JP6451632B2 - 異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびキット - Google Patents
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6451632B2 JP6451632B2 JP2015532868A JP2015532868A JP6451632B2 JP 6451632 B2 JP6451632 B2 JP 6451632B2 JP 2015532868 A JP2015532868 A JP 2015532868A JP 2015532868 A JP2015532868 A JP 2015532868A JP 6451632 B2 JP6451632 B2 JP 6451632B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- modified nucleobase
- heterologous nucleic
- target nucleic
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
〔1〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法:
(1)核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること;ならびに
(2)(1)で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔2〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程(1)および(2)がそれぞれ(1’)および(2’)により行われる、〔1〕の方法:
(1’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および異種核酸プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること;ならびに
(2’)当該異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔3〕標的核酸が、2以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕前記核酸サンプルを含有する溶液に異種核酸プローブを添加して、核酸サンプルおよび異種核酸プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、〔1〕〜〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的DNAを含有するサンプルである、〔1〕〜〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕異種核酸プローブがRNAプローブである、〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、〔1〕〜〔6〕のいずれかの方法。
〔8〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔1〕〜〔7〕のいずれかの方法。
〔9〕異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、異種核酸プローブが設計される、〔2〕〜〔8〕のいずれかの方法。
〔10〕異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、異種核酸プローブが設計される、〔2〕〜〔9〕のいずれかの方法。
〔11〕修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ELISAにより行われる、〔1〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット:
(I)異種核酸プローブ;および
(II)修飾核酸塩基に対する抗体。
(1)核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること;ならびに
(2)(1)で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートしても、異種核酸ハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程(2)において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸(換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸)を含有する場合、核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸および異種核酸プローブが反応して、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程(2)において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に(標的核酸が存在するにもかかわらず)修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸および異種核酸プローブが反応して、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程(2)において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
溶液中の異種核酸プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば0.01nM以上、好ましくは0.1nM以上、より好ましくは1nM以上、さらにより好ましくは5nM以上、特に好ましくは10nM以上であってもよい。溶液中の異種核酸プローブの濃度はまた、例えば1M以下、100mM以下、10mM以下、1mM以下、100μM以下、10μM以下または1μM以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、異種核酸プローブを溶液に添加してもよい。
例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント(例、完全または不完全フロイントアジュバント)とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し、最終免疫から約3〜約10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例、NS−1)を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、PEG法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法(Ulmanら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90,1184−89(1993))、ADLibシステム(国際公開第2004/011644号)等のin vitro法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
(2−1)上記工程(1)で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること;
(2−2)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ異種核酸プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること;および
(2−3)シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または2次抗体(2次抗体が用いられる場合)に結合した標識を利用して計測される値(例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性)である。
(2−1’)上記工程(1)で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること;
(2−2’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ異種核酸プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること;
(2−3’)バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること;ならびに
(2−4’)補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
(2−1’’)上記工程(1)で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること;
(2−2’’)修飾核酸塩基を含む標的核酸(標品)、かつ異種核酸プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること;ならびに
(2−3’’)シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
(i)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルおよび第1の親和性物質で標識された異種核酸プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること;
(ii)異種核酸ハイブリッドを、第2の親和性物質で処理された固相に固定すること;
(iii)修飾核酸塩基に対する1次抗体を、固相に固定された異種核酸ハイブリッドと反応させて、1次抗体と異種核酸ハイブリッドとの1次複合体を得ること;
(iv)標識物質で標識された2次抗体を1次複合体と反応させて、2次抗体と1次抗体との2次複合体を得ること;ならびに
(v)2次複合体中の2次抗体が有する標識物質を利用して、形成された異種核酸ハイブリッド(換言すれば、修飾核酸塩基)の存在および/または量を測定すること
第1の親和性物質および第2の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ(例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ)で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程(i)および(ii)の代わりに、(i’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および固相に固定された異種核酸プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された異種核酸プローブを得ること(例、第1の親和性物質で標識された異種核酸プローブを、第2の親和性物質で処理された固相に加えること)をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程(iii)の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。2次抗体は、1次抗体のみを認識する抗体(例、1次抗体の定常領域に結合する抗体)であってもよいが、2次複合体中の1次抗体および1次複合体の双方を認識するものであってもよい。(i)〜(v)を含む本発明の方法は、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
(I)異種核酸プローブ;および
(II)修飾核酸塩基に対する抗体。
異種核酸プローブおよび修飾核酸塩基は、上述したとおりである。例えば、異種核酸プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、2次抗体、2次抗体の検出試薬(例、2次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質)および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−TTGCGCGGCGTC[C]GTCCTGTTGACTTC−3’(配列番号1:[C]は5−メチルシトシンを示す)、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は5’−GAAGUCAACAGGACGACGCCGCGCAA−3’(配列番号2、核酸の主鎖はノーマルRNAまたは2’−O−メチル化RNA、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基[C]で不対部分が形成されるように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、5−メチルシトシンを含む標的核酸(1pmol、0.1pmol、または0.01pmol)と異種核酸プローブ(5pmol)をハイブリダイゼーションBuffer(4×SSC、0.3%Tween20)100μL中に溶解させた後(核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度はそれぞれ10nM、1nM、または0.1nMであり、異種核酸プローブの濃度は50nMである)、60℃で2時間反応させることで、標的核酸と異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート(Thermo Scientific社製)に100μL加え、37℃で30分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に異種核酸ハイブリッドを固定化した。300μLのPBS−Tで2回洗浄し、50ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3。本抗体は、5−メチルシトシンのみならず、DNAの主鎖構造(例、デオキシリボース部分およびリン酸部分の繰り返し単位から構成される構造)の少なくとも一部を認識する抗体である)を100μLずつ加え、37℃で1時間反応させた。300μLのPBS−Tで3回洗浄し、250ng/mLのペルオキシダーゼ標識抗IgG抗体(Thermo Scientific社製)を100μLずつ加え、37℃で30分反応させた。300μLのPBS−Tで3回洗浄した後、3,3’,5,5’−Tetramethylbenzidineを100μLずつ加え、遮光室温で15分反応させた。その後、2N塩酸溶液を100μLずつ加え、マイクロプレートリーダー(PerkinElmer社製Arvo)により450nmの吸光度を測定した。
また、主鎖がノーマルRNAまたは2’−O−メチル化RNAである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がDNAである同種核酸プローブ(配列番号3:5’−GAAGTCAACAGGACGACGCCGCGCAA−3’)を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。
その結果、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、検出シグナルのバックグラント値を低下させ(表4、図2)、また、各濃度の標的核酸においてS/N値を向上させた(表5、図3)。このことは、修飾核酸塩基を含む標的核酸の抗体による測定における検出感度の向上には、当該標的核酸に対して異種の核酸プローブの併用が有効であることを示す。特に、標的核酸の量が0.1pmol以上であるとき(即ち、溶液中の標的核酸の濃度を1nM以上にして異種核酸プローブとハイブリダイズさせて、異種核酸ハイブリッドを形成させたとき)、同種核酸プローブに対する異種核酸プローブの特に優れた効果が確認された(表5、図3)。
実施例1で用いた抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)の代わりに、100ng/mL抗メチルシトシン抗体(Millipore社製、Clone33D3)、100ng/mL抗メチルシトシン抗体(Millipore社製、Clone162 33 D3)、10ng/mL抗メチルシトシン抗体(ZYMO RESEARCH社製、Clone10G4)を用いた以外は、実施例1と同様の方法で試験した。なお、各抗体について異なる濃度を採用した理由は、各抗体の活性が異なり、検出シグナルが大きく変わってしまうことから、同程度の検出シグナルが得られるように調整したためである。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−AATCAG[C]GGGAGCTCTTTCTTTGCGCGGCGTCCGTCCTGTTGACTTC−3’(配列番号4:[C]は5−メチルシトシンを示す)、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は5’−GAAGUCAACAGGACGACGCCGCGCAA−3’(配列番号2、核酸の主鎖はノーマルRNAまたは2’−O−メチル化RNA、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸を用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。
また、主鎖がノーマルRNAまたは2’−O−メチル化RNAである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がDNAである同種核酸プローブ(配列番号3:5’−GAAGTCAACAGGACGACGCCGCGCAA−3’)を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−G[C]GGAGCTCTCCCT[C]GGGA[C]GGTGGCAGCCTCGAGTGGTCCTGCA−3’(配列番号5:[C]は5−メチルシトシンを示す)、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は5’−UGCAGGACCACUCGAGGCUGCCAC−3’(配列番号6、核酸の主鎖は2’−O−メチル化RNA、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸および異種核酸プローブを用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。
また、主鎖が2’−O−メチル化RNAである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がDNAである同種核酸プローブ(配列番号7:5’−TGCAGGACCACTCGAGGCTGCCAC−3’)を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−T[C]GTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGG−3’(配列番号8:[C]は5−メチルシトシンを示す)、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は5’−CCCCCUAGAAAAUUGAGAGAAGUCCACCACAAAAAAAAAA−3’(配列番号9、核酸の主鎖は2’−O−メチル化RNA、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸および異種核酸プローブを用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。
また、主鎖が2’−O−メチル化RNAである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がDNAである同種核酸プローブ(配列番号10:5’−CCCCCTAGAAAATTGAGAGAAGTCCACCACAAAAAAAAAA−3’)を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT[C]GT−3’(配列番号11:[C]は5−メチルシトシンを示す)、標的核酸を捕捉するための異種核酸プローブのヌクレオチド配列は5’−CACUGAACAAAUGGCACUAGUAAACUGAGCCAAAAAAAAAA−3’(配列番号12、核酸の主鎖は2’−O−メチル化RNA、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成したものをそれぞれ使用した。異種核酸プローブは、標的核酸との異種核酸ハイブリッドが形成されたとき、異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、上述のとおり異なる標的核酸および異種核酸プローブを用いた以外は、実施例1と同様の方法で行った。
また、主鎖が2’−O−メチル化RNAである異種核酸プローブの代わりに、主鎖がDNAである同種核酸プローブ(配列番号13:5’−CACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCAAAAAAAAAA−3’)を用いた以外は、同様の方法で標的核酸を測定した。
以下に記載された条件で標的核酸を測定した。その他の実験条件(例、反応系の容量)は、実施例1と同様であった。
標的核酸:配列番号1のヌクレオチド配列からなる、修飾核酸塩基を含むDNA(10pmol);
核酸プローブ:配列番号3のヌクレオチド配列からなる同種核酸(DNA)プローブ(5pmol);
修飾核酸塩基に対する抗体:100ng/mLの抗メチルシトシン抗体(Millipore社製、Clone33D3)。
その結果、標的核酸の非存在下(標的核酸(−))において、抗メチルシトシン抗体または同種核酸プローブの双方の存在下では、検出シグナル値は高かったが、抗メチルシトシン抗体または同種核酸プローブのいずれかの非存在下では、検出シグナルのバックグラウンド値の低下が認められた(表6)。このことは、抗メチルシトシン抗体または同種核酸プローブの双方の存在下で計測された高い検出シグナル値がそれらの非特異的結合に起因することを示唆する。
Claims (12)
- 以下:
(1)核酸サンプルおよび異種核酸プローブを溶液中でインキュベートすること;ならびに
(2)(1)で得られた溶液において、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体を用いて標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基を測定すること
を含み、
核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程(1)および(2)がそれぞれ(1’)および(2’):
(1’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および異種核酸プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および異種核酸プローブから構成される異種核酸ハイブリッドを形成すること;ならびに
(2’)当該異種核酸ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること
により行われる、
修飾核酸塩基の測定方法。 - 標的核酸が、2以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、請求項1記載の方法。
- 前記核酸サンプルを含有する溶液に異種核酸プローブを添加して、核酸サンプルおよび異種核酸プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項1または2記載の方法。
- 前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的DNAを含有するサンプルである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 異種核酸プローブがRNAプローブである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 異種核酸ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、異種核酸プローブが設計される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 異種核酸ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、異種核酸プローブが設計される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ELISAにより行われる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 以下を含む、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基の測定用キット:
(I)RNAプローブ;および
(II)標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体。 - RNAプローブが固相への固定を可能にする物質または基で標識されている、請求項11記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013171658 | 2013-08-21 | ||
JP2013171658 | 2013-08-21 | ||
PCT/JP2014/071703 WO2015025862A1 (ja) | 2013-08-21 | 2014-08-20 | 異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015025862A1 JPWO2015025862A1 (ja) | 2017-03-02 |
JP6451632B2 true JP6451632B2 (ja) | 2019-01-16 |
Family
ID=52483635
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015532868A Expired - Fee Related JP6451632B2 (ja) | 2013-08-21 | 2014-08-20 | 異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびキット |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160187325A1 (ja) |
EP (1) | EP3037531A4 (ja) |
JP (1) | JP6451632B2 (ja) |
WO (1) | WO2015025862A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107075505A (zh) * | 2014-09-29 | 2017-08-18 | 富士瑞必欧株式会社 | 含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法及试剂盒 |
JP2017221172A (ja) * | 2016-06-17 | 2017-12-21 | 富士レビオ株式会社 | 修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法 |
TWI808084B (zh) * | 2018-05-22 | 2023-07-11 | 先進光電科技股份有限公司 | 光學成像系統 |
JP7398712B2 (ja) | 2018-09-13 | 2023-12-15 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 乳癌細胞存在率の推定方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2558172B1 (fr) * | 1984-01-16 | 1986-06-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
FR2722799B1 (fr) * | 1994-07-21 | 1996-10-04 | Parteurop | Procede d'amplification d'acide nucleique a l'aide d'un nucleoside modifie, et detection du produit d'amplification a l'aide d'anticorps |
WO2001096604A2 (en) * | 2000-06-12 | 2001-12-20 | Genicon Sciences Corporation | Assay for genetic polymorphisms using scattered light detectable labels |
JP4233807B2 (ja) * | 2002-05-31 | 2009-03-04 | 住友精密工業株式会社 | 生化学反応体の検出方法とバイオチップ |
JP4214234B2 (ja) | 2002-07-30 | 2009-01-28 | 独立行政法人理化学研究所 | 体細胞相同組換えの促進方法及び特異的抗体の作製方法 |
JP3854943B2 (ja) * | 2003-05-23 | 2006-12-06 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Dnaメチル化率の測定方法 |
EP1914320A3 (en) * | 2006-10-16 | 2009-02-11 | Epigenomics AG | A method for detection of one or more CpG positions |
JP2009247260A (ja) * | 2008-04-04 | 2009-10-29 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Dnaメチル化測定方法 |
US20120107808A1 (en) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Weiwei Li | High throughput detection of gene-specific hydroxymethylation |
JP2012230019A (ja) * | 2011-04-27 | 2012-11-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | メチル化核酸検出法 |
-
2014
- 2014-08-20 JP JP2015532868A patent/JP6451632B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-08-20 US US14/912,348 patent/US20160187325A1/en not_active Abandoned
- 2014-08-20 EP EP14837506.6A patent/EP3037531A4/en not_active Withdrawn
- 2014-08-20 WO PCT/JP2014/071703 patent/WO2015025862A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2015025862A1 (ja) | 2017-03-02 |
US20160187325A1 (en) | 2016-06-30 |
EP3037531A1 (en) | 2016-06-29 |
EP3037531A4 (en) | 2017-04-26 |
WO2015025862A1 (ja) | 2015-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6497323B2 (ja) | ガイドプローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのためのキット | |
EP3158089B1 (en) | On-slide staining by primer extension | |
JP6451632B2 (ja) | 異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびキット | |
CN110117595B (zh) | 一种特异性结合pdl1的核酸适配体及其应用 | |
WO2010021396A1 (ja) | Dnaを定量又は検出する方法 | |
CN104884634A (zh) | 利用链置换交换反应检测非核酸分析物 | |
JP5266828B2 (ja) | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 | |
JP6451634B2 (ja) | 吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット | |
JP6451633B2 (ja) | 固相プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット | |
US8927210B2 (en) | Conjugate complexes for analyte detection | |
Veras et al. | Loss of ENT1 increases cell proliferation in the annulus fibrosus of the intervertebral disc | |
WO2016052368A1 (ja) | 修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法およびキット | |
Hu et al. | Antibodies specific for nucleic acids and applications in genomic detection and clinical diagnostics | |
JP5211790B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
WO2017217530A1 (ja) | 修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法 | |
US20180119149A1 (en) | In vitro selection of formaldehyde cross-linking aptamers | |
US20100105058A1 (en) | Method for Measuring DNA Methylation | |
CN107083388B (zh) | 一种特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh3及用途 | |
EP1032700A1 (en) | Separation of nucleic acids by antibodies to halogenated nucleotides | |
US20100086931A1 (en) | Method for assaying action of antitumor agent using decrease in gene expression level as index | |
US20120184719A1 (en) | Hybridoma producing anti-methylated dna antibody and utilization of same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170522 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180529 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180726 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181113 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181126 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6451632 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |