima de direcionamento de DNA produz pelo menos uma modificação epigenética no DNA genômico da célula no cromossomo 2, que afeta a localização 60,716,189-60,728,612 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome) causando na mesma

[208] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um uso de quaisquer células isoladas aqui descritas ou de qualquer uma das composições aqui descritas para a fabricação de um medicamento para aumentar a hemoglobina fetal em um mamífero ou para o tratamento de uma hemoglobinopatia no mamífero.

[209] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, a composição provoca um aumento no mRNA de hemoglobina fetal ou a expressão da proteína na célula de contato.

[210] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células de quaisquer composições descritas são autólogas ao mamífero, que é o receptor das células em um procedimento de transplante, isto é., as células da composição são derivadas ou colhidas do mamífero antes de qualquer modificação descrita.

[211] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células de quaisquer composições descritas são não-autólogas para o mamífero que é o receptor das células em um procedimento de transplante, isto é., as células da composição não são derivadas ou colhidas a partir do mamífero, antes de qualquer modificação descrita.

[212] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células quaisquer composições descritas são para o tipo de HLA mínimo combinado com o mamífero que é o receptor das células em um procedimento de transplante.

[213] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células de quaisquer composições descritas são células progenitoras isoladas antes de qualquer modificação descrita.

[214] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células de quaisquer composições descritas são células progenitoras hematopoiéticas isoladas, antes de qualquer modificação descrita.

[215] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células de quaisquer composições descritas são células estaminais pluripotentes isoladas induzidas antes de qualquer modificação descrita.

[216] Em uma modalidade de uso da composição aqui descrita, as células de quaisquer composições descritas são criopreservadas antes de usar.

[217] Sabe-se que existem variações associadas com HBF em BCL11A. Seis GWAS do nível de HbF (ou o número de célula F de característica altamente correlacionada) têm sido realizados em indivíduos de ascendência Européia, Africana e Asiática, cada um identificando variantes associadas à característica dentro de BCL11A (7-12). As mesmas variantes estão associadas com a gravidade clínica de SCD e β-talassemia (9, 10, 50), consistente com HbF como um modificador principal destas desordens. Variação em BCL11A é estimada para explicar ~ 15% da variância da característica no nível de HbF (7, 12, 43). Quatro SNPs diferentes foram identificados como mais altamente associados à característica (rs1427407 (7), rs11886868 (8), rs4671393 (9) e rs766432 (10-12)); estes agrupamentos de SNPs sentinelas dentro de 3 kb de um do outro no íntron 2 de BCL11A (Figs. 2A e 11B). Haplótipos incluindo os SNPs sentinela aparentam melhor explicar a associação de HbF do que qualquer SNP individual (12, 43). Cinquenta SNPs no lócus de BCL11A e vinte e sete SNPs dentro do íntron-2 foram associados com níveis de HbF com significância em todo o genoma (P <5 x 108). Apesar dos esforços de requensiamento em grande escala, as variantes de codificação de BCL11A não foram descritas (43).

[218] Anteriormente, os inventores usaram CSSCD para mapear finamente o sinal de associação com HbF no locus BCL11A, e relataram uma forte associação com rs4671393 (43). Nesse estudo, rs1427407 foi imputado. Dois SNP rs766432 adicionais, e rs11886868 também foram identificados em estudos anteriores como SNPs sentinelas mais altamente associados com as características (8, 10, 11, 51). Em um subgrupo de indivíduos (n = 728) para os quais genótipos em todos os quatro SNPs sentinela estavam disponíveis, o resultado da associação não foi significativo em rs4671393, rs766432 ou rs11886868 seguindo o condicionamento em genótipos em rs1427407; Por outro lado, a associação permaneceu altamente significativa para rs1427407 após acondicionamento em rs4671393, rs766432 ou rs11886868 (Tabela 4). Portanto, rs1427407 é o SNP mais fortemente associado com o nível de HbF no DHSs eritróide e melhor conta para a associação característica do que outros SNPs sentinelas anteriormente descritos.

[219] Análise condicional demonstrou associações que permaneceram significativas após condicionado em rs1427407. A associação residual mais significativa foi para rs7606173 em DHS +55 (P = 9,66 x 10-11); rs7599488 em DHS +62, a qual havíamos relatado anteriormente (43), foi apenas ligeiramente menos significativa (P = 2,43 x 10-10) (Tabela 1). Análise de variantes de sequência de DNA dentro dos três DHSs não deu sinais adicionais independentes associados com HbF (Tabela 5).

[220] Os inventores verificaram que a ligação do fator de transcrição de alelo (TF) específico de ligação é envolvida com expressão de BCL11A. Estudos bioquímicos específicos de alelo foram realizados utilizando heterozigotos informativos para controlar as diferenças de trans-atuação entre as amostras e para garantir a igualdade de abundância de ambos os alelos, justificados por uma representação igual de alelos em gDNA emparelhado (Fig. 2B e 2C). rs1427407 se encontra diretamente no centro de um pico de ligação de GATA1 e TAL1 em DHS +62 (Fig. 2B). Nos ensaios realizados ChIP, a cromatina foi sonicada para fragmentos de aproximadamente 500 bp. As cinco amostras precursoras eritróides humanas primárias heterozigotas para rs1427407 usadas para ChIP-qPCR foram sequenciadas por Sanger no DHSs eritróide. O único outro SNP heterozigótico dentro de 500-bp de rs1427407 em qualquer uma destas amostras foi rs7599488 (304-bp 3’ de rs1427407), que foi heterozigótico em apenas duas das cinco amostras. Este SNP não são abrange os motivos de ligação GATA1 ou TAL1. Por conseguinte, parece improvável que outro SNP dentro de DHS +62 poderia explicar a ligação de TF alelo-específica observada.

[221] Além disso, os inventores descobriram que há uma associação entre a expressão de BCL11A e o nível de HbF. Os estudos dos inventores fornece uma estimativa da alteração na expressão de BCL11A que pode resultar em um aumento clinicamente significativo no nível de HbF. Dentre um conjunto limitado de linhagens de células linfoblastóides humanas foram relatados previamente a correlação de alelo A de HbF elevado associado de rs4671393 com expressão de BCL11A reduzida (13). Extensão destas experiências com um conjunto maior de linhagens genotipadas não conseguiu confirmar esta observação. Assim, os inventores verificaram que o haplótipo rs1427407-rs7606173 de HbF elevado associado influencia a expressão de BCL11A em um contexto específico-eritróide, uma possibilidade consistente com os resultados de sensibilidade de DNase I. Expressão de mRNA de BCL11A em precursores eritróides primários diferiram por 1,7 vezes entre os haplótipos rs1427407-rs7606173 T-G de HbF elevado e G-C de HbF baixo (Fig 3B.); correspondentemente, os níveis médios de HbF foram de 10,6% e 3,1% em homozigotos T-G e G-C, respectivamente (Fig. 3C). De nota, os resultados demonstrando a expressão específica de alelo de BCL11A em células eritróides humanas primárias foram observados em células heterozigóticas para o haplótipo rs1427407- rs7606173, e, assim, os efeitos modestos sobre a expressão de BCL11A refletem os efeitos combinados de todos os SNPs funcionais dentro do haplótipo. Enquanto a herança de um haplótipo de BCL11A protetor é clinicamente benéfica em uma base populacional (9, 10, 50), o nível médio de HbF em homozigotos T-G permanece abaixo do necessário para prevenir a morbilidade de SCD. A sensibilidade do nível de HbF para a expressão BCL11A, no entanto, prevê que o alívio da gravidade da doença pode exigir apenas mais uma redução modesta na expressão de BCL11A.

[222] Os inventores investigaram ainda a regulação do desenvolvimento de genes de globina e BCL11A. Durante o desenvolvimento humano, ε-globina derivada do saco vitelino é substituída no primeiro trimestre pela y-globina derivada do fígado fetal. Após o nascimento, conforme a eritropoiese se desloca do fígado para a medula óssea, y-globina está gradualmente silenciada e β-globina predomina. Apenas um único interruptor na expressão do gene de globina ocorre na ontogenia de camundongo. Durante esta transição, que ocorre em meados de gestação, os eritrócitos primitivos derivados do saco vitelino circulante expressam globinas εy e βH1 em estágio embrionário, enquanto que os eritroblastos definitivos do fígado fetal expressam β1 and β2-globinas em estágio adulto. Concordante com esta chave de desenvolvimento, BCL11A é expressa na linhagem eritróide definitiva, mas não em fase primitiva e requerida para a alteração na expressão do gene de globina (16, 52).

[223] Nas linhagens repórter transgénicas BCL11A + 52,0-64,4 estáveis em 10,5 dpc, a expressão de lacZ foi observada apenas no primórdio de fígado fetal e não no sangue que circula dentro do embrião, da placenta ou do saco vitelino (Fig. 6A). Estes resultados, juntamente com a verificação da expressão de lacZ nos eritroblastos de fígado fetal definitivo de nas 12,5 dpc, mas não em eritrócitos circulantes primitivos derivados do saco vitelino (Fig. 4B), demonstram que as sequências potenciadoras compostas de BCL11A conduzem a expressão em um padrão específico desenvolvente concordante com a comutação do gene da globina endógeno.

[224] Uma série de mutantes de deleção foi gerada para refinar os elementos mínimos necessários para a atividade eritróide potenciadora. Sequências contendo +58 DHS centrais foram suficientes para a atividade eritróide potenciadora. Estas sequências flanqueadoras contendo apenas os elementos +62 or +55 não foram capazes de direcionar a expressão do gene eritróide (Fig. 6B). Para testar a capacidade de DHSs para aumentar a expressão do gene em precursores eritróides humanos primários, utilizou-se a entrega de lentivírus de um sistema repórter GFP, conforme descrito anteriormente (39). Do mesmo modo, +58 DHS potenciou a expressão do gene neste ensaio repórter (Fig. 7).

[225] Os inventores decidiram gerar linhagens de células com uma deleção de potenciador BCL11A para investigar o requisito do potenciador para a expressão de BCL11A. Células eritróides estáveis com ruptura do potenciador foram geradas. Uma vez que não existem linhagens de células eritróides humanas em fase adulta adequadas, e como prova do princípio, os inventores viraram-se para o sistema murino. As células de eritroleucemia de camundongo (MEL) dependem de BCL11A para um padrão em fase adulta da expressão do gene de globina (14). Os inventores identificaram um potenciador compósito eritróide ortólogo no íntron-2 de Bcl11a do camundongo. Como o potenciador de Bcl11a de íntron-2 marcado com GWAS, estas sequências possuíram uma série de DHSs específicos de eritróides. Além disso, estas seqüências foram decoradas por H3K4me1 and H3K27ac, lacked H3K4me3 e H3K27me3, e ocupadas por ambos GATA1 e TAL1 na cromatina eritróide de camundongo (Fig. 8). Elementos reguladores compostos compreendendo uma série de DHSs adjacentes têm demonstrado serem essenciais para a expressão de genes em lócus numerosas, incluindo, dentre outros, a região de controle de lócus de β-globina, sequências de múltiplas espécies conservadas de α-globina, e a região reguladora de IgH (53-55). Foram observadas as características únicas específicas da espécie do potenciador composto. Por exemplo, os inventores identificaram as sequências conservadas do camundongo para cada um dos três DHSs +62, +58 e +55, e encontraram a hipersensibilidade de DNase I eritróide das sequências conservadas +62 e +55, no entanto, as sequências conservadas +58 careciam da hipersensibilidade de DNase I.

[226] PCR e Southern blotting verificaram a excisão do segmento intrônico +50,-60,4 kb de Bcl11a em três clones MEL únicos e dois clones de linfócitos pré-B originais (Fig. 9). Os pontos de ruptura sequenciados de Sanger eram característicos da clivagem de TALEN mediada com reparo NHEJ subsequente (Fig. 10). Após a eliminação do segmento intrônico, observou-se uma redução dramática na transcrição de BCL11A nos clones de células MEL por RT-qPCR, utilizando pares de primers detectando junções de éxon a montante, abrangendo ou a jusante da deleção (Fig. 5A).

Definições

[227] Para conveniência, certos termos empregues por todo o pedido (incluindo o relatório descritivo, exemplos, e reivindicações anexas) são coletados aqui. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um técnico especialista no assunto ao qual esta invenção pertence.

[228] Tal como aqui utilizado, a frase “agente que liga o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2” refere-se a pequenas moléculas, ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos ou oligonucleotídeos que podem se ligar ao local dentro do DNA genômico (por exemplo, na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2) e reprimir mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A em uma célula em pelo menos 20% em comparação com o nível de mRNA ou de proteína de BCL11A em uma célula não tratada com um tal agente. Em uma modalidade, o agente “interfere com as interações de BCL11A com parceiros de ligação de BCL11A”, como a frase é aqui utilizada.

[229] Tal como aqui utilizado, o termo “molécula pequena” refere-se a um agente químico, incluindo, mas não limitados a, peptídeos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleotídeos, análogos de polinucleotídeos, aptâmeros, nucleotídeos, análogos de nucleotídeos, compostos orgânicos ou inorgânicos ( ou seja, incluindo compostos organometálicos e heteroorgânicos) possuindo um peso molecular inferior a cerca de 10.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 1.000 gramas por mols, os compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 500 gramas por mol, e sais, ésteres e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.

[230] Um “ácido nucleico”, tal como aqui descrito, pode ser RNA ou DNA, e pode ser de cadeia simples ou dupla, e pode ser selecionado, por exemplo, a partir de um grupo incluindo: ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse, oligonucleotídeos, análogos de ácidos nucleicos, por exemplo, ácido nucleico de peptídeo (PNA), PNA pseudo- complementares (pc-PNA), ácido nucléico bloqueado (LNA), etc. Tais sequências de ácidos nucleicos incluem, por exemplo, mas não estão limitadas a, proteínas que codificam as sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, que atuam como repressoras da transcrição, moléculas anti-sentido, ribozimas, pequenas sequências de ácidos nucleicos inibidoras, por exemplo, mas não estão limitados a RNAi, shRNAi, siRNA, micro RNAi (mRNAi), os oligonucleotídeos anti-sentido, etc.

[231] Por “interferir com as interações de BCL11A com parceiros de ligação de BCL11A” entende-se que a quantidade de interação de BCL11A com o parceiro de ligação BCL11A é pelo menos 5% inferior em populações tratadas com um inibidor de BCL11A, do que, em uma população de controle comparável, em que nenhum inibidor de BCL11A está presente. É preferido que a quantidade de interação de BCL11A com o parceiro de ligação de BCL11A em uma população tratada com inibidor de BCL11A seja pelo menos10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50 % inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais do que uma população de controle tratada comparável, na qual nenhum inibidor de BCL11A.é adicionado. No mínimo, a interação de BCL11A pode ser ensaiada através da determinação da quantidade de ligação de BCL11A ao parceiro de ligação de BCL11A utilizando técnicas padrão na técnica, incluindo, mas não se limitando a, espectrometria de massa, imunoprecipitacão, ou ensaios de filtração em gel. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de BCL11A pode ser ensaiada por medição da expressão da hemoglobina fetal no nível de mRNA ou proteína após o tratamento com um inibidor candidato de BCL11A.

[232] Em uma modalidade, a atividade de BCL11A é a interação de BCL11A com os seus parceiros de ligação: GATA- 1, FOG-1, os componentes do complexo NuRD, matrin-3, MTA2 e RBBP7. Por conseguinte, qualquer anticorpo ou fragmento do mesmo, molécula pequena, produto químico ou composto que possa bloquear esta interação é considerado um inibidor da atividade de BCL11A.

[233] Tal como aqui utilizado, o termo “célula projetada genética” refere-se a uma célula que compreende, pelo menos, uma modificação genética, tal como o termo é aqui utilizado.

[234] Tal como aqui utilizado, o termo “modificação genética” refere-se a uma perturbação ao nível genômico, resultando em uma diminuição na expressão ou atividade de BCL11A em uma célula. Exemplos de modificações genéticas podem incluir deleções, mutações por desvio de estrutura, mutações pontuais, remoção de éxon, a remoção de um ou mais locais hipersensíveis de DNAse (DHS) (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais regiões DHS), etc.

[235] Por “inibe a expressão de BCL11A” entende-se que a quantidade de expressão de BCL11A é, pelo menos, 5% inferior em uma célula ou população de células tratada com uma endonuclease de direcionamento de DNA, do que, uma célula de controle comparável ou população de células, em que a endonuclease de não direcionamento de DNA está presente. É preferido que a percentagem de expressão de BCL11A em uma população tratada é pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50% inferior, pelo menos 60% inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais do que uma população de controle tratada comparável na qual a endonuclease é adicionada.

[236] Por “inibir a atividade de BCL11A” entende- se que a quantidade de atividade funcional de BCL11A é, pelo menos, 5% inferior em uma célula ou população de células tratadas com os métodos aqui descritos, do que uma célula ou população de controle comparável, em que nenhuma endonuclease de direcionamento de DNA está presente. Prefere-se que a percentagem de atividade de BCL11A em uma população tratada inibidora de BCL11A seja pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior, pelo menos 50% inferior, pelo menos 60 % inferior, pelo menos 70% inferior, pelo menos 80% inferior, pelo menos 90% inferior, pelo menos 1 vez inferior, pelo menos 2 vezes inferior, pelo menos 5 vezes inferior, pelo menos 10 vezes inferior, pelo menos 100 vezes inferior, pelo menos 1000 vezes inferior, ou mais do que uma população de controle tratada comparável, em que nenhuma endonuclease de direcionamento de DNA está presente. No mínimo, a atividade de BCL11A pode ser ensaiada através da determinação da quantidade de expressão de BCL11A na proteína ou níveis de mRNA, utilizando técnicas padrão na técnica. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de BCL11A pode ser determinada utilizando um construto repórter, em que o construto repórter é sensível à atividade de BCL11A. A sequência de locus de g-globina é reconhecível pelo motivo de ligação de ácido nucleico do construto de BCL11A.

[237] Em uma modalidade, tal como é aqui utilizado, o termo “endonuclease de direcionamento de DNA” refere-se a uma endonuclease que gera uma quebra de cadeia dupla em uma posição desejada no genoma (por exemplo, no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612) sem produzir rupturas de dupla cadeia fora do alvo indesejadas. A endonuclease de direcionamento de DNA pode ser uma endonuclease de ocorrência natural (por exemplo, uma meganuclease bacteriana) ou ela pode ser gerada artificialmente (por exemplo, por meganucleases projetadas, TALENS, ou ZFNs, dentre outros).

[238] Em outra modalidade, tal como é aqui utilizado, o termo “endonuclease de direcionamento de DNA” refere-se a uma endonuclease que gera uma quebra de cadeia simples ou um “nick” ou quebra em uma cadeia da cadeia principal de açúcar de fosfato de DNA em uma posição desejada no genoma ( por exemplo, no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612) sem produzir rupturas de dupla cadeia fora do alvo indesejadas.

[239] Tal como aqui utilizado, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de cadeia dupla circular no qual segmentos adicionais de ácidos nucleicos podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos adicionais de ácidos nucleicos podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não-epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Estes vetores são aqui referidos como “vetores de expressão recombinantes”, ou mais simplesmente “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão com utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados indiferentemente, uma vez que o plasmídeo é a forma mais comummente utilizada de vetor. No entanto, os métodos e composições aqui descritos podem incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, a replicação do retrovírus defeituosos, lentivírus, adenovírus e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes.

[240] Dentro de um vetor de expressão, “operativamente ligado” pretende significar que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada à sequência(s) reguladora de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula alvo quando o vetor é introduzido na célula-alvo). O termo “sequência reguladora” pretende incluir promotores, estimuladores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). As sequências reguladoras incluem as que constituem direto a expressão de uma sequência de nucleotídeos, em muitos tipos de célula hospedeira, e aquelas com expressão direta da sequência nucleotídica apenas em determinadas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecido). Além disso, a endonuclease de direcionamento de DNA pode ser entregue por meio de um vetor compreendendo uma sequência reguladora para dirigir a síntese da endonuclease de direcionamento de DNA em intervalos específicos, ou ao longo de um período de tempo específico. Será apreciado pelos técnicos especialistas no assunto que o design do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula-alvo, o nível de expressão desejado, e similares.

[241] Tal como aqui utilizado o termo “clivagem” geralmente refere-se à geração de uma ruptura de cadeia dupla no genoma de DNA em um local desejado.

[242] Tal como aqui utilizado, o termo “quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA” refere-se a uma quantidade de uma endonuclease de direcionamento de DNA que produz atividade de endonuclease suficiente para gerar uma quebra de cadeia dupla no local desejado do genoma . Em uma modalidade, a quantidade eficaz de uma endonuclease de direcionamento de DNA gera uma quebra de cadeia dupla no lócus genético desejado em pelo menos 20% das células em uma população em contato com a composição (por exemplo, pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% das células na população compreendem uma modificação genética produzida pela composição de endonuclease de direcionamento de DNA).

[243] Tal como aqui utilizado, o termo “aumentar os níveis de hemoglobina fetal” em uma célula indica que a hemoglobina fetal é pelo menos 5% mais elevada em populações tratadas com um agente que rompe mRNA de BCL11A ou expressão da proteína (por exemplo, uma endonuclease de direcionamento de DNA) através da ligação ao DNA genômico no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, do que em uma população de controle comparável, em que o agente não está presente. É preferido que a percentagem de expressão de hemoglobina fetal em uma população tratada com um tal agente que se liga ao DNA genômico no cromossomo 2 na localização 60,716,189-60,728,612, é pelo menos 10% mais elevada, pelo menos 20% mais elevada, pelo menos 30% mais elevada, em menos 40% mais elevada, pelo menos 50% mais elevada, pelo menos 60% mais elevada, pelo menos 70% mais elevada, pelo menos 80% mais elevada, pelo menos 90% mais elevada, pelo menos 1 vez mais elevada, pelo menos 2 vezes mais elevada, pelo menos 5 vezes mais elevada, pelo menos 10 vezes mais elevada, pelo menos 100 vezes mais elevada, pelo menos 1000 vezes mais elevada, ou mais do que uma população de controle tratada de dimensão e condições de cultura comparáveis. O termo “população de controle tratada” é aqui utilizado para descrever uma população de células que tenha sido tratada com meios idênticos, indução viral, sequências de ácido nucleico, temperatura, confluência, tamanho do frasco, pH, etc, com a exceção da adição do agente que se liga ao DNA genômico no cromossomo 2 na localização 60,716,18960,728,612. Em uma modalidade, qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para medir um aumento da expressão da hemoglobina fetal, por exemplo, análise de Western Blot de proteína y-globina fetal e quantificação de mRNA de y-globina fetal.

[244] O termo “célula isolada”, tal como aqui utilizado refere-se a uma célula que tenha sido removida a partir de um organismo no qual foi originalmente encontrada, ou um descendente de uma tal célula. Opcionalmente a célula foi cultivada in vitro, por exemplo, na presença de outras células. Opcionalmente a célula é depois introduzida em um segundo organismo ou re-introduzida no organismo a partir do qual (ou a célula a partir da qual ele é descido) foi isolada.

[245] O termo “população isolada” com respeito a uma população isolada de células tal como aqui utilizado refere-se a uma população de células que tenha sido removida e separada a partir de uma população heterogênia ou mista de células. Em algumas modalidades, uma população isolada é uma população substancialmente pura de células, em comparação com a população heterogênea a partir da qual as células foram isoladas ou enriquecidas. Em algumas modalidades, a população isolada é uma população isolada de células progenitoras hematopoiéticas humanas, por exemplo, uma população substancialmente pura de células progenitoras hematopoiéticas humanas em comparação com uma população heterogênea de células compreendendo as células progenitoras hematopoiéticas humanas e células a partir das quais as células progenitoras hematopoiéticas humanas foram derivadas.

[246] O termo “substancialmente pura”, no que diz respeito a uma população celular particular, refere-se a uma população de células que é, pelo menos, cerca de 75%, de preferência pelo menos cerca de 85%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% pura, em relação às células que constituem uma população total de células. Isto é, os termos “substancialmente pura” ou “essencialmente purificada”, no que se refere a uma população de células progenitoras hematopoiéticas, refere-se a uma população de células que contêm menos do que cerca de 20%, mais preferencialmente menos do que cerca de 15%, 10%, 8%, 7%, mais preferencialmente menos do que cerca de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos do que 1%, de células que não são células progenitoras hematopoiéticas, tal como definido pelos termos aqui.

[247] Tal como aqui utilizado, o termo “tratamento” inclui a redução ou alívio de, pelo menos, um efeito adverso ou sintoma de uma doença, distúrbio ou doença. Por exemplo, o termo “tratar” e “tratamento” refere-se a administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição, por exemplo, uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma população de células progenitoras hematopoiéticas, de modo que o indivíduo tem uma redução em pelo pelo menos um sintoma da doença ou uma melhoria da doença, por exemplo, os resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os fins desta descrição, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, estabilização da doença (por exemplo, sem piorar), atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (quer parcial, quer total), seja detectável ou não detectável. Em algumas modalidades, o tratamento pode referir-se a prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento. Assim, um técnico especialista no assunto compreende que um tratamento pode melhorar a condição da doença, mas pode não ser uma cura completa para a doença. Em algumas modalidades, o tratamento pode incluir a profilaxia. No entanto, em modalidades alternativas, o tratamento não inclui a profilaxia.

[248] A frase “farmaceuticamente aceitável” é aqui empregue para se referir a aqueles compostos, formas materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico, adequadas para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurados com uma benefício razoável/razão de risco.

[249] Tais como aqui utilizados, os termos “farmaceuticamente aceitáveis”, “fisiologicamente toleráveis” e as variações gramaticais dos mesmos, conforme eles se referem a composições, veículos, diluentes e reagentes, são utilizados indistintamente e significam que os materiais são capazes de administração a ou sobre um mamífero sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis, tais como náuseas, tontura, perturbação gástrica e semelhantes. Um veículo farmaceuticamente aceitável não irá promover o aumento de uma resposta imunitária a um agente com o qual é misturado, a menos que assim se desejar. A preparação de uma composição farmacológica que contém ingredientes ativos dissolvidos ou dispersos nela é bem compreendida na técnica, e não necessita de ser limitada com base na formulação. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões, no entanto, formas sólidas adequadas para solução ou suspensões em líquido antes da utilização, também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada ou apresentada como uma composição de lipossomas. O ingrediente ativo pode ser misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo, e em quantidades adequadas para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH e semelhantes que aumentam a eficácia do ingrediente ativo. A composição terapêutica da presente invenção pode incluir sais farmaceuticamente aceitáveisdos seus componentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e semelhantes. Veículos fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na técnica. Exemplos de veículos líquidos são soluções aquosas estéreis que não contêm materiais além dos ingredientes ativos e água, ou contêm um tampão tal como fosfato de sódio ao valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, tal como solução salina tamponada com fosfato. Ainda adicionalmente, os veículos aquosos podem conter mais do que um sal tampão, bem como sais tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose, polietilenoglicol e outros solutos. As composições líquidas podem também conter fases liquidas em adição à e para a exclusão de água. Exemplos destas fases líquidas adicionais são a glicerina, óleos vegetais, tais como óleo de semente de algodão, e emulsões água-óleo. A quantidade de um agente ativo utilizado com os métodos aqui descritos, que será eficaz no tratamento de uma desordem ou condição particular, dependerá da natureza da desordem ou condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.

[250] Tal como aqui utilizado, “prevenção” ou “prevenir”, quando usado em referência a uma doença, distúrbio ou dos seus sintomas, refere-se a uma redução da probabilidade de um indivíduo vir a desenvolver uma doença ou distúrbio, por exemplo, uma hemoglobinopatia. A probabilidade de desenvolver uma doença ou distúrbio é reduzida, por exemplo, quando um indivíduo que tem um ou mais fatores de risco para uma doença ou desordem ou falha em desenvolver a doença ou desenvolve tal doença ou distúrbio em um momento posterior ou com menos gravidade, estatisticamente falando, em relação a uma população tendo os mesmos fatores de risco e que não receberam tratamento, tal como aqui descrito. A falha em desenvolver sintomas de uma doença, ou o desenvolvimento de sintomas reduzido (por exemplo, por, pelo menos 10% em uma escala clinicamente aceita para essa doença ou desordem) ou retardado (por exemplo, por dias, semanas, meses ou anos) é considerado prevenção eficaz.

[251] Em conexão com o contato de uma célula com uma endonuclease de direcionamento de DNA para diminuir a expressão de BCL11A, a frase “aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula” indica que a hemoglobina fetal em uma célula ou população de células é, pelo menos, 5% maior na célula ou população de células tratadas com a endonuclease de direcionamento de DNA, que uma população de controle comparável, em que nenhuma endonuclease de direcionamento de DNA está presente. É preferido que a expressão de hemoglobina fetal em uma célula tratada com endonuclease de direcionamento de DNA seja pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 60% maior, pelo menos 70% maior, pelo menos 80% maior, pelo menos 90% maior, pelo menos 1 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, pelo menos 1000 vezes maior, ou mais do que uma população de controle tratada comparável. O termo “população de controle tratada” é aqui utilizado para descrever uma população de células que tenha sido tratada com meios idênticos, indução viral, sequências de ácido nucleico, temperatura, confluência, tamanho do frasco, pH, etc, com a exceção da adição do inibidor de BCL11A.

[252] O termo “mamífero” tem a intenção de abranger um “mamífero” no singular e “mamíferos”no plural, e inclui, mas não está limitado a humanos; primatas, como símios, macacos, orangotangos e chimpanzés; canídeos, tais como cães e lobos; felinos, como gatos, leões e tigres; equídeos, tais como cavalos, burros e zebras; animais alimentares, tais como vacas, porcos e ovelhas; ungulados, tais como veados e girafas; roedores, tais como camundongos, ratos, hamsters e cobaias; e ursos. Em algumas modalidades preferidas, um mamífero é um ser humano.

[253] Por conseguinte, em uma modalidade, o mamífero foi diagnosticado com uma hemoglobinopatia. Em outra modalidade, a hemoglobinopatia é uma b- hemoglobinopatia. Em uma modalidade preferida, a hemoglobinopatia é uma doença das células falciformes. Tal como aqui utilizado, “doença das células falciformes” pode ser anemia falciforme, doença da hemoglobina C falciforme (HbSC), foice beta-plus-talassemia (HbS/β+), ou foice beta- talassemia zero (HbS/β0). Em outra modalidade preferida, a hemoglobinopatia é uma b-talassemia.

[254] Tal como aqui utilizado, o termo “hemoglobinopatia” significa qualquer defeito na estrutura ou função da hemoglobina qualquer de um indivíduo, e inclui defeitos na estrutura primária, secundária, terciária ou quaternária de hemoglobina causada por qualquer mutação, tal como mutações de deleção ou mutações de substituição nas regiões de codificação do gene de b-globina, ou mutações em, ou deleções de, os promotores ou potenciadores de tais genes que causam uma redução na quantidade de hemoglobina produzida quando comparada a uma condição normal ou padrão. O termo inclui ainda qualquer diminuição na quantidade ou eficácia de hemoglobina, normal ou anormal, causada por fatores externos, tais como a doença, quimioterapia, toxinas, venenos, ou semelhantes.

[255] Em uma modalidade, o termo “quantidade eficaz”, tal como aqui utilizado, refere-se à quantidade de uma composição de células que é segura e suficiente para tratar, diminuir a probabilidade de, ou atrasar o desenvolvimento de uma hemoglobinopatia. A quantidade pode assim, curar ou resultar em melhoria dos sintomas do hemoglobinopatia, retardar o curso da progressão da doença hemoglobinopatia, retardar ou inibir um sintoma de uma hemoglobinopatia, retardar ou inibir o estabelecimento de sintomas secundários de uma hemoglobinopatia ou inibir o desenvolvimento de um sintoma secundário de uma hemoglobinopatia. A quantidade eficaz para o tratamento da hemoglobinopatia depende do tipo de hemoglobinopatia a ser tratada, da gravidade dos sintomas, do indivíduo a ser tratado, a idade e condição geral do indivíduo, do modo de administração e assim por diante. Assim, não é possível ou prudente especificar uma “quantidade eficaz” exata. No entanto, para qualquer dado caso, uma “quantidade eficaz” apropriada pode ser determinada por um técnico especialista no assunto utilizando apenas experimentação de rotina.

[256] Tal como aqui utilizado, o termo “compreendendo” ou “compreende” é utilizado em referência às composições, métodos, e respectivo componente(s) da mesma, que são essenciais para a invenção, ainda aberta à inclusão de elementos não especificados, sejam essenciais ou não.

[257] Tal como aqui utilizado, o termo “consistindo essencialmente em” refere-se aos elementos necessários para uma dada modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam materialmente as característica(s) funcionais básicas ou novas daquela modalidade da invenção.

[258] O termo “consistindo em” refere-se a composições, métodos, e respectivos componentes, como aqui descritos, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado naquela descrição da modalidade.

[259] Tal como é usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um,” “uma,” e “o” incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, referências a “o método” inclui um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo aqui descrito e/ou que se tornarão evidentes para os técnicos especialistas no assunto após a leitura desta descrição e assim por diante. Entende-se que a descrição detalhada precedente e os exemplos que se seguem são apenas ilustrativos, e não são para serem tomados como limitações ao escopo da invenção. Várias alterações e modificações às modalidades descritas, as quais serão evidentes para aqueles técnicos especialistas no assunto, podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção. Além disso, todas as patentes, pedidos de patentes, e publicações identificadas são aqui expressamente incorporados por referência com a finalidade de descrever e revelar, por exemplo, os métodos descritos nestas publicações que podem ser utilizados em ligação com a presente invenção. Estas publicações são fornecidas exclusivamente para sua descrição antes da data de apresentação do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar esta descrição em virtude da invenção, antes ou por qualquer outra razão. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo desses documentos são baseadas em informações disponíveis para os requerentes, e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou conteúdo desses documentos.

Hemoglobinopatias

[260] A hemoglobina fetal (HbF) é um tetrâmero de dois polipeptídeos de a-globina de adulto e dois polipeptídeos β tipo Y-globina fetais. Durante a gestação, os genes Y-globina duplicados constituem os genes predominantes transcritos a partir do lócus de β- globina. Após o nascimento, Y-globina torna-se progressivamente substituída por β-globina adulta, um processo referido como a “troca fetal” (3). Os mecanismos moleculares subjacentes a esta troca têm permanecido em grande parte indefinidos, e têm sido um assunto de intensa pesquisa. A troca de desenvolvimento da produção de hemoglobina predominantemente fetal ou HbF (α2Y2) para produção de hemoglobina adulta ou HbA (α2β2) começa em cerca de 28 a 34 semanas de gestação, e continua logo após o nascimento em que ponto HbA torna-se predominante. Esta troca resulta essencialmente da diminuição da transcrição dos genes da gama-globina e aumento da transcrição dos genes da beta-globina. Em média, o sangue de um adulto normal contenha apenas cerca de 2% de HbF, embora os níveis de HbF residuais têm uma variação de mais de 20 vezes em adultos saudáveis (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)).

[261] As hemoglobinopatias abrangem um número de anemias de origem genética em que há uma diminuição da produção e/ou aumento da destruição (hemólise) de glóbulos vermelhos (RBC). Estes distúrbios incluem defeitos genéticos que resultam na produção de hemoglobinas anormais com uma capacidade diminuída concomitante para manter a concentração de oxigênio. Alguns de tais transtornos envolvem a falha de produzir β-globina normal em quantidades suficientes, enquanto outros envolvem a falha de produzir inteiramente β- globina normal. Estes distúrbios associados especificamente com a proteína de β-globina são referidos geralmente como β- hemoglobinopatias. Por exemplo, β-talassemias resultam de um defeito parcial ou completo da expressão do gene da β- globina, levando à HbA deficiente ou ausente. Anemia falciforme resulta de uma mutação pontual no gene estrutural de β-globina, que conduz à produção de uma hemoglobina anormal (falciforme) (HbS). HbS RBCs são mais frágeis do que os RBCs normais, e submetidos à hemólise mais facilmente, levando eventualmente à anemia (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)). Além disso, a presença de uma variante genética BCL11A, variação HBS1L-MYB, melhora a severidade clínica em beta-talassemia. Esta variante tem sido mostrada para ser associada com os níveis de HbF. Tem sido demonstrado que existe uma razão de probabilidade de 5 por ter uma forma menos severa de beta-talassemia com a variante de HbF elevada (Galanello S. et al., 2009, Blood, na imprensa).

[262] A busca de tratamento visando à redução do desequilíbrio da cadeia de globina em pacientes com β- hemoglobinopatias tem incidido sobre a manipulação farmacológica de hemoglobina fetal (α2Y2; HbF). O potencial terapêutico importante de tais abordagens é sugerido pelas observações do fenótipo leve de indivíduos com co- hereditariedade de ambas β-talassemia homozigótica e persistência hereditária de hemoglobina fetal (HPFH), assim como por aqueles pacientes com β-talassemia homozigótica que sintetizam sem hemoglobina adulta, mas nos quais um requisito reduzido para transfusões é observado na presença de concentrações elevadas de hemoglobina fetal. Além disso, observou-se que certas populações de pacientes adultos com anormalidades na cadeia β têm níveis acima do normal de hemoglobina fetal (HbF), e foram observadas para ter um curso clínico mais suave da doença do que os pacientes com níveis normais adultos de HbF. Por exemplo, um grupo de pacientes com anemia falciforme da Arábia Saudita que expressam 20 a 30% de HbF têm manifestações clínicas única leves da doença (Pembrey, et al., Br. J. Haematol. 40: 415-429 (1978)). É aceito agora que β-hemoglobinopathies, como a anemia falciforme e as β-talassemias, são melhoradas pelo aumento da produção de HbF. (Revisto em Jane and Cunningham Br. J. Haematol. 102: 415-422 (1998) and Bunn, N. Engl. J. Med. 328: 129-131 (1993)).

[263] Embora os mecanismos moleculares que controlam a troca de desenvolvimento in vivo da expressão gênica de y- para β-globina sejam presentemente desconhecidos, não há evidências acumulativas de que fatores externos podem influenciar a expressão do gene de Y- globina. O primeiro grupo de compostos descobertos possuindo atividade de reativação de HbF foram fármacos citotóxicos. A capacidade para fazer com que a síntese de novo de HbF por manipulação farmacológica foi mostrada pela primeira vez utilizando 5-azacitidina em animais experimentais (DeSimone, Proc Natl Acad Sci U S A. 79(14):4428-31 (1982)). Estudos subsequentes confirmaram a capacidade de 5-azacitidina para aumentar HbF em pacientes com β-talassemia e doença das células falciformes (Ley, et al., N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475 (1982), and Ley, et al., Blood 62: 370-380 (1983)). Experiências adicionais demonstraram que os babuínos tratados com doses citotóxicas de arabinosilcitosina (ara- C) reagiram com notáveis elevações de F-reticulócitos (Papayannopoulou et al., Science. 224(4649):617-9 (1984)), e que o tratamento com hidroxiuréia levou à indução de y- globina em macacos ou babuínos (Letvin et. al., N Engl J Med. 310(14):869-73 (1984)).

[264] O segundo grupo de compostos investigados quanto à sua capacidade para causar atividade de reativação de HbF foram os ácidos graxos de cadeia curta. A observação inicial em células progenitoras de sangue do cordão fetal levou à descoberta de que o ácido Y-aminobutírico pode atuar como um indutor de hemoglobina fetal (Perrine et al., Biochem Biophys Res Commun.148(2):694-700 (1987)). Estudos subsequentes mostraram que o butirato estimulou a produção de globina em babuínos adultos (Constantoulakis et al., Blood. Dec; 72(6):1961-7 (1988)), e induziu a Y-globina em células progenitoras eritróides em animais adultos ou pacientes com anemia das células falciformes (Perrine et al., Blood. 74(1):454-9 (1989)). Os derivados de ácidos graxos de cadeia curta, tais como o fenilbutirato (Dover et al., Br J Haematol. 88(3):555-61 (1994)) e ácido valpróico (Liakopoulou et al., 1: Blood. 186(8):3227-35 (1995)), também foram exibidos para induzir HbF in vivo. Dado o grande número de análogos de ácidos graxos de cadeia curta ou derivados desta família, há uma série de compostos potenciais desta família mais potente do que o butirato. Ácidos fenilacético e fenilalquílico (Torkelson et al., Blood Cells Mol Dis. 22(2):150-8. (1996)), que foram descobertos durante estudos posteriores, foram considerados potenciais indutores de HbF, uma vez que eles pertenciam a esta família de compostos. Presentemente, no entanto, o uso de butirato ou os seus análogos na anemia falciforme e β-talassemia permanece experimental e não pode ser recomendado para tratamento fora de ensaios clínicos.

[265] Os ensaios clínicos destinados a reativação da síntese de hemoglobina fetal na anemia falciforme e β- talassemia incluíram a administração a curto prazo e a longo prazo de tais compostos, tal como 5-azacitidina, hidroxiuréia, eritropoietina humana recombinante, e análogos de ácido butírico, assim como combinações destes agentes. Na sequência destes estudos, hidroxiuréia foi utilizada para indução de HbF em seres humanos, e depois tornou-se o primeiro e único fármaco aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de hemoglobinopatias. No entanto, inconvenientes variáveis têm contraindicado a utilização a longo prazo de tais agentes ou terapias, incluindo efeitos colaterais indesejados, e variabilidade nas respostas dos pacientes. Por exemplo, embora a hidroxiuréia estimule a produção de HbF e tem sido demonstrada clinicamente para reduzir as crises falciformes, é potencialmente limitada por mielotoxicidade e o risco de carcinogenese. Potencial de carcinogenicidade a longo prazo seria também existe em terapias baseadas na 5- azacitidina. Terapias à base de eritropoietina não se mostraram consistentes entre uma gama de populações de pacientes. As meia-vidas curtas do ácido butírico in vivo têm sido consideradas como um obstáculo potencial em adaptar estes compostos para uso em intervenções terapêuticas. Além disso, doses muito altas de ácido butírico são necessárias para induzir a expressão do gene da Y-globina, exigindo cateterismo para infusão contínua do composto. Além disso, estas doses elevadas de ácido butírico podem ser associadas com a neurotoxicidade e danos de múltiplos órgãos (Blau, et al., Blood 81: 529-537 (1993)). Embora mesmo aumentos mínimos nos níveis de HbF sejam úteis na doença das células falciformes, as β-talassemias exigem um aumento muito maior que não é fiável, ou de forma segura, alcançado por qualquer um dos agentes atualmente utilizados (Olivieri, Seminars in Hematology 33: 24-42 (1996)).

[266] A identificação de reguladores naturais de indução e produção de HbF poderia proporcionar um meio para conceber intervenções terapêuticas que ultrapassem os vários inconvenientes dos compostos descritos acima. Estudos de associação genômica ampla recentes produziram introspecções sobre a base genética de inúmeras doenças e características complexas (McCarthy et al., Nat Rev Genet 9, 356 (2008) e Manolio et. al. J Clin Invest 118, 1590 (2008)). No entanto, na grande maioria dos casos, a ligação funcional entre uma associação genética e a patofisiologia subjacente continua a ser revelada. O nível de hemoglobina fetal (HbF) é herdado como uma característica quantitativa e clinicamente importante, dado o seu papel acima mencionado e bem caracterizado na melhoria da gravidade das principais β- hemoglobinopatias, anemia falciforme e β-talassemia (Nathan et. al., Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6th, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003)). Dois estudos de associação do genoma identificaram três principais lócus contendo um conjunto de cinco polimorfismos de nucleotídeo único comuns (SNPs) que respondem por 20% da variação dos níveis de HbF (Lettre et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2008); Uda et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008); Menzel et al., Nat Genet 39, 1197 (2007)). Além disso, várias destas variantes parecem prever a gravidade clínica da doença das células falciformes (Lettre et al.,Proc Natl Acad Sci U S A (2008)) e pelo menos um desses SNPs pode também afetar os resultados clínicos em β-talassemia (Uda et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008)). O SNP com o maior tamanho do efeito, explicando mais de 10% da variação da HbF, está localizado no segundo íntron de um gene no cromossomo 2, BCL11A. Ao passo que BCL11A, um fator de transcrição do tipo dedo-de-zinco C2H2, tem sido investigado para o seu papel no desenvolvimento de linfócitos (Liu et al., Nat Immunol 4, 525 (2003) and Liu et al., Mol Cancer 5, 18 (2006)), seu papel na produção de glóbulos vermelhos ou regulação do gene da globina não foi previamente avaliado.

[267] No início da era de DNA recombinante, os estudos de estrutura do gene da globina proporcionaram uma base molecular forte para interrogar a troca de globina fetal. Um esforço considerável tem se concentrado em delinear os elementos cis dentro do lócus da β-globina necessários para a regulação adequada dos genes dentro do agrupamento da globina tipo β. Estes estudos dependeram de mutações e deleções que ocorrem naturalmente que influenciam drasticamente os níveis de HbF em adultos, e foram complementados por geração de camundongos transgênicos que abrigam porções do agrupamento (Nathan et. al., Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6th, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003) e G. Stamatoyannopoulos, Exp Hematol 33, 259 (2005)). Embora os elementos cis precisos necessários para a comutação de globina permaneçam mal definidos, os resultados em camundongos transgênicos têm fortemente indicado que os genes de Y-globina são autonomamente silenciados na fase adulta, uma descoberta que é mais compatível com a ausência de ativadores específicos do estado fetal ou a presença de um repressor de estágio específico. Os resultados dos recentes estudos de associação genética fornecem genes candidatos para interrogar por seu envolvimento no controle dos genes de Y-globina, como BCL11A.

Células progenitoras hematopoéticas

[268] Em uma modalidade, a célula progenitora hematopoiética é contatado ex vivo ou in vitro. Em uma modalidade específica, a célula que está sendo contatada é uma célula da linhagem eritróide. Em uma modalidade, a composição de células compreende células possuindo expressão diminuída de BCL11A.

[269] As “células progenitoras hematopoiéticas”, como o termo é aqui utilizado, referem-se às células de uma linhagem de células estaminais que dão origem a todos os tipos de células sanguíneas, incluindo a mielóide (monócitos e macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos/plaquetas, células dendríticas), e as linhagens linfóides (células T, células B, células NK). Uma “célula de linhagem eritróide” indica que a célula que está sendo contatada é uma célula que sofre eritropoeise, de tal modo que após a diferenciação final, constitui um dos eritrócitos ou glóbulos vermelhos (RBC). Tais células pertencem a uma das três linhagens eritróide, linfóide, e mielóide, provenientes das células progenitoras hematopoéticas da medula óssea. Após a exposição aos fatores de crescimento específicos e outros componentes do microambiente hematopoiético, as células progenitoras hematopoiéticas podem amadurecer através de uma série de tipos celulares de diferenciação intermediários, todos os intermediários da linhagem eritróide, em RBCs. Assim, as células da “linhagem eritróide”, como o termo é aqui utilizado, compreendem células progenitoras hematopoiéticas, rubriblastos, prorubricitos, eritroblastos, metarubricitos, reticulócitos e eritrócitos.

[270] Em algumas modalidades, a célula progenitora hematopoiética tem, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular característico de células progenitoras hematopoiéticas: CD34+, CD59+, Thy1/CD90+,CD38lo/-, e C- kit/CD117+. De preferência, as células progenitoras hematopoiéticas têm vários desses marcadores.

[271] Em algumas modalidades, as células progenitoras hematopoiéticas de linhagem eritróide têm o marcador de superfície celular característico da linhagem eritróide: CD71 e Ter119.

[272] As células estaminais, tais como as células progenitoras hematopoiéticas, são capazes de proliferar e dar origem a mais células progenitoras que têm a capacidade de gerar um grande número de células-mãe, que podem, por sua vez dar origem à células filhas diferenciadas ou diferenciáveis. As células filhas próprias podem ser induzidas a proliferar e produzir progênie que subsequentemente se diferencia em um ou mais tipos de células maduras, e ao mesmo tempo retêm uma ou mais células com potencial de desenvolvimento parental. O termo “célula estaminal” refere-se, em seguida, a uma célula com a capacidade ou potencial, em circunstâncias particulares, de diferenciar-se para um fenótipo diferenciado ou mais especializado, e que retém a capacidade de, sob determinadas circunstâncias, proliferar sem grandes diferenças. Em uma modalidade, o termo célula progenitora ou estaminal refere- se a uma célula mãe generalizada cujos descendentes (progenitura) se especializam, frequentemente em diferentes direções, por diferenciação, por exemplo, através da aquisição de caracteres completamente individuais, tal como ocorre na diversificação progressiva de células e tecidos embrionários. Diferenciação celular é um processo complexo que ocorre normalmente através de muitas divisões celulares. Uma célula diferenciada pode derivar de uma célula multipotente que é ela mesma derivada de uma célula multipotente, e assim por diante. Embora cada uma destas células multipotentes possam ser consideradas como células estaminais, a gama de tipos de células de cada um pode dar origem a poder variar consideravelmente. Algumas células diferenciadas também têm a capacidade de dar origem a células de maior potencial de desenvolvimento. Tal capacidade pode ser natural ou pode ser induzida artificialmente, por tratamento com vários fatores. Em muitos casos biológicos, células estaminais são também “multipotentes”, porque elas podem produzir progênie de mais do que um tipo de célula diferente, mas isso não é necessário para “estamidade.” A auto renovação é a outra parte da definição clássica de células estaminais, e é essencial tal como utiliza neste documento. Em teoria, a auto renovação pode ocorrer por qualquer um de dois mecanismos principais. As células estaminais podem se dividir assimetricamente, com uma filha retendo o estado-tronco e a outra filha expressando alguma outra função específica e distinta e fenótipo. Em alternativa, algumas das células estaminais em uma população podem se dividir simetricamente em dois troncos, mantendo, assim, algumas células estaminais na população como um todo, enquanto que as outras células na população dão origem apenas à progênie diferenciada. Geralmente, “células progenitoras” têm um fenótipo celular que é mais primitivo (isto é, encontram-se em uma etapa anterior ao longo de uma via de desenvolvimento ou a progressão de uma célula é totalmente diferenciada). Muitas vezes, as células progenitoras também têm potencial proliferativo significativo ou muito alto. As células progenitoras podem dar origem a vários tipos de células diferenciadas distintas ou a um único tipo de célula diferenciada, dependendo da via de desenvolvimento e no ambiente em que as células se desenvolvem e se diferenciam.

[273] No contexto da ontogenia celular, o adjetivo “diferenciada”, ou “diferenciação” é um termo relativo. Uma “célula diferenciada” é uma célula que tem progredido na parte inferior da via de desenvolvimento do que a célula com que está sendo comparada. Assim, as células estaminais podem diferenciar-se para as células precursoras da linhagem de restrição (por exemplo, uma célula progenitora hematopoiética), que por sua vez podem se diferenciar em outros tipos de células precursoras na parte inferior da via (tal como um precursor de eritrócito), e, em seguida, para uma célula diferenciada de etapa final, tal como um eritrócito, que desempenha um papel característico em um determinado tipo de tecido, e pode ou não reter a capacidade para proliferar mais.

Células Estaminais Pluripotentes Induzidas

[274] Em algumas modalidades, as células humanas projetadas genéticas descritas aqui são derivadas de células pluripotentes estaminais isoladas. Uma vantagem de usar iPSCs é que as células podem ser derivadas a partir da mesma matéria em que as células progenitoras estão para serem administradas. Isto é, uma célula somática pode ser obtida de um indivíduo reprogramado para uma célula estaminal pluripotente induzida, e, em seguida, re-diferenciada em uma célula progenitora hematopoiética a ser administrada ao indivíduo (por exemplo, as células autólogas). Uma vez que as células progenitoras são essencialmente derivadas de uma fonte autóloga, o risco de rejeição do enxerto ou respostas alérgicas é reduzido em comparação com a utilização de células de outro indivíduo ou grupo de indivíduos. Em algumas modalidades, as células progenitoras hematopoiéticas são obtidas a partir de fontes não-autólogas. Além disso, a utilização de iPSCs nega a necessidade de células obtidas a partir de uma fonte embrionária. Assim, em uma modalidade, as células estaminais utilizadas nos métodos descritos não são as células estaminais embrionárias.

[275] Embora a diferenciação seja geralmente irreversível sob contextos fisiológicos, vários métodos foram recentemente desenvolvidos para reprogramar células somáticas para células estaminais pluripotentes induzidas. Exemplos de métodos são conhecidos dos técnicos especialistas no assunto e são descritos resumidamente aqui a seguir.

[276] Tal como aqui utilizado, o termo “reprogramação” refere-se a um processo que altera ou inverte o estado de diferenciação de uma célula diferenciada (por exemplo, uma célula somática). Dito de outra forma, uma reprogramação refere-se a um processo de dirigir a diferenciação de uma célula para trás para um tipo mais primitivo ou mais indiferenciado de células. Deve notar-se que a colocação de muitas células primárias em cultura pode levar à alguma perda de características totalmente diferenciadas. Assim, simplesmente a cultura de tais células incluídas no termo células diferenciadas não torna essas células em células não diferenciadas (por exemplo, células indiferenciadas) ou células pluripotentes. A transição de uma célula diferenciada para a pluripotência requer um estímulo de reprogramação para além dos estímulos que levam à perda parcial de caráter diferenciado em cultura. Células reprogramadas também têm a característica da capacidade de passagem prolongada sem perda de crescimento potencial, em relação ao pais de células primárias, que geralmente têm a capacidade para apenas um número limitado de divisões em cultura.

[277] A célula a serem reprogramadas podem ser parciais ou terminalmente diferenciadas antes da reprogramação. Em algumas modalidades, a reprogramação engloba reversão completa do estado de diferenciação de uma célula diferenciada (por exemplo, uma célula somática) para um estado pluripotente ou um estado multipotente. Em algumas modalidades, a reprogramação engloba reversão completa ou parcial, do estado de diferenciação de uma célula diferenciada (por exemplo, uma célula somática) para uma célula indiferenciada (por exemplo, uma célula do tipo embrionária). A reprogramação pode resultar na expressão de genes particulares pelas células, a expressão de que contribui ainda mais para a reprogramação. Em certas modalidades aqui descritas, a reprogramação de uma célula diferenciada (por exemplo, uma célula somática) faz com que a célula diferenciada assuma um estado não diferenciado (por exemplo, é uma célula não diferenciada). As células resultantes são referidas como “células reprogramadas,” ou “células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs ou células IPS).”

[278] A reprogramação pode envolver a alteração, por exemplo, inversão, de, pelo menos, alguns dos padrões hereditários de modificação de ácido nucleico (por exemplo, metilação), condensação de cromatina, alterações epigenéticas, impressão genêmica, etc, que ocorrem durante a diferenciação celular. A reprogramação é distinta de simplesmente manter o estado não diferenciado existente de uma célula pluripotente que é já existente, ou a manutenção do estado do que o estado totalmente diferenciado de uma célula que já é uma célula multipotente (por exemplo, uma célula-tronco hematopoiética). Reprogramação também é distinta de promover a auto-renovação ou proliferação de células que já são pluripotente ou multipotentes, embora as composições e métodos aqui descritos podem também ser úteis para esses fins, em algumas modalidades.

[279] A abordagem específica ou o método usado para gerar células estaminais pluripotentes a partir de células somáticas (de modo geral referida como “reprogramar”) não é crítica para a invenção reivindicada. Deste modo, qualquer método que reprograme uma célula somática para o fenótipo pluripotente seria adequado para utilização nos métodos aqui descritos.

[280] As metodologias de reprogramação para a geração de células pluripotentes usando combinações definidas de fatores de transcrição descreveram células estaminais pluripotentes induzidas. Yamanaka e Takahashi converteram células somáticas de camundongos para células semelhantes às células ES com potencial de desenvolvimento expandido pela transdução direta de Oct4, Sox2, Klf4, e c- Myc (Takahashi e Yamanaka, 2006). iPSCs se assemelham às células ES, a medida que elas restauram o circuito de transcrição associado à pluripotência e muc da paisagem epigenética. Além disso, iPSCs de camundongo satisfazem todos os ensaios padrão para pluripotência: especificamente, a diferenciação in vitro em tipos de células das três camadas germinais, formação de teratoma, contribuição para as quimeras, transmissão da linha germinal (Maherali e Hochedlinger, 2008), e complementação tetraplóide (Woltjen et al., 2009).

[281] Estudos subsequentes têm mostrado que as células iPS humanas podem ser obtidas utilizando métodos de transdução semelhantes (Lowry et al., 2008; Park et al., 2008; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007b), e o trio de fator de transcrição, OCT4, SOX2, e NANOG, foi estabelecido como o conjunto central de fatores de transcrição que regulam a pluripotência (Jaenisch e Young, 2008). A produção de células iPS pode ser conseguida através da introdução de sequências de ácidos nucleicos que codificam os genes associados às células estaminais para uma célula adulta somática, historicamente utilizando vetores virais.

[282] As células iPS podem ser geradas ou obtidas a partir de células somáticas terminalmente diferenciadas, bem como a partir de células estaminais adultas, ou células estaminais somáticas. Isto é, uma célula progenitora não pluripotente pode ser processada em pluripotente ou multipotente pela reprogramação. Em tais casos, pode não ser necessário incluir como muitos fatores de reprogramação necessários para reprogramar uma célula terminalmente diferenciada. Além disso, a reprogramação pode ser induzida pela introdução não viral de fatores de reprogramação, por exemplo, através da introdução das próprias proteínas, ou através da introdução de ácidos nucleicos que codificam os fatores de reprogramação, ou através da introdução de RNAs mensageiro que após a tradução produzem os fatores de reprogramação (ver, por exemplo , Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov 5;7(5):618-30). A reprogramação pode ser alcançada através da introdução de uma combinação de ácidos nucleicos que codificam os genes associados às células estaminais, incluindo, por exemplo, Oct-4 (também conhecido como oct-3/4 ou Pouf51), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, , Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, l-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, e LIN28. Em uma modalidade, a reprogramação utilizando os métodos e composições aqui descritos pode ainda compreender a introdução de um ou mais de Oct-3/4, um membro da família Sox, um membro da família Klf, e um membro da família Myc a uma somática célula. Em uma modalidade, os métodos e composições aqui descritos compreendem ainda a introdução de um ou mais de cada um de Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC e Klf4 para reprogramação. Como observado acima, o método exato utilizado para a reprogramação não é necessariamente fundamental para os métodos e composições aqui descritos. No entanto, onde as células diferenciadas a partir de células reprogramadas são para seren usadas em, por exemplo, a terapia humana, em uma modalidade a reprogramação não é efetuada por um método que altera o genoma. Assim, em tais modalidades, a reprogramação é conseguida, por exemplo, sem a utilização de vetores virais ou plasmídicos.

[283] A eficiência de reprogramação (isto é, o número de células reprogramadas) derivada a partir de uma população de células de partida pode ser reforçada com a adição de várias moléculas pequenas, como mostrado por Shi, Y., et al (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797, and Marson, A., et al (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135. Assim, um agente ou combinação de agentes que aumentam a eficiência ou a taxa de produção de células estaminais pluripotentes induzidas pode ser utilizado na produção de iPSCs específicas do paciente ou específicas da doença. Alguns exemplos não limitativos de agentes que aumentam a eficiência de reprogramação incluem Wnt solúvel, meio condicionado de Wnt, BIX-01294 (um metiltransferase histona G9a), PD0325901 (um inibidor de MEK), inibidores da metiltransferase de DNA, desacetilase histona (HDAC), ácido valpróico, 5'- azacitidina, dexametasona, suberoilanilida, ácido hidroxâmico (SAHA), vitamina C, e tricostatina (TSA), dentre outros.

[284] Outros exemplos não limitativos de agentes de aumento da reprogramação incluem: ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA (por exemplo, MK0683, vorinostate) e outros ácidos hidroxâmicos), BML-210, Depudecina (por exemplo, (-)-depudecina), HC Toxina, Nullscript (4-(l,3- dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-il)-N- hidroxibutanamida), Fenilbutirato (por exemplo, fenilbutirato de sódio) e ácido valpróico ((VPA) e outros ácidos graxos de cadeia curta), Scriptaid, Suramina sódica, Tricostatina A (TSA), APHA Composto 8, Apicidina, butirato de sódio, pivaloiloximetil butirato (Pivanex, AN-9), Trapoxina B , Clamidocina, Depsipeptídeo (também conhecido como FR901228 ou FK228), benzamidas (por exemplo, CI-994 (por exemplo, N-acetil dinalina) e MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido m-carboxicinamínico ácido bishidroxâmico), JNJ16241199, Tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (por exemplo, ácido 6-(3-clorofenilureido)capróico hidroxâmico), AOE (ácido 2-amino- 8-oxo-9,10-epoxidecanóico), CHAP31 e CHAP50. Outros agentes melhoradores de reprogramação incluem, por exemplo, as formas dominantes negativas de HDAC (por exemplo, formas cataliticamente inativas), inibidores de siARN de HDAC, e anticorpos que se ligam especificamente com as HDACs. Estes inibidores estão disponíveis, por exemplo, a partir de BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene, e Sigma Aldrich.

[285] Para confirmar a indução de células estaminais pluripotentes para uso com os métodos aqui descritos, os clones isolados podem ser testados para a expressão de um marcador de células estaminais. Tal expressão em uma célula derivada de uma célula somática identifica as células como células estaminais pluripotentes induzidas. Os marcadores de células estaminais podem ser selecionados a partir do grupo não limitativo incluindo SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1, e Nat1. Em uma modalidade, uma célula que expressa Oct4 ou Nanog é identificada como pluripotente. Os métodos para detectar a expressão de tais marcadores podem incluir, por exemplo, RT- PCR e métodos imunológicos que detectam a presença dos polipeptídeos codificados, tais como Western blots ou análise de citometria de fluxo. Em algumas modalidades, a detecção não envolve apenas RT-PCR, mas também inclui a detecção de marcadores de proteína. Marcadores intracelulares podem ser melhor identificados através de RT- PCR, enquanto que os marcadores de superfície celular são facilmente identificados, por exemplo, por imunocitoquímica.

[286] O caráter de células estaminais pluripotentes de células isoladas pode ser confirmado através de ensaios que avaliam a capacidade das iPSCs de diferenciar células de cada uma das três camadas germinais. Como um exemplo, formação de teratomas em camundongos nus pode ser utilizada para avaliar o caráter pluripotente dos clones isolados. As células são introduzidas aos camundongos nus, e a histologia e/ou a imuno-histoquímica é realizada em um tumor proveniente de células. O crescimento de um tumor compreendendo células de todas as três camadas germinais, por exemplo, indica ainda que as células são células estaminais pluripotentes.

Células somáticas para reprogramação

[287] As células somáticas, tal como o termo é aqui utilizado, referem-se a todas as células que formam o corpo de um organismo, excluindo as células da linhagem germinativa. Cada tipo de célula no corpo do mamífero - à parte do espermatozoide e óvulos, as células a partir das quais elas são feitas (gametócitos) e células estaminais indiferenciadas - é uma células somática diferenciada. Por exemplo, órgãos internos, pele, ossos, sangue e tecido conjuntivo são todos feitos de células somáticas diferenciadas.

[288] Os tipos de células somáticas adicionais para utilização com as composições e métodos aqui descritos incluem: um fibroblasto (por exemplo, um fibroblasto primário), uma célula muscular (por exemplo, um miócito), uma célula do cumulus, uma célula neural, uma célula mamária, um hepatócito e uma célula das ilhotas pancreáticas. Em algumas modalidades, a célula somática é uma linhagem de células primárias ou é a progênie de uma linhagem de células primária ou secundária. Em algumas modalidades, a célula somática é obtida a partir de uma amostra humana, por exemplo, um folículo de cabelo, uma amostra de sangue, uma biópsia (por exemplo, uma biópsia da pele ou de uma biópsia de tecido adiposo), uma amostra de swab (por exemplo, uma amostra de swab bucal), e é, portanto, uma célula somática humana.

[289] Alguns exemplos não limitativos de células somáticas diferenciadas incluem, mas não estão limitados a, célula epitelial, endotelial, neuronal, adiposa, cardíaca, do músculo esquelético, células do sistema imunológico, hepática, baço, pulmão, células sanguíneas em circulação, gastrointestinal, renal, da medula óssea e as células pancreáticas. Em algumas modalidades, uma célula somática pode ser uma célula primária isolada a partir de qualquer tecido somático, incluindo, mas não limitado para o cérebro, fígado, intestino, estômago, intestino, gordura, músculo, útero, pele, baço, órgão endócrino, osso, etc. Além disso, a célula somática pode ser de qualquer espécie de mamífero, com exemplos não limitativos, incluindo uma célula de murino, bovino, símio, porcino, equino, ovino, ou de humanos. Em algumas modalidades, a célula somática é uma célula somática humana.

[290] Quando as células reprogramadas são usadas para a geração de células progenitoras hematopoiéticas a seren utilizadas no tratamento terapêutico de doença, é desejável, mas não necessário, a utilização de células somáticas isoladas a partir do paciente a ser tratado. Por exemplo, células somáticas envolvidas em doenças e células somáticas que participam no tratamento terapêutico de doenças e semelhantes podem ser utilizadas. Em algumas modalidades, um método para selecionar as células reprogramadas a partir de uma população heterogênea compreendendo células reprogramadas e células somáticas em que elas foram geradas ou derivadas pode ser realizado por quaisquer meios conhecidos. Por exemplo, um gene de resistência a fármacos ou similares, tal como um gene marcador selecionável pode ser utilizado para isolar as células reprogramadas usando o marcador selecionável como um índice.

[291] As células somáticas reprogramadas como aqui descritas podem expressar qualquer número de marcadores de células pluripotentes, incluindo: fosfatase alcalina (AP); ABCG2; antígeno-1 embrionário de estágio específico (SSEA- 1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-caderina; II-tubulina; actina do músculo liso (MA); fator de crescimento de fibroblastos 4 (FGF4), Cripto, DAX1; proteína dedo-de-zinco 296 (Zfp296); N- acetiltransferase-1 (Nat1); (transcrito 1 associado à célula ES) (ECAT1);ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; fator de transcrição célula embrionário indiferenciado (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; telomerase, incluindo TERT; genes do cromossomo X silenciosos; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box contendo proteína 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; desenvolvimento associado à pluripotência 2 (DPPA2); ponto de rutura de linfoma de célula T 1 (TCL1); DPPA3/Stella; DPPA4; outros marcadores gerais de pluripotência, etc. Outros marcadores podem incluir Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; b-catenina, e Bmi1. Tais células podem também ser caracterizadas pela diminuição da regulação dos marcadores característicos de células somáticas a partir dos quais a célula estaminal pluripotente induzida é derivada.

Edição do genoma e endonucleases de direcionamento de DNA

[292] Tal como aqui utilizado, o termo “edição genoma” refere-se a um método de genética inversa utilizando nucleases manipuladas artificialmente para cortar e criar quebras de cadeia dupla específicas em localização(s) desejada no genoma, que são então reparadas por processos celulares endógenos, tais como, a recombinação homóloga (HR), homologia de reparação dirigida (HDR) e junção de extremidade não homóloga (NHEJ). NHEJ junta diretamente as extremidades do DNA em uma ruptura de cadeia dupla, enquanto HDR utiliza uma sequência homóloga como um modelo para a regeneração da sequência de DNA em falta no ponto de ruptura.

[293] A edição de genoma não pode ser realizada utilizando endonucleases de restrição tradicionais, uma vez que a maioria das enzimas de restrição reconhecem alguns pares de bases de DNA como seu alvo, e a probabilidade é muito alta que a combinação de pares de base reconhecida irá ser encontrada em vários locais de todo o genoma, resultando em cortes múltiplos (ou seja, não se limitando a um local desejado). Para superar este desafio e criar quebras de cadeia dupla específicas do local, várias classes distintas de nucleases foram descobertas e bioprojetadas até o moemento. Estas são as meganucleases, nucleases de dedo-de- zinco (ZFNs), sistema Cas9/CRISPR, e nucleases efetoras do tipo ativadoras de transcrição (TALENs).

[294] As meganucleases são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1), a família GIY-YIG, a família His-Cys box e a família HNH. Estas famílias são caracterizadas por motivos estruturais, que afetam a atividade catalítica e a sequência de reconhecimento. Por exemplo, os membros da família LAGLIDADG são caracterizados por possuírem uma ou duas cópias do motivo conservado LAGLIDADG (ver Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). As meganucleases LAGLIDADG com uma única cópia dos motivos LAGLIDADG formam homodímeros, enquanto membros com duas cópias de LAGLIDADG são encontrados como monômeros. Da mesma forma, os membros da família GIY- YIG têm um módulo GIY-YIG, que é de 70 a 100 resíduos de comprimento, e incluem quatro ou cinco motivos de sequência conservados com quatro resíduos invariantes, dois dos quais são necessários para a atividade (ver Van Roey et al. (2002), Nature Struct. Biol. 9: 806-811). As meganucleases His-Cys box são caracterizadas por uma série altamente conservada de histidinas e cisteínas ao longo de uma região que abrange várias centenas de resíduos de aminoácidos (ver Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). No caso da família NHN, os membros são definidos por motivos contendo dois pares de histidinas conservadas rodeados por resíduos de asparagina (ver Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). As quatro famílias de meganucleases são largamente separadas uma da outra no que diz respeito aos elementos estruturais conservados e, por conseguinte, a especificidade de sequência de reconhecimento de DNA e atividade catalítica.

[295] As meganucleases são comumente encontradas em espécies microbianas, e têm a propriedade única de terem sequências de reconhecimento muito longas (>14bp) tornando- as assim, naturalmente, muito específicas para cortar em uma localização desejada. Isto pode ser explorado para fazer rupturas específicas do local de cadeia dupla na edição de genoma. Um técnico especialista no assunto pode utilizar estas meganucleases que ocorrem naturalmente, no entanto, o número de tais meganucleases que ocorrem naturalmente é limitado. Para ultrapassar este desafio, métodos de rastreamento de mutagênese e de alto rendimento foram usados para criar variantes de meganucleases que reconhecem sequências únicas. Por exemplo, várias meganucleases foram fundidas para criar enzimas híbridas que reconhecem uma nova sequência. Alternativamente, o DNA que interage aminoácidos da meganuclease pode ser alterado para criar meganucleases específicas de sequência (ver, por exemplo, a Patente Norte- Americana 8,021,867). As meganucleases podem ser concebidas usando os métodos descritos em, por exemplo, Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975; Patentes Norte- Americanas Nos. 8,304,222; 8,021,867; 8,119,381; 8,124,369; 8,129,134; 8,133,697; 8,143,015; 8,143,016; 8,148,098; ou 8,163,514, o conteúdo de cada uma é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Alternativamente, as meganucleases com características específicas do local de corte podem ser obtidas usando tecnologias disponíveis comercialmente, por exemplo, tecnologia de edição de genoma Precision BioSciences’ Directed Nuclease Editor™.

[296] As tecnologia de endonuclease de restrição de ZFNs e TALENs utilizam uma enzima de corte de DNA não- específico que está ligada a um peptídeo(s) de reconhecimento de sequência de DNA específico, tais como dedos-de-zinco e efetores tipo ativadores de transcrição(TALEs). Tipicamente, uma endonuclease cujo local de reconhecimento de DNA e local de clivagem são separados um do outro é selecionada, e a sua porção de clivagem é separada e, em seguida, ligada a um peptídeo de sequência de reconhecimento, obtendo-se desse modo uma endonuclease com especificidade muito elevada para uma sequência desejada. Uma enzima de restrição exemplar com tais propriedades é FokI. Além disso, FokI tem a vantagem de exigir dimerização para ter atividade de nucleasse, e isto significa que a especificidade aumenta drasticamente à medida que cada parceiro de nuclease reconhece uma sequência única de DNA. Para reforçar este efeito, as nucleases FokI foram projetadas que só podem funcionar como heterodímeros, e aumentaram a atividade catalítica. As nucleases de funcionamento de heterodímeros evitam a possibilidade da atividade de homodímero não desejada e, assim, aumentam a especificidade da ruptura de cadeia dupla.

[297] Embora as porções de nucleases de ambas ZFNs e TALENs tenham propriedades semelhantes, a diferença entre estas nucleases modificadas está no seu peptídeo de reconhecimento de DNA. ZFNs apoiam-se nos dedos-de-zinco Cys2-His2 e TALENs em TALEs. Ambos os domínios peptídicos de reconhecimento de DNA têm a característica de que eles são naturalmente encontrados em combinações em suas proteínas. Dedos-de-zinco Cys2-His2 tipicamente acontecem nas repetições que são de 3 bp separadas, e estão disponíveis em diversas combinações de uma variedade de proteínas de interação de ácidos nucleicos, tais como fatores de transcrição. TALEs, por outro lado são encontrados em repetições com uma proporção de reconhecimento de um-para- um entre os aminoácidos e os pares de nucleotídeos reconhecidos. Porque ambos os dedos-de-zinco e TALENs acontecem em padrões repetidos, diferentes combinações podem ser tentadas para criar uma ampla variedade de especificidades de sequência. Abordagens para fazer endonucleases de dedos-de-zinco específicas do local incluem, por exemplo, a montagem modular (onde os dedos-de- zinco correlacionaram com uma sequência de tripleto estão ligadas em uma fila para cobrir a sequência necessária), OPEN (seleção de baixa severidade de domínios peptídicos vs. nucleotídeos tripletos seguido pelas seleções de elevado rigor de combinação de peptídeo contra o alvo final em sistemas bacterianos), e um rastreamento bacteriano de um híbrido de bibliotecas de dedo-de-zinco, dentre outros. ZFNs para uso com os métodos e composições aqui descritos podem ser obtidos comercialmente a partir de, por exemplo, Sangamo Biosciences ™ (Richmond, CA).

[298] É aqui contemplado que o sistema Cas9/CRISPR de edição do genoma pode ser utilizado com os métodos e composições aqui descritos. Repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR)/sistemas associados a CRISPR (CAS) é útil para edição do genoma de RNA programável (ver, por exemplo, Jinek, M. et al. Science (2012) 337(6096):816-821).

[299] Em alternativa, a edição de genoma pode ser realizada utilizando vírus recombinantes adeno-associados (rAAV) baseados na engenharia genômica, que é uma plataforma de edição de genoma centrada em torno da utilização de vetores de rAAV que permite a inserção, deleção ou substituição de sequências de DNA em genomas de células de mamíferos vuvas. O genoma de rAAV é uma molécula de ácido desoxirribonucleico de cadeia simples (ssDNA), ou detectada positiva ou negativa, que é cerca de 4,7 quilobases de comprimento. Estes vetores virais de DNA de cadeia simples têm elevadas taxas de transdução e têm uma propriedade única de estimular a recombinação homóloga endógena na ausência de causar quebras duplas de DNA no genoma de cadeia. Um técnico especialista no assunto pode criar um vetor de rAAV a um lócus genômico alvo desejado e realizar as duas alterações no gene endógeno brutas e/ou subtis em uma célula, tal como uma deleção. A edição de genoma de rAAV tem a vantagem na medida em que tem como alvo um único alelo, e não resulta em quaisquer alterações genômicas fora do alvo. A tecnologia de edição genoma rAAV está disponível comercialmente, por exemplo, o sistema rAAV GENESIS™ da Horizon™ (Cambridge, UK).

Veículos farmaceuticamente aceitáveis

[300] Os métodos de administração de progenitores hematopoiéticos humanos a um indivíduo como aqui descritos envolvem a utilização de composições terapêuticas que compreendem células progenitoras hematopoiéticas. As composições terapêuticas contêm um veículo fisiologicamente tolerável em conjunto com a composição celular e, opcionalmente, pelo menos um agente bioativo adicional, tal como aqui descrito, dissolvido ou disperso nele como um ingrediente ativo. Em uma modalidade preferida, a composição terapêutica não é substancialmente imunogênica quando administrada a um mamífero ou paciente humano para fins terapêuticos, a menos que assim se desejar.

[301] Em geral, as células progenitoras hematopoiéticas aqui descritas são administradas como uma suspensão com um veículo farmaceuticamente aceitável. Um técnico especialista no assunto reconhecerá que um veículo farmaceuticamente aceitável para ser utilizado em uma composição de células não incluirá tampões, compostos, agentes de criopreservação, conservantes, ou outros agentes em quantidades que interferem substancialmente com a viabilidade das células a serem entregues aos indivíduos. Uma formulação compreendendo células pode incluir, por exemplo, tampões osmóticos que permitam a integridade da membrana da célula para ser mantida, e opcionalmente, nutrientes para manter a viabilidade celular ou melhorar o enxerto após a administração. Tais formulações e suspensões são conhecidas dos técnicos especialistas no assunto e/ou podem ser adaptadas para utilização com as células progenitoras hematopoiéticas como aqui descritas utilizando experimentação de rotina.

[302] Uma composição de células também pode ser emulsionada ou apresentada como uma composição de lipossomas, desde que o procedimento de emulsificação não afete negativamente a viabilidade das células. As células e qualquer outro ingrediente ativo podem ser misturados com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo e em quantidades adequadas para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos.

[303] Os agentes adicionais incluídos em uma composição de células tal como aqui descrito podem incluir sais farmaceuticamente aceitáveis dos seus componentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes. Veículos fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na técnica. Exemplos de veículos líquidos são soluções aquosas estéreis que não contêm materiais além dos ingredientes ativos e água, ou contêm um tampão tal como fosfato de sódio ao valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, tal como solução salina tamponada com fosfato. Ainda adicionalmente, os veículos aquosos podem conter mais do que um sal de tampão, bem como sais tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose, polietilenoglicol e outros solutos. As composições líquidas podem também conter fases liquidas em adição à e para a exclusão de água. Exemplos destas fases líquidas adicionais são a glicerina, óleos vegetais, tais como óleo de semente de algodão, e emulsões água-óleo. A quantidade de um composto ativo utilizado nas composições de células como aqui descrito que é eficaz no tratamento de uma desordem ou condição particular, dependerá da natureza da desordem ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.

Administração e Eficácia

[304] Tais como aqui utilizados, os termos “administrar”, “introduzir” e “transplantar” são utilizados indiferentemente no contexto da colocação de células, por exemplo, células progenitoras hematopoiéticas, tal como aqui descrito em um indivíduo, por um método ou rota que resulta na localização, pelo menos parcial das células introduzidas em um local desejado, tal como um local de ferimento ou de reparação, de modo que o efeito(s) desejado é produzido. As células, por exemplo, células progenitoras hematopoiéticas, ou a sua progênie diferenciada podem ser administradas por qualquer via apropriada que resulte na entrega a um local desejado no indivíduo, em que pelo menos uma porção das células ou componentes de células implantadas permanecem viáveis. O período de viabilidade das células após a administração a um indivíduo pode ser tão curto como algumas horas, por exemplo, 24 horas, a alguns dias, enquanto a vários anos, ou seja, o enxerto a longo prazo. Por exemplo, em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, uma quantidade efetiva de células progenitoras hematopoiéticas é administrada através de uma via sistêmica de administração, tal como uma injeção intraperitoneal ou intravenosa.

[305] Quando fornecidas profilaticamente, as células progenitoras hematopoiéticas aqui descritas podem ser administradas a um indivíduo antes de qualquer sintoma de uma hemoglobinopatia, por exemplo, antes da troca de y- globina para β-globina predominantemente fetal. Por conseguinte, a administração profilática de uma população de células progenitoras hematopoiéticas serve para evitar uma hemoglobinopatia, tal como aqui descrita.

[306] Quando fornecidas terapeuticamente, as células progenitoras hematopoiéticas são fornecidas em (ou depois) do início de um sintoma ou indicação de uma hemoglobinopatia, por exemplo, mediante o aparecimento da doença das células falciformes.

[307] Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, a população de células progenitoras hematopoiéticas sendo administrada de acordo com os métodos aqui descritos compreende células progenitoras hematopoiéticas obtidas a partir de um ou mais doadores. Tal como aqui utilizado, “alogênica” refere-se a uma célula progenitora hematopoiética ou amostras biológicas que compreendem células progenitoras hematopoiéticas obtidas a partir de um ou mais doadores diferentes da mesma espécie, em que os genes em um ou mais lócus não são idênticos. Por exemplo, uma população de células progenitoras hematopoiéticas a ser administrada a um indivíduo pode ser derivada a partir do sangue do cordão umbilical obtido a partir de um mais indivíduos doadores não relacionados, ou a partir de um ou mais irmãos não idênticos. Em algumas modalidades, as populações de células progenitoras hematopoiéticas singenêicas podem ser utilizadas, tais como as obtidas a partir de animais geneticamente idênticos, ou a partir de gêmeos idênticos. Em outras modalidades deste aspecto, as células progenitoras hematopoiéticas são células autólogas, isto é, as células progenitoras hematopoiéticas são obtidas ou isoladas a partir de um indivíduo e administradas ao mesmo indivíduo, ou seja, o doador e o receptor são os mesmos.

[308] Para a utilização nos vários aspectos aqui descritos, uma quantidade efetiva de células progenitoras hematopoiéticas compreende pelo menos 102 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 5 X 102 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 103 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 5 X 103 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 104 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 5 X 104 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 2 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 3 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 4 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 5 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 6 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 7 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 8 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 9 X 105 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 1 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 2 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 3 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 4 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 5 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 6 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 7 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 8 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, pelo menos 9 X 106 células progenitoras hematopoiéticas, ou múltiplos destas. As células progenitoras hematopoiéticas podem ser obtidas a partir de um ou mais doadores, ou podem ser obtidas a partir de uma fonte autóloga. Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, as células progenitoras hematopoiéticas são expandidas em cultura antes da administração a um indivíduo em necessidade das mesmas.

[309] Em uma modalidade, o termo “quantidade eficaz” tal como aqui utilizado refere-se à quantidade de uma população de células progenitoras hematopoiéticas humanas ou sua descendência necessárias para aliviar, pelo menos, um ou mais dos sintomas de uma hemoglobinopatia, e refere-se a uma quantidade suficiente de uma composição para proporcionar o efeito desejado, por exemplo, o tratamento de um indivíduo tendo uma hemoglobinopatia. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, portanto, refere-se a uma quantidade de células progenitoras hematopoiéticas ou uma composição compreendendo células progenitoras hematopoiéticas que é suficiente para promover um efeito particular, quando administradas a um indivíduo típico, tal como um que tem ou está em risco de uma hemoglobinopatia .Uma quantidade eficaz como é aqui utilizada também inclui uma quantidade suficiente para prevenir ou retardar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o curso de um sintoma da doença (por exemplo, mas não limitado a, retardar a progressão de um sintoma da doença), ou inverter um sintoma da doença. Entende-se que, para qualquer dado caso, uma “quantidade eficaz” apropriada pode ser determinada por um técnico especialista no assunto utilizando experimentação de rotina.

[310] Tal como aqui utilizado, “administrar” refere-se à entrega de uma composição de células estaminais hematopoiéticas, tal como aqui descrita em um indivíduo por um método ou rota que resulta na localização, pelo menos, parcial da composição de células em um local desejado. Uma composição de células pode ser administrada por qualquer via apropriada que resulta no tratamento eficaz no indivíduo, isto é, a administração resulta na entrega a um local desejado no indivíduo, em que pelo menos uma porção da composição de entrega, ou seja, pelo menos, 1 x 104 são células entregues no local desejado para um período de tempo. Os modos de administração incluem injeção, infusão, instilação, ou ingestão. ”Injeção” inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, sub-capsular, subaracnóide, intraespinhal, intracérebro espinhal, e injeção intraesternal e infusão. Para a entrega de células, a administração por injeção ou perfusão é geralmente preferida.

[311] Em uma modalidade, as células tais como aqui descritas são administradas sistemicamente. As frases “administração sistêmica”, “administrada sistemicamente”, “administração periférica” e “administrado perifericamente” como usadas aqui se referem à administração de uma população de células progenitoras hematopoiéticas que não são diretamente em um local alvo, tecido ou órgão, tal que ela entra, em vez disso, no sistema circulatório do indivíduo e, assim, é submetida ao metabolismo e outros processos semelhantes.

[312] A eficácia de um tratamento, que compreende uma composição como aqui descrita para o tratamento de uma hemoglobinopatia pode ser determinada pelo médico especialista. No entanto, um tratamento é considerado “tratamento eficaz”, como o termo é aqui utilizado, se qualquer um ou todos os sinais ou sintomas de, como apenas um exemplo, os níveis de β-globina fetal são alterados de uma forma benéfica, outros sintomas aceitos clinicamente ou marcadores de doença são melhoradas ou amenizados, por exemplo, em pelo menos 10% após o tratamento com um inibidor. A eficácia pode também ser medida por uma falha de um indivíduo a agravar-se como avaliada pela hospitalização ou necessidade de intervenções médicas (por exemplo, a progressão da doença é interrompida ou pelo menos retardada). Os métodos de medição destes indicadores são conhecidos dos técnicos especialistas no assunto e/ou aqui descritos. O tratamento inclui qualquer tratamento de uma doença em um indivíduo ou um animal (alguns exemplos não limitativos que incluem um humano, ou um mamífero) e incluem: (1) inibição da doença, por exemplo, prender, ou retardar a progressão da sepse; ou (2) aliviar a doença, por exemplo, provocando a regressão dos sintomas; e (3) prevenção ou redução da probabilidade do desenvolvimento de infecção ou sepse.

[313] O tratamento de acordo com a presente invenção melhora um ou mais sintomas associados com uma desordem de β-globina através do aumento da quantidade de hemoglobina fetal no indivíduo. Os sintomas geralmente associados com uma hemoglobinopatia incluem, por exemplo, anemia, hipóxia tecidual, disfunção orgânica, valores de hematócrito anormais, eritropoiese ineficaz, contagem de reticulócitos anormais (eritrócitos), carga de ferro anormal, a presença de sideroblastos em anel, esplenomegalia, hepatomegalia, fluxo de sangue periférico prejudicado, dispneia, aumento de hemólise, icterícia, crises de dor anêmica, síndrome torácica aguda, sequestro esplênico, priapismo, acidente vascular cerebral, síndrome mão-pé, e dor tal como angina de peito.

[314] Em uma modalidade, a célula progenitora hematopoiética é contatada ex vivo ou in vitro com uma endonuclease de direcionamento de DNA, e a célula ou a sua descendência é administrada a um mamífero (por exemplo, humano). Em outra modalidade, a célula progenitora hematopoiética é uma célula da linhagem eritróide. Em uma modalidade, uma composição compreendendo uma célula progenitora hematopoiética foi previamente posta em contato com uma endonuclease de direcionamento de DNA e um veículo farmaceuticamente aceitável e é administrada a um mamífero.

[315] Em uma modalidade, qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para medir um aumento da expressão da hemoglobina fetal, por exemplo, a análise de Western Blot da proteína de hemoglobina fetal e quantificação de mRNA de Y-globina fetal.

[316] Em uma modalidade, a célula progenitora hematopoiética é posta em contato com uma endonuclease de direcionamento de DNA in vitro ou ex vivo. Em uma modalidade, a célula é de origem humana (por exemplo, uma autóloga ou heteróloga). Em uma modalidade, a composição provoca um aumento da expressão da hemoglobina fetal.

[317] A presente invenção pode ser definida em qualquer um das seguintes parágrafos alfabetizados: [A] Um método para a produção de uma célula progenitora tendo mRNA de BCL11A ou a expressão da proteína diminuídos o método compreendendo o contato de uma célula progenitora isolada com um agente que se liga ao DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 (de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome), reduzindo, assim, o mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A [B] Um método para a produção de uma célula humana projetada genética isolada tendo pelo menos uma modificação genética em que compreende o contato de uma célula isolada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no mesmo. [C] O método do parágrafo [A] ou [B], em que a célula progenitora isolada ou célula isolada é uma célula progenitora hematopoiética. [D] O método do parágrafo [C], em que o progenitor hematopoiético é uma célula da linhagem eritróide. [E] O método do parágrafo [A] ou [B], em que a célula progenitora isolada ou célula isolada é uma célula estaminal pluripotente induzida. [F] O método do parágrafo [C], em que a célula progenitora hematopoiética é contatada ex vivo ou in vitro. [G] O método de qualquer um dos parágrafos [A] a [F], em que pelo menos uma modificação genética é uma deleção. [H] O método do parágrafo [G], em que a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, ou remove uma porção da região que resulta na ruptura de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 (DHS). [I] Célula humana projetada genética isolada possuindo pelo menos uma modificação genética na localização 60,716,189-60,728,612 no cromossomo 2 de acordo com os parágrafos [B] a [H]. [J] Uma composição compreende as células humanas projetadas genéticas isoladas do parágrafo [I]. [K] Um método de aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula, o método compreendendo as etapas de: contatar uma célula isolada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que as endonucleases de direcionamento de DNA clivam o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada na referida célula, ou a sua descendência, em relação à referida célula antes do referido contato. [L] O método do parágrafo [K], em que a célula isolada é uma célula progenitora hematopoiética. [M] O método do parágrafo [K] ou [G], em que a célula progenitora hematopoiética é uma célula da linhagem eritróide. [N] O método do parágrafo [K], em que a célula isolada é uma célula estaminal pluripotente induzida. [O] O método do parágrafo [G] ou [H], em que a célula progenitora hematopoiética é contatada ex vivo ou in vitro. [P] O método de qualquer um dos parágrafos [K] a [S], em que a pelo menos uma modificação genética é uma deleção. [Q] O método do parágrafo [P], em que a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 ou remove uma porção da região que resulta na ruptura de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 (DHS). [R] Um método para aumentar os níveis de hemoglobina fetal em um mamífero em necessidade do mesmo, o método compreendendo as etapas de contato de uma célula progenitora hematopoiética isolada no referido mamífero com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease de direcionamento de DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease de direcionamento de DNA, em que a endonuclease de direcionamento DNA cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 causando pelo menos uma modificação genética no seu interior, em que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada no referido mamífero, em relação à expressão antes do referido contato.

[318] A invenção é adicionalmente ilustrada pelo exemplo seguinte, que não deve ser entendido como limitante. Os conteúdos de todas as referências citadas ao longo deste pedido, bem como as figuras e tabela estão aqui incorporados por referência.

EXEMPLO

[319] Os inventores descobriram e caracterizaram elementos reguladores do gene BCL11A que são críticos para a sua expressão em células de linhagem eritróide. Variantes genéticas comuns dentro destas sequências estão associadas com nível de hemoglobina fetal e gravidade do distúrbio de beta-globina. Estas sequências incluem elementos reguladores distais com uma assinatura de cromatina potenciadora, possuindo cromatina acessível, marcas de histona ativas, e ocupação por fatores de transcrição eritróide. Estes elementos interagem com o promotor de BCL11A e promovem a expressão de genes em células eritróides, mas não outras linhagens que expressam BCL11A tais como linfócitos-B. Estes elementos reguladores podem ser direcionados para fins terapêuticos para alcançar inibição de BCL11A e reindução da hemoglobina fetal. Isto pode ser conseguido por mecanismos não limitados à edição de genoma, um ácido nucleico ou proteína de ligação, e modificação epigenética. As vantagens deste método incluem: perturbações de um regulador fisiológico da concentração de hemoglobina fetal, resultando em aumento da produção de gama-globina e a produção de beta- globina reduzida; efeito mínimo sobre a produção global de globina ou na produção de glóbulos vermelhos ou função; limitação de impacto em células fora da linhagem eritróide reduzindo assim a toxicidade potencial.

Materiais e métodos Cultura de células

[320] As células CD34+ humanas do sangue periférico mobilizado de doadores saudáveis foram obtidas a partir de centros de Excelência em Hematologia Molecular na Universidade de Yale, em New Haven, Connecticut e Centro de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson, Seattle, Washington. As células foram submetidas à maturação eritróide ex vivo com um protocolo de cultura líquido isento de soro de duas fases, tal como foi previamente descrito (39). As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidas de dadores saudáveis do Hospital de Crianças de Boston. Diferenciação eritróide a partir de PBMC foi realizada como previamente descrito (40). A eritroleucemia de camundongo (MEL) e células 293T foram cultivadas como anteriormente descrito (39). Células de murino de linfócitos pré-B transformadas v-Abl estavelmente (derivadas como descrito (41)) foram cultivadas em RPMI mais 2% de penicilina- estreptomicina, 15% de FCS, 2% de HEPES, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de piruvato de sódio, 1% de L-glutamina e 100 μM de Dmercaptoetanol.

ChIP e sensibilidade de DNase I

[321] Imunoprecipitação da cromatina e sequenciamento massivamente paralelos foram realizados como descrito (39). Foram utilizados os seguintes anticorpos: H3K27me3 (Millipore, 07-449), H3K4me3 (Millipore, 04-745), H3K4me1 (Abcam, ab8895), H3K27ac (Abcam, ab4729), RNA Polimerase II (PolII, Santa Cruz, sc-899), GATA1 (Abcam, ab11852) eTAL1 (Santa Cruz, sc-12984). A densidade de clivagem de DNase I foi realizada e analisada como anteriormente descrito (42). Para ChIP-qPCR, o enriquecimento relativo foi determinado pela comparação de amplificação de material ChIP a 1% de entrada da cromatina pelo método ΔCt. Loci previamente relatados para serem ocupados e não ocupados por GATA1 e TAL1 foram utilizados como controles positivos e negativos, respectivamente (39).

Captura de conformação de cromossomo (3C)

[322] O ensaio 3C foi realizado como anteriormente descrito (39), exceto como abaixo. Núcleos de precursores eritróides humanos primários de ligação cruzada com formaldeído foram digeridos com HindIII antes da ligação e inversão de ligações cruzadas. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada utilizando SYBR Green Supermix iQ (BioRad, 170-8880). Um fragmento contendo o promotor BCL11A foi utilizado como região de âncora. Para corrigir a eficiência de amplificação de diferentes primers, um modelo de controle foi preparado por digestão e ligação de uma mistura equimolar de dois cromossomos artificiais bacterianos (BACs), compreendendo o locus BCL11A humano completo (RP11-606L8 e RP11-139C22) e um dos agrupamentos humanos Dglobina (CTD- 3055E11). Uma interação entre os fragmentos em HS1/HS2 e HS3 da região de controle do locus de 13-globina humana (LCR) serviu como um controle positivo. A interação frequência foi expressa como a amplificação em relação à interação de LCR conhecida, normalizada para o modelo de controle de BAC.

Mapeamento fino do lócus de BCL11A

[323] Marcadores (todas as coordenadas de hg19) foram selecionados a partir de dentro de três íntrons de BCL11A, 2 DHSs +62 (chr2:60,717,492-60,718,860), +58 (chr2:60,721,411-60,722,674) e +55 (chr2:60,724,802- 60,726,084). 21 marcadores foram identificados a partir do banco de dados do Projeto Genomas 1000 usando as populações de referência do Norte da Europa (CEU), Nigéria (YRI) e Africano-Americana (ASW) (Tabela S1). 38 variantes adicionais estavam presentes em dbSNP135 (Tabela 2). Os inventores sequenciaram através da química de Sanger três intervalos de DHS no DNA de 52 e 36 células falciformes doentes falciformes (SCD) a partir de pacientes na coorte CSSCD com níveis elevados (> 8%) e baixos (<2%) de HbF, respectivamente. A partir deste esforço sequenciamento, sete variantes de sequências novas foram identificadas (Tabela 3). Porque a maioria dos marcadores agrupam em intervalos pequenos genômicos, não foi possível projetar testes de genotipagem para alguns deles. Das 66 variantes não redundantes identificadas nos três DHSS, ensaios de genotipagem para 40 marcadores foram realizados em 1263 participantes do CSSCD, uma coorte SCD Africano-americana para a qual o DNA genômico (gDNA) está disponível e os níveis de HbF são conhecidos (21). Marcadores foram genotipados usando a plataforma Sequenom iPLEX. Indivíduos e variantes de sequência de DNA com uma taxa de sucesso de genotipagem <90% foram excluídos. A concordância geral genótipa estimada a partir de triplicatas foi de 100%. Os controles de qualidade de passagem de SNPs (QC; n = 38) são listados nas Tabelas 2 e 3, e mostrados esquematicamente nas Figs. 11A e 11B abaixo de três DHSS. Uma fração substancial dos SNPs genotipados é rara nas populações de referência, de modo que não surpreende a monomórfica em CSSCD (n = 18). Depois de QC, 1.178 indivíduos e 20 SNPs polimórficas permaneceram para a análise. Os níveis de HbF foram modelados como previamente descrito (9, 43). Associação e análises condicionais de variantes individuais (MAF> 1%) foram realizadas com PLINK (44) por meio de regressão linear sob um modelo genético aditivo. Análise de variantes comuns (MAF> 1%) revelou que rs1427407 em DHS +62 teve a associação mais forte com o nível de HbF (P = 7,23 x 10-50; Figs. 11A e 3B). Análise condicional demonstrou que, após o condicionamento em rs1427407 e rs7606173, não mais SNPs foram significativas (Fig. 3B). Ajustar para componentes principais (PCs) em 855 indivíduos para os quais os dados de genotipagem de todo o genoma estavam disponíveis na conta para mistura e outros fatores de confusão produziram resultados semelhantes.

[324] Para variantes raras e de baixa frequência (MAF <5%), os inventores realizaram análises usando cada um dos três DHSS 62, 58 e 55 como da unidade de teste baseada em conjunto. Para essas análises, foi utilizado o teste de associação do programa de sequência kernel (SKAT-O) (45) com os parâmetros predefinidos. Os inventores selecionaram o limite de 5% para MAF, a fim de maximizar o valor estatístico dado a nossa dimensão limitada da amostra, mas note que marcadores com um MAF entre 1% e 5% também foram analisados nas análises únicas variantes apresentadas acima. Esta sobreposição variante é contabilizada usando análises condicionais com as variantes comuns associadas de forma independente com níveis de HbF. Dois conjuntos foram encontrados para ser estatisticamente significativos, ou seja, DHS +62 e DHS +55, mas, após condicionamento em rs1427407 e rs7606173, os resultados não eram mais estatisticamente significativos, sugerindo LD fraca entre as variantes raras/de baixa frequência e os SNPs comuns (Tabela 5). Os inventores não encontraram provas de que seqüência raras e de baixa frequência variantes dentro de BCL11A DHSs influenciam os níveis de HbF em pacientes com DF, apesar do re-sequenciamento de Sanger destes DHSs em 88 indivíduos com fenótipo HbF extremo.

[325] As frequências de haplótipos rs1427407- rs7606173 em CSSCD são: T-G 24,5%, T- C 0,085%, G-C 42,3%, G-G 33,1%. O nível médio de HbF é 4,05% (SD 3,10) em 213 indivíduos rs1427407-rs7606173 G-C, 7,08% (SD 4,50) em 254 heterozigotos rs1427407-rs7606173 T-G/G-T e 11,21% (SD 4,37) em 60 indivíduos rs1427407-rs7606173 T-G (Fig. 3C). Para comparações dos níveis de HbF entre os genótipos, os valores de P foram determinados por testes t de student de uma cauda. Haplotipagem Molecular

[326] Para dois SNPs heterozigotos no mesmo cromossomo, existem duas fases possíveis: A-B/a-b (modelo 1) e A-b/a-B (modelo 2). Para SNPs dentro dos 2 fragmentos de íntrons12-kb BCL11A +52.0-64.4 kb, a fase foi determinada por clonagem de produtos PCR e determinação co-distribuição de alelos SNP. Para determinar a fase dos alelos rs7569946 e rs1427407 (separados por 30,1 kb no cromossomo 2), PCR de fusão emulsão foi realizada como previamente descrito (24, 25) com pequenas modificações. PCR de fusão traz duas regiões de interesse, a partir de partes separadas do mesmo cromossomo, em conjunto em um único produto. Ao realizar a reação em emulsão com microgotículas aquosas rodeadas por óleo, a preponderância de amplicóns são derivadas a partir de uma única molécula do molde. O DNA genômico de indivíduos conhecido em ser duplamente heterozigótico para rs7569946 e rs1427407 serviu como molde na sequência de reação 100 i&l (com as concentrações finais indicadas): KOD Hot Start DNA Polimerase (14 U, Novagen, 71086), tampão KOD (1X), MgSO4 (1,5 mM), dNTPs (0,2 mM cada), primers 7569946-F e rs1427407- R (1 i & m cada), primer rs7569946-R (30 nM), primer interior de ponte rs7569946-R-revcomp-rs1427407-F (30 nM), gDNA (200 ng). A reação aquosa 100 i&l foi adicionada gota a gota com agitação à fase oleosa 200 i&l para criar uma emulsão. Duas alíquotas de emulsão 125 i&l foram amplificadas de acordo com as seguintes condições: 95 graus 2 minutos; 45 ciclos de 95 graus 20 segundos, 60 graus 10 segundos, 70 graus 30 segundos; 70 graus 2 minutos. O produto de PCR de fusão extraído com hexano foi submetido ao PCR aninhado em 25 i&l como se segue: Hot Start KOD DNA Polimerase (0,5 L), tampão KOD (1X), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM cada),primers rs7569946-aninhado-F e rs1427407-aninhado-R (300 nM cada), produto de PCR fusão extraído (75 nl); 95 graus 2 minutos; 35 ciclos de 95 graus 20 segundos, 60 graus 10 segundos, 70 graus 30 segundos; 70 graus 2 minutos. O produto aninhado foi confirmado por eletroforese em gel de agarose para constituir uma única banda de tamanho esperado. O produto purificado foi clonado com o kit Zero Blunt PCR Cloning (Life Technologies, K2700-20). O sequenciamento de Sanger de clones de amplicóns de fusão enumerados de 4 sequências possíveis: A-B, a-b, b-A e a-B. A probabilidade de cada fase foi calculada com base no pressuposto de uma distribuição multinominal (Tabela 6). A taxa de probabilidade para as duas configurações foi calculada como uma medida para a significância estatística dos dados correspondentes ao modelo haplótipo 1 (em comparação com o modelo 2). Uma razão se aproximando do infinito sugere modelo 1, uma razão de 1 sugere equilíbrio, e uma razão próximo de zero sugere modelo 2.

Pirosequenciamento

[327] Os doadores saudáveisde células CD34+ foram selecionados para identificar os cinco doadores heterozigotos para rs1427407. Estas células CD34+ foram submetidas à diferenciação eritróide ex vivo. Cromatina foi isolada e ChIP realizada com anticorpos GATA1 e TAL1. A cromatina de entrada, em comparação com material precipitado de GATA1 ou TAL1 foi objeto de pirosequenciamento para determinar o equilíbrio alélico de rs1427407. Os doadores saudáveisde CD34+ foram rastreados para identificar três doadores heterozigotos para o haplótipo rs1427407-rs7606173 G-C/T-G. Estas células CD34+ foram submetidas à diferenciação eritróide ex vivo. O DNA complementar (cDNA) e gDNA foram submetidos a pirossequencimento para determinar o balanço alélico de rs7569946.

[328] As condições de PCR como se segue: Mistura mestre 2X HotStarTaq (Qiagen, 203,443), MgCl2 (concentração final 3 mM), DNA molde (0,1-1 ng) e os primers específicos de SNP para a frente e reversos biotinilados (200 nM cada). Condições dos ciclos de PCR foram: 941/4C 15 min; 45 ciclos de 94°C 30 s; 60°C 30 s; 72°C 30 s; 72°C 5 min. Um primer de cada par foi biotinilado. A cadeia de produto de PCR contendo o primer biotinilado foi ligada a esferas de estreptavidina e combinada com um primer de sequenciamento específico. O DNA de cadeia simples preparado foi sequenciado e o genótipo analisado utilizando o Sistema PSQ96 HS de pirossequenciamento (Qiagen pirossequenciao) seguindo as instruções do fabricante.

Camundongos transgênicos

[329] O constructo pWHERE-Dest repórter potenciador foi obtido do Dr. William Pu. Modificado de pWHERE (Invitrogen, pwhere) como previamente descrito (46), o constructo tem isoladores H19 murino que flanqueiam uma variante lacZ CpG livre acionada por um promotor mínimo Hsp68 mínimo com uma cassete de destino Gateway no MCS a montante. Os fragmentos potenciadores foram amplificados a partir do gDNA de camundongo, recombinadas no vetor pDONR221 (Invitrogen, 12536-017) pela BP clonase (Invitrogen, 11.789.020) e recombinados no vetor pWHERE-Dest com LR clonase (Invitrogen, 11791020). Os plasmídeos foram digeridos com PacI para remover a cadeia principal do vetor. Os fragmentos repórter lacZ estimuladoras foram purificados por eletroeluição em gel e, em seguida, concentrados utilizando Wizard DNA Clean-Up System (Promega, A7280). Os camundongos transgênicos foram produzidas por injeção pronuclear para ovos fertilizados FVB. Aproximadamente 10 ng/μ de solução de DNA foi usado para a série de injeções. As fêmeas CD-1 foram utilizadas como receptoras para embriões injetados. 10,5 a 14,5 embriões dpc foram dissecados de mães de aluguel com todo o monte e coloração de tecidos X-gal realizada como anteriormente descrito (47). As citospinas coradas com X-gal foram contra-coradas com Vermelho Rápido Nuclear (Vector Laboratories, H-3403). As causadas utilizadas para genotipagem com PCR. Procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitè de Uso e Cuidados Animais Institucional do Hospital Infantil.

Ensaio de potenciador de precursor eritróide humano

[330] Os fragmentos de DNA genômicos contendo elementos potenciadores putativos foram clonados em pLVX- Puro (Clontech, 632.164) a montante de um gene repórter de promotor mínimo de TK e GFP tal como descrito (39). As células 293T foram transfectadas com o reagente Fugene 6 (Promega, E2691), de acordo com o protocolo do fabricante. O meio foi mudado após 24 horas para meio SFEM fornecido com 2% de penicilina-estreptomicina, e após 36 horas, o sobrenadante foi recolhido e filtrado. As culturas eritróides derivadas de célula CD34+ foram transduzidas com lentivírus nos dias de expansão 4 e 5 por infecção de centrifugação como anteriormente descrito (39). As células foram ressuspensas em meios de diferenciação eritróide 24 horas após a segunda infecção. A selecção com puromicina 1 μg/ml teve início 48 horas após a infecção. As células transduzidas foram analisadas após cinco dias em meio de diferenciação por citometria de fluxo para intensidade de fluorescência de meio GFP.

Citometria de fluxo

[331] Células vivas foram fechadas por exclusão de 7-aminoactinomicina D (7-AAD, BD Pharmingen, 559925). A medula óssea (por eritroblastos) e do baço (linfócitos) para suspensões foram isoladas a partir de camundongos transgênicos adultos jovens. Após a lise hipotônica de glóbulos vermelhos maduros, as células vivas (7-AAD-) escolhidas com base na coloração com CD71-biotina (BD, 557.416), estreptavidina-APC (BD, 554067), Ter-119-PE (BD, 553673), CD19-APC (BD, 550992) ou CD3-PE (BD, 100308). As populações classificadas CD71+Ter119+, CD19+ and CD3+ utilizadas para citospina e isolamento de RNA.

Deleção cromossômica mediada por TALEN

[332] As nucleases efetoras (TALENS) foram concebidas para gerar clivagens no íntron 2 de BCL11A [2 em locais de 50,4 kb (denominado local 5') e 60,4 kb (local 3') em relação ao TSS. As TALENS reconhecem as sequências seguintes: CTTAAGGCAAGAATCACT (SEQ ID NO: 2) (5’ esquerda), CCATGCCTTTCCCCCCCT (SEQ ID NO: 3) (5’ direita), GAGTTAAAATCAGAAATCT (SEQ ID NO: 4) (3’ esquerda), CTGACTAATTGATCAT (SEQ ID NO: 5) (3’ direita). TALENS foram sintetizadas com clonagem Golden Gate (48) usando NN RVD oara reconhecer G. Os domínios de ligação de DNA sintetizado foram clonados em pcDNA3.1 (Invitrogen, V790-20) com o domínio de nuclease FokI, domínio N-terminal A152 e domínio C-terminal +63 anteriormente descrito (49). 2.5 &g de cada um dos quatro plasmídeos TALEN com 0,5 & g pmaxGFP (Lonza) foram entregues a 2 x 106 MEL ou células pré-B por eletroporação acordo com o protocolo do fabricante (Lonza, VCA-1005). As células positivas para GFP foram separadas por citometria de fluxo após 48 horas. As células cultivadas por diluição limitante em placas de 96 poços para isolar clones individuais. Os clones rastreados por PCR de gDNA para detectar a amplificação de um produto curto a montante do local 5 'e a jusante do local 3' ndicando deleção do segmento intermédio. Os clones excluídos monoalélicos foram submetidos a uma segunda rodada de eliminação TALEN mediada para se obter clones excluídos bialélicos. Os clones com supressão bialélico foram identificados por detecção de ausência de amplificação a partir de dentro do fragmento deletado. A frequência de deleção foi de aproximadamente uma em 50 alelos. A deleção foi validada comSouthern blotting. O DNA genômico foi digerido com BMTI; uma sonda de 561 pb (amplificada a partir a montante de gDNA do local 5 ') hibridiza com um fragmento de 3,6 kb a partir do alelo de tipo selvagem e um fragmento de 8,9 kb a partir do alelo A50.4-60.4 excluído.

RT-qPCR e immunoblotting

[333] O isolamento de RNA com colunas RNeasy (Qiagen, 74106), transcrição inversa com o kit de síntese iScript cDNA (Bio-Rad, 170-8890), qPCR com SYBR Green Supermix iQ (Bio-Rad, 170-8880) e imunotransferência realizada como descrito (39 ). Para os genes do agrupameno de 13-globina, um par de primers comum reconhece 13-globinas 132 e 131 adultas, enquanto primers independentes reconhecem as 13-globinas embrionárias εy e 13H1. Os anticorpos seguintes foram usados para imunoblotting: BCL11A (Abcam, ab19487), GAPDH (Santa Cruz, sc-25778).

Resultados

[334] Estudos de associação do genoma (GWAS) têm verificado numerosas variantes genéticas comuns associadas com características, frequentemente localizadas ao DNA regulamentar. A hipótese de que a variação de regulamentação pode contribuir para herdabilidade substancial sofreu avaliação experimental escassa. Aqui os inventores mostram que uma variação genética comum no BCL11A associada com o nível de hemoglobina fetal (HbF) indica sequências não codificadoras decoradas por uma assinatura de cromatina eritróide potenciadora. O Mapeamento fino dentro deste DNA regulatório putativo revela uma variante comum de desregulação de motivo associada com ligação ao fator de transcrição reduzida, expressão diminuída de BCL11A, e HbF elevada. As sequências que rodeiam funcionam in vivo como um potenciador restrito de linhagem específica para estágio de desenvolvimento. Por engenharia de genoma, foi mostrado que este potenciador é necessário para a expressão de BCL11A eritróide ainda dispensável fora da linhagem eritróide. Estes resultados ilustram como GWAS pode destacar variantes funcionais de impacto modesto dentro de elementos essenciais causais para a expressão do gene apropriado. O potenciador BCL11A-marcado com GWAS representa um alvo terapêutico favorável para os distúrbios de Dglobina.

[335] GWAS tem sido tremendamente bem sucedido na identificação de muitos milhares de polimorfismos de nucleotídeo únicos comuns (SNPs) associados com características humanas e doenças. No entanto avançar a partir da associação genética ao processo biológico causal tem sido muitas vezes difícil. Os desafios incluem o grande número de variantes que podem ser correlacionadas com características individuais associadas (devido ao desequilíbrio de ligação (LD)), o tamanho do efeito modesto de muitas associações variante-característica, e o local de muitas variantes associadas no genoma não codificante. Estudos de mapeamento de cromatina de escala do genoma recentes destacaram o enriquecimento de variantes GWAS em elementos de DNA reguladores, sugerindo que muitas variantes causais podem afetar a regulação do gene. No entanto, alguns exemplos confirmando a importância das variantes causais ou elementos têm sido experimentalmente demonstrados.

[336] Os GWAS do nível de HbF foram particularmente impressionantes. A variação genética em apenas três loci (HBB, HBS1L - MYB, e BCL11A) é responsável por até 50% da variação hereditária no nível de HbF. As mesmas variantes também estão associadas com a gravidade clínica da principal doença falciforme de β-globinopatias e β-talassemia, talvez não surpreendentemente, uma vez que HbF é um importante modificador desses transtornos. Trabalho de laboratório do inventor e outros têm validado que BCL11A é um regulador direto dos níveis de HbF. BCL11A é um repressor transcricional que reside dentro de complexos multiproteicos ocupando o agrupamento de genes de β-globina. Enquanto a deficiência constitutiva de BCL11A resulta em letalidade embrionária e desenvolvimento de linfócitos diminuído, a deficiência específica eritróide de BCL11A neutraliza o silenciamento de desenvolvimento de genes de globina embrionário e fetal, e é suficiente para resgatar as características hematológicas e patológicas da doença falciforme em modelos de camundongos. Portanto BCL11A emergiu como um novo alvo terapêutico para os distúrbios de β-globina. Compreender as consequências da BCL11A prejudicada é imperativo. Variantes de codificação humanas de BCL11A não foram descritas, apesar dos esforços de requensiamento de grande escala. As variantes BCL11A associadas com níveis de HbF residem nas regiões de BCL11A não codificante. Para entender melhor o quão comum a variação genética impacta em BCL11A, o nível de HbF, e a gravidade do distúrbio de β-globina, o papel de variantes associadas com HBF foi investigado em detalhes.

Variantes associadas à característica próximas a potenciadores eritróides

[337] Numerosos GWAS, bem como o acompanhamento de estudos de mapeamento fino foram realizados de características eritróides (incluindo fenótipos, como o número de eritrócitos e de volume, concentração de hemoglobina e nível de HbF), identificando 636 SNPs associados à característica na importância de todo o genoma (p<5e-8). Estes SNPs são enriquecidos em regiões promotoras e regiões de codificação quando comparados com os SNPs aleatório (Figura 1). Ainda que a maioria dos SNPs residem noutro local no genoma. Um perfil de cromatina global de precursores eritróides humanos primários foi realizado, que identificou um conjunto extenso de potenciadores eritróides distais definidos por modificações de histonas característicos e hipersensibilidade de DNase I. Um forte co-localização de GWAS SNPs eritroides com potenciadores foi observada em comparação com SNPs não-eritróides associados à característica, SNPs encontrados em uma matriz de genotipagem comum, ou SNPs aleatoriamente permutados. 13,5% dos SNPs associados à característica eritróides caiu diretamente para potenciadores eritróides, um enriquecimento de 11,4 vezes em relação aos potenciadores permutados aleatórios (P < 1 x 10-4), em comparação com 1,4% de SNPsnão- eritróides associados à característica, o que representa um enriquecimento de 1,4 vezes (P = 0,0013). Muitos dos SNPs associados à característica eritróides foram encontrados em estreita proximidade com potenciadores eritróides (Figura 1B). A distância média para potenciadorwa eritróides era 16,0 quilobases (kb) para eritróides SNPs associados à característica, em comparação com 238,0, 392,6, e 482,4 kb, respectivamente, para os SNPs não-eritróides associados à característica, a genotipagem da matriz, e permutados aleatoriamente. Estes resultados indicam que uma fração substancial de variantes comuns associada a características eritróides residem na ou perto de potenciadores eritróides, e são consistentes com a hipótese de que as variantes causais muitas vezes influenciam a regulação de genes dependente de contexto.HbF GWAS marca uma assinatura de potenciador eritróide

[338] Seis GWAS foram conduzidos de nível de HbF (ou o número de célula F de característica altamente correlacionada), incluindo populações de origem Europeia, Africana, e Asiática. Cada um identificou variantes associadas à característica dentro de BCL11A. Variação em BCL11A é estimada para explicar ~ 15% da variância da característica. Quatro SNPs diferentes foram identificados como mais altamente associados à agrupamentos de SNPs “sentinela”dentro 3 kb um do outro em íntron 2 de BCL11A (Figura 2A). Haplótipos incluindo SNPs sentinelas parecem explicar melhor a associação de HbF do que qualquer SNP individual. Cinquenta SNPs no locus BCL11A e vinte e sete SNPs dentro do íntron 2 foram associados com níveis de HbF com uma significância de amplo genoma (P <5 x 10-8).

[339] A distribuição dos SNPs associados com HbF em BCL11A foram comparados com sensibilidade de DNase I, um indicador de estado de cromatina sugestivo de potencial regulador. Em precursores eritróides humanos, três picos de hipersensibilidade de DNase I foram observadas no íntron-2, adjacente a, e sobrepondo-se a variantes de associadas com HbF (Figura 2A), denominados locais hipersensíveis à DNase I (DHSS) +62, +58, e +55 baseados em distância em kb a partir da TSS de BCL11A. Cérebro e os linfócitos B, dois tecidos que expressam elevados níveis de BCL11A, e linfócitos T, que não expressam BCL11A apreciável, mostram padrões únicos de sensibilidade de DNase I no locus BCL11A, com uma escassez de hipersensibilidade de DNase I que recobre SNPs associados com características (Figura 2A).

[340] A assinatura da cromatina em torno do locus BCL11A foi ainda analisada por imunoprecipitação de cromatina com sequenciamento paralelo em massa (ChIP-seq). ChIP-seq a partir de precursores eritróides humanos primários revelou modificações de histonas com um intensificador de assinatura que recobre os SNPs associados à característica no íntron-2 de BCL11A, incluindo a presença de H3K4me1 e H3K27ac e ausência de marcadores H3K4me3 e H3K27me3 (Fig.2a). Os fatores de transcrição eritróides principais GATA1 e TAL1 ocupam esta região potenciadora (Fig. 2A). Experimentos ChIP-qPCR demonstraram três picos discretos de GATA1 e TAL1 vinculativos dentro de BCL11A íntron-2, cada um pertencente com uma dos DHS eritróides (Fig. 2B).

[341] Uma característica comum de elementos reguladores distais é a interação de longo alcance com os promotores cuja expressão eles regulam. Foram avaliadas as interações entre o promotor BCL11A e fragmentos em 250 kb do locus BCL11A, incluindo sequências a montante, a jusante, e intragênicas. A maior interação de promotor foi observada dentro da região do íntron-2 contendo o eritróide DHS e SNPs associados à característica (Fig. 2C). Estes resultados indicam que estas sequências têm potencial regulador.

Variantes regulatórias

[342] Foi colocado em hipótese de que os SNPs associados à característica causal poderiam funcionar através da modulação de elementos cis-regulatórios críticos. Portanto, a extensa genotipagem de SNPs foi realizada dentro dos três eritroides DHSS +62, +58, +55 e em 1263 amostras de DNA do Estudo Cooperativo de Doença Falciforme (CSSCD), uma coorte doença de falciforme Africana-Americana para a qual o DNA genômico está disponível, e níveis de HbF são conhecidos. 66 sequência de DNA variantes localizadas nos três DHSS de dbSNP foram identificadas a partir de populações de referência CEU, YRI, e ASW dentro do Projeto Genomas 1000, e por 88 sequenciamentos de Sanger individuais de CSSCD com fenótipo de HbF extremo. 26 marcadores falharam o projeto de ensaio de genotipagem e 18 eram monomórficos (Tabelas 1 e 2). Após o controle de qualidade, 1.178 SNPs individuais e 20 polimórficos permaneceram para testes de associação. Análise de variantes comuns (menor freqüência do alelo (MAF)> 1%) revelou que rs1427407 em 62 DHS+ teve a associação mais forte com o nível de HbF (P = 7,23 x 10 -50; Tabela 1).

[343] Anteriormente, os inventores tinham usado o CSSCD para mapeamento fino do sinal de associação com HbF no locus BCL11A, e relataram uma forte associação com rs4671393; nesse estudo, rs1427407 foi imputado. Dois SNP adicionais, rs766432 e rs11886868 também foram identificados em estudos anteriores como SNPs sentinelas mais altamente associados com nível de HbF (ou o número de células F). Em um subgrupo de indivíduos (N = 728) para os quais genótipos em todos os quatro SNPs sentinela eram conhecidos, quando condicionado em genótipos em rs1427407, o resultado da associação não foi significativo em rs4671393, rs766432, ou rs11886868; por outro lado, a associação permaneceu altamente significativa para rs1427407 quando condicionado em rs4671393, rs766432, ou rs11886868 (Tabela 3). Portanto rs1427407 SNP é o mais associado com HbF dentro do DHS eritróide, e melhor contas para a associação de característica do que outros SNPs sentinelos previamente descritos.

[344] Quando condicionadas em rs1427407, outras associações com nível de HbF foram encontradas dentro de três DHSS que não foram completamente perdidos (Tabela 1). A associação mais significativa restante foi para rs7606173 em DHS +55 (P = 5,11 x 10 -10); rs7599488 DHS em 58, as quais foram previamente relatadas, era apenas um pouco menos significativa (P = 1.71 x 10-9) nesta análise condicional. Após o condicionamento em rs1427407 e rs7606173, nenhum SNP mais foi significativo (Tabela 1). O ajuste para componentes principais (PCs) em 855 indivíduos para os quais os dados de genotipagem de todo o genoma estavam disponíveis na conta para mistura e outros fatores de confusão produziram resultados semelhantes (dados não mostrados). O haplótipo rs1427407-rs7606173 T-G foi definido como aquele mais altamente associado com o nível de HbF.

[345] Variantes raras e de baixa frequência (MAF <5%) foram também analisadas quanto à sua associação com níveis de HbF usando cada um dos três DHSS +62, +58, e +55 como um conjunto de testes. Dois conjuntos foram encontrados para serem significativos, nomeadamente, DHS +62 e DHS +55, mas, após condicionamento em rs1427407 e rs7606173, os resultados não foram mais significativos, indicando LD fraca entre as variantes rara /de baixa frequência e os SNPs comuns (Tabela 4). Portanto, nenhuma evidência de que as variantes de sequência raras e de baixa frequência dentro do BCL11A DHSs influenciam os níveis de HbF em pacientes SCD foi encontrada, apesar dos 88 requensiamento de Sanger individuais de CSSCD com fenótipo extremo de HbF.

[346] Os rs1427407 SNP cai dentro de um pico de GATA1 e ligação TAL1, conforme determinado por ChIP-seq e ChIP-qPCR (Figs. 2A e 2B). O menor alelo T interrompe o nucleotídeo G de um elemento de sequência altamente semelhante a um meio motivo composto E-box/GATA [CTG(n9)GATA]. Este motivo foi encontrado para ser altamente enriquecido por complexos GATA1 e TAL1 em células eritróides por experiências ChIP-seq. Amostras primárias eritróides foram identificadas a partir de indivíduos heterozigotos para o alelo G-major e alelo T menor em rs1427407, e submetidas estas amostras a ChIP seguido por pirosequenciamento. Os inventores identificaram um equilíbrio de alelos no DNA de entrada. No entanto a ligação mais frequente ao alelo G foi observada em comparação com o alelo T de cerca de 60:40, em ambas as amostras imunoprecipitadas de cromatina GATA1 e TAL1 (Fig. 3A).

[347] Foi previamente relatado que o alelo A associado a HbF elevada de rs4671393 foi associado com expressão de BCL11A em linhagens celulares linfoblastóides humanas. Os inventores foram incapazes de reproduzir uma associação significativa entre o genótipo de BCL11A e o nível de expressão analisando um conjunto maior de linhagens de células linfoblastóides (dados não mostrados). Foi especulado que o haplótipo rs7606173-rs1427407 associado com HbF elevada influencia a expressão de BCL11A em um contexto eritróide específico. Os SNP rs7569946 sinônimos comuns encontram-se dentro do éxon 4 de BCL11A, e podem servir como um marcador de expressão alélica. Três amostras eritróides humanas primárias foram identificadas, que foram duplamente heterozigóticas para o haplótipo rs1427407-rs7606173 e rs7569946. As amostras foram submetidas a haplotipagem molecular por PCR de fusão de emulsão. A haplotipagem demonstrou que, para cada amostra, o alelo G principal de rs7569946 estava em fase com o haplótipo rs1427407-rs7606173 associado com HbF baixa. O DNA genômico e cDNA foram analisados por pirosequenciamento de rs7569946 para determinar o equilíbrio alélico. Considerando que os alelos foram equilibrados no DNA genômico, desequilíbrio significativo no cDNA favorecendo o aumento da expressão do alelo G associado com HbF baixa de rs7569946 foi observado (Fig. 3B). Estes resultados indicam que o alelo T de rs1427407 de HbF elevado, o que perturba o motivo meia-E- caixa/GATA, está associado com a ligação reduzida de GATA1 e TAL1 e expressão reduzida de BCL11A em precursores eritróides. O nível médio de HbF em 60 haplótipos homozigotos rsl427407-rs7606173 T-G de HbF elevado foi 11,21%, em comparação com 4,05% em 213 indivíduos homozigotos de haplótipos rs1427407-rs7606173 G-C de baixo HbF (P = 2,5 x 10-19) (Figg. 3C). Em suma, a seguinte evidência indica que rs 1427407 é um SNP causal para o nível de HbF: tem a maior associação com o fenótipo de qualquer variante conhecida, representa as associações observadas com SNPs sentinelaa anteriormente descritoa, afeta um motivo necessário para ligação de GATA1 e TAL1, e está associado com ligação de GATA1 e TAL1, bem como com a expressão de BCL11A. No entanto, a variação nesta posição na configuração de haplótipos comuns está associada com apenas perturbação modesta da expressão de BCL11A.

Suficiência potenciadora para a expressão eritróide

[348] Para entender o contexto em que esses SNPs associados à características aparentes reguladores desempenham o seu papel, a função dos elementos cis- regulatórios de ancoragem foi explorada. Os inventores clonaram ~ 12 kb (+ 52,0-64,4 kb de TSS) que continha os três DHSS eritróides, e ensaiaram o potencial intensificador em um ensaio repórter transgênico. Neste ensaio, sequências potenciadoras putativas são posicionadas a montante de um promotor mínimo (Hsp68) e do gene repórter (lacZ) ligados pelas sequências de isoladores. Os constructos foram introduzidos para zigotos murinos com a expressão do gene repórter monitorizada ao longo do desenvolvimento. BCL11A de camundongo endógeno mostrou expressão abundante ao longo do sistema nervoso central em desenvolvimento com expressão muito inferior observada no fígado fetal. Em contraste, a expressão do gene repórter em embriões transgênicos foi observada a ser largamente confinada ao fígado fetal, o local da eritropoiese definitiva, com menor expressão observada no sistema nervoso central (Fig. 4A).

[349] Uma característica de genes de globina é a regulação do desenvolvimento. Durante o desenvolvimento humano, ε-globina derivada do saco vitelino é substituída no primeiro trimestre por Y-globina fetal derivada de fígado. Próximo ao nascimento, Y-globina está gradualmente silenciada, e β-globina torna-se ativada. Há apenas uma única troca na expressão gênica durante a ontogenia do camundongo. Durante esta transição, que ocorre em meados da gestação, os eritrócitos primitivos derivados do saco vitelino circulantes expressam globinas de estágio embrionário εy e βH1, considerando que os eritroblastos definitos do fígado fetal expressam globinas de estágio adulto β1 e β2. Concordante com essa opção de desenvolvimento, a expressão de BCL11A é expressa na linhagem eritróide definitiva, mas não na primitiva. Linhagens transgênicas estáveis foram derivados dos camundongos repórteres BCL11A +52,0-64,4. Nesses camundongos, nos eritrócitos circulantes E12,5 não marcaram para X-gal, enquanto que os eritroblastos do fígado robustamente marcaram positivos (Fig. 4B). Em E10,5 expressão de lacZ é observada apenas no primórdio do fígado fetal, e não no sangue que circula dentro do embrião, placenta, ou saco vitelino (Fig. 6A). Estes resultados indicam que as sequências reguladoras de íntron-2 de BCL11A marcadas com GWAS são suficientes para a expressão de genes especifica desenvolvida de forma apropriada.

[350] Dentro do compartimento hematopoiético, a expressão de BCL11 é verificada em precursores eritróides e linfócitos B. Precursores eritróides e linfócitos B foram isolados a partir de animais transgênicos adultos jovens, e a expressão do gene repórter lacZ foi avaliada. BCL11A endógeno foi expresso em 10,4 vezes os níveis mais elevados em linfócitos B do baço em comparação com precursores eritróides da medula óssea. No entanto, a expressão de lacZ foi restrita aos precursores eritróides e não foi observada nos linfócitos B (Fig.4C). Estes resultados indicam a especificidade eritróide destas sequências reguladoras.

[351] Uma série de mutantes de deleção foi gerada para refinar os elementos mínimos necessários para a atividade eritróide potenciadora. Sequências contendo +58 DHS centrais foram suficientes para a atividade eritróide potenciadora. Estas sequências flanqueadoras contendo apenas os elementos +62 ou +55 não foram capazes de direcionar a expressão do gene eritróide (Fig. 6B). Estes DHSs também foram testados quanto à sua capacidade para aumentar a expressão do gene em precursores eritróides humanas primários. Os inventores utilizaram o fornecimento lentiviral de um sistema repórter GFP com um promotor mínimo de TK, como descrito anteriormente. Do mesmo modo, apenas +58, mas não +55 ou 62 +DHSs foram capazes de aumentar a expressão do gene repórter neste ensaio (Fig. 7).

Requisito potenciador para a expressão eritróide

[352] Em seguida, os inventores escolheram determinar a exigência destas sequências reguladoras para a expressão adequada de BCL11A e genes de globina. A inspeção do lócus de Bcl11a em perfis de cromatina global publicada anteriormente de células eritróides de camundongo revelou que esta região do íntron -2 possui uma assinatura de intensificador ortóloga com presença de H3K4me1 e H3K27ac, ausência de H3K4me3 e H3K27me3, e ocupação por GATA1 e TAL1 (Fig. 8). Além disso, a hipersensibilidade de DNase I específica para eritróide foi observada a estas sequências. Em cada um dos eritróide humanos DHSs +62, +58, e +55, foi observada evidência de conservação da sequência evolutiva, em especial dentro de +62 e +55. Para determinar a exigência destas sequências reguladoras ortólogas para a expressão de BCL11A, foi utilizada a linhagem de células de eritroleucemia de camundongo (MEL). Estas células dependem da expressão de BCL11A para a expressão do gene de globina padrão de estágio adulto adequado. Nucleases específicas de sequência podem resultar na produção de pequenas deleções cromossômicas. TALENs foram projetados para introduzir quebras de cadeia dupla para flanquear as sequências de íntron-2 de Bcl11a ortóloga de 10 kb que levam a assinatura de cromatina potenciadora eritróide. Os clones foram selecionados para reparo de NHEJ mediado, e três clones únicos foram isolados que tinham sido submetidos à excisão bialélica. PCR e Southern blotting verificaram a excisão do segmento intrônico dentro de clones (Fig. 9). Pontos de interrupção de Sanger sequenciados eram característicos da clivagem TALEN mediada com reparação subsequente NHEJ (Fig. 10).

[353] A expressão de BCL11A foi analisada nas células MEL com eliminação bialélica intrônica de 10 kb. A redução drástica de expressão de BCL11A a ~3% dos níveis basais foi observada (Fig. 5A). Reduções semelhantes foram observadas com pares de primers detectando junções de éxon a montante, abrangendo, ou jusante da exclusão. Por Western blotting, a expressão de BCL11A não foi detectável nos clones potenciadoras excluídos de 10-kb (Fig. 5B). Células MEL expressam tipicamente altos níveis de genes da globina adultos β1 e β2, e baixos níveis de genes da globina embrionários εy e βH1. Na ausência do potenciador de 10-kb para BCL11A, a expressão de genes de globina adultos foi diminuída por ~2-5 vezes, enquanto que os genes de globina embrionários foram consideravelmente desreprimidoa. A proporção de εy embrionária para adulto β 1/2 foi aumentada em média de 364 vezes em clones faltando o potenciador ortólogo BCL11A eritróide (Fig. 5C).

[354] Para determinar se as sequências intrônicas +50,4-60,4 kb foram universalmente necessárias para a expressão de BCL11A, sua perda foi avaliada em um contexto não-eritróide. A mesma estratégia de introdução de dois pares de TALENs para se obter clones com a deleção Δ50,4- 60,4 mediada por NHEJ foi empregada em uma linhagem de células de linfócito pró-B. Dois clones Δ50,4-60,4 únicos foram isolados e verificados por PCR, Southern blotting, e sequenciamento de Sanger (Figs. 9 e 10). Em contraste com as células eritróides, expressão de BCL11A foi retida nos clones de células pró-B deletados potenciadores de Δ50,4-60,4kb, em ambos os níveis de RNA e os de proteína (Figuras 5A e 5B). Estes resultados indicam que as sequências potenciadoras eritróides ortólogas não são necessárias para a integridade da transcrição a partir do lócus de Bel11a, mas apenas essencial para a expressão do gene eritróide.

[355] Uma assinatura de cromatina potenciadora foi verificada no íntron-2 de BCL11A, sobrepondo-se diretamente os SNPs associados com HbF. Esta região tinha numerosas características bioquímicas de um potenciador, incluindo ocupação pelos marcadores de histona H3K4mel e H3K27ac na ausência de H3K4me3 e H3K27me3, ligando eritróides TFs GATA1 e TAL1, locais hipersensíveis à DNase-1 específicos de eritróide, e interação de promotor de longo alcance por 3C. Além disso, os inventores foram capazes de mapear finamente esse local, usando o DHSs como um guia, para identificar SNP rs1424707 como sendo o mais altamente associado à característica, que é inteiramente responsável pela associação característica de SNPs sentinelas descritos anteriormente e altamente ligados. Além disso, mostra-se aqui que rs1427407 interrompe o motivo meia-E-caixa/GATA ocupado por fatores de transcrição GATA1 e TALI em precursores eritróides. No entanto, mesmo após o condicionamento sobre rs1427407, uma associação permanece com vários outros SNPs em DHSS adjacentes, indicando um efeito de haplótipos. Verificou-se que os haplótipos que possuem uma combinação de genotipos SNP em elementos adjacentes que cada um modula a função reguladora cooperativa para dar o fenótipo de expressão final BCL11A. Usando doadores heterozigóticos, um modesto impacto do haplótipo associado de HbF elevado foi demonstrado tanto em ligação de TF e expressão de BCL11A.

[356] Estes estudos ajudam a estimar a mudança na expressão de BCL11A, necessária para resultar em um aumento clinicamente significativo no nível de HbF em pacientes com distúrbios de β-globina. A diferença na expressão de BCL11A entre os haplótipos rs1427407-rs7606173 T-G de HbF elevada e G-C de baixo HbF foi de 1,7 vezes, e os níveis de HbF de T-G e homozigotos GC foram de 11,2% e 4,1% (Figs 3B e 3C). Os níveis de HbF de >20% foram previstos para evitar as consequências adversas da SCD. Uma redução na expressão de BCL11A em várias vezes provavelmente abordaria este objetivo de HbF.

[357] Este estudo identifica variação reguladora em BCL11A, que impacta um potenciador eritróide. Muitos SNPs associados à característica são não codificantes e têm tamanho de efeito relativamente pequeno. Devido a estas características, estes SNPs são por vezes considerados de importância clínica insignificante. Este estudo mostra que um tamanho do efeito pequeno gerado por uma variante não- codificante individual não evita um tamanho do efeito grande do elemento regulador subjacente. Por exemplo, apesar de um impacto relativamente modesto de SNPs funcionais na expressão do gene alvo subjacente BCL11A, os elementos reguladores causais são essenciais para a expressão de genes de globina e BCL11A em precursores eritróides de fase adulta. O mesmo elemento regulador é dispensável para a expressão de BCL11A wm uma linhagem não-eritróide. Um objetivo de estudar alelos de proteção é entender seus mecanismos moleculares subjacentes em uma tentativa de reproduzir este efeito biológico em indivíduos em risco. Assim, muitos polimorfismos associados à característica irão residir elementos reguladores críticos de contexto específico cuja função pode iluminar ainda mais a biologia subjacente da característica, além de simplesmente identificar o gene regulamentado. Por exemplo, a perda de BCL11A enquanto resultando em comutação de hemoglobina prejudicada também resulta na neurogênese e linfopoiese comprometidas, e resulta em letalidade embrionária. Em última análise, uma melhor compreensão dos elementos reguladores causais e características subjacentes de redes reguladoras associadas, podem identificar novos alvos terapêuticos. O próprio potenciador eritróide de BCL11A poderia constituir um alvo favorável para edição do genoma terapêutico, em que a ablação poderia impedir a expressão de BCL11A em precursores eritróides com desrepressão de HbF resultante, enquanto preservando a expressão de BCL11A em linhagens não-eritróides. Referências 1. L. Fugger, G. McVean, J. I. Bell, N. Engl. J. Med. 367, 2370-2371 (2012). 2. J. Ernst et al., Nature. 473, 43-49 (2011). 3. D. S. Paul et al., PLoS Genet. 7, e1002139 (2011). 4. M. T. Maurano et al., Science. 337, 1190-1195 (2012). 5. P. van der Harst et al., Nature. 492, 369-375 (2012). 6. ENCODE Project Consortium et al., Nature. 489, 5774 (2012). 7. S. Menzel et al., Nat. Genet. 39, 1197-1199 (2007). 8. M. Uda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1620-1625 (2008). 9. G. Lettre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 11869-11874 (2008). 10. M. Nuinoon et al., Hum. Genet. 127, 303-314 (2010). 11. N. Solovieff et al., Blood. 115, 1815-1822 (2010). 12. P. 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Kim, Genome Res. 20, 8189 (2010). 29. D. E. Bauer, S. C. Kamran, S. H. Orkin, Blood. 120, 2945-2953 (2012). 30. A. John et al., Development. 139, 1831-1841 (2012). 31. R. P. Patwardhan et al., Nat. Biotechnol. 30, 265270 (2012). 32. A. Melnikov et al., Nat. Biotechnol. 30, 271-277 (2012). 33. K. A. Frazer, S. S. Murray, N. J. Schork, E. J. Topol, Nat. Rev. Genet. 10, 241-251 (2009). 34. A. N. Koehler, Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 331-340 (2010). 35. F. D. Urnov, E. J. Rebar, M. C. Holmes, H. S. Zhang, P. D. Gregory, Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010). 36. J. K. Joung, J. D. Sander, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013). 37. J. van der Oost, Science. 339, 768-770 (2013). 38. Agradecimentos a A. Woo, A. Cantor, M. Kowalczyk, S. Burns, J. Wright, J. Snow, J. Trowbridge e membros do Laboratório Orkin, particularmente C. Peng, P. Das, G. Guo, M. Kerenyi, e E. Baena, por discussões. C. Guo e F. Alt forneceu a linhagem de células pré-B, A. He e W. Pu o constructo repórter lacZ, C. Currie e M. Nguyen assistência técnica, D. Bates e T. Kutyavin experiência com análise da sequência, R. 39. J. Xu et al., Dev. Cell. 23, 796-811 (2012). 40. E. van den Akker, T. J. Satchwell, S. Pellegrin, G. Daniels, A. M. Toye, Haematologica. 95, 1594-1598 (2010). 41. A. L. Bredemeyer et al., Nature. 442, 466-470 (2006). 42. R. E. Thurman et al., Nature. 489, 75-82 (2012). 43. G. Galarneau et al., Nat. Genet. 42, 1049-1051 (2010). 44. S. Purcell et al., Am. J. Hum. Genet. 81, 559-575 (2007). 45. M. C. Wu et al., Am. J. Hum. Genet. 89, 82-93 (2011). 46. A. He, S. W. Kong, Q. Ma, W. T. Pu, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5632-5637 (2011). 47. M. A. McDevitt, Y. Fujiwara, R. A. Shivdasani, S. H. Orkin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 7976-7981 (1997). 48. T. Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39, e82 (2011). 49. J. C. Miller et al., Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011). 50. R. Galanello et al., Blood. 114, 3935-3937 (2009). 51. H. T. Bae et al., Blood. 120, 1961-1962 (2012). 52. K. E. McGrath et al., Blood. 117, 4600-4608 (2011). 53. D. Noordermeer, W. de Laat, IUBMB Life. 60, 824833 (2008). 54. D. R. Higgs, D. Vernimmen, B. Wood, Adv. Genet. 61, 143-173 (2008). 55. E. Pinaud et al., Adv. Immunol. 110, 27-70 (2011). Table 1 Associação de análise SNPs comuns emBCL11A DHSs +62, +58, or +55

Análise de associação de comum (MAF > 1%) SNPs em BCL11A DHSs +62, +58, +55 ou de 1.178 indivíduos de CSSCD disponíveis para análise, DHS, local de hipersensibilidade de DNase I, MAF, frequência do alelo menor. Tabela 2 SNPs com BCL11A DHSs +62, +58, ou +55

SNPs caem dentro de BCL11A DHSS +62, +58, +55 e presentes ou em qualquer dbSNP ou os dados de 1000 Genomas para populações de referência YRI, CEU e ASW, SNPs genotipados são identificados e MAF dentro do CSSCD listado, coordenadas genômicas hg19 Tabela 3 | Marcadores adicionais verificados por resequenciamento de Sanger

88 indivíduos de CSSCD com extremo fenótipo de HbF foram submetidos a resequenciamento de Sanger dos três DHSs dentro de BCL11A, novos marcadores listados identificado, SNPs genotipados são identificados e MAF dentro de CSSCD listados, Coordenadas genômicas hg19. Tabela 4, Análises condicionais de quatro SNPs sentinelas

Análises condicionais para quatro SNPs sentinelas comuns previamente associados com os níveis de HbF {{44; 20; 19; 36; 37; 515}}. Todos os quatro foram genotipados em 728 indivíduos de CSSCD. Não foi possível calcular P para rs766432 quando condicionado em rs4671393 (e viceversa), porque estes dois marcadores são tão fortemente correlacionados (r2 = 0,997), r2 = 0,848 entre rs1427407 e rs766432; r2 = 0,709 entre rs1427407 e rs11886868; r2 = 0,850 entre rs1427407 e rs4671393; r2 = 0,761 entre rs766432 e rs11886868; r2 = 0,758 entre rs11886868 e rs4671393 Tabela 5 Análise variante rara e de baixa frequência

Os resultados análise de variantes raras e de baixa frequência (MAF <5%), A análise foi realizada utilizando o algoritmo SKAT-O-baseado em conjunto usando DHSs de indivíduos +62, +58, +55 e até três conjuntos diferentes, A fila inferior “toda” mostra os resultados dos ensaios quando as três regiões foram condensadas em conjunto, Tabela 6 | Sequenciamento de PCR de haplotipagem de fusão emulsão

Análise de PCR de fusão emulsão de haplótipo rs7569946–rs1427407. PCR de fusão conduzida em emulsão a partir de três doadores individuais duplamente heterozigotos para rs7569946 and rs1427407, gerando um amplicón de fusão abrangendo ambos SNPs. O amplicón de fusão foi clonado, e os clones individuais foram sequenciados por Sanger. O número de clones de cada genótipo é listado. A razão de probabilidade para a fase G–G/A–T como comparada com G–T/A–G foi calculada. Tabela 7. Coordenadas de fragmentos para ensaios reporter

Coordenadas dos fragmentos clonados potenciadoras putativos nos ensaios repórter potenciadores, coordenadas do Cromossomo 2 listadas em hg19, bem como em referência à BCL11A TSS. Tabela 8. Sequências de Oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos utilizados nos experimentos indicados.

Claims

1. Método para a produção de uma célula progenitora hematopoiética tendo mRNA de BCL11A diminuído ou expressão de proteína diminuída caracterizado pelo fato de que compreende introduzir um RNA que codifica uma endonuclease direcionada a DNA, uma endonuclease direcionada a DNA, ou um vetor codificando uma endonuclease direcionada a DNA em uma célula progenitora hematopoiética isolada, ex vivo ou in vitro, em que a endonuclease direcionada a DNA se liga a e cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome, e causa uma deleção de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 +62, +58 e +55, reduzindo, assim, o mRNA ou a expressão de proteína de BCL11A na célula progenitora hematopoiética ou sua progênie eritróide, em que a endonuclease direcionada a DNA compreende um domínio de ligação de DNA de TAL que reconhece uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 2-5.

2. Método in vitro ou ex vivo para a produção de uma célula progenitora hematopoiética humana geneticamente modificada isolada tendo pelo menos uma modificação genética caracterizado pelo fato de que compreende introduzir uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease direcionada a DNA, um RNA que codifica uma endonuclease direcionada a DNA, ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease direcionada a DNA em uma célula progenitora hematopoiética humana isolada, em que a endonuclease direcionada a DNA se liga a e cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, causando pelo menos uma modificação genética no mesmo, em que a pelo menos uma modificação genética é a deleção de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 +62, +58, e +55, em que a endonuclease direcionada a DNA compreende um domínio de ligação de DNA de TAL que reconhece uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 2-5.

3. Método de aumentar os níveis de hemoglobina fetal em uma célula progenitora hematopoiética ou sua progênie eritróide caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: introduzir uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos uma endonuclease direcionada a DNA, um RNA que codifica uma endonuclease direcionada a DNA ou um vetor que transporta a sequência de codificação de uma endonuclease direcionada a DNA em uma célula progenitora hematopoiética isolada, in vitro ou ex vivo, em que a endonuclease direcionada a DNA se liga a e cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 e causa uma deleção de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 +62, +58, e +55 no mesmo, pelo que a expressão de hemoglobina fetal é aumentada na referida célula progenitora hematopoiética, ou a sua progênie eritróide, em relação à referida célula progenitora hematopoiética antes da referida introdução, em que a endonuclease direcionada a DNA compreende um domínio de ligação de DNA de TAL que reconhece uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 2-5.

4. Método, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula progenitora hematopoiética é uma célula da linhagem eritróide.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a deleção remove toda a região entre a localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2 ou remove uma porção da região que resulta na ruptura de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1.

6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma célula progenitora hematopoiética humana geneticamente modificada isolada que tem uma deleção de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 +62, +58, e +55 na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a composição compreende ainda excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis selecionados a partir de soluções salinas, dextrose, glicerol e etanol; substâncias auxiliares selecionadas de agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes tamponantes de pH; nutrientes; e combinações dos mesmos.

7. Uso de uma célula progenitora hematopoiética humana isolada caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma β- hemoglobinopatia em um humano através do aumento dos níveis de hemoglobina fetal, em que a célula progenitora hematopoiética humana isolada foi contatada com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um mRNA que codifica uma endonuclease direcionada a DNA, uma endonuclease direcionada a DNA ou um vetor que codifica uma endonuclease direcionada a DNA, em que a endonuclease direcionada a DNA se liga a e cliva o DNA genômico da célula na localização 60,716,189-60,728,612 do cromossomo 2, de acordo com a montagem do genoma humano hg 19 do Navegador UCSC Genome, e causa uma deleção de um ou mais locais hipersensitivos de DNAse 1 +62, +58, ou +55 no mesmo, em que a endonuclease direcionada a DNA compreende um domínio de ligação de DNA de TAL que reconhece uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 2-5, e em que a β-hemoglobinopatia é a anemia falciforme ou β-talassemia.

8. Uso de uma célula progenitora hematopoiética humana geneticamente modificada isolada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou de uma composição conforme definida na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma β-hemoglobinopatia em um humano através do aumento dos níveis de hemoglobina fetal, em que a β-hemoglobinopatia é a anemia falciforme ou β-talassemia.