JP6716465B2 - 集積した単一細胞の配列決定 - Google Patents
集積した単一細胞の配列決定 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6716465B2 JP6716465B2 JP2016564984A JP2016564984A JP6716465B2 JP 6716465 B2 JP6716465 B2 JP 6716465B2 JP 2016564984 A JP2016564984 A JP 2016564984A JP 2016564984 A JP2016564984 A JP 2016564984A JP 6716465 B2 JP6716465 B2 JP 6716465B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cdna
- acid sequence
- rna
- immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title description 111
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 196
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 166
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 165
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 140
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 140
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 140
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 117
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 107
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 106
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 100
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 62
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 54
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 52
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 52
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 39
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 186
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 185
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 44
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 35
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1H-pyrimidin-4-one Chemical group N1CNC=C(C1=O)C KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 101100041125 Arabidopsis thaliana RST1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001353 Chip-sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101710112477 Phycobiliprotein ApcE Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101100443250 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DIG1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108091012456 T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- 238000012172 direct RNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- -1 flow cell surfaces Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本出願は、2014年5月8日出願の米国仮特許出願第61/990,598号および2014年11月13日出願の同第62/079,495号の優先権を主張する。前記2つの優先権出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
一態様において、本発明は、標的RNAの固定化、該標的RNAの少なくとも一部分に対し相補的なcDNA配列の生成、該cDNA配列を切断することによる新しい自由末端の生成、および、アダプター配列を該新しい自由末端にライゲーションすることによるcDNAのタグ付けに関する。
1.1.cDNAの生成
第1アプローチは図1に概要を示し、図2〜6Bに図示する。図1〜6は、例示的実施形態であり、発明はこれに限定されることはなく、様々な変形が本明細書の下記で論じられるか、または、読者にとって明らかであろうことが理解されよう。図示する実施形態では、RNA200、典型的にはmRNAを表面100に固定化(または「捕捉」)する(図2を参照)。一部の実施形態において、表面100はビーズである。他の実施形態では、表面は実質的に平面とすることができる。図示するように、RNAは、表面に固定したアンカーポリヌクレオチド50にアニールすることにより捕捉することができる。一アプローチでは、mRNAのポリAテール55を、アンカーポリヌクレオチドのオリゴd(T)部分51にアニールする。オリゴd(T)部分51は、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)反応などを準備するのに適切であり、自由5'末端を含む(図2)。一部の実施形態では、RNAを、オリゴd(T)以外のアンカーポリヌクレオチドの配列、例えば、転写産物特異的配列にアニールする。一部の実施形態では、RNAはポリ(A)テールを含まない。簡単にするため、RNAはmRNAと呼び、RNAをアニールする捕捉配列は、オリゴd(T)捕捉配列と呼ぶこととする。
RNA:cDNAハイブリッドを、制限エンドヌクレアーゼ(RE)を用いて切断して、自由RNA5'末端および自由DNA3'末端を生成する(図4)。REは、cDNA:RNAハイブリッドの制限部位(RST1:RST1’)で切断する。一実施形態では、切断により生じた末端を互い違いにし、粘着末端を生成する(図4)。一実施形態では、REは平滑末端を生成する。REの特徴を以下で述べる。切断ステップ後、REは不活性化(例えば、加熱不活性化)してよい。
アダプターオリゴヌクレオチド310を、例えばDNAリガーゼを用いて、切断済みcDNA分子の自由3'末端にライゲーションする。任意の適切なライゲーション方法を用いることができる。図5に示すように、アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅プライマー配列(AP1’)53の第2コピーを含む。
RNAをRNA:cDNAハイブリッドから取り除く。RNAは、酵素的、化学的、または熱的に取り除くことができる。一部の実施形態では、RNAを分解する。結果は、アダプターをタグ付けされた固定化結合一本鎖cDNA(図7)、つまり、タグ付き核酸分子である。一実施形態では、RNAを、RNアーゼHなどのリボヌクレアーゼを用いてハイブリッドから取り除く。
しばしば、図面に示すように、単一アダプターオリゴヌクレオチド310を用いる。しかしながら、一部の実施形態では、2つ以上の異なるアダプターオリゴヌクレオチドを用いる。一アプローチでは、異なるアダプターオリゴヌクレオチドは、異なるRE部位に適合し、RNAを異なるRE部位と共に同一反応で処理することを可能にする。
固定化タグ付き核酸分子は、典型的には、以下で記載するように、表面でのクローン増幅および配列決定といった追加の処理ステップにかける。
第2タグ付けアプローチを図8および9に示す。図8および9はある実施形態を示すが発明はこれに限定されることはなく、様々な変形が本明細書の下記で論じられるか、または、読者にとって明らかであろうことが理解されよう。
この実施形態では、ポリAテールを固定化オリゴd(T)含有アンカーポリヌクレオチドにアニールすることにより、mRNA60を、上記セクション1.1にも記載するように表面(例えばビーズ)61に固定する。固定化mRNAを上記セクション1.1に記載するように逆転写して、第1鎖cDNA63が表面に固定されているRNA:cDNAハイブリッド62を生成する。
RNAを、例えば、RNアーゼHなどのリボヌクレアーゼで処置するといった、化学的、熱的、または酵素的な方法を用いてハイブリッドから取り除き、一本鎖固定化cDNAを残す。
固定化cDNAを、次に、認識オリゴヌクレオチド64にハイブリダイズする。該認識オリゴヌクレオチド64はcDNAの一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、cDNAの一部を二本鎖にし、制限酵素で消化しやすくする。cDNAと認識オチゴヌクレオチドとの間の相補度は、二本鎖領域(例えば、cDNA:オリゴハイブリッド)をもたらすのに十分な程度であり、該二本鎖領域は、オリゴヌクレオチド:cDNAハイブリッドを認識しcDNAを切断する、特異的制限エンドヌクレアーゼにより認識することが可能である。認識オリゴヌクレオチドの長さは典型的には、少なくとも12塩基、通常は少なくとも15塩基、時には少なくとも25塩基であろう。
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むオリゴヌクレオチド:cDNAハイブリッドを、固定化cDNAを切断する特異的な制限エンドヌクレアーゼにより認識する。REの作用により自由3'cDNA末端を生成する。認識オリゴヌクレオチドおよび制限エンドヌクレアーゼの選択に応じて、固定化切断生成物は平滑末端または粘着末端は有することが可能である。粘着末端は、RNA:cDNAハイブリッドについての上記セクション1.3で述べたcDNA:RNA切断生成物に似て、cDNAまたは認識オリゴヌクレオチドによりもたらされる一本鎖オーバーハングを含むことが可能である。
アダプターオリゴヌクレオチドは、RNA:cDNAハイブリッドについての上記セクション1.3の記載に類似して、切断済みcDNA分子の自由3'末端にライゲーションすることができ、これは、タグ付きcDNA、または、より一般的には、不均一なタグ付き固定化cDNA集団を含む一つもしくは複数の表面をもたらす。
典型的には、固定化タグ付き核酸分子は、以下で記載するように、表面でのクローン増幅および配列決定といった追加の処理ステップにかける。
3.1.一般的な特性
上記のように、アダプターオリゴヌクレオチドの添加の前に、cDNA:RNAハイブリッドまたはcDNA:認識オリゴヌクレオチドハイブリッドを、制限エンドヌクレアーゼで切断する。本明細書で用いる場合、制限エンドヌクレアーゼは、特異的認識ヌクレオチド配列(制限部位)において、またはその近くで、DNAを切断する酵素である。例えば、Roberts et al., 2007 “REBASE-enzymes and genes for DNA restriction and modification,” Nucleic Acids Res35 (Database issue): D269-70;http site rebase.neb.comを参照のこと。限定ではなく例示として、本発明で用いる制限酵素には、タイプI酵素(EC 3.1.21.3)、タイプIIおよびタイプIIPなどのタイプII酵素(EC 3.1.21.4)、ならびに、タイプIII酵素(EC 3.1.21.5)が含まれる。制限酵素は天然で発生し、組み換え生成することができ、そして、(多数の異なるタンパク質に由来する配列を含むような)人工的とすることができる。
(i)cDNA:RNAハイブリッドを切断する第1アプローチでは、酵素はそのようなハイブリッドを切断可能であるべきである。
(ii)部位は、多数の異なるRNA種に存在し、その結果、十分な数のcDNAがタグ付けされるべきである。「十分な数」とは、大部分、ほぼ全て、大多数、または、大多数より少ないサブセットとすることができる。
(iii)固定化切断済みcDNAの長さは、配列決定目標に十分であり(通常、少なくとも15〜20塩基)、配列決定反応を起こすためにそれを固定する基質から十分に離れているべきである。以下で論じるように、多くのRNAまたはゲノムDNAの配列を特定するのに必要なのは、cDNAまたはゲノム配列の一部のみである(例えば、既知の配列データベースを参照することにより特異的RNAを特定するには、部分配列で十分である)。
(iv)固定化切断済みcDNAの長さは、使用する増幅方法と適合すべきである。
cDNA:RNAハイブリッドを切断する方法では、適切な酵素がそのようなハイブリッドを認識しよう。例えば、適切な酵素には、AvaII、AvrII、BanI、HaeIII、HinfI、およびTaqIが含まれる(Murray et al., 2010, Sequence-specific cleavage of RNA by Type II restriction enzymes” Nucleic Acids Res. 38:8257-68を参照)が、これらに限定されない。
一アプローチでは、制限酵素部位は、平均長さが約250塩基対、例えば、50〜500塩基対、または、150〜350塩基対の標的ポリヌクレオチドの形成を可能にする頻度で、ソースである生物のRNA(cDNA)に発生する。好適には、固定化cDNAのほとんど(例えば、50%超、75%超、80%超、90%超、または95%超)が切断およびタグ付けされ、ほとんど(例えば、50%超、75%超、80%超、90%超、または95%超)の固定化タグ付きcDNAの長さが、少なくとも25塩基、または少なくとも40塩基、または少なくとも50塩基、または少なくとも75塩基、または少なくとも100塩基、または少なくとも150塩基である。
M=AまたはC;N=AまたはCまたはGまたはT;R=AまたはG;S=CまたはG;V=AまたはCまたはG;W=AまたはT;Y=CまたはT。
本明細書で提供する方法では、認識オリゴヌクレオチドを固定化標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。ハイブリッドの形成は、制限酵素による切断と、それに続く、二本鎖「アダプター」構成をライゲーションする自由DNA末端の形成を可能にする。
認識オリゴヌクレオチドは、上記セクション3(a)(i)〜(iv)の考察を考慮して設計すべきであることが理解されよう。これは、認識オリゴヌクレオチドおよびREは組み合わさって、cDNAのうちどの位置を切断するかを決定するためである。
一部の実施形態では、認識オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドのライブラリまたは集団であり、ここでは、ある部分が完全に縮重する(つまり、A、T、G、およびCを有するオリゴヌクレオチドが示される)、部分的に縮重する(つまり、塩基A、T、G、およびCのうち2つか3つを有するオリゴヌクレオチドが示される)、および/または、デオキシイノシンなどの「ユニバーサル」塩基により示される。
一部の実施形態において、ライブラリは、2つ、3つ、または4つの異なる配列といった2つ以上の切断剤認識配列を含む。実施形態において、異なる切断剤認識配列は、異なる切断剤により認識される。
一部の実施形態では、1つまたは複数の特異的な配列サブセットのみに結合するように認識オリゴヌクレオチドを選択する。例えば、アクチンをコードするcDNAのみをタグ付けするように認識オリゴヌクレオチドを選択することが可能である。
本明細書において、RNAの特徴を描写する文脈で記載する方法、系、および装置は、本明細書に誘導された当業者には明確であろう修正(例えば、ゲノムDNAを断片化し、個々の断片を配列決定する、一本鎖DNAをDNA依存DNAポリメラーゼを用いて二本鎖にする)をもって、DNA配列決定に用いることが可能であることが理解されよう。
下記に示す追加の処理ステップを用いて、タグ付き分子を配列決定することができる。
ある実施形態では、タグ付きcDNAテンプレートを配列決定の前に増幅し、表面(例えば、個々のビーズ上、表面の特定位置など)にテンプレート分子のクローン(二クローン性またはオリゴクローン性の)集団を生成する。クローン増幅法の例には、ブリッジ増幅およびwildfire増幅が含まれる。しかしながら、本発明は、任意の特定の増幅法に限定されることはない。さらに、増幅は必要ではない。例えば、単一のポリヌクレオチドを特徴付けることができる。
図10は、cDNA第2鎖の合成を示す。第2鎖を合成するためのプライマーとして作用する相補的な配列(AP1)を含む固定化オリゴヌクレオチドに、第1鎖のAP1’タグ配列をハイブリダイズする。ブリッジ増幅の周知のプロセスが、図11〜13に示すように続く。図12は増幅後の表面を示し、これは配列決定用クローンテンプレートをもたらす。図13は、AP1’に対し相補的なプライマーを用いたsequencing by synthesis法を示す。図14は、鎖(つまり、フォワード鎖の集団またはリバース鎖の集団)のうち一つを配列決定前に取り除き、配列決定できる一本鎖のローンをもたらすことができることを示す。
「Wildfire」増幅(Ma et al., 2013, Isothermal amplification method for next-generation sequencing” Proc Nat Acad Sci 10:14320-23)は、固相クローン増幅に用いることが可能である。米国特許出願公開第2012/0156728号明細書(Wildfire amplification)および同第2013/0203607号明細書(WildFirePaired-End sequencing)を参照のこと。このアプローチの修正版では、図15および16に示すように、ポリアデニル化mRNAを固定化ポリ(T)配列にハイブリダイズし、第1鎖cDNA合成を実行し、そして、RNAテンプレートを取り除いて固定化第1鎖cDNAを残す。cDNAは上記のようにタグ付し、その後Wildfire法を用いて増幅する。
個々の分子の配列決定(単一分子配列決定)またはクローン集団の配列決定は、Solexa(Illumina)シーケンス法、パイロシーケンス(pyrosequencing)(454)法、SOLiDシーケンス法、およびPolonatorシーケンス法などの既知の方法を用いて実行することが可能である。例えば、Shendure and Ji, 2008, “Next-generation DNA sequencing” Nature Biotechnology 26:1135-45、特に、図3およびその中で言及された参考文献を参照のこと。Shendureおよび前記参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。一部の実施形態では、sequencing-by-synthesis法を用いる。一部の実施形態において、配列決定方法はsequencing-by-synthesis法である。一部の実施形態では、可逆的ターミネーター法を用いる。
一部の実施形態では、mRNAを直接的に配列決定するか、または、クローン増幅のないcDNA合成の後もしくはそれと同時に配列決定する。例えば、Causey et al., 米国特許出願公開第20110129827号明細書“Methods For Transcript Analysis”;Ozsolak et al., 2010 “Amplification-free digital gene expression profiling from minute cell quantities Nature Methods 7:619-21;Ozsolak et al., 2011 “Single-molecule direct RNA sequencing without cDNA synthesis” Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011 Jul-Aug; 2(4): 565-570; Hebenstreit, 2012, “Methods, Challenges and Potentials of Single Cell RNA-seq” Biology (Basel). 1(3):658-667;Saliba et al., 2014, “Single-cell RNA-seq: advances and future challenges,” Nucleic Acids Res. 42:8845-60を参照のこと。
6.配列決定
ハイスループット配列決定法が既知であり、ここでは、配列決定する核酸テンプレートをビーズ、フローセル表面、または半導体などの固体支持体に固定または位置付けする。さまざまな異なる配列決定アプローチを用いることができる。蛍光または他の光を検出する配列決定法では、異なるテンプレート分子またはクローン集団(例えば、増幅クラスタ)を物理的に分離して配置し、その結果、異なるテンプレートに対応するシグナルを光学的に識別可能であるようにすることが望ましい。本発明のタグ付き核酸分子の配列は、このような方法を用いて決定することができる。配列決定についての例示的アプローチには、ビーズ上での配列決定および平面基質上での配列決定が含まれる。
一部のアプローチでは、Part1に記載の、調製したクローン集団を備えるビーズを含め、ビーズ上のテンプレートを配列決定する。
図17に示すアプローチでは、配列決定ビーズを第1チャンバから第2チャンバに移す際、それを「フィラービーズ」の導入により「希釈」する。テンプレート核酸がフィラービーズに固定されず、配列決定プロセス中に検出可能なシグナルを生成しないという意味で、フィラービーズは「不活性」である。フィラービーズの添加の効果は、配列決定ビーズを互いに空間的に分離し、その結果、個々の配列決定ビーズからのシグナルを光学的に識別可能にすることである。
一部の実施形態では、配列決定ビーズおよびフィラービーズを、第2チャンバに密に充填し、配列決定反応中(例えば、配列決定サイクル間の洗浄ステップ中)の移動を最小化する。ビーズの移動は、シグナルの解釈をより計算的に困難にする。
上記のように、あるビーズベース法では、配列決定チャンバは単一ビーズ層のみを収容する。これはチャンバの深さが理由である。他のビーズベースアプローチでは、(i)ビーズは、チャンバの底にある間隔の空いたコンパートメントまたはパッドに固定することができ;(ii)リガンド−抗リガンドベースの相互作用によりチャンバ底に束縛することができ(例えば、チャンバ底の別々の位置に点在する抗リガンドが、ビーズのリガンドと相互作用する);(iii)物理的相互作用により底に束縛することができる(例えば、底に、疎水性表面または不活性表面により分離した、負に帯電した点でパターンを形成し、その結果、核酸に覆われたビーズをその分離した点に固定することができる)。一部の実施形態では、ビーズを、光学的に分離されたシグナルを実現するのに十分なほどの低密度で、チャンバ底にランダムに配置する。これには容量を減少させるという明確な短所がある。
第1チャンバ、第2チャンバ、任意でフィラービーズ源、および連結チャネルの組み合わせを、「配列決定モジュール」ということができる。図示するように、細胞を、配列決定モジュールの外にあるマイクロ流体装置で捕捉、洗浄、および溶解し、その後、細胞溶解物(つまり、RNA含有部分)をモジュールの第1チャンバに導入する。第1鎖cDNA合成、ならびに、アダプターオリゴヌクレオチドの切断およびライゲーションを、第1チャンバで実行することができる。
一部の実施形態では、ビーズに固定していないRNAまたはDNAのテンプレートを、配列決定チャンバに移し、実質的に平面の基質に固定する。実施形態では、それは、チャンバ底の上のガラスもしくはPDMSであるか、または、チャンバ底からなる。このような固定化に対し多数のアプローチが知られ、それを本発明に適用することが可能であろう。一アプローチでは、細胞溶解物をポリd(T)でコーティングした表面に接触させ、その後、逆転写およびcDNA配列決定を行う。図21および22は、オリゴヌクレオチドを表面に固定する例示的方法を示すが、他の方法も当技術分野で知られている。一アプローチでは、個々のRNA分子を(そして、結果として、RNAに由来するクローン集団を)物理的に分離し、そこから生じるシグナルを光学的に識別するのに十分に低密度で捕捉オリゴヌクレオチドのローンを含むチャンバに、RNAを導入する。配列決定用に、ランダムな、または規則正しいテンプレートアレイを作成する方法は周知である。例えば、米国特許出願公開第2013/0116153号明細書;C. Adessi et al., Nucleic Acids Res. 2000 Oct 15;28(20):E87;M. Fedurco et al., Nucleic Acids Res. 2006 Feb 9;34(3):e22を参照のこと。
sequencing-by-synthesis反応には、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物を組み込みシグナルを検出する、多数のサイクルが含まれる。これは、典型的には、反応物をサイクルのある時点で配列決定チャンバに導入し、次のサイクルの開始前に該反応物およびを生成物を取り除くことにより行う。これは、反応物、反応物溶液、および洗浄溶液等をチャンバに導入し、標準的なマイクロ流体法を用いてそれらを取り除くことにより達成される。一部の実施形態では、マイクロ流体装置には、配列決定前に、配列決定反応物および/または洗浄溶液を予め装填する。
第2チャンバからのシグナルは、カメラ(例えば、CCDカメラ)ならびにFluidigm社により開発された光学系、および、当技術分野で既知の光学系を用いて収集することが可能である。例えば、図23を参照のこと。このような実施形態では、カメラとシグナル源との間の物質は、シグナルに対し透過的であろう。
7.集積装置
図20は、配列決定カセットをマイクロ流体チップに集積可能であることを示す。表示するアプローチでは以下のステップを実行することができ、ステップ2〜9(および、任意でステップ1)は、マイクロ流体装置において実行し、ステップ6〜9は配列決定モジュールにおいて実行する。
細胞濃縮は、マイクロ流体装置、「オフ−チップ(off-chip)」、またはその両方で起き得る。濃縮パラメータには、物理的特性(例えば、サイズ、変形、密度、電荷)および生物学的特性(例えば、マーカータンパク質の発現)が含まれる。
単一細胞の捕捉は、様々な方法を用いて実行することができる。一アプローチでは国際公開第2013/130714号("Methods, systems, and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics")に記載の特徴を有する単一細胞捕捉マイクロ流体装置を用いて、個々の細胞を単離し、核酸を処理し、該核酸の配列決定をする。所望により、例えば、上記の配列決定モジュールを組み込むといったある修正を所望により加えることは、本明細書に誘導された当業者の技量の内にあるだろう。国際公開第2013/130714号および同第2014/144789号は、チャネル、ポンプなどのマイクロ流体要素についての記載を含め、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるものとする。
8.追加特徴
本セクションは、上記のある要素についての追加の記載を提供する。
本明細書で提供するアンカーポリヌクレオチドを用いて、mRNA分子を固体支持体に捕捉する。そのため、アンカーポリヌクレオチドは、mRNA分子を捕捉するためにオリゴd(T)プライマーを含み得る。アンカーポリヌクレオチドはさらに、標的ポリヌクレオチド(例えば、cDNA)をアダプター核酸でタグ付けした後、該標的ポリヌクレオチドを増幅する手段を提供する。アンカーポリヌクレオチドは、さらに、制限酵素認識配列を含み、固定化標的ポリヌクレオチドを、増幅および/または配列決定の後に固体支持体から取り除くための手段を提供する。限定ではなく説明のため、アンカーポリヌクレオチドの例を図2に示す。この実施形態では、固体支持体(ビーズ)に付着した2つのアンカーポリヌクレオチドを示す。一方のアンカーポリヌクレオチドを本明細書では「第1アンカーポリヌクレオチド」というが、これは増幅プライマー(AP1)および制限認識部位(例えば、切断部位1またはCS1)を含む。オリゴd(T)プライマー、AP1に対し相補的な増幅プライマー(AP1’)、および制限認識部位(例えば、切断部位2またはCS2)を含むアンカーポリヌクレオチドを、本明細書では「第2アンカーポリヌクレオチド」という。アンカーポリヌクレオチドのさらなる例を図3に示す。図3は、第1アンカーポリヌクレオチドおよび第2アンカーポリヌクレオチドを示し、ここでは、mRNAテンプレートが、そのポリAテールを介して第2アンカーポリヌクレオチドのオリゴd(T)にアニールされている。
実施形態では、第1アンカーポリヌクレオチドを固体支持体に固定する。実施形態では、第1アンカーポリヌクレオチドは第1増幅核酸配列を含み、増幅プライマー(「増幅プライマー1」または「AP1」ともいう)として機能する。実施形態では、第1アンカーポリヌクレオチドは、制限酵素認識部位(「切断部位1」または「CS1」ともいう)などの第1放出核酸配列を含む。実施形態では、第1放出核酸配列(例えば、CS1)が、第1増幅核酸配列(例えば、AP1)を固体支持体に連結する。
一部の実施形態では、第2アンカーポリヌクレオチドを固体支持体に固定する。実施形態では、第2アンカーポリヌクレオチドは、第2増幅核酸配列(増幅プライマー2またはAP2ともいう)を含む。実施形態では、第2アンカーポリヌクレオチドは、制限酵素認識部位(切断部位2またはCS2ともいう)などの第2放出核酸配列を含む。実施形態では、第2放出核酸配列(例えば、CS2)は、第2増幅核酸配列(例えば、AP2)を固体支持体に連結する。実施形態では、第2増幅核酸配列(例えば、AP2)は、第2放出核酸配列(例えば、CS2)を、標的ポリヌクレオチド捕捉配列(例えば、オリゴdTT20)に連結する。したがって、本明細書で提供する一本鎖cDNAは、デオキシチミン配列(例えば、オリゴdTT20)に共有結合的に付着させることにより、固体支持体に固定することができ、ここで、該デオキシチミン配列は第2増幅核酸配列(例えば、AP2)に連結し、これは、第2放出核酸配列(例えば、CS2)を通じて固定支持体に結合する。
本明細書に提供する方法では、アダプター核酸配列を、切断済み標的ポリヌクレオチドにライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成する。本明細書で提供するアダプター核酸配列は、切断済み標的ポリヌクレオチド(例えば、cDNA)にライゲーションすることが可能な任意の核酸とすることができる。アダプター核酸配列は、プライマー増幅配列を含むため、標的ポリヌクレオチドの増幅手段を提供する。一実施形態では、アダプター核酸は増幅プライマー相補体(AP1’)を含み、これを用いて、第1アンカーポリヌクレオチドの増幅プライマー(AP1)にアニールすることにより、例えばブリッジPCRにより標的ポリヌクレオチドを増幅する方法を提供する。
当業者は、本明細書で提供する核酸配列にタグ付けする方法は、複数の核酸配列のタグ付けに適用可能であることを即座に認識しよう。本明細書で提供する方法が、複数の核酸配列にタグ付けするステップを含む場合、標的ポリヌクレオチドはそれぞれ独立して異なる。そのため、標的ポリヌクレオチドは不均一となり得る。実施形態では、該複数の標的ポリヌクレオチドは複数のcDNA配列である。実施形態では、該複数の標的ポリヌクレオチドは複数のリボ核酸配列である。該複数の標的ポリヌクレオチドは、単離細胞に由来し得る。本明細書で提供する単離細胞は、該細胞が事前に発生した細胞培養物、組織、臓器、または有機体中のほかの構成要素(細胞)から実質的に分離した、または、精製した細胞である。「単離」した細胞には、標準的な精製方法により精製した細胞が含まれる。
上記のように、標的ポリヌクレオチドはcDNAとすることができる。したがって、一態様において、タグ付き一本鎖cDNAを形成する方法を提供する。該方法によると、(i)標的cDNAを固体支持体に固定することにより、固定化標的cDNAを形成する。(ii)前記固定化標的cDNAに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−cDNAハイブリッドを形成する。(iii)前記認識オリゴヌクレオチド−cDNAハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みcDNAハイブリッドを形成する。(iv)前記切断済みcDNAにアダプター核酸をライゲーションすることにより、タグ付き一本鎖cDNAを形成する。標的ポリヌクレオチドがcDNAである場合、該cDNAは、当技術分野で一般的に知られる固定化方法、および上記の固定化方法を用いて、固体支持体に固定することができる。例えば、該cDNAは、共有結合により、化学的に修正した(官能化した)固体支持体に直接的に固定することができる。他の実施形態では、該cDNAは、上記のように第2アンカーポリヌクレオチドを通じて固体支持体に付着する。該cDNAが第2アンカーポリヌクレオチドを通して固体支持体に付着する場合、mRNA分子を、該mRNAのポリアデニル化3'末端と標的ポリヌクレオチド捕捉配列の核酸配列(例えば、デオキシチミン配列またはオリゴdTT20)との間の水素結合により固体支持体にハイブリダイズすることで、固定化mRNAを形成する。上記のように、標的ポリヌクレオチド捕捉配列は、第2アンカーポリペプチドの一部を形成する。固定化mRNAをその次に逆転写することにより、RNA:DNAハイブリッドを形成する。RNA:DNAハイブリッドをエンドリボヌクレアーゼ酵素(例えばRNアーゼH)に接触させることにより該RNA:DNAハイブリッドのmRNAを分解することで、標的ポリヌクレオチド捕捉配列を通じて固体支持体に付着した一本鎖cDNAを形成することができる。固定化一本鎖cDNA(標的cDNA)を、上記のように認識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−cDNAハイブリッドを形成することができる。上記のように、認識オリゴヌクレオチドは、縮重核酸配列が隣接する切断剤認識配列(例えば、BaeG1認識配列)を含むことができる。認識オリゴヌクレオチド−cDNAハイブリッドを切断剤(例えばBaeG1)で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みcDNAハイブリッドを形成することができる。上記のように、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みcDNAハイブリッドは、5'オーバーハングを含み得る。上記のアダプター核酸を切断済みcDNAにライゲーションすることにより、タグ付き一本鎖cDNAを形成する。当技術分野で一般的に知られている任意のライゲーション方法およびDNAリガーゼを用いて、アダプター核酸を切断済みcDNAにライゲーションすることができる。
上記のように、標的ポリヌクレオチドはリボ核酸とすることができる。したがって、別の態様において、タグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。該方法によると、(i)標的リボ核酸を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸を形成する。(ii)前記固定化標的リボ核酸を逆転写することにより、RNA:DNAハイブリッドを形成する。(iii)前記RNA:DNAハイブリッドをRNA:DNA切断剤で切断することにより、切断済みRNA:DNAハイブリッドを形成する。(iv)前記切断済みRNA:DNAハイブリッドにアダプター核酸をライゲーションする。(v)前記リボ核酸配列を前記RNA:DNAハイブリッドから取り除くことにより、タグ付き核酸配列を形成する。標的リボ核酸を固体支持体に固定する場合、前記標的リボ核酸はmRNAとすることができ、固定化は、上記のように、前記mRNAのポリアデニル化配列と、本明細書に記載のポリヌクレオチド捕捉配列との間の水素結合を通して実行することができる。mRNAの逆転写によりRNA:DNAハイブリッドを形成し、前記RNA:DNAハイブリッドは切断剤を用いて切断することができる。前記切断剤は、一方の鎖はDNAであり、もう一方の鎖はRNAである、DNAおよびRNAの二本鎖ハイブリッドを切断することが可能な制限エンドヌクレアーゼとすることができる。RNA:DNAハイブリッドを切断する際、5'オーバーハング、3'オーバーハング、または、オーバーハングなしの平滑末端を生成することができる。そのため、切断済みRNA:DNAハイブリッドは、5'オーバーハング、3'オーバーハング、または、平滑末端を含むことができ、その後、アダプター核酸にライゲーションすることができる。アダプター核酸をRNA:DNAハイブリッドにライゲーションしたら、前記RNAは、上記のようにエンドリボヌクレアーゼを用いて消化することにより取り除くことができ、これはタグ付き核酸配列の形成をもたらす。
別の態様では、複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを含む認識オリゴヌクレオチドライブラリであって、該不均一な認識オリゴヌクレオチドはそれぞれ、縮重核酸配列が隣接した制限酵素認識配列を含むライブラリを提供する。本明細書で提供する縮重核酸配列は、制限酵素認識配列(本明細書では切断剤認識配列ともいう)に隣接し、縮重ヌクレオチドを含む。縮重ヌクレオチドは、異なる標的ポリヌクレオチド(例えば、一本鎖cDNA)に対し相補的、または部分的に相補的とすることができる。用語「部分的に相補的」とは、異なる標的ポリヌクレオチド(各標的ポリヌクレオチドは異なっている)以外にハイブリダイズすることが可能な認識オリゴヌクレオチドを意味する。実施形態では、切断剤認識配列には、縮重核酸配列が隣接する。実施形態では、縮重核酸配列は標的ポリヌクレオチド(例えば、cDNA)に対し部分的に相補的である。実施形態では、縮重核酸配列は標的ポリヌクレオチドに対し特異的に相補的である。実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは5' An-Xm-Bn 3'の構造を有し、ここにおいて、AおよびBは、標的ポリヌクレオチドを含む配列に対し相補的、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列であり、nは独立して10〜40の整数である。Xは切断剤認識配列であり、mは4〜10の整数である。切断剤は、上記のように制限酵素(例えば、BaeG1)である。実施形態では、ライブラリはマイクロ流体装置の一部を形成する。
本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを増幅し、続いて配列決定することができる。当技術分野で既知の任意の核酸増幅法を用いることができる。特異的で非限定的な一例では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを増幅する。実施形態では、本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを、ブリッジPCRを用いて増幅する。したがって、実施形態では、PCR増幅はブリッジPCRである。ブリッジPCRの技法は当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第2013/131962号に記載されており、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。実施形態では、本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを、等温テンプレートウォーキング(isothermal template walking)法を用いて増幅する。等温テンプレートウォーキング法は当技術分野で周知の増幅法であり、例えば、Ma Z et al., PNAS 2013;110:14320-14323に記載されており、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。実施形態において、該方法は、接触ステップの後、増幅したcDNAを配列決定するステップを含む。実施形態において、各ステップはマイクロ流体装置で行われる。提供する本発明に有用なマイクロ流体装置の例は、米国特許出願公開第2013/0302883号明細書、同第2013/0302884号明細書、同第2013/0296196号明細書、同第2013/0295602号明細書、および同第2013/0302807号明細書に公開されており、これらはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
Claims (6)
- タグ付き核酸配列を形成する方法であって、
(i)標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定するステップであって、
(a)固体支持体にRNA分子を捕捉することにより捕捉RNAを形成するステップと;
(b)前記捕捉RNAを逆転写し、その後、捕捉RNAを取り除くことにより、前記固体支持体に固定された標的ポリヌクレオチドを形成するステップと;
を含み、これにより、固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(ii)前記固定化標的ポリヌクレオチドに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと;
(iii)前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み標的ポリヌクレオチドを含む、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと;
(iv)前記切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成するステップであって、前記アダプター核酸配列は、前記固体支持体に共有結合的に結合する第1アンカーポリヌクレオチドの第1増幅核酸配列相補体を含むステップと;
を含む、方法。 - 前記固体支持体はビーズ構造を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1増幅核酸配列相補体を、PCR増幅を可能とする条件下で前記第1増幅核酸配列にハイブリダイズすることにより、前記タグ付き核酸配列を増幅する、請求項1に記載の方法。
- 複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する方法であって、
(i)複数の不均一な標的ポリヌクレオチドを、請求項1に記載のステップ(a)および(b)を行うことにより固体支持体に固定し、複数の不均一な固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(ii)前記不均一な固定化標的ポリヌクレオチドに複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、複数の認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと;
(iii)前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、複数の切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと;
(iv)前記複数の切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成するステップであって、前記アダプター核酸配列は、前記固体支持体に共有結合的に結合する第1アンカーポリヌクレオチドの第1増幅核酸配列相補体を含むステップと;
を含む、方法。 - 複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを含む認識オリゴヌクレオチドのライブラリであって、該不均一な認識オリゴヌクレオチドはそれぞれ、請求項1に記載の方法における使用のための縮重核酸配列が隣接する制限酵素認識配列を含む、ライブラリ。
- cDNA配列を増幅する方法であって、
(i)単離細胞から抽出したRNA分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成するステップと;
(ii)前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化RNA:DNAハイブリッドを形成するステップと;
(iii)前記リボ核酸配列を前記RNA:DNAハイブリッドから取り除くことにより、固定化cDNA配列を形成するステップと;
(iv)前記固定化cDNA配列に認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド:DNAハイブリッドを形成するステップと;
(v)前記認識オリゴヌクレオチド:cDNAハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド:切断済みcDNAハイブリッドを形成するステップと;
(vi)前記切断済みcDNAにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付きcDNA配列を形成するステップであって、前記アダプター核酸配列は、前記固体支持体に共有結合的に結合する第1アンカーポリヌクレオチドの第1増幅核酸配列相補体を含むステップと;
(vii)前記cDNA配列をクローン増幅により増幅するステップと;
を含む、方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461990598P | 2014-05-08 | 2014-05-08 | |
US61/990,598 | 2014-05-08 | ||
US201462079495P | 2014-11-13 | 2014-11-13 | |
US62/079,495 | 2014-11-13 | ||
PCT/US2015/029986 WO2015172080A1 (en) | 2014-05-08 | 2015-05-08 | Integrated single cell sequencing |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017514478A JP2017514478A (ja) | 2017-06-08 |
JP2017514478A5 JP2017514478A5 (ja) | 2018-06-07 |
JP6716465B2 true JP6716465B2 (ja) | 2020-07-01 |
Family
ID=54393068
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016564984A Active JP6716465B2 (ja) | 2014-05-08 | 2015-05-08 | 集積した単一細胞の配列決定 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20150337295A1 (ja) |
EP (1) | EP3140428B1 (ja) |
JP (1) | JP6716465B2 (ja) |
CN (1) | CN106460051A (ja) |
SG (2) | SG11201609055RA (ja) |
WO (1) | WO2015172080A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106811460B (zh) | 2015-11-30 | 2020-11-27 | 浙江安诺优达生物科技有限公司 | 用于低频突变检测的二代测序文库的构建方法及试剂盒 |
EP3467121A4 (en) * | 2016-05-25 | 2020-02-12 | Nikon Corporation | METHOD FOR IDENTIFYING TARGET BIOLOGICAL, BALLS FOR USE IN IDENTIFYING TARGET BIOLOGICAL, BALL SET, AND DEVICE FOR IDENTIFYING TARGET BIOLOGICAL |
AU2019247841B2 (en) * | 2018-04-04 | 2023-02-09 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Methods of generating nanoarrays and microarrays |
US10842821B2 (en) | 2018-04-05 | 2020-11-24 | Medeor Therapeutics, Inc. | Cellular compositions derived from prior organ donors and methods of manufacture and use thereof |
US10881692B2 (en) | 2018-04-05 | 2021-01-05 | Medeor Therapeutics, Inc. | Compositions for establishing mixed chimerism and methods of manufacture thereof |
SG11202102722SA (en) * | 2018-10-25 | 2021-04-29 | Illumina Inc | Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes |
WO2020160122A1 (en) * | 2019-01-29 | 2020-08-06 | Molecular Assemblies, Inc. | Reusable initiators for synthesizing nucleic acids |
CN118339306A (zh) * | 2021-12-02 | 2024-07-12 | 生物辐射实验室股份有限公司 | Dna:rna双链体断裂的用途 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9620769D0 (en) * | 1996-10-04 | 1996-11-20 | Brax Genomics Ltd | Nucleic acid sequencing |
ES2563643T3 (es) * | 1997-04-01 | 2016-03-15 | Illumina Cambridge Limited | Método de secuenciación de ácido nucleico |
GB9714716D0 (en) | 1997-07-11 | 1997-09-17 | Brax Genomics Ltd | Characterising nucleic acids |
US20060275782A1 (en) * | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
CA2406236C (en) * | 2000-04-17 | 2013-02-19 | Dyax Corp. | Novel methods of constructing libraries of genetic packages that collectively display the members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins |
AUPQ974900A0 (en) * | 2000-08-29 | 2000-09-21 | Macquarie Research Limited | Degenerate oligonucleotide gene-shuffling |
US20040209263A1 (en) * | 2000-12-07 | 2004-10-21 | Clawson Gary A. | Selection of catalytic nucleic acids targeted to infectious agents |
JP2004097158A (ja) * | 2002-09-12 | 2004-04-02 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 発現遺伝子同定用cDNAタグの作成方法、及び該cDNAタグを用いる遺伝子発現解析方法 |
US8241573B2 (en) * | 2006-03-31 | 2012-08-14 | Illumina, Inc. | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
US20110129827A1 (en) | 2008-04-04 | 2011-06-02 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for transcript analysis |
US20100035249A1 (en) * | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Rna sequencing and analysis using solid support |
US20120156728A1 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Life Technologies Corporation | Clonal amplification of nucleic acid on solid surface with template walking |
US9309566B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification |
US9625454B2 (en) * | 2009-09-04 | 2017-04-18 | The Research Foundation For The State University Of New York | Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices |
CN103890245B (zh) * | 2011-05-20 | 2020-11-17 | 富鲁达公司 | 核酸编码反应 |
EP3285062B1 (en) | 2012-02-29 | 2019-08-07 | Fluidigm Corporation | Methods, systems, and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics |
NO2694769T3 (ja) * | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
WO2014144789A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Fluidigm Corporation | Methods and devices for analysis of defined multicellular combinations |
-
2015
- 2015-05-08 SG SG11201609055RA patent/SG11201609055RA/en unknown
- 2015-05-08 CN CN201580024133.5A patent/CN106460051A/zh active Pending
- 2015-05-08 WO PCT/US2015/029986 patent/WO2015172080A1/en active Application Filing
- 2015-05-08 SG SG10202004286UA patent/SG10202004286UA/en unknown
- 2015-05-08 EP EP15789313.2A patent/EP3140428B1/en active Active
- 2015-05-08 US US14/708,048 patent/US20150337295A1/en not_active Abandoned
- 2015-05-08 JP JP2016564984A patent/JP6716465B2/ja active Active
-
2018
- 2018-12-21 US US16/229,786 patent/US20190249238A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015172080A1 (en) | 2015-11-12 |
EP3140428A4 (en) | 2018-02-28 |
EP3140428B1 (en) | 2021-07-28 |
JP2017514478A (ja) | 2017-06-08 |
US20150337295A1 (en) | 2015-11-26 |
CN106460051A (zh) | 2017-02-22 |
EP3140428A1 (en) | 2017-03-15 |
US20190249238A1 (en) | 2019-08-15 |
SG10202004286UA (en) | 2020-06-29 |
SG11201609055RA (en) | 2016-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6716465B2 (ja) | 集積した単一細胞の配列決定 | |
US11692223B2 (en) | Methods and arrays for producing and sequencing monoclonal clusters of nucleic acid | |
US20210071171A1 (en) | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation | |
US10988760B2 (en) | Sample preparation on a solid support | |
US20210155985A1 (en) | Surface concatemerization of templates | |
CN103370425B (zh) | 用于核酸扩增的方法、组合物、***、仪器和试剂盒 | |
US10597715B2 (en) | Methods for sequencing nucleic acids | |
EP3103885B1 (en) | Methods for sequencing nucleic acids | |
JP2013544498A (ja) | 固定化プライマーを使用した標的dnaの直接的な捕捉、増幅、および配列決定 | |
US11060139B2 (en) | Methods for sequencing nucleic acids | |
EP3303614B1 (en) | Enhanced utilization of surface primers in clusters |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180417 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180417 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190312 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190610 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191203 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200303 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200312 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200512 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200610 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6716465 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |