JP6479759B2 - 固体支持体上での核酸増幅方法 - Google Patents

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本出願は、２０１３年３月１４日提出された仮特許出願シリアル６１／７８１３５６号の非仮特許出願である。

本発明は、核酸の精製、固定化及び増幅方法に関する。特には、固体支持体を使用する核酸増幅に関する。

核酸の精製および増幅のための様々な方法が当業者に知られている。しかしながら、これらの方法は、遅く、面倒で、高価であり、自動化や大量製造が困難である。それらはまた、感度、特異性、精度、正確さや、多様な適用に首尾よく使用することを可能とするその他の特性について性能が不足している。これらの方法は、たいてい複雑で、試料からの標的核酸の単離を必要とし、増幅のため標的を調製し、増幅を行い、増幅産物を検出する。いくつかの用途では、次世代配列決定などの配列決定のためのテンプレートを製造し、標的核酸を配列決定することも含む。これらの多くの方法では、さらに１つ以上の精製工程が必要とされる。これらの工程のすべてが、実施時間、コスト、複雑さおよび人件費を増加させる。特異性、感度、選択性、精度および正確性について汎用性のある方法を提供することは重要である。原試料から所望の単離および増幅産物を容易に得るために、最小限のアッセイ工程および試薬で、迅速、効率的かつ容易に使用できる方法が必要である。これらの産物は、増幅核酸または一組の増幅核酸（ハイレベルの多重化を含む多重化等）であり、固体支持体上または溶液中で遊離した状態で、即時の配列決定および次世代配列決定のためのテンプレートとして利用することができる。また、鎖の配向を維持する指向性増幅の方法は、マッピングによる配列の適切なアラインメントおよびより正確な定量的測定（遺伝子発現レベル等の定量）を提供する。さらに、これらの方法は、本技術分野で知られている多種多様な核酸増幅法で利用することができる。また、これらの方法は、タグ配列と共に利用することもできる。本発明は、特定の核酸を試料から精製、固定化及び増幅するための方法を提供し、本技術分野における現在の制限の多くを克服する。

本発明は、核酸を固体支持体上で固定化及び増幅する方法を提供する。具体的には、所望の核酸または複数の核酸（多重化）を核酸の混合物を含有する試料から固定化し、増幅する方法である。

本発明の一実施態様では、この方法は、１つの固体支持体または代替的には別々の固体支持体に固定された第一および第二オリゴヌクレオチドを提供する。第一オリゴヌクレオチドは、３'−末端からの伸長を防ぐためにブロックされ、そして標的核酸の第一部分に相補的な配列を有している。第二オリゴヌクレオチドは、標的核酸の第二部分と同一である配列を有する。試料は、固体支持体に適用され、試料中の標的配列が第一オリゴヌクレオチドに結合する。その後、固体支持体は、結合していない核酸および試料由来の他の成分を除去するために洗浄される。標的結合領域を含むプライマーおよびポリメラーゼプロモーター配列を含むタグ領域は結合した標的核酸にアニーリングされる。プライマーは、第一二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより伸長される。標的配列が第一二本鎖核酸から除去され、結合していない第一核酸を生成する。第一核酸が第二オリゴヌクレオチドにアニーリングされ、第二オリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長され、第一核酸と第二核酸を含む第二二本鎖核酸を生成する。その後、第三核酸の複数のコピーが固体支持体にプロモーター配列に特異的なポリメラーゼを添加することによって生成され、それにより標的核酸を増幅する。

第二の実施形態では、プライマーが標的にハイブリダイズし、標的が同時に第一オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように、プライマーを試料および固体支持体と併用することができる。その後、固体支持体は、結合していない核酸およびプライマーならびに試料由来の他の成分を除去するために洗浄される。

第三の実施形態では、方法は、所望の標的核酸の追加のさらなる増幅を可能とする工程をさらに含む。これらの工程では、第三核酸の複数のコピーが、固体支持体上のに第二オリゴヌクレオチドに結合する。第二オリゴヌクレオチドは、第三二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより伸長される。第三核酸は、固体支持体に結合された第四核酸を生成するために第三二本鎖核酸から除去される。プライマー配列は、第四核酸にアニールされ、プライマーおよび第四核酸の両方がポリメラーゼによって伸長され、第五核酸と追加の第二核酸を含む第四二本鎖核酸を生産する。第四二本鎖核酸は、第四二本鎖核酸のプロモーターに特異的であるポリメラーゼとインキュベートされ、第三核酸のさらなる複数のコピーを生成する。本実施形態によれば、その後、第三核酸をさらに増幅してもよい。

第四の実施形態では、標的核酸を結合するための特異性を増加し、他の核酸の増幅を減少させるために、プライマーは、イソシトシン（ｉｓｏＣ）および/またはイソグアニン（ｉｓｏＧ）など１つ以上の非天然ヌクレオチドを含むタグ配列を含む。

第五の実施形態では、４つの異なる第二オリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合させ、それぞれが３'−末端に異なるヌクレオチドと特定の一塩基多型（ＳＮＰ）部位で第一核酸に結合する配列を有する。この構成では、増幅は単一のアッセイで４つすべての可能性のあるＳＮＰを同定するために利用することができる。

第二実施態様では、断片化された標的核酸の指向性増幅が、配列決定など、その後の操作のために提供される。一実施形態では、試料と第一プライマーが固体支持体に適用される。第一プライマーは、３'−末端にヌクレオチド約６〜約９個のランダムな配列、および５'−末端に第一タグ配列を含み、断片化された標的核酸の方向を決定するために使用される。固体支持体に結合される第一および第二オリゴヌクレオチドは、同じ固体支持体に、あるいは異なる固体支持体に結合できるように提供される。第一オリゴヌクレオチドは、必要に応じて潜在的なエキソヌクレアーゼ消化を防ぐために、例えば５'−末端でブロックされ、断片化された標的核酸の一部に相補的な配列を有する。あるいは、第一オリゴヌクレオチドは、断片化された標的核酸由来の複数の断片の固定化を可能にする配列（例えばランダムまたはセミランダム配列など）を含む。第二オリゴヌクレオチド配列は、第一プライマーの上記タグ配列の少なくとも一部に相補的である。

第一プライマーは断片化された標的核酸にアニールされ、結合した断片化された標的核酸は第一オリゴヌクレオチドにアニールされる。固体支持体は結合していない試料および第一プライマーを除去ために洗浄される。第一プライマー配列は、ポリメラーゼによって伸長され、断片化された標的核酸および第一核酸を含む第一二本鎖核酸を生成する。

断片化された標的核酸が、第一二本鎖核酸から除去され、第一核酸を生成する。第一核酸は第二オリゴヌクレオチドにアニールされ、第二プライマーが、固体支持体に添加される。第二プライマーは、３'−末端にヌクレオチド約６〜約９個のランダム配列、および５'−末端に第二タグ配列を含み、第一プライマーの第一タグ配列にあるエレメントと同じまたは同様のエレメントを含んでいてもよく、また含んでいなくてもよい。第二プライマーは、第一核酸にアニールされ、そしてポリメラーゼによって伸長され、第一核酸と３'−末端に第一タグ配列および５'−末端に第二タグ配列を有する第二核酸を含む第二二本鎖を生成する。

この第二核酸はさらに増幅され、核酸標的の方向を決定するタグ配列を含有する標的核酸を生成する。

本実施態様の一実施形態において、第一プライマーは、タグ配列の一部としてバーコード配列をさらに含み、同定および方向付けをさらに助ける。

第三実施態様では、標的核酸の第一部分に相補的である配列を有する第一プライマーが、固体支持体上に固定化される方法が提供される。一実施形態において、ディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドが使用される。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドは、同じ標的核酸上の別の結合された１つまたは複数のオリゴヌクレオチド３'である標的配列内の位置で標的核酸にハイブリダイズする。ディスプレーサーがポリメラーゼで伸長されると、成長している伸長産物は、他の結合された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドに遭遇し、結合した１つまたは複数のオリゴヌクレオチドによって開始された伸長産物と共に、標的核酸鎖からそれ/それらを外す。本実施形態では、ディスプレーサーオリゴヌクレオチドは、第一部分の３'側に位置する標的核酸の第二部分に相補的な配列を有する。ブロッカーは、第一部分の５'側に位置する標的核酸配列の第三部分に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する。これらのオリゴヌクレオチドと標的核酸は、固体支持体に適用される。ディスプレーサーとブロッカーオリゴヌクレオチドとは、標的核酸にアニールされ、アニールされた標的は第一プライマーへのハイブリダイゼーションにより、固体支持体上に固定化される。

固体支持体は、結合していない核酸および試料の他の成分を除去するために洗浄される。第一プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される。伸長は、ブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、定義された長さの第一二本鎖核酸を生成する。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによって伸長され、第一二本鎖核酸の標的鎖を外す。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、固体支持体に結合していない定義された長さの第二核酸を含む第二二本鎖核酸を生成する。

第二プライマーは、第一核酸にアニールされ、ポリメラーゼによって伸長され、第一核酸および第三核酸を含む第三二本鎖核酸を生成する。第二および第三二本鎖核酸は、例えば、熱変性または本技術分野において公知の他の適切な手段で解離される。第二プライマーは、第一核酸にアニールされ、伸長してより多くの第三二本鎖核酸を生成する。

第三核酸は、ハイブリダイゼーションにより、固体支持体上の空の第一プライマーに固定化される。第一プライマーがポリメラーゼにより伸長されてより多くの第三二本鎖核酸を生成する。元の標的核酸は、そこに結合させたディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドと共に、固体支持体上の空の第一プライマーにアニールされる。第一プライマーがポリメラーゼにより伸長されて、より多くの第一二本鎖核酸を生成する。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドも伸長され、第一二本鎖核酸の標的核酸を置換する。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、支持体に結合していない定義された長さの第二核酸を含む第二二本鎖核酸を生成する。

第二プライマーがハイブリダイゼーションにより第二核酸にアニールされ、ポリメラーゼによって伸長され、第二核酸と第四核酸を含む第四二本鎖核酸を生成する。その後、すべての二本鎖は変性され、そしてサイクルは所望のように繰り返され、標的核酸が増幅される。

この実施態様の一実施形態では、標的核酸は二本鎖であり、両方の鎖が固定化され、増幅される。プライマーおよび任意にはディスプレーサーおよび／またはブロッカーが、上述の方法に従って各鎖に対して製造される。各標的核酸鎖に対するプライマーは、単一の支持体が利用される場合は１つの固体支持体上に固定され、２つの支持体が利用される場合は各支持体上に１つのプライマーが固定される。各標的鎖は、その標的核酸鎖のための相補的な配列を有するプライマーにハイブリダイゼーションにより固定化される。プライマーは、ｃＤＮＡを生成するためにポリメラーゼにより伸長され、その後標的核酸鎖が取り除かれる。除去は、ディスプレーサーが使用される場合、置換によるものであり、ディスプレーサーを使用しない場合、熱変性によるもの、または他の本技術分野で公知の適切な方法によるものである。現段階では、標的核酸鎖のために設計されたプライマーは、他の標的核酸鎖から生成されたｃＤＮＡのための第二プライマーとして機能することができ、そしてその逆も同じである。ｃＤＮＡはそれぞれの第二プライマーに結合し（例えば反対側の標的核酸鎖の第一プライマー）、第二プライマーはポリメラーゼによって伸長され、そして得られた二本鎖が解離する。その後、このプロセスは所望のように繰り返され、標的核酸が増幅される。

本発明の他の態様は、本明細書を通して説明される。

本発明の１つの方法の概略図である。 図１Ａ−１の続きである。 図１Ａの方法に組み込み得る追加の工程を示す図である。 選択性を増加させ、かつ望ましくない核酸配列の増幅を減少させるために非天然ヌクレオチドを含むプライマーを利用する本発明の別の方法の概略図である。 図２−１の続きである。 図２−２の続きである。 増幅後の標的オリゴヌクレオチドの方向を確立するためにタグ配列を有するプライマーを用いる本発明の別の方法の概略図である。 図３−１の続きである。 図３−２の続きである。 既定の長さの増幅された標的核酸を製造するためにブロッカーおよびディスプレーサーを利用する本発明の別の方法の概略図である。 図４−１の続きである。 ブリッジ構成で標的核酸の第一および第二鎖ｃＤＮＡｓを結合する第一および第二固定化オリゴヌクレオチドを利用する本発明の別の方法の概略図である。 ＰＣＲを組み込んだ本発明の別の方法の概略図である。 第一固定化オリゴヌクレオチドおよびブロッカーオリゴヌクレオチドが、方法の開始時に同時に標的核酸に結合する、本発明の別の方法の概略図である。 図７−１の続きである。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本開示全体を通して参照されるすべての特許、特許出願および刊行物は、その全体が本明細書中に参照により組み入れられる。本明細書中の用語の定義が複数ある場合には、本項の定義が優先する。

本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの多量体型を意味し、少なくとも２、または通常約５〜約２００、またはより一般的には約１００までの長さの、天然および非天然ヌクレオチドを包含する。したがって、この用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。また、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性とすることができ、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ホスホロジチオエートヌクレオチド、ホスホルアミデートヌクレオチド、およびメチルホスホネートヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用される用語「標的」、「標的配列」または「標的核酸」は、精製、単離、捕捉、固定化、増幅、同定、検出、定量、質量決定および／または配列決定などが望まれる、目的のポリヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。標的配列は、その実際の配列の点では、既知であっても未知であってもよい。

本明細書で使用される用語「プライマー」または「プライマー配列」は、増幅すべき各特定の配列に実質的に相補的であるように選択された配列を含む核酸である。より具体的には、プライマーはそれらのそれぞれの標的にハイブリダイズするために十分に相補的である。したがって、プライマー配列は、標的の正確な配列を反映する必要はない。非相補的な塩基またはより長い配列を、プライマー中に散在させることができるが、プライマー配列が標的核酸の配列に十分に相補的であり、ハイブリダイゼーションおよび伸長が可能であることが条件である。

さらに、プライマーは、ヌクレアーゼ耐性とすることができ、エキソヌクレアーゼによる分解を防止するために修飾されたプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーは、３'または５'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために修飾されている。そのような修飾には、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホロアミデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、３'末端リン酸修飾および３'アルキル置換が挙げられるが、それらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、増幅反応において使用されるプライマーおよび／またはプローブは、１つ以上の修飾により、３'および／または５'エキソヌクレアーゼ活性から保護される。

当業者は、標的配列の伸長のために適切であるプライマーを設計し製造することができる。本明細書で提供される方法および組成物における使用のためのプライマーの長さは、ヌクレオチド配列同一性や、これらの核酸がハイブリダイズされ、またはインビトロでの核酸伸長の間に使用される温度等のいくつかの要因に依存する。特定の配列同一性のプライマーの好ましい長さを決定するのに必要な検討事項は当業者に知られている。

用語「支持体」または「固体支持体」とは、マイクロタイターウェル、ビーズ、粒子または繊維等のポリマー、および、スライドガラスまたはチューブなどのシランまたはケイ酸塩支持体等の従来支持体を意味し、そこに第一および第二オリゴヌクレオチドなどの捕捉分子が共有結合または非共有結合される。

本明細書で使用される用語「試料」は、限定されるものではないが、生物の任意の部分から得られた血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、涙または唾液、尿、***、糞便、喀痰、嘔吐物、胃吸引液、気管支吸引液、スワブ（鼻咽頭、直腸、眼、尿生殖器等）、臓器、筋肉、骨髄、ＦＦＰＥ組織、皮膚、腫瘍および/または細胞などのヒトまたは動物から単離された組織または液体；植物材料、細胞、流体等；個々の細菌、細菌の群やその培養物；食品；化粧品；薬/医薬品；バイオプロセスを経由して調製された材料（完成品及び中間原料）；水；限定されるものではないが、土壌、水、空気などの環境試料；上述された源由来の半精製または精製された核酸；限定されるものではないが、次世代配列決定、試料プロセッシング、ヌクレアーゼ消化、制限酵素消化、複製等の配列決定のためのテンプレート形成のようなプロセスの結果である核酸等、を含むが、これらに限定されるものではなく、本質的に所望の標的核酸を含むあらゆる試料を意味する。

本明細書で使用される用語「増幅すること（amplifying）」または「増幅（amplification）」とは、完全な標的核酸配列またはその一部と同一または相補的である核酸鎖、または標的核酸配列の代用として機能するユニバーサル配列を生成するプロセスを意味する。本明細書で使用される用語「同一」とは、別の核酸と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸を意味する。

本明細書で使用される用語「固定される（affixed）」とは、第一および第二オリゴヌクレオチドなどの固体支持体への（各）分子の結合を意味する。本技術分野で一般に知られている多種多様な方法を結合のために使用することができる。１つの好ましい方法は共有結合である。

本明細書で使用される用語「核酸」は、標準的なホスホジエステル結合または他の結合によって共有結合された含窒素複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド化合物を意味する。核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー又はそれらの類似体などが挙げられる。核酸では、骨格は、１つ以上の糖−ホスホジエステル結合、ぺプチド−核酸（ＰＮＡ）結合（国際公開第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせなどの種々の結合で構成される。核酸中の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または２'メトキシおよび２'ハロゲン化物（２'−Ｆ等）置換等の置換を有する類似化合物である。

窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、イソシトシンおよびイソグアニンなどの非天然ヌクレオチド、それらの類似体（例えばイノシン；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992）、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ⁴−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、様々な化学的な位置のいずれかで変更されたまたは交換された置換基を有するピリミジンまたはプリン、例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ⁶−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ⁴−アルキルピリミジン、または非置換又は３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンなどのピラゾロ化合物（例えば、米国特許第５,３７８,８２５号明細書、同第６,９４９,３６７号明細書および国際公開第９３／１３１２１号））であればよい。

核酸は、骨格が１つ以上の位置で窒素含有塩基を有さない「脱塩基」位を含むことができる（米国特許第５,５８５,４８１号明細書）。例えば、１つまたは複数の脱塩基位置が、独立したオリゴヌクレオチド配列を一緒につなげるリンカー領域を形成することができる。核酸は、従来のＲＮＡおよびＤＮＡに見られるように従来の糖、塩基、および結合のみを含んでいてもよく、従来の構成要素および置換を含むこともできる（例えば、２'メトキシ骨格で連結された通常の塩基、または従来の塩基および１つまたは複数の類似体の混合物を含むポリマー）。この用語は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含み、ＲＮＡ模倣糖コンフォメーションにおいてロックされた二環式フラノースを有する１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含み、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ中の相補的な配列のためのハイブリダイゼーション親和性を強化させる（Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42):13233-41）。

本明細書で使用される用語「放出すること（releasing）」または「放出された（released）」は、２つの別個のオリゴヌクレオチド鎖を形成する核酸の二本鎖を変性させる温度まで加熱することにより、そのテンプレートから所望の増幅された核酸を分離することを意味する。

本明細書で使用される用語「除去すること（removing）」は、二本鎖の１つの核酸鎖をもう一方から単離、さもなければ除去および分離するために使用される種々の方法を意味し、例えば二本鎖の鎖の一方の酵素的、熱的および／または化学的消化、分解および／または開裂、または熱、音響エネルギー、化学物質、酵素またはそれらの組み合わせによる鎖の変性／解離等である。

用語「タグ領域」または「タグ配列」は、オリゴヌクレオチドまたはプライマーなどの他の核酸構造中に１つ以上の所望の機能を与えるために組み込まれるユーザーにより定義された１つまたは複数の核酸配列を意味する。そのようなエレメントの例としては、例えば、アダプタ、配列決定プライマー、増幅プライマー、捕捉及び／又はアンカーエレメント、ハイブリダイゼーション部位、プロモーターエレメント、制限エンドヌクレアーゼ部位、検出エレメント、質量タグ、バーコード、結合エレメント、および／または非天然ヌクレオチドなどが挙げられる。他のエレメントとしては、混合物中で他の核酸または核酸断片から、タグ配列が組み込まれている１つあるいはそれ以上の核酸または核酸断片を明確に区別するおよび/または同定するもの、交差反応性などを最小限に抑えるため核酸の混合物中において他に存在しないエレメント、および配列方向の決定を補助するためのエレメントなどを含む。タグ配列内のいくつかまたはすべてのエレメントは、増幅産物中に組み込むことができる。

本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする（hybridize）」、「アニール（anneal）」または「アニーリング（annealing）」は、適切な条件下で、ワトソン・クリック塩基対合によりお互い結合する実質的に相補的な配列を有する核酸についての能力を意味する。核酸のアニーリングまたはハイブリダイゼーション技術は本技術分野で周知である。参照：Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989); Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.(1994)。本明細書で使用される用語「実質的に相補的」は、結合核酸の完全な相補性、ならびに核酸の所望の結合を達成するのに十分な相補性の両方を意味する。同様に、用語「相補的なハイブリッド」は、実質的に相補的なハイブリッドを包含する。

本明細書で使用される用語「ディスプレーサーオリゴヌクレオチド」または「ディスプレーサー」は、同じ標的核酸上に結合された他の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの３'である標的配列内の位置で核酸標的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。ディスプレーサーがポリメラーゼで伸長されると、成長している伸長産物は他の結合された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドに遭遇し、その結合した１つまたは複数のオリゴヌクレオチドによって開始された任意の１つまたは複数の伸長産物と共に、核酸鎖からそれ/それらを外す。

本明細書で使用される用語「ブロッカーオリゴヌクレオチド」または「ブロッカー」は、修飾オリゴヌクレオチドまたは核酸に結合する薬剤、または修飾された核酸に結合する薬剤であって、複製を予防または阻害することができ、増幅反応においてプライマーおよび／またはプローブ中に組み込まれるものを意味する。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、２'フルオロ（２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオシド）修飾、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド、またはすべて複製を阻害または防ぐ３'−修飾を有するヌクレオチドを含むことができる。

核酸配列を増幅する一般的な方法は、本技術分野において、十分に説明され、周知である。そのような方法はいずれも、本発明の方法で用いることができる。一部の実施形態において、増幅は、例えば、VogelsteinおよびKinzler（"Digital PCR," PNAS, 96:9236-9241(1999)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたもののようなデジタルＰＣＲ法を使用する。そのような方法は、標的領域の増幅に先立ち、標的領域を含む試料を希釈することを含む。希釈は、従来のプレート、マルチウェルプレート、ナノウェルへの希釈、及びマイクロパッド上への希釈または微小液滴などを含むことができる。（参照：Beer NR, et al., "On-chip, real time, single copy polymerase chain reaction in picoliter droplets," Anal. Chem. 79(22):8471-8475(2007); Vogelstein and Kinzler, "Digital PCR," PNAS, 96:9236-9241(1999);およびPohl and Shih, "Principle and applications of digital PCR," Expert Review of Molecular Diagnostics, 4(1):41-47 (2004)；これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）いくつかの実施形態において、増幅はデジタルＰＣＲによるものである。

いくつかの場合において、標的領域の増幅のために、本発明の方法で使用される酵素には、３'−５'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング能力を有するＤＮＡポリメラーゼなどの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。この方法で使用することができる酵素の例としては、AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent、およびKapa HiFiDNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

高忠実度酵素は、標的配列の高忠実度（高精度）増幅を可能にする。いくつかの実施形態において、用いられる酵素は、３'−５'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング能力を有するＤＮＡポリメラーゼなどの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを含む。この方法で使用することができる酵素としては、AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent、およびKapa HiFiDNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

増幅産物は、当業者に公知の多くの方法、例えばこれらに限定されるものではないが、蛍光、電気化学検出、ゲル分析および配列決定などを用いて分析/検出することができる。さらに、産物は、リアルタイム増幅等の当業者に公知の多くの方法を用いて定量することができる。定量は、アクチンまたはＧＡＰＤＨなどのいわゆる「ハウスキーピング遺伝子」と、または既知の量で反応に添加できる内部標準と比較することによって標準化することができる。そのような方法は周知であり、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.) (2001)に記載されている。

本明細書に記載の方法を実行するための機器類は容易に入手可能である。このような機器には、リアルタイムおよびエンドポイントＰＣＲアッセイ、エマルジョンＰＣＲ、固相ＰＣＲ、融解曲線分析、および配列決定分析のための機器が挙げられる。このような機器には、ライフテクノロジーズ7500 Fast Dxリアルタイム機器（高解像度融解曲線分析も可能）および3500x1キャピラリーゲル機器が含まれる。本発明の方法において有用である本技術分野で公知の他の機器も、本発明の方法を実施する際に当業者の使用のために考慮される。

本発明は、核酸の混合物を含有する試料からの核酸標的の固定化及び増幅のための方法を提供する。増幅の様々な技術は本技術分野で知られている。これらの公知の方法の一部は、本発明の方法で活用することができる。特許出願公開第２０１１／０００３３０５号公報は、これらの方法のいくつかを開示しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明の方法は、多種多様な核酸構造および組成を利用する。これらのオリゴヌクレオチドの合成は、当業者に周知の標準的なホスホルアミダイト化学を用いて実施された。

図１Ａに示した本発明の１つの方法は、固体支持体の同じまたは隣接領域または別の支持体のいずれかに結合した第一及び第二固定化オリゴヌクレオチドを提供する。第一固定化オリゴヌクレオチドの配列は、標的核酸配列の第一部分に相補的である。第二固定化オリゴヌクレオチドの配列は、標的核酸配列の第二部分に同一である。第一固定化オリゴヌクレオチドの３'−末端は、第二固定化オリゴヌクレオチドの３'−末端が伸長を可能とするのに対し、その伸長を防止する方法でブロックされている。

当技術分野で一般に知られているように、オリゴヌクレオチドの３'−末端は、ブロッキング部分を使用して、化学的または構造的にブロックすることができる。ブロックされたオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第５,３９９,４９１号明細書、同第５,５５４,５１６号明細書、同第５,８２４,５１８号明細書および米国出願公開第２００６−００４６２６５号公報に記載されている。ブロックされたオリゴヌクレオチドとは、通常３'−末端にまたはその近くに化学的および／または構造的な修飾を含み、酵素的手段によるそのオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の開始を防止または妨げるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような修飾の例としては、３'２'−ジデオキシヌクレオチド塩基、酵素的伸長を防止する３'−非ヌクレオチド部分、または２つの５'−末端を有する最終的なオリゴヌクレオチドを作るためのオリゴヌクレオチドの３'−〜５'−方向に短い配列のアタッチメント（すなわち、第１の５'−〜３'−オリゴヌクレオチドが、通常、より短い第２の５'−〜３'−オリゴヌクレオチドに、それらの３'−末端で共有結合することにより接続される）の使用を含む。修飾の他の例は、オリゴヌクレオチドの３'−末端で少なくとも３個のヌクレオチドに相補的な配列から構成される「キャップ」であり、キャップの５'−末端塩基がオリゴヌクレオチドの３'−末端塩基に相補的である。また、オリゴヌクレオチドの伸長阻止は、その３'−末端を固体支持体に連結することによって達成することができる。したがって、本発明で使用する固定化オリゴヌクレオチドは、伸長のブロックが所望される場合には、その３'−末端またはその近くで固体支持体に結合されるように配向することができる。

標的核酸配列の第一部分と第二部分は、同じであってもよく、また異なっていてもよい。ほとんどの状況では、第一及び第二固定化オリゴヌクレオチド配列は、厳密には相補的でないことが好ましい。

一例では、試料由来の標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、第一固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより固体支持体上に固定化される。これは、第一および第二固定化オリゴヌクレオチドが別々の支持体に結合している場合には、第一固体支持体とすることができる。固体支持体は、試料の結合されていない成分を除去するために洗浄される。次に、標的結合領域およびタグ領域（タグ領域がポリメラーゼのプロモーター配列（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）を含む）を含む第一プライマーが固定された標的ＲＮＡにハイブリダイズする。第一プライマーは、その後、標的ＲＮＡのセグメントに結合した第一ｃＤＮＡ鎖を生成するためにポリメラーゼ酵素を使用して伸長される。標的ＲＮＡのセグメントは、その後酵素的に分解され（例えばＲＮａｓｅＨなど）、溶液中に第一ｃＤＮＡ鎖を遊離させる。第一ｃＤＮＡ鎖は、その後第一固体支持体上の（または、第一および第二固定化オリゴヌクレオチドが別々の支持体に結合している場合は第二固体支持体上の）第二固定化オリゴヌクレオチドにアニールする。第二固定化オリゴヌクレオチドは、その後ポリメラーゼ酵素を使用して伸長され、第一ｃＤＮＡ鎖のセグメントに結合した第二ｃＤＮＡ鎖を生成する。これにより、活性な二重鎖Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含む二本鎖が作り出される。複数のＲＮＡ転写物は、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、この二本鎖から溶液中に生成される。

あるいは、第一固定化オリゴヌクレオチドは、この方法において第一プライマーの伸長を停止させるために使用することができる。そのため、所望であれば、第一ｃＤＮＡ鎖の長さは、第一固定化オリゴヌクレオチドの標的鎖上の位置によって決定することができる。例えば、このブロッキング特性は、標的核酸がＲＮＡである場合２'−メトキシ残基を、または標的がＤＮＡである場合ロックド核酸（ＬＮＡ）を付けることなどの、標的核酸に対する非常に高いアフィニティーをもたせるように固定化オリゴヌクレオチドの標的結合領域を設計することにより、またはポリメラーゼの進行を阻止するためブロックグループ（立体的ブロッカー、インターカレート分子またはグルーブ結合剤等）を５'−末端に結合させることにより生じさせることができる。この技術は、本発明の他の方法においても利用することができる。

一実施形態では、第一および第二固定化オリゴヌクレオチドは、多種多様な方法で１つまたは複数の固体支持体上に構成することができ、同じ固体支持体に両方のオリゴヌクレオチドを結合することを含むが、これらに限定されるものではない。これは、固定化オリゴヌクレオチドを本質的に表面全体に結合すること、または固定化オリゴヌクレオチドを表面上の特定の領域、例えばスポット、膜の層などの表面の一部、あるいはワイヤまたはチューブ上のような表面のセグメントなどに結合することを含む。固定化オリゴヌクレオチドは混合することができ、あるいは支持体上の別々の位置、例えば異なるスポット、膜の異なる部分またはワイヤまたはチューブの異なる領域に結合させてもよい。これらの別々の位置は、アッセイの設計フロー、およびアッセイ装置、デバイスまたは機器の構成に応じて、互いに直接隣接していてもよく、または遠位位置（種々の程度に）であってもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドのそれぞれは、異なる支持体に結合されていてもよい。例えば、固定化オリゴヌクレオチドは、異なる粒子、異なるワイヤ、膜の異なる層、アレイの異なる個々のパッド、デバイスの異なるチャンバ、または異なる繊維に結合されていてもよい。

異なる支持体は、異なる種類の固体支持体であってもよい。例えば、第一オリゴヌクレオチドはチャンバの壁に結合されていてもよく、第二オリゴヌクレオチドはチャンバの内側部分内の繊維メッシュに結合されていてもよい。あるいは、２つの異なる支持体は、例えば膜と表面、チューブとウェル、またはチューブとワイヤであってもよい。

異なる固体支持体は、懸濁粒子の混合物、繊維マトリックスまたはワイヤーの束などのように相互に散在していてもよい。それらはまた、スタティックビーズアレイ、アレイの個々のパッド、膜の異なる層、またはマイクロ流体デバイス等のデバイス内の異なるチャンバ等、個別の位置であることができる。

さらに、種々の固体支持体は、アッセイの設計フロー、およびアッセイ装置、デバイスまたは機器の構成に応じて、互いに直接隣接して構成されていてもよく、または遠位位置（種々の程度に）で構成されていてもよい。本発明において使用することができる多種多様な固体支持体の種類としては、多孔質または非多孔性粒子、繊維、膜、ワイヤ、メッシュ、チューブ、チャンバ、ウェルおよびフローセル等が含まれるが、これらに限定されるものではない。支持体のスケールは、マクロからミクロ、ナノまたはそれ以下の範囲で変化してもよい。

この方法は、所望のＲＮＡ転写産物の数を増加させる追加の工程を含んでもよい。上記生成されたＲＮＡ転写物は、その後第二固定化オリゴヌクレオチドにアニールすることができ、ポリメラーゼを用いて伸長され、追加の第二ｃＤＮＡ鎖を生成する。得られたＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡはＲＮａｓｅＨを用いて分解され、第一プライマーがこれらの追加の二ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる。第一プライマー及び追加の第二ｃＤＮＡ鎖が伸長され、活性なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターで二本鎖を生成し、より多くのＲＮＡ転写物がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて製造される。溶液中のこれらの追加のＲＮＡ転写物は、第二固定化オリゴヌクレオチドにアニールされ、サイクルが繰り返される。

上記実施形態では、第一固定化オリゴヌクレオチドの配列は、高特異性または低特異性、あるいは特定の所望のレベルの特異性で目的の標的にハイブリダイズするように設計することができる。これにより、単一標的配列の非常に特異的な捕捉または試料中に存在するすべての／ほとんどの／多くの核酸の一般的な非特異的捕捉が可能となる。同様に、第一プライマーおよび第二固定化オリゴヌクレオチドはまた、任意の所望の特異性のレベルで結合するように設計することができる。例えば、第一プライマーの配列と２つのオリゴヌクレオチドとは、目的の標的核酸の非常に特定の領域に正確に相補的であるように設計することができ、（適切な結合条件下で）高いレベルの特異性をもたらす。また、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの配列は、１つだけまたはいくつかの相違点（例えばＳＮＰ、点変異、または２つ以上のＳＮＰまたは点変異）を含む配列間を区別するように設計することができる。SNPまたは点変異を識別するための１つの方法は、３'−末端にＳＮＰ／突然変異の部位を有するように１つまたは両方のプライマーを設計することである。正しい一致は、伸長および増幅を可能とする一方、ミスマッチでは伸長および増幅ができない。

オリゴヌクレオチドはまた、遺伝的転座事象（例えば慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ／ａｂｌ）または他の融合事象（例えば前立腺がんにおけるＴ２:ＥＲＧ）の産物であるmＲＮＡ標的などのキメラ標的の接合部位にまたがるように設計してもよい。あるいは、いずれかのオリゴヌクレオチドの配列が中程度の特異性で標的の複数の領域に結合するように設計することができる。

上述の実施態様の第二の実施形態では、ディスプレーサーオリゴヌクレオチドはまた、第一プライマーの３'にある位置で標的核酸にハイブリダイズすることができる。第一プライマーが伸長されると、ディスプレーサーも伸長され、標的核酸から第一プライマーの伸長産物を外す。このアプローチの１つの利点は、標的核酸から伸長産物を取り除くために熱変性を必要としないということである。例えば標的がＤＮＡである場合、ＲＮａｓｅＨでの消化は考慮されない。更に、ディスプレーサーの伸長産物は、増幅過程に入ることもでき、それにより増幅収量を増加させる。さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズすることもできる。ブロッカーが、プライマーの５'側の位置で標的核酸に結合する。ブロッカーは、プライマー（ならびに使用される場合はディスプレーサー）の伸長を停止させ、これにより伸長産物の長さを規定することとなる。ディスプレーサーおよび／またはブロッカーオリゴヌクレオチドを採用するこの技術は、本発明の他の方法においても利用することができる。

第三の実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、縮重塩基および／またはランダムな塩基の領域を含んでもよく、またはその全体がランダムな塩基からなっていてもよく、これにより低い特異性をもたらす。本明細書に記載される方法は、上述の方法で第一および第二固定化オリゴヌクレオチドと第一プライマーとを用いて特異性を調節することができるという点において、アッセイ特異性の制御に関して他の既存の方法に対する改善をもたらす。例えば、第一および第二固定化オリゴヌクレオチドと第一プライマーとを高い特異性で標的核酸にハイブリダイズするように設計することにより、優れた特異性を達成することができる。これに対応して、標的核酸の第一固定化オリゴヌクレオチドへの結合は、より低い特異性の条件下で行うことができる。これにより、野生型および変異型配列などの複数の種類の標的が捕捉できる一方、第二固定化オリゴヌクレオチドの伸長は高い特異性で行うことができる。これは、ＳＮＰｓまたは点突然変異の検出を可能とする（上記参照）。これらの条件下では、第一プライマーの特異性は、特異性の所望の全体的なレベルを提供するように調整することができる。

第四の実施形態では、一組の４つの異なる第二固定化オリゴヌクレオチドが設計され、各々は３'−末端に異なるヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）を備える。各々は標的核酸の対応する位置において異なるＳＮＰに対して特異的である。一構成では、これらの４つの異なる第二固定化オリゴヌクレオチドは、第一固定化オリゴヌクレオチドを取り巻く固体支持体に結合してもよい。第一固定化オリゴヌクレオチドを用いる目的の標的核酸の捕捉および第一鎖ｃＤＮＡの生成、ｃＤＮＡの第二固定化オリゴヌクレオチドによる再捕捉および特異的伸長（すなわち、一致した３'−末端が伸長し、ミスマッチのものは伸長しない）の後、すべての４つの可能なＳＮＰsを１つのアッセイで同定することができる。

第五の実施形態では、Ｔ７プロモーターを、ＳＰ６およびＴ３などの種々のプロモーターで置換することができる。この置換がなされた場合、そのプロモーターに対応する適切な酵素が伸長のために使用される。

第六の実施形態では、第一プライマーはさらにタグ領域を含み、タグ領域は、所望の機能性を提供する他のエレメントを含んでいてもよい。このようなエレメントの例には、アダプター、配列決定プライマー、増幅プライマー、追加の捕捉エレメント、検出エレメント、質量タグ、バーコードおよび結合エレメントなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのエレメントは、増幅産物中に組み込まれる。また、第二固定化オリゴヌクレオチドは、標的核酸結合領域の５'に位置するタグ領域を含んでもよく、また、所望の機能性を加える他のエレメントを含んでもよい。他のエレメントの例は直前に挙げられている。

第一プライマーのタグ領域は、さらにイソシトシン（ｉｓｏＣ）及びイソグアニン（ｉｓｏＧ）（図２）などの非天然ヌクレオチドを含む。これらの非天然のヌクレオチドは、それぞれイソGおよびイソＣと結合するが、天然のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）とは結合しない。これらの非天然ヌクレオチドは、標準的なホスホジエステル結合、または、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート結合のような他の結合によって共有結合で連結されていてもよい。この構成を有する第一プライマーを使用すると、イソＣ及び／またはイソＧヌクレオチドを含む第一ｃＤＮＡが生成され、次いでこれが、イソCおよび／またはイソGヌクレオチドをまた含むＲＮＡ転写物を生成するために使用される。増幅の次の回では、第一プライマーから生成された配列に結合するプライミング領域を含む第二プライマーが利用される。このプライミング領域は、第一回の増幅で生成されたイソＣおよび／またはイソＧヌクレオチドに相補的であるイソＣおよび／またはイソＧヌクレオチドを含む。増幅はその後前述したように進むが、今度は第二プライマーによって駆動される。この態様の１つの利点は、第二プライマーがイソＣおよび／またはイソＧヌクレオチドに非常に特異的であり、標的の他の領域に結合しないので、増幅副生成物を減少させることである。他の非天然塩基対を使用してもよいが、それらは互いに対を作るが、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）とは対を作らず、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼの基質となる。例として、非天然のヌクレオチドとしては、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１０−β−Ｄ−２０−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドン（Ｚとして知られている）及び２−アミノ−８−（１０−β−Ｄ−２０−デオキシリボフラノシル）−イミダゾ[１,２−ａ]−１,３,５−トリアジン−４（８Ｈ）−オン）（Ｐとしても知られいる）(Steven A. Benner, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 15105-15112)、２,４−ジアミノ−５−(３−Ｄ−リボフラノシル）ピリミジン（ｐｙＤＡＤ）と２'−デオキシキサントシン（ｐｕＡＤＡ）（米国特許第８,３５４,２２５号明細書）とピリジン−２−オンおよび２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Lee & Berdis, Biochim Biophys Acta, 2010 May; 1804(5）: 1064-1080)があげられるが、これらに限定されるものではない。

図６に示した本発明の第二の実施態様は、いずれも固体支持体の同じまたは隣接領域に、または別々の支持体に結合した第一及び第二固定化オリゴヌクレオチドを提供する。第一固定化オリゴヌクレオチドの配列は、標的配列の第一部分に相補的である。第二固定化オリゴヌクレオチドの配列は、標的配列の第二部分と同じである。第一固定化オリゴヌクレオチドの３'−末端は、第二固定化オリゴヌクレオチドの３'−末端が伸長を可能とするのに対し、伸長を防止する方法でブロックされている。

標的核酸配列の第一部分と第二部分は、同じであっても異なっていてもよい。ほとんどの状況では、第一及び第二固定化オリゴヌクレオチド配列は、厳密には相補的でないことが好ましい。

増幅法は、ＲＮＡまたはＤＮＡ標的核酸を用いて行うことができる。一例では、試料からのＲＮＡ標的（例えばｍＲＮＡ）は、第一固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより固体支持体上に固定化される。第一および第二固定化オリゴヌクレオチドが別々の支持体に結合している場合、これは第一固体支持体であってもよい。固体支持体は、試料の結合されていない成分を除去するために洗浄される。

標的結合領域を含む第一プライマーは、固定された標的ＲＮＡにハイブリダイズされる。第一プライマーはポリメラーゼにより伸長され、固定化標的ＲＮＡのセグメントに結合した第一ｃＤＮＡ鎖を生成する。ＲＮＡ標的のセグメントは酵素的に分解され（例えばＲＮａｓｅＨなど）、溶液中に第一ｃＤＮＡ鎖を遊離する。第一ｃＤＮＡ鎖は、第一固体支持体上の、あるいは第一および第二固定化オリゴヌクレオチドが異なる支持体に結合している場合には第二固体支持体の第二固定化オリゴヌクレオチドにアニールされる。第二固定化オリゴヌクレオチドはポリメラーゼを用いて伸長され、第一ｃＤＮＡ鎖のセグメントに結合した第二ｃＤＮＡ鎖を生成する。第一プライマーおよび／または第二固定化オリゴヌクレオチドはさらにタグ配列を含むことができる。

二本鎖はその後分離される（例えば熱変性等）。第一プライマーは、固体支体に結合された第二ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされ、第一ｃＤＮＡ鎖は、第二固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。さらに、元の標的鎖は、第一固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、第一プライマーは元の標的鎖にハイブリダイズする。第一プライマーおよび第二固定化オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによって伸長され、プロセスが繰り返される。このサイクルは、所望の増幅がなされるまで繰り返すことができる。別のワークフローが本発明のこの実施形態で利用できることは、当業者によって認識される。例えば、第一プライマーは、標的核酸が第一固定化オリゴヌクレオチドに結合するのと同じ工程において、標的核酸に結合してもよい。また、元の標的鎖と第一ｃＤＮＡ鎖とは、熱変性などのＲＮＡｓｅＨ消化以外の方法を用いて分離することができる。

図7に示す本発明の第三の実施態様では、固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、固体支持体にハイブリダイズされる。固定化オリゴヌクレオチド/第一プライマーの配列は、標的配列の第一部分に相補的である。本実施形態の一例では、標的の第一部分の５'側に、標的の第二部分に相補的なブロッカーオリゴヌクレオチドも必要に応じて提供される。ブロッカーオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズされ、標的核酸は固体支持体上の固定化オリゴヌクレオチド／第一プライマーにハイブリダイズされる。

固体支持体は、試料の結合されていない成分を除去するために洗浄される。固定化オリゴヌクレオチド／第一プライマーは、ポリメラーゼで伸長され、伸長はブロッカーで終結し、固体支持体に結合された定義された長さの第一二本鎖核酸を生成する。標的核酸は、固体支持体に結合された第一核酸を残して、第一二本鎖から除去される（例えば、標的がＲＮＡまたは熱変性である場合にＲＮａｓｅＨで消化など）。結合領域およびタグ領域（タグ領域は、ポリメラーゼプロモーター配列（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）そして必要に応じて伸長を防止する方法でブロックされた３'−末端を含む）を含む第二プライマーは、その結合領域が第一核酸の３'−末端と重なり合うように第一核酸にハイブリダイズされる。

第一核酸は、活性な二重鎖Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含む第二二本鎖核酸を生成するように伸長される。複数のＲＮＡ転写物は、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、この二本鎖から溶液中に生成される。これらのＲＮＡ転写物は、固体支持体上の固定化オリゴヌクレオチド／プライマーにハイブリダイズすることができ、固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、第三二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより伸長される。第三二本鎖のＲＮＡ鎖は、固体支持体に結合された第三核酸を残して除去される（例えばＲＮａｓｅＨ消化、熱変性など）。第二プライマーはその後第三核酸にハイブリダイズされ、サイクルは所望の増幅が達成されるまで繰り返される。

第四の実施態様では、新鮮凍結またはホルマリン固定パラフィン包埋組織試料などの断片化された試料から増幅された標的核酸の方向を決定するための方法が提供され、配列決定が簡素化される（図３）。

一例では、新鮮凍結もしくはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、体液または他の同様な試料由来の核酸は、断片化され、多様な核酸を生成する。標的核酸の最初の捕捉は、第一プライマーとのハイブリダイゼーションの前にまたは後に起こってもよい。また、捕捉は、イオン性結合または他の結合性相互作用（核酸縮合または密集法（crowding method）など）に基づくまたは駆動されるハイブリダイゼーションであってもよい。必要に応じて、捕捉はヘアピンプライマーを利用することができる。一般に、捕捉は、捕捉が第一プライマーまたはヘアピンプライマーの伸長を妨げないように、標的核酸の５'−末端に向けられるか、または標的核酸配列の長さに沿った弱い相互作用に基づく。あるいは、標的／第一プライマー複合体は、過剰な第一プライマーを除去した後、固体支持体から放出される。

あらかじめ結合されていない場合、第一プライマーまたはヘアピンプライマーは標的核酸にハイブリダイズされる。第一プライマーは、その３'−末端にランダム、または大部分がランダムである約６〜約９ヌクレオチドセグメントを、そしてその５'−末端にタグ配列を含む。バーコード配列は、必要に応じてタグ配列に含まれ、典型的には３'-ランダム配列とタグ配列の残り部分との間に挿入される。このタグ配列カセット、または（含まれる場合）バーコード配列またはその２つの組み合わせは、初期ｍＲＮＡ標的配列の方向を決定するために使用されものである。プライマーがヘアピンプライマーである場合、良好なエンドスタッキング相互作用に起因する標的核酸配列の３'−末端に優先的にハイブリダイズする約６〜約９のオーバーハング３'ランダムヌクレオチド領域を含む。あるいは、ヘアピンは標的配列の３'−末端にライゲートすることができる。

第一プライマーまたはヘアピンプライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションが完了すると、固体支持体は過剰プライマーを除去するために洗浄され、プライマーは適当なポリメラーゼを用いて伸長される。通常では、ポリメラーゼは、ｍＲＮＡ標的の場合、逆転写酵素である（任意にはＲＮａｓｅＨ活性を欠く）。これは、標的核酸上の第一プライマーのハイブリダイゼーション位置に依存して１つまたは複数のｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ複合体を生成する。具体的には、プライマーが３'−末端にハイブリダイズしたかまたは標的ｍＲＮＡの長さに沿った複数の位置でハイブリダイズしたかによる。

ｃＤＮＡは標的ｍＲＮＡから分離される。この工程は、ＲＮａｓｅＨによる消化により達成することができる。遊離のｃＤＮＡは、通常ではプロトコルの前工程で使用されたのと同じ捕捉方法を用いて捕捉され、第一プライマーと類似している第二プライマーにハイブリダイズされる（必要でない場合バーコードを含めなくてもよい）。ｃＤＮＡ／第二プライマー複合体は、過剰のプライマーを除去するために洗浄される。第二プライマーは、適切なＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長される。しかし、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いてもよい。この伸長の産物（以下構築物という）は、それらの５'−末端および３'−末端の両方に既知のタグ配列を有することになる。

これらの構築物は、その後第一および第二プライマーに対する元のタグ配列の少なくとも１つのセグメントとそれぞれ同一である第三及び第四プライマーを用いて増幅される。これら第三及び第四プライマーはまた任意に、第一および/または第二プライマーのタグ配列に含まれていなかった所望の機能的エレメントを含むそれらの５'−末端に位置するタグ配列を含有することができる。必要に応じて、種は、適切かつ所望のこの方法の任意の場所でサイズに応じて分離することができる。

この方法はＤＮＡ標的に利用されることもでき、ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼの代わりに使用され、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖における鎖は熱変性などＲＮＡ消化以外の手段によって分離される。さらに、第一および第二プライマーは、標的配列へのそれらのハイブリダイゼーション特性を改善するために、５−メチル−ｄＣ、２,６−ジアミノプリン、Ｃ５プロピニル−ｄＣおよび−ｄＵ、ならびに２'−Ｆ−修飾ヌクレオチド等のヌクレオチド類似体で修飾することができる。

第五の実施態様では、ディスプレーサーとブロッカーオリゴヌクレオチドとを用いる所定の長さの増幅された標的核酸を調製するための方法が提供される。

一例では、第一プライマーは固体支持体上に固定化される（図４）。第一プライマーの配列は、標的核酸配列の第一部分に相補的である。ディスプレーサーオリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび標的核酸は固体支持体に追加される。ディスプレーサー配列は標的核酸の第二部分に相補的である。第二部分は第一部分の３'側に位置している。ブロッカー配列は標的核酸の第三部分に相補的である。第三部分は標的の第一部分の５'側に位置する。ディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチド両方は、標的核酸にハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた標的は第一プライマーのハイブリダイゼーションにより固体支持体上に固定化される。

固体支持体は、試料の結合されていない成分及び結合していないブロッカーおよびディスプレーサーオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄される。第一プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、固体支持体に結合された所定の長さの第一核酸を含む第一二本鎖を生成する。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによって伸長され、第一二本鎖から標的核酸を外す。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、固体支持体に結合していない定義された長さの第二核酸を含む第二二本鎖を生成する。

その後、第二プライマ―が第一核酸にハイブリダイズされ、ポリメラーゼによって伸長され、第一核酸と第三核酸を含む第三二本鎖を生成する。第二および第三二本鎖はまた、熱変性または本技術分野で公知の他の適切な手段等で解離される。第二プライマーは、第一核酸にアニーリングし、ポリメラーゼにより伸長され、より多くの第三二本鎖を生成する。

第三核酸は、空いている第一プライマーへのハイブリダイゼーションによって固体支持体上に固定化される。第一プライマ―は、ポリメラーゼにより伸長され、より多くの第三二本鎖核酸を生成する。元の標的核酸鎖は、そこに結合されたディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドと共に、空いている第一プライマーにハイブリダイズされ、第一プライマーは、より多くの第一二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより伸長される。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによって伸長され、第一二本鎖核酸の標的核酸鎖を外す。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、支持体に結合されていない定義された長さの第二核酸を含む第二二本鎖核酸を生成する。

第二プライマーが第二核酸にハイブリダイズされ、ポリメラーゼによって伸長され、第二核酸と第四核酸を含む第四二本鎖核酸を生成する。その後すべての二本鎖は変性され、そしてそのサイクルは所望のように繰り返される。

この例の一実施形態では、追加のブロッカーおよび／またはディスプレーサーオリゴヌクレオチドは洗浄工程の後に上記の反応混合物に添加される。あるいは、ブロッカーとディスプレーサーオリゴヌクレオチドは、標的との最初のハイブリダイゼーション工程で除外されるが、洗浄工程の後に加えられる。

第二の実施形態においては、ディスプレーサーおよび／またはブロッカーオリゴヌクレオチドが省略される。ディスプレーサーが省略される場合、そうでなければ置換活性を介してお互いに分離されていた二本鎖の鎖は、今回は熱変性等他の手段によって分離される。

この例の第三の実施形態では、一方または他方または両方のプライマーがタグ配列を含む。一構成では、一方または両方のタグ配列は、ユーザ選択配列である追加のプライマー部位を含む。これらの１つまたは２つの追加のプライマー配列は、上記の第１回目の増幅後の増幅を駆動するために利用することができる。さらに、これらの１つまたは２つの追加プライマーは、上述した第一プライマーが結合している固体支持体と同じまたは異なるいずれかの１つまたは複数の固体支持体に取り付けることができる。

また、本発明の特定の実施形態に関連して本明細書中において説明されるタグ配列の包含および潜在的使用は、本発明の他の実施形態にも同様に適用されること意図される。

第四の実施形態では、（固体支持体に結合された）第一プライマーは、試料由来の多くの標的核酸の固定化をサポートする配列を有する。例えば、第一プライマーの配列は、多くの標的核酸の結合をサポートする長さで約６〜約９ヌクレオチドのランダムなヌクレオチドのストレッチを含むことができる（例えば、ｍＲＮＡ標的の複数の断片など）。あるいは、第一プライマーの配列は、多くの標的核酸の集団の規定または半規定サブセットの結合をサポートする長さで約８〜約２０ヌクレオチドのセミランダムなヌクレオチドのストレッチを含むことができる（例えば、ゲノムＤＮＡ標的からの複数の断片など）。さらに、いくつかの他のレベルの特異性は、試料中の目的の標的核酸の大部分が固定化できるように設計することができる。プライマーが伸長され、手順が上述のように継続される。

第五の実施形態では、方法は固体支持体に結合された第一および第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーを提供する（図５）。第一固定化オリゴヌクレオチド／プライマーの配列は、標的核酸配列の第一部分に相補的である。第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーの配列は、標的核酸配列の第二部分と同一である。一例において、ディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドが増幅法で使用される。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドは、標的核酸の第二部分に相補的である配列を有し、その第二部分は標的核酸の第一部分の３'側に位置する。ブロッカーオリゴヌクレオチドは標的核酸の第三部分に相補的である配列を有し、その第三部分は標的核酸の第一部分の５'側に位置する。ディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズされ、標的核酸は固体支持体上の第一固定化オリゴヌクレオチド／プライマーにハイブリダイズされる。

固体支持体は、試料中の結合されていない成分を除去するために洗浄される。第一固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、固体支持体に結合され定義された長さの第一核酸を含む第一二本鎖核酸が生成される。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドはまた伸長され、第一二本鎖核酸から標的核酸を外す。伸長はブロッカーオリゴヌクレオチドで終結し、定義された長さの第二核酸を含む第二二本鎖核酸が生成される。この第二二本鎖核酸は、固体支持体に結合されない。第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、ブリッジ構造を生成するために、固体支持体に結合された第一核酸にハイブリダイズされる（図５参照）。

第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、ポリメラーゼにより伸長され、共に固体支持体に結合された第一核酸および第三核酸を含む第三二本鎖核酸を生成する。第二および第三二本鎖は、その後解離される（例えば、熱変性または本技術分野で公知の他の適切な手段等により）。第一核酸は、空いている第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーにハイブリダイズされ、第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、より多くの第三二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより伸長される。同様に、第三核酸は、空いている第一固定化オリゴヌクレオチド／プライマーにハイブリダイズされ、第一固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、より多くの第三二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより伸長される。また、第二核酸は、第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーにハイブリダイズされ、第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、第四二本鎖核酸を生成するために伸長される。

元の標的核酸は、そこにハイブリダイズされたディスプレーサーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドと共に、空いている固定化オリゴヌクレオチド／第一プライマーにハイブリダイズされる。固定化オリゴヌクレオチド／第一プライマーは、ポリメラーゼにより伸長され、より多くの第一二本鎖核酸を生成する。ディスプレーサーオリゴヌクレオチドはまた伸長され、それが伸長されると第一二本鎖から標的核酸を外す。伸長はブロッカーで終結し、固体支持体に結合されていない定義された長さの第二核酸を含む第二二本鎖核酸を生成する。その後すべての二本鎖は変性され、そしてサイクルは所望のように繰り返される。

第六の実施形態においては、標的核酸は二重鎖である。第一および第二固定化オリゴヌクレオチド／プライマーは、それぞれ二重鎖標的核酸の第一および第二鎖上の第一領域に相補的である。これらの２つの領域は、二重鎖標的核酸の異なる位置にある。一方または他方または両方の鎖は、上記のように任意のディスプレーサーおよび/またはブロッカーオリゴヌクレオチドを提供することができる。各鎖に対する方法は、１回目の増幅については上述したものと同じであり、その後置換された鎖もプロセスに入って上述したようなブリッジ増幅が進められ、これにより増幅量が増加される。溶液中に残された標的核酸は、ディスプレーサーおよび／またはブロッカーをハイブリダイズし、支持体上のプライマーに結合されるさらなるラウンドに加わり、さらなる増幅にも関与し、再び増幅量を増加させる。

また、本発明の特定の実施形態に関して本明細書において説明される二本鎖標的の両方の鎖の増幅は、本発明の他の実施形態でも同様に増幅できることが意図される。

上述した情報は、装置及び方法の実施形態を製造および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に与えるために設けられており、発明者が自分の発明で考慮する範囲を限定することを意図するものではない。（当業者に明らかである発明を実施するための）上記の態様の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書において引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、種々の方法で引用された洗浄工程の多くは任意であり、２つの核酸鎖をお互いに除去および／または分離するいくつかの工程も同様である。洗浄および／または分離工程の少なくとも一部を実施しないことにより、所望の結果を達成しながら、より速く、より簡単でより経済的なワークフローをもたらす。別の例では、例示の方法における特定のオリゴヌクレオチドおよび/または標的核酸の段階的な添加および／または結合は併合してもよい。さらに、タグ配列の使用は、いくつかの実施形態では任意であり、それらの可能性のある構成は、上記の例示したものから変化してもよいが、当業者の知識の範囲内に限る。いくつかの例では、エキソヌクレアーゼ消化を５'−末端から防止するブロッキンググループの使用は必要とされない。さらに、多種多様なポリメラーゼ、伸長条件及び当業者に公知の他の増幅プロトコールは、上述の方法における様々な工程または工程の組み合わせにおいて使用することができる。当業者に自明である開示された方法への他の自明な変更も本発明に包含される。

Claims (4)

1. 核酸の混合物を含有する試料から標的核酸を固定化及び増幅する方法であって、
   そこに固定された第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを有する固体支持体に前記試料を適用する工程であって、前記第一オリゴヌクレオチドは、３'−末端からの伸長を防ぐためにブロックされており、前記標的核酸の第一部分に相補的な配列を有し、前記第二オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の第二部分と同一の配列を有し、前記の標的核酸が第一オリゴヌクレオチドに結合し、そして必要に応じて結合していない核酸を除去するために前記固体支持体を洗浄する工程；
   標的結合領域およびプロモーター配列を有する第一プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズし、第一二本鎖核酸を生成するためにポリメラーゼにより前記第一プライマーを伸長し、そして必要に応じて前記標的核酸を前記二本鎖核酸から取り除き第一核酸を生成する工程；
   前記第一核酸を前記第二オリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記第二オリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長し、第一核酸と第二核酸を含む第二二本鎖核酸を生成する工程；ならびに
   プロモーター依存ポリメラーゼにより第三核酸の複数の複製物を生成し、それにより前記標的核酸を増幅する工程
   を含む方法。
2. 前記増幅された第三核酸を前記第二オリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記第二オリゴヌクレオチドを伸長して第三二本鎖核酸を生成する工程；
   必要に応じて、前記増幅された第三核酸を取り除き、固体支持体に結合された第四核酸を生成する工程；
   前記プライマー配列を前記第四核酸にアニーリングし、前記プライマーおよび前記第四核酸をポリメラーゼにより伸長し、第五核酸と追加の第二核酸を含む第四二本鎖核酸を生成する工程；および
   ポリメラーゼにより前記第三核酸の複数のコピーを生成する工程であって、前記ポリメラーゼが前記第四二本鎖核酸上のプロモーターに特異的であり、それにより前記標的核酸を増幅する工程
   をさらに含む請求項１記載の方法。
3. 前記プライマーが、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含むタグ配列をさらに含む請求項１記載の方法。
4. 前記第二オリゴヌクレオチドが、３'−末端に前記第一核酸の４つの異なるＳＮＰに特異的な別々のヌクレオチドをそれぞれ有する４つのオリゴヌクレオチドである請求項１記載の方法。