CN105431554B - 无催化剂的表面官能化和聚合物接枝 - Google Patents

无催化剂的表面官能化和聚合物接枝 Download PDF

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Abstract

本文所描述的某些实施方案涉及具有包含硅烷或硅烷衍生物的表面的基底，所述硅烷或硅烷衍生物共价连接至任选取代的环烯或任选取代的杂环烯，用于与官能化目标分子如聚合物、水凝胶、氨基酸、核苷、核苷酸、肽、多核苷酸或蛋白直接缀合。在某些实施方案中，所述硅烷或硅烷衍生物含有任选取代的降冰片烯或降冰片烯衍生物。还公开了用于制备官能化表面的方法以及在DNA测序和其他诊断应用中的用途。

Description

无催化剂的表面官能化和聚合物接枝
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年7月1日提交的美国临时专利申请第61/841,647号和于2014年3月27日提交的美国临时专利申请第61/971,381号的优先权权益，将其各自通过引用明确地整体并入本文。
发明领域
大体上，本申请涉及化学、生物和材料科学领域。更具体地，本申请涉及具有包含硅烷或硅烷衍生物的表面的基底，所述硅烷或硅烷衍生物包含与其共价连接的任选取代的不饱和部分，所述不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯或杂环炔，用于与官能化目标分子直接缀合。还公开了制备官能化表面的方法以及在DNA测序和其他诊断应用中的用途。
发明背景
包被有聚合物或水凝胶的基底被用于许多技术应用中。例如，植入式的医疗装置可用生物学惰性聚合物包被。在另一实例中，包被有聚合物或水凝胶的基底被用于制备和/或分析生物学分子。分子的分析，如某些核酸测序方法依赖于将核酸链连接于基底的包被有聚合物或水凝胶的表面。然后可通过本领域已知的多种不同方法测定所连接的核酸链的序列。
在某些边合成边测序方法中，流动池的一个或多个表面被核酸与之连接的聚合物或水凝胶包被。当前的商业流动池利用非连接性凝胶包被层(gel coating)。使用适当的缀合化学可提供具有共价连接的凝胶包被层的商业上可行的流动池。诸如材料的费用、与制造过程的兼容性、储存和运送期间的稳定性以及支持下游化学过程步骤(如核酸扩增和测序)的能力的考虑，是要考虑的重要因素。从本公开可以清楚，该公开提供了具有某些优点的具体有益的化学过程。
发明概述
本申请公开了制备用于直接缀合适当官能化的目标水凝胶、聚合物、分子或生物分子的基底表面的新方法。所述表面用包含第一多个任选取代的不饱和部分的硅烷或硅烷衍生物处理，所述不饱和部分直接地或通过连接基团与硅烷或硅烷衍生物的硅原子共价结合，且其选自：环烯、环炔、杂环烯或杂环炔，如降冰片烯、环辛烯、环辛炔、二环炔，或者在不需要催化剂或另外的交联剂的情况下，其中呈现环张力的任何环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或者其衍生物。在具体的实施方案中，本申请的实施取消了另外的交联化合物或催化剂的使用，并且提供单表面修饰方法作为常规起点，以获得用于DNA测序和其他诊断应用的大多数官能化表面。此外，据发现，根据本申请相应地制备的基底表面具有较高的稳定性，其导致较长的贮藏寿命和储存时降低的表面污染。最后，据发现，与标准的硅烷类(如APTES或APTMS)相比，根据本申请制备的基底表面具有独特的表面亲和力，其导致更好的可湿性(用基于水的组分)和更均匀的包被。
本申请也公开了将引物接枝至基底表面的新方法。在一个实施方案中，所述表面用包含第一多个任选取代的不饱和部分的硅烷或硅烷衍生物处理，所述第一多个任选取代的不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯或杂环炔，且在不需要催化剂或其他交联剂的情况下，所述第一多个任选取代的不饱和部分直接地或通过连接基团与硅烷或硅烷衍生物的硅原子共价连接。然后，将引物与具有官能团的官能化分子预缀合，所述官能团与寡核苷酸共价连接，其中所述寡核苷酸包含选自以下的第二多个任选取代的不饱和部分：环烯、环炔、杂环烯或杂环炔，如环辛炔或二环炔，例如，二环[6.1.0]壬-4-炔。最后，通过使官能化分子的官能团与硅烷或硅烷衍生物的不饱和部分反应，将预缀合引物共价连接至硅烷或硅烷衍生物。
本文所描述的某些实施方案涉及基底，其包含含有硅烷或硅烷衍生物的第一表面，所述硅烷或硅烷衍生物通过与其硅原子共价连接的第一多个不饱和部分共价连接至官能化分子，所述第一多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合。在某些实施方案中，所述基底还包含通过第二多个不饱和部分与官能化分子共价连接的寡核苷酸，所述第二多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合。
本文所描述的某些实施方案涉及将包含官能团的官能化分子固定至基底的第一表面的方法，所述方法包括：将包含第一多个不饱和部分的硅烷或硅烷衍生物应用于基底的第一表面，所述第一多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合，且所述第一多个不饱和部分与所述硅烷或硅烷衍生物共价连接；以及通过使官能化分子的官能团与第一多个不饱和部分反应，将官能化分子共价连接至硅烷或硅烷衍生物以形成包被层。在某些实施方案中，所述方法还包括提供包含第二多个不饱和部分的寡核苷酸，所述第二多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合；以及使所述寡核苷酸的第二多个不饱和部分与官能化分子的官能团反应以形成共价键合。
本文所描述的某些实施方案涉及将引物接枝至基底的第一表面的方法，所述方法包括：
提供基底，其包含在基底的第一表面上的包被层，其中所述包被层包含硅烷或硅烷衍生物，所述硅烷或硅烷衍生物通过其第一多个不饱和部分与官能化分子共价连接，其中所述官能化分子包含官能团，并且其中所述第一多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合；
使包含第二多个不饱和部分的寡核苷酸与所述包被层接触，所述第二多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合；以及
使所述寡核苷酸的第二多个不饱和部分与官能化分子的官能团反应以形成共价键合。在某些实施方案中，所述包被层通过以下步骤制备：将包含第一多个不饱和部分的硅烷或硅烷衍生物应用于基底的所述第一表面上，以及通过使官能化分子的官能团与第一多个不饱和部分反应，将官能化分子共价连接至硅烷或硅烷衍生物。
本文所描述的某些实施方案涉及将引物接枝至基底的第一表面上的方法，所述方法包括：
提供基底，其具有包含硅烷或硅烷衍生物的第一表面，其中所述硅烷或硅烷衍生物包含选自以下的第一多个不饱和部分：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合，所述第一多个不饱和部分与基底的第一表面上的硅烷或硅烷衍生物共价连接；
提供预缀合的引物，其包含与官能化分子共价连接的寡核苷酸，其中所述官能化分子包含官能团，以及
使预缀合的引物与硅烷或硅烷衍生物接触，通过使官能化分子的官能团与所述硅烷或硅烷衍生物的第一多个不饱和部分反应形成共价键合，使得预缀合的引物被共价连接至所述基底的第一表面。
在某些实施方案中，通过使所述官能化分子的官能团与所述寡核苷酸的第二多个不饱和部分反应形成共价键来制备预缀合的引物，其中所述寡核苷酸的所述第二多个不饱和部分选自：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合。
在本文所描述的任何实施方案中，所述第一多个不饱和部分可选自：降冰片烯、杂降冰片烯、降冰片烯衍生物、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、环辛炔、二环炔或其任选取代的变体或者它们的组合。在某些其他实施方案中，也可使用呈现环张力的任何其他环烯、环炔、杂环烯或杂环炔。在某些实施方案中，所述第一多个不饱和部分可为任选取代的降冰片烯。在某些实施方案中，所述第一多个不饱和部分可为任选取代的环辛炔。在某个实施方案中，所述第一多个不饱和部分可选自任选取代的二环壬炔。在某些实施方案中，所述任选取代的二环壬炔包括二环[6.1.0]壬-4-炔。
在本文所描述的任何实施方案中，所述寡核苷酸的第二多个不饱和部分可选自：降冰片烯、杂降冰片烯、降冰片烯衍生物、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、环辛炔、二环炔或其任选取代的变体或者它们的组合。在某些其他实施方案中，也可使用呈现环张力的任何其他环烯、环炔、杂环烯或杂环炔。在某些实施方案中，所述第二多个不饱和部分可为任选取代的环辛炔。在某些实施方案中，所述第二多个不饱和部分可为任选取代的二环壬炔。在某些其他实施方案中，所述任选取代的二环壬炔包括二环[6.1.0]壬-4-炔。
在本文所描述的任何实施方案中，所述硅烷或硅烷衍生物可包含下式：
其中R1、R2和R3可各自独立地选自：氢、卤素、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的芳氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基氧基。在某些实施方案中，各个R1、R2和R3可独立地选自任选取代的烷氧基。在某些这样的实施方案中，R1、R2和R3各自为甲氧基。
在本文所描述的任何实施方案中，所述硅烷或硅烷衍生物可通过化学气相沉积应用于所述第一表面。在某些其他实施方案中，所述硅烷或硅烷衍生物可通过产量工程***(YES)法应用于所述第一表面。
在本文所描述的任何实施方案中，所述硅烷或硅烷衍生物还包含在硅烷或硅烷衍生物的硅原子和所述第一多个不饱和部分之间共价连接的连接基团。在某些这样的实施方案中，所述连接基团选自：任选取代的亚烷基、任选取代的亚杂烷基、任选取代的亚环烷基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、任选取代的聚乙二醇、可裂解的连接基团或它们的组合。在某些这样的实施方案中，所述连接基团为任选取代的亚烷基连接基团。在某些其他这样的实施方案中，所述连接基团为任选取代的亚乙基连接基团。在某些其他这样的实施方案中，所述连接基团为可裂解的连接基团。在某些这样的实施方案中，所述可裂解的连接基团选自：(-S-S-)、酯、硝基苯、亚胺、肽、寡核苷酸或多核苷酸。
在本文所描述的任何实施方案中，所述官能化分子包括聚合物、水凝胶、氨基酸、肽、核苷、核苷酸、多核苷酸、蛋白或它们的组合。在某些实施方案中，所述官能化分子选自：聚合物、水凝胶、氨基酸、肽、核苷、核苷酸、多核苷酸、蛋白或它们的组合。在某些其他实施方案中，所述官能化分子为包含一个或多个选自以下的官能团的水凝胶或聚合物：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、氧化腈、硝酮或硫醇。在某些实施方案中，所述官能化分子包括聚合物或水凝胶，所述聚合物或水凝胶包含下文“实施方式详述”中所述式(I)的重复单元和式(II)的重复单元。在某些实施方案中，所述官能化分子包括聚合物，所述聚合物包含以下“实施方式详述”中所述的式(III)或式(III')。
在本文所描述的任何实施方案中，所述官能化分子包含选自以下的官能团：任选取代的烯基、叠氮基、任选取代的氨基、羧基、任选取代的腙、任选取代的肼、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、氧化腈、硝酮或硫醇，条件是官能化分子不为降冰片烯和聚合的降冰片烯。在某些这样的实施方案中，所述官能化分子包含叠氮基基团。在某些实施方案中，所述官能化分子为聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
在本文所描述的任何实施方案中，所述基底选自：玻璃基底、硅基基底(silicasubstrate)、石英、塑料基底、金属基底、金属氧化物基底或它们的组合。在一个实施方案中，所述基底为玻璃基底。
在本文所描述的任何实施方案中，所述第一表面包含官能化分子包被区和惰性区。在某些实施方案中，所述惰性区选自：玻璃区、金属区、掩蔽区、空隙区或它们的组合。在一个实施方案中，所述惰性区包括玻璃。
在本文所描述的方法的任何实施方案中，所述方法还可包括洗涤步骤，以去除过量的未结合的官能化分子。
在本文所描述的方法的任何实施方案中，所述方法还可包括干燥步骤。
在本文所描述的接枝引物的方法的任何实施方案中，所述方法还可包括洗涤步骤，以去除过量的未结合的寡核苷酸。
附图简述
图1A显示了被降冰片烯-硅烷衍生物[(5-二环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷(1a)硅烷化并且随后被PAZAM包被且与PAZAM热交联的玻璃基底。
图1B显示硅烷化的接枝降冰片烯硅烷衍生物(1a)/PAZAM包被的无图案化表面与含TET染料的互补寡核苷酸序列杂交的Typhoon中值强度的相关图表。
图2A显示具有纳米微孔(nanowell)的图案化玻璃基底，其被降冰片烯-硅烷衍生物(1a)硅烷化，随后被PAZAM包被并与PAZAM热交联。
图2B显示硅烷化的接枝降冰片烯硅烷衍生物(1a)/PAZAM包被的无图案化表面与含TET染料的互补寡核苷酸序列杂交的中值荧光强度的相关图表。
图3A显示使用丙烯酰胺官能化基底的接枝表面与含染料的互补寡核苷酸序列杂交的Typhoon荧光图像。
图3B显示使用降冰片烯硅烷衍生物(1a)硅烷化的PAZAM包被基底的接枝表面与含染料的互补寡核苷酸序列杂交的Typhoon荧光图像。
图3C显示0.25％PAZAM水溶液使降冰片烯硅烷衍生物(1a)硅烷化的表面变湿。
图4显示来自通过实施例1所述方法制备的基底的接枝引物的测序指标。
图5A显示使用不含铜的接枝方法具有BCN修饰的引物的基底接枝表面的最初Typhoon图像。
图5B的线状和条状图表描述了用BCN修饰的引物接枝PAZAM表面后的最初TET QC数据和热应力试验后测定的表面损失百分比。
图6A显示使用不含铜的接枝方法和不同浓度BCN修饰的引物的基底的接枝表面的最初Typhoon图像。
图6B的线状和条状图表描述了用不同浓度BCN修饰的引物接枝PAZAM表面后的最初TET QC数据和热应力试验后测定的表面损失百分比。
图7A显示从具有低簇密度的BCN修饰的引物接枝表面所生长的簇的荧光图像。
图7B显示从具有高簇密度的BCN修饰的引物接枝表面所生长的簇的荧光图像。
图8A和8B显示来自从标准HiSeq***获得的包被有预缀合PAZAM混合物的通道的两个表面的簇的缩略图。
图9显示来自从标准MiSeq***获得的来自包被有预缀合PAZAM混合物的通道的一个表面的簇的缩略图。
实施方式详述
本发明的实施方案涉及官能化分子与被硅烷或硅烷衍生物官能化的基底表面的缀合，所述硅烷或硅烷衍生物具有与其硅原子共价结合的选自以下的任选取代的不饱和部分：环烯、环炔、杂环烯或杂环炔。在一个实施方案中，所述官能化分子为水凝胶、聚合物或预期被连接至基底的其他分子。在某些实施方案中，通过降冰片烯衍生物(如降冰片烯-衍生化硅烷，如[(5-二环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷)，将所述官能化分子缀合至表面。在某些实施方案中，通过环炔-衍生化硅烷(如环辛炔或二环壬炔-衍生化硅烷，例如二环[6.1.0]壬-4-炔衍生化硅烷，或者它们的混合物)，将所述官能化分子缀合至表面。
某些实施方案涉及用于进行边合成边测序反应的流动池，其包含通过降冰片烯-衍生化硅烷的连接、环辛炔-衍生化硅烷的连接或二环壬炔-衍生化硅烷的连接与玻璃基底缀合的水凝胶，如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(“PAZAM”)。
某些实施方案涉及用于进行边合成边测序反应的流动池，其包含通过环辛炔或二环壬炔-衍生化连接(如二环[6.1.0]壬-4-炔衍生化连接)与包被有水凝胶或聚合物的基底表面缀合的寡核苷酸，如P5或P7引物。
定义
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有规定，本文提及的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物通过引用整体并入本文。在本文的术语存在多种定义的事件中，除非另有规定，以在该部分中的定义为准。除非上下文另有明确指示，如说明书和所附的权利要求中所用，单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。除非另有指示，采用质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。除非另有规定，“或”或者“和”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括(include)”、“包含(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。如在该说明书中所用，无论是在过渡的短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”应被解释为具有开放式含义。即，该术语应被解释为与短语“具有至少”或“包括至少”同义。当在方法的环境中使用时，术语“包括”意指所述方法包括至少所列的步骤，但可包括其他步骤。当在化合物、组合物或装置的环境中使用时，术语“包含”意指化合物、组合物或装置包含至少所列的特征或组分，但也可包含其他特征或组分。
本文所用的段落标题仅出于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
如本文所用，常规的有机物的缩写定义如下：
Ac 乙酰基
Ac2O 乙酸酐
APTS 氨丙基硅烷
APTES (3-氨丙基)三乙氧基硅烷
APTMS (3-氨丙基)三甲氧基硅烷
aq. 水(的)
Azapa N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺
BCN 二环[6.1.0]壬-4-炔
BHT 丁羟甲苯
Bn 苄基
Brapa或BRAPA N-(5-溴乙酰氨基戊基)丙烯酰胺
Bz 苯甲酰基
BOC或Boc 叔丁氧羰基
Bu 正丁基
cat. 催化剂
Cbz 苄氧羰基
CMP 化学机械抛光
CyCl 氰尿酰氯
CVD 化学气相沉积
℃ 摄氏度温度
dATP 脱氧腺苷三磷酸
dCTP 脱氧胞苷三磷酸
dGTP 脱氧鸟苷三磷酸
dTTP 脱氧胸苷三磷酸
DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCA 二氯乙酸
DCE 1,2-二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DIEA 二异丙基乙胺
DIPEA 二异丙基乙胺
DMA 二甲基乙酰胺
DME 二甲氧基乙烷
DMF N,N'-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DPPA 叠氮磷酸二苯酯
Et 乙基
EtOAc 乙酸乙酯
g 克
GPC 凝胶渗透色谱
h或hr 小时
iPr 异丙基
KPi pH 7.0的10mM磷酸钾缓冲液
KPS 过硫酸钾
IPA 异丙醇
LCMS 液相色谱-质谱法
LDA 二异丙基氨基锂
m或min 分钟
mCPBA 间氯过氧苯甲酸
MeOH 甲醇
MeCN 乙腈
mL 毫升
MTBE 甲基叔丁醚
NaN3 叠氮化钠
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
NHS-AA 丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯
PAZAM 丙烯酰胺与Azapa的任意比率的聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)
PG 保护基
Ph 苯基
PMEDTA N,N,N',N”,N”-五甲基二亚乙基三胺
ppt 沉淀物
rt 室温
SBS 边合成边测序
SFA 于美国专利公开第2011/0059865号中定义的无硅烷丙烯酰胺
磺基-HSAB或SHSAB N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯
TEA 三乙胺
TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基
TCDI 1,1'-硫代羰基二咪唑
Tert，t 第三位的；叔位的
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TEMED 四甲基乙二胺
YES 产量工程***
μL 微升
如本文所用，术语“阵列”指与一个或多个底物连接的不同探针分子的群体，使得不同的探针分子可根据相对位置彼此区分开来。阵列可包含不同的探针分子，所述探针分子各自位于基底上不同的可寻址位置。可选地或此外，阵列可包含单独的基底，每个基底携带不同探针分子，其中可根据基底在其所连接至的表面的位置或根据基底在液体中的位置鉴定不同的探针分子。其中单独的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于，包含如美国专利第6,355,431 B1号、第2002/0102578号和PCT公开第WO 00/63437号中所述的孔中小珠的阵列。可被用于本申请以区分液体阵列中小珠的示例性模式，例如使用微流体装置(如荧光激活细胞分选仪(FACS)，其描述于例如美国专利第6,524,793号中。可被用于本申请的阵列的其他实例包括但不限于以下文献中所描述的阵列：美国专利第5,429,807号；第5,436,327号；第5,561,071号；第5,583,211号；第5,658,734号；第5,837,858号；第5,874,219号；第5,919,523号；第6,136,269号；第6,287,768号；第6,287,776号；第6,288,220号；第6,297,006号；第6,291,193号；第6,346,413号；第6,416,949号；第6,482,591号；第6,514,751号和第6,610,482号；以及WO 93/17126；WO 95/11995；WO 95/35505；EP 742 287和EP 799897。
如本文所用，术语“共价连接”或“共价结合”指形成这样的化学键，其特征在于原子间共享电子对。例如，共价连接的聚合物包被层(polymer coating)指，相比通过其他手段(例如，吸附或静电的相互作用)与表面的连接，与基底的官能化表面形成化学键的聚合物包被层。应了解，与表面共价连接的聚合物也可通过除共价连接之外的其它手段(例如，物理吸附)连接。
如本文所用，“Ca至Cb”或“Ca-b”指指定基团中的碳原子数，其中“a”和“b”为整数。即，所述基团可含有包括“a”和“b”在内的“a”至“b”个碳原子。因此，例如，“C1至C4烷基”或“C1-4烷基”基团指具有1至4个碳的所有烷基基团，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。
如本文所用，术语“卤素”或“卤基”意指元素周期表第7列的放射性稳定的原子中任一种，例如，氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。
如本文所用，“烷基”指完全饱和(即，不含有双键或三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子(每当在本文出现时，数值范围如“1至20”指给定范围中的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意指烷基基团可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等等，至多且包括20个碳原子组成，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“烷基”的事件)。烷基基团也可为具有1至9个碳原子的中等大小的烷基。烷基基团也可为具有1至4个碳原子的低级烷基。烷基基团可被指定为“C1-4烷基”或类似的指定。仅通过实例的方式，“C1-4烷基”表示烷基链上存在一至四个碳原子，即，烷基链选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基基团包括但决不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等等。
如本文所用，“烷氧基”指式–OR，其中R为如上所定义的烷基，如“C1-9烷氧基”，其包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等等。
如本文所用，“烷硫基”指式–SR，其中R为如上所定义的烷基，如“C1-9烷硫基”等等，其包括但不限于：甲硫基、乙硫基、正丙硫基、1-甲基乙硫基(异丙硫基)、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基等等。
如本文所用，“烯基”指含有一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“烯基”的事件。烯基基团也可为具有2至9个碳原子的中等大小的烯基。烯基基团也可为具有2至4个碳原子的低级烯基。烯基基团可被指定为“C2-4烯基”或类似的指定。仅通过实例的方式，“C2-4烯基”表示烯基链上存在两个至四个碳原子，即，烯基链选自：乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2,-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基。典型的烯基基团包括但决不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等等。
如本文所用，“炔基”指含有一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“炔基”的事件。炔基基团也可具有2至9个碳原子的中等大小的炔基。炔基基团也可为具有2至4个碳原子的低级炔基。炔基基团可被指定为“C2-4炔基”或类似的指定。仅通过实例的方式，“C2-4炔基”表示炔基链上存在两个至四个碳原子，即，炔基链选自：乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基。典型的炔基基团包括但决不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基，等等。
如本文所用，“杂烃基”指在链骨架上含有一个或多个杂原子的直链或支链烃，所述杂原子为除碳以外的元素，其包括但不限于氮、氧和硫。杂烃基基团可具有1至20个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“杂烃基”的事件。杂烃基基团也可为具有1至9个碳原子的中等大小的杂烃基。杂烃基基团也可为具有1至4个碳原子的低级杂烃基。杂烃基基团可被指定为“C1-4杂烃基”或类似的指定。杂烃基基团可含有一个或多个杂原子。仅通过实例的方式，“C1-4杂烃基”表示杂烃基链上有一至四个碳原子以及在链骨架上另有一个或多个杂原子。
如本文所用，“亚烷基”意指仅含有碳和氢的完全饱和的直链或支链的双自由基化学基团，其通过两个连接点连接于分子的剩余部分(即，烷二基)。亚烷基基团可具有1至20,000个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“亚烷基”的事件。亚烷基基团也可为具有1至9个碳原子的中等大小的亚烷基。亚烷基基团也可为具有1至4个碳原子的低级亚烷基。亚烷基基团可被指定为“C1-4亚烷基”或类似的指定。仅通过实例的方式，“C1-4亚烷基”表示亚烷基链上存在一至四个碳原子，即，亚烷基链选自：亚甲基、亚乙基、乙-1,1-二基、亚丙基、丙-1,1-二基、丙-2,2-二基、1-甲基-亚乙基、亚丁基、丁-1,1-二基、丁-2,2-二基、2-甲基-丙-1,1-二基、1-甲基-亚丙基、2-甲基-亚丙基、1,1-二甲基-亚乙基、1,2-二甲基-亚乙基和1-乙基-亚乙基。
如本文所用，术语“亚杂烷基”指其中亚烷基的一个或多个骨架原子选自除碳之外的原子(例如，氧、氮、硫、磷或它们的组合)的亚烷基链。亚杂烷基链可具有2至20,000的长度。示例性的亚杂烷基包括但不限于：-OCH2-、-OCH(CH3)-、-OC(CH3)2-、-OCH2CH2-、-CH(CH3)O-、-CH2OCH2-、-CH2OCH2CH2-、-SCH2-、-SCH(CH3)-、-SC(CH3)2-、-SCH2CH2-、-CH2SCH2CH2-、-NHCH2-、-NHCH(CH3)-、-NHC(CH3)2-、-NHCH2CH2-、-CH2NHCH2-、-CH2NHCH2CH2-等等。
如本文所用，“亚烯基”意指仅含有碳和氢且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链双自由基化学基团，其通过两个连接点连接于分子的其余部分。亚烯基基团可具有2至20,000个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“亚烯基”的事件。亚烯基基团也可为具有2至9个碳原子的中等大小的亚烯基。亚烯基基团也可为具有2至4个碳原子的低级亚烯基。亚烯基基团可被指定为“C2-4亚烯基”或类似的指定。仅通过实例的方式，“C2-4亚烯基”表示亚烯基链上存在两个至四个碳原子，即，亚烯基链选自：亚乙烯基、乙烯-1,1-二基、亚丙烯基、丙烯-1,1-二基、丙-2-烯-1,1-二基、1-甲基-亚乙烯基、丁-1-亚烯基、丁-2-亚烯基、丁-1,3-亚二烯基、丁烯-1,1-二基、丁-1,3-二烯-1,1-二基、丁-2-烯-1,1-二基、丁-3-烯-1,1-二基、1-甲基-丙-2-烯-1,1-二基、2-甲基-丙-2-烯-1,1-二基、1-乙基-亚乙烯基、1,2-二甲基-亚乙烯基、1-甲基-亚丙烯基、2-甲基-亚丙烯基、3-甲基-亚丙烯基、2-甲基-丙烯-1,1-二基和2,2-二甲基-乙烯-1,1-二基。
如本文所用，“亚炔基”意指仅含有碳和氢且含有至少一个碳-碳三键的直链或支链双自由基化学基团，其通过两个连接点连接于分子的其余部分。
术语“芳香性的”指具有共轭的π电子体系的环或环系，且包括碳环芳香族(例如，苯基)和杂环芳香族(例如，吡啶)基团。该术语包括单环或稠环多环(即，共享邻近的原子对的环)基团，条件是整个环系为芳香性的。
如本文所用，“芳基”指环骨架上仅含有碳的芳香环或环系(即，共享两个邻近的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该体系中每个环均为芳香性的。芳基基团可具有6至18个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“芳基”的事件。在某些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可被指定为“C6-10芳基”、“C6或C10芳基”或类似的指定。芳基基团的实例包括但不限于：苯基、萘基、薁基和蒽基。
如本文所用，“亚芳基”指仅含有碳和氢的芳香环或环系，其通过两个连接点连接于分子的其余部分。
如本文所用，“芳氧基”和“芳硫基”指RO-和RS-，其中R为如上所定义的芳基，如“C6-10芳氧基”或“C6-10芳硫基”等等，其包括但不限于苯氧基。
“芳烷基”或“芳基烷基”为经亚烷基基团连接的作为取代基的芳基基团，如“C7-14芳烷基”等等，其包括但不限于：苄基、2-苯乙基、3-苯丙基和萘烷基。在某些实例中，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C1-4亚烷基基团)。
如本文所用，“杂芳基”指环骨架上含有一个或多个杂原子的芳香环或环系(即，共享两个邻近原子的两个或更多个稠环)，所述杂原子为除碳之外的元素，其包括但不限于氮、氧和硫。当杂芳基为环系时，该体系中每个环为芳香性的。杂芳基基团可具有5-18个环成员(即，构成环骨架的原子数，其包括碳原子和杂原子)，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“杂芳基”的事件。在某些实施方案中，杂芳基基团具有5至10元环成员或5至7元环成员。杂芳基基团可被指定为“5-7元杂芳基”、“5-10元杂芳基”或类似的指定。杂芳基环的实例包括但不限于：呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、***基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。
如本文所用，“亚杂芳基”指环骨架上含有一个或多个杂原子的芳香环或环系，其通过两个连接点连接于分子的其余部分。
“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”为经亚烷基基团所连接的作为取代基的杂芳基基团。实例包括但不限于：2-噻吩甲基、3-噻吩甲基、呋喃甲基、噻吩乙基、吡咯烷基、吡啶烷基、异噁唑烷基和咪唑烷基。在某些实例中，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C1-4亚烷基基团)。
如本文所用，“碳环基”意指环系骨架上仅含有碳原子的非芳香环的环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺旋连接的形式连接在一起。碳环基可具有任何的饱和度，条件是环系中至少一个环不是芳香性的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基以及环炔基。碳环基基团可具有3至20个碳原子，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“碳环基”的事件。碳环基基团也可为具有3至10个碳原子的中等大小的碳环基。碳环基基团也可为具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可被指定为“C3-6碳环基”或类似的指定。碳环基环的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、二环[2.2.2]辛基、金刚烷基和螺[4.4]壬基。
“(碳环基)烷基”为经亚烷基基团所连接的作为取代基的碳环基基团，如“C4-10(碳环基)烷基”等等，其包括但不限于：环丙基甲基、环丁基甲基、环丙基乙基、环丙基丁基、环丁基乙基、环丙基异丙基、环戊基甲基、环戊基乙基、环己基甲基、环己基乙基、环庚基甲基等等。在某些实例中，亚烷基基团为低级亚烷基基团。
如本文所用，“环烷基”意指完全饱和的碳环基环或环系。实例包括：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，“亚环烷基”意指完全饱和的碳环基环或环系，其通过两个连接点连接于分子的其余部分。
如本文所用，“环烯基”或“环烯”意指具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。实例为环己烯基或环己烯。另一实例为降冰片烯或降冰片烯基。
如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯”意指环骨架上具有至少一个杂原子且具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔”意指具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。实例为环辛炔。另一实例为二环壬炔。
如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔”意指环骨架上具有至少一个杂原子且具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。
如本文所用，“杂环基”意指环骨架上含有至少一个杂原子的非芳香环的环或环系。杂环基可以以稠合、桥接或螺旋-连接的形式连接在一起。杂环基可具有任何饱和度，条件是环系中至少一个环不是芳香性的。杂原子可存在于该环系中的非芳香环或芳香环上。杂环基基团可具有3至20元的环成员(即，构成环骨架的原子数，其包括碳原子和杂原子)，尽管本定义也涵盖了未指定数值范围的术语“杂环基”的事件。杂环基基团也可为具有3至10个环成员的中等大小的杂环基。杂环基基团也可为具有3至6个环成员的杂环基。杂环基基团可被指定为“3-6元杂环基”或类似的指定。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一种或至多三种，以及在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一种或两种选自以下的杂原子：O、N或S。杂环基环的实例包括但不限于：吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙基、环氧己基、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、哌啶基、哌嗪基、二氧哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷基(pyrrolidionyl)、4-哌啶酮基(piperidonyl)、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二氧杂芑基(dioxinyl)、1,3-二氧杂环己基、1,4-二氧杂芑基、1,4-二氧杂环己基、1,3-氧硫杂环己基、1,4-氧硫杂环己二烯基、1,4-氧硫杂环己基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-二氧杂环戊烯基(dioxolyl)、1,3-二氧戊环基、1,3-二硫杂环戊二烯基(1,3-dithiolyl)、1,3-二硫戊环基(dithiolanyl)、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑啉酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂戊环基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。
如本文所用，“亚杂环基”意指含有至少一个杂原子的非芳香环的环或环系，其通过两个连接点连接分子的其余部分。
“(杂环基)烷基”为通过亚烷基基团所连接的作为取代基的杂环基基团。实例包括但不限于咪唑啉基甲基和二氢吲哚基乙基。
如本文所用，“酰基”指–C(＝O)R，其中R为本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。非限制性实例包括：甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯醛基。
“O-羧基”基团指“-OC(＝O)R”基团，其中R选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“C-羧基”基团指“-C(＝O)OR”基团，其中R选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。非限制性实例包括羧基(即，-C(＝O)OH)。
“缩醛”基团指RC(H)(OR')2，其中R和R'独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“氰基”基团指“-CN”基团。
“氰酰”基团指“-OCN”基团。
“异氰酸基”基团指“-NCO”基团。
“硫氰酸基”基团指“-SCN”基团。
“异硫氰酸基”基团指“-NCS”基团。
“亚磺酰基”基团指“-S(＝O)R”基团，其中R选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“磺酰基”基团指“-SO2R”基团，其中R选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“S-磺酰氨基”基团指“-SO2NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“N-磺酰氨基”基团指“-N(RA)SO2RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
如本文所用，“氧化腈”指“RC≡N+O-”基团，其中R选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基或5-10元杂环基。制备氧化腈的非限制性实例包括，通过用氯胺-T处理或通过碱对氯肟[RC(Cl)＝NOH]的作用由醛肟原位产生。
如本文所用，“硝酮”指“RARBC＝NRc +O-”基团，其中RA、RB和Rc各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基或5-10元杂环基。
“O-氨甲酰基”基团指“-OC(＝O)NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“N-氨甲酰基”基团指“-N(RA)OC(＝O)RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“O-硫代氨甲酰基”基团指“-OC(＝S)NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“N-硫代氨甲酰基”基团指“-N(RA)OC(＝S)RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“C-酰氨基(amido)”基团指“-C(＝O)NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“N-酰氨基”基团指“-N(RA)C(＝O)RB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
“氨基(amino)”基团指“-NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自本文所定义的氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。非限制性实例包括游离的氨基(即-NH2)。
“氨烷基”基团指经亚烷基基团连接的氨基基团。
“烷氧烷基”基团指经亚烷基基团连接的烷氧基基团，如“C2-8烷氧烷基”等等。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”指–NHNH2基团。
如本文所用，术语“腙”或“腙基”指基团。
如本文所用，术语“甲酰基”指–C(O)H基团。
如本文所用，术语“环氧”指
如本文所用，术语“酯”指R-C(＝O)O-R'，其中R和R'可独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选取代的变体。
如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”指–C(O)OH。
如本文所用，术语“硫氰酸根”指–S-C≡N基团。
如本文所用，术语“氧基-胺(oxo-amine)”指–O-NH2基团，其中–NH2中的一个或多个氢可被R基团任选地取代。R可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。
如本文所用，“核苷酸”包含含氮的杂环碱基、糖和一个或多个磷酸基团。它们为核酸序列的单体单元。在RNA中，糖为核糖，而在DNA中，糖为脱氧核糖，即缺乏存在于核糖2'位置上的羟基基团的糖。含氮的杂环碱基可为嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及其修饰衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及其修饰衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9连接。
如本文所用，“核苷”与核苷酸结构上类似，但在5'位置上缺乏任何磷酸基团。如本文所用，术语“核苷”为本领域技术人员所理解的普通含义。实例包括但不限于：包含核糖基团的核糖核苷和包含脱氧核糖基团的脱氧核糖核苷。修饰的戊糖基团为其中氧原子被碳代替和/或碳被硫或氧原子代替的戊糖基团。“核苷”为可具有取代碱基部分和/或糖部分的单体。此外，核苷可被并入较大的DNA和/或RNA聚合物和寡聚体中。
如本文所用，术语“多核苷酸”指核酸，大体上，其包括DNA(例如基因组DNA cDNA)、RNA(例如mRNA)、合成的寡核苷酸和合成的核酸类似物。多核苷酸可包含天然或非天然碱基或者其组合和天然或非天然的骨架连接，例如硫代磷酸酯、PNA或2′-O-甲基-RNA或者其组合。
如本文所用，“BCN引物”或“BCN修饰的引物”指在5'端含有共价连接的二环[6.1.0]壬-4-炔的引物。所述引物被定义为单链DNA(ssDNA)，其具有游离的3'OH基团且5'端有修饰以允许偶联反应。引物长度可为任意的碱基长度数，并且可包含多个非天然核苷酸。
如本文所用，术语“硅烷”指含有一个或多个硅原子的有机或无机化合物。无机硅烷化合物的非限制性实例为SiH4或卤代的SiH4(其中氢被一个或多个卤原子代替)。有机硅烷化合物的非限制性实例为X-RC-Si(ORD)3，其中X为非-可水解的有机基团，如氨基、乙烯基、环氧、甲基丙烯酸酯、硫、烷基、烯基、炔基；RC为隔离基团，例如-(CH2)n-，其中n为0至1000；RD选自本文所定义的氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的芳基、任选取代的5-10元杂芳基和任选取代的5-10元杂环基。如本文所用，术语“硅烷”可包含不同硅烷化合物的混合物。
如本文所用，术语“四嗪”或“四嗪基”指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可被任选地取代。
如本文所用，术语“四唑”或“四唑基”指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可被任选地取代。
如本文所用，术语“不饱和部分”指包含至少一个双键或至少一个三键的化学基团，其包括：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体。不饱和部分可为单价的或二价的。当不饱和部分为单价时，环烯、环炔、杂环烯、杂环炔可与环烯基、环炔基、杂环烯基、杂环炔基可互换地使用。当不饱和部分为二价时，环烯、环炔、杂环烯、杂环炔可与亚环烯基、亚环炔基、亚杂环烯基、亚杂环炔基可互换地使用。
如本文所用，术语“聚合物”指由许多重复的亚单元构成的分子。聚合物可为线性的、分支的或超支化的。分支聚合物的非限制性实例包括：星型聚合物、梳型聚合物、刷子状聚合物、树枝状聚合物、梯状和树状聚合物。本文描述的聚合物也可为聚合物纳米粒子的形式。
如本文所用，前缀“光”或“光-”意指与光辐射或电磁辐射有关。所述术语可涵盖全部或部分的电磁谱，其包括但不限于：通常被称为光谱的无线电、微波、红外线、可见光、紫外线、X-射线或γ射线部分的一个或多个范围。光谱部分可为被表面的金属区(如本文所述的金属)阻挡的光谱。可选地或此外，光谱的部分可为穿过表面空隙区(如由玻璃、塑料、硅或本文所述的其他材料组成的区)的光谱。在具体的实施方案中，可使用能够穿过金属的辐射。可选地或此外，可使用被玻璃、塑料、硅或本文所述的其他材料遮蔽的辐射。
如本文所用，术语“反应位点”意指在本文所描述的官能化分子包被层(coatings)上可被用来通过化学反应或分子相互作用的方式连接一个或多个分子的位点。这样的连接可经共价键或通过其他键合力或相互作用力进行。
如本文所用，术语“YES法”指通过产量工程***(“YES”)所提供的化学气相沉积方法，所述产量工程***具有由Illumina Inc.所研发的化学气相沉积过程。YES法包括三种不同的气相沉积***。自动化的YES-VertaCoat硅烷气相***被指定用于成批生产，其具有可容纳200或300mm晶片的柔性晶片处理模块。手工负载的YES-1224P硅烷气相***被指定用于通用的批量生产，其具有可配置的大容量室。Yes-LabKote为低成本的桌面形式，其用于可行性研究和R&D是理想的。
如本文所用，取代的基团源自未取代的母体基团，其中将一个或多个氢原子换为另一原子或基团。除非另有指示，当基团被视为“取代的”时，其意指基团被一个或多个选自以下的取代基独立地取代：C1-C6烷基，C1-C6烯基，C1-C6炔基，C1-C6杂烃基，C3-C7碳环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，C3-C7-碳环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，卤基，氰基，羟基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)，芳氧基，硫氢基(巯基)，卤(C1-C6)烷基(例如，–CF3)，卤(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)，C1-C6烷硫基，芳硫基，氨基，氨基(C1-C6)烷基，硝基，O-氨甲酰基，N-氨甲酰基，O-硫代氨甲酰基，N-硫代氨甲酰基，C-胺基，N-胺基，S-磺酰氨基，N-磺酰氨基，C-羧基，O-羧基，酰基，氰酰，异氰酸基，氰硫基，异氰硫基，亚磺酰基，磺酰基和氧代(＝O)。每当基团被描述为“任选取代的”时，所述基团被上述取代基取代。
应理解，根据上下文某些自由基的命名惯例可包括单自由基或双自由基。例如，当取代基针对分子的其余部分需要两个连接点时，应理解，所述取代基为双自由基。例如，被认定为需要两个连接点的作为烷基的取代基包括诸如–CH2–、–CH2CH2–、–CH2CH(CH3)CH2–等等的双自由基。其他自由基的命名惯例明确地指出所述自由基是双自由基，如“亚烷基”或“亚烯基”。
每当取代基被描述为双自由基(即，针对分子的其余部分具有两个连接点)时，除非另有指示，应理解为所述取代基可以以任何定向构型的形式连接。因此，例如，被描述为–AE–或的取代基包括被定向使得在分子的最左边连接点处连接A的取代基，以及其中在分子的最右边连接点连接A的情况。
当本文公开的化合物具有至少一个立体中心时，它们可以以各个对映体和非对映体或这样的异构体的混合物(包括外消旋体)的形式存在。通过实施本领域实践者熟知的多种方法，实现各个异构体的分离或各个异构体的选择性合成。除非另有指示，所有这样的异构体或其混合物包括在本文公开的化合物的范围内。此外，本文公开的化合物可以以一种或多种结晶形式或非结晶形式存在。除非另有指示，所有这样的形式包括在本文公开的化合物的范围内，其包括任意多晶型的形式。此外，本文公开的某些化合物可与水形成溶剂化物(即，水合物)或与常规有机溶剂形成溶剂化物。除非另有指示，这样的溶剂化物包括在本文公开的化合物的范围内。
如本文所用，术语“百分比表面剩余”可指使用TET QC对P5/P7表面引物染色所测定的强度。可将P5和P7引物用于Illumina Inc.销售的商业流动池的表面上，用于基于HiSeq、MiSeq、基因组分析仪和NextSeq平台的测序。引物的序列描述于美国专利公开第2011/0059865 A1号，将其通过引用并入本文。TET为染料标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有针对P5/P7引物的互补序列。TET可与表面上的P5/P7引物杂交；可将过量的TET洗涤掉，并且可使用扫描仪器如Typhoon扫描仪(General Electric)，通过荧光检测测定连接的染料浓度。
技术人员公认，本文所描述的某些结构可为化合物的共振形式或互变异构体，所述化合物可被其他化学结构清楚地代表；技术人员公认，这样的结构仅可代表这种化合物样品的非常少部分。这样的化合物被认为在所描述的结构的范围内，尽管这样的共振形式或互变异构体未在本文描述。
硅烷或硅烷衍生物
本文公开的某些实施方案涉及硅烷或硅烷衍生物，其包含多个选自以下的不饱和部分：环烯、环炔、杂环烯、杂环炔或其任选取代的变体或者它们的组合。如本文所用，“环烯”意指具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。如本文所用，“杂环烯”意指在环骨架上含有至少一个杂原子且具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。如本文所用，“环炔”意指具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。如本文所用，“杂环炔”意指环骨架上含有至少一个杂原子且具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中该环系中没有环为芳香性的。在某些实施方案中，杂环烯中的杂原子选自N、O或S。环烯和杂环烯均可被任选地取代。不饱和部分可为单价的或二价的。不饱和部分可直接地共价连接至硅烷或硅烷衍生物的硅原子上，或通过连接基团间接连接。不饱和部分可与官能化分子进一步连接。在某些实施方案中，不饱和部分为任选取代的环烯，如降冰片烯和其衍生物。在某些实施方案中，不饱和部分为任选取代的环辛炔或二环壬炔。呈现环张力的其他环烯、杂环烯、环炔、杂环炔也可被用作不饱和部分。
降冰片烯
在某些实施方案中，所述环烯为降冰片烯或降冰片烯衍生物。
在某些实施方案中，降冰片烯可被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-C6烷基，C1-C6烯基，C1-C6炔基，C1-C6杂烃基，C3-C7碳环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，C3-C7-碳环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，卤基，氰基，羟基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)，芳氧基，硫氢基(巯基)，卤(C1-C6)烷基(例如，–CF3)，卤(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)，C1-C6烷硫基，芳硫基，氨基，氨基(C1-C6)烷基，硝基，O-氨甲酰基，N-氨甲酰基，O-硫代氨甲酰基，N-硫代氨甲酰基，C-胺基，N-胺基，S-磺酰氨基，N-磺酰氨基，C-羧基，O-羧基，酰基，氰酰，异氰酸基，氰硫基，异氰硫基，亚磺酰基，磺酰基和氧代(＝O)。
可选地，降冰片烯上的两个相邻的取代基可形成其他环。例如，表示二取代的降冰片烯，其中Ra和Rb连同和它们连接的原子可以连接在一起以形成任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环基。
在某些实施方案中，降冰片烯可被其他环烯代替。非限制性实例包括：任选取代的反式环辛烯、任选取代的反式环戊烯、任选取代的反式环庚烯、任选取代的反式环壬烯、任选取代的二环[3.3.1]壬-1-烯、任选取代的二环[4.3.1]癸-1(9)-烯、任选取代的二环[4.2.1]壬-1(8)-烯和任选取代的二环[4.2.1]-壬-1-烯。
杂(降冰片烯)
在某些实施方案中，本文所用的杂环烯为杂降冰片烯。如本文所用，(杂)降冰片烯意指降冰片烯分子中的一个或多个碳原子被一个或多个杂原子代替。(杂)降冰片烯的非限制性的实例包括： 或其任选取代的变体。
示例性的降冰片烯的反应
A.与叠氮化物的1,3-偶极环加成
1912年，Wolff首次报道了有机叠氮化物和烯键的反应导致1,2,3-***啉的形成(参见Wolff,Liebigs.Ann.,1912,394,23)。该种反应类型被称为1,3-偶极环加成。叠氮化物添加物与末端炔烃的反应被公认为是Huisgen研究的1,3-偶极环加成反应的实例(参见Proceedings of the Chemical Society,1961,357-396)。Scheiner等人报道了芳基叠氮化物与降冰片烯的动力学研究(参见Scheiner等人,J.Am.Chem.Soc,1965,87,306-311)。总的反应式如下所示：
此外，Shea等人报道了在1,3-偶极环加成中扭转张力的双键与2,4,6-三硝基苯基叠氮化物的反应性的研究。试验了一系列包括反式环烯和桥头烯的单环和二环烯烃(参见，Shea等人,J.Am.Chem.Soc.1992,114,4846-4855)。
B.与四嗪的偶联反应
Hansell等人报道了，通过四嗪和降冰片烯的反转电子要求的Diels-Alder(DAinv)反应，用于聚合物功能化和偶联的不含添加剂的“点击”反应(参见Hansell等，J.Am.Chem.Soc.2011,133,13828-13831)。总反应图式如下所示：
其他示例性的不含金属的点击反应包括(杂-)Diels-Alder和基于自由基的硫醇-烯反应，其报道于Hoyle等人，Chem.Soc.Rev.2010,39,1355-1387。
C.与四唑和腙的偶联反应
Kaya等人报道了，在不含铜的点击反应中降冰片烯氨基酸(1)用于蛋白修饰(参见Kaya等人，Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4466-4469)。在第一实例中，通过碱促进的HCl消除从氯腙产生腈亚胺，并且然后将所述腈亚胺用于与降冰片烯衍生物(1)的环加成反应。在第二实例中，在光化学反应中从四唑产生腈亚胺。
D.与烯烃的开环反应
Kim等人报道了，通过使用表面起始的降冰片烯的开环易位聚合，从携带天然氧化物(Si/SiO2)的硅片表面培养薄聚合物膜的方法。以下的图概括了三步式的步骤：(i)在包含降冰片烯基团的硅上形成自我组装的单层；(ii)将钌催化剂[(Cy3P)2Cl2Ru＝CHPh，Cy＝环己基]连接至表面；以及(iii)加入的单体进行聚合以产生膜(参见Kim等人，Macromolecules 2000,33,2793-2795)。
类似地，Liu等人报道了通过钌催化剂催化降冰片烯衍生物与富电子烯烃的选择性区域的开环/交叉易位反应，如以下图式所示(参见Liu等人，Org.Lett.2005,7,131-133)。
E.与氧化腈的环加成
Gutsmiedl等人报道了张力促进的涉及降冰片烯修饰的DNA基底的氧化腈环加成的第一实例。有张力的烯烃适合与多个氧化腈的环加成，所述氧化腈从氯化羟肟酸(hydroxamoyl chlorides)原位产生或通过用N-氯代琥珀酰亚胺处理亲本肟直接地产生(参见Gutsmiedl等人，Org.Lett.2009,11,2405-2408)。
环辛炔
在某些实施方案中，环炔为环辛炔或环辛炔衍生物。
在某些实施方案中，环炔可被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6杂烃基、C3-C7碳环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，C3-C7-碳环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，卤基，氰基，羟基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)，芳氧基，硫氢基(巯基)，卤(C1-C6)烷基(例如，–CF3)，卤(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)，C1-C6烷硫基，芳硫基，氨基，氨基(C1-C6)烷基，硝基，O-氨甲酰基，N-氨甲酰基，O-硫代氨甲酰基，N-硫代氨甲酰基，C-胺基，N-胺基，S-磺酰氨基，N-磺酰氨基，C-羧基，O-羧基，酰基，氰酰，异氰酸基，氰硫基，异氰硫基，亚磺酰基，磺酰基和氧代(＝O)。
可选地，环辛炔上的两个邻近的取代基可形成其他环。例如，表示二取代环辛炔，其中Ra和Rb连同和它们连接的原子可以连接在一起以形成：任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环基。在某些实施方案中，环辛炔衍生物可包含以下结构：
张力促进的叠氮化物-炔烃的环加成或氧化腈-炔烃的环加成
环辛炔可与叠氮化物进行1,3-环加成。该种类型的张力促进的叠氮化物-炔烃的环加成(SPAAC)反应已被用于不含铜的DNA连接反应中。Van Geel等人已报道了，多种有张力的辛炔可被用于有效标记叠氮化物示踪的蛋白(参见R.van Geel等人,“PreventingThiol-yne Addition Improves the Specificity of Strain-Promoted Azide-炔Cycloaddition,”Bioconjugate Chem.,2012,23,392-398)。类似的研究也被Yao等人报道，其证明了可使用有张力的炔烃将荧光素连接至氨基酸序列(参见Tao等人，“Fluorophoretargeting to cellular proteins via enzyme-mediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition,”J.Am.Chem.Soc.,2012,134,3720-3728)。
将氧化腈、硝酮作为叠氮化偶极子的替代物在与环辛炔反应中的相对活性的最新研究表明，张力促进的炔/氧化腈的环加成有极好的反应性(参见Sanders等人,J.Am.Soc.Chem.2011,133,949-957；Jawalekar等人,Chem.Commun.2011,47,3198-3200；和McKay等人,Chem.Commun.2010,46,931-933)。据观察，二环[6.1.0]壬炔(BCN)与氧化苯腈的[3+2]加成的速率常数，比其与叠氮苄基的相应反应的速率常数大10倍。类似的结果也在二苯并环辛炔(DIBO)与氧化苄腈(从氯化羟肟酸原位产生)或叠氮苄基之间的环加成中观察到。该研究表明前者的反应比后者约快60倍。
二环壬炔
在某些实施方案中，环炔可包括二环环系，例如，二环壬炔。在某些实施方案中，二环壬炔可选自二环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物。在某些其他实施方案中，二环壬炔也可选自二环[6.1.0]壬-2-炔或二环[6.1.0]壬-3-炔。
在某些实施方案中，二环壬炔可被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-C6烷基，C1-C6烯基，C1-C6炔基，C1-C6杂烃基，C3-C7碳环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，C3-C7-碳环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂环基-C1-C6-烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，5-10元杂芳基(C1-C6)烷基(被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤烷基和C1-C6卤烷氧基任选取代)，卤基，氰基，羟基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)，芳氧基，硫氢基(巯基)，卤(C1-C6)烷基(例如，–CF3)，卤(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)，C1-C6烷硫基，芳硫基，氨基，氨基(C1-C6)烷基，硝基，O-氨甲酰基，N-氨甲酰基，O-硫代氨甲酰基，N-硫代氨甲酰基，C-胺基，N-胺基，S-磺酰氨基，N-磺酰氨基，C-羧基，O-羧基，酰基，氰酰，异氰酸基，氰硫基，异氰硫基，亚磺酰基，磺酰基和氧代(＝O)。
可选地，二环壬炔上的两个邻近的取代基可形成其他环。例如，表示二取代的二环[6.1.0]壬-4-炔，其中Ra和Rb连同和它们连接的原子可连接在一起以形成任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环基。由于二环环系中的张力，如以上针对环辛炔所述，二环壬炔可以与叠氮化物或氧化腈进行类似的SPAAC炔烃环加成。
水凝胶
本文所描述的某些实施方案包括，通过官能化的硅烷或硅烷衍生物的不饱和部分，将官能化的水凝胶固定至基底的表面。可用于本申请的水凝胶的非限制性实例如本文所述。
WO 00/31148公开了聚丙烯酰胺水凝胶和基于聚丙烯酰胺水凝胶的阵列，其中优选从丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸衍生物形成所谓的聚丙烯酰胺预聚合物。然后可调整预聚合物的交联。由此产生的水凝胶为固体支持的，优选在玻璃上。也可实现固体支持的水凝胶的功能化。
WO 01/01143描述了与WO 00/31148类似的技术，但区别在于所述水凝胶具有能够参与与生物分子的[2+2]光环加成反应以便形成这种生物分子的固定化阵列的官能度。二甲基马来酰亚胺(DMI)是特别优选的官能度。WO02/12566和WO03/014392中也描述了[2+2]光环加成反应在基于聚丙烯酰胺的微阵列技术环境中的使用。
美国专利第6,465,178号公开了试剂组合物在提供用于制备核酸的微阵列的活性玻片(slide)中的用途；所述试剂组合物包括丙烯酰胺共聚物。陈述了所述活性玻片特别适合于代替制备微阵列的常规(例如甲硅烷基化的)玻璃片。
WO 00/53812公开了基于聚丙烯酰胺的水凝胶的DNA阵列的制备以及这些阵列在复制扩增中的用途。
一旦形成水凝胶，若需要，然后可将分子连接至水凝胶，使得产生分子阵列。连接以现有技术中的不同方式实现。例如，美国专利第6,372,813号教导了，通过在两个二甲基马来酰亚胺基团之间进行[2+2]光环加成步骤，将携带二甲基马来酰亚胺基团的多核苷酸固定至携带二甲基马来酰亚胺基团的所产生的水凝胶上—一个二甲基马来酰亚胺基团与被固定的多核苷酸连接，一个侧接于水凝胶。
当分子阵列在水凝胶产生后形成时，采用两种策略实现该目标。首先，在水凝胶产生后，可以以化学方法将其修饰。该方法的问题包括，阵列制备中总体的低效率以及涉及连接化学的低稳定性，尤其当暴露于高温、离子溶液和多个洗涤步骤时。
更常规的替代选择是实现共聚单体的聚合化，所述共聚单体具有能与被排列的分子反应的预备的或预激活的官能度。
现有技术中已描述了针对水凝胶开始形成后，随后在水凝胶上排列分子的替代选择，其中在产生水凝胶的同时形成阵列。这可通过例如丙烯酰胺-衍生化多核苷酸的直接共聚作用实现。WO 01/62982中描述了该方法的实例，其中丙烯酰胺-衍生化多核苷酸与丙烯酰胺的溶液混合，以及直接地实现聚合作用。
MOSAIC技术(Mosaic Technologies，Boston,Mass.,USA)公司生产了ACRYDITETM(丙烯酰胺亚磷酰胺)，其可在合成的单体与丙烯酰胺的共聚作用之前与多核苷酸反应。
Efimov等人(Nucleic Acids Research,1999,27(22),4416-4426)公开了同时形成水凝胶/阵列的其他实例，其中丙烯酰胺、活性丙烯酸衍生物和具有5′-或3′-端丙烯酰胺基团的修饰多核苷酸的共聚作用受到影响。
聚合物
本文所描述的某些实施方案包括，通过环烯或杂环烯官能化的硅烷或硅烷衍生物，将官能化的聚合物固定至基底的表面。可被用于本申请的聚合物的非限制性实例在以下文献中有描述：美国专利第13/784,368号和美国专利公开第2011/0059865号中，将其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，如本文所用，聚合物包含式(I)的重复单元和式(II)的重复单元：
其中：R1为H或烷基；RA选自：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪和硫醇；X为任选取代的亚烷基连接基团或任选取代的亚杂烷基连接基团；R4、R4’、R5和R5’各自独立地选自：H、R6、OR6、-C(O)OR6、-C(O)R6、-OC(O)R6、-C(O)NR7R8或-NR7R8；R6独立地选自：H、OH、烷基、环烷基、羟烷基、芳基、杂芳基、杂环基或其任选取代的变体；R7和R8各自独立地选自H或烷基，或者R7和R8与和它们连接的原子连接在一起以形成杂环。
在某些实施方案中，RA为叠氮基。在某些实施方案中，X为任选取代的亚烷基连接基团。在某些实施方案中，R1为氢，在某些其他实施方案中，R1为甲基。在某些实施方案中，R4为氢，R4’为-C(O)NR7R8。在某些实施方案中，R5和R5’各自为氢。在某些实施方案中，R5为氢，R5’为甲基。
在某些实施方案中，如本文所用，聚合物包含式(III)或式(III’)的聚合物：
其中R1选自H或任选取代的烷基；RA选自：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪和硫醇；各个-(CH2)-p可被任选地取代；p为1-50范围内的整数；R5选自H或任选取代的烷基；n为1至50,000范围内的整数；以及m为1至100,000范围内的整数。在某些实施方案中，p为5。在某些实施方案中，RA为叠氮基。
PAZAM
在一个实施方案中，式(III)或式(III’)的聚合物也用式(IIIa)或式(IIIb)表示：
其中n为1-20,000范围内的整数，以及m为1-100,000范围内的整数。
在某些实施方案中，用于直接缀合的官能化分子为聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。在某些实施方案中，PAZAM为线状聚合物。在某些其他实施方案中，PAZAM为轻度交联的聚合物。在某些实施方案中，将PAZAM以水溶液的形式应用于表面。在某些其他实施方案中，将PAZAM以水溶液的形式应用于表面，所述水溶液含有一种或多种溶剂添加剂，如乙醇。用于制备不同PAZAM聚合物的方法在美国专利第13/784,368号中有详细讨论，将其通过引用整体并入本文。
基底
在某些实施方案中，本申请中使用的基底包括硅基基底，如玻璃、熔融二氧化硅和其他含有二氧化硅的材料。在某些实施方案中，硅基基底也可为硅、二氧化硅、氮化硅、硅烷。在某些实施方案中，本申请中使用的基底包括塑料材料，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯和聚(甲基丙烯酸甲酯)。优选的塑料材料为聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯和环烯聚合物基底。在某些实施方案中，所述基底为基于硅的材料或塑料材料。在一个实施方案中，所述基底具有至少一个包括玻璃的表面。
在某些其他实施方案中，所述基底可为金属。在某些这样的实施方案中，所述金属为金。在某些实施方案中，所述基底具有至少一个包含金属氧化物的表面。在一个实施方案中，所述表面包含氧化钽。
丙烯酰胺、烯酮(enone)或丙烯酸酯也可被用作基底材料。其他基底材料可包括但不限于：砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物和共聚物。前述列表意图示例本申请，但不限制本申请。
在某些实施方案中，所述基底和/或基底表面可为石英。在某些其他实施方案中，所述基底和/或基底表面可为半导体，即GaAs或ITO。
基底可包含单一的材料或多种不同的材料。基底可为复合材料或叠层板。基底可为平面的、圆形的、有织纹的和图案化的。例如，可通过金属垫在非金属的表面形成特征来形成图案化，例如其在美国专利申请第13/661,524号中有描述，通过引用将其并入本文。另一有益的图案化表面为在表面上形成有很好的特征的图案化表面，例如其在以下文献中有描述：美国第13/787,396号、美国专利申请公开第2011/0172118 A1号或美国专利第7,622,294号中，将其各自通过引用并入本文。对于使用图案化基底的实施方案，凝胶可选择性地连接至图案化特征(例如凝胶可连接至金属垫或凝胶可连接至小井(wells)的内部)，或者可选地，可将凝胶均匀地连接穿过图案化特征和空隙区。
在分子阵列的制备和运用中，使用基于塑料的基底的优点包括费用方面：通过例如注射模塑法制备合适的基于塑料的基底，通常比例如通过刻蚀和键合制备基于硅的基底便宜。另一优点为几乎无限制塑料的种类，其允许微调支持物的光学特性以适合其意图或可投入的应用中。
其中金属被用作基底或基底上的垫，这可由于金属的预期应用：金属的导电性可允许调整在基于DNA的传感器中的电场。在该方式下，可提高DNA的错配鉴别，可影响固定化的寡核苷酸分子的方向，或可促进DNA杂交动力学。
优选地，所述基底为基于硅的，但所采用的基底的形状可根据本申请实施的应用而变化。通常，然而，支持材料(如硅，例如熔融硅)的玻片在分子的制备及其随后的整合中尤其有用。具体用于本申请实践中的材料为销售的商品名SPECTRASILTM的熔融硅片。尽管如此，对技术人员显而易见的是，本申请同样地适用基底的其他形式(其包括基于硅的支持物)，如珠、杆等等。
在某些实施方案中，基底的表面包含官能化分子包被区和无包被层的惰性区。在某些这样的实施方案中，所述官能化分子包被层为水凝胶或聚合物包被层。所述官能化分子包被区可包含反应位点，并且因此可被用来通过化学键或其他的分子相互作用与分子连接。在某些实施方案中，所述官能化分子包被区(例如反应特征、垫、珠或小井)和惰性区(被鉴定为空隙区)可交替分布，以便形成图案化或网格。这样的图案化可为一维的或二维的。在某些实施方案中，惰性区可选自：玻璃区、金属区、掩蔽区或空隙区。可选地，这些材料可形成反应区。惰性或反应性将取决于针对基底所使用的化学过程和方法。在一个实施方案中，所述表面包括玻璃区。在其他实施方案中，所述表面包含金属区。在其他实施方案中，所述表面包含掩蔽区。在本文所描述的组合物的某些实施方案中，所述基底可为珠子。可被本公开的聚合物包被，或另外可被用于本文所述的组合物或方法的非限制性的示例性基底材料，在以下文献中有描述：美国专利第13/492,661号和第13/661,524号中，将其各自通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本文所描述的基底形成至少部分的流动池或位于流动池中。在某些这样的实施方案中，所述流动池还包含多核苷酸，所述多核苷酸通过官能化分子包被层(例如，聚合物包被层)与基底的表面连接。在某些实施方案中，所述多核苷酸以多核苷酸簇的形式存在于流动池中，其中所述多核苷酸簇的多核苷酸通过聚合物包被层与流动池的表面连接。在这样的实施方案中，所述多核苷酸所连接至的流动池主体的表面被认为是基底。在其他实施方案中，将具有由聚合物包被的表面的单独的基底***流动池的主体。在优选的实施方案中，所述流动池是被分为多个泳道(lanes)或多个部分(sectors)的流动室，其中多个泳道或多个部分中的一个或多个包含包被有本文所描述的共价连接的聚合物包被层(coating)的表面。在本文所描述的流动池的某些实施方案中，单一多核苷酸簇内所连接的多核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列。在本文所描述的流动池的某些实施方案中，不同的多核苷酸簇内所连接的多核苷酸具有不同的或非相似的核苷酸序列。可被用于本文所述的方法或组合物中的示例性流动池以及用于制备流动池的基底，包括但不限于可商购自Illumina,Inc.(San Diego，CA)或描述于US 2010/0111768 A1或US 2012/0270305中的那些，将其各自通过引用并入本文。
基于硅的基底
在某些实施方案中，本申请中使用的基底为基于硅的基底。通常，以某种方式化学修饰基于硅的基底表面，以便共价连接能够与官能化分子如水凝胶、聚合物或部分成形的水凝胶(例如预聚合物(PRP))反应的化学反应基团。通常，表面活化剂为有机硅烷化合物。在一个实施方案中，表面活化剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，其被称为“结合硅烷”或“交联硅烷”并可商购自Pharmacia，尽管其他基于硅的表面活化剂也是已知的，如单乙氧基二甲基硅烷丁醛、3-巯丙基-三甲氧基硅烷和3-氨丙基三甲氧基硅烷(所有可获自Aldrich)。在该方式中，可将侧官能团如氨基、醛基(aldehydro)或可聚合的基团(例如烯烃)连接于硅。
本申请采用包含共价连接的环烯或杂环烯的有机硅烷化合物。在某些实施方案中，所述环烯为任选取代的降冰片烯。在某些实施方案中，所述有机硅烷化合物的硅烷基团具有以下结构：
其中R1、R2和R3各自独立地选自：氢、卤素、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的芳氧基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基氧基。在某些这样的实施方案中，R1、R2和R3独立地为任选取代的烷氧基。在某些其他实施方案中，R1、R2和R3各自为甲氧基。在一个实施方案中，所述有机硅烷化合物为[(5-二环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。
连接基团
在本文所描述的某些实施方案中，硅烷或硅烷衍生物与环烯或杂环烯之间的连接基团选自：任选取代的亚烷基、任选取代的亚杂烷基、任选取代的亚环烷基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、任选取代的聚乙二醇、可裂解的连接基团或它们的组合。
在某些实施方案中，本文所描述的连接基团为任选取代的亚烷基连接基团。在某些实施方案中，所述连接基团为-(CH2)n-，其中n选自1至20,000。在一个实施方案中，n为2。在某些其他实施方案中，本文所描述的连接基团为任选取代的亚杂烷基连接基团。例如，所述连接基团为-(CH2)n-，其中n选自1至20,000，并且骨架上的一个或多个碳原子被一个或多个选自以下的杂原子代替：O、S、N或P。
在某些实施方案中，本文所描述的连接基团为可裂解的连接基团。在某些实施方案中，所述连接基团选自：酸不稳定连接基团(其包括二烷氧苄基连接基团、Sieber连接基团、吲哚连接基团、叔丁基Sieber连接基团)、亲电的可裂解连接基团、亲核的可裂解连接基团、光裂解的连接基团，在还原条件、氧化条件下进行裂解，采用安全拉手型连接基团(safety-catch linkers)进行裂解，以及通过消除机理进行裂解。在某些这样的实施方案中，LA选自：二硫化物连接基团(-S-S-)、酯、硝基苯、亚胺、酶促地或化学上可裂解的肽和多核苷酸，如DNA。
可裂解的连接基团是本领域已知的，并且可采用常规的化学方法将连接基团连接于核苷酸碱基和标签上。可通过任何合适的方法将连接基团裂解，其包括暴露于酸、碱、亲核试剂、亲电试剂、自由基、金属、还原剂或氧化剂、光、温度、酶等等。也可使用用来裂解3'-O-保护基键的相同催化剂裂解本文讨论的连接基团。合适的连接基团可修改自以下文献中所公开的标准化学保护基：Greene&Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons.，或Greg T.Hermanson’s“Bioconjugate Techniques”,AcademicPress。Guillier等人(Chem.Rev.100:2092-2157,2000)公开了在固相合成中所使用的其他合适的可裂解连接基团。
术语“可裂解的连接基团”的使用不意味着暗含需要从例如反应的杂环去除完整的连接基团。作为实例，裂解位点可位于连接基团上的位置，其确保连接基团的一部分在裂解后依然连接于所述杂环。
A.亲电裂解的连接基团
通常，亲电裂解的连接基团通过质子裂解，并且包括对酸敏感的裂解。合适的连接基团包括修饰的苄基体系，如三苯甲基、p-烷氧基苄基酯和p-烷氧基苄酰胺。其他合适的连接基团包括叔丁氧羰基(Boc)基团和缩醛体系。
在硫缩醛或其他含硫保护基的裂解中，也可考虑使用亲硫的金属(如镍、银或汞)来用于制备合适的连接分子。
B.亲核裂解的连接基团
亲核裂解也是一种公认的制备连接分子的方法。可使用在水中不稳定的基团如酯类(即，在碱性pH下被容易地裂解)和对非水的亲核试剂不稳定的基团。氟化物离子可被用来裂解诸如三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS))的基团中的硅-氧键。
C.光裂解的连接基团
光裂解连接基团已被广泛地用于碳水化合物化学中。优选地，激活裂解所需的光不会影响被修饰的核苷酸的其他组分。例如，如果荧光团被用作标签，如果其能吸收裂解所述连接分子所需的不同波长的光，则其为优选的。合适的连接基团包括基于邻硝基苄基化合物和硝基黎芦基化合物的连接基团。也可使用基于二苯乙醇酮化学的连接基团(Lee等人，J.Org.Chem.64:3454-3460,1999)。
D.还原条件下的裂解
有许多已知的连接基团易受还原裂解的影响。使用基于钯催化剂的催化加氢作用已被用来裂解苄基和苄氧羰基基团。二硫键的还原也是本领域已知的。
E.氧化条件下的裂解
基于氧化的方法是本领域已知的。这些方法包括p-烷氧基苄基基团的氧化以及硫和硒连接基团的氧化。使用碘的水溶液裂解二硫化物和其他基于硫或硒的连接基团也在本申请的范围内。
F.安全拉手型连接基团
安全拉手型连接基团是以两个步骤进行裂解的连接基团。在优选的体系中，第一步产生反应性亲核中心，随后进行第二步，其涉及导致裂解的分子内环化。例如，可用肼或光化学处理乙酰丙酯的连接以释放活性胺，然后可使其环化以裂解该分子中别处的酯(Burgess等人，J.Org.Chem.62:5165-5168,1997)。
G.通过消除机理的裂解
也可使用消除反应。例如，可使用碱催化的基团(如芴甲氧羰基和氰乙基)消除和钯催化的烯丙基体系的还原消除。
在某些实施方案中，所述连接基团可包含隔离单元。其他示例性合适的可裂解连接基团在美国公开第2006-0188901号中有详细讨论，将其通过引用整体并入本文。
测序应用
本文所述的方法可使用多种扩增技术中的任一种。可使用的示例性技术包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)。在具体的实施方案中，可将用于扩增的一个或多个引物连接至聚合物包被层。在PCR实施方案中，可将用于扩增的一个或两个引物都连接至聚合物包被层。利用两种连接引物的模式通常被称为桥式扩增，因为双链扩增子在位于被拷贝的模板序列两侧的两条连接引物之间形成桥状结构。可被用于桥式扩增的示例性试剂和条件例如在以下文献中有描述：美国专利第5,641,658号；美国专利公开第2002/0055100号；美国专利第7,115,400号；美国专利公开第2004/0096853号；美国专利公开第2004/0002090号；美国专利公开第2007/0128624号；和美国专利公开第2008/0009420号，将其各自通过引用并入本文。也可用以下形式进行PCR扩增：一条扩增引物连接于聚合物包被层，第二条扩增引物在溶液中。使用一条连接引物和可溶引物的组合的示例性模式，是描述于例如以下文献中的乳化PCR：Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145或者美国专利公开第2005/0130173号或第2005/0064460号，将其各自通过引用并入本文。乳化PCR为示例性模式，并且应理解，为了本文所述方法的目的，乳化液的使用是任选的，并且的确在一些实施方案中，没有使用乳化液。此外，引物不需要被直接地连接至基底或ePCR参照中所述的固体支持物上，并且反而可连接至本文所述的聚合物包被层上。
可修改RCA技术以用于在本公开的方法中使用。可被用于RCA反应的示例性组分和RCA借以产生扩增子的原理在例如以下文献中有描述：Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)和US 2007/0099208 A1，将其各自通过引用并入本文。用于RCA的引物可在溶液中或连接至聚合物包被层。
可修改MDA技术以用于在本公开的方法中使用。用于MDA的一些基本原理和有用的条件在例如以下文献中有描述：Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；Lage等人,Genome Research 13:294-307(2003)；Walker等人,Molecular Methods forVirus Detection,Academic Press,Inc.,1995；Walker等人,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)；US 5,455,166；US 5,130,238和US 6,214,587，将其各自通过引用并入本文。用于MDA的引物可在溶液中或连接至聚合物包被层。
在具体的实施方案中，可使用上述示例性扩增技术的组合。例如，可以以组合的形式使用RCA和MDA，其中RCA被用来在溶液中产生连体(concatameric)复制子(例如使用液相引物)。然后所述扩增子可被用作使用连接至聚合物包被层的引物的MDA的模板。在该实例中，组合RCA和MDA步骤后产生的扩增子，将被连接至聚合物包被层。
在某些实施方案中，本文所描述的官能化的水凝胶或聚合物包被的基底，可被用于测定多核苷酸的核苷酸序列。在这样的实施方案中，所述方法可包括以下步骤：(a)使多核苷酸聚合酶与通过本文所描述的任一种聚合物或水凝胶包被层与基底表面连接的多核苷酸簇接触；(b)向基底的由聚合物包被的表面提供核苷酸，使得当通过多核苷酸聚合酶利用一个或多个核苷酸时，产生可检测的信号；(c)检测一条或多条多核苷酸簇上的信号；以及(d)重复步骤(b)和(c)，从而测定一条或多条多核苷酸簇上存在的多核苷酸的核苷酸序列。
通过本领域已知的多种方法，可使用核酸测序来测定多核苷酸的核苷酸序列。在优选的方法中，利用边合成边测序(SBS)来测定通过本文所描述的任一种聚合物包被层与基底表面连接的多核苷酸的核苷酸序列。在这样的方法中，向与多核苷酸聚合酶结合的模板多核苷酸提供一个或多个核苷酸。所述多核苷酸聚合酶将一个或多个核苷酸并入与多核苷酸模板互补的新合成的核酸链中。所述合成起始于寡核苷酸引物，所述引物与模板多核苷酸的部分或者与通用部分或非变化核酸部分互补，其共价结合在模板多核苷酸的一端。当核苷酸针对模板多核苷酸并入时，产生可检测信号，其允许确定测序过程每一步骤期间已并入哪种核苷酸。在该方式下，可产生与模板多核苷酸的至少部分互补的核酸序列，从而允许确定模板多核苷酸的至少部分的核苷酸序列。流动池为容纳阵列提供了便利模式，所述阵列通过本公开的方法产生，且进行边合成边测序(SBS)或涉及循环中重复递送试剂的其他检测技术。例如，为了起始第一轮SBS循环，可使得一个或多个标记核苷酸、DNA聚合酶等流进/流过容纳通过本文所述的方法制备的核酸阵列的流动池。可检测到其中引物延伸引起并入标记核苷酸的阵列的那些位点。任选地，所述核苷酸还可包含可逆的终止特性，一旦核苷酸加入至引物该特性使进一步的引物延伸终止。例如，可将具有可逆终止部分的核苷酸类似物加入至引物，使得不能发生随后的延伸，直到递送解封剂以去除所述部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可将解封剂递送至流动池(检测发生前或后)。可在多个递送步骤之间进行洗涤。然后可将循环重复n次，使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可容易地修改并用于在通过本公开的方法所产生的阵列中使用的示例性SBS方法、流体***和检测平台，在例如以下文献中有描述：Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)；WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US 2008/0108082，将其各自通过引用整体并入本文。
可使用利用循环反应的其他测序方法，如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测当具体核苷酸并入初生核酸链时释放的无机焦磷酸盐(PPi)(Ronaghi等人,AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等人Science 281(5375),363(1998)；US 6,210,891；US 6,258,568和US 6,274,320，将其各自通过引用整体并入本文)。在焦磷酸测序中，可通过ATP硫酸化酶将释放的PPi立即转化为腺苷三磷酸(ATP)来检测释放的PPi，并且可通过荧光素酶产生的光子来检测所产生的ATP的水平。因此，可通过发光检测***监测测序反应。用于基于荧光的检测***的激发辐射源不是焦磷酸测序步骤必需的。可将焦磷酸测序应用于本公开的阵列的有益流体***、检测器和程序，在例如以下文献中有描述：WO 12/058096 A1、US 2005/0191698 A1、US 7,595,883和US 7,244,559，将其各自通过引用整体并入本文。
边测序边连接反应也是有益的，其包括例如在以下文献中所描述的那些：Shendure等人Science 309:1728-1732(2005)；US 5,599,675和US 5,750,341，将其各自通过引用整体并入本文。某些实施方案可包含在例如以下文献中所描述的边测序边杂交的步骤：Bains等人,Journal of Theoretical Biology 135(3),303-7(1988)；Drmanac等人,Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor等人,Science 251(4995),767-773(1995)和WO 1989/10977，将其各自通过引用整体并入本文。在边测序边连接和边测序边杂交的步骤中，将阵列的位点上存在的核酸进行重复的寡核苷酸递送和检测的循环。可很容易地修改本文所述或本文所引用的参考文献中的用于SBS方法的流体***，以用于在边测序边连接或边测序边杂交步骤中递送试剂。通常，寡核苷酸为荧光标记的，并且可使用与本文或本文所引用的参考文献中关于SBS方法所述的相似的荧光检测器来检测。
某些实施方案可利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可通过携带荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用，或用零模波导(ZMWs)来检测核苷酸的并入。基于FRET的测序的技术和试剂，在例如以下文献中有描述：Levene等人.Science 299,682–686(2003)；Lundquist等人.Opt.Lett.33,1026–1028(2008)；Korlach等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008)，将其公开通过引用整体并入本文。
某些SBS实施方案包括检测当核苷酸并入延伸的产物中时所释放的质子。例如，基于检测释放质子的测序可使用可商购自Torrent(Guilford，CT，a Life Technologiessubsidiary)的电检测器和相关技术或描述于以下文献中的测序方法和***：US 2009/0026082 A1；US 2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1，将其各自通过引用整体并入本文。
本公开的阵列(例如，通过本文所述的方法所产生的)的另一有益的应用是基因表达分析。可使用RNA测序技术(如被提及为数字RNA测序的技术)检测或定量基因表达。可使用本领域已知的测序方法学(如上所述的测序方法学)，进行RNA测序技术。也可使用与阵列直接杂交的杂交技术或使用多路分析来检测或定量基因表达，在阵列上检测其产物。本公开的阵列(例如通过本文所述的方法所产生的)也可被用来确定来自一个或多个个体的基因组DNA样品的基因型。可在本公开的阵列上实施的基于阵列的表达和基因分型分析的示例性方法，在以下文献中有描述：美国专利第7,582,420号；第6,890,741号；第6,913,884号或第6,355,431号或美国专利公开第2005/0053980 A1号；第2009/0186349 A1号或US2005/0181440 A1，将其各自通过引用整体并入本文。
在采用流动池的上述方法的某些实施方案中，在单一流步骤期间，仅单种类型的核苷酸存在于流动池中。在这样的实施方案中，所述核苷酸可选自：dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物。在采用流动池的上述方法的其他实施方案中，在单一流步骤期间，多种类型的不同核苷酸存在于流动池中。在这样的方法中，所述核苷酸可选自：dATP、dCTP、dGTP、dTTP以及其类似物。
对于与流动池中存在的基底表面上的聚合物包被层连接的一条或多条多核苷酸，通过检测多核苷酸模板处或其附近产生的信号来实现每一流动步骤期间并入的一个或多个核苷酸的测定。在上述方法的某些实施方案中，可检测的信号包括光学信号。在其他实施方案中，可检测的信号包括非光学信号。在这样的实施方案中，非光学的信号包括一条或多条多核苷酸模板处或其附近的pH变化。
实施例
其他实施方案在以下实施例中进一步详细地公开，其不以任何方式意图限制权利要求的范围。
实施例1
将PAZAM固定在降冰片烯1a硅烷化的玻璃表面上
方案1
表面硅烷化
方法1(使用玻璃真空干燥器的硅烷化)：将200μL-500μL液体降冰片烯硅烷存放在玻璃瓶内，并且放置在玻璃真空干燥器内。也将玻璃基底放入干燥器内。然后将干燥器抽真空至15-30mTorr的压力，并且放入温度在60℃-125℃之间的烘箱内。让硅烷化进行1小时，之后将干燥器从烘箱取出，在空气中冷却和排放。在该步骤后正确使用基底，或者它们可经过其他固化步骤(100℃下1小时)和/或溶剂洗涤步骤，如乙醇漂洗。
方法2(使用YES CVD烘箱的硅烷化)：首先，将基底放入CVD炉室，并且将所述室抽真空至300mTorr的压力。最初，样品用氧等离子体处理10分钟。等离子体激活后，将所述室抽真空，并且在500mTorr的基准压力下通过注入0.5mL水进行10分钟再水化循环。再次清洗循环后，进行硅烷化程序。15分钟的延时后，将硅烷阀设置为打开0.15秒，以及关闭20秒。硅烷化在500mTorr的基准压力和125℃的炉室温度下进行60分钟，以及随后也在125℃下进行2轮氮清洗循环。然后将所述室排放3分钟。YES炉室的硅烷化循环是高度自动化并受到控制的。硅烷化步骤期间，将降冰片烯硅烷容器保持在120℃，并且硅烷蒸气管线保持在恒定的125℃。将真空管线保持在145℃。完成循环后，将基底取出，在烘箱外冷却短暂的时间，并且在无其他处理的情况下随后使用。这些基底在硅烷化后保持活力至少一个月。
PAZAM的沉积和表面交联
将500μL PAZAM(0.25％+5％乙醇)水溶液沉积在降冰片烯硅烷化玻璃基底的顶部并遍布整个表面。用以下程序通过旋涂法获得PAZAM的薄膜：步骤1–600rpm，5秒，加速度1500rpm/秒；步骤2–1500rpm，30秒，加速度5000rpm/秒；步骤3–4000rpm，5秒，加速度5000rpm/秒；步骤4–600rpm，5秒，加速度5000rpm/秒。也可使用其他旋涂方法。旋涂后，将所述基底在65℃-75℃的烘箱或加热板上加热1小时。
清洗：加热步骤后，可将基底在水中洗涤，通过增加45℃下的超声处理步骤(10分钟)，随后通过大量的水漂洗，并且用氮枪干燥来去除未结合的PAZAM。
引物接枝：通过使KPi(10mM)中的炔烃寡核苷酸与PMDETA、硫酸铜和NaAsc(500mg/mL水溶液)在60℃下反应30分钟，将所制备的基底用于引物接枝步骤中。
QC：引物接枝步骤完成后，接枝的引物经过TET质量控制。TET为与具有针对P5/P7引物的互补序列的染料标记寡核苷酸。TET可与表面上的P5/P7引物杂交；过量的TET可被清洗掉，并且可使用扫描仪器如Typhoon扫描仪(General Electric)，通过荧光检测测定连接的染料浓度。所述染料浓度的强度被测定为指示水凝胶固定化后的百分比表面剩余。美国申请第13/784,368号也公开了PAZAM的沉积和表面交联程序，将其通过引用整体并入。
图1A显示了这样的D263Schott玻璃基底，其被降冰片烯-硅烷衍生物[(5-二环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷(1a)硅烷化，并且随后被PAZAM包被且与PAZAM热交联。黑色区域为当接枝P5/P7引物且与TET染料衍生化的互补链杂交时所观察到的真实荧光强度。图1B显示每条相同的接枝降冰片烯(1a)硅烷化/PAZAM包被的无图案化表面的通道与含TET染料的互补寡核苷酸序列杂交的中值荧光强度的相关图表。
实施例2
纳米微孔基底上有PAZAM的图案化表面的制备
通过将纳米微孔(nanowell)基底与PAZAM聚合物整合并且化学机械抛光(CMP)产生图案化的、可测序的簇。使用纳米压印技术，经由Illumina所研发加工的且向台湾半导体制造有限责任公司(TSMC)外包的专利纳米制造来制备纳米微孔基底(400nm直径、750nm斜度、300nm深度的孔)。通过CVD将实施例1的降冰片烯硅烷沉积在基底的整个表面上，旋涂PAZAM并且在60℃-70℃加热，生成聚合物与基底表面的共价连接。通过用在水中的10wt％的3μm SiO2微颗粒悬浮液将所述表面抛光，凭借CMP方法去除空隙处共价连接的聚合物。然后按照标准的Illumina方案，将图案化的聚合物基底用引物接枝。用Typhoon成像器使基底上图案化的引物成像。然后将基底接种phiX DNA，用源自Twist DX试剂盒(等温扩增)的Illumina’s专利扩增方案聚集且测序。使用标准的SBS测序试剂盒，在Illumina HiSeq2000上进行测序，并且使用Illumina’s测序分析查看器选取指标。测序分析数据表明，降冰片烯硅烷化基底运行的测序指标与用丙烯酰胺官能化的基底的测序指标等同。
图2A显示具有纳米微孔的图案化D263Schott玻璃基底，其被降冰片烯-硅烷衍生物(1a)硅烷化，并且随后被PAZAM包被且与PAZAM热交联。黑色区域为化学机械抛光过量的PAZAM并且接枝P5/P7引物且与TET-染料衍生化的互补链杂交后所观察到的真实的荧光强度。图2B显示每条相同的接枝降冰片烯(1a)硅烷化/PAZAM包被的无图案化表面的泳道与含TET染料的互补寡核苷酸序列杂交的中值荧光强度的相关图表。
硅烷化的降冰片烯基底不仅排除了其他交联剂的使用需求，而且其对PAZAM表现出优选的亲和力，并且促进PAZAM水溶液的扩散。因此，所述PAZAM包被层更均匀且对基底质量的变化的敏感度更小。图3A显示由于使用标准的丙烯酰胺官能化表面的典型旋涂失败的流动池的typhoon图像。图3B显示降冰片烯硅烷衍生物(1a)硅烷化的流动池的typhoon图像，其导致更均匀的包被层。图3C显示甚至在固液界面的表面能之间存在大量能量错配时，与水涂布剂相比，0.25％的PAZAM水溶液使降冰片烯硅烷衍生物(1a)硅烷化的表面变湿。
实施例3
表面稳定性试验
降冰片烯硅烷化/PAZAM包被的基底也表现出好的贮藏寿命。使用YES方法，用实施例1的降冰片烯硅烷使一些图案化基底和无图案化基底硅烷化，然后使用实施例1和2所描述的方法进行PAZAM包被和热交联。将图案化基底储存在室温黑暗中的滑动载体中，放入干燥器。30天后，对这些基底进行测序，并且提供可接受的TET QC结果和测序指标(图4)。
实施例4
用BCN修饰的寡核苷酸进行引物接枝
方案2
将BCN修饰的寡核苷酸接枝至PAZAM包被的表面的方法，其一个实施方案如下所述：在无任何催化剂的情况下，与标准的P5和P7(硫代磷酸盐和炔烃)寡核苷酸含有相同序列的5’-修饰的BCN P5和P7寡核苷酸，被用来与包被有PAZAM(0.25％w/v)的流动池表面反应(方案2)。PAZAM包被的表面通过以下步骤制备：首先用3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)处理表面，随后用丙烯酰氯(80μL纯丙烯酰氯和40μL在1880μL无水MeCN中的DIPEA)或活化的丙烯酰基NHS酯(在pH＝8.0 200mM的KPi中，20mg/mL)处理，以形成不饱和的丙烯酰胺基团。然后，将PAZAM引至不饱和表面，并且在60℃将所述基底孵育50-75分钟(静止)。美国申请第13/784,368号中描述了通用的方法，将其通过引用整体并入本文。流动池的每条泳道的详细实验条件描述于下面的表1中。
图5A描述了使用无催化剂接枝上述BCN修饰的寡核苷酸的流动池的接枝表面的最初Typhoon图像。将流动池表面进行热应力试验以确定接枝的包被层的鲁棒性，并且图5B中所示的结果表明，信号减少(大约与表面损失相关)为最小，并且与标准的泳道一致。
为了研究获得最佳引物密度的实验条件，还试验了不同浓度的BCN修饰的寡核苷酸(表2)。使用实施例1中所述的类似步骤，从降冰片烯修饰的硅烷制备PAZAM包被的流动池表面。然后，将不同浓度的BCN修饰的引物接枝至聚合物层。图6A中显示了使用不含铜的接枝方法和不同浓度的BCN引物的流动池的接枝表面的最初Typhoon图像。所述流动池表面也进行热应力试验，并且图6B显示了在表面热应力前和后进行的TET QC分析的结果。
在两个接枝的流动池表面上进行的桥式扩增均平稳地进行。使用荧光显微镜观察簇，并且它们可与对照泳道上生长的簇相比。图7A显示从BCN引物接枝的表面生长的簇的荧光图像。模板接种浓度为0.5pM。类似地，图7B显示当模板浓度为3pM时，从BCN引物接枝的表面生长的簇的荧光图案化。
然后，使用HiSeq仪器，对BCN修饰的寡核苷酸接枝的流动池表面采取一些测序运行。高水平的指标可与对照泳道相比。SBS数据的比较表明，高水平的测序指标与当前获自使用标准的炔烃寡核苷酸接枝的PAZAM表面的结果极其相当。
实施例5
BCN寡核苷酸的引物接枝
在本文所描述的基底表面制备方法的某些实施方案中，未加工的基底首先用硅烷衍生物(例如，降冰片烯衍生化硅烷)包被，然后将PAZAM旋涂至表面。然后将基底抛光和组装，随后进行引物接枝和QC。还探讨了使用预接枝的PAZAM制备基底的替代方法，通过用溶液中的标准P5和P7寡核苷酸将PAZAM官能化而制备预接枝的PAZAM。该方法提供了一些重要的优点。将引物接枝步骤移至上游将允许更有效的聚合物纯化，以及更大地控制实现靶表面引物密度所使用的寡核苷酸的量。此外，完成的基底的工作流可被缩短为包被的基底表面已经含有用于模板杂交所需的引物，并且因此去除了使用专门的流体装置来实现充分接枝的表面的需求。
将混合的P5/P7 BCN修饰的引物的溶液(总浓度＝15μM)加入至PAZAM(0.5w/v％)的水溶液，并且将得到的混合物在70℃加热2小时。冷却至室温后，使用该混合物包被用降冰片烯-衍生化硅烷层预处理的标准HiSeq流动室(方案3)。
方案3
对预接枝的表面进行标准的热应力试验，并且信号损失(对应于表面损失)可与对照相比。使用Illumina标准方案中所述的标准试剂进行2×26HiSeq SBS测序实验。图8A显示获自预接枝的PAZAM表面的簇的类型。降低接种的模板浓度(0.5pM)。在图8B中显示了在接种浓度增加至3pM时来自相同流动室中通道的底部表面。簇密度的变化在预期的极限内，并且因此说明这种新表面表现出与对照表面十分相似。图像的检查(图8A和8B)显示所述簇是典型的，仅有的变化是通过考虑半高全宽(FWHM)所估计的表观簇“大小”，其被内在地用作表观簇大小的代表。这与这些簇的降低的强度一致。预接枝通道、对照通道和接枝BCN修饰的引物通道的SBS指标之间的比较证实了，SBS循环从表面上所产生的簇进行。
使用MiSeq仪器进行类似的、较长的SBS运行。在该实例中，将标准的PAZAM溶液与BCN修饰的引物在70℃孵育3小时。然后按照标准的方案，将得到的接枝聚合物的混合物应用于降冰片烯官能化的MiSeq流动池上。板簇生成后，随之使用标准的四通道体系进行2×151个循环SBS运行。图9显示从标准的MidSeq体系(2×151 SBS)获得的、生长自包被有预缀合的PAZAM混合物的通道表面的簇的缩略图。图像的右部分是图像的左部分的放大。
来自该次运行的所有循环的SBS图像可与来自标准(SFA和PAZAM)的SBS实验的SBS图像相比。与标准表面比较，信噪比的测定也十分相似，表明测序期间没有发生染料分子的明显截留(即聚合物包被层没有经历其他变化)。

Claims (37)

1.基底，其包含含有硅烷或硅烷衍生物的第一表面，所述硅烷或硅烷衍生物通过第一多个不饱和部分与官能化分子的反应来共价结合至所述官能化分子，所述第一多个不饱和部分选自环烯、杂环烯、及其任选取代的变体以及它们的组合，并且所述第一多个不饱和部分任选地通过连接基团与所述硅烷或硅烷衍生物共价连接，其中所述官能化分子包括水凝胶或聚合物，并且所述聚合物或水凝胶包含式(I)的重复单元和式(II)的重复单元：
其中
R1为H或任选取代的烷基；
RA选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、氧化腈、硝酮和硫醇；
X为任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基；
R4、R4’、R5和R5’各自独立地选自H、R6、OR6、-C(O)OR6、-C(O)R6、-OC(O)R6、-C(O)NR7R8和-NR7R8；
R6独立地选自H、OH、烷基、环烷基、羟烷基、芳基、杂芳基、杂环基、及其任选取代的变体；以及
R7和R8各自独立地为H或烷基，或者R7和R8与和它们连接的原子连接在一起形成杂环。
2.如权利要求1所述的基底，其中所述第一多个不饱和部分选自降冰片烯、杂降冰片烯、降冰片烯衍生物、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、及其任选取代的变体以及它们的组合。
3.如权利要求2所述的基底，其中所述第一多个不饱和部分选自任选取代的降冰片烯。
4.如权利要求1-3中任一项所述的基底，其包含在所述硅烷或硅烷衍生物的硅原子和所述第一多个不饱和部分之间共价连接的连接基团。
5.如权利要求4所述的基底，其中所述连接基团选自任选取代的亚烷基、任选取代的亚杂烷基、任选取代的亚环烷基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、任选取代的聚乙二醇、可裂解的连接基团以及它们的组合。
6.如权利要求5所述的基底，其中所述连接基团选自任选取代的亚烷基和任选取代的亚杂烷基。
7.如权利要求1-3中任一项所述的基底，其中
R1为H或烷基；
RA选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪和硫醇；
R4为–C(O)NH2；
R5为H或任选取代的烷基；
R4’和R5’各自为H；
X为任选取代的-(CH2)p-；以及
p为1至50范围内的整数。
8.如权利要求7所述的基底，其中p为5，且RA为叠氮基。
9.如权利要求1-3中任一项所述的基底，其还包含寡核苷酸，所述寡核苷酸通过第二多个不饱和部分共价连接至所述官能化分子，所述第二多个不饱和部分选自环烯、环炔、杂环烯、杂环炔、及其任选取代的变体以及它们的组合。
10.如权利要求9所述的基底，其中所述第二多个不饱和部分选自任选取代的环辛炔、任选取代的二环壬炔和任选取代的二环[6.1.0]壬-4-炔。
11.如权利要求1-3中任一项所述的基底，其中所述基底选自玻璃基底、硅基基底、塑料基底、石英基底、金属基底、金属氧化物基底及它们的组合。
12.如权利要求1-3中任一项所述的基底，其包含用官能化分子包被的区域和惰性区。
13.制备权利要求1所述的基底的第一表面的方法，所述方法包括：
将包含第一多个不饱和部分的硅烷或硅烷衍生物应用于所述基底的所述第一表面上，所述第一多个不饱和部分选自环烯、杂环烯、及其任选取代的变体以及它们的组合，并且所述第一多个不饱和部分任选地通过连接基团与所述硅烷或硅烷衍生物共价连接；以及
通过使官能化分子的官能团与所述第一多个不饱和部分反应，将包含所述官能团的所述官能化分子共价连接至所述硅烷或硅烷衍生物以形成包被层。
14.如权利要求13所述的方法，其还包括：
提供包含第二多个不饱和部分的寡核苷酸，所述第二多个不饱和部分选自环烯、环炔、杂环烯、杂环炔、及其任选取代的变体以及它们的组合；
使所述寡核苷酸的所述第二多个不饱和部分与所述官能化分子的官能团反应以形成共价键合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一多个不饱和部分选自降冰片烯、杂降冰片烯、降冰片烯衍生物、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、及其任选取代的变体以及它们的组合；以及其中所述第二多个不饱和部分选自环辛炔、二环炔、及其任选取代的变体以及它们的组合。
16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述硅烷或硅烷衍生物的所述第一多个不饱和部分为任选取代的降冰片烯。
17.如权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的所述第二多个不饱和部分选自任选取代的环辛炔、任选取代的二环壬炔和任选取代的二环[6.1.0]壬-4-炔。
18.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述硅烷或硅烷衍生物包含在硅原子和所述第一多个不饱和部分之间共价连接的连接基团。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述连接基团选自任选取代的亚烷基、任选取代的亚杂烷基、任选取代的亚环烷基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、任选取代的聚乙二醇、可裂解的连接基团和它们的组合。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述连接基团选自任选取代的亚烷基和任选取代的亚杂烷基。
21.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述硅烷或硅烷衍生物通过化学气相沉积或产量工程***(YES)法应用于所述第一表面上。
22.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中
R1为H或任选取代的烷基；
RA选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪和硫醇；
R4is–C(O)NH2；
R5为H或烷基；
R4’和R5’各自为H；
X为任选取代的-(CH2)p-；以及
p为1至50范围内的整数。
23.如权利要求22所述的方法，其中p为5，且RA为叠氮基。
24.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其还包括洗涤步骤以去除过量的未结合的官能化分子。
25.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其还包括干燥步骤。
26.将引物接枝至基底的第一表面上的方法，所述方法包括：
提供预缀合的引物，其包含与官能化分子共价连接的寡核苷酸，其中所述官能化分子包含官能团，以及其中所述官能化分子包括水凝胶或聚合物；以及
使所述预缀合的引物与具有包含硅烷或硅烷衍生物的第一表面的基底接触，其中所述硅烷或硅烷衍生物包含选自以下的第一多个不饱和部分：环烯、杂环烯、及其任选取代的变体以及它们的组合，所述第一多个不饱和部分任选地通过连接基团与所述基底的所述第一表面上的所述硅烷或硅烷衍生物共价连接，并且通过使所述官能化分子的所述官能团与所述硅烷或硅烷衍生物的所述第一多个不饱和部分反应以形成共价键合，所述预缀合的引物共价连接至所述基底的所述第一表面。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述预缀合的引物通过以下步骤制备：使所述官能化分子的所述官能团与所述寡核苷酸的第二多个不饱和部分反应以形成共价键，其中所述寡核苷酸的所述第二多个不饱和部分选自环烯、环炔、杂环烯、杂环炔及其任选取代的变体以及它们的组合。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述硅烷或硅烷衍生物的所述第一多个不饱和部分选自降冰片烯、杂降冰片烯、降冰片烯衍生物、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、环辛炔、二环炔、及其任选取代的变体以及它们的组合。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述硅烷或硅烷衍生物的所述第一多个不饱和部分为任选取代的降冰片烯。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的所述第二多个不饱和部分选自任选取代的环辛炔、任选取代的二环壬炔和任选取代的二环[6.1.0]壬-4-炔。
31.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述硅烷或硅烷衍生物通过化学气相沉积或产量工程***(YES)法应用于所述第一表面上。
32.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述聚合物或水凝胶包含式(I)的重复单元和式(II)的重复单元：
其中
R1为H或任选取代的烷基；
RA选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、氧化腈、硝酮和硫醇；
X为任选取代的亚烷基连接基团或任选取代的亚杂烷基连接基团；
R4、R4’、R5和R5’各自独立地选自H、R6、OR6、-C(O)OR6、-C(O)R6、-OC(O)R6、-C(O)NR7R8和-NR7R8；
R6独立地选自H、OH、烷基、环烷基、羟烷基、芳基、杂芳基、杂环基、及其任选取代的变体；以及
R7和R8各自独立地为H或烷基，或者R7和R8与和它们连接的原子连接在一起形成杂环。
33.如权利要求32所述的方法，其中
R1为H或烷基；
RA选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、和硫醇；
R4为–C(O)NH2；
R5为H或任选取代的烷基；
R4’和R5’各自为H；
X为任选取代的-(CH2)p-；以及
p为1至50范围内的整数。
34.如权利要求33所述的方法，其中p为5，且RA为叠氮基。
35.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其还包括洗涤步骤以去除过量的未结合的官能化分子。
36.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其还包括洗涤步骤以去除过量的未结合的寡核苷酸。
37.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其还包括干燥步骤。
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