DE102018122546B3 - Verfahren zum Hochdurchsatz-Peptid-MHC-Affinitätsscreening für TCR-Liganden - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening auf einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex, umfassend ein stabilisiertes MHC-Molekül und entsprechende Anwendungen des Verfahrens.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening auf einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex, umfassend ein stabilisiertes Peptid-MHC-Molekül, und entsprechende Anwendungen des Verfahrens.
  • Grundlagen der Erfindung
  • Die Präsentation von Peptiden auf der Zelloberfläche von MHC-Molekülen spielt eine grundlegende Rolle für die Immunantwort gegen Virusinfektionen oder Krebs (1). MHC-Klasse-I-Moleküle sind trimere Komplexe, die aus einer polymorphen schweren Kette, Beta-2-Mikroglobulin (β2m) und einem Peptidliganden bestehen, typischerweise zwischen 8 und 10 Aminosäuren lang, und abgeleitet vom Abbau von zytosolischen Proteinen sind. T-Zellen können mit ihrem Klon-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifische Peptid-MHC-Komplexe (pMHC) erkennen und eine Immunantwort auslösen.
  • Die Herstellung von löslichen pMHC-Komplexen ist für viele verschiedene Anwendungen in wissenschaftlichen und klinischen Bereichen wichtig, welche sich um die Interaktion zwischen pMHCs und TCRs drehen. Sie wurden erstmals 1992 mit Hilfe von Proteinexpressions- und Rückfaltungstechniken erzeugt und werden seitdem für viele Anwendungen eingesetzt, z. B. zur Identifizierung antigenspezifischer T-Zellen durch Durchflusszytometrie oder zur Affinitätsmessung der TCR-pMHC-Interaktion (2 bis 5).
  • Die Affinität des TCR zu seinem verwandten pMHC hat einen wesentlichen Einfluss auf die Funktionalität der exprimierenden T-Zelle (6). So wurden Anstrengungen unternommen, um die Affinität von niedrigaffinen TCRs zu verbessern, um optimale Werte für klinische Anwendungen zu erreichen (7). Umfangreiche Maturierungsexperimente haben TCRs mit pikomolaren Affinitäten hervorgebracht, ein Bereich, der normalerweise Antikörpern vorbehalten ist. Sie binden gezielte pMHCs mit langen Interaktionshalbwertszeichen auch in monomerer Form und haben damit als Tumorzellen ansteuernde Komponente in bi-spezifischen T-Zell-Engager-Formaten Aufmerksamkeit erregt (8, 9).
  • WO 2013/030620 offenbart rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle, die in Bakterien produziert werden und als unlöslicher Bindungskörper zum Nachweis epitopenspezifischer CTL vorliegen. Diese werden zunächst in einer Lösung eines chaotropen Mittels denaturiert. Das Chaotrope wird dann in Gegenwart des gewünschten Peptids (Renaturierung, Rückfaltung) entfernt und der Peptidkomplex der Klasse-I wird durch Gelfiltrationschromatographie vom ungefalteten Protein getrennt. Die Herstellung dieser spezifischen MHC-Klasse-I-Moleküle ist ein aufwändiger und komplexer Prozess, der nur von Experten in speziell dafür vorgesehenen Labors durchgeführt werden kann. WO 2013/030620 offenbart ein Gen für die Kodierung eines MHC-Klasse-I-Moleküls, wobei das MHC-Klasse-I-Molekül eine Alpha-1-Helix und eine Alpha-2-Helix aufweist und das Gen so kodiert ist, dass eine Bindung zwischen der Alpha-1-Helix und der Alpha-2-Helix im MHC-Klasse-I-Molekül entsteht. Somit kann ein Kit zur Analyse von T-Zell-Frequenzen bereitgestellt werden. Die Aminosäure 139 wird durch ein Cystein substituiert, um Cys-139 bereitzustellen, die Aminosäure 84 wird durch Cystein substituiert, um Cys-84 bereitzustellen, oder die Aminosäure 85 wird durch Cystein substituiert, um Cys-85 bereitzustellen, die Disulfidbrücke wird zwischen der Alpha-1-Helix und der Alpha-2-Helix in der schweren Kette der MHC-Klasse-I zwischen Cys-139 und Cys-84 oder zwischen Cys-139 und Cys-85 gebildet.
  • In der US-Anmeldung 2009-0117153 wird eine so genannte Disulfidfalle offenbart, die ein Antigenpeptid umfasst, das kovalent an ein MHC-Klasse-I Schwerkettenmolekül durch eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinen gebunden ist. In einigen Konfigurationen kann eine Disulfidfalle, wie beispielsweise ein Disulfidfalle-Einkettentrimer (dtSCT), eine einzelne zusammenhängende Polypeptidkette umfassen. Bei der Synthese in einer Zelle oxidiert eine Disulfidfalle in dem ER richtig und kann von T-Zellen erkannt werden. In einigen Konfigurationen wird ein Peptidteil einer Disulfidfalle nicht durch hochaffine Konkurrenzpeptide verdrängt, auch wenn das Peptid an die schwere Kette relativ schwach bindet. In verschiedenen Konfigurationen kann eine Disulfidfalle zur Impfung, zur Auslösung von CD8-T-Zellen und in multivalenten MHC/Peptidreagenzien zur Zählung und Verfolgung von T-Zellen eingesetzt werden. Ebenfalls offenbart sind Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die für eine Disulfidfalle kodiert. Solche Nukleinsäuren, die DNA-Vektoren sein können, können als Impfstoffe eingesetzt werden.
  • Zeynep Hein, et al. (in: Peptide-independent stabilization of MHC class I molecules breaches cellular quality control. J Cell Sci 2014 127: 2885-2897) beschreiben eine Variante des murinen MHC-I Allotyps H-2Kb, bei der die Helices-α1 und -α2 durch eine Disulfidbindung in der Nähe der F-Tasche verbunden sind, die ihre Mobilität einschränkt. Die C84-C139-Disulfidbindung ermöglicht eine normale PLC-Interaktion und Antigenpräsentation, macht aber die MHC-I-Oberflächenexpression TAP- und Tapasin-unabhängig, beschleunigt den anterograden Transport und verringert die Rate der MHC-I-Endozytose stark.
  • WO 2011/101681 offenbart disulfidbindungsstabilisierte rekombinante MHC-Klasse-Il-Moleküle, die durch eine Disulfidbindung zwischen Cysteinresten, die sich in der α2-Domäne der α-Kette und der β2-Domäne der β-Kette befinden, verbunden sind, wobei die Cysteinreste nicht in nativen MHC-Klasse-II- α2- und β2-Domänen vorhanden sind.
  • WO 2018/029350 offenbart einen Kon-Rate-Test und einen verbesserten TCR-Liganden-Koff-Rate-Test, der eine breitere Anwendung durch eine neuartige Kombination mit der UV-Peptid-Austauschtechnologie ermöglicht. Die Offenbarung ermöglicht die Herstellung von Koff-Rate MHC-Monomeren im Hochdurchsatz, mit denen dann TCR-Kandidaten für erweiterte Peptidbibliotheken in Assays wie dem TCR-Liganden Koff-Rate-Assay, der bisher nicht möglich war, gescreent werden können. Darüber hinaus ermöglicht der UV-Peptidaustausch mit den Koff-Rate-MHC-Monomeren die Analyse von TCR-Kandidaten, die spezifische Peptide mit der Aminosäure Cystein erkennen, die bisher die Koff-Rate-Messung stören oder sogar beseitigen konnten.
  • Newell et al. (in: Newell EW. Higher Throughput Methods of Identifying T Cell Epitopes for Studying Outcomes of Altered Antigen Processing and Presentation. Frontiers in Immunology. 2013; 4:430) offenbaren eine hochgehaltvolle kombinatorische Peptid-MHC-Tetramer-Färbung mittels Massenzytometrie.
  • Bakker et al. (in: Bakker AH, Hoppes R, Linnemann C, et al. Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1, -A3, -A11, and -B7. PNAS 2008; 105(10):3825-3830) offenbaren konditionelle Liganden, die sich bei Einwirkung von langwelligem UV-Licht auflösen und für das menschliche MHC-Molekül HLA-A2 designed werden können. Diese Peptidaustauschtechnologie kann angeblich zu einem allgemein anwendbaren Ansatz für Hochdurchsatz-MHC-basierte Anwendungen zur Analyse der zytotoxischen T-Zell-Immunität entwickelt werden.
  • Cochran und Stern (in: A diverse set of oligomeric class II MHC-peptide complexes for probing T-cell receptor interactions. Chem Biol. 2000 Sep;7(9):683-96) offenbaren Werkzeuge zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die für die Initiierung von Aktivierungsprozessen in T-Zellen verantwortlich sind. Ein topologisch vielfältiger Satz von Oligomeren des humanen MHC-Proteins HLA-DR1, der in seiner Größe von Dimeren bis hin zu Tetrameren variiert, wurde durch Variation der Position eines eingeführten Cysteinrestes und der Anzahl und des Abstands von sulfhydrylreaktiven Gruppen, die auf neuartigen und kommerziell erhältlichen kreuzvernetzenden Reagenzien durchgeführt wurden, hergestellt. Fluoreszenzsonden, die in die kreuzvernetzenden Reagenzien integriert sind, ermöglichten die Messung der Oligomerbindung an die T-Zellenoberfläche. Oligomere MHC-Peptidkomplexe, einschließlich einer Vielzahl von MHC-Dimeren, -Trimeren und -Tetrameren, banden an T-Zellen und initiieren antigenspezifisch T-Zell-Aktivierungsprozesse.
  • Chong et al. (in: High-throughput and Sensitive Immunopeptidomics Platform Reveals Profound Interferon-γ-Mediated Remodeling of the Human Leukocyte Antigen (HLA) Ligandome. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 2018;17(3):533-548) offenbaren ein hochdurchsatzfähiges, reproduzierbares und empfindliches Verfahren zur sequentiellen immunaffinen Aufreinigung von HLA-I- und -II-Peptiden aus bis zu 96 Proben in einem Plattenformat, das sowohl für Zelllinien als auch für Gewebe geeignet ist. Das Verfahren zielt darauf ab, den angeblich höchst kritischsten Schritt in der Immunopeptidomics-Pipeline, die Probenvorbereitung, zu verbessern, da es die gesamte Peptidausbeute und Reproduzierbarkeit bestimmt.
  • Luimstra et al. (in: Luimstra JJ, Garstka MA, Roex MCJ, et al. A flexible MHC class I multimer loading system for large-scale detection of antigen-specific T cells. J Exp Med2018; 215(5): 1493-1504) offenbaren ein angeblich einfaches, schnelles, flexibles und effizientes Verfahren, um viele verschiedene MHC-Klasse-I (MHC I)-Multimere parallel unter Verwendung von temperaturvermitteltem Peptidaustausch zu erzeugen. Sie entwickelten konditionelle Peptide für HLA-A*02:01 und H-2Kb, die bei niedrigen Temperaturen stabile Peptid-MHC I-Komplexe bilden, sich aber bei einer definierten erhöhten Temperatur dissoziieren. Die resultierenden konditionellen MHC I-Komplexe, entweder allein oder als gebrauchsfertige Multimere hergestellt, können ohne zusätzliche Behandlung und innerhalb kurzer Zeit schnell mit Peptiden der Wahl beladen werden.
  • Ein potenzieller Nachteil der TCR-Affinitätssteigerung ist die Einführung von Off-Target-Toxizitäten. Aufgrund der inhärenten Kreuzreaktivität von TCRs können diese entstehen, indem sie die Affinität zu anderen pMHCs ebenfalls unwissentlich erhöhen (10). Mehrere solcher Fälle wurden bereits in klinischen Studien berichtet (11 bis 13).
  • Ein umfassendes Screening ist daher notwendig, um nicht nur die Wirksamkeit, sondern auch die Spezifität und Sicherheit der therapeutischen Kandidaten sicherzustellen (14). Dies ist eine Aufgabe von hoher Komplexität angesichts der derzeit etablierten Größe des Immunopeptidoms mit mindestens 150.000 MHC-Klasse-I-Ligandenpeptiden, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden, und den verfügbaren Verfahren zur pMHC-Generierung (15).
  • Die Generierung im großen Maßstab von pMHC-Bibliotheken und das anschließende Hochdurchsatz-Screening auf Bindung von TCRs, z. B. zur Generierung von Bindungsmotiven oder die direkte Identifizierung und Charakterisierung potenziell kreuzreaktiver Peptide, sind mit gängigen Technologien der Technik, wie den oben genannten, nach wie vor schwierig zu erreichen. Diese Schwierigkeit erstreckt sich auf die Herstellung hochwertiger pMHC-Komplexe auch in geringerer Anzahl für Einzelpersonen oder Institutionen ohne die notwendigen technisch anspruchsvollen Einrichtungen zur Herstellung von pMHC, z. B. für eine zeitsensible On-Demand-Produktion in klinischen Umgebungen. Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Strategien in diesem Bereich zur Verfügung zu stellen. Andere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der folgenden Beschreibung der Erfindung deutlich.
  • Gemäß einem ersten Aspekt davon wird die vorstehende Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren zum Screening auf einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex gelöst, umfassend die Schritte von: a) Bereitstellen eines geeignet stabilisierten MHC-Moleküls, wobei das MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I umfasst, und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Beta1-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II, b) Kontaktieren des entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls mit einer Vielzahl von Peptidliganden davon, um Peptidliganden/MHC (pMHC)-Molekülkomplexe zu bilden, und c) Screenen der pMHC-Molekülkomplexe auf TCR-Bindung.
  • Bevorzugt wird ein Verfahren gemäß der Erfindung, wobei das stabilisierte MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Disulfidbrücke zwischen zwei Aminosäuren umfasst, vorzugsweise mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren zwischen α-Helices, beispielsweise durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen von MHC I (basierend auf IGMT-Nummerierung mit Ausnahme der ersten 24 Aminosäuren). Entweder kann das TCR- oder das MHC-Molekül auf einer festen Oberfläche, wie beispielsweise einem Chip, Glasträger, Biosensor oder einer Perle (Bead), insbesondere als Hochdurchsatz-Screening-Format, angemessen immobilisiert werden.
  • In einem zweiten Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder zur Erzeugung eines spezifischen Aminosäurebindungsmotivs für einen TCR zur Verfügung, umfassend die Durchführung des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt davon, der einen vorgewählten TCR umfasst, und den zusätzlichen Schritt zum Bestimmen und Vergleichen der Aminosäuresequenzen jener Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch das spezifische Aminosäurebindungsmotiv für den vorgewählten TCR identifiziert wird.
  • In einem dritten Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR zur Verfügung, umfassend die Durchführung des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, und den zusätzlichen Schritt des Bestimmens und Vergleichens der Aminosäuresequenzen dieser Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird.
  • In einem vierten Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR zur Verfügung, umfassend die Durchführung des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, der einen vorgewählten TCR umfasst, und den zusätzlichen Schritt zum Bestimmen und Vergleichen der Aminosäuresequenzen jener Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird.
  • In einem fünften Aspekt davon können die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zum Screening oder zum in vitro-Priming von zellulären Arzneimitteln eingesetzt werden. Die stabilisierten HLA-Komplexe, die an Beads, Filamente, Nanopartikel oder andere Träger gebunden sind, können problemlos mit einem Peptid von Interesse beladen werden, das Antigen-präsentierende Zellen nachahmt, und anschließend bequem in Kombination mit kostimulatorischen Molekülen (z. B. Anti-CD28, Anti-41BB) als „ready to use“ künstliche Antigen-präsentierende Zellen für in vitro Priming und Expansion verwendet werden.
  • Aktuelle Verfahren zur Generierung von pMHC-Bibliotheken in großem Umfang (large-scale), eine Hochdurchsatz-Bindungsmotivbestimmung eines hochaffinen TCR und die Identifizierung und Charakterisierung potenziell kreuzreaktiver Peptide haben Stabilitätsprobleme, weshalb es erforderlich ist, Multimere ohne zusätzliche Handhabung und innerhalb kurzer Zeit (wie in Luimstra et al., oben) schnell mit Peptiden der Wahl zu beladen, was auch Technologien wie UV-Austausch ungeeignet macht.
  • Mit der vorliegenden Technologie gewinnen die Erfinder mehrere Vorteile gegenüber dem Wildtyp-Molekül oder anderen bestehenden Austauschtechnologien: Das leere Monomer kann in großen Mengen vor dem gewünschten Experiment hergestellt werden, und die pMHC-Generierung wird durch kein anderes Verfahren eingeschränkt, abgesehen von der Beschaffung der gewünschten Peptide und schnellen Reaktionen der Peptidbeladung. Die Erfinder haben die resultierenden pMHC-Komplexe auch mindestens zwei Wochen lang bei 4°C erfolgreich gelagert und für Affinitätsmessungen ohne Signalverlust wiederverwendet. Zusätzlich zu all diesen Vorteilen, die durch die Einführung der Modifikation erreicht wurden, sind die von der Mutante erzeugten pMHC-Komplexe für Wildtyp-Komplexe in Bezug auf die TCR-Ligandenbindung im Wesentlichen repräsentativ.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screening auf einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex für die TCR-Bindung bereit.
  • Das Verfahren umfasst die Verwendung eines entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls, das mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Beta1-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II umfasst. Die Haupthistokompatibilitätskomplexe der Klasse-I und II weisen eine insgesamt ähnliche Faltung auf. Die Bindungsplattform besteht aus zwei Domänen, die bei MHC-Klasse-I von einer einzigen schweren α-Kette (HC) und bei MHC-Klasse-II (α-Kette und β-Kette) von zwei Ketten stammen. Die beiden Domänen entwickelten sich zu einem leicht gekrümmten β-Blatt als Basis und zwei α-Helices darauf, die weit genug auseinander liegen, um eine Peptidkette dazwischen aufzunehmen. Somit kann für beide MHC-Klassen eine geeignete Stabilisierung für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden.
  • In einer Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung die Verwendung eines disulfidstabilisierten, zunächst leeren MHC-Moleküls, das durch einfaches Hinzufügen eines geeigneten Peptids vor dessen Verwendung geladen werden kann. pMHCs, die mit diesem modifizierten MHC-Molekül erzeugt werden, sind repräsentativ für die nicht-modifizierte Wildtypvariante und eignen sich für das Screening, z. B. Hochdurchsatz-Bindungsmotivbestimmung eines hochaffinen TCR sowie die Identifizierung und Charakterisierung potenziell kreuzreaktiver Peptide.
  • Die leeren MHCs bauen sich auf häufig verwendeten Oberflächen, wie Glasplatten, nicht wesentlich ab, sind repräsentativ für die nicht-modifizierte Wildtypvariante, wenn sie mit Peptid beladen sind, und eignen sich zum Screening und ermöglichen es, pMHCs schnell zu erzeugen, selbst wenn sie auf einer Oberfläche immobilisiert sind. Dies wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch eine „angemessen stabilisierte“ pMHC erreicht und als solches verstanden.
  • In früheren Studien mit dem murinen MHC-Klasse-I-Molekül H-2Kb konnte Einführung einer Disulfidbindung zwischen gegenüberliegenden Resten in der F-Tasche durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen den Komplex stabilisieren. So wurde in einer Ausführungsform eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren zwischen α-Helices eingeführt, z. B. durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen von MHC I. Während es in einigen Fällen schwierig sein kann, Monomere ohne Peptidliganden zu isolieren, konnte dies durch Zugabe von Peptid mit niedriger Affinität effizient überwunden werden.
  • Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen bevorzugten Verfahrens wird das entsprechend stabilisierte MHC-Molekül mit einer Vielzahl von Peptidliganden kontaktiert, um Peptidliganden/MHC (pMHC)-Molekülkomplexe zu bilden. Die Verwendung von pMHC-Komplexen als lösliche Analyten anstelle von der Immobilisierung ist für schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screenings vorzuziehen, da eine Vielzahl von regenerierbaren Biosensoren zur reversiblen Immobilisierung von bispezifischen TCR-Konstrukten existiert.
  • „Kontaktieren“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass das/die Peptid(e) mit den leeren und/oder niedrigaffinen peptidbeladenen MHC-Molekülen so in Kontakt gebracht wird/sind, dass ein wesentlicher Teil der Peptide mit den leeren und/oder niedrigaffinen peptidbeladenen MHC-Molekülen Komplexe bildet („beladen“ wird). Als ein bevorzugtes Beispiel wurde die Beladung von MHC-Komplexen durch Zugabe und Mischen der gewünschten Peptide mit einem Molverhältnis von mindestens 100 zu 1 zur Monomerlösung in einem geeigneten Puffer und mindestens 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Die Furche zwischen den beiden Helices nimmt Peptide auf, basierend auf (i) der Bildung eines Satzes konservierter Wasserstoffbrücken zwischen den Seitenketten des MHC-Moleküls und dem Rückgrat des Peptids und (ii) der Besetzung definierter Taschen durch Peptidseitenketten (Ankerreste P2 oder P5/6 und PΩ in MHC-Klasse I und P1, P4, P6 und P9 in MHC-Klasse-II). Die Art der Wechselwirkungen einzelner Peptid-Seitenketten mit dem MHC hängt von der Geometrie, der Ladungsverteilung und der Hydrophobie der Bindungsfurche ab. In der MHC-Klasse-I wird die Bindungsfurche an beiden Enden durch konservierte Tyrosinreste verschlossen, was zu einer Größenbeschränkung der gebundenen Peptide auf üblicherweise 8-10 Reste führt, wobei das C-terminale Ende in die F-Tasche eindockt. Im Gegensatz dazu nehmen MHC-Klasse-II-Proteine in der Regel Peptide mit einer Länge von 13-25 Resten in ihrer offenen Bindungsfurche auf, wobei das Peptid N-terminus normalerweise aus der P1-Tasche extrudiert. Es wurde berichtet, dass die Wechselwirkungen in der F-Taschenregion in der MHC-Klasse-I und der P1-Region (einschließlich der P2-Stelle) in der MHC-Klasse-II einen dominanten Einfluss auf die Präsentation stabiler pMHC-Komplexe und auf die Immunodominanz bestimmter peptidischer Epitope zu haben scheinen. Interessanterweise befinden sich diese Taschen an gegenüberliegenden Enden der Bindungsfurche der jeweiligen MHC-Klasse-I und MHC-Klasse II-Strukturen.
  • Die Vielzahl der Peptidliganden kann mindestens etwa 1.500 verschiedene MHC-Bindungspeptide, vorzugsweise mindestens etwa 5.000 verschiedene MHC-Bindungspeptide, mehr bevorzugt mindestens 15.000 verschiedene MHC-Bindungspeptide und am meisten bevorzugt ein Immunopeptidompräparat mit mindestens 150.000 MHC-Bindungspeptiden umfassen. Die Peptide umfassen ein Bindungsmotiv von 8-10 Resten in der Länge für MHC-Klasse-I-Proteine und 13-25 Resten in der Länge für MHC-Klasse-II-Proteine und können eine Länge zwischen 8 und 100, vorzugsweise zwischen 8 und 30, bevorzugter zwischen 8 und 16 Resten aufweisen. Am meisten bevorzugt sind Peptide, die aus dem eigentlichen Bindungsmotiv bestehen.
  • Ligandenpeptide, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von Polypeptiden abgeleitet werden, die krebsbedingt, infektionsbezogen (bakteriell oder viral) und sogar von Immun- (z. B. Autoimmun-) erkrankungen bedingt sind. Der Begriff umfasst auch entsprechend mutierte oder natürlich vorkommende mutierte Ligandenpeptide, die sich also von ihrer zugrunde liegenden Sequenz unterscheiden, wie sie im jeweiligen Polypeptid vorkommen.
  • Bevorzugt wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Kontaktieren das Laden der MHC-Bindungspeptide auf das MHC bei einer Temperatur zwischen etwa 4°C und 37°C, vorzugsweise bei einer Raumtemperatur (15° bis 25°C, vorzugsweise 20°C), umfasst.
  • Es wurde überraschend festgestellt, dass die beladenen HLA/Peptidmoleküle (pMHC) sehr stabil für mehr als etwa 1 Tag und vorzugsweise für mehr als 1 Woche (z. B. mehr als 2 Wochen) bei etwa 4°C sind. Dies ermöglicht einen effektiven und komfortablen Einsatz in viel mehr Anwendungen als bei den oben beschriebenen bekannten Verfahren.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und etwas anders als in der Literatur oben wurde auch festgestellt, dass das vorliegende Verfahren dem beliebten Verfahren des UV-Austauschs mit einem WT pMHC-Molekül deutlich überlegen war, so dass sie (insbesondere im Hochdurchsatzformat) auf einer Oberfläche, wie einem Chip oder Glasträger, durchgeführt werden konnte. Während der UV-vermittelte Peptid-Ligandenaustausch eine hohe Anzahl verschiedener pMHC-Komplexe erzeugen kann, variiert die Austausch-Effizienz je nach Peptid und seiner Affinität zur Bindung an das jeweilige MHC-Klasse-I-Allel, was zu unterschiedlichen pMHC-Konzentrationen in den Proben führt. Diese Unsicherheit ist ein Problem bei der Affinitätsmessung mit pMHCs, die als lösliche Analyten verwendet werden, da genaue Kenntnisse der Konzentration erforderlich sind, um genaue Affinitäten zu bestimmen. Da die disulfidstabilisierte MHC-Mutation ohne Peptid stabil ist, gilt diese Einschränkung nicht. Werden die Peptide in einer Konzentration zugesetzt, die hoch genug ist, um die leeren MHC-Komplexe zu sättigen, ist die effektive Konzentration von pMHC bekannt, was die Genauigkeit der Messungen deutlich erhöht und falsche negative Ergebnisse vermeidet.
  • Im nächsten Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die pMHC-Molekülkomplexe auf eine TCR-Bindung überprüft. Die bindenden und kinetischen Eigenschaften dieser Interaktion sind Schlüsselparameter für eine schützende T-Zellvermittelte Immunität, wobei stärkere TCR-pMHC-Interaktionen eine erhöhte Interaktionshalbwertszeit aufweisen und somit eine überlegene T-Zell-Aktivierung und Reaktionsfähigkeit verleihen als schwächere. Die Wechselwirkungsstärke zwischen dem TCR-Rezeptor und dem pMHC-Liganden wird typischerweise als Dissoziationskonstante Kd beschrieben und gemessen, eine Gleichgewichtskonstante, die ein Verhältnis zwischen der On-Rate-Konstante kon und der Off-Rate-Konstante koff einer bestimmten Wechselwirkung ist. Die Dissoziationskonstante Kd korreliert umgekehrt mit der Bindungsstärke einer bestimmten Interaktion, da kleinere Kd-Werte eine stärkere Bindung darstellen.
  • Das Screening kann jedes geeignete und bekannte Verfahren zur Messung und/oder zum Nachweis von pMHC/TCR-Bindungen umfassen, z. B. strukturelle TCR-pMHC Affinitäts-/Aviditätsmessungen. Ein Beispiel ist das Screening einer Peptid-MHC-Bibliothek für die TCR-Bindung durch Bio-Layer-Interferometrie (BLI), einer speziellen Form der reflektierenden Interferometrie (RI), wie im vorliegenden Kontext offenbart, wobei Bindungsinteraktionen für die TCR stärker als ein für das Verfahren von Kd 1,0 × 10-5 geeigneter Empfindlichkeitsschwellenwert mit gemessenen Kd-Werten im Bereich von 3,7 × 10-9 M bis 7,2 × 10-6 erfasst wurden, oder es wurden keine Bindungsinteraktionen für die TCR erkannt, wenn sie schwächer als der Empfindlichkeitsschwellenwert waren.
  • Andere Verfahren beinhalten andere Formen von RI, wie die Oberflächenplasmonresonanz (SPR) oder die reflektierende interferometrische Spektroskopie (RIfS) oder die einfarbige Reflektometrie (SCORE, Biametrics, Tübingen, Deutschland) oder markerbasierte Assays, z. B. die durchflusszytometrische Analyse mit NTAmeren (TCMetrix, Epalinges, Schweiz) oder pMHC- oder TCR-Tetramere, oder andere Formen von fluoreszierenden Messwerten, wie Protein-Mikroarrays. Natürlich können diese Methoden idealerweise in Hochdurchsatzformaten durchgeführt werden bzw. können leicht an diese angepasst werden.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „etwa“, dass er +/- 10% eines bestimmten Wertes umfasst, sofern nicht anders angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt exemplarisch die Verwendung eines disulfidstabilisierten leeren HLA-A*02:01-Moleküls vor, das durch einfache Zugabe von Peptiden vor Gebrauch geladen werden kann. pMHCs, die mit diesem modifizierten MHC-Molekül erzeugt werden, sind repräsentativ für die nicht-modifizierte Wildtypvariante und eignen sich somit für das Screening, z. B. Hochdurchsatz-Bindungsmotivbestimmung eines hochaffinen TCR sowie für die Identifizierung und Charakterisierung potenziell kreuzreaktiver Peptide.
  • Bevorzugt wird ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das MHC-Molekül HLA oder ein Multimer von HLA, MHC I oder MHC II ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Dimer, einem Trimer und einem Tetramer. Verfahren, die mehr als ein MHC-Molekül gleichzeitig in Screenings verwenden, sind in der Technik bekannt, z. B. von Altman, et al. (in: Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 4 Oct 1996: Vol. 274, Issue 5284, pp. 94-969.) Ebenso können Dimere oder Trimere verwendet werden.
  • Die verwendeten MHC-Moleküle beinhalten mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen den Aminosäuren. Diese Brücke wird ausgewählt aus einer rekombinant eingeführten Disulfidbrücke, der Einführung von nicht-natürlichen zu kreuzvernetzenden Aminosäuren, der Einführung von photovernetzenden Aminosäuren und chemisch eingeführten Querverbindungen. Die Einführung von Vernetzungen mit Cysteinen wird hier beschrieben; Beispiele für dimere Reagenzien zur Kreuzvernetzung sind DPDPB und HBVS sowie der trimere Vernetzer TMEA.
  • Besonders bevorzugt wird ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren zwischen α-Helices eingebracht wird, beispielsweise durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen von MHC I. Molekulardynamiksimulationen der Domäne α1 und α2 oder des gesamten MHC-I haben einen herausragenden Unterschied zwischen leerem und peptidgebundenem MHC-I aufgezeigt: In Abwesenheit von Peptid sind die schraubenförmigen Abschnitte, die den F-Taschenbereich flankieren (Reste 74-85 und 138-149 in den Helices α1 bzw. α2), deutlich mobiler. Es scheint, dass gebundene Peptide die Mobilität dieser Region einschränken und dass eine ähnlich vorteilhafte und stabilisierende Konformationsbegrenzung erreicht werden könnte, wenn man die Helices von α1 und α2 mit einer Bindung, bequemerweise einer Disulfidbindung, verknüpft.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „TCR“ jedes proteinhaltige Molekül/Konstrukt, das eine von TCR abgeleitete oder TCR-ähnliche Bindungsdomäne umfasst, wobei das Molekül/Konstrukt für die Analyse/den Nachweis von pMHC/TCR-Bindungen gemäß der vorliegend beschriebenen Erfindung geeignet ist. Im Falle der α- und/oder β-Kette eines TCR kann dies ein Molekül beinhalten, bei dem beide Ketten in der Lage bleiben, einen T-Zell-Rezeptor zu bilden (entweder mit einer nicht modifizierten α- und/oder β-Kette oder mit einem Fusionsprotein oder einer modifizierten α- und/oder β-Kette), der seine biologische Funktion ausübt, insbesondere die Bindung an einen (spezifischen) pMHC, und/oder die funktionelle Signaltransduktion bei Peptidaktivierung. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der TCR ausgewählt ist aus einem nativen TCR, einem löslichen TCR-Molekül, einem einkettigen TCR und einem TCR-ähnlichen Molekül, das eine von TCR abgeleitete oder TCR-ähnliche Bindungsdomäne (z. B. abgeleitet von einem Antikörper) umfasst, wie beispielsweise ein bispezifisches (bs) TCR, wie beispielsweise die vorliegend Beschriebenen.
  • Die Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen ermöglichen einen parallelen Nachweis, eine Analyse und/oder ein Screening einer viel größeren Anzahl von Peptidliganden und/oder pMHC im Vergleich zu herkömmlichen Technologien, einschließlich UV-Austauschverfahren. Die Gesamtheit von Peptiden, die der Zelloberfläche durch menschliche Leukozytenantigen-(HLA)-Moleküle der Klassen-I und II präsentiert werden, wird als Immunopeptidom bezeichnet. Im Mai 2017 wurden bereits 119.073 hochzuverlässige HLA Klasse-I-Peptide und 73.465 hochzuverlässige HLA Klasse-II-Peptide gemeldet (Shao W, Pedrioli PGA, Wolski W, et al. The SysteMHC Atlas project. Nucleic Acids Research. 2018;46 (Database issue):D1237-D1247) und daher ist zu erwarten, dass das menschliche Immunopeptidom 150.000 MHC-bindende Peptide für jedes der Klassen-I und II übersteigt. Mit aktuellen Verfahren können etwa 700 Peptide pro Tag analysiert werden, so dass ein Bedarf an „echten“ Hochdurchsatzverfahren besteht, d. h. an einer Vielzahl von analysierten Peptidliganden, die mindestens etwa 1.500 verschiedene MHC-Bindungspeptide, vorzugsweise mindestens etwa 5.000 verschiedene MHC-Bindungspeptide, bevorzugter mindestens etwa 15.000 verschiedene MHC-Bindungspeptide und meist bevorzugt - eine im Wesentlichen vollständige Immunopeptidompräparierung mit mindestens etwa 150.000 MHC-Bindungspeptiden umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen ein immunopeptidomweites Screening in einem so kurzen Zeitraum wie innerhalb eines Tages.
  • In Anbetracht der Anzahl der zu detektierenden/analysierenden pMHC/TCR-Bindungen ist ein Verfahren nach der vorliegenden Erfindung vorzuziehen, wobei das Verfahren als Hochdurchsatz-Screening (HTS)-Format durchgeführt wird. In HTS können bis zu Hunderttausende von experimentellen Proben unter bestimmten Bedingungen gleichzeitig auf pMHC/TCR-Bindung getestet werden. Die Proben werden in der Regel und vorzugsweise von Laborrobotern bearbeitet, die die Probenvorbereitung, das Handling und die Datenanalyse automatisieren. HTS generiert und verwendet somit einfach und zuverlässig große Datensätze, um komplexe biologische Fragestellungen zu beantworten, z. B. pMHC/TCR-Bindungskinetik und biologische Funktion wie vorliegend beschrieben.
  • HTS verlangt klassischerweise, dass Proben in einem Array-Format vorbereitet werden. Bei Bedarf können die Proben-Arrays entweder auf Mikrotiterplatten in Flüssigkeit oder auf festem Agar gezüchtet werden. Die Dichte der Platten kann zwischen 96, 192, 384, 768, 1.536 und 6.144 liegen. Alle diese Dichten sind Vielfache von 96 und spiegeln die ursprüngliche 96-Well-Mikrotiterplatte wider, die in 8 × 12 mit 9 mm Abstand angeordnet ist (siehe auch z. B. Bean GJ, Jaeger PA, Bahr S, Ideker T. Development of Ultra-High-Density Screening Tools for Microbial „Omics.“ PLoS ONE. 2014 Jan 21;9(1):e85177).
  • Für Anwendungen im Zusammenhang mit der pMHC/TCR-Bindungskinetik, wie sie detektiert/analysiert und vorliegend beschrieben wird, kann eine feste Oberfläche, wie beispielsweise ein Chip, Biosensor, Glasobjektträger oder Bead verwendet werden, auf der einige der Analysereagenzien (z. B. entweder der TCR- oder das MHC-Molekül) entsprechend immobilisiert, z. B. gespottet werden können. Zur Immobilisierung kann jede geeignete Technik eingesetzt werden, z. B. durch Biotin-Streptavidin-Interaktion. Beispiele für die vorliegend beschriebenen Ausführungsformen sind Bindungsassays, welche Bindung mindestens eines löslichen TCR(s) an mindestens einen immobilisierten pMHC(s) oder Bindung mindestens eines immobilisierten TCR(s) an mindestens einen löslichen pMHC(s) umfassen.
  • Bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, wobei das TCR und/oder das MHC-Molekül nicht oder nicht ausreichend mit einem nachweisbaren Marker markiert ist/sind. Entsprechende Marker sind in der Technik bekannt und beinhalten die direkte oder indirekte Kennzeichnung mit radioaktiven, fluoreszierenden oder chemischen Gruppen (z. B. Farbstoffe). Auch enzymatische Marker oder antigene Marker (zum Nachweis mit Antikörpern) sowie Massenmarker können verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Kodierung von Markern (z. B. spezifische Nukleinsäuren). Im Falle einer Nichtkennzeichnung kann ein Nachweis der Bindung basierend auf Änderungen des physikalischen Zustands bei komplexer Bildung/Bindung verwendet werden, um die Bindung zu identifizieren, wie z. B. eine Änderung der Masse, der Ladung oder Änderungen der optischen Eigenschaften, beispielsweise der optischen Dicke der Bioschicht durch Analytbindung und damit des Interferenzmusters oder des Reflexionskoeffizienten.
  • Verfahren zum Nachweis einer Bindung, insbesondere einer „spezifischen“ Bindung eines pMHC mit einem TCR, sind in der Technik bekannt. In der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt ein Verfahren nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt, bei dem Kd-Werte sowie kon- und koff-Werte für die TCR gemessen werden können, vorzugsweise mit einer Empfindlichkeit zwischen Kds von 1 × 10-10 M und 1 × 10-3 M, wobei die Empfindlichkeit durch die Analytenkonzentration gesteuert werden kann.
  • Als ein bevorzugtes Beispiel wird die Affinität mit einer 1:2 Analytverdünnungsreihe beginnend bei 500 nM oder mit einer 1 / 10
    Figure DE102018122546B3_0001
    Analytverdünnungsreihe beginnend bei 500 nM gemessen. Als ein bevorzugtes Beispiel werden die Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexe in parallelen Assayreaktionen mit unterschiedlichen Konzentrationen verwendet.
  • In noch einem weiteren wichtigen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Messens der T-Zell-Aktivierung, umfassend einen TCR und einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekül-Komplex, der den TCR bindet. Verfahren zum Nachweis einer solchen T-Zell-Aktivierung durch eine Bindung, insbesondere eine „spezifische“ Bindung eines pMHC an einen TCR, sind in der Technik bekannt. In der vorliegenden Erfindung wurden beispielsweise Co-Inkubations-Assays mit peptidbeladenen Zielzellen, Jurkat-Effektorzellen und bs-868Z11-CD3 in sechs verschiedenen Konzentrationen durchgeführt, und eine Korrelation der gemessenen Affinität für die Peptidliganden aus der Positionsscanning-Bibliothek mit der niedrigsten bsTCR-Konzentration, die notwendig ist, um eine 3-fache Lumineszenzerhöhung über dem Hintergrund zu induzieren, wurde als Cut-off genommen.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Erfassen oder Erzeugen eines spezifischen Aminosäurebindungsmotivs für einen TCR, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorliegend beschrieben, wobei ein vorgewählter TCR ausgewählt wird, für das ein bestimmtes Aminosäurebindungsmotiv nachgewiesen oder erzeugt werden soll. Das Verfahren umfasst a) das Bereitstellen eines entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls, wobei das MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I umfasst, und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Beta1-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II, b) Kontaktieren des entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls mit einer Vielzahl von Peptidliganden davon, um Peptidliganden/MHC (pMHC)-Molekülkomplexe zu bilden, und c) Screenen der pMHC-Molekülkomplexe auf TCR-Bindung unter Verwendung des vorgewählten TCR. In einem weiteren Schritt werden die Aminosäuresequenzen dieser Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, bestimmt und gegebenenfalls und vorzugsweise verglichen, was zur Identifizierung des spezifischen Aminosäurebindungsmotivs für den vorgewählten TCR führt.
  • Eine weitere Ausführungsform umfasst eine Mutagenese einer bestimmten Aminosäuresequenz nach deren Identifizierung und das Kontaktieren der mutierten Peptide mit einem entsprechend stabilisierten MHC-Molekül und das Screening der pMHC-Molekülkomplexe auf TCR-Bindung mit einem vorgewählten TCR, um ein Aminosäure-Bindungsmotiv für den vorgewählten TCR zu erhalten. Die Mutagenese von Peptiden kann leicht durchgeführt werden, z. B. durch die Synthese von mutierten Peptiden oder die chemische Modifikation bestehender Aminosäuren in entsprechenden Peptidbindern. Die Mutagenese kann auch das Hinzufügen von Markern oder anderen Gruppen zu den Peptiden beinhalten, um diagnostisch wirksame Bindemittel zu identifizieren. Dieser Aspekt bezieht sich auf das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorliegend beschrieben, wobei die Verfahrensschritte wiederholt werden, umfassend einen Pool von Peptiden, bestehend aus modifizierten Aminosäuresequenzen für die vorgewählte TCR, wie identifiziert. Die Modifikation kann außerdem durch einen der bekannten Computeralgorithmen und/oder Programme gesteuert werden, mit denen verbesserte Bindungsparameter basierend auf Modifikationen der Aminosäuresequenz(en) berechnet werden.
  • Ein Beispiel dafür ist das Screening einer pMHC-Komplexbibliothek, welche auf diese Weise erzeugten Peptiden umfasst, gegen eine vorgewählte TCR für TCR-Bindung durch Bio-Layer-Interferometrie (BLI), wie in diesem Kontext offenbart, wobei Bindungsinteraktionen für die TCR stärker als ein für das Verfahren von Kd 1,0 × 10-5 geeigneter Empfindlichkeitsschwellenwert mit gemessenen Kd-Werten im Bereich von 3,7 × 10-9 M bis 7,2 × 10-6 erfasst wurden, oder es wurden keine Bindungsinteraktionen für die TCR festgestellt, wenn diese schwächer als der Empfindlichkeitsschwellenwert sind. In dieser Ausführungsform zeigt die vorliegende Erfindung eine besondere Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren, da die Erzeugung von pMHC-Komplexen mit einem entsprechend stabilisierten MHC-Molekül vorhersagbare Mengen an pMHC erzeugt und damit die Kd-Messgenauigkeit im Vergleich zu bestehenden Verfahren erhöht. ( ).
  • In einer weiteren Ausführungsform besteht die Vielzahl von Peptidliganden größtenteils aus bekannten Peptidliganden aus dem Immunopeptidom, wie sie z. B. durch Massenspektrometrie identifiziert werden, wobei ein vorgewählter TCR auf TCR-Bindung geprüft wird, um vorhandene kreuzreaktive Peptidliganden für den TCR direkt zu identifizieren. Bevorzugt wird das Verfahren nach dieser Ausführungsform, wo die Anzahl der verschiedenen Peptide mindestens etwa 1.500 verschiedene MHC-bindende Peptide, vorzugsweise mindestens etwa 5.000 verschiedene MHC-bindende Peptide, umfasst, die parallel gemessen werden.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR, umfassend die Durchführung des Verfahrens zum Nachweis oder zur Erzeugung eines spezifischen Aminosäurebindungsmotivs für einen TCR, wie im vorliegenden Kontext beschrieben, und den zusätzlichen Schritt zum Bestimmen und Vergleichen der Aminosäuresequenzen jener Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird. Dieser Aspekt weist Varianten eines Peptids nach, die von einem einzigen TCR erkannt werden.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR, umfassend das Durchführen des Verfahrens zum Screening eines TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexes für die TCR-Bindung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie im vorliegenden Kontext beschrieben, umfassend einen vorgewählten TCR, und dem zusätzlichen Schritt zum Bestimmen und Vergleichen der Aminosäuresequenzen jener Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird. Dieser Aspekt erkennt auch Varianten eines Peptids, die von einem einzigen TCR erkannt werden.
  • Ein Beispiel dafür ist die Identifizierung eines kreuzreaktiven Peptidliganden basierend auf dem Aminosäurebindungsmotiv, der zuvor durch Screening eines vorgewählten TCR für die TCR-Bindung mit einer von Mutagenese abgeleiteten pMHC-Komplexbibliothek gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde, und die Suche nach einem passenden Peptidliganden in einer Datenbank mit bekannten oder angenommenen Peptidliganden.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexes, umfassend das Durchführen des Verfahrens zum Screenen nach einem TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex für die TCR-Bindung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie im vorliegenden Kontext beschrieben, umfassend ein vorgewähltes pMHC, und den zusätzlichen Schritt zur Identifizierung derjenigen TCRs, für die eine pMHC-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird. Dieser Aspekt erkennt Varianten von TCRs, die ein einzelnes Peptid erkennen.
  • In diesen Aspekten können die gleichen Verfahren zum Nachweis einer Bindung eines pMHC mit einem vorgewählten TCR, wie oben beschrieben, verwendet werden. Da die TCR-Bindung jedoch nicht unbedingt spezifisch sein muss, müssen der Cut-off-Wert und die Sensitivität für die Messung und Bewertung der Bindung nicht optimal sein und sollten unter den jeweiligen Umständen als am besten geeignet gewählt werden, was für den Fachmann verständlich ist.
  • In einem weiteren wichtigen Aspekt der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die Verfahren ferner den Schritt des Messens der T-Zell-Aktivierung, umfassend einen TCR und einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekül-Komplex, der den TCR bindet. Verfahren zum Nachweis einer solchen T-Zell-Aktivierung durch eine Bindung, insbesondere eine „spezifische“ Bindung eines pMHC an einen TCR, sind in der Technik bekannt. In der vorliegenden Erfindung wurden beispielsweise Co-Inkubations-Assays mit peptidbeladenen Zielzellen, Jurkat-Effektorzellen und bs-868Z11-CD3 in sechs verschiedenen Konzentrationen durchgeführt, und eine Korrelation der gemessenen Affinität für die Peptidliganden aus der Positionsscanning-Bibliothek mit der niedrigsten bsTCR-Konzentration, die notwendig ist, um eine 3-fache Lumineszenzerhöhung über dem Hintergrund zu induzieren, wurde als Cut-off genommen.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich dann auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein entsprechend stabilisiertes MHC-Molekül umfasst, wobei das MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I umfasst, und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Beta1-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II, wobei das stabilisierte MHC-Molekül an ein Bead, ein Filament, einen Nanopartikel oder einen anderen geeigneten Träger gebunden ist. Die Zusammensetzung umfasst ferner geeignete Puffer und/oder Hilfsstoffe. Vorzugsweise kann die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung weiterhin eine oder eine Kombination aus mehreren und/oder einer chronologischen Sequenz dieser kostimulatorischen Moleküle umfassen, wie beispielsweise einen Anti-CD28- oder Anti-41BB-Antikörper.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich dann auf die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren gemäß der Erfindung wie vorliegend beschrieben.
  • Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich dann auf ein Verfahren zur verbesserten personalisierten Identifizierung von T-Zell-Rezeptoren oder der Aktivierung von T-Zellen und/oder T-Zell-Therapeutika gegen proliferative Krankheiten wie Krebs durch Stimulation mit pMHC-Komplexen zur Herstellung von zellulären Arzneimitteln für einen bestimmten Patienten. Eine solche Stimulation kann auf pMHC-Komplexen basieren, die mit Peptiden beladen sind, die durch Erhalten/Bereitstellen einer Probe von Krebsgewebe und/oder Krebszellen von dem Patienten identifiziert wurden, Bereitstellen einer Probe von normalem Gewebe und/oder Zellen von dem Patienten, Nachweisen von Peptiden, wie sie im Kontext von MHC in der/den Probe(n) unter Verwendung des XPRESIDENT® oder eines vergleichbaren Verfahrens dargestellt werden, und Bestimmen der Sequenz(en) von mindestens einem der Peptide, optional, Nachweisen der Expression der zugrundeliegenden Gene der Peptide, wie bestimmt, Nachweisen des MHC-Präsentationsniveaus/Anzahl der Peptide, wie sie in der/den Probe(n) nachgewiesen werden, wahlweise Vergleichen des MHC-Präsentationsniveaus/Anzahl der Peptide, wie sie in dem Tumor und normalen Gewebe- und/oder Zellproben nachgewiesen werden, Durchsuchen nach einem optimierten TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex, umfassend ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Die T-Zellen beinhalten diejenigen, die direkt von dem Patienten gewonnen wurden und die nach der Stimulation als zelluläres Arzneimittel wieder verabreicht werden können. Diese Stimulation kann die Verwendung von vorproduzierten Stimulationsrahmen beinhalten, die durch Immobilisierung eines geeignet stabilisierten MHC-Moleküls, vorzugsweise unter klinischen Qualitätsbedingungen (z. B. GMP), auf einen Träger, zum Beispiel Filamente oder Beads, hergestellt werden, die dann bei Bedarf mit Peptid beladen werden, zum Beispiel direkt an der klinischen Site. Diese Stimulationsrahmen können auch andere kostimulatorische Moleküle (z. B. Anti-CD28-Antikörper, Anti 41BB-Antikörper) beinhalten, die zusammen mit dem entsprechend stabilisierten MHC-Molekül immobilisiert sind.
  • In einem bevorzugten Aspekt des obigen Verfahrens ist das Peptid, z. B. ein Peptid, das für eine bestimmte Art von Krebs oder eine andere Art von proliferativer Erkrankung spezifisch ist, der Einheit, die das Verfahren durch vorherige Identifizierung bei einem anderen Patienten oder Patienten durchführt, bereits bekannt. Das Peptid kann somit schnell ausgewählt und für einen anderen Patienten mit der gleichen Krebsart produziert werden, auf das Stimulationsframework geladen und zur Herstellung eines zellulären Arzneimittels verwendet werden.
  • In einem bevorzugten Aspekt des obigen Verfahrens umfasst der Prozess der Aktivierung von T-Zellen und/oder T-Zell-Therapeutika, die direkt von dem Patienten gewonnen werden, auch das Transduzieren der T-Zellen, um einen tumorspezifischen exogenen T-Zell-Rezeptor (TCR) zu exprimieren, und optional die geeignete Formulierung des resultierenden T-Zell-Therapeutikums.
  • Der Begriff „T-Zelle“ bezieht sich auf T-Lymphozyten im Sinne des Stands der Technik und soll rekombinante T-Zellen umfassen. Wie im vorliegenden Kontext verwendet, beziehen sich die Begriffe „T-Zell-Rezeptor“ und „TCR“ auf ein Molekül, das sich auf der Oberfläche der T-Zelle befindet und für die Erkennung der Antigene verantwortlich ist, die an MHC-Moleküle binden, und üblicherweise auf ein Molekül, das ein Peptid erkennen kann, wenn es von einem MHC-Molekül präsentiert wird. Das Molekül ist ein Heterodimer mit α- und β-Ketten (oder selektiv γ -und δ-Ketten) oder ein TCR-Konstrukt, das Signale erzeugt. Der TCR der vorliegenden Erfindung ist ein hybrider TCR, der die von anderen Arten abgeleiteten Sequenzen beinhaltet. Da in menschlichen T-Zellen murine TCRs beispielsweise effektiver als menschliche TCRs exprimiert werden können, beinhaltet der TCR eine variable Region des Menschen und eine konstante Region der Maus. Der Begriff umfasst auch lösliche TCR-Moleküle und Derivate davon, sofern sie die für die Bindung erforderlichen komplementäritätsbestimmenden Regionen (CDRs) beinhalten.
  • Die XPRESIDENT®-Technologie wird unter anderem in WO 03/100432 , WO 2005/076009 und WO 2011/128448 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wurden.
  • In einem bevorzugten Aspekt des obigen Verfahrens umfasst die Entwicklung verbesserter personalisierter T-Zell-Rezeptoren, T-Zellen und/oder T-Zell-Therapeutika gegen proliferative Erkrankungen ferner die Umwandlung der autologen (eigenen) T-Zellen des Patienten, um einen tumorspezifischen exogenen T-Zell-Rezeptor (TCR) zu exprimieren, und optional die geeignete Formulierung des resultierenden T-Zell-Therapeutikums.
  • Die vorliegenden Erfinder zeigen, dass das disulfidmodifizierte Molekül HLA-A*02:01 als Beispiel leicht als stabiles und leeres MHC-Monomer erzeugt werden kann, das nach der Umfaltung mit Ligandenpeptiden beladen ist und zur Erzeugung von Affinitätsdaten in guter Übereinstimmung mit Daten verwendet wird, die mit Wildtyp pMHC-Komplexen gesammelt wurden.
  • Sowohl DS-A*02:01 als auch bispezifische TCRs können zusammen mit BLIbasierten Screenings verwendet werden, um pMHC-bsTCR-Bindungsaffinitäten zu messen, eine Plattform mit viel höherem Durchsatz als Oberflächenplasmonresonanzmessungen, die derzeit in der Literatur für diese Wechselwirkungen verwendet werden. Das Molekül DS-A*02:01 ist ein Schlüsselelement dieser Plattform und bietet eine zuverlässige und dennoch hochdurchlässige pMHC-Generation. Diese Plattform könnte auch für die Analyse anderer Biologika nützlich sein, wenn sie auf pMHCs abzielen, wie monoklonale Antikörper oder Bispezifika (z. B. BITEs). Die pMHC-bsTCR-Bindungsaffinitäten korrelierten gut mit zellulären Assays, wenn beide von den Erfindern mit einem funktionellen bispezifischen T-Zell-Engager durchgeführt wurden. Nach Kenntnis der Erfinder ist dies die erste eingehende Analyse des Zusammenhangs zwischen der pMHC-bsTCR-Bindungsaffinität und der in vitro-Aktivität über ein breites Spektrum von Affinitäten. Im Vergleich zu den zellulären Screenings war die AffinitätsScreening-Plattform einfacher zu bedienen und deutlich schneller durchzuführen und qualifizierte sich daher als Früherkennungsinstrument. Aufgrund der Fähigkeit des DS-A*02:01-Konstrukts, selbst niedrigaffine Peptidliganden als pMHC-Komplexe vorhersagbar darzustellen, können die Erfinder pMHC-bsTCR-Bindungsaffinitäten präzise messen, ohne Variationen bei exogenen Peptidladungsansätzen berücksichtigen zu müssen, was zu keinem Verlust potenziell wertvoller Informationen führt. Die Erfinder glauben, dass die einfache Handhabung der vorgestellten Affinitätsanalyseplattform die Entwicklung sicherer und effektiver bispezifischer Moleküle auf Basis des T-Zell-Rezeptors von Anfang an unterstützen wird.
  • Als Beispiel zeigen die Erfinder, dass es möglich ist, schnell pMHC-bsTCR-bindende Affinitätsdatensätze zu generieren und daraus reaktionsübergreifende Suchmotive zu extrapolieren. Unter der Leitung der Erfinder der HLA-Peptidomik-basierten XPRESIDENT-Plattform können mit den Suchmotiven potenziell kreuzreaktive Peptidliganden identifiziert werden. In der vorgestellten Ausführung dieser Strategie konnten die Erfinder eine große Anzahl von Peptiden identifizieren, die vom bsTCR stark erkannt wurden und in der Lage waren, die Aktivierung von T-Zellen zu induzieren, wobei der Sequenzkonsens im Vergleich zum ursprünglichen Ziel nur eine von neun Positionen betrug.
  • Diese spannende innovative Technologie könnte sogar zu Screening des gesamten entdeckten Immunopeptidoms führen: pMHC-Bibliotheken solcher Dimensionen sind derzeit nur über Hefedarstellung mit zufällig mutierten einkettigen Peptid-MHC-Bibliotheken verfügbar (32, 33). Obwohl sie für eine breite TCR-Analyse nützlich sind, sind sie im Gebrauch weitaus komplizierter und haben eine weniger vorhersagbare Peptidligandenzusammensetzung als die Peptid-Mikroarrays, die typischerweise in der Antikörperentwicklung verwendet werden. Aufgrund seiner Stabilität und des aufwandsarmen Peptidladeprozesses kann das Molekül DS-A*02:01 die ideale Lösung für die Herstellung von pMHC-Mikroarrays mit hoher Komplexität in der Zukunft sein, z. B. durch die Kombination von großflächiger Beschichtung leerer MHCs und dem hohen Durchsatz moderner Peptidmikroarray-Inkjetdrucker.
  • Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I präsentieren kurze Peptidliganden auf der Zelloberfläche zur Erkennung durch zytotoxische CD8+ T-Zellen. MHC-Klasse-I-Komplexe mit tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs) sind Schlüsselziele von Krebsimmuntherapieansätzen, die sich derzeit in der Entwicklung befinden und daher sowohl für die Wirksamkeit als auch für Sicherheitsscreenings wichtig sind. Ohne Peptidliganden sind MHC-Klasse-I-Komplexe instabil und zerfallen schnell, was die Produktion von löslichen Monomeren für analytische Zwecke arbeitsintensiv macht. Die Erfinder haben ein disulfidbindungsstabilisiertes HLA-A*02:01 -Molekül entwickelt, das ohne Peptid stabil ist, aber innerhalb weniger Minuten Peptid-MHC-Komplexe mit Liganden der Wahl bilden kann. Die Erfinder veranschaulichen die Übereinstimmung zwischen der modifizierten Mutante und der Wildtypvariante in Bezug auf die Bindungsaffinität von Wildtyp- oder gereiften hochaffinen TCRs. Die Erfinder demonstrieren ihr Potenzial als Analyt in Hochdurchsatz-Affinitätsscreening von bispezifischen TCR-Molekülen und erzeugen ein umfassendes TCR-Bindungsmotiv zur Identifizierung von Off-Target-Interaktionen.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Erfindung auf die folgenden Punkte bezieht.
    • Gegenstand 1. Verfahren zum Screening nach einem TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekülkomplex umfassend die Schritte: a) das Bereitstellen eines entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls, wobei das MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I umfasst, und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Beta1-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II, b) Kontaktieren des entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls mit einer Vielzahl von Peptidliganden davon, um Peptidliganden/MHC (pMHC)-Molekülkomplexe zu bilden, und c) Screenen der pMHC-Molekülkomplexe auf TCR-Bindung.
    • Gegenstand 2. Verfahren nach Gegenstand 1, wobei das MHC-Molekül HLA oder ein Multimer von HLA, MHC I oder MHC II ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Dimer, einem Trimer und einem Tetramer.
    • Gegenstand 3. Verfahren nach Gegenstand 1 oder 2, wobei die mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren ausgewählt ist aus einer rekombinant eingeführten Disulfidbrücke, der Einführung von nicht-natürlichen zu kreuzvernetzenden Aminosäuren, der Einführung von photovernetzenden Aminosäuren und chemisch eingeführten Kreuzvernetzungen.
    • Gegenstand 4. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei die mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren zwischen α-Helices eingebracht wird, beispielsweise durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen von MHC I.
    • Gegenstand 5. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 4, wobei die Vielzahl von Peptidliganden mindestens etwa 1.500 verschiedene MHC-bindende Peptide, vorzugsweise mindestens etwa 5.000 verschiedene MHC-bindende Peptide, mehr bevorzugt mindestens etwa 15.000 verschiedene MHC-bindende Peptide und am meisten bevorzugt ein Immunopeptidompräparat mit mindestens etwa 150.000 MHC-bindenden Peptiden umfasst.
    • Gegenstand 6. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 5, wobei das Kontaktieren das Beladen der MHC-bindenden Peptide bei einer Temperatur zwischen etwa 4°C und 30°C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur, umfasst.
    • Gegenstand 7. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 6, wobei die geladenen HLA/Peptidmoleküle mehr als etwa 1 Tag und vorzugsweise mehr als 1 Woche bei etwa 4°C stabil sind.
    • Gegenstand 8. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 7, wobei das Sensitivitätsniveau für das Affinitätsscreening eines TCR für die Bindung an pMHC-Komplexe höher als etwa Kd 1,0 × 10-9, vorzugsweise höher als etwa Kd 1,0 × 10-6 und bevorzugter höher als etwa Kd 1,0 × 10-3 ist.
    • Gegenstand 9. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 8, wobei der TCR ausgewählt ist aus einem nativen TCR, einem löslichen TCR-Molekül und einem TCR-ähnlichen Molekül, wie beispielsweise einem bs TCR.
    • Gegenstand 10. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 9, wobei entweder das TCR- oder das MHC-Molekül auf einer festen Oberfläche, wie beispielsweise einem Chip, Biosensor, Glasträger oder einem Bead, geeignet immobilisiert wird.
    • Gegenstand 11. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 10, wobei der TCR und/oder das MHC-Molekül label- und/oder markierungsfrei ist/sind.
    • Gegenstand 12. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 11, wobei das Verfahren als Hochdurchsatz-Screening-Format durchgeführt wird.
    • Gegenstand 13. Verfahren zum Nachweis oder zur Erzeugung eines spezifischen Aminosäurebindungsmotivs für einen TCR zur Verfügung, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Gegenstände 1 bis 12, umfassend einen vorgewählten TCR, und den zusätzlichen Schritt zum Bestimmen und Vergleichen der Aminosäuresequenzen jener Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch das spezifische Aminosäurebindungsmotiv für den vorgewählten TCR identifiziert wird.
    • Gegenstand 14. Verfahren nach Gegenstand 13, wobei die Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexe in parallelen Assayreaktionen mit unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden.
    • Gegenstand 15. Verfahren nach Gegenstand 13 oder 14, wobei die Verfahrensschritte wiederholt werden, umfassend einen Pool von Peptiden, bestehend aus modifizierten Aminosäurebindungsmotiven für den vorgewählten TCR, wie identifiziert.
    • Gegenstand 16. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach Gegenstand 15 und den zusätzlichen Schritt des Bestimmens und Vergleichens der Aminosäuresequenzen dieser Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird.
    • Gegenstand 17. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Gegenstände 1 bis 12, umfassend einen vorgewählten TCR und den zusätzlichen Schritt des Bestimmens und Vergleichens der Aminosäuresequenzen dieser Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird.
    • Gegenstand 18. Verfahren gemäß einem der Gegenstände 1 bis 17, ferner umfassend den Schritt des Messens der T-Zell-Aktivierung, umfassend einen TCR und einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekül-Komplex, der den TCR bindet.
    • Gegenstand 19. Verfahren zum Aktivieren und/oder Stimulieren und/oder Expandieren einer Zellpopulation (z. B. spezifische T-Zellpopulation) mit einem Peptidligand/MHC-Molekülkomplex, der ein Stimulationsframework trägt, wobei das Framework einen auf einem Träger immobilisierten Peptidligand/MHC-Molekülkomplex umfasst, z. B. Beads, Filamente, Nanopartikel oder beliebigen Träger, der diesen Komplex tragen kann, wobei ein entsprechend stabilisierter MHC-Komplex auf dem Träger immobilisiert werden kann und das Framework in einem solchen Zustand für eine längere Zeit vor der Zugabe des Peptidliganden gelagert wird, wodurch die Praktikabilität eines solchen Stimulationsframeworks, der Antigen-präsentierende Zellen in Forschung oder klinischer Praxis nachahmt, erheblich erhöht wird.
    • Gegenstand 20. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein entsprechend stabilisiertes MHC-Molekül umfasst, wobei das MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I umfasst, und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Beta1-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II, wobei das stabilisierte MHC-Molekül an ein Bead, ein Filament, einen Nanopartikel oder einen anderen geeigneten Träger gebunden ist.
    • Gegenstand 21. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Gegenstand 20, ferner umfassend ein oder eine Kombination von mehreren kostimulatorischen Molekülen und/oder eine chronologische Sequenz dieser kostimulatorischen Moleküle, wie zum Beispiel einen Anti-CD28-Antikörper oder einen Anti-41BB-Antikörper.
    • Gegenstand 22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Gegenstand 20 oder 21, wobei das stabilisierte MHC-Molekül für eine längere Zeit vor der Zugabe des Peptidliganden gelagert werden kann, z. B. bei Raumtemperatur oder 4°C.
    • Gegenstand 23. Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 20 bis 22 in einem Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 19.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun in den Beispielen unter Bezugnahme auf die begleitenden Abbildungen weiter beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt werden zu wollen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle zitierten Literaturquellen durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen. In den Abbildungen:
    • zeigt einen Überblick über die disulfidstabilisierte HLA-A*02:01-Produktion und den Einsatz für Affinitätsmessungen, (a) Expressionsplasmide der schweren Kette und β2m werden in E. coli transfiziert und Proteine von Interesse in Einschlusskörpern exprimiert. HLA-Monomere werden unter Größenausschluss gereinigt. (b) Leere DS-A*02:01-Moleküle können durch Inkubation bei Raumtemperatur mit Peptidliganden beladen werden. Für Affinitätsmessungen werden sie auf funktionalisierten Biosensoren immobilisiert, z. B. durch Biotin-Streptavidin-Interaktion, und zur Erfassung der Assoziation und Dissoziation von TCRs oder TCR-ähnlichen Molekülen verwendet.
    • zeigt das Assoziations- und Dissoziationsverhalten von 1G4 TCR mit verschiedenen MHC-Monomeren. Rohdaten werden schwarz, Kurvenanpassungen rot dargestellt. Alle Messungen wurden als 1:2 Analytverdünnungsreihe ab 24 µM durchgeführt. (a) Bindungskurve des 1G4 TCR gegen immobilisiertes ESO 9V DS-A*02:01 pMHC. (b) Bindungskurve des 1G4 TCR gegen immobilisiertes ESO 9V WT-A*02:01 pMHC. (c) Bindungskurve des 1G4 TCR gegen immobilisiertes leeres DS-A*02:01. (d) Bindungskurve des 1G4 TCR gegen immobilisiertes SL9 DS-A*02:01 pMHC.
    • zeigt die Affinitäten der SV9-spezifischen bs-868Z11-CD3 bsTCR mit verschiedenen MHC-Monomeren und Peptidliganden. (a) Bindungskurve von bs-868Z11-CD3 gegen immobilisiertes SL9 DS-A*02:01 pMHC. Rohdaten werden schwarz, Kurvenanpassungen rot dargestellt. Gemessen mit einer 1:2 Analytverdünnungsreihe ab 500 nM. (b) Bindungskurve von bs-868Z11-CD3 gegen immobilisiertes SL9 WT-A*02:01 pMHC. Rohdaten werden schwarz, Kurvenanpassungen rot dargestellt. Gemessen mit einer 1:2 Analytverdünnungsreihe ab 500 nM. (c) Bindungskurve von bs-868Z11-CD3 gegen immobilisiertes leeres DS-A*02:01. Gemessen mit einer 1:2 Analytverdünnungsreihe ab 500 nM. (d) Korrelation zwischen Affinitäten, gemessen mit DS-A*02:01 pMHCs oder WT-A*02:01 pMHC-Komplexen, die mittels UV-Austausch erzeugt wurden. KDs wurden für 140 verschiedene Peptidliganden aufgezeichnet, die mit beiden Verfahren erzeugt und in aufeinander folgenden Experimenten mit guten Kurvenanpassungen gemessen wurden. KDs wurden mit 500 nM und 158 nM Analytenkonzentrationen gefittet. R2 ist der berechnete Korrelationskoeffizient, die gestrichelte Linie stellt das optimale Verhältnis dar.
    • zeigt das Bindungsmotiv von bs-868Z11-CD3, das unter Verwendung der mit DS-A*02:01 erzeugten mutierten Aminosäuresequenzbibliothek als löslicher Analyt und immobilisiertes bsTCR erzeugt wurde. Kds wurden mit Kurven von mindestens einer und mehr der Analytkonzentrationen der Erfinder mit mindestens einem Peak-Signal von 0,05 nm für die aufzunehmenden Kurven angepasst. Positionen ohne passende Kurven wurden ein Kd of 5 × 10-6 M zugeordnet. Gemessen mit einer 1 / 10
      Figure DE102018122546B3_0002
      Analytverdünnungsreihe ab 500 nM. (a) Wärmekarte der Affinitäten in Abhängigkeit von der eingeführten Aminosäure und der ausgetauschten Position in der Peptidsequenz. Rote Felder zeigen starke, gelbe mittlere und grüne schwache Bindungsaffinitäten an. Weiße Quadrate zeigen eine Aminosäure des Wildtyp-Peptids an. (b) Visualisierung des Bindungsmotivs als Seq2logo-Grafik. Die Größe der einzelnen Buchstaben stellt umgekehrt die gemessene Affinität für die jeweilige Aminosäure an dieser Stelle dar, berechnet aus dem inversen Ko-Wert dividiert durch 108 und dem PSSM-Logo-Algorithmus. (c) Bindungskurve von bs-868Z11-CD3 bsTCR gegenüber ALYNVLAKV (SEQ ID NO:1) geladen DS-A*02:01 pMHC. Gemessen mit einer 1:2 Analytverdünnungsreihe ab 500 nM. Rohdaten werden schwarz, Kurvenanpassungen rot dargestellt.
    • zeigt das Ergebnis von Koinkubationsassays mit peptidgeladenen Zielzellen, Jurkat-Effektorzellen und bs-868Z11-CD3 in sechs verschiedenen Konzentrationen, (a) Gemessene fache-Induktion über dem Hintergrund für Jurkat-Zellen, die in verschiedenen Konzentrationen von bs-868Z11-CD3 in Gegenwart von SL9 Wildtyp-Peptid-geladenen T2-Zielzellen stimuliert wurden. (b) Korrelation der gemessenen Affinität für die Peptidliganden aus der Positionsscan-Bibliothek mit der niedrigsten bsTCR-Konzentration, die erforderlich ist, um eine 3-fache Lumineszenzerhöhung über dem Hintergrund zu induzieren. Peptide werden je nach Ort des Austausches in der Wildtyp-Sequenz in 9 verschiedene Gruppen eingeteilt und entsprechend gefärbt. (c) Korrelation der gemessenen Affinität für die Peptidliganden aus der Positionsscan-Bibliothek mit ihrem von NetMHC vorhergesagten pMHC-Bindungsrang. Peptide werden in 6 verschiedene Gruppen eingeteilt, abhängig von der niedrigsten bsTCR-Konzentration, die notwendig ist, um eine 3-fache Lumineszenzerhöhung über dem Hintergrund zu induzieren. (d) Korrelation der gemessenen Affinitäten für die kreuzreaktiven Peptidligandenkandidaten mit der niedrigsten bsTCR-Konzentration, die erforderlich ist, um eine 3-fache Lumineszenzerhöhung über dem Hintergrund zu induzieren, (e) Gemessene fache-Induktion über dem Hintergrund für Jurkat-Zellen, die in verschiedenen Konzentrationen von bs-868Z11-CD3 in Gegenwart von mit Peptid ALYNVLAKV (SEQ ID NO: 1) beladenen T2-Zielzellen stimuliert wurden.
    • zeigt den Vergleich von DS-A*02:01 oder UV-Austausch erzeugten WT-A*02:01 pMHC-Komplexen als lösliche Analyten für Affinitätsmessungen mit immobilisiertem bs-868Z11-CD3. DS-A*02:01 Komplexe sind links, WT-A*02:01 Komplexe sind rechts. Alle Messungen wurden als 1:2 Analytverdünnungsreihe ab 500 nM durchgeführt. Rohdaten werden schwarz, Kurvenanpassungen rot dargestellt.
  • SEQ ID NOs 1 bis 5 zeigen Peptidsequenzen, wie sie in den Beispielen unten verwendet werden.
  • Beispiele
  • Synthese der Peptide
  • Alle Peptide wurden firmenintern unter Verwendung der Standard-Fmoc-Chemie mit einem Syro II Peptidsynthesizer erzeugt. Die Peptide wurden anschließend mittels HPLC analysiert und wiesen eine durchschnittliche Reinheit von 74% auf. UV-lichtempfindliche Peptide enthielten einen lichtempfindlichen Baustein mit einem 2-Nitrophenylaminorest. Das Dipeptid GM wurde von Bachem bezogen. Vor dem Einsatz wurden die Peptide in DMSO gelöst (Sigma, Cat. Nr. 41640), 0,5% TFA (Sigma, Kat.Nr. T6508) bei Konzentrationen von 2 mg/ml bis 10 mg/ml, je nach gewünschtem Anwendungsfall.
  • Erzeugung von MHC-Komplexen durch Rückfaltung und Reinigung
  • Rekombinante HLA-A*02:01 Wildtyp (WT-A*02:01) oder die schwere Kette HLA-A*02:01 Disulfidmutante (DS-A*02:01) mit C-terminalen BirA-Signalsequenzen und humanen β2m leichten Ketten wurden in Escherichia coli als Einschlusskörper hergestellt und wie zuvor beschrieben gereinigt (2). Rückfaltungsreaktionen für HLA-A*02:01-Komplexe wurden wie zuvor beschrieben mit geringen Modifikationen durchgeführt (Saini et al 2013). Kurz gesagt, WT-A*02:01 oder DS-A*02:01 schwere Kette, β2m leichte Kette und Peptid wurden in Rückfaltungspuffer verdünnt (100 mM Tris-Cl pH 8, 0,5 M Arginin, 2 mM EDTA, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 5 mM reduziertes Glutathion) und für 2 bis 8 Tage bei 4°C unter Rühren vor der Konzentration inkubiert. Das konzentrierte Protein wurde mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) in 20 mM Tris-HCI, pH 8/150 mM NaCl auf einem ÄKTAprime-System (GE Healthcare) mit einer HiLoad 26/600 200 pg Säule (GE Healthcare) gereinigt. Die Peakfraktion wurde entweder direkt auf 2000 µg/ml konzentriert, aliquotiert und bei -80°C gefroren oder von BirA Biotin-Protein-Ligase (Avidität) über Nacht bei 4°C nach Herstellerangaben biotinyliert und einer zweiten Gelfiltration vor der Endkonzentration auf 2000 µg/ml, Aliquotierung und Lagerung bei -80°C unterzogen.
  • Zur Herstellung von Wildtyp HLA-A*02:01 Peptid-MHC-Komplexen wurden Volllängenpeptide oder UV-lichtempfindliche Volllängenpeptide in einer Konzentration von 30 µM dem Rückfaltungspuffer zugesetzt. Um leere DS-A*02:01-Komplexe herzustellen, wurde das Dipeptid GM dem Rückfaltungspuffer in einer Konzentration von 10mM zugesetzt.
  • Erzeugung von peptidgetauschten HLA-A*02:01 pMHC-Komplexen unter Verwendung von UV-vermitteltem Peptidligandenaustausch oder leeren DS-A*02:01-Komplexen.
  • Peptidaustauschreaktionen mit UV-lichtspaltbaren Peptiden wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Zusammenfassend wurden Nonamer-Peptide mit biotinylierten UV-lichtempfindlichen pMHC-Komplexen im Molverhältnis von 100 zu 1 gemischt und mindestens 30 Minuten UV-Licht (Camag) mit Wellenlänge 366 nm ausgesetzt.
  • Peptidladereaktionen mit leeren DS-A*02:01 MHC-Komplexen wurden durch Zugabe und Vermischung der gewünschten Peptide mit einem Molverhältnis von mindestens 100 zu 1 zur Monomerlösung und 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Produktion löslicher TCRs
  • Lösliche TCRs wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (20). Zusammenfassend wurden TCR Alpha- und TCR Beta-Kettenkonstrukte in Escherichia coli als Einschlusskörper separat exprimiert und gereinigt. TCR-Alpha-Ketten sind an Position 48 mutiert, indem ein Threonin durch ein Cystein ersetzt wird und TCR-Beta-Ketten an Position 57, indem ein Serin durch ein Cystein ersetzt wird, um eine Disulfidbindung zwischen den Ketten zu bilden.
  • Design und Produktion von bsTCR
  • Das Molekül bs-868Z11-CD3 wurde durch Verknüpfen des scTv 868Z11 mit dem C-Terminus der F(ab')-Domäne eines humanisierten Anti-CD3-Antikörpers (22, 23) erzeugt. Zu diesem Zweck wurde die Vβ-Domäne des scTv direkt mit der oberen CH2-Region fusioniert, die vom menschlichen IgG2 abgeleitet ist (APPVAG, SEQ ID NO: 2). Die Cystein-Knock-Outs C226S und C229S im Gelenk verhindern die Bildung von F(ab)2 Molekülen. HCMV-getriebene Expressionsvektoren, die entweder für das vorstehend beschriebene Konstrukt oder die leichte Kette des humanisierten antiCD3-Antikörpers kodieren, wurden vorübergehend in ExpiCHO-Zellen (Thermo) cotransfiziert. Nach 12 Tagen wurde der Überstand mittels Tandemchromatographie (Protein L gefolgt von präparativem Größenausschluss, GE Biosciences) verarbeitet und hochreines monomeres bsTCR in PBS formuliert.
  • OctetRED-basierte kinetische Affinitätsmessungen anhand der Bio-Layer-Interferometrie
  • Die Affinität von sTCR- oder bsTCR-Molekülen für verschiedene pMHC-Komplexe wurde an einem OctetRED 384-System (Pall Fortebio) mittels kinetischer oder stationärer Bindungsanalyse gemessen. Alle Analyten oder Liganden wurden auf ihre Endkonzentration im Kinetik-Puffer (PBS, 0,1% BSA, 0,05% TWEEN 20) verdünnt, sofern nicht anders angegeben. Alle Biosensoren wurden vor dem Einsatz mindestens 10 Minuten im Kinetik-Puffer hydratisiert. Die Beladungen und Messungen wurden in 384 geneigten Wellplatten (Pall Fortebio) mit mindestens 40 µl bei einem Sensorversatz von 3 mm durchgeführt. Die Plattentemperatur wurde auf 25°C und die Schüttelgeschwindigkeit auf 1000 U/min eingestellt. Um eine stufenübergreifende Korrektur zu ermöglichen, wurden die Basislinien vor der Assoziationsphase und der folgenden Dissoziationsphase im gleichen Well durchgeführt. Der kinetische Puffer wurde als Dissoziationspuffer mit DMSO in einer geeigneten Konzentration verwendet, der gegebenenfalls hinzugefügt wurde, um der Analytzusammensetzung zu entsprechen.
  • Im Falle von pMHC Immobilisierung wurden dip und read Streptavidin- (SA; Pall Fortebio Cat. Nr. 18-5021) Biosensoren verwendet, um biotinylierte pMHC-Monomere bei einer angenommenen Konzentration von 25 µg/ml für 60 Sekunden zu immobilisieren, gefolgt von einer 60-Sekunden-Basislinie und Assoziations- und Dissoziationsphasen von jeweils 60 Sekunden, wenn nicht anders angegeben.
  • Im Falle von bsTCR Immobilisierung wurden dip und read anti-human Fab-CH1 2. Generation (FAB2G; Pall Fortebio Cat. Nr. 18-5127) Biosensoren verwendet, um bsTCR-Moleküle in einer Konzentration von 100 µg/ml für 60 Sekunden zu immobilisieren, gefolgt von einer 15-Sekunden-Basislinie und Assoziations- und Dissoziationsphasen von jeweils 60 Sekunden, wenn nicht anders angegeben. Der FAB2G-Biosensor wurde bis zu 4 Mal regeneriert, indem der beladene Biosensor für je 5 Sekunden in 10 mM Glycin pH1,5 und dem Kinetik-Puffer dreimal hintereinander inkubiert wurde. FAB2G wurden ebenfalls vor ihrer ersten Ligandenimmobilisierung vorkonditioniert.
  • Alle Sensorprogramme wurden mit der OctetRED-Software „Data Analysis HT“ Version 10.0.3.7 (Pall Fortebio) analysiert. Die Rohsensordaten wurden auf der Y-Achse ausgerichtet, indem die Daten auf das Ende des Basislinienschritts ausgerichtet wurden, und die Zwischenschrittkorrektur verwendet wurde, um den Beginn der Dissoziation auf das Ende der Zuordnungsphase auszurichten. Es wurde keine Savitzky-Golay-Filterung angewendet. Die resultierenden Sensorprogramme wurden dann mit einem 1:1 Langmuir-Kinetik-Bindungsmodell angepasst.
  • Zelllinien
  • Die TAP-defiziente HLA-A*02:01 exprimierende Zelllinie T2 wurde von ATCC (CRL-1992) bezogen und in RPMI Medium 1640 GlutaMAXTM (Thermo Fisher, Kat. Nr. 61870010), ergänzt durch 10% hitzeinaktiviertes FCS (Life Technologies, Kat. Nr. 10270106) und die Antibiotika Penicillin und Streptomycin (Biozym, Kat. Nr. 882082, je 100 µg ml-1), bis zu 16 Zyklen (Passagen), falls erforderlich, kultiviert.
  • Die GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat-Zelllinie wurde von Promega (Kat. Nr. CS1764) bei dem Zyklus Nr. 6 beschafft und in RPMI Medium 1640 GlutaMAX™ (Thermo Fisher, Kat. Nr. 61870010), ergänzt durch 10% hitzeinaktivierte FCS (Life Technologies, Kat. Nr. 10270106), 1% Natriumpyruvat (C.C.Pro, Kat. Nr. Z-20M) und die Antibiotika Hygromycin B (Merck Millipore, Kat. Nr. 400052, 200 µg/ml), Penicillin und Streptomycin (Biozym, Kat. Nr. 882082, je 100 µg/ml) bis zum Zyklus 14, falls erforderlich, kultiviert.
  • T-Zell-Aktivierungsassay
  • T-Zell-Aktivierungsassays mit GloResponse™ NFAT-luc2 Jurkat-Zellen und peptidbeladenen T2-Zielzellen wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Zusammenfassend wurden T2-Zellen aus einer kontinuierlichen Zellkultur gewonnen, gewaschen und in T2-Kulturmedium in einer Konzentration von 3,3 × 106 Zellen/ml resuspendiert und auf 96 Well-Rundbodenplatten übertragen (Corning costar®, Kat. Nr. 3799). Peptid in DMSO, 0,5% TFA wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 nM zugesetzt und die Suspension 2 bis 3 Stunden bei 37°C inkubiert, 5% CO2.
  • bsTCR, formuliert in PBS, wurde in T2-Kulturmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnt und 25 µl der jeweiligen Verdünnung auf weiße 96 Well-Flachbodenplatten (Brand, Cat. Nr. 781965) verteilt.
  • GloResponse™ NFAT-luc2 Jurkat-Zellen wurden aus kontinuierlicher Zellkultur gewonnen, gewaschen und in T2-Kulturmedium in einer Konzentration von 3.0 × 106 Zellen ml-1 resuspendiert und 25 µl der Zellsuspension wurden auf die weißen 96 Well-Flachbodenplatten mit bsTCR-Verdünnungen verteilt.
  • Nach der Peptidladung wurden T2-Zellen resuspendiert und 25 µl auf die weißen 96 Well-Flachbodenplatten mit bsTCR-Verdünnungen und GloResponse™ NFAT-luc2 Jurkat-Zellen für ein Endverhältnis Effektor-Target von 1:1 (je 75.000 Zellen) verteilt. Vollständig montierte Platten wurden 5 Minuten lang bei 300 U/min auf einem Plattenrüttler gemischt und für 18 bis 20 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden 75 µl Bio-Glo™ Luciferase-Reagenz in jedes Well gegeben und die Platten minutenlang bei 300 U/min auf einem Plattenschüttler im Dunkeln inkubiert, bevor bei 0,5 Sekunden Integrationszeit mit einem Synergy2 Plattenleser (Biotek) die Lumineszenz abgelesen wurde. Die Lumineszenz, gemessen in relativen Lichteinheiten (RLU), wurde in eine Größenordnung (-fach) der Induktion für jedes Well umgewandelt, indem das gemessene RLU durch das von Kontrollwells dividiert wurde.
  • 9. Design und Herstellung von disulfidstabilisierten leeren HLA-A*02:01 Molekülen Molekulardynamische Simulationen von leeren und peptidbeladenen MHC-Klasse-I-Molekülen haben gezeigt, dass erstere eine erhöhte Mobilität in der F-Tasche aufweisen, die den C-Terminus des Peptidliganden aufnimmt (16). In früheren Studien mit dem murinen MHC-Klasse-I-Molekül H-2Kb konnte Einführung einer Disulfidbindung zwischen gegenüberliegenden Resten in der F-Tasche durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen den Komplex stabilisieren. Die Mutante konnte ohne Peptid wieder gefaltet werden und war in der Lage, rückwirkend Peptidbindungen vorzunehmen (17, 18).
  • Die Erfinder gingen davon aus, dass das gleiche Konzept auf das menschliche MHC-Klasse-I-Molekül HLA-A*02:01 angewendet werden könnte. Die Modifikationen wurden in ein HLA-A*02:01 Schwerketten-Expressionsplasmid eingebracht, welcher als Einschlusskörper in E. coli produziert und mit ähnlich produziertem β2m und dem Dipeptid GM inkubiert wurde ( . Dieses Dipeptid hat eine sehr geringe Affinität zum MHC-Klasse-I-Komplex und unterstützt die Rückfaltung19. Während der Größenausschlusschromatographie (SEC) löst es sich schnell von der Bindungstasche durch Pufferaustausch gegen den laufenden Puffer und ergibt gereinigtes leeres disulfidstabilisiertes HLA-A*02:01 (DS-A*02:01). Leere Wildtyp-A*02:01-Komplexe (WT-A*02:01) konnten nicht auf die gleiche Weise hergestellt werden.
  • Die Abwesenheit von GM im gereinigten Monomer konnte durch die Analyse der thermischen Stabilität nachgewiesen werden: Das leere DS-A*02:01-Molekül war weniger temperaturstabil als das gleiche Molekül, das noch mit GM komplexiert war.
  • Das resultierende Molekül wurde entweder über Nacht bei 4°C biotinyliert und durch einen zweiten SEC-Lauf vom überschüssigen Biotin getrennt oder direkt bei -80°C vor der Anwendung gelagert.
  • Ladungs- und Affinitätsmessungen von Peptiden unter Verwendung von löslichen TCRs und Wildtyp-MHCs oder disulfidmodifizierten MHCs
  • Anschließend bestimmten die Erfinder, ob das leere HLA-Molekül zur Bildung von Peptid-MHC-Komplex und TCR-Ligandenbindung in der Lage war. Die Affinitätsmessungen wurden mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI) an einem OctetRED 384 mit dem rückgefalteten TCR 1G4 als löslichem Analyten durchgeführt. Dieser TCR erkennt das HLA-A*02:01-spezifische Peptid SLLMWITQC (ESO 9C, SEQ ID NO: 3), das vom Cancer-Testis-Antigen NY-ESO-1 oder dessen synthetischer Variante SLLMWITQV (ESO 9V, SEQ ID NO: 4)(20,21) stammt. Biotinyliertes DS-A*02:01 wurde entweder direkt in seinem Leerzustand oder nach einer kurzen Inkubation mit dem Peptid ESO 9V auf streptavidinbeschichteten Biosensoren immobilisiert ( . Es konnten keine Unterschiede zwischen Peptidinkubationen von 5 Minuten, der minimalen Zeit, die benötigt wurde, um die Affinitätsmessungen nach dem Aufbau einzuleiten, oder länger festgestellt werden. Weitere Analysen zeigten, dass der volle Austausch tatsächlich innerhalb von ein bis zwei Minuten erreicht wurde, wenn hohe Peptidkonzentrationen verwendet wurden. Die Kinetik wurde über mehrere 1G4-Konzentrationen hinweg gemessen, und der Wildtyp HLA-A*02:01, der direkt mit ESO 9V rückgefaltet wurde, diente als Kontrolle.
  • Die 1G4 TCR-Bindung an DS-A*02:01 9V oder an WT-A*02:01 ESO 9V war in Bezug auf Sensorprogramme und KDs, die sich aus Kurvenanpassungen ergeben, sehr ähnlich ( und . Ein schwaches Bindungssignal (aber keine Dissoziation) konnte für das leere immobilisierte Monomer bei hohen Konzentrationen von 1G4 nachgewiesen werden ( ). Diese Bindung konnte verhindert werden, indem anschließend ein Peptid hinzugefügt wurde, das von 1G4 nicht erkannt wird, wie SLYNTVATL ( , SEQ ID NO: 5). Das schwache Signal, das mit leerem DS-A*02:01 erhalten wurde, könnte durch unspezifische Wechselwirkungen des TCR mit der leeren Bindungstasche erklärt werden, ein Zustand, der von TCRs in vivo typischerweise nicht eingenommen wird.
  • Korrelation zwischen DS-A*02:01 und WT-A*02:01 Affinitätsmessungen für eine affinitätsgereifte TCR
  • Nachdem die Erfinder die Verwendbarkeit des DS-A*02:01-Moleküls als Ligand äquivalent zu WT-A*02:01 für unmodifizierte TCRs etabliert hatten, wollten sie diese Analyse auf mutierte hochaffine TCRs und eine größere Anzahl von Peptidliganden ausweiten. Die Erfinder verwendeten den gereiften einkettigen TCR (scTv) 868Z11, eine affinitätsgereifte Variante eines TCR, die das von HIV p17 abgeleitete HLA-A*02:01-restringierte Peptid SLYNTVATL (SL9, SEQ ID NO: 5)(8, 22) erkennt.
  • Die Erfinder führten Affinitätsmessungen durch Immobilisierung von leeren oder mit SL9-Peptid-beladenen DS-A*02:01-Molekülen auf Streptavidin-Biosensoren und Messungen gegen lösliches bs-868Z11-CD3, eine bsTCR-Variante des 868Z11 scTv, die in Fusion mit einem humanisierten Anti-CD3-Antikörper exprimiert wurde (23). Die Bindungsaffinität für SL9 DS-A*02:01 pMHC war ähnlich wie beim SL9 WT-A*02:01 pMHC mit 2,35 nM bzw. 3,24 nM ( und b). Für dieses bsTCR war keine Bindung mit leeren MHC-Molekülen messbar ( ).
  • Anschließend analysierten die Erfinder bs-868Z11-CD3 Bindungsaffinitäten zu einer positionellen Scan-Bibliothek auf Basis der SL9-Peptidsequenz. Diese Bibliothek entstand durch den Austausch einer Aminosäure an einer Position des Wildtyp-SL9-Peptids gegen die 18 verbleibenden proteinogenen Aminosäuren unter Beibehaltung aller anderen Positionen, was zu 162 verschiedenen Peptiden führte, wenn sie an allen Positionen des Nonamers durchgeführt wurden (Cystein wurde wegen seiner Neigung zur Dimerisierung ausgeschlossen) (24). pMHC-Komplexe wurden von den Erfindern entweder durch Addition zu DS-A*02:01-Molekülen wie zuvor oder durch die Durchführung eines UV-Licht vermittelten Peptidligandenaustauschs erzeugt, einer Technologie, die auch zur schnellen pMHC-Komplexgenerierung fähig ist (25). Entsprechende pMHC-Komplexe wurden auf Streptavidin immobilisiert und Kinetik wurde bei zwei verschiedenen bs-868Z11-CD3-Konzentrationen gemessen. Wie erwartet, führte die Verwendung von alternativen Peptidliganden zu einer Vielzahl von verschiedenen KDs, die von nicht nachweisbar innerhalb der Sensitivitätsgrenzen des gewählten Aufbaus bis hin zu vergleichbar oder sogar stärker als die Interaktion mit dem unmodifizierten SL9-Peptid reichen.
  • Zum direkten Vergleich wurden alle gemessenen pMHC-Komplexe ausgewählt, die sowohl bei Analytkonzentrationen als auch bei Kurvenanpassungen mit R2-Werten von mindestens 0,9, repräsentativ für Signale innerhalb des ausgewählten KD-Empfindlichkeitsbereichs, auswertbaren Signalen hatten. Die Ko-Werte für die resultierenden 140 Peptidliganden waren über den gesamten Affinitätsbereich sehr ähnlich, wenn sie gegeneinander aufgetragen wurden, was durch den hohen Korrelationskoeffizientenwert unterstützt wird ( ). Die Diskrepanzen lagen bei über 90% der pMHC-Paare im 2-fachen Bereich und die Unterschiede betrugen höchstens 6,82-fache . Innerhalb der Gruppe mit mehr als 2-fachen Veränderungen wurde ein Trend zu einer größeren Dissoziationskonstante für Messungen mit dem Molekül DS-A*02:01 beobachtet.
  • Kinetisches Screening im Hochdurchsatz zur Bindung von Motiven
  • Die Verwendung von pMHC-Komplexen als lösliche Analyten anstelle von der Immobilisierung ist für schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screenings vorzuziehen, da eine Vielzahl von regenerierbaren Biosensoren zur reversiblen Immobilisierung von bispezifischen TCR-Konstrukten existiert. Diese Biosensoren sind typischerweise mit Antikörpern beschichtet und können mindestens 20 Mal für kinetische Messungen ohne Verlust der Auslesequalität eingesetzt werden.
  • Während der UV-vermittelte Peptid-Ligandenaustausch eine hohe Anzahl verschiedener pMHC-Komplexe erzeugen kann, variiert die Austausch-Effizienz je nach Peptid und seiner Affinität zur Bindung an das jeweilige MHC-Klasse-I-Allel, was zu unterschiedlichen pMHC-Konzentrationen in den Proben führt. Diese Unsicherheit ist ein Problem bei der Affinitätsmessung mit pMHCs, die als lösliche Analyten verwendet werden, da genaue Kenntnisse der Konzentration erforderlich sind, um genaue Affinitäten zu bestimmen.
  • Da die disulfidstabilisierte A*02:01-Mutante ohne Peptid stabil ist, gilt diese Einschränkung nicht. Werden die Peptide in einer Konzentration zugesetzt, die hoch genug ist, um die leeren MHC-Komplexe zu sättigen, ist die effektive Konzentration von pMHC bekannt, was die Genauigkeit der Messungen deutlich erhöht und falsche negative Ergebnisse vermeidet. Beispiele für dieses Verhalten konnten in der Positionsscan-Bibliothek gefunden werden, was zu schlechten Anpassungsdaten und einer Fehlberechnung der Affinität bei Verwendung von UV-Austauschpräparaten im Vergleich zu DS-A*02:01 Peptidbeladungen führte ( ) (26).
  • Durch die Immobilisierung des bs-868Z11-CD3 bsTCR konnten die Erfinder die Positionsscan-Bibliothek bei vier verschiedenen löslichen pMHC-Konzentrationen für jeden Peptidliganden im Bereich von 500 bis 15,8 nM innerhalb von 4 Stunden nach unbeaufsichtigter Messzeit bei einem 20-fach reduzierten Preis analysieren. Alle Kurven, die mindestens einen Signalpegel von 0,05 nm erreichten, wurden in die Anpassungen einbezogen, was zu einem umfassenden TCR-Bindungsmotiv führte ( .
  • Der 868Z11 TCR zeigte ein erwartetes Erkennungsmuster: Veränderungen der Aminosäuren zwischen den Positionen 3 bis 7 hatten den größten Einfluss auf die bsTCR-Bindungsaffinität. Interessanterweise führte nur eine Aminosäureänderung zu einer erhöhten Bindungsaffinität von bs-868Z11-CD3 im Vergleich zur Interaktion mit dem Wildtyp-Peptid, was die bemerkenswerte Affinität des TCR für das Ziel in seinem affinitätsgereiften Zustand zeigt. Dieses Verhalten kann auch grafisch veranschaulicht werden, wenn das Bindungsmotiv als Seq2Logo-Graph visualisiert wird ( .
  • Identifizierung von Peptidliganden, die mit bs-868Z11-CD3 kreuzreagieren
  • Die Erfinder wollten des Weiteren untersuchen, ob sie mit dem erzeugten Bindungsmotiv kreuzreaktive Peptidliganden aus dem menschlichen Genom identifizieren können. Die Erfinder schufen aus dem Affinitätsdatensatz ein Peptidliganden-Suchmotiv durch Einführung eines exemplarischen KD-Schwellenwerts von 50 nM: Alle einzelnen Aminosäuresubstitutionen, die den bs-868Z11-CD3 KD über diesen Schwellenwert hinaus erhöhen, wurden aus dem Motiv ausgeschlossen.
    Basierend auf diesem Motiv führten die Erfinder eine Suche in der NCBI humanen nicht-redundanten Protein-Sequenzdatenbank nach Nonamer-Sequenzen durch, die den vom Motiv erlaubten Kombinationen entsprachen. Die Suche identifizierte über 400 Treffer innerhalb des menschlichen Genoms mit Sequenzidentität zur Wildtyp-Sequenz SLYNTVAL im Bereich von 1 bis 6 identischen Positionen. 140 Peptide wurden ausgewählt, als repräsentativ für die Verteilung der Sequenzidentität in der größeren Gruppe getestet, synthetisiert und für Affinitätsmessungen verwendet. Die Erfinder konnten Bindungsaffinitäten von einstelligen µM KDs oder höher für 91 dieser Peptide erkennen.
  • Eines von ihnen, ALYNVLAKV (SEQ ID NO: 1), war besonders bemerkenswert. Es wurde als theoretisches Peptid ausgewählt, aber zusätzlich in Gewebeproben und Zelllinien gemäß der XPRESIDENT™-Immunopeptidomics-Datenbank gefunden. Diese Datenbank kombiniert quantitative HLA-Peptidomik auf der Grundlage der LC-MS-Analyse und quantitative Transkriptomik von RNAseq aus gesunden Geweben und Tumorgeweben, um Peptide zu identifizieren, die ausschließlich oder überwiegend auf Tumorgewebe präsentiert werden (28, 29). ALYNVLAKV, ein Antigen aus der Zwischenfilamentfamilie Orphan 1 oder 2 (IFFO1/2), wurde an mehreren gesunden Gewebe- und Tumorgewebeproben nachgewiesen, die von Kopf und Hals, Milz oder Niere bis hin zu nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom oder Nierenzellkarzinom reichen. Die pMHC-bsTCR Bindungsaffinität wurde mit einem KD von 65,9 nM gemessen ( ). Die Erfinder konnten ein zweites LC-MSdetektiertes Peptid, KTFNLIPAV (SEQ ID NO: 6), identifizieren, das auf drei Tumorgewebeproben mit einem niedrigeren KD von 413 nM nachgewiesen wurde.
  • Korrelation der bsTCR-Affinität mit der Aktivierung von T-Zellen
  • Die pMHC-bsTCR Bindungsaffinität kann mit dieser Hochdurchsatz-Screening-Plattform gemessen werden, sollte aber mit der in vitro-Aktivität konsistent sein, da funktionelle T-Zell-Interaktion mit bsTCR noch nützlicher ist. In der Regel werden in vitro Co-Inkubationen von Ziel- und Effektorzellen in Verbindung mit einem geeigneten Messwert verwendet, um diese Konstrukte zu charakterisieren. GloResponse™ NFAT-luc2 Jurkat Effektorzellen, eine Zelllinie, die ein Luciferase-Reportergen exprimiert, das von einem NFAT-Response-Element gesteuert wird, und peptidbeladene T2-Zielzellen, eine TAP-defiziente A*02:01-Zelllinie mit wiederherstellbarer pMHC-Präsentation durch exogene Peptidladung wurden in Gegenwart von bs-868Z11-CD3 inkubiert, um die Bedeutung des kinetischen Screenings in diesem Zusammenhang zu bestätigen.
  • T2-Zellen wurden separat mit entsprechenden Peptiden aus der Positionsscan-Bibliothek bei einer Konzentration von 100 nM beladen und anschließend 18 Stunden lang vor dem Auslesen mit Jurkats und verschiedenen bsTCR-Konzentrationen koinkubiert. Wie erwartet stießen die Erfinder auf ein breites Spektrum von Ergebnissen, das von einer nicht nachweisbaren T-Zell-Aktivierung bei jeder bsTCR-Konzentration bis hin zu starken Reaktionen ab niedrigen Konzentrationen, z. B. für das Wildtyp-Peptid, reichte ( .
  • Da für viele der Wechselwirkungen im ausgewählten bsTCR-Konzentrationsbereich keine EC50-Werte bestimmt werden konnten, kategorisierten die Erfinder die einzelnen Peptide durch Beginn der T-Zell-Aktivierung, definiert als die niedrigste bsTCR-Konzentration, die in der Lage war, ein 3-fach erhöhtes Signal darüber zu induzieren. Die Anfangswerte wurden gegen die jeweils gemessenen KDs aufgetragen ( .
  • Insgesamt entdeckten die Erfinder eine gute Korrelation zwischen den ermittelten KD-Werten und der T-Zell-Aktivierung mit einer bemerkenswerten Gruppe von Sonderfällen mit starken pMHC-bsTCR-Bindungsaffinitäten, aber spätem Beginn oder gar keiner Aktivierung. Die Erfinder konnten eine direkte Verbindung zwischen diesen Peptiden und ihrer von NetMHC vorhergesagten Bindungsstärke zum MHC identifizieren ( )(26). pMHC-bsTCR Bindungsaffinität korrelierte gut mit dem Beginn der T-Zell-Aktivierung für Peptidliganden zwischen NetMHC Rang 0,05 und 2, während über diesem Schwellenwert die T-Zell-Aktivierung mit weiter zunehmenden NetMHC-Rängen weitgehend unabhängig von der pMHC-bsTCR Bindungsaffinität abnahm.
  • Die Erfinder führten auch T-Zell-Aktivierungstests für die 140 Peptidliganden durch, die durch Bindungsmotivsuche ausgewählt wurden, 24 waren in der Lage, eine 3-fache T-Zell-Aktivierung über dem Hintergrund mit mindestens einer der gelieferten bsTCR-Konzentrationen zu induzieren ( ). Gemessene KDs korrelierten mit dem Beginn der T-Zell-Aktivierung ähnlich wie die bei der Positionsscan-Bibliothek erhaltenen Ergebnisse. Das zuvor hervorgehobene IFFO1-Antigen ALYNVLAKV (SEQ ID NO: 1) reagierte auch im Reporterassay ( .
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Claims (12)

  1. Verfahren zum Screenen für einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekül-Komplex, umfassend die Schritte: a) das Bereitstellen eines entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls, wobei das MHC-Molekül mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alphal-Domäne und Aminosäuren der Alpha2-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC I umfasst, und mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren der Alpha1-Domäne und Aminosäuren der Betal-Domäne des stabilisierten MHC-Moleküls im Falle von MHC II umfasst, b) Kontaktieren des entsprechend stabilisierten MHC-Moleküls mit einer Vielzahl von Peptidliganden davon, um Peptidliganden/MHC (pMHC)-Molekülkomplexe zu bilden, und c) Screenen der pMHC-Molekülkomplexe auf TCR-Bindung.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das MHC-Molekül HLA oder ein Multimer von HLA, MHC I oder MHC II ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Dimer, einem Trimer und einem Tetramer.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren ausgewählt ist aus einer rekombinant eingeführten Disulfidbrücke, der Einführung von zu vernetzenden nicht-natürlichen Aminosäuren, der Einführung von photovernetzenden Aminosäuren und chemisch eingeführten Kreuzverbindungen, vorzugsweise wobei die mindestens eine künstlich eingeführte kovalente Brücke zwischen Aminosäuren zwischen α-Helices eingeführt wird, zum Beispiel durch Mutation eines Tyrosins an Position 84 und eines Alanins an Position 139 zu Cysteinen von MHC I.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die geladenen HLA/Peptidmoleküle mehr als etwa 1 Tag und vorzugsweise mehr als 1 Woche bei etwa 4°C stabil sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Sensitivitätsniveau für das Affinitätsscreening eines TCR für die Bindung an pMHC-Komplexe höher als etwa Kd 1,0 × 10-9, vorzugsweise höher als etwa Kd 1,0 × 10-6 und bevorzugter höher als etwa Kd 1,0 × 10-3 ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei entweder der TCR- oder das MHC-Molekül auf einer festen Oberfläche, wie beispielsweise einem Chip, Biosensor, Glasträger oder einem Bead, geeignet immobilisiert wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren als Hochdurchsatz-Screening-Format durchgeführt wird.
  8. Verfahren zum Nachweis oder zur Erzeugung eines spezifischen Aminosäurebindungsmotivs für einen TCR zur Verfügung, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend einen vorgewählten TCR, und den zusätzlichen Schritt zum Bestimmen und Vergleichen der Aminosäuresequenzen jener Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch das spezifische Aminosäurebindungsmotiv für den vorgewählten TCR identifiziert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexe in parallelen Assayreaktionen mit unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden, vorzugsweise wobei die Verfahrensschritte wiederholt werden, umfassend einen Pool von Peptiden, bestehend aus modifizierten Aminosäurebindungsmotiven für den vorgewählten TCR, wie identifiziert.
  10. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 9 und den zusätzlichen Schritt des Bestimmens und Vergleichens der Aminosäuresequenzen dieser Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird.
  11. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Kreuzreaktivität eines TCR, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend einen vorgewählten TCR und den zusätzlichen Schritt des Bestimmens und Vergleichens der Aminosäuresequenzen dieser Peptidliganden in den Peptidliganden/MHC-Molekülkomplexen, für die eine TCR-Bindung nachgewiesen wurde, wodurch die Kreuzreaktivität des TCR identifiziert wird.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, ferner umfassend den Schritt des Messens der T-Zell-Aktivierung, umfassend einen TCR und einen TCR-bindenden Peptidliganden/MHC-Molekül-Komplex, der den TCR bindet.
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