JP6511046B2 - 触媒を使用しない表面官能基化およびポリマーグラフト - Google Patents

触媒を使用しない表面官能基化およびポリマーグラフト Download PDF

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Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１３年７月１日に出願された米国仮特許出願第６１／８４１，６４７号および２０１４年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／９７１，３８１号に対する優先権の利益を主張し、これらのそれぞれはその全体が参考として本明細書に明確に援用される。
一般に、本出願は、化学、生物学および材料科学の分野に関する。より詳細には、本出願は、目的の官能基化分子と直接コンジュゲートするための、共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンから選択される必要に応じて置換されている不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体を含む表面を有する基材に関する。官能基化表面を調製する方法、ならびにＤＮＡ配列決定および他の診断用途における使用も開示される。
ポリマーまたはヒドロゲルがコーティングされている基材は、多くの技術的用途に使用される。例えば、埋込式医療用デバイスは、生物的に不活性なポリマーによりコーティングされ得る。別の例では、ポリマーまたはヒドロゲルがコーティングされている基材は、生物分子の調製および／または分析に使用される。ある種の核酸配列決定法などの分子解析は、ポリマーまたはヒドロゲルがコーティングされている基材の表面に核酸鎖を結合することを利用している。次に、結合した核酸鎖の配列は、当分野で周知のいくつかの様々な方法により決定することができる。
ある種のシークエンシング−バイ−シンセシス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法では、フローセルの１つまたは複数の表面が、核酸が結合するポリマーまたはヒドロゲルによりコーティングされる。現在市販されているフローセルは、非結合型ゲルコーティングを利用している。適切なコンジュゲート化学を使用することにより、共有結合しているゲルコーティングを有する商業的に実現可能なフローセルを提供することができる。材料の費用、工業法との適合性、保管および輸送の間の安定性、ならびに核酸増幅および配列決定などの下流の化学的な処理工程を支援する能力などを考慮することを考えることは重要である。本開示は、本開示から明らかとなる、いくつかの利点を有する特に有用な化学を提供する。
本出願は、適切に官能基化されている目的のヒドロゲル、ポリマー、分子またはバイオ分子に直接コンジュゲートするための基材表面を調製する新規方法を開示する。この表面は、シランまたはシラン誘導体のケイ素原子に直接、あるいは、リンカーを介して共有結合している、環ひずみが存在するノルボルネン、シクロオクテン、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または任意のシクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、またはそれらの誘導体などのシクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンから選択される第１の必要に応じて置換されている複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体により、触媒または追加の架橋剤を必要とすることなく、処理される。特定の実施形態において、本出願の実施により、追加の架橋性化合物または触媒の使用が排除され、ＤＮＡ配列決定および他の診断用途において使用するための非常に多様な官能基化表面を得るための、共通の開始点としての単一表面修飾がもたらされる。さらに、本出願により調製される基材表面は、より高い安定性を有することが見いだされ、保管寿命が一層長くなり、かつ保管時の表面汚染が低減される。最後に、本出願により調製される基材表面は、標準的なシラン（ＡＰＴＥＳまたはＡＰＴＭＳなど）と比べて、特有の表面親和力を有することが見いだされ、これにより、水をベースとする構成成分との一層良好な湿潤性および一層均一なコーティングがもたらされる。
本出願はまた、基材の表面にプライマーをグラフトする新規方法も開示する。一実施形態において、この表面は、シランまたはシラン誘導体のケイ素原子に直接、またはリンカーを介して共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンから選択される第１の必要に応じて置換されている複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体により、触媒または追加の架橋剤を必要とすることなく、処理される。次に、プライマーが、オリゴヌクレオチドに共有結合している官能基を有する機能性分子により予めコンジュゲートされ、このオリゴヌクレオチドは、シクロオクチンまたはビシクロアルキン、例えばビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インなどのシクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンから選択される第２の必要に応じて置換されている複数の不飽和部分を含む。最後に、この予めコンジュゲートされたプライマーは、官能基化分子の官能基をシランまたはシラン誘導体の不飽和部分と反応させることによって、シランまたはシラン誘導体に共有結合される。
本明細書に記載されている一部の実施形態は、シランまたはシラン誘導体のケイ素原子に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第１の複数の不飽和部分を介して官能基化分子に共有結合しているシランまたはシラン誘導体を含む第１の表面を含む基材に関する。一部の実施形態において、この基材は、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第２の複数の不飽和部分を介して官能基化分子に共有結合しているオリゴヌクレオチドをさらに含む。
本明細書に記載されている一部の実施形態は、官能基を含む官能基化分子を基材の第１の表面に固定化する方法であって、シランまたはシラン誘導体に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第１の複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体を該基材の第１の表面に塗布する工程、および官能基化分子の官能基を第１の複数の不飽和部分と反応させることにより、シランまたはシラン誘導体に官能基化分子を共有結合させて、コーティング層を形成する工程を含む、方法に関する。一部の実施形態において、本方法はさらに、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第２の複数の不飽和部分を含むオリゴヌクレオチドを用意する工程、およびオリゴヌクレオチドの第２の複数の不飽和部分を官能基化分子の官能基と反応させて、共有結合を形成する工程を含む。
本明細書に記載されている一部の実施形態は、基材の第１の表面にプライマーをグラフトする方法であって、
基材の第１の表面にコーティング層を含む基材を用意する工程であって、コーティング層が、シランまたはシラン誘導体の第１の複数の不飽和部分を介して官能基化分子に共有結合しているシランまたはシラン誘導体を含み、該官能基化分子が官能基を含み、第１の複数の不飽和部分が、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される、工程、
シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第２の複数の不飽和部分を含むオリゴヌクレオチドを上記のコーティング層に接触させる工程、および
オリゴヌクレオチドの第２の複数の不飽和部分を官能基化分子の官能基と反応させて、共有結合を形成する工程
を含む、方法に関する。一部の実施形態において、このコーティング層は、基材の第１の表面上に、第１の複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体を塗布する工程、および官能基化分子の官能基を第１の複数の不飽和部分と反応させることにより、シランまたはシラン誘導体に官能基化分子を共有結合する工程により調製される。
本明細書に記載されている一部の実施形態は、基材の第１の表面上にプライマーをグラフトする方法であって、
シランまたはシラン誘導体を含む第１の表面を有する基材を用意する工程であって、該シランまたはシラン誘導体が、該シランまたはシラン誘導体に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第１の複数の不飽和部分を基材の第１の表面に含む、工程、
官能基化分子に共有結合しているオリゴヌクレオチドを含む予めコンジュゲートされているプライマーを用意する工程であって、該官能基化分子が官能基を含む、工程、および
官能基化分子の官能基をシランまたはシラン誘導体の第１の複数の不飽和部分と反応させて共有結合を形成することにより、予めコンジュゲートされているプライマーが基材の第１の表面に共有結合するように、予めコンジュゲートされているプライマーをシランまたはシラン誘導体に接触させる工程
を含む、方法に関する。
一部の実施形態において、予めコンジュゲートされているプライマーは、官能基化分子の官能基をオリゴヌクレオチドの第２の複数の不飽和部分と反応させて、共有結合を形成することにより調製され、該オリゴヌクレオチドの該第２の複数の不飽和部分は、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、第１の複数の不飽和部分は、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択することができる。一部の他の実施形態において、環ひずみのある他のいずれのシクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンも使用することができる。一部の実施形態において、第１の複数の不飽和部分は、必要に応じて置換されているノルボルネンとすることができる。一部の実施形態において、第１の複数の不飽和部分は、必要に応じて置換されているシクロオクチンとすることができる。一部の実施形態において、第１の複数の不飽和部分は、必要に応じて置換されているビシクロノニンから選択することができる。一部の実施形態において、必要に応じて置換されているビシクロノニンは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを含む。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドの第２の複数の不飽和部分は、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択することができる。一部の他の実施形態において、環ひずみのある他のいずれのシクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンも使用することができる。一部の実施形態において、第２の複数の不飽和部分は、必要に応じて置換されているシクロオクチンとすることができる。一部の実施形態において、第２の複数の不飽和部分は、必要に応じて置換されているビシクロノニンとすることができる。一部のさらなる実施形態において、必要に応じて置換されているビシクロノニンは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを含む。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、シランまたはシラン誘導体は、以下の式
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているアリールオキシ、必要に応じて置換されているヘテロアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールオキシからそれぞれ独立して選択される）を含むことができる。一部の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ、必要に応じて置換されているアルコキシから独立して選択することができる。一部のこうした実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、メトキシである。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、シランまたはシラン誘導体は、化学蒸着によって第１の表面に塗布することができる。一部の他の実施形態において、シランまたはシラン誘導体は、Ｙｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＹＥＳ）法により第１の表面に塗布することができる。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、シランまたはシラン誘導体はさらに、シランまたはシラン誘導体のケイ素原子と第１の複数の不飽和部分との間に共有結合しているリンカーを含む。一部のこうした実施形態において、リンカーは、必要に応じて置換されているアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロアルキレン、必要に応じて置換されているシクロアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、必要に応じて置換されているポリエチレングリコール、開裂可能なリンカー、またはそれらの組合せから選択される。一部のこうした実施形態において、リンカーは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーである。一部のさらなるこうした実施形態において、リンカーは、必要に応じて置換されているエチレンリンカーである。一部の他のこうした実施形態において、リンカーは、開裂可能なリンカーである。一部のこうした実施形態において、開裂可能なリンカーは、（−Ｓ−Ｓ−）、エステル、ニトロベンゼン、イミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから選択される。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、官能基化分子は、ポリマー、ヒドロゲル、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、官能基化分子は、ポリマー、ヒドロゲル、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの組合せから選択される。一部のさらなる実施形態において、官能基化分子は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンまたはチオールから選択される１つまたは複数の官能基を含むヒドロゲルまたはポリマーである。一部の実施形態において、官能基化分子は、発明を実施するための形態において以下に記載されている、式（Ｉ）の繰り返し単位および式（ＩＩ）の繰り返し単位を含む、ポリマーまたはヒドロゲルを含む。一部の実施形態において、官能基化分子は、発明を実施するための形態において以下に記載されている、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）を含む、ポリマーを含む。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、官能基化分子は、必要に応じて置換されているアルケニル、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、カルボキシル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、またはチオールから選択される官能基を含み、但し、官能基化分子はノルボルネンでも重合ノルボルネンでもない。一部のこうした実施形態において、官能基化分子は、アジド基を含む。一部の実施形態において、官能基化分子は、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）である。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、基材は、ガラス基材、シリカ基材、石英、プラスチック基材、金属基材、金属酸化物基材、またはそれらの組合せから選択される。一実施形態において、基材はガラス基材である。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、第１の表面は、官能基化分子コーティング領域と不活性領域との両方を含む。一部の実施形態において、不活性領域は、ガラス領域、金属領域、マスク領域もしくは介在領域、またはそれらの組合せから選択される。一実施形態において、不活性領域はガラスを含む。
本明細書に記載されている方法の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、過剰の非結合官能基化分子を除去するための洗浄工程をさらに含むことができる。
本明細書に記載されている方法の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、乾燥工程をさらに含むことができる。
本明細書に記載されている、プライマーをグラフトする方法の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、過剰の非結合オリゴヌクレオチドを除去するための洗浄工程をさらに含むことができる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
シランまたはシラン誘導体のケイ素原子に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第１の複数の不飽和部分を介して官能基化分子に共有結合している該シランまたはシラン誘導体を含む第１の表面を含む基材。
（項目２）
前記第１の複数の不飽和部分が、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される、項目１に記載の基材。
（項目３）
前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているノルボルネンである、項目１または２に記載の基材。
（項目４）
前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているシクロオクチンである、項目１または２に記載の基材。
（項目５）
前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニンから選択される、項目１または２に記載の基材。
（項目６）
前記ビシクロノニンが、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インである、項目５に記載の基材。
（項目７）
前記シランまたはシラン誘導体が、以下の式

（式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ は、水素、ハロゲン、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているアリールオキシ、必要に応じて置換されているヘテロアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールオキシからそれぞれ独立して選択される）
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の基材。
（項目８）
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ が、独立して必要に応じて置換されているアルコキシである、項目７に記載の基材。
（項目９）
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ のそれぞれがメトキシである、項目８に記載の基材。
（項目１０）
前記シランまたはシラン誘導体のケイ素原子と前記第１の複数の不飽和部分との間に共有結合しているリンカーをさらに含む、項目１から９のいずれか一項に記載の基材。
（項目１１）
前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロアルキレン、必要に応じて置換されているシクロアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、必要に応じて置換されているポリエチレングリコール、開裂可能なリンカー、またはそれらの組合せから選択される、項目１０に記載の基材。
（項目１２）
前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレンまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンから選択される、項目１０または１１に記載の基材。
（項目１３）
前記リンカーが必要に応じて置換されているエチレンである、項目１０から１２のいずれか一項に記載の基材。
（項目１４）
前記リンカーが開裂可能なリンカーである、項目１０または１１に記載の基材。
（項目１５）
前記開裂可能なリンカーが、（−Ｓ−Ｓ−）、エステル、ニトロベンゼン、イミン、ペプチドまたはポリヌクレオチドから選択される、項目１１または１４に記載の基材。
（項目１６）
前記シランまたはシラン誘導体が、化学蒸着により前記第１の表面に塗布される、項目１から１５のいずれか一項に記載の基材。
（項目１７）
前記シランまたはシラン誘導体が、Ｙｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＹＥＳ）法により前記第１の表面に塗布される、項目１から１５のいずれか一項に記載の基材。
（項目１８）
前記官能基化分子が、ポリマー、ヒドロゲル、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの組合せを含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の基材。
（項目１９）
前記官能基化分子が、必要に応じて置換されているアルケニル、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、カルボキシル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、またはチオールから選択される官能基を含み、但し、該官能基化分子はノルボルネンでも重合ノルボルネンでもない、項目１８に記載の基材。
（項目２０）
前記官能基化分子が、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンもしくはチオール、またはそれらの組合せから選択される１つまたは複数の官能基を含むヒドロゲルまたはポリマーである、項目１から１９のいずれか一項に記載の基材。
（項目２１）
前記官能基化分子が、式（Ｉ）の繰り返し単位および式（ＩＩ）の繰り返し単位

（式中、
Ｒ １ は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ Ａ は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオールからなる群から選択され、
Ｘは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンリンカーであり、
Ｒ ４ 、Ｒ ４’ 、Ｒ ５ およびＲ ５’ は、Ｈ、Ｒ ６ 、ＯＲ ６ 、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ ６ 、−Ｃ（Ｏ）Ｒ ６ 、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ ６ 、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ ７ Ｒ ８ または−ＮＲ ７ Ｒ ８ からそれぞれ独立して選択され、
Ｒ ６ は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、または必要に応じて置換されているそれらの改変体から独立して選択され、
Ｒ ７ およびＲ ８ は、Ｈまたはアルキルからそれぞれ独立して選択されるか、Ｒ ７ およびＲ ８ は、それらが結合している１個または複数の原子と一緒になって複素環を形成する）
を含む、項目２０に記載の基材。
（項目２２）
前記官能基化分子が、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマー

（Ｒ １ は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルであり、
Ｒ Ａ は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジンおよびチオールからなる群から選択され、
Ｒ ５ は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルから選択され、
−（ＣＨ ２ ）−ｐのそれぞれは、必要に応じて置換することができ、
ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である）
を含む、項目２０に記載の基材。
（項目２３）
ｐが５である、項目２２に記載の基材。
（項目２４）
前記官能基化分子がアジド基を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の基材。
（項目２５）
前記官能基化分子が、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）である、項目２４に記載の基材。
（項目２６）
シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第２の複数の不飽和部分を介して前記官能基化分子に共有結合しているオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の基材。
（項目２７）
前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているシクロオクチンである、項目２６に記載の基材。
（項目２８）
前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニンから選択される、項目２６に記載の基材。
（項目２９）
前記必要に応じて置換されているビシクロノニンがビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを含む、項目２８に記載の基材。
（項目３０）
ガラス基材、シリカ基材、プラスチック基材、石英基材、金属基材、金属酸化物基材、またはそれらの組合せから選択される、項目１から２９のいずれか一項に記載の基材。
（項目３１）
ガラスを含む、項目３０に記載の基材。
（項目３２）
前記第１の表面が、官能基化分子コーティング領域と不活性領域との両方を含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の基材。
（項目３３）
前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域または介在領域から選択される、項目３２に記載の基材。
（項目３４）
前記不活性領域がガラスを含む、項目３３に記載の基材。
（項目３５）
官能基を含む官能基化分子を基材の第１の表面に固定化する方法であって、
シランまたはシラン誘導体に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第１の複数の不飽和部分を含む該シランまたはシラン誘導体を該基材の該第１の表面に塗布する工程、および
該官能基化分子の該官能基を該第１の複数の不飽和部分と反応させることにより、該官能基化分子を該シランまたはシラン誘導体に共有結合させて、コーティング層を形成する工程
を含む、方法。
（項目３６）
シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第２の複数の不飽和部分を含むオリゴヌクレオチドを用意する工程、
該オリゴヌクレオチドの該第２の複数の不飽和部分を前記官能基化分子の前記官能基と反応させて、共有結合を形成する工程
をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第１の複数の不飽和部分が、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記第２の複数の不飽和部分が、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記シランまたはシラン誘導体の前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているノルボルネンである、項目３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記シランまたはシラン誘導体の前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているシクロオクチンである、項目３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記シランまたはシラン誘導体の前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニンから選択される、項目３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記必要に応じて置換されているビシクロノニンがビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記オリゴヌクレオチドの前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているシクロオクチンである、項目３６から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記オリゴヌクレオチドの前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニンから選択される、項目３６から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記必要に応じて置換されているビシクロノニンがビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記シランまたはシラン誘導体が、以下の式

（式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ は、水素、ハロゲン、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているアリールオキシ、必要に応じて置換されているヘテロアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールオキシからそれぞれ独立して選択される）
を含む、項目３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ が、独立して必要に応じて置換されているアルコキシである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ のそれぞれがメトキシである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記シランまたはシラン誘導体が、ケイ素原子と前記第１の複数の不飽和部分との間に共有結合しているリンカーをさらに含む、項目３５から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロアルキレン、必要に応じて置換されているシクロアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、必要に応じて置換されているポリエチレングリコール、開裂可能なリンカー、またはそれらの組合せから選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレンまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンから選択される、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５２）
前記リンカーが必要に応じて置換されているエチレンである、項目４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記リンカーが、開裂可能なリンカーである、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５４）
前記開裂可能なリンカーが、（−Ｓ−Ｓ−）、エステル、ニトロベンゼン、イミン、ペプチドまたはポリヌクレオチドから選択される、項目５０または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記シランまたはシラン誘導体が、化学蒸着により前記第１の表面に塗布される、項目３５から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記シランまたはシラン誘導体が、Ｙｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＹＥＳ）法により前記第１の表面に塗布される、項目３５から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記官能基化分子が、ポリマー、ヒドロゲル、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの組合せを含む、項目３５から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記官能基化分子が、必要に応じて置換されているアルケニル、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、カルボキシル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、またはチオールから選択される官能基を含み、但し、該官能基化分子はノルボルネンでも重合ノルボルネンでもない、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記官能基化分子が、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンもしくはチオール、またはそれらの組合せから選択される１つまたは複数の官能基を含むヒドロゲルまたはポリマーである、項目３５から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記官能基化分子が、式（Ｉ）の繰り返し単位および式（ＩＩ）の繰り返し単位

（式中、
Ｒ １ は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ Ａ は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオールからなる群から選択され、
Ｘは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンリンカーであり、
Ｒ ４ 、Ｒ ４’ 、Ｒ ５ およびＲ ５’ は、Ｈ、Ｒ ６ 、ＯＲ ６ 、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ ６ 、−Ｃ（Ｏ）Ｒ ６ 、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ ６ 、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ ７ Ｒ ８ または−ＮＲ ７ Ｒ ８ からそれぞれ独立して選択され、
Ｒ ６ は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、または必要に応じて置換されているそれらの改変体から独立して選択され、
Ｒ ７ およびＲ ８ は、Ｈまたはアルキルからそれぞれ独立して選択されるか、またはＲ ７ およびＲ ８ は、それらが結合している１個または複数の原子と一緒になって複素環を形成する）
を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記官能基化分子が、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）

（Ｒ １ は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルであり、
Ｒ Ａ は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオールからなる群から選択され、
Ｒ ５ は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルから選択され、
−（ＣＨ ２ ）−ｐのそれぞれは、必要に応じて置換することができ、
ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である）
を含むポリマーを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
ｐが５である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記官能基化分子がアジド基を含む、項目３５から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記基材が、ガラス基材、シリカ基材、プラスチック基材、石英基材、金属基材、金属酸化物基材、またはそれらの組合せから選択される、項目３５から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記基材がガラスを含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の表面が、官能基化分子コーティング領域と不活性領域との両方を含む、項目３５から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域または介在領域から選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記不活性領域がガラスを含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
過剰の非結合官能基化分子を除去するための洗浄工程をさらに含む、項目３５から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
乾燥工程をさらに含む、項目３５から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
基材の第１の表面にプライマーをグラフトする方法であって、
該基材の第１の表面にコーティング層を含む基材を用意する工程であって、該コーティング層が、シランまたはシラン誘導体の第１の複数の不飽和部分を介して官能基化分子に共有結合している該シランまたはシラン誘導体を含み、該第１の複数の不飽和部分が、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されている改変体もしくはそれらの組合せから選択され、該官能基化分子が官能基を含む、工程、
シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される第２の複数の不飽和部分を含むオリゴヌクレオチドを該コーティング層に接触させる工程、および
該オリゴヌクレオチドの該第２の複数の不飽和部分を該官能基化分子の該官能基と反応させて、共有結合を形成する工程
を含む、方法。
（項目７２）
前記コーティング層が、
前記第１の複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体を前記基材の前記第１の表面に塗布する工程、および
前記官能基化分子の前記官能基を該第１の複数の不飽和部分と反応させることにより、該官能基化分子を該シランまたはシラン誘導体に共有結合させる工程
により調製される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
基材の第１の表面にプライマーをグラフトする方法であって、
シランまたはシラン誘導体を含む第１の表面を有する基材を用意する工程であって、該シランまたはシラン誘導体が、該シランまたはシラン誘導体に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される該第１の複数の不飽和部分を該基材の該第１の表面に含む、工程、
官能基化分子に共有結合しているオリゴヌクレオチドを含む予めコンジュゲートされているプライマーを用意する工程であって、該官能基化分子が官能基を含む、工程、および
該官能基化分子の該官能基を該シランまたはシラン誘導体の該第１の複数の不飽和部分と反応させて共有結合を形成することにより、該予めコンジュゲートされているプライマーが該基材の該第１の表面に共有結合するように、該予めコンジュゲートされているプライマーを該シランまたはシラン誘導体に接触させる工程
を含む、方法。
（項目７４）
前記予めコンジュゲートされているプライマーが、前記官能基化分子の前記官能基を前記オリゴヌクレオチドの第２の複数の不飽和部分と反応させて、共有結合を形成することにより調製され、該オリゴヌクレオチドの該第２の複数の不飽和部分は、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記第１の複数の不飽和部分および前記第２の複数の不飽和部分が、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、シクロオクチン、ビシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから独立して選択される、項目７１、７２および７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記シランまたはシラン誘導体の前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているノルボルネンである、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記シランまたはシラン誘導体の前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているシクロオクチンである、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記シランまたはシラン誘導体の前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニンである、項目７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記ビシクロノニンが、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インである、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記オリゴヌクレオチドの前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているシクロオクチンである、項目７１、７２、および７４から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記オリゴヌクレオチドの前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニンである、項目７１、７２、および７４から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記ビシクロノニンが、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インである、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記シランまたはシラン誘導体が、以下の式

（式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ は、水素、ハロゲン、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているアリールオキシ、必要に応じて置換されているヘテロアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールオキシからそれぞれ独立して選択される）
を含む、項目７１から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ が、独立して必要に応じて置換されているアルコキシである、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ のそれぞれがメトキシである、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記シランまたはシラン誘導体が、ケイ素原子と前記第１の複数の不飽和部分との間に共有結合しているリンカーをさらに含む、項目７１から８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロアルキレン、必要に応じて置換されているシクロアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、必要に応じて置換されているポリエチレングリコール、開裂可能なリンカー、またはそれらの組合せから選択される、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレンまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンから選択される、項目８６または８７に記載の方法。
（項目８９）
前記リンカーが必要に応じて置換されているエチレンである、項目８６から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記リンカーが、開裂可能なリンカーである、項目８６または８７に記載の方法。
（項目９１）
前記開裂可能なリンカーが、（−Ｓ−Ｓ−）、エステル、ニトロベンゼン、イミン、ペプチドまたはポリヌクレオチドから選択される、項目８７または９０に記載の方法。
（項目９２）
前記シランまたはシラン誘導体が、化学蒸着により前記第１の表面に塗布される、項目７１から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記シランまたはシラン誘導体が、Ｙｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＹＥＳ）法により前記第１の表面に塗布される、項目７１から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記官能基化分子が、ポリマー、ヒドロゲル、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの組合せを含む、項目７１から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記官能基化分子が、必要に応じて置換されているアルケニル、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、カルボキシル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、またはチオールから選択される官能基を含み、但し、該官能基化分子はノルボルネンでも重合ノルボルネンでもない、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記官能基化分子が、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンもしくはチオール、またはそれらの組合せから選択される官能基を含むヒドロゲルまたはポリマーである、項目７１から９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記官能基化分子が、式（Ｉ）の繰り返し単位および式（ＩＩ）の繰り返し単位

（式中、
Ｒ １ は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ Ａ は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオールからなる群から選択され、
Ｘは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンリンカーであり、
Ｒ ４ 、Ｒ ４’ 、Ｒ ５ およびＲ ５’ は、Ｈ、Ｒ ６ 、ＯＲ ６ 、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ ６ 、−Ｃ（Ｏ）Ｒ ６ 、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ ６ 、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ ７ Ｒ ８ または−ＮＲ ７ Ｒ ８ からそれぞれ独立して選択され、
Ｒ ６ は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、または必要に応じて置換されているそれらの改変体から独立して選択され、
Ｒ ７ およびＲ ８ は、Ｈまたはアルキルからそれぞれ独立して選択されるか、またはＲ ７ およびＲ ８ は、それらが結合している１個または複数の原子と一緒になって複素環を形成する）
を含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記官能基化分子が、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）

（Ｒ １ は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルであり、
Ｒ Ａ は、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオールからなる群から選択され、
Ｒ ５ は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルから選択され、
−（ＣＨ ２ ）−ｐのそれぞれは、必要に応じて置換することができ、
ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である）
を含むポリマーを含む、項目９６に記載の方法。
（項目９９）
ｐが５である、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記官能基化分子がアジド基を含む、項目７１から９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記基材が、ガラス基材、シリカ基材、プラスチック基材、石英基材、金属基材、金属酸化物基材、またはそれらの組合せから選択される、項目７１から１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記基材がガラスを含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記第１の表面が、官能基化分子コーティング領域と不活性領域との両方を含む、項目７１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域もしくは介在領域、またはそれらの組合せから選択される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記不活性領域がガラスを含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
過剰の非結合官能基化分子を除去するための洗浄工程をさらに含む、項目７１から１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
過剰の非結合オリゴヌクレオチドを除去するための洗浄工程をさらに含む、項目７１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
乾燥工程をさらに含む、項目７１から１０７のいずれか一項に記載の方法。

図１Ａは、ノルボルネン−シラン誘導体［（５−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エニル）エチル］トリメトキシシラン（１ａ）によりシラン処理し、続いて、ＰＡＺＡＭによりコーティングして熱的に架橋したガラス基材を示す。
図１Ｂは、相補的なＴＥＴ色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせた、グラフトノルボルネンシラン誘導体（１ａ）によるシラン処理／ＰＡＺＡＭコーティングした非パターン化表面のＴｙｐｈｏｏｎ強度中央値の関連グラフを示す。
図２Ａは、ノルボルネン−シラン誘導体（１ａ）によりシラン処理し、続いて、ＰＡＺＡＭによりコーティングして熱的に架橋した、ナノウェルによりパターン化したガラス基材を示す。
図２Ｂは、相補的なＴＥＴ色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせた、グラフトノルボルネンシラン誘導体（１ａ）によるシラン処理／ＰＡＺＡＭコーティングした非パターン化表面の蛍光強度中央値の関連グラフを示す。
図３Ａは、アクリルアミド官能基化基材を使用する、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。
図３Ｂは、ノルボルネンシラン誘導体（１ａ）によりシラン処理したＰＡＺＡＭコーティング基材を使用する、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。
図３Ｃは、０．２５％ＰＡＺＡＭ水溶液が、ノルボルネンシラン誘導体（１ａ）によりシラン処理した表面を湿らせていることを示している。
図４は、実施例１において記載されている手順によって調製した基材に由来する、グラフトプライマーの配列決定メトリクスを示す。
図５Ａは、ＢＣＮ修飾プライマーを用いる、銅不含グラフト法を使用する、基材のグラフト表面の初期Ｔｙｐｈｏｏｎ画像を示す。
図５Ｂは、ＢＣＮ修飾プライマーによりＰＡＺＡＭ表面をグラフトした後の初期ＴＥＴ ＱＣデータ、および熱応力試験後に測定された表面減少率を例示する、線グラフおよび棒グラフである。
図６Ａは、銅不含グラフト法および様々な濃度のＢＣＮ修飾プライマーを用いる、基材のグラフト表面の初期Ｔｙｐｈｏｏｎ画像を示す。
図６Ｂは、様々な濃度のＢＣＮ修飾プライマーによりＰＡＺＡＭ表面をグラフトした後の初期ＴＥＴ ＱＣデータ、および熱応力試験後に測定された表面減少率を例示する、線グラフおよび棒グラフである。
図７Ａは、低クラスター密度を有する、ＢＣＮ修飾プライマーでグラフトした表面から成長したクラスターの蛍光画像を示している。
図７Ｂは、高クラスター密度を有する、ＢＣＮ修飾プライマーでグラフトした表面から成長したクラスターの蛍光画像を示している。
図８ＡＢは、標準ＨｉＳｅｑシステムから得られた予めコンジュゲートされているＰＡＺＡＭ混合物によりコーティングされたチャネルの両面に由来する、クラスターのサムネイル画像を示す。
図９は、標準ＭｉＳｅｑシステムから得られた予めコンジュゲートされているＰＡＺＡＭ混合物によりコーティングされたチャネルの一面に由来する、クラスターのサムネイル画像を示す。
本発明の実施形態は、シランまたはシラン誘導体のケイ素原子に共有結合している、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、またはヘテロシクロアルキンから選択される必要に応じて置換されている不飽和部分を有するシランまたはシラン誘導体により官能基化した基材の表面への官能基化分子のコンジュゲートに関する。一実施形態において、官能基化分子は、基材に結合させるのが望まれる、ヒドロゲル、ポリマーまたは他の分子である。一部の実施形態において、この官能基化分子は、［（５−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エニル）エチル］トリメトキシシランなどのノルボルネン誘導体化シランなどのノルボルネン誘導体を介して、表面にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、官能基化分子は、シクロオクチンまたはビシクロノニン誘導体化シラン（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン誘導体化シラン）またはそれらの混合物などのシクロアルキン誘導体化シランを介して、表面にコンジュゲートされる。
一部の実施形態は、ノルボルネン誘導体化シラン連結基、シクロオクチン誘導体化シラン連結基、またはビシクロノニン誘導体化シラン連結基を介して、ガラス基材にコンジュゲートされたポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）（「ＰＡＺＡＭ」）などのヒドロゲルを含む、シークエンシング−バイ−シンセシス反応を実施するためのフローセルに関する。
一部の実施形態は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン誘導体化連結基などのシクロオクチンまたはビシクロノニン誘導体化連結基を介して、ヒドロゲルまたはポリマーコーティングされた基材にコンジュゲートされているＰ５またはＰ７プライマーなどのオリゴヌクレオチドを含む、シークエンシング−バイ−シンセシス反応を実施するためのフローセルに関する。
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照される、特許、出願、出願公開、および他の刊行物はすべて、特に明記されない限り、それらの全体が、参照により組み込まれている。本明細書における用語に対して複数の定義が存在する場合、特に明記されない限り、この項目におけるものが優先する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示物を含む。特に示さない限り、質量分光法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換え型ＤＮＡ技法、および薬理学の従来の方法が用いられる。「または」または「および」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的なものではない。本明細書において使用する場合、移行句においてまたは請求項の本体においてに関わりなく、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンエンドな意味を有すると解釈されるものとする。すなわち、この用語は、句「少なくとも有する」または「少なくとも含む」と同義語として解釈されるものとする。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、方法の文脈において使用する場合、少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含んでもよいことを意味する。化合物、組成物またはデバイスの文脈において使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、該化合物、組成物またはデバイスが、少なくとも列挙された特徴または構成要素を含むが、追加の特徴または構成要素も含んでもよいことを意味する。
本明細書において使用される見出し項目は、構成上の目的に過ぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用する場合、一般的な有機物の略語は、以下の通り定義される：
Ａｃ アセチル
Ａｃ２Ｏ 無水酢酸
ＡＰＴＳ アミノプロピルシラン
ＡＰＴＥＳ （３−アミノプロピル）トリエトキシシラン
ＡＰＴＭＳ （３−アミノプロピル）トリメトキシシラン
ａｑ． 水性
Ａｚａｐａ Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド
ＢＣＮ ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン
ＢＨＴ ブチル化ヒドロキシルトルエン
Ｂｎ ベンジル
ＢｒａｐａまたはＢＲＡＰＡ Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド
Ｂｚ ベンゾイル
ＢＯＣまたはＢｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｕ ｎ−ブチル
ｃａｔ． 触媒的な
Ｃｂｚ カルボベンジルオキシ
ＣＭＰ 化学機械研磨
ＣｙＣｌ 塩化シアヌル
ＣＶＤ 化学蒸着
℃ 摂氏度での温度
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸
ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸
ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸
ｄＴＴＰ デオキシチミジン三リン酸
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＡ ジクロロ酢酸
ＤＣＥ １，２−ジクロロエタン
ＤＣＭ 塩化メチレン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ ジメチルアセトアミド
ＤＭＥ ジメトキシエタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド
Ｅｔ エチル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ｇ グラム
ＧＰＣ ゲル浸透クロマトグラフィー
ｈまたはｈｒ 時間
ｉＰｒ イソプロピル
ＫＰｉ ｐＨ７．０における１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
ＫＰＳ ペルオキソ過硫酸カリウム
ＩＰＡ イソプロピルアルコール
ＬＣＭＳ 液体クロマトグラフィー−質量分光法
ＬＤＡ リチウムジイソプロピルアミド
ｍまたはｍｉｎ 分
ｍＣＰＢＡ メタ−クロロ過安息香酸
ＭｅＯＨ メタノール
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ｍＬ ミリリットル
ＭＴＢＥ メチル三級−ブチルエーテル
ＮａＮ３ アジ化ナトリウム
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＨＳ−ＡＡ アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＰＡＺＡＭ アクリルアミドとＡｚａｐａとが任意の比のポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）
ＰＧ 保護基
Ｐｈ フェニル
ＰＭＥＤＴＡ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン
ｐｐｔ 沈殿物
ｒｔ 室温
ＳＢＳ シークエンシング−バイ−シンセシス
ＳＦＡ 米国特許公開第２０１１／００５９８６５号において定義されているシラン不含アクリルアミド
スルホ−ＨＳＡＢまたはＳＨＳＡＢ Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ａｚｉｄｏｂｅｎｏａｔｅ）
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＥＭＰＯ （２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシル
ＴＣＤＩ １，１’−チオカルボニルジイミダゾール
Ｔｅｒｔ、ｔ 三級
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＥＭＥＤ テトラメチルエチレンジアミン
ＹＥＳ Ｙｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
μＬ マイクロリットル
本明細書で使用する場合、用語「アレイ」とは、様々なプローブ分子が、相対的な位置に従って互いに区別することができるように、１つまたは複数の基材に結合している様々なプローブ分子の集団を指す。アレイは、基材上の様々なアドレス可能な位置に互いに位置している様々なプローブ分子を含むことができる。代替的または追加的に、アレイは、様々なプローブ分子をそれぞれ保有する個別の基材を含むことができ、様々なプローブ分子は、基材が結合している表面の基材の位置に従って、または液体における基材の位置に従って特定することができる。個別の基材がその表面に位置している例示的なアレイには、非限定的に、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、ＵＳ２００２／０１０２５７８、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６３４３７に記載されている、ウェルにおけるビーズを含むものが挙げられる。例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などのマイクロ流体デバイスを使用して、液体アレイにおけるビーズを識別するために本出願において使用することができる例示的なフォーマットは、例えば、米国特許第６，５２４，７９３号において記載されている。本出願において使用することができるアレイのさらなる例には、非限定的に、米国特許第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５８３，２１１号、同第５，６５８，７３４号、同第５，８３７，８５８号、同第５，８７４，２１９号、同第５，９１９，５２３号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２８７，７６８号、同第６，２８７，７７６号、同第６，２８８，２２０号、同第６，２９７，００６号、同第６，２９１，１９３号、同第６，３４６，４１３号、同第６，４１６，９４９号、同第６，４８２，５９１号、同第６，５１４，７５１号および同第６，６１０，４８２号、ならびにＷＯ９３／１７１２６、ＷＯ９５／１１９９５、ＷＯ９５／３５５０５、ＥＰ７４２２８７およびＥＰ７９９８９７に記載されているものが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子間の対電子を共有することを特徴とする、化学結合の形成を指す。例えば、共有結合しているポリマーコーティングとは、他の手段、例えば接着、静電的相互作用を介した表面への結合と比較すると、基材の官能基化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合しているポリマーはまた、共有結合の他の手段、例えば物理吸着により結合し得ることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「ａ」および「ｂ」が整数である「Ｃａ〜Ｃｂ」または「Ｃａ〜ｂ」は、指定した基中の炭素原子数を指す。すなわち、この基は、「ａ」〜「ｂ」個を含む炭素原子を含有することができる。したがって、例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」または「Ｃ１〜４アルキル」基とは、１〜４個の炭素を有するすべてのアルキル基、すなわち、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−および（ＣＨ３）３Ｃ−を指す。
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、本明細書で使用する場合、元素周期表の７列目の放射安定な原子のいずれか１つ、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
本明細書で使用する場合、「アルキル」とは、完全に飽和されている（すなわち、二重結合も三重結合も含有しない）線状または分岐状炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１〜２０個の炭素原子（本明細書において現れる場合はいつでも、「１〜２０個」などの数値範囲は、所与の範囲内の各整数を指し、例えば、「１〜２０個の炭素原子」とは、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、最大２０個を含む炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が表されていない用語「アルキル」の出現にも及ぶ）を有することができる。アルキル基はまた、１〜９個の炭素原子を有する中間サイズのアルキルであってもよい。アルキル基はまた、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルとすることもできる。アルキル基は、「Ｃ１〜４アルキル」または類似の命名として表されてもよい。単なる例として、「Ｃ１〜４アルキル」は、アルキル鎖中に１〜４個の炭素原子が存在していることを指し、すなわち、このアルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基には、決して限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「アルコキシ」とは、式−ＯＲを指し、ここで、Ｒは、以下に限定されないがメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシなどを含む、「Ｃ１〜９アルコキシ」などの、上で定義されているアルキルである。
本明細書で使用する場合、「アルキルチオ」とは、式−ＳＲを指し、ここで、Ｒは、以下に限定されないがメチルメルカプト、エチルメルカプト、ｎ−プロピルメルカプト、１−メチルエチルメルカプト（イソプロピルメルカプト）、ｎ−ブチルメルカプト、イソ−ブチルメルカプト、ｓｅｃ−ブチルメルカプト、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプトなどを含む、「Ｃ１〜９アルキルチオ」などの、上で定義されているアルキルである。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」とは、１つまたは複数の二重結合を含有する、線状または分岐状炭化水素鎖を指す。アルケニル基は２〜２０個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「アルケニル」という用語の出現にも及ぶ。アルケニル基はまた、２〜９個の炭素原子を有する中間サイズのアルケニルであってもよい。アルケニル基はまた、２〜４個の炭素原子を有する低級アルケニルとすることもできる。アルケニル基は、「Ｃ２〜４アルケニル」または類似の命名として表されてもよい。単なる例として、「Ｃ２〜４アルケニル」は、アルケニル鎖中に２〜４個の炭素原子が存在していることを示し、すなわち、アルケニル鎖は、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、プロペン−３−イル、ブテン−１−イル、ブテン−２−イル、ブテン−３−イル、ブテン−４−イル、１−メチル−プロペン−１−イル、２−メチル−プロペン−１−イル、１−エチル−エテン−１−イル、２−メチル−プロペン−３−イル、ブタ−１，３−ジエニル、ブタ−１，２，−ジエニル、およびブタ−１，２−ジエン−４−イルからなる群から選択される。典型的なアルケニル基には、決して限定されないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニルなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「アルキニル」とは、１つまたは複数の三重結合を含有する、線状または分岐状炭化水素鎖を指す。アルキニル基は２〜２０個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「アルキニル」という用語の出現にも及ぶ。アルキニル基はまた、２〜９個の炭素原子を有する中間サイズのアルキニルであってもよい。アルキニル基はまた、２〜４個の炭素原子を有する低級アルキニルとすることもできる。アルキニル基は、「Ｃ２〜４アルキニル」または類似の命名として表されてもよい。単なる例として、「Ｃ２〜４アルキニル」は、アルキニル鎖中に２〜４個の炭素原子が存在していることを指し、すなわち、アルキニル鎖は、エチニル、プロピン−１−イル、プロピン−２−イル、ブチン−１−イル、ブチン−３−イル、ブチン−４−イルおよび２−ブチニルからなる群から選択される。典型的なアルキニル基には、決して限定されないが、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアルキル」とは、１個または複数のヘテロ原子、すなわち以下に限定されないが、鎖骨格に窒素、酸素および硫黄を含めた、炭素以外の元素を含有する線状または分岐状炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は１〜２０個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「ヘテロアルキル」という用語の出現にも及ぶ。ヘテロアルキル基はまた、１〜９個の炭素原子を有する中間サイズのヘテロアルキルであってもよい。ヘテロアルキル基はまた、１〜４個の炭素原子を有する低級ヘテロアルキルとすることもできる。ヘテロアルキル基は、「Ｃ１〜４ヘテロアルキル」または類似の命名として表されてもよい。ヘテロアルキル基は、１個または複数のヘテロ原子を含有してもよい。単なる例として、「Ｃ１〜４ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖中に１〜４個の炭素原子、およびさらにはこの鎖の骨格中に１個または複数のヘテロ原子が存在していることを示す。
本明細書で使用する場合、「アルキレン」は、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している炭素と水素だけを含有する完全に飽和な分岐鎖または直鎖のジラジカル化学基（すなわち、アルカンジイル）を意味する。アルキレン基は１〜２０，０００個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、アルキレンという用語の出現にも及ぶ。アルキレン基はまた、１〜９個の炭素原子を有する中間サイズのアルキレンであってもよい。アルキレン基はまた、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキレンとすることもできる。アルキレン基は、「Ｃ１〜４アルキレン」または類似の命名として表されてもよい。単なる例として、「Ｃ１〜４アルキレン」は、アルキレン鎖中に１〜４個の炭素原子が存在していることを示し、すなわち、アルキレン鎖は、メチレン、エチレン、エタン−１，１−ジイル、プロピレン、プロパン−１，１−ジイル、プロパン−２，２−ジイル、１−メチル−エチレン、ブチレン、ブタン−１，１−ジイル、ブタン−２，２−ジイル、２−メチル−プロパン−１，１−ジイル、１−メチル−プロピレン、２−メチル−プロピレン、１，１−ジメチル−エチレン、１，２−ジメチル−エチレン、および１−エチル−エチレンからなる群から選択される。
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロアルキレン」とは、アルキレンの１個または複数の骨格原子が、炭素以外の原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンまたはそれらの組合せから選択される、アルキレン鎖を指す。ヘテロアルキレン鎖は、２〜２０，０００個の長さを有することができる。例示的なヘテロアルキレンには、以下に限定されないが、−ＯＣＨ２−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）−、−ＯＣ（ＣＨ３）２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−、−ＳＣ（ＣＨ３）２−、−ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）−、−ＮＨＣ（ＣＨ３）２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、− −ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−などが含まれる。
本明細書で使用する場合、「アルケニレン」は、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、炭素と水素だけを含有する直鎖または分岐鎖のジラジカル化学基を意味する。アルケニレン基は２〜２０，０００個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、アルケニレンという用語の出現にも及ぶ。アルケニレン基はまた、２〜９個の炭素原子を有する中間サイズのアルケニレンであってもよい。アルケニレン基はまた、２〜４個の炭素原子を有する低級アルケニレンとすることもできる。アルケニレン基は、「Ｃ２〜４アルケニレン」または類似の命名として表されてもよい。単なる例として、「Ｃ２〜４アルケニレン」は、アルケニレン鎖中に２〜４個の炭素原子が存在していることを示し、すなわち、アルケニレン鎖は、エテニレン、エテン−１，１−ジイル、プロペニレン、プロペン−１，１−ジイル、プロパ−２−エン−１，１−ジイル、１−メチル−エテニレン、ブタ−１−エニレン、ブタ−２−エニレン、ブト−１，３−ジエニレン、ブテン−１，１−ジイル、ブト−１，３−ジエン−１，１−ジイル、ブタ−２−エン−１，１−ジイル、ブタ−３−エン−１，１−ジイル、１−メチル−プロパ−２−エン−１，１−ジイル、２−メチル−プロパ−２−エン−１，１−ジイル、１−エチル−エテニレン、１，２−ジメチル−エテニレン、１−メチル−プロペニレン、２−メチル−プロペニレン、３−メチル−プロペニレン、２−メチル−プロペン−１，１−ジイル、および２，２−ジメチル−エテン−１，１−ジイルからなる群から選択される。
本明細書で使用する場合、「アルキニレン」は、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、炭素と水素だけを含有する直鎖または分岐鎖のジラジカル化学基を意味する。
用語「芳香族性」とは、共役パイ電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香族基（例えば、フェニル）とヘテロ環式芳香族基（例えば、ピリジン）との両方を含む。この用語には、単環式、または多環式縮合環（すなわち、隣接する一対の原子を共有する環）基が含まれるが、但し環系全体が芳香族性である。
本明細書で使用する場合、「アリール」とは、環骨格に炭素しか含有していない芳香族環または環系（すなわち、２個の隣接炭素原子を共有する２個またはそれ超の縮合環）を指す。アリールが環系である場合、この系の各環は芳香族性である。アリール基は６〜１８個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「アリール」という用語の出現にも及ぶ。一部の実施形態において、アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ６〜１０アリール」、「Ｃ６またはＣ１０アリール」、または類似の命名として表されてもよい。アリール基の例には、以下に限定されないが、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが含まれる。
本明細書で使用する場合、「アリーレン」とは、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している、炭素と水素だけを含有する芳香族環または環系を指す。
本明細書で使用する場合、「アリールオキシ」および「アリールチオ」とは、ＲＯ−およびＲＳ−を指し、ここで、Ｒは、以下に限定されないが、フェニルオキシを含む、「Ｃ６〜１０アリールオキシ」または「Ｃ６〜１０アリールチオ」などの、上で定義されているアリールである。
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、以下に限定されないが、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、およびナフチルアルキルを含む、「Ｃ７〜１４アラルキル」などのアルキレン基を介して、置換基として接続しているアリール基である。一部の場合、アルキレン基は低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１〜４アルキレン基）である。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」とは、環骨格中に、１個または複数のヘテロ原子、すなわち、以下に限定されないが、窒素、酸素および硫黄を含む炭素以外の元素を含有する、芳香族環または環系（すなわち、２個の隣接原子を共有する２個またはそれ超の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、この系の各環は芳香族性である。ヘテロアリール基は５〜１８個の環員（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子数）を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「ヘテロアリール」という用語の出現にも及ぶ。一部の実施形態において、ヘテロアリール基は、５〜１０個の環員または５〜７個の環員を有する。ヘテロアリール基は、「５〜７員のヘテロアリール」、「５〜１０員のヘテロアリール」、または類似の命名として表されてもよい。ヘテロアリール環の例には、以下に限定されないが、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキンリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアリーレン」とは、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している、環骨格中に１個または複数のヘテロ原子を含有する芳香族環または環系を指す。
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、アルキレン基を介して、置換基として接続しているヘテロアリール基である。例には、以下に限定されないが、２−チエニルメチル、３−チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが含まれる。一部の場合、アルキレン基は低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１〜４アルキレン基）である。
本明細書で使用する場合、「カルボシクリル」は、環系の骨格に、炭素原子しか含有していない非芳香族環式環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つまたはそれ超の環は、一緒になって、縮合、架橋またはスピロ接続様式であってもよい。カルボシクリルは、任意の飽和度を有してもよいが、但し、環系の少なくとも１つの環は、芳香族性ではない。すなわち、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は３〜２０個の炭素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「カルボシクリル」という用語の出現にも及ぶ。カルボシクリル基はまた、３〜１０個の炭素原子を有する中間サイズのカルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基はまた、３〜６個の炭素原子を有するカルボシクリルとすることもできる。カルボシクリル基は、「Ｃ３〜６カルボシクリル」または類似の命名として表されてもよい。カルボシクリル環の例には、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３−ジヒドロ−インデン、ビシクロ（ｂｉｃｙｃｌｅ）［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが含まれる。
「（カルボシクリル）アルキル」は、以下に限定されないが、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロプロピルエチル、シクロプロピルブチル、シクロブチルエチル、シクロプロピルイソプロピル、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロヘプチルメチルなどを含む、「Ｃ４〜１０（カルボシクリル）アルキル」などの、アルキレン基を介して置換基として接続しているカルボシクリル基である。一部の場合、アルキレン基は、低級アルキレン基である。
本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和されているカルボシクリル環または環系を意味する。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれる。
本明細書で使用する場合、「シクロアルキレン」は、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している、完全に飽和されているカルボシクリル環または環系を意味する。
本明細書で使用する場合、「シクロアルケニル」または「シクロアルケン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの二重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味する。例は、シクロヘキセニルまたはシクロヘキセンである。別の例は、ノルボルネンまたはノルボルネニルである。
本明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルケニル」または「ヘテロシクロアルケン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの二重結合を有する、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味する。
本明細書で使用する場合、「シクロアルキニル」または「シクロアルキン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの三重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味する。例は、シクロオクチンである。別の例は、ビシクロノニンである。
本明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルキニル」または「ヘテロシクロアルキン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの三重結合を有する、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味する。
本明細書で使用する場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、一緒になって、縮合、架橋またはスピロ接続様式であってもよい。ヘテロシクリルは、任意の飽和度を有してもよいが、但し、環系の少なくとも１つの環は、芳香族性ではない。ヘテロ原子は、環系において、非芳香族環または芳香族環中のどちらかで存在し得る。ヘテロシクリル基は３〜２０個の環員（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子数）を有することができるが、本定義は、数値範囲が表されていない、「ヘテロシクリル」という用語の出現にも及ぶ。ヘテロシクリル基はまた、３〜１０個の環員を有する中間サイズのヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基はまた、３〜６個の環員を有するヘテロシクリルとすることもできる。ヘテロシクリル基は、「３〜６員のヘテロシクリル」または類似の命名として表されてもよい。好ましい６員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、１個から最大３個のＯ、ＮまたはＳからから選択され、好ましい５員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１個または２個のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例には、以下に限定されないが、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジオニル、４−ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３−ジオキシニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキシニル、１，４−ジオキサニル、１，３−オキサチアニル、１，４−オキサチイニル、１，４−オキサチアニル、２Ｈ−１，２−オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジニル、１，３−ジオキソリル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオリル、１，３−ジチオラニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３−オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ−１，４−チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヘテロシクリレン」とは、２つの結合点を介して、分子の残りに結合している、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族環または環系を意味する。
「（ヘテロシクリル）アルキル」は、アルキレン基を介して、置換基として接続しているヘテロシクリル基である。例には、以下に限定されないが、イミダゾリニルメチルおよびインドリニルエチルが含まれる。
本明細書で使用する場合、「アシル」とは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルである。非限定例には、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ベンゾイル、およびアクリルが含まれる。
「Ｏ−カルボキシ」基とは「−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルから選択される。
「Ｃ−カルボキシ」基とは「−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルから選択される。非限定例には、カルボキシル（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が含まれる。
「アセタール」基とはＲＣ（Ｈ）（ＯＲ’）２を指し、ここで、ＲおよびＲ’は、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルから独立して選択される。
「シアノ」基とは、「−ＣＮ」基を指す。
「シアナト」基とは、「−ＯＣＮ」基を指す。
「イソシアナト」基とは、「−ＮＣＯ」基を指す。
「チオシアナト」基とは、「−ＳＣＮ」基を指す。
「イソチオシアナト」基とは、「−ＮＣＳ」基を指す。
「スルフィニル」とは「−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルから選択される。
「スルホニル」基とは「−ＳＯ２Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルから選択される。
「Ｓ−スルホンアミド」基とは「−ＳＯ２ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｎ−スルホンアミド」基とは「−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「ニトリルオキシド」とは、本明細書で使用する場合、「ＲＣ≡Ｎ＋Ｏ−」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、または５〜１０員のヘテロシクリルから選択される。ニトリルオキシドを調製する非限定例には、クロラミン（ｃｈｌｏｒａｍｉｄｅ）−Ｔにより処理することにより、または塩化イミドイル［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］に基づく作用により、アルドキシムからのインサイチュ生成が挙げられる。
「ニトロン」とは、本明細書で使用する場合、「ＲＡＲＢＣ＝ＮＲｃ ＋Ｏ−」基を指し、ここで、ＲＡ、ＲＢおよびＲｃは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、または５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｏ−カルバミル」基とは「−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｎ−カルバミル」基とは「−Ｎ（ＲＡ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｏ−チオカルバミル」基とは「−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｎ−チオカルバミル」基とは「−Ｎ（ＲＡ）ＯＣ（＝Ｓ）ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｃ−アミド」基とは「−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｎ−アミド」基とは「−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「アミノ」基とは「−ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、本明細書で定義されている通り、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員のヘテロアリール、および５〜１０員のヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。非限定例には、遊離アミノ（すなわち、−ＮＨ２）が含まれる。
「アミノアルキル」基とは、アルキレン基を介して接続しているアミノ基を指す。
「アルコキシアルキル」基は、「Ｃ２〜８アルコキシアルキル」など、アルキレン基を介して接続しているアルコキシ基を指す。
用語「ヒドラジン」または「ヒドラジニル」とは、本明細書で使用する場合、−ＮＨＮＨ２基を指す。
用語「ヒドラゾン」または「ヒドラゾニル」とは、本明細書で使用する場合、
基を指す。
用語「ホルミル」は、本明細書で使用する場合、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を指す。
用語「エポキシ」は、本明細書で使用する場合、
を指す。
用語「エステル」とは、本明細書で使用する場合、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’を指し、ＲおよびＲ’は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、または必要に応じて置換されているそれらの改変体とすることができる。
用語「カルボン酸」または「カルボキシル」とは、本明細書で使用する場合、−Ｃ（Ｏ）ＯＨを指す。
用語「チオシアネート」とは、本明細書で使用する場合、−Ｓ−Ｃ≡Ｎ基を指す。
用語「オキソ−アミン」とは、本明細書で使用する場合、−Ｏ−ＮＨ２基を指し−ＮＨ２の１個または複数の水素は、Ｒ基により必要に応じて置換され得る。Ｒは、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルとすることができる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」には、複素環式塩基、糖、および１つまたは複数のリン酸基を含有する窒素が含まれる。これらは、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、すなわちリボース中の２’位に存在しているヒドロキシル基がない糖である。複素環式塩基を含有する窒素は、プリンまたはピリミジン塩基とすることができる。プリン塩基には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびそれらの修飾誘導体またはアナログが含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、およびそれらの修飾誘導体またはアナログが含まれる。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」とは、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、５’位においていかなるリン酸部分もない。本明細書では、用語「ヌクレオシド」は、当業者により理解されるその通常の意味で使用される。例には、以下に限定されないが、リボース部分を含むリボヌクレオシド、およびデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドが含まれる。修飾ペントース部分は、酸素原子が炭素により置き換えられている、および／または炭素が硫黄原子もしくは酸素原子により置き換えられている、ペントース部分である。「ヌクレオシド」は、置換されている塩基および／または糖の部分を有することができるモノマーである。さらには、ヌクレオシドは、より大きなＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリマーおよびオリゴマーに組み込まれ得る。
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、合成オリゴヌクレオチドおよび合成核酸アナログを含めた、核酸を指す。ポリヌクレオチドは、天然もしくは非天然の塩基、またはそれらの組合せ、および天然もしくは非天然の骨格連結、例えば、ホスホロチオエート、ＰＮＡまたは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、またはそれらの組合せを含むことができる。
本明細書で使用する場合、「ＢＣＮプライマー」または「ＢＣＮ修飾プライマー」とは、５’末端において、共有結合しているビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを含むプライマーを指す。プライマーは、カップリング反応を可能にする遊離３’ＯＨ基および５’末端に修飾基を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子として定義される。プライマーの長さは、任意の数の塩基の長さとすることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「シラン」とは、１個または複数のケイ素原子を含有する有機または無機有機化合物を指す。無機シラン化合物の非限定例は、ＳｉＨ４、または水素が１個もしくは複数のハロゲン原子により置き換えられているハロゲン化ＳｉＨ４である。有機シラン化合物の非限定例は、Ｘ−ＲＣ−Ｓｉ（ＯＲＤ）３であり、Ｘは、アミノ、ビニル、エポキシ、メタクリレート、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニルなどの加水分解が不可能な有機基であり、ＲＣは、スペーサー、例えば−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、０〜１０００である）であり、ＲＤは、本明細書で定義されている通り、水素、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているアルキニル、必要に応じて置換されているカルボシクリル、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されている５〜１０員のヘテロアリール、および必要に応じて置換されている５〜１０員のヘテロシクリルから選択される。本明細書で使用する場合、用語「シラン」は、様々なシラン化合物の混合物を含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「テトラジン」または「テトラジニル」とは、４個の窒素原子を含む、６員のヘテロアリール基を指す。テトラジンは、必要に応じて置換され得る。
本明細書で使用する場合、用語「テトラゾール」または「テトラゾリル」とは、４個の窒素原子を含む、５員の複素環式基を指す。テトラゾールは、必要に応じて置換され得る。
本明細書で使用する場合、用語「不飽和部分」とは、少なくとも１つの二重結合または１つの三重結合を含む、化学基（シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体を含む）を指す。不飽和部分は一価または二価とすることができる。不飽和部分が一価である場合、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキンは、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニルと互換的に使用される。不飽和部分が二価である場合、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキンは、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルケニレン、ヘテロシクロアルキニレンと互換的に使用される。
本明細書で使用する場合、用語「ポリマー」とは、多数の繰り返しサブ単位からなる分子を指す。ポリマーは、線状、分岐状または超分岐状とすることができる。分岐状ポリマーの非限定例には、星形ポリマー、櫛形ポリマー、ブラシ型ポリマー、デンドリマー型ポリマー、ラダー、およびデンドリマーが含まれる。本明細書に記載されているポリマーは、ポリマーナノ粒子の形態であることもできる。
本明細書で使用する場合、接頭語「フォト（ｐｈｏｔｏ）」または「フォト（ｐｈｏｔｏ−）」は、光照射または電子波照射に関連することを意味する。この用語は、以下に限定されないが、スペクトルのラジオ波、マイクロ波、赤外、可視、紫外、Ｘ線、またはガンマ線の一部として一般に公知の、１つまたは複数の範囲を含めた、電磁波スペクトルのすべてまたは一部を包含することができる。スペクトルの一部は、本明細書において説明されている金属などの、表面の金属領域により遮断されるものとすることができる。代替的または追加的に、スペクトルの一部は、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書において説明されている他の材料から作られる領域などの、表面の介在領域を通過するものとすることができる。特定の実施形態において、金属を通過することが可能な照射線を使用することができる。代替的または追加的に、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書において説明されている他の材料によりマスクされる照射線を使用することができる。
本明細書で使用する場合、用語「反応性部位」は、化学反応または分子の相互作用により、１つまたは複数の分子を結合させるために使用することができる、本明細書に記載されている官能基化分子のコーティング上の部位を意味する。こうした結合は、共有結合を介するもの、または他の結合もしくは相互作用力によるものとすることができる。
本明細書で使用する場合、用語「ＹＥＳ法」とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により開発された、化学蒸着法によるＹｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（「ＹＥＳ」）によってもたらされる化学蒸着手段を指す。これには、３種の様々な蒸着システムが含まれる。自動化ＹＥＳ−ＶｅｒｔａＣｏａｔシラン蒸気システムは、２００または３００ｍｍウェハを収容することができる、可撓性ウェハ取り扱いモジュールによる大量生産向けに設計されたものである。手動搭載型ＹＥＳ−１２２４Ｐシラン蒸気システムは、その変更可能な大容量チャンバを有する多様な大量生産向けに設計されたものである。Ｙｅｓ−ＬａｂＫｏｔｅは、実現可能性調査およびＲ＆Ｄにとって理想的な、低コストの卓上版である。
本明細書で使用する場合、置換されている基は、１個または複数の水素原子が別の原子または基に交換された、無置換の親基から誘導される。特に示さない限り、基が「置換されている」と見なされる場合、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７カルボシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、Ｃ３〜Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１つまたは複数の置換基により置換されていることを意味する。基が「必要に応じて置換されている」と記載されている場合、その基は、上の置換基により置換され得る。
ある種のラジカルの命名規則は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのどちらかを含むことができることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残りと２つの結合点を必要とする場合、この置換基はジラジカルであると理解される。例えば、２つの結合点を必要とするアルキルとして特定される置換基には、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−などのジラジカルが含まれる。他のラジカル命名規則は、そのラジカルが「アルキレン」または「アルケニレン」などのジラジカルであることを明確に示している。
置換基がジラジカル（すなわち、分子の残りに対して２つの結合点を有する）として示される場合、この置換基は、特に示さない限り、任意の方向の立体配置で結合し得ることを理解されたい。すなわち、例えば、−ＡＥ−または
として示される置換基には、置換基が、Ａが分子の一番左の結合点で結合しているような向きであること、およびＡが分子の一番右の結合点で結合している場合が含まれる。
本明細書において開示されている化合物が、少なくとも１つの立体中心を有する場合、それらは、個々の鏡像異性体およびジアステレオマーとして、またはラセミ体を含めた、こうした異性体の混合物として存在し得る。個々の異性体の分離または個々の異性体の選択的合成は、当分野の専門家に周知の様々な方法を適用することにより達成される。特に示さない限り、こうした異性体のすべておよびそれらの混合物は、本明細書において開示されている化合物の範囲に含まれる。さらには、本明細書において開示されている化合物は、１つまたは複数の結晶性形態またはアモルファス形態で存在し得る。特に示さない限り、こうした形態はすべて、任意の多形形態を含む、本明細書において開示されている化合物の範囲に含まれる。さらに、本明細書において開示されている化合物の一部は、水と溶媒和物（すなわち、水和物）または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。特に示さない限り、こうした溶媒和物は、本明細書において開示されている化合物の範囲に含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「パーセント残留表面」とは、Ｐ５／Ｐ７表面プライマーを染色するためのＴＥＴ ＱＣを使用して測定される強度を指すことができる。これらのＰ５およびＰ７プライマーは、ＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、Ｇｅｎｏｍｅ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームで配列決定するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている市販のフローセルの表面に使用される。プライマーの配列は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許公開第２０１１／００５９８６５Ａ１号に記載されている。ＴＥＴは、Ｐ５／Ｐ７プライマーへの相補的配列を有する色素標識オリゴヌクレオチドである。ＴＥＴは、表面にあるＰ５／Ｐ７プライマーにハイブリダイズすることができ、過剰のＴＥＴは、洗い流すことができ、結合した色素濃度は、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）などの走査装置を使用して蛍光を検出することにより測定することができる。
当業者は、本明細書に記載されている一部の構造が、他の化学構造によって適性に表すことができる化合物の共鳴形態または互変異性体であってもよいことを認識するであろう。当業者は、こうした構造がこのような化合物の実例の極めて小さな一部を表し得るに過ぎないことを認識している。こうした化合物は、図示されている構造の範囲内とみなされるが、こうした共鳴形態または互変異性体は本明細書において示されていない。
シランまたはシラン誘導体
本明細書において開示されている一部の実施形態は、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せから選択される、複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体に関する。本明細書で使用する場合、「シクロアルケン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの二重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味する。本明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルケン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの二重結合を有する、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を含有するカルボシクリル環または環系を意味する。本明細書で使用する場合、「シクロアルキン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの三重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味する。本明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルキン」は、環系の環が芳香族性ではない、少なくとも１つの三重結合を有する、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を含有するカルボシクリル環または環系を意味する。一部の実施形態において、ヘテロシクロアルケン中のヘテロ原子は、Ｎ、ＯまたはＳからなる群から選択される。シクロアルケンとヘテロシクロアルケンとの両方が、必要に応じて置換され得る。不飽和部分は一価または二価とすることができる。不飽和部分は、シランまたはシラン誘導体のケイ素（ｓｉｌｉｏｎ）原子に直接、共有結合し得るか、またはリンカーを介して間接的に結合し得る。不飽和部分は、官能基化分子にさらに結合することができる。一部の実施形態において、不飽和部分は、ノルボルネンおよびその誘導体などの、必要に応じて置換されているシクロアルケンである。一部の実施形態において、不飽和部分は、必要に応じて置換されているシクロオクチンまたはビシクロノニンである。環ひずみがある他のシクロアルケン、ヘテロシクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルキンも不飽和部分として使用することができる。
ノルボルネン
一部の実施形態において、シクロアルケンは、ノルボルネンまたはノルボルネン誘導体である。
一部の実施形態において、ノルボルネンは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７カルボシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、Ｃ３〜Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、およびオキソ（＝Ｏ）から選択される１つまたは複数の置換基により置換され得る。
代替的に、ノルボルネン上のこれらの２つの隣接置換基は、さらなる環を形成することができる。例えば、
は、二置換のノルボルネンを表し、ＲａおよびＲｂは一緒になって、それらが結合している原子と一緒になって、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているヘテロアリール、必要に応じて置換されているシクロアルキルまたは必要に応じて置換されているヘテロシクリルを形成することができる。
一部の実施形態において、ノルボルネンは他のシクロアルケンにより置き換えることができる。非限定例には、必要に応じて置換されているｔｒａｎｓ−シクロオクテン、必要に応じて置換されているｔｒａｎｓ−シクロペンテン、必要に応じて置換されているｔｒａｎｓ−シクロヘプテン、必要に応じて置換されているｔｒａｎｓ−シクロノネン、必要に応じて置換されているビシクロ［３．３．１］ノナ−１−エン、必要に応じて置換されているビシクロ［４．３．１］デカ−１（９）−エン、必要に応じて置換されているビシクロ［４．２．１］ノナ１（８）−エン、および必要に応じて置換されているビシクロ［４．２．１］−ノナ−１−エンが含まれる。
ヘテロ（ノルボルネン）
一部の実施形態において、本明細書において使用されるヘテロシクロアルケンは、ヘテロノルボルネンである。本明細書で使用する場合、（ヘテロ）ノルボルネンは、ノルボルネン分子中の１個または複数の炭素原子が、１個または複数のヘテロ原子により置き換えられていることを意味する。（ヘテロ）ノルボルネンの非限定例には、
または必要に応じて置換されているそれらの改変体が含まれる。
例示的なノルボルネン反応
Ａ．アジドとの１，３−双極性環付加
有機アジドとオレフィン性結合との反応による１，２，３−トリアゾリンの形成は、１９１２年、Ｗｏｌｆｆにより最初に報告された。Ｗｏｌｆｆ， Ｌｉｅｂｉｇｓ． Ａｎｎ．、１９１２年、３９４巻、２３頁を参照されたい。このタイプの反応は、１，３−双極性環付加と呼ばれる。末端アルキンへのアジド付加は、Ｈｕｉｓｇｅｎの研究から、１，３−双極性環付加反応の一例として認識された。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９６１年、３５７〜３９６頁を参照されたい。Ｓｃｈｅｉｎｅｒらは、アリールアジドのノルボルネンへの速度論調査を報告した（Ｓｃｈｅｉｎｅｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、１９６５年、８７巻、３０６〜３１１頁を参照されたい）。一般反応スキームは、以下の通りに示される。
さらに、Ｓｈｅａらは、２，４，６−トリニトロフェニルアジドとの１，３−双極性環付加における、ひずみのねじれた二重結合の反応性の検討を報告した。ｔｒａｎｓ−シクロアルケンおよび橋頭位アルケンを含めた、一連の単環式および二環式オレフィンが試験された。Ｓｈｅａら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１９９２年、１１４巻、４８４６〜４８５５頁を参照されたい。
Ｂ．テトラジンとのカップリング反応
ポリマーの官能基化、ならびにテトラジンとノルボルネンとの逆電子要求型ディールス−アルダー（ＤＡｉｎｖ）反応によるカップリングのための添加物不含の「クリック」反応が、Ｈａｎｓｅｌｌら（Ｈａｎｓｅｌｌら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２０１１年、１３３巻、１３８２８〜１３８３１頁を参照されたい）により報告された。一般反応スキームは、以下の通りに示される。
他の例示的な金属不含クリック反応には、Ｈｏｙｌｅら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．、２０１０年、３９巻、１３５５〜１３８７頁により報告された、（ヘテロ−）ディールス−アルダーおよびラジカル系のチオール−エン反応が含まれる。
Ｃ．テトラゾールおよびヒドラゾンとのカップリング反応
Ｋａｙａらは、銅不含のクリック反応における、タンパク質修飾用のノルボルネンアミノ酸（１）を報告した。Ｋａｙａら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．、２０１２年、５１巻、４４６６〜４４６９頁を参照されたい。この最初の例では、ニトリルイミンが、塩化ヒドラゾニルから塩基促進によるＨＣｌ脱離により生成し、次に、ノルボルネン誘導体（１）との環化付加反応に使用された。第２の例では、ニトリルイミンが、光化学反応において、テトラゾールから生成した。
Ｄ．オレフィンとの開環反応
Ｋｉｍらは、ノルボルネンの表面開始開環メタセシス重合を使用することによる、天然酸化物（Ｓｉ／ＳｉＯ２）を保有するシリコンウェハの表面からポリマー膜を成長させる方法を報告した。以下のスキームは、３つの工程手順：（ｉ）ノルボレニル基を含むケイ素上での自己組織化単分子膜の形成、（ｉｉ）表面へのルテニウム触媒［（Ｃｙ３Ｐ）２Ｃｌ２Ｒｕ＝ＣＨＰｈ、Ｃｙ＝シクロヘキシル］の結合、（ｉｉｉ）添加されたモノマーの重合による膜の生成を概略している。Ｋｉｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０００年、３３巻、２７９３〜２７９５頁を参照されたい。
同様に、Ｌｉｕらは、以下のスキームに示されている通り、ルテニウム触媒により触媒される、ノルボルネン誘導体と電子豊富オレフィンとの、位置選択的開環／クロスメタセシス反応を報告した。Ｌｉｕら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．、２００５年、７巻、１３１〜１３３頁を参照されたい。
Ｅ．ニトリルオキシドとの環化付加
Ｇｕｔｓｍｉｅｄｌらは、ニトリルオキシドのひずみ促進性環化付加が関与するノルボルネン修飾ＤＮＡ基材の最初の例を報告した。ひずみのあるアルケンは、塩化ヒドロキサモイルから、または親オキシムのＮ−クロロスクシンイミドによる処理によって、直接、インサイチュで生成させた様々なニトリルオキシドとの環化付加に好適である。Ｇｕｔｓｍｉｅｄｌら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．、２００９年、１１巻、２４０５〜２４０８頁を参照されたい。
シクロオクチン
一部の実施形態において、シクロアルキンは、シクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体である。
一部の実施形態において、シクロアルキンは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７カルボシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、Ｃ３〜Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、およびオキソ（＝Ｏ）から選択される１つまたは複数の置換基により置換され得る。
代替的に、シクロオクチン上のこれらの２つの隣接置換基は、さらなる環を形成することができる。例えば、
は、二置換のシクロオクチンを表し、ＲａおよびＲｂは一緒に、それらが結合している原子と一緒になって、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているヘテロアリール、必要に応じて置換されているシクロアルキルまたは必要に応じて置換されているヘテロシクリルを形成することができる。一部の実施形態において、シクロオクチン誘導体は、以下の構造
を含むことができる。
ひずみ促進性アジド−アルキン環化付加またはニトリルオキシド−アルキン環化付加
シクロオクチンは、アジドと１，３−環化付加を受けることができる。このタイプのひずみ促進性アジド−アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）反応は、銅不含ＤＮＡライゲーションに使用されてきた。Ｖａｎ Ｇｅｅｌらは、アジドタグ付きタンパク質を効率よく標識するために、ひずみのある様々なオクチンを使用することができることを報告している。Ｒ． ｖａｎ Ｇｅｅｌら、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｔｈｉｏｌ−ｙｎｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎ−Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２０１２年、２３巻、３９２〜３９８頁を参照されたい。類似の業績が、Ｙａｏらによっても報告され、彼らは、アミノ酸配列にフルオロフォアを結合するために、ひずみのあるアルキンを使用することができることを実証している。Ｙａｏら、「Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｅｎｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｚｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２０１２年、１３４巻、３７２０〜３７２８頁を参照されたい。
シクロオクチンとの反応における、アジド双極子の代替としての、ニトリルオキシド、ニトロンの相対活性に関する最近の検討により、ひずみ促進性アルキン／ニトリルオキシド環化付加の優れた反応性が示唆された。Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ．、２０１１年、１３３巻、９４９〜９５７頁、Ｊａｗａｌｅｋａｒら、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１１年、４７巻、３１９８〜３２００頁、およびＭｃＫａｙら、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１０年、４６巻、９３１〜９３３頁を参照されたい。ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）とベンゾニトリルオキシドとの［３＋２］付加に関する速度定数は、ベンジルアジドを用いる対応する反応に関して観察されるものよりも、１０倍大きいことが観察された。類似の結果が、ジベンゾシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏａｃｔｙｎｏｌ）（ＤＩＢＯ）と、ベンゾニトリルオキシド（塩化ヒドロキサモイルからインサイチュ生成される）またはベンジルアジドとの間の環化付加においても観察された。これらの検討により、前者の反応が、後者よりも約６０倍、速かったことが示唆されている。
ビシクロノニン
一部の実施形態において、シクロアルキンは、二環式環系、例えばビシクロノニンを含むことができる。一部の実施形態において、ビシクロノニンは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インまたはその誘導体から選択することができる。一部の他の実施形態において、ビシクロノニンは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−２−インまたはビシクロ［６．１．０］ノナ−３−インからも選択することができる。
一部の実施形態において、ビシクロノニンは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７カルボシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、Ｃ３〜Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、５〜１０員のヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシにより必要に応じて置換されている）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、およびオキソ（＝Ｏ）から選択される１つまたは複数の置換基により置換され得る。
代替的に、ビシクロノニン上のこれらの２つの隣接置換基は、さらなる環を形成することができる。例えば、
は、二置換のビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インを表し、ＲａおよびＲｂは一緒に、それらが結合している原子と一緒になって、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているヘテロアリール、必要に応じて置換されているシクロアルキルまたは必要に応じて置換されているヘテロシクリルを形成することができる。ビシクロノニンは、二環式環系におけるひずみのために、シクロオクチンに関する上記のアジドまたはニトリルオキシドと類似のＳＰＡＡＣアルキン環化付加を受けることができる。
ヒドロゲル
本明細書に記載されている一部の実施形態は、官能基化シランまたはシラン誘導体の不飽和部分により、基材の表面に官能基化ヒドロゲルを固定化する工程を含む。本出願において使用することができるヒドロゲルの非限定例は、本明細書に記載されている。
ＷＯ００／３１１４８は、ポリアクリルアミドヒドロゲルおよびポリアクリルアミドヒドロゲルをベースとするアレイを開示しており、ここで、いわゆるポリアクリルアミドプレポリマーは、好ましくはビニル基を含有するアクリルアミド、およびアクリル酸またはアクリル酸誘導体から形成される。次に、このプレポリマーの架橋を行うことができる。そうして作製したヒドロゲルは、好ましくはガラスに固体担持される。固体担持ヒドロゲルの官能基化も行うことができる。
ＷＯ０１／０１１４３は、ＷＯ００／３１１４８と類似している技術であるが、ヒドロゲルがバイオ分子との［２＋２］光環化付加反応に関与することが可能な官能基を保有し、こうしたバイオ分子の固定化アレイを形成するという点で異なる技術を記載している。ジメチルマレイミド（ＤＭＩ）が特に好ましい官能基である。ポリアクリルアミドをベースとするマイクロアレイ技術の文脈における［２＋２］光環化付加反応の使用は、ＷＯ０２／１２５６６およびＷＯ０３／０１４３９２にも記載されている。
米国特許第６，４６５，１７８号は、核酸のマイクロアレイの調製に使用するための活性化スライドの提供における試薬組成物の使用を開示している。この試薬組成物には、アクリルアミドコポリマーが含まれる。活性化スライドは、マイクロアレイの調製における従来の（例えば、シリル化）ガラス製スライドを置き換えるのに特に好適であると明記されている。
ＷＯ００／５３８１２は、ポリアクリルアミドをベースとするＤＮＡのヒドロゲルアレイの調製、およびレプリカ増幅におけるこれらのアレイの使用を開示している。
所望の場合、一旦、ヒドロゲルが形成されると、次に、分子アレイを作製するように、ヒドロゲルに分子を結合することができる。結合は、従来技術における様々な方法で行われてきた。例えば、米国特許第６，３７２，８１３号は、ジメチルマレイミド基を保有するポリヌクレオチドを、２つのジメチルマレイミド基間の［２＋２］光環化付加工程を行うことにより、ジメチルマレイミド基を保有して作製したヒドロゲルに固定化することを教示している。１つのジメチルマレイミド基は、ポリヌクレオチドに結合して固定化され、１つのジメチルマレイミド基は、ヒドロゲルからの側鎖となる。
分子アレイがヒドロゲルの生成後に形成される場合、２つの戦略が、この目的を実現するために用いられてきた。１つ目は、ヒドロゲルが作製された後に、これを化学修飾してもよい。この手法の課題には、アレイの調製における効率の総合的な低さ、および、特に高温、イオン性溶液および複数の洗浄工程に曝されると、結合化学に関連する安定性の低さが挙げられる。
より一般的な代替法は、配列されることになる分子と反応するよう整えられた、または予備活性化された官能基を有するコモノマーとの重合を行うことである。
ヒドロゲルを最初に形成した後、続いてそれに分子を配列させる代替法は、従来技術に記載されており、この場合、アレイはヒドロゲルの作製と同時に形成される。これは、例えば、アクリルアミド誘導体化ポリヌクレオチドの直接共重合により行うことができる。この手法の一例は、ＷＯ０１／６２９８２に記載されており、この場合、アクリルアミド誘導体化ポリヌクレオチドがアクリルアミドの溶液と混合され、重合は直接、行われる。
Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．、米国）は、ＡＣＲＹＤＩＴＥ（商標）（アクリルアミドホスホロアミダイト）を作製しており、これは、ポリヌクレオチドと反応させた後に、得られたモノマーとアクリルアミドとを共重合することができる。
Ｅｆｉｍｏｖら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９年、２７巻（２２号）、４４１６〜４４２６頁）は、ヒドロゲル／アレイの同時形成のさらなる例を開示しており、反応性アクリル酸誘導体であるアクリルアミドと５’または３’末端アクリルアミド基を有する修飾ポリヌクレオチドとの共重合が行われている。
ポリマー
本明細書に記載されている一部の実施形態には、シクロアルケンまたはヘテロシクロアルケンで官能基化したシランまたはシラン誘導体を介して、官能基化ポリマーを基材の表面に固定化する工程が含まれる。本出願において使用することができるポリマーの非限定例は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＵＳ第１３／７８４，３６８号および米国特許公開第２０１１／００５９８６５号に記載されている。
一部の実施形態において、本明細書において使用されるポリマーは、式（Ｉ）の繰り返し単位および式（ＩＩ）の繰り返し単位
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルであり、ＲＡは、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、およびチオールからなる群から選択され、Ｘは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンリンカーであり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、Ｒ６、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８または−ＮＲ７Ｒ８からそれぞれ独立して選択され、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、または必要に応じて置換されているそれらの改変体から独立して選択され、Ｒ７およびＲ８は、Ｈまたはアルキルからそれぞれ独立して選択されるか、またはＲ７およびＲ８は、それらが結合している１個または複数の原子と一緒になって複素環を形成する）
を含む。
一部の実施形態において、ＲＡはアジドである。一部の実施形態において、Ｘは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーである。一部の実施形態において、Ｒ１は水素であり、一部の他の実施形態において、Ｒ１はメチルである。一部の実施形態において、Ｒ４は水素であり、Ｒ４’は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態において、Ｒ５およびＲ５’のそれぞれは水素である。一部の実施形態において、Ｒ５は水素であり、Ｒ５’はメチルである。
一部の実施形態において、本明細書において使用されるポリマーは、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマー
（式中、Ｒ１は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルから選択され、ＲＡは、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、およびチオールからなる群から選択され、−（ＣＨ２）−ｐのそれぞれは、必要に応じて置換することができ、ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、Ｒ５は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルから選択され、ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である）を含む。一部の実施形態において、ｐは５である。一部の実施形態において、ＲＡはアジドである。
ＰＡＺＡＭ
一実施形態において、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーはまた、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）
（式中、ｎは、１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
によっても表される。
一部の実施形態において、直接コンジュゲートに使用される官能基化分子は、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）である。一部の実施形態において、ＰＡＺＡＭは線状ポリマーである。一部の他の実施形態において、ＰＡＺＡＭは、軽度に架橋されているポリマーである。一部の実施形態において、ＰＡＺＡＭは、水溶液として表面に塗布される。一部の他の実施形態において、ＰＡＺＡＭは、エタノールなどの１種または複数の溶媒添加物との水溶液として表面に塗布される。様々なＰＡＺＡＭポリマーを調製するための方法は、その全体が参照により明細書に組み込まれている、ＵＳ第１３／７８４，３６８号に詳述されている。
基材
一部の実施形態において、本出願に使用される基材には、ガラス、溶融シリカ、および他のシリカ含有材料などのシリカをベースとする基材が含まれる。一部の実施形態において、シリカをベースとする基材はまた、ケイ素、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、水素化ケイ素とすることもできる。一部の実施形態において、本出願に使用される基材には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネートおよびポリ（メタクリル酸メチル）などのプラスチック製材料が含まれる。好ましいプラスチック製材料は、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリスチレンおよび環式オレフィンポリマーの基材である。一部の実施形態において、基材は、シリカをベースとする材料またはプラスチック製材料である。一実施形態において、基材は、ガラスを含む少なくとも１つの表面を有する。
一部の他の実施形態において、基材は金属とすることができる。一部のこうした実施形態において、金属は金である。一部の実施形態において、基材は、金属酸化物を含む少なくとも１つの表面を有する。一実施形態において、表面は酸化タンタルを含む。
アクリルアミド、エノン、またはアクリレートもまた、基材材料として利用することができる。他の基材材料は、以下に限定されないが、ガリウムひ素（ｇａｌｌｉｕｍ ａｒｅｓｎｉｄｅ）、リン化インジウム、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、石英、樹脂、ポリマーおよびコポリマーを含むことができる。上記の列挙は、例示を意図するものであり、本出願に限定されるものではない。
一部の実施形態において、基材および／または基材表面は、石英とすることができる。一部の他の実施形態において、基材および／また基材表面は、半導体、すなわちＧａＡｓ、またはＩＴＯとすることができる。
基材は、単一材料または複数の様々な材料を含むことができる。基材は、複合体または積層体とすることができる。基材は、平坦である、丸みがある、ざらざらしている、およびパターン化されているものとすることができる。パターンは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１３／６６１，５２４号に記載されている、非金属表面上にフィーチャーを形成する金属パッドによって形成され得る。別の有用なパターン化表面は、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１３／７８７，３９６号、米国特許出願公開第２０１１／０１７２１１８Ａ１号、または米国特許第７，６２２，２９４号において記載されている、表面に形成されたウェルフィーチャーを有するものである。パターン化した基材を使用する実施形態の場合、ゲルはパターンフィーチャーに選択的に結合（例えば、ゲルは金属パッドに結合することができ、またはゲルはウェルの内側に結合することができる）するか、または代替的に、ゲルは、パターンフィーチャーと介在領域との両方全体に、均一に結合することができる。
分子アレイの調製および使用においてプラスチックをベースとする基材を使用する利点には、コストが含まれる。例えば、射出成形による適切なプラスチックをベースとする基材の調製は、一般に、例えば、シリカをベースとする基材のエッチングおよび結合による調製よりも安価である。別の利点は、意図されるかまたは利用される用途に好適な支持体の光学特性の微調整が可能な様々なプラスチックがほとんど無限にあることである。
金属が基材としてまたは基材上のパッドとして使用される場合、これは、所望の用途が理由となり得る。金属の導電性により、ＤＮＡをベースとするセンサーにおける電場の調節を可能にし得る。この方法では、ＤＮＡの不適合性の区別を強化することができ、固定化されたオリゴヌクレオチド分子の配向決定を行うことができるか、またはＤＮＡハイブダイゼーション速度を加速することができる。
好ましくは、基材は、シリカをベースとするが、用いられる基材の形状は、本出願が実施される用途に応じて様々とすることができる。しかし、一般に、シリカ、例えば溶融シリカなどの支持材料のスライドが、特に、調製およびその後の分子の集積に利便性がある。本出願の実施において特に有用なものは、ＳＰＥＣＴＲＡＳＩＬ（商標）という商標名で販売されている、溶融シリカのスライドである。これにもかかわらず、本出願は、ビーズ、ロッドなどの基材（シリカをベースとする支持体を含む）である他の提示物にも等しく適用可能であることが、当業者に明らかとなろう。
一部の実施形態において、基材の表面は、機能性分子によりコーティングされている領域と、コーティング剤を含まない不活性領域との両方を含む。一部のこうした実施形態において、官能基化分子のコーティング剤は、ヒドロゲルまたはポリマーコーティング剤である。機能性分子によりコーティングされている領域は、反応性部位を含むことができ、したがって、化学結合または他の分子相互作用により、分子を結合するために使用することができる。一部の実施形態において、パターンまたは格子を形成するように、機能性分子によりコーティングされている領域（例えば、反応性フィーチャー、パッド、ビーズまたはウェル）と不活性領域（介在領域と呼ばれる）とを交互に並べることができる。こうしたパターンは、一次元または二次元にあることができる。一部の実施形態において、不活性領域は、ガラス領域、金属領域、マスク領域または介在領域から選択することができる。あるいは、これらの材料は、反応性領域を形成することができる。不活性または反応性は、基材上で使用される化学および方法に依存することになろう。一実施形態において、表面はガラス領域を含む。別の実施形態において、表面は金属領域を含む。さらに別の実施形態において、表面はマスク領域を含む。本明細書に記載されている組成物の一部の実施形態において、基材はビーズとすることができる。本開示のポリマーによりコーティングすることができるか、または他には組成物においてもしくは本明細書で説明されている方法において使用することができる非限定的な例となる基材材料は、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１３／４９２，６６１号および同第１３／６６１，５２４号に記載されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されている基材は、フローセルの少なくとも一部の形態であるか、またはフローセルに位置している。一部のこうした実施形態において、フローセルはさらに、機能性分子によるコーティング、例えばポリマーコーティングを介して、基材の表面に結合しているポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドクラスター中のフローセルに存在しており、ポリヌクレオチドクラスターのポリヌクレオチドは、ポリマーコーティングを介して、フローセルの表面に結合している。こうした実施形態において、ポリヌクレオチドが結合しているフローセル本体の表面は基材とみなされる。他の実施形態において、ポリマーでコーティングされている表面を有する個別の基材は、フローセルの本体に装着される。好ましい実施形態において、フローセルは、複数のレーンまたは複数のセクターに分けられているフローチャンバであり、複数のレーンまたは複数のセクターの１つまたは複数が、本明細書に記載されている、共有結合したポリマーコーティング剤でコーティングされている表面を含む。本明細書に記載されているフローセルの一部の実施形態において、単一ポリヌクレオチドクラスター内に結合しているポリヌクレオチドは、同一または類似のヌクレオチド配列を有する。本明細書に記載されているフローセルの一部の実施形態において、異なるポリヌクレオチドクラスターの結合しているポリヌクレオチドは、異なるまたは非類似のヌクレオチド配列を有する。本明細書において説明されている方法または組成物で使用することができるフローセルの製造用の例示的なフローセルおよび基材は、以下に限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されているもの、またはそれらの各々が参照により本明細書に組み込まれている、ＵＳ２０１０／０１１１７６８Ａ１またはＵＳ２０１２／０２７０３０５において記載されているものが挙げられる。
シリカをベースとする基材
一部の実施形態において、本出願において使用される基材は、シリカをベースとする基材である。一般に、シリカをベースとする基材表面は、官能基化分子、例えばヒドロゲル、ポリマーまたはある程度形成されているヒドロゲル（例えば、プレポリマー（ＰＲＰ））と反応することが可能な化学的に反応性に富む基に共有結合するように、ある方法で化学修飾されている。表面活性化剤は、通常、有機シラン化合物である。一実施形態において、表面活性化剤は、「Ｂｉｎｄ Ｓｉｌａｎｅ」または「Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ Ｓｉｌａｎｅ」として公知の、およびＰｈａｒｍａｃｉａから市販されているγ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランであるが、モノエトキシジメチルシリルブタナール、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシランおよび３−アミノプロピルトリメトキシシラン（すべて、Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）などの他のケイ素をベースとする表面活性化剤も公知である。この方法では、アミノ基、アルデヒド基または重合可能な基（例えば、オレフィン）などの側鎖官能基がシリカに結合し得る。
本出願は、共有結合しているシクロアルケンまたはヘテロシクロアルケンを含む有機シラン化合物を用いる。一部の実施形態において、シクロアルケンは、必要に応じて置換されているノルボルネンである。一部の実施形態において、有機シラン化合物のシラン部分は以下の構造
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているアリールオキシ、必要に応じて置換されているヘテロアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールオキシからそれぞれ独立して選択される）を有する。一部のこうした実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して必要に応じて置換されるアルコキシである。一部のさらなる実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれはメトキシである。一実施形態において、有機シラン化合物は、［（５−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エニル）エチル］トリメトキシシランである。
リンカー
本明細書に記載されている一部の実施形態において、シランまたはシラン誘導体とシクロアルケンまたはヘテロシクロアルケンとの間のリンカーは、必要に応じて置換されているアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロアルキレン、必要に応じて置換されているシクロアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、必要に応じて置換されているポリエチレングリコール、開裂可能なリンカーまたはそれらの組合せから選択される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されているリンカーは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは１〜２０，０００から選択される。一実施形態において、ｎは２である。一部の他の実施形態において、本明細書に記載されているリンカーは、必要に応じて置換されているヘテロアルキレンリンカーである。例えば、リンカーは−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは１〜２０，０００から選択され、骨格上の１個または複数の炭素原子が、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＰから選択される１個または複数のヘテロ原子により置き換えられている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されているリンカーは、開裂可能なリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、酸に不安定なリンカー（ジアルコキシベンジルリンカー、Ｓｉｅｂｅｒリンカー、インドールリンカー、ｔ−ブチルＳｉｅｂｅｒリンカーを含む）、求電子的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能なリンカー、還元条件下、酸化条件下での開裂、セーフティキャッチリンカーの使用による開裂、および脱離機構による開裂から選択される。一部のこうした実施形態において、ＬＡは、ジスルフィドリンカー（−Ｓ−Ｓ−）、エステル、ニトロベンゼン、イミン、酵素によりまたは化学的に開裂可能なペプチド、およびＤＮＡなどのポリヌクレオチドから選択される。
開裂可能なリンカーは、当分野で公知であり、従来の化学を適用して、リンカーをヌクレオチド塩基および標識に結合することができる。このリンカーは、酸、塩基、求核剤、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素などへの曝露を含む、任意の適切な方法により開裂することができる。本明細書で議論されているリンカーは、３’−Ｏ−保護基の結合を開裂するために使用されるものと同じ触媒を使用して開裂することもできる。適切なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ＳｏｎｓまたはＧｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎの「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている、標準的な化学保護基から採用することができる。固相合成に使用されるさらなる適切な開裂可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒら（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、１００巻、２０９２〜２１５７頁、２０００年）に開示されている。
用語「開裂可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を、例えば反応性複素環から除去する必要があることを暗示することを意図するものではない。一例として、開裂部位は、リンカーの一部が開裂後に複素環に結合したままであることを確実にする、リンカーの場所に位置することができる。
Ａ．求電子的に開裂するリンカー
求電子的に開裂するリンカーは、通常、プロトンにより開裂され、酸に敏感な開裂を含む。適切なリンカーには、トリチル、ｐ−アルコキシベンジルエステルおよびｐ−アルコキシベンジルアミドなどの修飾ベンジル系が含まれる。他の適切なリンカーには、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基およびアセタール系が含まれる。
チオアセタールまたは他の硫黄含有保護基の開裂における、ニッケル、銀または水銀などの求硫黄性金属の使用も、適切なリンカー分子の調製に考えることができる。
Ｂ．求核的に開裂するリンカー
求核的な開裂も、リンカー分子の調製に、よく認識されている方法である。水中で不安定なエステルなどの基（すなわち、塩基性ｐＨで簡単に開裂し得る）および非水性求核剤に不安定な基を使用することができる。フッ化物イオンは、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）またはｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）などの基において、ケイ素−酸素結合を開裂するために使用することができる。
Ｃ．光開裂可能なリンカー
光開裂可能なリンカーは、炭水化物の化学において広く使用されてきた。開裂を活性化するために必要な光は、修飾ヌクレオチドの他の構成成分に影響を及ぼさないことが好ましい。例えば、フルオロフォアを標識として使用する場合、これは、リンカー分子を開裂するために必要な異なる波長の光を吸収する場合、好ましい。適切なリンカーには、Ｏ−ニトロベンジル化合物およびニトロベラトリル化合物をベースとするものが含まれる。ベンゾインの化学に基づくリンカーも使用することができる（Ｌｅｅら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、６４巻、３４５４〜３４６０頁、１９９９年）。
Ｄ．還元条件下での開裂
還元的開裂に敏感なリンカーが多数公知である。パラジウムをベースとする触媒を使用する触媒的水素化を使用して、ベンジルおよびベンジルオキシカルボニル基が開裂される。ジスルフィド結合の還元も、当分野において公知である。
Ｅ．酸化条件下での開裂
酸化に基づく手法が、当分野において周知である。これらには、ｐ−アルコキシベンジル基の酸化、ならびに硫黄およびセレンリンカーの酸化が含まれる。ジスルフィド、および他の硫黄またはセレンをベースとするリンカーを開裂する水性ヨウ素の使用も、本出願の範囲内である。
Ｆ．セーフティキャッチリンカー
セーフティキャッチリンカーは、２つの工程で開裂するものである。好ましい系では、第１の工程は、反応性に富む求核的中心の生成であり、その後に開裂をもたらす分子内環化が関与する第２の工程が続く。例えば、レブリン酸エステル連結基は、ヒドラジンまたは光化学により処理されて、活性なアミンを放出することができ、次に、このアミンは環化して、分子内のどこかのエステルを開裂させる（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、６２巻、５１６５〜５１６８頁、１９９７年）。
Ｇ．脱離機構による開裂
脱離反応も使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃおよびシアノエチルなどの基の塩基触媒脱離、およびアリル系のパラジウム触媒による還元的脱離を使用することができる。
一部の実施形態において、リンカーはスペーサー単位を含むことができる。他の例示的な適切な開裂可能なリンカーは、その全体が参照により明細書に組み込まれている、米国公開第２００６−０１８８９０１号に詳細に議論されている。
配列決定用途
本明細書において説明されている方法は、様々な増幅技法のいずれかを使用することができる。使用することができる例示的な技法には、以下に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライマー増幅（ＲＰＡ）が含まれる。特定の実施形態において、増幅に使用される１つまたは複数のプライマーは、ポリマーコーティング剤に結合することができる。ＰＣＲの実施形態において、増幅に使用される一方または両方のプライマーを、ポリマーコーティング剤に結合することができる。結合したプライマーの２つの種を利用するフォーマットは、二重鎖アンプリコンが、複写された鋳型配列をフランキングする２つの結合しているプライマー間に架橋様構造を形成するので、ブリッジ増幅と呼ばれることが多い。ブリッジ増幅に使用することができる例示的な試薬および条件は、例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６４１，６５８号、米国特許公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許公開第２００４／００９６８５３号、米国特許公開第２００４／０００２０９０号、米国特許公開第２００７／０１２８６２４号、および米国特許公開第２００８／０００９４２０号に記載されている。ＰＣＲ増幅は、ポリマーコーティング剤および第２のプライマーに結合させた増幅用プライマーの１つを用いて、溶液中で行うこともできる。１つの結合させたプライマーと可溶なプライマーとの組合せを使用する例示的なフォーマットは、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｒｅｓｓｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１００巻、８８１７〜８８２２頁（２００３年）、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許公開第２００５／０１３０１７３号もしくは同第２００５／００６４４６０号に記載されているエマルションＰＣＲである。エマルションＰＣＲは、そのフォーマットの例示であり、本明細書において説明されている方法の目的は、エマルションの使用は任意選択であり、実際に、いくつかの実施形態の場合、エマルションは使用されていないことが理解されよう。さらに、プライマーは、ｅＰＣＲの参照文献に説明されている基材または固体支持体に直接結合している必要はなく、代わりに、本明細書において説明されているポリマーコーティング剤に結合することができる。
ＲＣＡ技法は、本開示の方法に使用するために改変することができる。ＲＣＡ反応において使用することができる例示的な構成成分、およびＲＣＡがアンプリコンを作製する原理は、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、１９巻、２２５〜２３２頁（１９９８年）およびＵＳ２００７／００９９２０８Ａ１に記載されている。ＲＣＡに使用されるプライマーは溶液中に存在することができるか、またはポリマーコーティング剤に結合することができる。
ＭＤＡ技法は、本開示の方法に使用するために改変することができる。ＭＤＡの一部の基本的な原理および有用な条件は、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９９巻、５２６１〜６６頁（２００２年）、Ｌａｇｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３巻、２９４〜３０７頁（２００３年）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９５年、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻、１６９１〜９６頁（１９９２年）、ＵＳ５，４５５，１６６、ＵＳ５，１３０，２３８、およびＵＳ６，２１４，５８７に記載されている。ＭＤＡに使用されるプライマーは溶液中に存在することができるか、またはポリマーコーティングに結合することができる。
特定の実施形態において、上で例示した増幅技法の組合せを使用することができる。例えば、ＲＣＡおよびＭＤＡは、ＲＣＡが使用されて、溶液中で（例えば、溶液相のプライマーを使用して）コンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｃ）アンプリコンを生成する組合せで使用することができる。次に、ポリマーコーティング剤に結合しているプライマーを使用して、上記のアンプリコンがＭＤＡ用の鋳型として使用され得る。この例では、ＲＣＡ工程とＭＤＡ工程を組み合わせた後に作製したアンプリコンが、ポリマーコーティング剤に結合することになろう。
一部の実施形態において、本明細書に記載されている、官能基化ヒドロゲルまたはポリマーによりコーティングされている基材は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。こうした実施形態において、本方法は、（ａ）ポリヌクレオチドポリメラーゼを、本明細書に記載されているポリマーまたはヒドロゲルコーティングのいずれか１つを介して、基材の表面に結合しているポリヌクレオチドクラスターに接触させる工程、（ｂ）１種または複数のヌクレオチドがポリヌクレオチドポリメラーゼにより利用されると検出可能なシグナルが生成されるように、ヌクレオチドをポリマーによりコーティングされた基材の表面に供給する工程、（ｃ）１つまたは複数のポリヌクレオチドクラスターでシグナルを検出する工程、および（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返し、これより１つまたは複数のポリヌクレオチドクラスターに存在しているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程を含むことができる。
核酸配列決定は、当分野で公知の様々な方法により、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。好ましい方法では、シークエンシング−バイ−シンセシス（ＳＢＳ）を利用して、本明細書に記載されているポリマーコーティングのいずれか１つを介して基材の表面に結合しているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。こうした方法では、ポリヌクレオチドポリメラーゼに関連する鋳型ポリヌクレオチドに、１種または複数のヌクレオチドが供給される。このポリヌクレオチドポリメラーゼにより、１種または複数のヌクレオチドが、ポリヌクレオチド鋳型に相補的な新規に合成された核酸鎖に組み込まれる。この合成は、鋳型ポリヌクレオチドの一部、または鋳型ポリヌクレオチドの一方の末端で共有結合している普遍または非可変核酸の一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーから開始される。ヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに組み込まれるので、配列決定法の各工程の間に組み込まれたヌクレオチドの決定が可能になる検出可能なシグナルが生じる。この方法では、鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な核酸の配列を生じさせることができ、これにより、鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも一部のヌクレオチド配列の決定が可能になる。フローセルは、本開示の方法によって作製されるアレイであって、シークエンシング−バイ−シンセシス（ＳＢＳ）、または試薬の周期的な繰り返し送達に関与する他の検出技法が施されるアレイを収容するための便利なフォーマットを提供する。例えば、最初のＳＢＳサイクルを開始するため、１種または複数の標識したヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどが、本明細書において説明されている方法によって作られた核酸アレイを収容するフローセル内に／内を流され得る。プライマーの伸長により標識化ヌクレオチドの組込みが引き起こされる、アレイのこうした部位が検出され得る。必要に応じて、ヌクレオチドはさらに、ヌクレオチドが一旦プライマーに加えられると、さらなるプライマーの伸長を終了させる、可逆的終結特性を含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログをプライマーに加えて、脱ブロック剤が送達されて上記の部分が除去されるまで、その後の伸長が起こり得なくなるようにすることができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態の場合、脱ブロック試薬をフローセルに送達させることができる（検出が起こる前またはその後に）。様々な送達工程の間に、洗浄を行うことができる。次に、このサイクルをｎ回繰り返して、プライマーをヌクレオチドｎ個分伸長し、これにより、長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって作製されるアレイにおける使用に容易に採用することができる、例示的なＳＢＳ手順、流体系および検出プラットフォームは、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４５６巻、５３〜５９頁（２００８年）、ＷＯ０４／０１８４９７、ＵＳ７，０５７，０２６、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、ＵＳ７，３２９，４９２、ＵＳ７，２１１，４１４、ＵＳ７，３１５，０１９、ＵＳ７，４０５，２８１、およびＵＳ２００８／０１０８０８２に記載されている。
ピロ配列決定などの、周期的な反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。ピロ配列決定は、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれる際の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出するものである（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｏｎａｇｈｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４２巻（１号）、８４〜９頁（１９９６年）、Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１１巻（１号）、３〜１１頁（２００１年）、Ｒｏｎａｇｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻（５３７５号）、３６３頁（１９９８年）、ＵＳ６，２１０，８９１、ＵＳ６，２５８，５６８およびＵＳ６，２７４，３２０）。ピロ配列決定では、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることにより検出することができ、生じたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼにより生じる光子により検出することができる。したがって、この配列決定反応は、ルミネッセンス検出システムによって、モニタリングすることができる。蛍光に基づく検出システムに使用される励起照射源は、ピロ配列決定手順には必要ではない。本開示のアレイにピロ配列決定を適用するために使用することができる、有用な流体系、検出および手順は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ１２／０５８０９６Ａ１、ＵＳ２００５／０１９１６９８Ａ１、ＵＳ７，５９５，８８３、およびＵＳ７，２４４，５５９に記載されている。
例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻、１７２８〜１７３２頁（２００５年）、ＵＳ５，５９９，６７５およびＵＳ５，７５０，３４１において記載されているものを含む、シークエンシング−バイ−ライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応もまた有用である。一部の実施形態は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｂａｉｎｓ ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３５巻（３号）、３０３〜７頁（１９８８年）、Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、５４〜５８頁（１９９８年）、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻（４９９５号）、７６７〜７７３頁（１９９５年）、およびＷＯ１９８９／１０９７７において記載されている、シークエンシング−バイ−ハイブリダイゼーション（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）手順を含むことができる。シークエンシング−バイ−ライゲーション手順とシークエンシング−バイ−ハイブリダイゼーション手順との両方において、アレイの部位に存在している核酸に、オリゴヌクレオチド送達および検出という繰り返しサイクルを施す。シークエンシング−バイ−ライゲーション手順またはシークエンシング−バイ−ハイブリダイゼーション手順用の試薬を送達するため、本明細書において、または本明細書において引用されている参照文献において説明されているＳＢＳ法向けの流体系を容易に採用することができる。通常、オリゴヌクレオチドは、蛍光標識されており、本明細書における、または本明細書において引用されている参照文献におけるＳＢＳ手順に関して記載されているものと類似の蛍光検出器を使用して検出することができる。
一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを必要とする方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの組込みは、フルオロフォアを保有するポリメラーゼとγ−リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用により、またはゼロモードウェーブガイド（ｚｅｒｏｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴに基づく配列決定に関する技法および試薬は、例えば、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｅｖｅｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９巻、６８２〜６８６頁（２００３年）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、Ｏｐｔ． Ｌｅｔｔ．、３３巻、１０２６〜１０２８頁（２００８年）、Ｋｏｒｌａｃｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０５巻、１１７６〜１１８１頁（２００８年）に記載されている。
一部のＳＢＳの実施形態には、ヌクレオチドが伸長生成物に組み込まれると放出される光子の検出が含まれる。例えば、放出された光子の検出に基づく配列決定は、電気検出器、およびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている関連技法、またはそのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＵＳ２００９／００２６０８２Ａ１、ＵＳ２００９／０１２７５８９Ａ１、ＵＳ２０１０／０１３７１４３Ａ１、またはＵＳ２０１０／０２８２６１７Ａ１に記載されている配列決定法およびシステムを使用することができる。
例えば、本明細書において説明されている方法により作製された本開示のアレイの別の有用な用途は、遺伝子発現解析である。遺伝子発現は、デジタルＲＮＡ配列決定と呼ばれるものなどの、ＲＮＡ配列決定技法を使用して、検出または定量することができる。ＲＮＡ配列決定技法は、上で説明されているものなどの、当分野で公知の配列決定の方法論を使用して実施することができる。遺伝子発現はまた、アレイへの直接ハイブリダイゼーションにより実施されるハイブリダイゼーション技法を使用して、またはその生成物がアレイ上で検出される多重アッセイを使用して、検出または定量することもできる。例えば、本明細書において説明されている方法により作製された本開示のアレイは、１つまたは複数の個体に由来するゲノムＤＮＡ試料の遺伝子型を決定するために使用することもできる。本開示のアレイ上で実施することができる、アレイに基づく発現および遺伝子型解析のための例示的な方法は、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号、または同第６，３５５，４３１号、または米国特許公開第２００５／００５３９８０Ａ１号、同第２００９／０１８６３４９Ａ１号、またはＵＳ２００５／０１８１４４０Ａ１に記載されている。
フローセルを用いる上記の方法の一部の実施形態において、単一タイプのヌクレオチドだけが、単一フロー工程の間、フローセル中に存在している。こうした実施形態において、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびそれらのアナログからなる群から選択することができる。フローセルを用いる上記の方法の他の実施形態において、複数の異なるタイプのヌクレオチドが、単一フロー工程の間、フローセル中に存在している。こうした方法では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびそれらのアナログから選択することができる。
フローセル中に存在している基材の表面のポリマーコーティングに結合している１種または複数のポリヌクレオチドについて、各フロー工程の間に組み込まれた１種または複数のヌクレオチドの決定は、ポリヌクレオチド鋳型において、またはその近傍で生じたシグナルを検出することにより実現される。上記の方法の一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、光学シグナルを含む。他の実施形態において、検出可能なシグナルは、非光学シグナルを含む。こうした実施形態において、非光学シグナルは、１つまたは複数のポリヌクレオチド鋳型において、またはその近傍におけるｐＨの変化を含む。
さらなる実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示され、これらの実施例は、特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない。
（実施例１）
ノルボルネン１ａによりシラン処理されているガラス表面におけるＰＡＺＡＭの固定化
表面のシラン処理
方法１（ガラス製真空デシケーターを使用するシラン処理）：液体ノルボルネンシラン２００μＬ〜５００μＬをガラス製バイアルの内側に堆積させ、ガラス製真空デシケーターに入れた。ガラス基材も上記のデシケーターに入れた。次に、このデシケーターを１５〜３０ｍＴｏｒｒの圧力まで排気し、６０〜１２５℃の間の温度のオーブンに入れた。シラン処理を１ｈ続け、その後、このデシケーターをオーブンから取り出し、冷却して空気中に通気した。この工程の直後に基材を利用するか、または基材に追加の硬化工程（１００℃で１ｈ）および／またはエタノールによるすすぎなどの溶媒による洗浄工程を施した。
方法２（ＹＥＳ ＣＶＤオーブンを使用するシラン処理）：まず、基材をＣＶＤオーブンチャンバに導入し、このチャンバを３００ｍＴｏｒｒの圧力まで排気した。この試料を最初に酸素プラズマにより１０ｍｉｎ処理した。プラズマによる活性化後、チャンバを排気し、基本圧５００ｍＴｏｒｒで水０．５ｍＬを注入することによる、１０ｍｉｎの再水和サイクルを実行した。さらなるパージサイクルの後、シラン処理プログラムを実行した。１５ｍｉｎの遅延時間後、シランのバルブを０．１５秒間の開、２０秒間の閉に設定した。シラン処理を５００ｍＴｏｒｒの基本圧力、および１２５℃のチャンバ温度で６０ｍｉｎ、次いで、２回の窒素パージサイクルをやはり１２５℃で行った。次に、このチャンバを３ｍｉｎかけて、通気した。ＹＥＳオーブンのシラン処理サイクルは、高度に自動化され、制御されていた。シラン処理工程の間、ノルボルネンシランの容器を１２０℃に維持し、シラン蒸気のラインを１２５℃の一定に維持した。真空ラインを１４５℃に維持した。サイクルの完了後、基材を取り出し、短時間、オーブンの外で冷却し、続いて、追加の後処理を行うことなく使用した。これらの基材は、シラン処理後、少なくとも１か月、使用可能であった。
ＰＡＺＡＭの堆積および表面の架橋
ノルボルネンシラン処理したガラス基材の上部に水性ＰＡＺＡＭ（０．２５％＋５％エタノール）５００μＬを堆積させ、表面全体に広げた。以下の手順を含むスピンコーティングにより、ＰＡＺＡＭの薄膜を得た：工程１−６００ｒｐｍ、５秒間、加速１５００ｒｐｍ／秒、工程２−１５００ｒｐｍ、３０秒、加速５０００ｒｐｍ／秒、工程３−４０００ｒｐｍ、５秒間、加速５０００ｒｐｍ／秒、工程４−６００ｒｐｍ、５秒間、加速５０００ｒｐｍ／秒。他のスピンコーティング処方も使用することができる。スピン−コーティングの後、この基材をオーブン中、またはホットプレートで１ｈ、６５〜７５℃に加熱した。
洗い流し：加熱工程後、４５℃で音波照射工程（１０ｍｉｎ）を加えることにより、基材を水中で洗浄し、非結合ＰＡＺＡＭを除去し、次いで、多量の水によるすすぎ、および窒素銃による乾燥を行った。
プライマーのグラフト：ＫＰｉ（１０ｍＭ）中のアルキンオリゴヌクレオチドを、６０℃で３０分間、ＰＭＤＥＴＡ、硫酸銅およびＮａＡｓｃ（５００ｍｇ／ｍＬ水溶液）と反応させることによるプライマーのグラフト工程に、上記の調製した基材を使用した。
ＱＣ：プライマーのグラフト工程を完了した後、このグラフトプライマーにＴＥＴ品質管理を施した。ＴＥＴは、Ｐ５／Ｐ７プライマーに対する相補的配列を有する、色素標識されたオリゴヌクレオチドである。ＴＥＴは、表面のＰ５／Ｐ７プライマーにハイブリダイズすることができる。過剰のＴＥＴは、洗い流すことができ、結合した色素濃度を、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）などの走査装置を使用する蛍光検出により測定することができる。色素濃度の強度は、ヒドロゲル固定化後の残存しているパーセント表面の指標として測定した。ＰＡＺＡＭの堆積および表面架橋の手順も、その全体が参照により組み込まれている、米国出願第１３／７８４，３６８号に開示されている。
図１Ａは、ノルボルネン−シラン誘導体［（５−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エニル）エチル］トリメトキシシラン（１ａ）によりシラン処理し、続いて、ＰＡＺＡＭによりコーティングして熱的に架橋したＤ２６３Ｓｃｈｏｔｔガラス基材を示している。暗いエリアは、Ｐ５／Ｐ７プライマーをグラフトし、ＴＥＴ色素により誘導体化した相補鎖とハイブリダイズした際に観察された実際の蛍光強度である。図１Ｂは、同じグラフトノルボルネン（１ａ）によるシラン処理／ＰＡＺＡＭコーティングされた非パターン化表面であって、相補的なＴＥＴ色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズした非パターン化表面の各レーンに対する蛍光強度中央値の関連グラフを示している。
（実施例２）
ナノウェル基材における、ＰＡＺＡＭによりパターン化した表面の調製
ＰＡＺＡＭポリマーおよび化学機械研磨（ＣＭＰ）によりナノウェル基材を一体化することにより、パターン化された配列決定可能なクラスターを作り出した。ナノウェル基材（直径４００ｎｍ、ピッチ７５０ｎｍ、ウェル深さ３００ｎｍ）をＩｌｌｕｍｉｎａにより開発された知的所有権のあるナノ加工処理による加工を行い、ナノインプリントリソグラフィを使用するＴａｉｗａｎ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ（ＴＳＭＣ）に外部委託した。実施例１のノルボルネンシランを基材の表面全体にＣＶＤにより堆積し、ＰＡＺＡＭをスピンコーティングして、６０〜７０℃に加熱して基材表面にポリマーの共有結合による連結基を作り出した。ＣＭＰ法による、水中の３μｍ ＳｉＯ２マイクロ粒子の１０ｗｔ％スラリーを用いて表面を磨くことにより、介在する共有結合により連結したポリマーを除去した。次に、パターン化したポリマーの基材を標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ プロトコールに従って、プライマーによりグラフトした。Ｔｙｐｈｏｏｎイメージャーを用いて、基材上にパターン化したプライマーを画像化した。次に、ｐｈｉＸ ＤＮＡを基材に接種し、Ｉｌｌｕｍｉｎａの知的所有権のある増幅プロトコールによりクラスターを形成させて、Ｔｗｉｓｔ ＤＸキット（等温増幅）から導いて、配列決定した。配列決定は、標準的なＳＢＳシークエンシング試薬キットを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００で行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉｅｗｅｒを使用してこのメトリクスを抽出した。配列決定の分析データにより、ノルボルネンシラン処理した基材の配列決定メトリクスは、アクリルアミドにより官能基化した基材のそれと等価である。
図２Ａは、ノルボルネン−シラン誘導体（１ａ）によりシラン処理し、続いて、ＰＡＺＡＭによりコーティングして熱的に架橋した、ナノウェルによりパターン化したＤ２６３Ｓｃｈｏｔｔガラス基材を示す。暗いエリアは、過剰のＰＡＺＡＭを化学機械研磨した後、およびＰ５／Ｐ７プライマーをグラフトし、ＴＥＴ色素により誘導体化した相補鎖とハイブリダイズした際に観察された実際の蛍光強度である。図２Ｂは、相補的なＴＥＴ色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズした、同じグラフトノルボルネン（１ａ）によるシラン処理／ＰＡＺＡＭコーティングした非パターン化表面の、各レーンに対する蛍光強度中央値の関連グラフを示す。
ノルボルネンシラン処理された基材は、追加の架橋剤の必要性を排除するばかりではなく、ノルボルネンシラン処理した基材は、ＰＡＺＡＭに対して優先的な親和性を示し、かつＰＡＺＡＭ水溶液の拡散を促進した。その結果、ＰＡＺＡＭコーティングが一層均一になり、基材の品質変動にそれほど敏感ではなかった。図３Ａは、標準的なアクリルアミド官能基化表面を使用するスピンコーティングの典型的な失敗の結果としての、フローセルのｔｙｐｈｏｏｎ画像を示している。図３Ｂは、より均一なコーティングがもたらされているノルボルネンシラン誘導体（１ａ）によるシラン処理したフローセルのｔｙｐｈｏｏｎ画像を示している。図３Ｃは、固−液界面の表面エネルギー間に、エネルギーの大きな不整合が存在する場合でさえも、水の塗りつけと比べて、０．２５％ＰＡＺＡＭ水溶液は、ノルボルネンシラン誘導体（１ａ）によりシラン処理した表面を湿らせることを示している。
（実施例３）
表面安定性試験
ノルボルネンシラン処理／ＰＡＺＡＭコーティング基材も良好な保管寿命を実証した。ＹＥＳ法を使用して、実施例１のノルボルネンシランによりいくつかのパターン化基材および非パターン化基材をシラン処理し、次に、実施例１および２において記載されている方法を使用して、ＰＡＺＡＭコーティングおよび架橋を施した。パターン化基材は、室温、暗所で、デシケーター内のスライド担体に保管した。３０日後、これらの基材を配列決定し、許容されるＴＥＴ ＱＣ結果および配列決定メトリクスをもたらした（図４）。
（実施例４）
ＢＣＮ修飾したオリゴによるプライマーのグラフト
ＰＡＺＡＭによりコーティングした表面にＢＣＮ修飾したオリゴをグラフトする方法の一実施形態は、以下の通りである：標準Ｐ５およびＰ７（チオリン酸およびアルキン）オリゴと同じ配列を含有する５’修飾ＢＣＮ Ｐ５およびＰ７オリゴを使用し、触媒を何ら使用しないで、ＰＡＺＡＭ（０．２５％ｗ／ｖ）によりコーティングしたフローセル表面と反応させた（スキーム２）。まず、表面を３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｏｙｓｉｌａｎｅ）（ＡＰＴＭＳ）で処理し、次いで塩化アクリロイル（無溶媒の塩化アクリロイル８０μＬ、および無水ＭｅＣＮ１８８０μＬ中のＤＩＰＥＡ４０μＬ）または活性化されているアクリロイルＮＨＳエステル（ＫＰｉ中、２０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝８．０、２００ｍＭ）で処理することにより、ＰＡＺＡＭによりコーティングされた表面を調製し、不飽和アクリルアミド基を形成させた。次に、ＰＡＺＡＭをこの不飽和表面に導入し、基材を６０℃で５０〜７５ｍｉｎ、インキュベートした（静置）。一般法は、その全体が参照により明細書に組み込まれている、米国出願第１３／７８４，３６８号に記載されている。フローセルの各レーンに関する詳細な実験条件は、以下の表１に例示されている。
上記のＢＣＮ修飾オリゴの触媒を使用しないグラフトを使用する、フローセルのグラフト表面の初期Ｔｙｐｈｏｏｎ画像が、図５Ａに図示されている。このフローセル表面に熱応力試験を施し、グラフトされたコーティングの頑健性を求め、図５Ｂに示されている結果は、シグナルの低下（表面減少とほぼ相関する）が最小限であり、標準レーンと一致することを実証した。
最適なプライマー密度を得るための実験条件を探索するため、様々な濃度のＢＣＮ修飾オリゴも試験した（表２）。ＰＡＺＡＭによりコーティングしたフローセル表面は、実施例１に記載されているものと同様の手順を使用して、ノルボルネン修飾シランから調製した。次に、様々な濃度のＢＣＮ修飾プライマーをポリマー層にグラフトした。銅不含グラフト法および様々な濃度のＢＣＮプライマーを使用したフローセルのグラフト表面の初期Ｔｙｐｈｏｏｎ画像を図６Ａに実証している。このフローセル表面にも熱応力試験を施し、図６Ｂは、表面の熱応力負荷前および後に実施した、ＴＥＴ ＱＣ解析からの結果を示している。
グラフトしたフローセル表面に行ったブリッジ増幅は円滑に進行した。蛍光顕微鏡を使用して、これらのクラスターを検査し、それらは対照レーンにおいて成長したものと同等であるように見えた。図７Ａは、ＢＣＮプライマーでグラフトした表面から成長したクラスターの蛍光画像を示している。鋳型の接種濃度は０．５ｐＭとした。同様に、図７Ｂは、鋳型濃度が３ｐＭである場合の、ＢＣＮプライマーによるグラフト表面から成長したクラスターの蛍光画像を示している。
次に、ＢＣＮ修飾オリゴグラフトしたフローセル表面を、ＨｉＳｅｑ装置を使用するいくつかの配列決定実験に取り入れた。メトリクスのレベルの高さは、対照レーンと同等であった。ＳＢＳデータの比較により、配列決定メトリクスのレベルの高さは、標準アルキンオリゴを使用してグラフトしたＰＡＺＡＭ表面から現在のところ得られている結果とかなり同等であることが示される。
（実施例５）
ＢＣＮオリゴによるプライマーのグラフト
本明細書に記載されている基材表面の調製法の一部の実施形態において、原料となる基材をまずシラン誘導体、例えば、ノルボルネン誘導体化シランによりコーティングし、次に、その表面にＰＡＺＡＭをスピンコーティングする。次に、この基材を磨いて組み立て、続いてプライマーのグラフトおよびＱＣを施す。予備グラフトしたＰＡＺＡＭを使用し、溶液中、標準Ｐ５およびＰ７オリゴでＰＡＺＡＭを官能基化することによる基材調製の代替手法も探索した。この方法は、いくつかの重要な利点をもたらす。プライマーのグラフト工程を上流に移動することにより、より効果的なポリマー精製およびオリゴの使用量の一層高度な制御が行われて、表面のプライマーの標的密度を実現することができると思われる。さらに、コーティングした基材表面は、鋳型のハイブリダイゼーションのために必要なプライマーをすでに含有していると思われるので、完成した基材へのワークフローを短縮することができ、こうして、適切にグラフトされた表面を実現するために特化した流体装置を使用する必要がなくなる。
混合したＰ５／Ｐ７ ＢＣＮ修飾プライマー（全濃度＝１５μＭ）の溶液をＰＡＺＡＭ（０．５ｗ／ｖ％）水溶液に加え、得られた混合物を７０℃で２時間、加熱した。室温まで冷却した後、この混合物を使用して、ノルボルネンにより誘導体化したシラン層により予備処理した、標準的なＨｉＳｅｑフローセルをコーティングした（スキーム３）。
予備グラフトした表面に標準的な熱応力試験を施し、シグナルの減少（表面減少に相当する）は、対照と同等であった。Ｉｌｌｕｍｉｎａの標準プロトコールにおいて記載されている標準試薬を用いて、２×２６ＨｉＳｅｑ ＳＢＳ配列決定実験を行った。図８Ａは、予備グラフトしたＰＡＺＡＭ表面から得られたクラスターのタイプを示している。接種鋳型濃度は、低下させた（０．５ｐＭ）。図８Ｂにおいて、接種濃度を３ｐＭまで増加させた、同じフローセルのチャネルからの底面を示している。クラスター密度の変化は、予期される範囲内にあり、したがって、この新しい表面は、対照表面と非常に類似した挙動であることを示している。画像（図８Ａおよび８Ｂ）の検査により、これらのクラスターは、わずかな変動は、半値全幅（ＦＷＨＭ）（見かけ上のクラスターサイズに対する代用として内部で使用している）を考慮することにより見積もられる見かけ上のクラスター「サイズ」であるという、典型的なものであることを示している。これは、こうしたクラスターの強度が低下したことと一致している。予備グラフトした、対照とＢＣＮ修飾プライマーでグラフトしたチャネルに関するＳＢＳメトリクス間の比較により、ＳＢＳサイクルは、表面に生じるクラスターから進行したことが確認される。
ＭｉＳｅｑ装置を使用して、類似のより長いＳＢＳの実験を行った。この場合、標準ＰＡＺＡＭ溶液を７０℃で３時間、ＢＣＮ修飾プライマーとインキュベートした。次に、標準プロトコールに従い、得られたグラフトポリマー混合物をノルボルネン官能基化ＭｉＳｅｑフローセルに塗布した。オンボードのクラスター生成に続き、標準４チャネルシステムを使用して２×１５１サイクルのＳＢＳ実験を行った。図９は、標準ＭｉｄＳｅｑシステム（２×１５１のＳＢＳ）から得られた予めコンジュゲートされているＰＡＺＡＭ混合物によりコーティングされたチャネル表面から成長したクラスターのサムネイル画像を示す。画像の右側の部分は、画像の左側の部分の拡大図である。
この試行からのすべてのサイクルに関するＳＢＳ画像は、標準（ＳＦＡおよびＰＡＺＡＭ）ＳＢＳ実験に由来するものと同等である。シグナル対ノイズ比の測定値は、標準表面と比べて、やはり非常に類似しており、配列決定の間に、色素分子の明らかな取込みは起こっていないことを示している（すなわち、このポリマーコーティングは、さらなる変化を受けていないように見える）。

Claims (21)

  1. シランまたはシラン誘導体に共有結合している、シクロアルケン、ヘテロシクロアルケン、および必要に応じて置換されているそれらの改変体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される第１の複数の不飽和部分と官能基化分子との反応を介して該官能基化分子に共有結合した該シランまたはシラン誘導体を含む第１の表面を含む基材。
  2. 前記第１の複数の不飽和部分が、ノルボルネン、ヘテロノルボルネン、ノルボルネン誘導体、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン誘導体、および必要に応じて置換されているそれらの改変体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の基材。
  3. 前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているノルボルネンである、請求項１または２に記載の基材。
  4. 前記基材の前記第１の表面上の前記シランまたはシラン誘導体が、以下の式

    を含むシラン化合物から調製され、
    式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、必要に応じて置換されているアルキル、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているアリールオキシ、必要に応じて置換されているヘテロアリール、および必要に応じて置換されているヘテロアリールオキシからなる群からそれぞれ独立して選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基材。
  5. Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ のうちの少なくとも１つが、ケイ素原子を前記表面に結合させる、請求項４に記載の基材。
  6. 前記シランまたはシラン誘導体のケイ素原子と前記第１の複数の不飽和部分との間に共有結合しているリンカーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の基材。
  7. 前記リンカーが、必要に応じて置換されているアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロアルキレン、必要に応じて置換されているシクロアルキレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、必要に応じて置換されているポリエチレングリコール、および開裂可能なリンカー、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の基材。
  8. 前記官能基化分子が、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの組合せを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の基材。
  9. 前記官能基化分子が、必要に応じて置換されているアルケニル、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、カルボキシル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群から選択される官能基を含み、但し、該官能基化分子はノルボルネンでも重合ノルボルネンでもない、請求項８に記載の基材。
  10. 前記シラン化合物が結合した表面が、式

    を含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の基材。
  11. 前記官能基化分子が、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオール、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の官能基を含むポリマーである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の基材。
  12. 前記官能基化分子が、式（Ｉ）の繰り返し単位および式（ＩＩ）の繰り返し単位

    （式中、
    Ｒ１は、Ｈまたはアルキルであり、
    ＲＡは、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロンおよびチオールからなる群から選択され、
    Ｘは、必要に応じて置換されているアルキレンリンカーまたは必要に応じて置換されているヘテロアルキレンリンカーであり、
    Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、Ｒ６、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８および−ＮＲ７Ｒ８からなる群からそれぞれ独立して選択され、
    Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル、ならびに必要に応じて置換されているそれらの改変体からなる群から選択され、
    Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立してＨまたはアルキルであるか、Ｒ７およびＲ８は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ ７ Ｒ ８ または−ＮＲ ７ Ｒ ８ において、それらが結合している１個または複数の原子と一緒になって複素環を形成する）を含む、請求項１１に記載の基材。
  13. Ｒ Ａは、アジド、必要に応じて置換されているアミノ、必要に応じて置換されているアルケニル、必要に応じて置換されているヒドラゾン、必要に応じて置換されているヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要に応じて置換されているテトラゾール、必要に応じて置換されているテトラジンおよびチオールからなる群から選択され、
    Ｒ４は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、
    Ｒ５は、Ｈまたは必要に応じて置換されているアルキルであり、
    それぞれのＲ４’およびＲ５’はＨであり、
    Ｘは、必要に応じて置換されている−（ＣＨ２）−ｐであり、
    ｐは、１〜５０の範囲の整数である、請求項１２に記載の基材。
  14. 前記官能基化分子が、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の基材。
  15. シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、アルキンおよび必要に応じて置換されているそれらの改変体もしくは組合せからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの第２の複数の不飽和部分と前記官能基化分子との反応を介して前記官能基化分子に共有結合している該オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の基材。
  16. 前記第２の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているビシクロノニン、好ましくはビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インから選択される、請求項１５に記載の基材。
  17. 請求項１に記載の基材の第１の表面を調製する方法であって、
    該第１の表面を含む該基材を用意する工程であって、該第１の表面が、該基材の該第１の表面に共有結合している、シクロアルケン、ヘテロシクロアルケン、および必要に応じて置換されているそれらの改変体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される第１の複数の不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体を含む、工程、および
    官能基化分子の官能基を該第１の複数の不飽和部分と反応させることにより、該官能基を含む該官能基化分子を該シランまたはシラン誘導体に共有結合させる工程
    を含む、方法。
  18. シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、アルキンおよび必要に応じて置換されているそれらの改変体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される第２の複数の不飽和部分を含むオリゴヌクレオチドを用意する工程、
    該オリゴヌクレオチドの該第２の複数の不飽和部分を前記官能基化分子の前記官能基と反応させて、共有結合を形成する工程
    をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記官能基化分子が、前記シランまたはシラン誘導体と反応させる前にオリゴヌクレオチドに共有結合させられる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記官能基化分子が、前記シランまたはシラン誘導体と反応させた後にオリゴヌクレオチドに共有結合させられる、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記第１の複数の不飽和部分が、必要に応じて置換されているノルボルネンである、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
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