JP2007506429A

JP2007506429A - ポリマー核酸のハイブリダイゼーションプローブ

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Publication number: JP2007506429A
Application number: JP2006528153A
Authority: JP
Inventors: ハート，リチャード・エイ; ホウィテイカー，トム・ジェイ
Original assignee: アトム・サイエンシズ・インコーポレーテッド
Priority date: 2003-09-23
Filing date: 2004-09-23
Publication date: 2007-03-22
Also published as: WO2005030929A3; EP1687445A2; EP1687445A4; US20050112636A1; WO2005030929A2

Abstract

新規ポリマー核酸プローブは、さまざまなハイブリダイゼーションプラットホームにおいて検出感度及び特異性を向上させる。プローブは、結合した複数の短い核酸配列（モノマーという）でできており、ハイブリダイゼーション用途に使用する長いポリマープローブを形成する。プローブの表面への固定を必要とする用途に関し、ポリマープローブは、プローブの端に化学修飾することなくさまざまな表面に固定できる点で長いＤＮＡプローブに類似している。標的核酸は、ポリマープローブ中の比較的短いモノマーにハイブリダイズするため、ポリマープローブは、長いＤＮＡプローブよりも特異的である。更に、ポリマープローブは、表面の単位面積あたりに固定される接近可能なモノマーオリゴヌクレオチドプローブ数を増加させることによって、シグナル対バックグラウンド比も向上させる。
【選択図】図２Ａ

Description

本発明は、核酸ハイブリダイゼーションの分野に関するものである。これには、臨床診断、臨床スクリーニング、遺伝子型決定、病原体検出、病原体同定、特定遺伝子の検出、遺伝子発現試験、医学的応用、及び多型の検出を含めた広範な応用のために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）標的を、公知配列を有するプローブにハイブイリダイズさせることが含まれる。

ＤＮＡとＲＮＡ
遺伝情報は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の４つの塩基（アデニン［Ａ］、グアニン［Ｇ］、チミン［Ｔ］、及びシトシン［Ｃ］）の配列内に含まれている。同様に、リボ核酸（ＲＮＡ）にも４つの塩基、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びウラシル（Ｕ）がある。ＤＮＡ及びＲＮＡでは、これらの塩基が糖−リン酸骨格に結合している。この骨格は、構造的方向性を有しており、一端は５’端と規定され、他端は３’端である。特に言及しない限り、ＤＮＡ配列は、慣例により５’端から最初に記載されている。したがって、ＡＧＡ−ＴＣＧ−ＧＴＣは５’−ＡＧＡ−ＴＣＧ−ＧＴＣ−３’と同等である。更に、ＤＮＡの２つの１本鎖が結合（ハイブリダイズ）して２本鎖ＤＮＡ（ハイブリッド）を形成する場合、それらは逆平行に結合し、一方の鎖の５’から３’方向は他方の鎖の５’から３’方向と１８０°をなしている。最も安定なハイブリッドは、一方の鎖の配列が他方の鎖の配列と相補的である場合に形成される。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドでは、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である；ＤＮＡ／ＲＮＡでは、ＡはＵに相補的であり、ＧはＣに相補的である。このことは、公知配列のプローブ核酸と安定なハイブリッドを形成するかどうか試験することによって標的核酸について配列情報を得ることを可能にする。ハイブリッドの長さ、相補性の程度、ミスマッチの位置、Ｇ−Ｃ含量、ｐＨ、及び塩濃度などのいくつかのパラメータは、全て得られたハイブリッドの安定性に影響する。一般に、短いハイブリッドの安定性は、長いハイブリッドの安定性よりも、少量のミスマッチに影響される。

他の核酸
ペプチド核酸（ＰＮＡ）［Ｅｇｈｏｌｍら、米国特許第６，４５１，９６８号］は、ＤＮＡの合成アナログであり、ハイブリダイゼーションやポリメラーゼ連鎖反応技術におけるＤＮＡの代用品としてうまく使用されている［Ｇａｎｅｓｈら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４（９）：９３１（２０００）を参照されたい］。ＰＮＡ／ＤＮＡ２重鎖及びＰＮＡ／ＲＮＡ２重鎖は、一般に、対応のＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ２重鎖よりも安定である［Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：５０７２（１９９７）］。ハイブリダイゼーション技術には、ＤＮＡ模倣能の点で成功がさまざまな多くのＰＮＡ化学的骨格修飾が用意されている［Ｇａｎｅｓｈら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４（９）：９３１（２０００）］。ＰＮＡ骨格の構造は標準の酵素学的連結技術を許容しないが、化学的方法が開発されている。天然核酸に対する他の修飾には、２’酸素と４’炭素とを糖骨格内でリンクさせることが含まれる。この修飾産物は、「ロックト核酸」又はＬＮＡと命名されている。ＬＮＡのフラノース環は、Ｃ３’エンド型構造内でロックされており、これは非常に安定なＬＮＡ／ＤＮＡ及びＬＮＡ／ＲＮＡ２重鎖をもたらす［Ｐｅｔｅｒｓｅｎ及びＷｅｎｇｅｌ、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：７４（２００３）］。

固定されたプローブへのハイブリダイゼーション
ハイブイリダイゼーション実験は、由来の異なる核酸間の遺伝的類似性の程度を測定する。多くの場合、こうした実験は、プローブと呼ばれる公知配列の１つの核酸と、標的と呼ばれる調査対象である核酸とを用いて行われる。ハイブリダイゼーション実験は溶液中で行うことができるが、同時に存在する使用可能なプローブ配列数を制限する。この制限を克服するには、さまざまな配列のプローブを、固体表面のさまざまな位置に固定することができ、これにより高度の多重化を可能にする。多くの研究者は、これらのハイブリダイゼーションアレイ（ＤＮＡマイクロアレイ、遺伝子センサー、遺伝子チップなどともいう）は、特定配列のＤＮＡ又はＲＮＡがサンプル中に存在するかどうかを決定する最良の方法であると考えている。プローブは、典型的には化学合成によって作製される短いオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）でも、典型的にはクローニングによって又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）若しくは他の増幅技術を用いてＤＮＡを複製することによって作製されるＤＮＡのより長いセクションでもよい。１本鎖標的核酸をプローブとハイブリダイズさせることによって、標的核酸の配列情報が得られる。２つの鎖が完全な相補体である場合、得られるハイブリッドは最も安定である。たった１つのミスマッチでさえ、２５ｂｐのハイブリッドの安定性を顕著に減少させるであろう［Ｗａｎｇら、１９９５］。したがって、総称して「ストリンジェンシー」と呼ばれる適切な条件下、ハイブリダイゼーション後の特定プローブ部位における安定なハイブリッドの存在は、標的核酸に相補配列が存在することを示す。このように、適当なストリンジェンシー下では、配列ＡＧＡ−ＴＣＧ−ＧＴＣを有するプローブ部位での安定なＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの存在は、標的のセクションに配列ＧＡＣ−ＣＧＡ−ＴＣＴがあることを示しているであろう。安定なハイブリッドの存在は、通常、標的ＤＮＡを標識し、ハイブリダイゼーション反応後に標識を検出することによって決定される。当該分野に熟練した者は、アレイ又はプローブを何ら改変することなく、このタイプのアレイによってリボ核酸（ＲＮＡ）標的も精査され得ることを認識するであろう。同様に、ＤＮＡアナログ、例えばペプチド核酸［Ｅｇｈｏｌｍら、米国特許第６，４５１，９６８号］、又は化学修飾したＤＮＡ、例えばロックト核酸［Ｐｅｔｅｒｓｅｎ及びＷｅｎｇｅｌ、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：７４（２００３）］からプローブを作製できることが認識されるであろう。

ハイブリダイゼーションアレイでの部位特異的配列固定は、多量のプローブ配列を１つの基板に採用して、同時に標的核酸を試験することを可能にする。この利点は、病原体検出の例に見ることができる。病原体を検出し、特徴付けするために、毒素をコードする遺伝子配列、毒素の産生及び送達に関連する配列、病原性因子に関連する配列、並びに抗菌物質耐性遺伝子を同時に標的にして診断の確実性を向上させることができるであろう。ウイルス診断は、ウイルスゲノムに存在する配列構造の同定を目的とする複数のプローブに依拠するであろう。したがって、多量の病原体が診断手順において同時に調査される場合、更に多量のハイブリダイゼーション反応を必要とする。マイクロアレイは、こうした反応を同時に実施する能力を提供する。ＤＮＡアレイの並列的性質により、他のプローブと同一条件下で対照配列も試験することができる。対照配列とは、標的核酸に存在することが知られている配列と相補的な配列（陽性対照）であるか、又は標的核酸存在しないことが知られている配列と相補的な配列（陰性対照）である。

長いプローブ
長いプローブは、複数の付着物を介して基板表面に付着したプローブである。長いプローブは、例えばポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライドグラスに付着させ、紫外線照射で架橋させることができる。アミン又はエポキシコーティングのような他のいくつかのコーティングも用いることができる。１級アミン基（Ｒ−ＮＨ_２）を用いたコーティングでは、例えば、アミンは中性ｐＨで陽電荷をもち、ＤＮＡの陰性荷電したリン酸骨格とのイオン結合の形成を介して長いＤＮＡの付着を可能にする。紫外線又は熱への曝露は、静電相互作用を補う共有結合を誘発するであろう。ＤＮＡは、その長さにしたがって複数の位置に結合するため、ＤＮＡの特定セクションは標的へのハイブリダイゼーションに利用できないかもしれない。しかしながら、これらのＤＮＡの長さは、たとえプローブにミスマッチや利用できないセクションがあったとしても、ハイブリッドを非常に安定にする。長いＤＮＡはその構造の長さにしたがって基板に付着するため、短いＤＮＡの固定に必要とされる末端修飾は、長いＤＮＡプローブには必要とされない。これは、短い合成ＤＮＡプローブに対する費用や複雑さを顕著に減じることを意味する。他の利点は、Ｇ−Ｃ結合はＡ−Ｔ結合よりも強いという事実によって起こる安定性の配列依存的変動が、長いＤＮＡでは平均する傾向にあるということである。しかしながら、長いプローブでは１塩基ミスマッチによって起こる不安定性もあまり顕著ではなく、アレル特異的ハイブイリダイゼーションを困難にし、多型の特徴付けを目標とした応用における長いプローブの使用を妨げる。長いプローブは、遺伝子の発現をモニターする応用に、より好適である。長いプローブに関する他の問題は、クローン又はＰＣＲ産物の調製に多大な努力を要し、発現をモニターするためにＰＣＲで産生される配列は、確実に増幅できるものに制限されることが多いということである。

短いプローブ
短いＯＤＮプローブの主な利点は、１塩基ミスマッチが、短いハイブリッドを長いハイブリッドよりも不安定化させることである。この特性は、１塩基多型（ＳＮＰ）の決定のようなアレル特異的ハイブリダイゼーションを必要とする応用に生かすことができる。ハイブリッド安定性は長さが短くなるとともに減少するという事実は、より長いプローブは長い標的の内部構造の解明を助けるという事実とともに、約８塩基よりも短いＯＤＮプローブの使用を妨げる。

短いプローブの固定には、典型的には、ＯＤＮへの高価な末端修飾を必要とする。オリゴヌクレオチドを固体支持体へ付着させるための化学作用のデザインは、マイクロアレイ開発技術において主要な研究の焦点となっており、ＯＤＮ固定に非常によく機能する多くの市販の活性化基板が存在している。フォトリソグラフィー技術を用いて、オリゴヌクレオチドプローブがｉｎｓｉｔｕで合成されている。この技術は、非常に高密度のＯＤＮプローブアレイを可能にする［Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７（１９９１）］が、このアプローチで調製したマイクロアレイは非常に高価である。フォトリソグラフィー法も、中密度及び低密度アレイや、多量の反復実験を必要とする状況にはあまり適当ではない。５’−又は３’−アルキルアミンを利用する化学作用は、アルデヒド、エポキシド、及びアミンで修飾した表面とうまく反応する［Ｄｏｌａｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２９：ｅ１０７（２００１）；Ｇｕｏら、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．、１２：４４７（２００２）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：２１３（１９９５）］。チオール誘導体化ＯＤＮは、メルカプトシラン化（mercaptosilanated）表面又は金でコーティングした表面に付着することが示されている（Ｈｅｒｎｅ及びＴａｒｌｏｖ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１９：８９１６（１９９７）；Ｒｏｇｅｒｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６６：２３（１９９９））。

同様にうまく機能することが示されている他の化学作用には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような不安定な中間体及び／又は複雑な化学処理が含まれる［Ｋｗｉａｔｏｗｓｋｉら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２７：４７１０（１９９９）；Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２７：３０３５（１９９９）；Ｓｔｒｏｔｈｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２８：３５３５（２０００）］。

固体支持体上のＯＤＮプローブの充填密度は、重要な検討材料である［Ｓｔｅｅｌら、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪ．、７９：９７５（２０００）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２９：５１６３（２００１）］。ＯＤＮプローブの過剰な充填密度及び表面への近接性は、立体効果及び込み合い効果［Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．、２１ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：５（１９９９）］及び／又はＤＮＡで修飾した表面でのＤＮＡ骨格の陰電荷濃度による静電的反発力［Ｓｔｅｅｌら、（２０００）；Ｈｅｒｎｅ及びＴａｒｌｏｖ（１９９７）］のために、ハイブリダイゼーションシグナルを減少させる。末端修飾には、多くの場合、ＯＤＮと付着物成分とのあいだでスペーサーとして作用する分子鎖が含まれる［Ｓｃｈｅｐｉｎｏｖら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５：１１５５（１９９７）］。これは、固定されたＯＤＮプローブを表面から更に遠くへ伸長させ、ハイブリダイゼーションシグナルを増加させる。更に感度を上げるために、多孔性アクリルアミドマトリックス又は「ゲルパッド」が開発されている［Ｌｉｖｓｈｉｔｓ及びＭｉｒｚａｂｅｋｏｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、７１：２７９５（１９９６）］。「ゲルパッド」アプローチを用いたハイブリダイゼーションは、単位面積あたりのプローブ濃度がより高く、プローブ接近可能性が向上しているため、より感度が高いことがわかっている［Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら、Ｇｅｎｅ、１８８：４５（１９９７）］。ミスマッチの識別性の向上は、ゲルパッドアプローチのための液相ハイブリダイゼーション条件の近似から生ずることが示唆されている［Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら、（１９９７）；Ｌｉｖｓｈｉｔｓ及びＭｉｒｚａｂｅｋｏｖ、（１９９６）］。多孔性基板への固定も用いられている［Ｃｈｅｅｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３：５７７７（２００１）］。ポリアクリルアミドと活性化ＯＤＮプローブとの共重合に関する方法が開発されているが、ゲルパッドアレイの調製は面倒で技術的手腕の問われるものである。ポリアクリルアミドの間隙率の低さはハイブリダイゼーション動態に影響し、標的とする核酸配列の長さに制約を与える［Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９：３４（１９９８）］。

ポリマープローブ
ポリマーは、モノマーと呼ばれる、より小さな分子の複数コピーで構成される分子である。モノマーは共有結合してポリマーを形成する。本願では：
・モノマーは、少なくとも８塩基の特定の核酸配列である；
・ポリマーは、１つのモノマー配列の複数コピーから成るホモポリマーでも、異なる配列を有する２以上のモノマーの複数コピーから成るコポリマーでもよい；
・異なるモノマーのコポリマー中での順序は変更することができる；
・モノマーは直接終端間結合することができ、又は分子リンカーを用いてモノマーを結合させることもできる；
・分子リンカーはポリマー中で同一であることができ、又は組成及びサイズを変更することもできる。

ポリマープローブを構築する方法−連結法
ポリマープローブを形成する１つの方法は、ＤＮＡリガーゼを用いてモノマー単位を連結することである。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡの損傷した鎖を修復する酵素である。多数のリガーゼ及び連結技術が存在する。多くのＤＮＡリガーゼは、２本鎖ＤＮＡの１つの鎖のニックを修復する；こうしたリガーゼは、典型的には、ニックの５’端がリン酸化され、ニックの他の側で隣接３’端は利用できるヒドロキシル基を有することを必要とする。研究者らは、この方法を用いて野生型配列と相補的な配列を連結させ、次にゲル電気泳導を用いて得られる鎖の長さを決定することによって突然変異を探索している。突然変異は、配列の１つをあまり有効に結合させず、連結産物の画分を試験した完全長よりも短くするであろう［Ｙａｇｅｒら、米国特許第６，０２５，１３９号］。他の密接に関連した方法には、合成遺伝子を形成するための再帰的指向性連結が含まれる［Ｍｅｙｅｒ及びＣｈｉｌｋｏｔｉ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３（２）：３５７（２００２）］。この技術では、２本鎖ＤＮＡの配列を反復して連結させてタンパク質ベースのポリマーを調製している。これらの技術を改変して、本願のポリマープローブを調製することができるであろう。しかしながら、ポリマープローブをハイブリダイゼーション技術に用いる前に、相補配列を除去する必要があるであろう。

ポリマープローブを構築する方法−環状鋳型を用いた鎖置換増幅
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は核酸の定温増幅技術である。ＲＣＡは、環状ＤＮＡ鋳型と、鋳型周辺を移動して環の配列相補体の縦列反復である長い１本鎖ＤＮＡ産物を産生するためにプライマー及び伸長産物を移動させる特化したポリメラーゼとを用いる。この方法は、標的に選択的に結合する「特異的結合分子」を有するレポーター分子の増幅を目的として特許されている（Ｌｉｚａｒｄ，Ｐ．Ｍ．、米国特許第５，８５４，０３３号；第６，２１０，８８４号）。この方法の「特異的結合分子」を排除することによって、この技術はポリマープローブを形成するための代替法となるであろう。

発明の概要
本発明は、核酸プローブ配列の複数のコピーでできているポリマー核酸のハイブリダイゼーションプローブであり、これは標的核酸中の目的配列に相補的である。ポリマー中のモノマー単位は、プローブ配列の一端又は両端に付着した１以上のリンカー成分を含むことができる。モノマー単位の複数のコピーは、直接又はポリマー内で変更することができる追加のリンカー成分を介して一緒に結合している。これは、ハイブリダイゼーションアレイ表面への固定に末端修飾を必要としないような長いＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの多くの利便性と、１塩基ミスマッチを識別する能力のような短いＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの多くの属性とを有する長鎖ポリマープローブを形成する。

発明の詳細な説明
本発明は、リンクした核酸モノマーを利用して、ポリマーハイブリダイゼーションプローブを形成する。モノマーは、標的核酸に存在するかもしれない目的配列に相補的であるようにデザインされている、少なくとも１つの核酸プローブ配列でできている。モノマーは、一端又は両端にリンカーを有することもでき、各リンカーは、核酸配列又は他の分子成分又は両者の組み合わせを含む。ポリマープローブは、ハイブリダイゼーション表面に、長いＤＮＡプローブと同様の様式で付着することができ、ポリマー鎖に沿っていくつかの位置で結合する。これらの結合位置間で、モノマー単位は標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションに利用可能であろう。表面の一部へ結合させるためにブロッキング分子を用いることができ、これにより、それらの部位でポリマープローブが付着するのを妨げ、ハイブリダイゼーションに利用可能なポリマープローブ中のモノマー単位の画分を増加させる。ポリマープローブの長さは、多くのモノマー単位を表面から十分離して位置させ、液相ハイブリダイゼーションに類似した条件を提供するであろう。この３次元効果は、より高密度の単位表面積あたりのモノマー単位も可能にし、各々の付着部位でプローブにハイブリダイズし得る標的数を増加させるであろう。

１つの態様では、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び相補的カプラーＤＮＡ配列を用いて、プローブモノマーをポリマープローブに組み立てる。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは（他の多くのリガーゼと同様）、２本鎖ＤＮＡ断片の平滑末端又は適合する突出末端で５’−リン酸化ＤＮＡ末端を３’−ヒドロキシル化ＤＮＡ末端へ共有結合的に結合させる。１本鎖ＤＮＡの連結には、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが機能するように相補的カプラーを加える必要がある。端にリンカー配列を用いてモノマーを合成する場合、万能カプラーを用いることができる。

この態様では、カプラー配列は、連結反応後に容易に除去し得るように、長さが限定され、低（Ｇ＋Ｃ）含量である必要がある。この態様における連結反応の１つの工程を、特定のプローブ配列及び特定のリンカー配列について図１に示す。この場合、例示プローブ配列はＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧである。初期合成では、Ｔ_６６ｍｅｒリンカーをプローブ配列の３’末端に付着させ、ＣＡＣＡＣＡ６ｍｅｒリンカーをプローブ配列の５’末端に付着させ、モノマー単位として用いられる４０ｍｅｒを形成する。したがって、ＴＧＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡカプラーは、２つのモノマーの反対端にハイブリダイズすることができ、２つの端を接続させ、２つのリンカー間にギャップ（「ニック」という）を有する２本鎖セクションを形成する。標準的リガーゼを用いて、このニックを横断してリンカーを共有結合させることができる。

標準的合成では、オリゴヌクレオチドは典型的には３’端のヒドロキシル基で終結させられているが、５’端は通常リン酸化されていない。したがって、リガーゼが有効であり得る前にリン酸化が必要である。これは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ又は当該分野に熟練した者に公知の多くの手段のいずれかを用いて達成することができる。しかしながら、図２ａ〜２ｄに示すように、５’端の完全なリン酸化は望ましくない。これらの図は、リン酸化及び非リン酸化ＯＤＮモノマーの混合物を用いたいくつかの可能な連結の結果を示している。当該分野に熟練した者は、これらの図に示したモノマーは、以前に連結していたポリマーをも意味することを認識するであろう。図２ａ〜２ｄでは、モノマーの部分を太さの異なる線で示している；プローブ配列は太線で示し、５’リンカーは中太線で示し、３’リンカーは細線で示している。５’リンカーの端のＰという文字は５’端のリン酸化を示す。反応及び解離は、Ａ、Ｂ、及びＣという文字で標識した矢印で示す。反応ＡはＯＤＮの両端におけるカプラーのリンカーへのハイブイリダイゼーションであり、反応Ｂは連結反応であり、Ｃは、２重鎖を解離してカプラーを除去するための上昇した温度でのインキュベーションである。図２ａ及び２ｂに示すように、非常に短いモノマーの場合を除き、単一モノマーの両端を同一カプラー分子にハイブリダイズさせることも可能である。図２ａは、非リン酸化モノマー１に関してこの反応を示す。カップリング反応により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結できない環状分子２を生ずる。したがって、反応Ｃでカプラーを除去すると、初期モノマーは元の線状状態に戻り、更なる反応を受けることができる。しかしながら、リン酸化モノマー３が同一のカップリング反応を受けると（図２ｂ）、４を生じ、反応ＢでＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結されることができ、カプラーが依然として付着している連続した環状ＯＤＮ５を形成する。反応Ｃでカプラーを除去した後の結果は環状の１本鎖ＯＤＮ６である。環状分子６は、更なる反応に参加して所望の長いポリマープローブを形成することができない；しかしながら、分子６は表面に付着し、表面位置数をポリマープローブが結合できる数に制限するために、長いポリマープローブの表面への固定を必要とする応用において有用な目的を果たす。これは、標的へのハイブリダイゼーションに利用可能なポリマープローブ中のモノマー単位数を増加させる。これらの自己連結反応と２つの異なる分子の連結とのあいだの相対的収率は、モノマーＯＤＮの濃度を増加させることによって調製することができる。環状分子６は、出発分子６が標的ＤＮＡに相補的である代わりに標的ＤＮＡと同一配列を有するという条件のみにおいて、非常に長いポリマープローブのローリングサークル合成に鋳型として用いることができることが注目される。

図２ｃは、２つの非リン酸化モノマー１のあいだで可能な反応を示す。カップリング反応Ａは、完全に環化した分子７、又は線状分子８を産生することができる。７も８もリン酸基がないために反応Ｂでは連結できず、いずれの場合も反応Ｃでは元の線状モノマーに戻す。

図２ｄは、１つの非リン酸化モノマー１と１つのリン酸化モノマー３とのあいだで可能な反応を示す。カップリング反応は、リン酸化５’末端を有する線状分子９、非リン酸化５’末端を有する線状分子１０、又は環状ＯＤＮ１３を産生することができる。分子９は反応Ｂで連結することができず、したがって反応Ｃでは２つの開始モノマーに戻す。分子１０は連結して線状分子１１を形成することができる。Ｃにおいてカプラーを除去した後の結果は、２つのモノマー（Ｎ＝２）でできている線状の１本鎖ポリマープローブ１２である。カプラー反応Ａが完全に環化した分子１３を形成する場合、唯一のカップリングセクションはリン酸を有し、連結反応はそのリン酸化セクションのみを結合させ、環状分子１４を形成する。反応Ｃはカプラーを除去し、先の例と同一の線状ポリマープローブ１２を生ずる。分子１２は更なる反応を受けてより長いポリマープローブを作製することができる。したがって、１つのリン酸化ＯＤＮと１つの非リン酸化ＯＤＮとの反応を伴う場合は全て、結果は、更なる反応を受けることができる出発物質又はポリマープローブである。

図２ｅは、２つのリン酸化モノマー３のあいだで可能な反応を示す。カプラー反応Ａは、２つの可能な産物、完全に環化した分子１５と線状分子１８を生ずる。全ての５’端はリン酸化されているため、連結反応Ｂは、それぞれ環状ＯＤＮ１６及び線状ＯＤＮ１９をもたらす。Ｃでカプラーを除去した後の産物は、それぞれ１本鎖環化ＯＤＮ１７、及び１本鎖線状ＯＤＮ２０である。分子１７は、更なる反応に利用できない点で分子６と同様だが、ポリマープローブから部位をブロックする上で有用であり得る。分子２０はリン酸化５’端を有し、他の反応でリン酸化モノマー又はポリマーと組み合わせると、最終環化産物を生ずるであろう。しかしながら、分子２０を非リン酸化モノマー又はポリマーと組み合わせると、環化しない、より長いポリマーを形成する。

反応ＡとＢは同一温度で同時に行うことができる。デカップリング反応Ｃはより高温を要する。したがって、好ましい態様に熱サイクル法を用いて反応を反復し、ポリマープローブの長さを増加させることができる。プローブ分子とともに形成されるハイブリッドがＴ４ＤＮＡリガーゼの変性温度以下で解離するように、カプラー分子の長さ及びＧ−Ｃ含量をデザインすることができる。

環化によって負荷される制限があるとしても、ポリマープローブは標準的モノマープローブよりも顕著によく機能する。実験は、ポリマープローブをモノマープローブと比較して用いたとき、固定された相補的プローブに５０℃でハイブリダイズした、１ｆモルの色素で標識したＥ．Ｃｏｌｉ標識ＤＮＡからのハイブリダイゼーションシグナルは、少なくとも３つの因子によって向上したことを示した。試験した３つの濃度のポリマープローブ（１２．５、６．２５、及び３．１２５μモル）全てに関し、これは正しかった；モノマープローブは最適濃度（５０μモル）であった。ポリマープローブ濃度は、１２．５μモルのポリマープローブが、等量の５０μモルのモノマープローブよりもモノマーが４倍少ないように、モノマー単位に換算して示していることに注意されたい。

他の連結反応−第２の態様では、リガーゼを変性させることなく、より高い温度を工程Ｃに用いることができるように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの代わりにＡｍｐｌｉｇａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏｐｈａｇｅ（商標）１本鎖ＤＮＡリガーゼ、又はＴｆｉリガーゼのような熱安定性ＤＮＡリガーゼが用いられる。第３の態様では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いてモノマープローブ単位の直接連結を達成することができる［Ｔｅｓｓｉｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５８：１７１（１９８６）］。この反応は、カプラーを使用せずにＯＤＮプローブを直接リンクさせる。たとえＴ４ＤＮＡリガーゼの場合のようにプローブ配列の両端でリンカーを必要としなくとも、少なくとも一端のリンカーがポリマープローブ中のプローブ配列の分離を果たし、隣接モノマー部位で形成されるハイブリッドによって起こるハイブリダイゼーションに対する立体障害を減少させる。更に他の態様では、非酵素学的（化学的）方法［Ｘｕ及びＫｏｏｌ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２７：８７５（１９９９）；Ｌｉｕ及びＴａｙｌｏｒ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２６：３３００（１９９８）］を用いてモノマープローブを連結させる。この場合も、プローブ配列の少なくとも一端のリンカーを用いて、ハイブリダイゼーション反応に対する立体障害を減少させることができるであろう。

配列の異なるモノマー−他の態様では、ポリマープローブが複数の配列を導入したコポリマーとなるように配列の異なるモノマーを連結させることができるであろう。これは、使用者が、いくつかの可能なＳＮＰが標的ＤＮＡに存在するかどうか知ることを望む場合に有用であろう。

カプラー配列を連結から防ぐ−他の態様では、配列の３’末端に最後の塩基を付加するためのジデオキシヌクレオシド三リン酸を用いて、カプラー配列の３’端を保護することができる。これは、当該分野に熟練した者に公知の多くのヌクレオチド伸長反応によって達成することができる。カプラー配列の５’端はリン酸化されていないため、すでに他の核酸への連結から保護されている。

環化−他の態様では、所望の長さのポリマープローブが達成された後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてポリマープローブの５’端をリン酸化することができる。これには、カプラーハイブリダイゼーションとリガーゼを伴い、多量のポリマープローブを環化させるであろう。初期熱サイクルでは、ポリマープローブの長さが更に増加するのを妨げるため、環化（同一ポリマープローブ分子の反対端間の連結）を避ける必要があるが、ポリマープローブが許容できる長さに到達した後は望ましいかもしれない。

ローリングサークル増幅−他の態様では、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いて非常に長いポリマープローブを作製することができるが、唯一の制限は分子全体がＤＮＡである必要があるということである。ＲＣＡは、φ２９ポリメラーゼのような鎖置換ポリメラーゼを、環化したオリゴヌクレオチド鋳型とともに用いる。産物は、環の相補体の複数の縦列反復で構成された、非常に高分子量の１本鎖オリゴヌクレオチドである。ＲＣＡ反応のための環化した鋳型は、ＲＣＡ産物の各モノマー成分が標的配列に相補的であるように、初期モノマー配列が標的ＤＮＡ配列と同一であることを除いて、上記と同様の連結反応で作製される。環化した鋳型は、さまざまなモノマー単位数の環から成ることができるが、全ては同一分子をプライマーとすることができ、そして全ては同一産物を生ずる。ＲＣＡ反応後、産物は所望のサイズに剪断されることができる。

例示的態様
連結反応によるポリマープローブの合成−Ｔ４ＤＮＡリガーゼを、配列（ＴＧ）_６を有するカプラー分子とともに用いて、５’及び３’末端の側面に（ＣＡ）_３が位置するＥ．ｃｏｌｉモノマープローブ配列を、１６時間の室温での連結反応で連結させた。同様の末端付加を有するβ−プロテオバクテリアのコンセンサス配列も同様に連結させた。バイオラッドのＰｒｏｔｅａｎ（商標）ＩＩｘｉ電気泳導セルを用いて、６％変性ポリアクリルアミドゲルで、２５０Ｖ×２時間、産物を電気泳導した。いずれの場合も、ポリマープローブについて得られた電気泳導プロファイルは、各増分（Ｎ＝２〜Ｎ＝１０）で起こる２本のバンドパターンを示し、他者によって得られた線状及び環化ＤＮＡのバンドと一致した（例えばＰｒｏｋａｒｉａのウェブサイト、ｐｒｏｋａｒｉａ．ｃｏｍ）。

連結したポリマープローブのハイブリダイゼーションの結果−連結したポリマープローブを段階希釈し、Ｓｕｐｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ（商標）スライドにプリントした。５’Ｃ_６−アルキルアミンで修飾したコンセンサス配列モノマーと、同様に修飾したＥ．ｃｏｌｉ配列モノマーとを、以前に沈着させたモノマーについて最適な結果を提供することがわかっている、ＭｉｃｒｏＳｐｏｔｔｉｎｇＰｌｕｓ溶液（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）中の５０μＭプローブ濃度でプリントした。３つの異なる濃度の未修飾ポリマープローブ（１２．５μＭ、６．２５μＭ、及び３．１３μＭ）を、ｓｐｏｔｔｉｎｇ溶液［３×ＳＳＣ、１．５Ｍベタイン］に沈着させた。ポリプローブ濃度をモノマー単位に換算して示していることに注意することが重要である；したがって、等量の等濃度モノマープローブとポリプローブは、同数のモノマー単位を有する。ポリマープローブの最適な固定条件は、ポリプローブの長さにしたがい、必要に応じて変化させることができる。プリントしたモノマープローブとポリプローブを、表面と一晩反応させる。１００ｍＭリン酸ナトリウム、１×デンハルト試薬、０．３％ＳＤＳ、並びに１ｐモルのＣｙ５−標識Ｅ．ｃｏｌｉプローブ相補体、及び１ｐモルのＣｙ３−標識コンセンサスプローブ相補体を用いて、４５℃で１２時間のハイブリダイゼーションを行った。これらのハイブリダイゼーション条件は、モノマーとして沈着させたプローブに関し、最適な選択性とシグナル強度のために選択された。ハイブリダイゼーション後、スライドを室温で洗浄し、パーキンエルマーのＳｃａｎＡｒｒａｙｉｍａｇｅｒで蛍光画像を得た。これらの結果は、ポリマープローブが、たとえポリマープローブ中のモノマー濃度が、Ｃ_６−アルキルアミンで修飾したモノマープローブよりも顕著に低くても、これらの条件で、少なくともＣ_６−アルキルアミンで修飾したモノマープローブと同様に機能したことを示した。高ストリンジェンシー（標的１ｆモル、ハイブリダイゼーション温度５０℃）を用いる以外は先の段落に記載したハイブリダイゼーション反応を反復した場合、ポリマープローブの平均蛍光強度は、Ｅ．ｃｏｌｉ配列のモノマーよりも顕著に強かった。

鎖置換増幅によるポリマープローブの合成−連結させたポリマープローブを鋳型として用いて、鎖置換増幅により長いポリプローブを合成した。反応には、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）、鋳型として先に記載したものと同一の反応に由来する短い連結したポリマープローブ、及びプライマーとして（ＴＧ）_６カプラー分子を用いた。反応条件は、［Ｄｅａｎら、多重鎖増幅を用いた広範なヒトゲノム増幅。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：５２６１−５２６６（２００２）］に記載のものと同様である。鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応は、長い１本鎖ポリマープローブを産生した。これを示すために、剪断したＳＤＡ反応産物のゲル電気泳導プロファイルを他のＤＮＡと比較した。非剪断産物は非常に大きくゲルに入らないため、剪断を要した。剪断ＳＤＡ反応産物の電気泳導プロファイルは、剪断１本鎖ＤＮＡのものに匹敵したが、剪断２本鎖ＤＮＡのものには匹敵しなかった（全て、Ｍｉｓｏｎｉｘ（商標）ＣｅｌｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒを用いて、電力レベル２で６０秒間超音波処理をした）。

わずか５秒間の剪断ＳＤＡ反応産物は、約５００ｂｐ〜８Ｋｂｐのサイズ分布を生じ、これは約Ｎ＝２０〜２７０に相当した。剪断産物をマイクロアレイに固定し、Ｅ．ｃｏｌｉ及びコンセンサス配列で標識した標的についてハイブリダイゼーション反応を実施した。蛍光画像は適切な位置にシグナルを生じ、ＳＤＡ産物はポリマープローブの正確な配列を有することを規定した。

この図は、本発明の１つの態様における２つの同一ＯＤＮモノマーの連結の一例を示す。モノマーは、縦棒で隔てられた上段ラインに示されている。モノマーは、それぞれの端を６ｍｅｒリンカーで取り囲まれた、下線で示した中央のプローブ配列を有する。これらのリンカーとハイブリダイズするカプラーを２番目のラインに示す。このカプラーは、モノマーへの結合位置を示すために３’端を左に示す。塩基が２つのモノマーの相補体とぴったりと合うように、カプラーのＡ塩基とＧ塩基とのあいだに大きな隔たりが描かれている。この隔たりは、厳密に配列を描写するためであり、これら２つの塩基間の実際の隔たりは、カプラー中の他の隣接塩基間と同じであろう。連結後のこの特定のカプラーの２重鎖の解離温度Ｔｄは、約２９．７℃と計算されており、リガーゼを変性することなく、連結後、カプラーの除去を可能にする。図２ａ〜２ｃ。例示的連結方法。この図では、モノマーの部分を太さの異なる線で示している；プローブ配列は太線で示し、５’リンカーは中太線で示し、３’リンカーは細線で示している。５’リンカーの端のＰという文字は、５’端のリン酸化を示す。連結されたニックは小さな黒丸で示す。反応Ａは、ＯＤＮの両端のリンカーへのカプラーのハイブリダイゼーションであり、反応Ｂは連結反応であり、Ｃは、２重鎖を解離させ、カプラーを除去するための上昇した温度でのインキュベーションである。図２ａは、非リン酸化モノマーとそれ自身との反応を示し、図２ｂは、リン酸化モノマーとそれ自身との反応を示す。図２ｃは、２つの非リン酸化モノマー間で可能な反応を示している。図２ｄ〜図２ｅ。例示的連結方法。この図では、モノマーの部分を太さの異なる線で示している；プローブ配列は太線で示し、５’リンカーは中太線で示し、３’リンカーは細線で示している。５’リンカーの端のＰという文字は、５’端のリン酸化を示す。連結されたニックは小さな黒丸で示す。反応Ａは、ＯＤＮの両端のリンカーへのカプラーのハイブリダイゼーションであり、反応Ｂは連結反応であり、Ｃは、２重鎖を解離させ、カプラーを除去するための上昇した温度でのインキュベーションである。図２ｄ及び２ｅは、それぞれ、１つの非リン酸化モノマーと１つのリン酸化モノマーとのあいだで可能な反応、及び２つのリン酸化モノマー間で可能な反応を示している。

Claims

一緒にされた１以上の配列の１本鎖核酸（モノマー）の複数のコピーを含む１本鎖ポリマープローブであって：
モノマーの長さは少なくとも６ヌクレオチドであり；
モノマーは、直接終端間結合しているか、又は異なる配列を有する他のモノマーを含んでも含んでいなくともよい分子リンカーの反対端に結合しており；
ポリマープローブは少なくとも４コピーのモノマーを含有し；そして、
ポリマープローブは、標的核酸の潜在配列、標的核酸の陽性対照配列、又は標的核酸にない陰性対照配列のいずれかに相補的であることが知られている少なくとも１つのプローブ配列を有する、前記ポリマープローブ。
モノマー核酸が、合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、及びＤＮＡ増幅技術を用いて形成した単離ＤＮＡのセクションから成る群より選択される、請求項１に記載のポリマープローブ。
１本鎖核酸のモノマー配列が、プローブ配列の一端又は両端に核酸の追加配列を含む、請求項１に記載のポリマープローブ。
１本鎖核酸のモノマー配列が、核酸でない分子リンカーによってプローブ配列の一端又は両端にリンクしている、請求項１に記載のポリマープローブ。
ポリマープローブがホモポリマーである、請求項１に記載のポリマープローブ。
ポリマープローブが、モノマー単位に関し、２以上の異なる配列を有するコポリマーである、請求項１に記載のポリマープローブ。
ポリマープローブが直線状である、請求項１に記載のポリマープローブ。
ポリマープローブが環状である、請求項１に記載のポリマープローブ。
モノマー又はポリマーのリン酸化５’末端を、５’端がリン酸化されていないポリマー配列又はモノマー配列の３’端に反復して結合させることを含む、請求項１に記載のプローブを形成する方法。
相補的カプラー核酸を、ギャップ（「ニック」）を有する２本鎖セクションを形成するように、１つのモノマー又はポリマーの３’配列と、他のモノマー又はポリマーの５’端の配列とにハイブイダイズさせ、ギャップを形成する核酸の端を連結させることによって結合が達成される、請求項０に記載の方法。
リガーゼを用いて核酸の端を連結する、請求項１０に記載の方法。
リガーゼが、核酸の５’末端にリン酸を必要とし、３’末端にヒドロキシルを必要とする酵素である、請求項１１に記載の方法。
リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＴｆｉＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、ＴｓｃＤＮＡリガーゼ、又はクロレラウイルスＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼである、請求項１２に記載の方法。
プローブ配列の３’端と５’端を少なくとも長さ４塩基の核酸リンカーで末端処理することによって万能カプラーがさまざまなプローブ配列に用いられ；５’端の核酸リンカーは、３’端の核酸リンカーと、長さ、配列、又は両方が同一又は異なっている、請求項０に記載の方法。
カプラーをハイブリダイズさせる値から、連結させる値、ハイブリダイズしたカプラー分子を連結したポリマーから解離させる値へと循環する反応混合物温度を有する熱サイクルを用いて連結を反復させる、請求項０に記載の方法。
熱サイクルを複数回反復させてポリマーの長さを増加させる、請求項１５に記載の方法。
リガーゼ変性が、少なくとも５０％のリガーゼがインキュベーション３０分後も有効なままである温度で解離するハイブリッドを形成する長さ及びＧ＋Ｃ含量を有するカプラーを用いることによって回避される、請求項１５に記載の方法。
リガーゼ変性が、熱安定性リガーゼを用いることによって回避される、請求項１５に記載の方法。
モノマー及び／又はポリマーが、カプラー分子を必要とすることなく、１本鎖モノマー及びポリマーを直接リンクさせることができるリガーゼを用いて結合される、請求項０に記載の方法。
リガーゼが、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ又はＴｈｅｒｍｏｐｈａｇｅ（商標）１本鎖ＤＮＡリガーゼである、請求項１９に記載の方法。
モノマー及び／又はポリマーが、非リガーゼ酵素法を用いて連結される、請求項９に記載の方法。
請求項１に記載のポリマープローブを、さまざまな別個の位置で固体基板表面上に固定することを含む核酸アレイの作製方法であって、各ポリマー核酸プローブは、１以上のモノマー配列でできている、前記方法。
固体基板が、ガラス、シリコン、ナイロン、ポリアクリルアミドゲル、テフロン（商標）、又は金属である、請求項０に記載の方法。
固体基板表面が、核酸の固定を高めるために成分でコーティングされている、請求項０に記載の方法。
固体基板表面が、エポキシド、アルデヒド、ポリ−Ｌ−リジン、ナイロン、アミノ、カルボキシレート、又は結合化学作用を高める他の成分でコーティングされている、請求項０に記載の方法。
プローブが、紫外線、熱、又は反応性化学作用を用いて固体基板表面に共有結合的に架橋される、請求項０に記載の方法。
固体基板表面のさまざまな別個の位置に固定された請求項１に記載のポリマープローブを含む核酸アレイであって、各ポリマー核酸プローブは、１以上のモノマー配列でできている、前記核酸アレイ。
標的核酸を含有するサンプルを、請求項２７に記載の核酸アレイと接触させ；固定されたポリマープローブを標的核酸とハイブリダイズさせ；そしてポリマープローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することを含む、標的核酸をアッセイする方法。
検出が、放射線標識、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、電気的検出、又は標識若しくは未標識標的核酸の質量分析を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
アッセイで得たハイブイリダイゼーション情報を用いて、特定の核酸配列がサンプル中に存在するかどうか決定する、請求項２８に記載の方法。
アッセイで得たハイブリダイゼーション情報を用いて核酸多型を検出する、請求項２８に記載の方法。
アッセイで得たハイブリダイゼーション情報を用いて、病原体を検出及び／又は同定する、請求項２８に記載の方法。
病原体が、細菌、ウイルス、又は真菌に由来する、請求項３２に記載の方法。
ハイブリダイゼーション情報を用いて疾患を診断する、請求項２８に記載の方法。
ハイブリダイゼーション情報を用いて、疾患治療の有効性をモニターする、請求項２８に記載の方法。
直接オリゴヌクレオチド合成法によってポリマープローブを調製する、請求項１に記載のポリマープローブを作製する方法。
環化した鋳型の鎖置換増幅によってポリマープローブを調製する、請求項１に記載のポリマープローブを作製する方法。
ＤＮＡ増幅技術を用いて形成される単離ＤＮＡのセクションが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて形成される、請求項２に記載のポリマープローブ。