JP6484987B2 - エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法 - Google Patents
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Description
[1] 以下の(a)または(b)に記載のルシフェラーゼ変異体:
(a)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換し、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[2] 前記(b)のルシフェラーゼ変異体が以下の(c)に記載のものである、上記[1]に記載のルシフェラーゼ変異体:
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換し、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[3] 前記44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸と置換する他のアミノ酸がイソロイシンである、上記[1]または[2]に記載のルシフェラーゼ変異体。
[4] 前記(a)の蛋白質が、配列番号:16、配列番号:14、配列番号:12、配列番号:10、配列番号:8、配列番号:6または配列番号:4のアミノ酸配列を含有するものである、上記[1]に記載のルシフェラーゼ変異体。
[5] 上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[6] 上記[5]記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
[7] 上記[6]記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[8] 上記[7]記載の形質転換体を培養し、上記[1]〜[4]のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、上記[1]〜[4]のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
[9] 上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体、上記[5]記載のポリヌクレオチド、上記[6]記載の組換えベクターおよび上記[7]記載の形質転換体から選択される少なくとも1つを含む、キット。
[10] さらにルシフェリンを含む、上記[9]記載のキット。
[11] 前記ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[10]記載のキット。
[12] 前記セレンテラジン類がセレンテラジンである、上記[11]記載のキット。
[13] 上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
[14] 前記ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[13]記載の方法。
[15] 前記セレンテラジン類がセレンテラジンである、上記[14]記載の方法。
[16] 上記[5]記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
[17] 前記ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[16]記載の方法。
[18] 前記セレンテラジン類がセレンテラジンである、上記[17]記載の方法。
本発明のルシフェラーゼ変異体とは、オプロフォーラスルシフェラーゼの分子量19 kDaの蛋白質の変異体である。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体は、配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体と実質的に同質の活性を有するルシフェラーゼ変異体を意味する。
(b)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換し、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
前記配列番号:2のアミノ酸配列における54番目のアラニンと置換する他のアミノ酸は、例えば、イソロイシン、バリン、メチオニン、ロイシン、システイン、セリン、フェニルアラニン、であり、好ましくは、イソロイシン、バリン、メチオニン、ロイシンまたはシステインであり、より好ましくは、イソロイシンである。
前記配列番号:2のアミノ酸配列における138番目のチロシンと置換する他のアミノ酸は、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン、、システイン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジンまたはグルタミンであり、好ましくは、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン、アルギニンまたはリジンであり、より好ましくは、イソロイシンである。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸;
C群:アスパラギン、グルタミン;
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸;
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン;
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;
G群:フェニルアラニン、チロシン。
本発明は、前述した本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
(i)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または
(ii)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換し、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、および酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)があげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、および昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)があげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)、pcDNA3ベクター、PICZ aベクター(インビトロジェン社製)なども好適に使用することができる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、Sf9、Sf21などがあげられる。
発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列;および
(2)本発明のポリヌクレオチドを含有するコード配列。
低温で発現誘導可能なプロモーター配列とは、宿主細胞を増殖させる培養条件から、温度を下げることによって蛋白質の発現を誘導可能なプロモーター配列を意味する。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック蛋白質をコードする遺伝子(コールドショック遺伝子)のプロモーターが挙げられる。コールドショック遺伝子のプロモーターとしては、前記したものが挙げられる。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、本発明のルシフェラーゼ変異体の製造方法を提供する。本発明のルシフェラーゼ変異体は、例えば、前記形質転換体を本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(DNA)が発現可能な条件下で培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明のルシフェラーゼ変異体が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明のルシフェラーゼ変異体が蓄積される。
上記培養物から、本発明のルシフェラーゼ変異体を分離・精製することによって、本発明のルシフェラーゼ変異体を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のルシフェラーゼ変異体の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
発光による検出マーカーとしての利用
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリン存在下、発光による検出マーカー(以下、「本発明の検出マーカー」)として利用することができる。本発明の検出マーカーは、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。
本発明のルシフェラーゼ変異体は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。この場合、本発明のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体を発現する細胞の培養容器にルシフェリンを添加すること、前記細胞とルシフェリンとを混合すること、前記細胞をルシフェリンの存在下で培養することが含まれる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサー)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン(発光基質)存在下、本発明のルシフェラーゼ変異体に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。さらに、発現したルシフェラーゼ変異体をセレンテラジン類と反応させ、生成する発光を高感度検出装置により可視化、画像化することもできる。
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンが酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成される反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。よって、本発明のルシフェラーゼ変異体は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
本発明のルシフェラーゼ変異体は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
本発明は、本発明ルシフェラーゼ変異体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにルシフェリンを含んでいてもよい。
本発明のキットは、上述したレポーター蛋白質もしくはレポーター遺伝子を用いた測定、発光による検出マーカー、BRET法による生理機能の解析または酵素活性の測定などに利用することができる。また、後述の発光反応方法に用いることもできる。
発光活性
本発明のルシフェラーゼン変異体は、ルシフェリンを酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンを基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。この活性を、本明細書において、「発光活性」と称することがある。
本発明のルシフェラーゼ変異体を用いた、ルシフェリンを基質とする発光反応は、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、ルシフェリンを収容した容器に本発明のルシフェラーゼ変異体を添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体を収容した容器にルシフェリンを添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを混合することが含まれる。反応条件としては、オプロフォーラスルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
反応溶液のpHは、通常約5〜約10、好ましくは約6〜約9、より好ましくは約7〜約8、特に好ましくは約7.5である。
本発明のルシフェラーゼ変異体の、ルシフェラーゼ活性は、ハロゲン化物イオン、非イオン性界面活性剤などにより活性化され得る。
19k OLase(以降KAZと記載)遺伝子への部位特異的変異法によるアミノ酸置換は、Ho et al., Gene (1989) 77: 51-59記載の方法に従い、PCR法により行った。KAZの塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号:1および配列番号:2に示す通りである。具体的には、KAZ遺伝子を有するpCold-KAZまたはpCold-ZZ-KAZを鋳型として、2種のPCRプライマーを用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施した。
pCold-F(5' ACG CCA TAT CGC CGA AAG G 3')(配列番号:17)
KAZ:Q18L-R(5' TAA CAC TTG ATC TAG GTT GTA TCC AGC 3')(配列番号:18)
KAZ:Q18L-F(5' GCT GGA TAC AAC CTA GAT CAA GTG TTA 3')(配列番号:19)
KAZ-5C/XbaI(5’CCGC TCT AGA TTA GGC AAG AAT GTT CTC GCA AAG CCT 3’)(配列番号:20)
KAZ-8N/EcoRI(5’GCG GAA TTC TTT ACG TTG GCA GAT TTC GTT GGA 3’)(配列番号:21)
KAZ-5C/XbaI(配列番号:20)
Inouye et al (2013) Biochem. Biophys.Res.Commun. 437: 23-28.に記載のpCold-ZZ-P-nanoKAZを鋳型として、以下のプライマーを用いて、PCR法により遺伝子増幅した。
nanoKAZ-1N/EcoRI(5’ gcgGAATTCTTCACCCTGGAGGACTTCGTCGGC 3’: アンダーラインEcoRI 配列)(配列番号:50)
nanoKAZ-3C/XbaI(5’ gccTCTAGATTAGGCCAGGATTCTCTCGCACAGTCT 3’:アンダーラインXbaI 配列)(配列番号:51)
実施例1及び2で得られたDNA断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、発現ベクターpColdII(タカラバイオ社)の制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結する事によって、以下のKAZ変異体ベクターを構築した:pCold-KAZ-A4E、pCold-KAZ-Q11R、pCold-KAZ-Q18L、pCold-KAZ-L27V、pCold-KAZ-A33N、pCold-KAZ-K43R、pCold-KAZ-V44I、pCold-KAZ-A54I、pCold-KAZ-F68D、pCold-KAZ-L72Q、pCold-KAZ-M75K、pCold-KAZ-I90V、pCold-KAZ-P115E、pCold-KAZ-Q124K、pCold-KAZ-Y138I、pCold-KAZ-N166R、およびpCold-dnKAZ。DNAシークエンサー(ABI社製)にて塩基配列を決定する事により、インサートDNAの確認を行った。
表2.KAZ変異体の置換アミノ酸及び塩基
KAZ変異体を大腸菌において発現させるため、実施例3で作製した組換えプラスミドを用いた。宿主大腸菌株としてBL21(Novagen, Madison, WI)を用いた。組換えプラスミドを含むBL21株をアンピシリン(50μg/mL)を含有する5 mLのLuria−Bertani培地(以降LB培地と記載)で、37℃で18時間、培養した。この種培養0.1mLを、10 mLのLB培地に植菌し、3時間培養した。その後、氷中で、1時間冷却した。その培養液に、最終濃度が1mMとなるようにIPTGを加えた後、さらに15℃で20時間培養した。培養後、1 mLの培養液を回収し、10,000 rpmで2分間の遠心分離により大腸菌を回収し、0.5 mLの30 mM Tris-HCl (pH7.6)-10 mM EDTA(和光純薬製)(以降TEと記載)中に懸濁した。Branson model 250 sonifire(Danbury, CT)を用い、3秒間の超音波処理することにより大腸菌を破壊し、粗酵素液を調製した。更に粗酵素液0.5mLを10,000回転で2分間遠心分離して上清と沈殿に分離後、沈殿を0.5mLのTEに懸濁した。上清及び沈殿20μLをSDS-PAGE分析に供し、可溶性蛋白質及び不溶性蛋白質の有無を確認した。その結果を図1に示す。図1中、Mおよび1〜17は次の通りである:M: 分子量サイズマーカー;1: KAZ; 2 KAZ-A4E;3: KAZ-Q11R;4: KAZ-Q18L;5: KAZ-L27V;6: KAZ-A33N; 7:KAZ-K43R; 8: KAZ-V44I;9: KAZ-A54I;10: KAZ-F68D;11: KAZ-L72Q;12: KAZ-M75K;13: KAZ-I90V;14: KAZ-P115E;15: KAZ-Q124K;16: KAZ-Y138I;17: KAZ-N166Rおよび18: dnKAZ。図1より、dnKAZ(18)のみ可溶性蛋白質として発現し、他の蛋白質(1〜16)はほとんど不溶性蛋白質として発現していることが明らかとなった。
実施例4にて得られた上清及び沈殿5μLを、0.5μg のセレンテラジン(JNC社製)を含む100μLのTEに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、相対発光活性(Imax) で表記した。
可溶性蛋白質として発現させるために、発現ベクターpCold-ZZ-X(Inouye & Sahara, Protein Express. Purif. (2009) 66:52-57に記載)を使用した。この発現ベクターのEcoRI/XbaI制限酵素部位に、実施例1及び2で取得したDNA断片を制限酵素EcoRI/XbaIにて消化、連結し、以下の融合KAZ変異体発現ベクターを構築した:pCold-ZZ-P-KAZ-A4E、pCold-ZZ-P-KAZ-Q11R、pCold-ZZ-P-KAZ-Q18L、pCold-ZZ-P-KAZ-L27V、pCold-ZZ-P-KAZ-A33N、pCold-ZZ-P-KAZ-K43R、pCold-ZZ-P-KAZ-V44I、pCold-ZZ-P-KAZ-A54I、pCold-ZZ-P-KAZ-F68D、pCold-ZZ-P-KAZ-L72Q、pCold-ZZ-P-KAZ-M75K、pCold-ZZ-P-KAZ-I90V、pCold-ZZ-P-KAZ-P115E、pCold-ZZ-P-KAZ-Q124K、pCold-ZZ-P-KAZ-Y138I、pCold-ZZ-P-KAZ-N166R、およびpCold-ZZ-P-dnKAZ。
ZZ融合KAZ変異体を大腸菌において発現させるため、実施例6で作製した組換えプラスミドを用いた。宿主大腸菌株としてBL21(Novagen, Madison, WI)を用いて、実施例4と同様の方法で粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液5μLをSDS-PAGE分析に供し、蛋白質の発現を確認した(図2)。図2中のMおよび1〜18は、図1で説明した通りである。
実施例7で得られた粗酵素液に最終濃度が1 mM になるようにDTTを加え、氷中に5時間以上静置した。その粗酵素液1μLを、1μg のセレンテラジン(JNC社製)を含む100μLのTEに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)を相対発光活性で表記した。
KAZ変異体発現ベクターの構築は以下の通りである。先ず、動物培養細胞での新規発現ベクターpcDNA3-GLspを構築した。具体的には、pcDNA3-GLucベクター(プロルミ社製)よりガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を以下のプライマーを用いPCR法により取得した。
GLsp-1R/EcoRI (5' ggc GAA TTC GGT GGG CTT GGC CTC GGC CAC 3'、アンダーラインEcoRI 配列)(配列番号:52)
T7プライマー(5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3')(配列番号:53)
(1)発現プラスミドの精製
実施例9にて得られた組換えプラスミドを用いて以下の実験を行った。組換えプラスミドは大腸菌JM83より、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製し、滅菌水に溶解した。同様にして、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター(pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製)を使用した。
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO-K1株を、10%(v/v)牛胎児血清(バイオウエスト社製)を含むHam’s F-12培地(和光純薬社製)にて培養した。CHO-K1細胞を1 x 105 細胞/ウエル/2 mL培地にて6 ウエルプレートに播種し(n = 2)、インキュベーター中37 ℃、5 %(v/v) CO2にて培養した。24時間後、精製した組換えプラスミドをFuGene HD(プロメガ社製)トランスフェクションキットを用いて、CHO-K1細胞にトランスフェクションし、次の実験に用いた。具体的には、100μL の培地に、組換えプラスミド1μgとpGL4.13 [Luc2/sv40]内部標準ベクター0.1μgと、FuGene HD 3μLを加え、室温で15分間放置した。100μLのDNA-FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加した。48時間培養後、培養液を回収した。一方、細胞内で発現したKAZ変異体については、細胞を3mLの1x PBSで3回洗浄後、1 mLの1x PBSに懸濁し、氷上で超音波破砕処理して得られたものを、細胞抽出KAZ変異体酵素液とした。
実施例10で得られた培養液及び細胞抽出液5μLを、0.5μg のセレンテラジン(JNC社製)を含む100μLの30mM Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTA(和光純薬)に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)を百分率で表記した。その結果を表5に示す。表5の結果から、いずれの1アミノ酸置換KAZ変異体においても、細胞からの分泌は認められなかった。
実施例8で、3ヶ所のアミノ酸置換(V44I、A54I、Y138I)が発光活性上昇に関与している可能性が示唆されたため、これらのアミノ酸の2アミノ酸置換変異体及び3アミノ酸置換変異体を作製し、発光活性を検討した。
実施例12で得られたDNA断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、発現ベクターpColdII(タカラバイオ社)の制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結することによって、pCold-KAZ-V44I-A54I、pCold-ZZ-V44I-Y138I、pCold-KAZ-A54I-Y138I、pCold-KAZ-V44I-A54I-Y138IのKAZ変異体発現ベクターを構築した。DNAシークエンサー(ABI社製)にて塩基配列を決定する事により、インサートDNAの確認を行った。
KAZの2アミノ酸置換変異体及び3アミノ酸置換変異体を大腸菌において,
pColdIIベクターを用いて発現させるため、実施例13で作製した組換えプラスミドと実施例3にて作製したpCold-V44I-KAZ、pCold-A54I-KAZ、pCold-Y138I-KAZを用いた。宿主大腸菌株としてBL21(Novagen, Madison, WI)を用いて、実施例4と同様の方法で粗酵素液の上清及び沈殿を調製した。上清及び沈殿20μLをSDS-PAGE分析に供し、可溶性蛋白質及び不溶性蛋白質の有無を確認した。その結果を図3に示す。図3中のMおよび1〜9は次の通りである。M: 分子量サイズマーカー;1: dnKAZ;2: KAZ;3: KAZ-V44I-A54I;4: KAZ-V44I-Y138I;5: KAZ-A54I-Y138I;6: KAZ-V44I-A54I-Y138I;7: KAZ-V44I;8: KAZ-A54I;および9: KAZ-Y138I。図3の結果から、dnKAZのみ可溶性蛋白質として発現し、他の変異体及びKAZは不溶性蛋白質として発現していることが明らかとなった。
実施例14にて得られた上清及び沈殿5μLを、実施例5と同様の方法で発光活性を測定した。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)を相対活性で表記した。
実施例12で得られたDNA断片をZZドメインに結合させ、可溶性蛋白質として発現させるために、実施例6と同様の方法で、pCold-ZZ-Pベクターを用いて、ZZドメインと融合したKAZ変異体を発現できるpCold-ZZ-P-KAZ-V44I-A54I、pCold-ZZ-P-KAZ-V44I-Y138I、pCold-ZZ-P-KAZ-A54I-Y138I、pCold-ZZ-P-KAZ-V44I-A54I-Y138Iの4種類の発現ベクターを構築した。
ZZ融合KAZ変異体を大腸菌において発現させるため、実施例16で作製した組換えプラスミドと実施例6にて作製したpCold-ZZ-P-V44I-KAZ、pCold-ZZ-P-A54I-KAZ、pCold-ZZ-P-Y138I-KAZを用いた。宿主大腸菌株としてBL21(Novagen, Madison, WI)を用いて、実施例7と同様の方法で粗酵素液を調製した。粗酵素液に最終濃度が1 mM になるようにDTTを加え、氷中に5時間以上静置後、発光活性を測定した。活性の測定法は、実施例8と同様の方法にて行った。また、得られた粗酵素液5μLをSDS-PAGE分析に供し、蛋白質の発現を確認した(図4)。図4中、Mおよび1〜9は次の通りである。M: 分子量サイズマーカー;1: ZZ-P-KAZ;2: ZZ-P-KAZ-V44I;3: ZZ-P-KAZ-A54I;4: ZZ-P-KAZ-Y138I;5: ZZ-P-KAZ-V44I-A54I;6: ZZ-P-KAZ-V44I-Y138I;7: ZZ-P-KAZ-A54I-Y138I;8: ZZ-P-KAZ-V44I-A54I-Y138I;および9: ZZ-P-dnKAZ。
基質特異性実験に使用したセレンテラジン類縁体は、それぞれ論文記載の方法で合成した。具体的には、bis-セレンテラジン はNakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett.. 38:6405-6406, フリマジン(Furimazine)は、Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848-1857, 6h-セレンテラジン、f-セレンテラジン、6h-f-セレンテラジンは、Inouye et al (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23-28 に記載の方法で合成した。
ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を使用してKAZの2アミノ酸置換変異体及び3アミノ酸置換変異体を分泌発現するベクターの構築は、実施例8にて作製したpcDNA3-GLsp-ベクターを用いて、実施例12にて作製したKAZの2アミノ酸置換変異体及び3アミノ酸置換変異体遺伝子断片及び実施例2で作製したdnKAZ遺伝子断片を常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pcDNA3-GLspのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、発現ベクターpcDNA3-GLsp-KAZ-V44I-A54I、pcDNA3-GLsp-KAZ-V44I-Y138I、pcDNA3-GLsp-KAZ-A54I-Y138I、pcDNA3-GLsp-KAZ-V44I-A54I-Y138I、pcDAN3-GLsp-dnKAZを構築した。なお、DNA シークエンサー(ABI社製)により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
(1)発現プラスミドの精製
実施例19にて得られた組換えプラスミドを実施例10と同様にして精製し、滅菌水に溶解した。同様にして、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター(pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製)を使用した。
実施例10と同様の方法にて、2アミノ酸置換KAZ変異体及び3アミノ酸置換KAZ変異体の培養液と細胞抽出KAZ変異体酵素液を得た。
得られた酵素溶液と細胞抽出KAZ変異体酵素液は、実施例11と同様の方法にて発光活性を測定した。
コザック配列を含むKAZの2アミノ酸置換変異体及び3アミノ酸置換変異体遺伝子断片及びnanoKAZ遺伝子断片を制限酵素Asp718とXbaI で消化後、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)のAsp718-XbaI部位に挿入し、pcDNA3-KAZ-V44I、pcDNA3-KAZ-A54I、pcDNA3-KAZ-Y138I、pcDNA3-KAZ-V44I-A54I、pcDNA3-KAZ-V44I-Y138I、pcDNA3-KAZ-A54I-Y138I、pcDNA3-KAZ-V44I-A54I-Y138Iベクターを構築した。
(1)発現プラスミドの精製
実施例21にて得られた組換えプラスミドを実施例10と同様にして精製し、滅菌水に溶解した。同様にして、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター(pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製)を使用した。
実施例10と同様の方法にて、2アミノ酸置換KAZ変異体及び3アミノ酸置換KAZ変異体の培養液と細胞抽出KAZ変異体酵素液を得た。
[配列番号:2]KAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:3] KAZ-V44Iの塩基配列である。
[配列番号:4] KAZ-V44Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:5] KAZ-A54Iの塩基配列である。
[配列番号:6] KAZ-A54Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:7] KAZ- Y138Iの塩基配列である。
[配列番号:8] KAZ-Y138Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:9] KAZ- V44I-A54Iの塩基配列である。
[配列番号:10] KAZ- V44I-A54Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:11] KAZ- V44I-Y138Iの塩基配列である。
[配列番号:12] KAZ- V44I-Y138Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:13] KAZ- A54I-Y138Iの塩基配列である。
[配列番号:14] KAZ- A54I-Y138Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:15] KAZ- V44I-A54I-Y138Iの塩基配列である。
[配列番号:16] KAZ- V44I-A54I-Y138Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:17] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(pCold-F)。
[配列番号:18] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Q18L-R)。
[配列番号:19] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Q18L-F)。
[配列番号:20] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ-5C/XbaI)。
[配列番号:21] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ-8N/EcoRI)。
[配列番号:22] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:A4E-F)。
[配列番号:23] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Q11R-F)。
[配列番号:24] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:L27V-R)。
[配列番号:25] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:L27V-F)。
[配列番号:26] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(A33N-R)。
[配列番号:27] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(A33N-F)。
[配列番号:28] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:K43R-R)。
[配列番号:29] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:L43R-F)。
[配列番号:30] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:V44I-R)。
[配列番号:31] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:V44I-F)。
[配列番号:32] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:A54I-R)。
[配列番号:33] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:A54I-F)。
[配列番号:34] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(pCold-R)。
[配列番号:35] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:F68D-R)。
[配列番号:36] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:F68D-F)。
[配列番号:37] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:L72Q-R)。
[配列番号:38] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:L72Q-F)。
[配列番号:39] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:M75K-R)。
[配列番号:40] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:M75K-F)。
[配列番号:41] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:I90V-R)。
[配列番号:42] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:I90V-F)。
[配列番号:43] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:P115E-R)。
[配列番号:44] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:P115E-F)。
[配列番号:45] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Q124K-R)。
[配列番号:46] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Q124K-F)。
[配列番号:47] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Y138I-R)。
[配列番号:48] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:Y138I-F)。
[配列番号:49] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(KAZ:N166R-R)。
[配列番号:50] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nanoKAZ-1N/EcoRI)。
[配列番号:51] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nanoKAZ-3C/XbaI)。
[配列番号:52] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(GLsp-1R/EcoRI)。
[配列番号:53] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(T7プライマー)。
Claims (16)
- 以下の(a)または(b)に記載のルシフェラーゼ変異体:
(a)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される2つまたは3つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列において44番目のバリン、54番目のアラニンおよび138番目のチロシンからなる群から選択される2つまたは3つのアミノ酸が他のアミノ酸と置換し、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目および166番目の位置以外で1〜10個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換したアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体;
ここで、44番目のバリンと置換する場合の他のアミノ酸は、イソロイシンであり、
54番目のアラニンと置換する場合の他のアミノ酸は、イソロイシンであり、
138番目のチロシンと置換する場合の他のアミノ酸は、イソロイシンである。 - 前記(a)の蛋白質が、配列番号:16、配列番号:14、配列番号:12、または配列番号:10のアミノ酸配列を含有するものである、請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体。
- 請求項1または2記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項5記載の形質転換体を培養し、請求項1または2に記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、請求項1または2に記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
- 請求項1または2に記載のルシフェラーゼ変異体、請求項3記載のポリヌクレオチド、請求項4記載の組換えベクターおよび請求項5記載の形質転換体から選択される少なくとも1つを含む、キット。
- さらにルシフェリンを含む、請求項7記載のキット。
- 前記ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項8記載のキット。
- 前記セレンテラジン類がセレンテラジンである、請求項9記載のキット。
- 請求項1または2に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
- 前記ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項11記載の方法。
- 前記セレンテラジン類がセレンテラジンである、請求項12記載の方法。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
- 前記ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項14記載の方法。
- 前記セレンテラジン類がセレンテラジンである、請求項15記載の方法。
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