JP6511720B2 - コドン最適化変異エビルシフェラーゼ遺伝子およびその使用方法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[2] 以下の(a)〜(d)からなる群から選択される、上記[1]に記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜20個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[3] 以下の(a)〜(c)からなる群から選択される、上記[1]に記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して98%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[4] 配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[5] さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび/または精製のためのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、上記[1]〜[4]のいずれか1に記載のポリヌクレオチド。
[6] 配列番号:5、配列番号:8、配列番号:10および配列番号:14のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
[7] 上記[1]〜[6]のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
[8] 上記[7]に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[9] 上記[8]に記載の形質転換体を培養し、上記[1]〜[6]のいずれか1に記載のポリヌクレオチドがコードする蛋白質を生成させる工程を含む、蛋白質の製造方法。
[10] 上記[1]〜[6]のいずれか1に記載のポリヌクレオチド、上記[7]に記載の組換えベクターまたは上記[8]に記載の形質転換体を含むキット。
[11] さらに、bis-セレンテラジンを含む、上記[10]に記載のキット。
[12] (i) 上記[1]〜[6]のいずれか1に記載のポリヌクレオチドにコードされる蛋白質;および
(ii) bis-セレンテラジンを含む、キット。
[13] (i) 下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;および
(ii) bis -セレンテラジンを含む、キット。
[14] 上記[1]〜[6]のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドにコードされる蛋白質と、bis -セレンテラジンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
[15] (i) 下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質;と、
(ii) bis-セレンテラジンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
[16] 上記[1]〜[6]のいずれか1に記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
[17] 発光基質として、bis-セレンテラジンを用いる、上記[16]に記載の方法。
1.本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
「配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性」とは、例えば、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性(本明細書中で、単に「発光活性」という場合がある。)、すなわち、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)が酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成する反応を触媒するようになる活性を意味する。なお、励起状態で生成したオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸;
C群:アスパラギン、グルタミン;
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸;
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン;
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;
G群:フェニルアラニン、チロシン。
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜4個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質。
翻訳促進のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。翻訳促進のためのペプチド配列としては、例えば、TEE配列が挙げられる。
精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が4残基以上、好ましくは6残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン S−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列、プロテインAのアミノ酸配列、およびアビジンタグ配列が挙げられる。
本発明は、前述した本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
「1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列」とは、同一配列中の任意かつ1〜複数個の塩基配列中の位置において、1〜複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加があることを意味する。
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜20個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して98%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、および酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)があげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、および昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)があげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)、PICZ aベクター(インビトロジェン社製)なども好適に使用することができる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド(すなわち、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド)を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、Sf9、Sf21などがあげられる。
発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターとは、具体的には、次のプロモーター配列、およびコード配列を含有する発現ベクターを意味する:
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列;および
(2)本発明のポリヌクレオチドを含有するコード配列。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の蛋白質の製造方法を提供する。本発明の蛋白質は、例えば、前記形質転換体を本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド(DNA)が発現可能な条件下で培養し、本発明の蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の蛋白質が蓄積される。
上記培養物から、本発明の蛋白質を分離・精製することによって、本発明の蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
発光による検出マーカーとしての利用
本発明の蛋白質は、ルシフェリン存在下、発光による検出マーカー(以下、「本発明の検出マーカー」)として利用することができる。本発明の検出マーカーは、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。
本発明の蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサー)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン(発光基質)存在下、本発明の蛋白質に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として利用することができる。
本発明の蛋白質は、ルシフェリンが酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成される反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。よって、本発明の蛋白質などは、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
本発明の蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
例えば、本発明の蛋白質 (「本発明のルシフェラーゼ」という場合がある。)をドナーとして使用し、蛍光物質(例えば、有機化合物、および蛍光蛋白質)をアクセプターとして使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を起こすことによりドナーとアクセプターとの間の相互作用を検出することができる。
用いる発光基質(ルシフェリン)は、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、bis-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、本発明の形質転換体および本発明の複合体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。また、本発明は、本発明の蛋白質を含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにルシフェリンを含んでいてもよい。
発光触媒活性
本発明の蛋白質は、ルシフェリン(例えば、セレンテラジン類)を酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、本発明の融合蛋白質等は、ルシフェリンを基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。この活性を、本明細書において、「発光触媒活性」と称することがある。
本発明の蛋白質を用いた、ルシフェリンを基質とする発光反応は、本発明の蛋白質とルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。ここで、「接触」とは、本発明の蛋白質とルシフェリンとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、ルシフェリンを収容した容器に本発明の蛋白質を添加すること、本発明の蛋白質を収容した容器にルシフェリンを添加すること、本発明の蛋白質とルシフェリンとを混合することが含まれる。反応条件としては、オプロフォーラスルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
本発明の蛋白質の、ルシフェリンを基質とする発光活性は、ハロゲン化物イオン、非イオン性界面活性剤などにより活性化される。
ハロゲン化物イオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどがあげられ、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンが好ましい。
天然型オプロフォーラスルシフェラーゼの触媒19kDaドメイン(KAZと略することもある)より変異導入して創出されたプロメガ社の変異オプロフォーラスルシフェラーゼの触媒19kDaドメイン(nanoLucと略することもある)のアミノ酸配列(配列番号:1)をもとに、コドン最適化オプロフォーラスルシフェラーゼの触媒変異19kDaドメイン(nanoKAZと略することもある)の遺伝子設計を行った。具体的には、nanoLucのアミノ酸配列(配列番号:1)を変えることなく、ヒトにおける高頻度使用のアミノ酸コドンのみを使用し、nanoKAZの塩基配列の設計を行った(配列番号:2)。nanoKAZドメインのコドン使用頻度表を表1に示した。明らかにコドン最適化nanoKAZドメイン核酸は、ヒト高頻度使用のアミノ酸コドンのみで設計されている。最適化設計したコドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子を、常法により化学合成法により合成した。
(1)分泌シグナル配列を使用しないでコドン最適化nanoKAZドメイン蛋白質を分泌発現する発現ベクター
コザック配列を含むコドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子配列フラグメントを制限酵素Asp817とXbaI で消化後、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)のAsp817-XbaI部位に挿入し、pcDNA3-nanoKAZ ベクターを構築した(図1)。
発現ベクターpcDNA3-nanoKAZ ベクターがコードするnanoKAZの塩基配列を配列番号:2に示し、そのアミノ酸配列を配列番号:1に示す。
コドン最適化nanoKAZドメイン蛋白質発現ベクターの構築は以下の通りである。先ず、動物培養細胞での新規発現ベクターpcDNA3-GLspを構築した。具体的には、pcDNA3-GLucベクター(プロルミ社製)よりガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列をプライマーGLsp-1R/EcoRI (配列番号:3:5' ggc GAA TTCGGT GGG CTT GGC CTC GGC CAC 3'、アンダーラインEcoRI 配列)とT7プライマー(配列番号:4:5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3')を用いPCR法により取得し、それをHindIII/EcoRIで消化後、得られた断片を、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)の制限酵素部位であるHindIII/EcoRI部位に挿入することにより、新規発現ベクターpcDNA3-GLspを構築した(図2)。すなわち、新規発現ベクターは、CMVのプロモーターに制御され、その下流にコザック配列、ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列、マルチクローニングサイト配列を有する。
次に、新規発現ベクターpcDNA3-GLspを用いたコドン最適化nanoKAZドメインタンパク質発現ベクターpcDNA3-GLsp-nanoKAZ(図3)の構築は以下の通りである。コドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子配列フラグメントを常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pcDNA3-GLspのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、図3に示す発現ベクターpcDNA3-GLsp-nanoKAZを構築した。なお、DNA シークエンサー(ABI社製)により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
(1)発現プラスミドの精製
実施例2にて得られたpcDNA3-nanoKAZ およびpcDNA3-GLsp-nanoKAZプラスミドを用いて以下の実験を行った。pcDNA3-nanoKAZ とpcDNA3-GLsp-nanoKAZ プラスミドは大腸菌JM83より、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製し、1μg/μLの濃度になるよう滅菌水に溶解した。同様にして、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター(pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製)を使用した。
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO-KI株を、10%(v/v)牛胎児血清(バイオウエスト社製)を含むHam’s F-12培地(和光純薬社製)にて培養し、ヒト子宮頸癌由来の細胞HeLa 細胞株およびアフリカミドリザルの腎臓の細胞COS-1細胞株を、10%(v/v)牛胎児血清(バイオウエスト社製)を含むDMEM(和光純薬社製)で培養した。それぞれの細胞を1 x 105 細胞/ウエル/2 mL培地にて6 ウエルプレートに播種し(n = 2)、インキュベーター中37 ℃、5 %(v/v) CO2にて培養した。24時間後、精製pcDNA3-nanoKAZ またはpcDNA3-GLsp-nanoKAZプラスミドをFuGene HD(プロメガ社製)トランスフェクションキットを用いて、CHO細胞にトランスフェクションし、次の実験に用いた。具体的には、100μL の培地に、pcDNA3-nanoKAZ発現ベクター1μgまたはpcDNA3-GLsp-nanoKAZ発現ベクター1μgとpGL4.13 [Luc2/sv40]内部標準ベクター0.1μgと、FuGene HD 3μLを加え、室温で15分間放置した。100μLのDNA-FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加した。48時間培養後、培養液を回収して、測定用分泌nanoKAZ酵素溶液とした。一方、細胞内で発現したnanoKAZについては、細胞を3mL1x PBSで3回洗浄後、1 mLの1x PBSに懸濁し、氷上で超音波破砕処理して得られたものを、細胞抽出nanoKAZ酵素液とした。
実施例3で得られた測定用酵素溶液5μLを、0.5μg のセレンテラジン(JNC社製)を含む100μLの50mM Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTA(和光純薬)に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)と60秒間の積算値を相対発光強度(rlu)で表記した。一方、トランスフェクションの効率を確認するための内部標準で使用したホタルルシフェラーゼについては、実施例3で得られた測定用酵素溶液5μLを、100μL の酵素アッセイ用試薬(プロメガ社)に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、10秒間での発光積算し、相対発光強度(rlu)で表記した。その結果ホタルルシフェラーゼの発光活性は、CHO-K1 細胞では、pcDNA3-nanoKAZ: 7,827 rlu、 pcDNA3-GLsp-nanoKAZ:6,865 rlu、 HeLa細胞ではpcDNA3-nanoKAZ:1,970 rlu、 pcDNA3-GLsp-nanoKAZ:1,787 rlu、 COS-1細胞では pcDNA3-nanoKAZ:28,232 rlu、 pcDNA3-GLsp-nanoKAZ:31,380 rlu,であった。細胞種間のトランスフェクションの効率の違いはあるが、pcDNA3-nanoKAZとpcDNA3-GLsp-nanoKAZのトランスフェクション効率は、細胞種内ではほぼ同一である。CHO-K1細胞、HeLa細胞、およびCOS-1細胞での、培養液及び細胞内の発光活性測定の結果を表4に示す。明らかに、分泌シグナルペプチド配列のないpcDNA3-nanoKAZを、pcDNA3-GLsp-nanoKAZと同等あるいはそれ以上に効率良く分泌することが示された。すなわち、本出願記載のコドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子を含む発現ベクターpcDNA3-nanoKAZは、分泌シグナルペプチド配列なしでnanoKAZを分泌させることが出来ることが明らかとなった。
基質特異性実験に使用したセレンテラジン類縁体は、それぞれ論文記載の方法で合成した。具体的には、bis-セレンテラジン はNakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett.. 38:6405-6406, フリマジン(Furimazine)は、Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848-1857, C2-セレンテラジン類縁体は、Inouye et al (2010) Anal. Biochem. 407: 247-252に記載の方法で合成した。実施例4記載の方法でnanoKAZを分泌させた培養液をセレンテラジンまたはその類縁体の酵素液として用いて、発光活性を測定した。その結果、nanoKAZによる基質特異性は表5に示す通りであった。セレンテラジン類縁体の中で、相対最大発光強度でセレンテラジンより10倍以上高い化合物は、h-、bis-、3me-、3meo-セレンテラジンであり、1分間の相対積算発光量で10倍以上のものはh-、bis-セレンテラジンである。一方、それらの発光パターンを、図4に示す。図4に示されている通り、発光パターンが急激に減衰しないものは、bis-セレンテラジン、フリマジンおよび3iso-セレンテラジンである。その結果、発光強度および積算発光量でセレンテラジンの10倍以上であり、且つ発光が減衰せずに連続的発光する組合せが可能である発光基質はbis-セレンテラジンである。bis-セレンテラジンは、既報のフリマジンよりも2倍以上活性が高く、発光機能が著しく改善されている。
大腸菌を宿主として、コドン最適化nanoKAZドメインを発現するために、発現ベクターpCold-ZZ-X(Inouye & Sahara, Protein Express. Purif. (2009) 66:52-57に記載)を使用した。この発現ベクターのEcoRI/XbaI制限酵素部位にコドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子をクローン化し、ZZドメインと融合したnanoKAZ蛋白質を発現できるpCold-ZZ-P-nanoKAZプラスミドを構築した(図5)。コドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子配列の確認は、塩基配列(ABI社製)をDNAシークエンサーにて確認した。
以下手順に従って、組換えnanoKAZドメインを精製した。先ず、大腸菌細胞で可溶性蛋白質として融合蛋白質を発現させた。発現させた融合蛋白質は、6個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグと、ZZドメインと、プロテアーゼ切断サイトと、目的蛋白質(すなわち、組換えnanoKAZドメイン)とを持つ。次に、大腸菌細胞で発現させた融合蛋白質を含む可溶性画分を、一回目のニッケルキレートカラムにかけた。そして、カラムに吸着した画分を、融合蛋白質を含む画分として回収した。次に、カラムから溶出させた融合蛋白質をプロテアーゼで切断した。さらに、融合蛋白質の切断フラグメントを2回目のニッケルキレートカラムにかけ、カラム通過画分を回収した。通過画分には、目的蛋白質である組換えnanoKAZドメインが含まれる。未切断融合蛋白質と切断ヒスチジンタグZZドメインはゲルに吸着させた。以下、これらの手順について詳細に説明する。
コドン最適化nanoKAZドメイン蛋白質(以下「nanoKAZ」と言うことがある。)を、大腸菌において発現させるため、実施例6で作製した組換えプラスミドpCold-ZZ-P-nanoKAZを用いた。宿主大腸菌株としてBL21(Novagen, Madison, WI)を用いた。アンピシリン(50μg/mL)を含有する10 mLのLuria−Bertani培地で、37℃で18時間、pCold-ZZ-P-nanoKAZを含むBL21株を培養した。この種培養を、400 mLのLB培地を含む3Lフラスコに植菌し、3時間培養し、その後、冷水で、1時間冷却した。その培地に、最終濃度が0.2 mMとなるようにIPTGを加えた後、さらに15℃で20時間培養した800 mLの培養液から、5,000 rpmで5分間の遠心分離により大腸菌を回収し、80 mLの50 mM Tris-HCl (pH7.6) 中に懸濁し、Branson model 250 sonifire(Danbury, CT)を用い、冷却しながら3分間に3回の超音波処理することにより大腸菌を破壊した。12,000 rpmで10分間の遠心分離後、ZZ-P-nanoKAZを含む上清70 mLを、50 mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム(カラムサイズ;2.5×6cm:GE Healthcare社製)に供した。250 mLの50 mM Tris-HCl (pH7.6) でカラムを洗浄した後、0.1 Mイミダゾールで吸着したHis-ZZ-P-nanoKAZを溶出させた。800 mLの培養細胞からの融合蛋白質ZZ-P-nanoKAZの収量は、37.2 mgであり、SDS−PAGE分析では、純度95%以上であった。
消化条件は、次の通りである。すなわち、ニッケルキレートカラムから溶出したHis-ZZ-P-nanoKAZ (2.7 mg)を、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTTを含む1 mLの50 mM Tris-HCl (pH7.6)中で、3μgのPreScission Protease(GE Healthcare社製)を用いて、4℃で18時間消化した。
PreScission proteaseによるHis-ZZ-P-nanoKAZの消化処理溶液の中には、切断により生じるZZドメインと組換えnanoKAZと、未切断His-ZZ-P-nanoKAZとが含まれる。切断ZZドメインと未切断His-ZZ-P-nanoKAZから組換えnanoKAZを分離するため、PreScission protease処理溶液を、50 mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化した2 mLのニッケルキレートカラム(0.5 x6 cm)に直接かけた。そして、0.7 mgの組換えnanoKAZを含む通過分画を回収した。精製nanoKAZ 蛋白質の純度は、SDS-PAGEで分析し95%以上であった(図6)。
ここで組換えnanoKAZの塩基配列を配列番号:10に示し、そのアミノ酸配列を配列番号:11に示す。
(i)-(iii)の精製過程の精製収量を表6にまとめた。
実験例7で得られた精製酵素溶液5μl(0.03μg)を、1μg のセレンテラジン(JNC社製)またはその類縁体を含む100μlの50 mM Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTA(和光純薬)に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)と60秒間の積算値を相対発光強度(rlu)で表記した。
実施例8記載の方法で、精製コドン最適化nanoKAZドメインの発光活性を測定した。その結果、精製nanoKAZによる基質特異性を表7に示す。セレンテラジン類縁体の中で、相対最大発光強度でセレンテラジンより10倍以上高い化合物は、h-、bis-、3me-、3meo-セレンテラジンであり、60秒間の相対積算発光量で10倍以上のものはh-、bis-セレンテラジンである。精製コドン最適化nanoKAZを酵素液として用いた結果は、培養細胞液を酵素液として用いた結果と良く一致している。
精製nanoKAZ(3 μg)を500 μlの10 mM EDTA を含む30 mM Tris-HCl(pH7.6) 溶液にエタノールに溶解した基質セレンテラジン(5μg/5μL)を添加することにより発光反応を開始させ、光路長10 mmの石英セルにて、蛍光測定装置(日本分光社製、FP-6500)の励起光源をオフにして発光スペクトルを測定し、スペクトル補正を行なった。測定条件は、バンドパス:20nm、レスポンス:0.5sec、スキャンスピード:2000nm/min、22〜25℃である。測定した発光スペクトルより発光極大値(λmax, nm)と半値幅(nm)を求め、表8にまとめた。このスペクトル結果は、最大発光波長は425 nmから462 nmの間にあり、半値幅は、71 nm から75 nmの間にあり、セレンテラジンC2位お及びC6位の誘導体は発光スペクトルに影響与えないことが明らかとなった。
nanoKAZ遺伝子とnanoLuc遺伝子の培養細胞系での遺伝子発現効率を比較するために、nanoKAZ遺伝子配列とnanoLuc遺伝子配列のみが異なる発現ベクターを構築し、構築した発現ベクターをCHO-K1 細胞へトランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性の発現量を以下の手順で比較した。なお、nanoLuc遺伝子については、Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848-1857記載の遺伝子配列を化学合成して用いた。
pcDNA3-GLsp-dnKAZは、nanoLucのアミノ酸数を同一にするため、nanoKAZ 遺伝子のアミノ末端にある7個のアミノ酸配列を削除したndKAZ 遺伝子フラグメント(dnKAZ フラグメント)を調製した。pCold-ZZ-P-nanoKAZを鋳型としてプライマーnanoKAZ-1N/EcoRI(配列番号:12:5’ gcgGAATTCTTCACCCTGGAGGACTTCGTCGGC 3’: アンダーラインEcoRI 配列)とプライマーnanoKAZ-3C/XbaI(配列番号: 13:5’ gccTCTAGATTAGGCCAGGATTCTCTCGCACAGTCT 3’:アンダーラインXbaI 配列)を用いて、PCR法により遺伝子増幅した。得られたフラグメントを制限酵素EcoRI/XbaIで消化後、実施例2記載のpcDNA3-GLsp ベクターのEcoRI-XbaI制限酵素部位に連結することにより、pcDNA3-GLsp-dnKAZを作成した。発現ベクターpcDNA3-GLsp-dnKAZがコードするGLsp-dnKAZの塩基配列を配列番号:14に示し、そのアミノ酸配列を配列番号:15に示す。また、その分泌後のアミノ酸配列を、配列番号:16に示す。
実施例2記載のpcDNA3-nanoKAZとプロモーター配列及びコザック配列を同一にした発現ベクターpcDNA3-nanoLucを使用した。pcDNA3-nanoLucベクターの構築は以下のとおりである。
化学合成したnanoLuc遺伝子を鋳型としてプライマーnLuc-3N/Asp718(配列番号:20:5’ gcgGGTACCACCATGGTCTTCACACTCGAAGATTTC 3’: アンダーラインAsp718 配列)とプライマーnLuc-2C/XbaI(配列番号:13)を用いて、PCR法により増幅した。得られたフラグメントを制限酵素Asp718/XbaIで消化後、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)のAsp817-XbaI部位に挿入し、pcDNA3-nanoLuc(図9)ベクターを構築した。発現ベクターpcDNA3-nanoLucがコードするnanoLucの塩基配列を配列番号:21に示し、そのアミノ酸配列を配列番号:22に示す。
実施例3記載の方法により、CHO-K1細胞へベクターを導入し、23時間培養後に培養液及び細胞抽出液を回収し、実施例4記載の方法によりセレンテラジンを発光基質として、培養液及び細胞内の発光活性を測定した。
CHO-K1細胞における培養液及び細胞内の発光活性測定の結果を表9に示す。その結果、nanoKAZ遺伝子は分泌シグナルの無い場合、培養液及び細胞内において、nanoLuc遺伝子を用いた場合約2倍の発現量が確認された。分泌シグナルが有る場合は、培養液に分泌発現するnanoKAZはnanoLucの約1.4倍の発光活性を示しており、本発明のコドン最適化法によるKAZ遺伝子は、
nanoLuc遺伝子より細胞内及び細胞外発現レポーター遺伝子として優れていることが明らかとなった。
[配列番号:2]nanoKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:3]実施例2で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:4]実施例2で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:5]GLsp-nanoKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:6]GLsp-nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:7]GLsp-nanoKAZの分泌後のアミノ酸配列である。
[配列番号:8]His-ZZ-P-nanoKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:9]His-ZZ-P-nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:10]組換えnanoKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:11]組換えnanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:12]実施例11で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:13]実施例11で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:14]GLsp-dnKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:15]GLsp-dnKAZおよびGLsp-nanoLucのアミノ酸配列である。
[配列番号:16]GLsp-dnKAZおよびGLsp-nanoLucの分泌後のアミノ酸配列である。
[配列番号:17]実施例11で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:18]実施例11で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:19]GLsp-nanoLucをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:20]実施例11で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:21]nanoLucをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:22]nanoLucのアミノ酸配列である。
Claims (12)
- 以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜20個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
ここで、(b)、(c)および(d)に記載の蛋白質は、分泌シグナルの無い場合、培養液及び細胞内において、nanoLuc遺伝子を用いた場合の約2倍の発現量であり、分泌シグナルが有る場合は、培養液に分泌発現するnanoLucの約1.4倍の発光活性を示す。 - 以下の(a)〜(c)からなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して98%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび/または精製のためのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:5、配列番号:8、配列番号:10および配列番号:14のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項6に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項7に記載の形質転換体を培養し、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドがコードする蛋白質を生成させる工程を含む、蛋白質の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載の組換えベクターまたは請求項7に記載の形質転換体を含むキット。
- さらに、bis-セレンテラジンまたはh-セレンテラジンを含む、請求項9に記載のキット。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
- 発光基質として、bis-セレンテラジンまたはh-セレンテラジンを用いる、請求項11に記載の方法。
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