CN107075505A - 含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以特异性地检测含有修饰核酸碱基的靶核酸的方法及手段。具体而言，本发明提供一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法，其包含以下步骤：(1)将核酸样品及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针在溶液中进行孵育；以及(2)在(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体测定修饰核酸碱基。本发明还提供一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定用试剂盒，其包含以下物品：(I)修饰核酸碱基配对性异源核酸探针；及(II)针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体。

Description

含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法及试剂盒。
背景技术
报道有几种通过免疫测定对天然地存在的修饰核酸碱基(例如甲基胞嘧啶、羟基甲基胞嘧啶)进行检测的技术(例如专利文献1、及非专利文献1、2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2012-230019号公报
非专利文献
非专利文献1:Prolletal.，DNAResearch13，37-42(2006)
非专利文献2:Kuritaetal.，Anal.Chem.2012，84，7533-7538
发明内容
发明所要解决的技术问题
在现有的方法中，可使用不能识别与核酸碱基配对的修饰核酸碱基，但可以识别处于非配对状态的修饰核酸碱基的抗体。因此，在使用这种抗体的现有的方法中，为了测定靶核酸内的特定位置的修饰核酸碱基，需要使其修饰核酸碱基为非配对状态。作为这种方法，可列举例如以下方法：1)包含a)使靶核酸片段化，使其仅含有测定对象的修饰核酸碱基，接着，b)使用进行了片段化的靶核酸(单链核酸)，及相对于修饰核酸碱基的抗对靶核酸内的修饰核酸碱基进行测定的方法(单链核酸中的修饰核酸碱基的测定方法)、以及2)包含使用a)指定的核酸探针形成含有修饰核酸碱基的靶核酸和核酸探针的双链核酸(在双链核酸中，修饰核酸碱基处于非配对状态)，接着，使用b)双链核酸、及针对于修饰核酸碱基的抗体对靶核酸内的修饰核酸碱基进行测定的方法(双链核酸中的修饰核酸碱基的测定方法)。
作为1)的方法，有利用限制酶进行的切断的方法。但是，未必存在能够以在切断碎片中仅包含测定对象的修饰核酸碱基的方式进行切断的限制酶。
作为2)的方法中的a)，可列举例如：i)由于使与存在于靶核酸内的测定对象外的修饰核酸碱基配对的核酸探针与靶核酸结合，从而掩蔽测定对象外的修饰核酸碱基的方法、及ii)由于使不与存在于靶核酸内的测定对象的修饰核酸碱基配对的核酸探针与靶核酸结合，从而使测定对象的修饰核酸碱基为非配对状态的方法(***结构的形成)。但是，在i)中，存在如下问题：为了掩蔽测定对象外的全部的修饰核酸碱基，需要非常长的核酸探针，其合成困难。另外，也考虑使短链的核酸探针多个结合的方法，但存在有时这些核酸探针彼此形成复合体，难以与靶核酸特异且有效地结合的问题。并且，存在难以完全掩蔽测定对象外的全部的修饰核酸碱基的问题。另外，ii)中，在测定对象的修饰核酸碱基的部分形成***结构时，核酸探针具有相对于靶核酸的错配等，因此，存在核酸探针的特异性且测定的特异性降低的问题。
具体而言，专利文献1及非专利文献1、2中，使用了抗甲基胞嘧啶抗体(克隆33D3)检测甲基胞嘧啶。但是，该抗甲基胞嘧啶抗体虽然可以识别非配对甲基胞嘧啶，但是，不能识别其互补的核酸碱基(鸟嘌呤)和进行了配对的甲基胞嘧啶。因此，使用这种抗体的专利文献1、及非专利文献1、2的方法中，为了测定靶核酸内的特定位置的修饰核酸碱基，需要使其修饰核酸碱基为非配对状态，因此，存在如上所述的问题。
上述免疫测定体系中，存在不仅可以检测含有修饰核酸碱基的靶核酸，而且也可以检测含有修饰核酸碱基的非靶核酸的问题。这是因为，由于针对于上述免疫测定中所使用的修饰核酸碱基的抗体仅识别处于非配对状态的修饰核酸碱基，因此，没有区别地识别靶核酸及非靶核酸中所含的修饰核酸碱基。特别是在将不仅可以包含含有修饰核酸碱基的靶核酸，而且可以包含含有修饰核酸碱基的许多非靶核酸的来自天然的样品设为测定对象的情况下，该问题是严重的。本发明的目的在于，特异性地对含有修饰核酸碱基的靶核酸进行测定，特别是不需要靶核酸的片段化及测定对象外的修饰核酸碱基(5-甲基胞嘧啶)的掩模等操作，实现所述的特异性的测定。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人等深入研究的结果发现：为了特异性地测定含有修饰核酸碱基的靶核酸，与现有的抗体不同，通过使用不能识别处于非配对状态的修饰核酸碱基，但可以识别与核酸碱基进行了配对的修饰核酸碱基的抗体，可以提高测定的特异性。即，可以认为，通过使用这种抗体，适当地设计核酸探针，由此可以仅特异性地测定核酸探针杂交了的靶核酸中的修饰核酸碱基。本发明人等还发现：为了适合于这种抗体的使用，使用制成可以与修饰核酸碱基进行配对的核酸探针；及为了提高测定精度，作为这种核酸探针的构成核酸，利用异源核酸等。实际上，本发明人等在通过基于这种构思而开发的方法特异性地测定含有修饰核酸碱基的靶核酸方面获得成功，直至完成本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法，其包括：
(1)将核酸样品及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针在溶液中进行孵育；以及
(2)在(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体对修饰核酸碱基进行测定。
[2]如[1]的方法，其中，核酸样品包含含有修饰核酸碱基的靶核酸，且工序(1)及(2)分别通过(1’)及(2’)来进行：
(1’)在溶液中通过孵育使包含含有修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品、及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针进行反应，形成由所述靶核酸及所述探针构成的异源核酸杂交体；以及
(2’)在含有所述异源核酸杂交体的溶液中，使用所述抗体对修饰核酸碱基进行测定。
[3]如[1]或[2]的方法，其还包括：
在含有所述核酸样品的溶液中添加所述探针，制备含有所述核酸样品及所述探针这两者的溶液。
[4]如[1]～[3]中任一种方法，其中，所述核酸样品包含含有修饰核酸碱基的靶DNA。
[5]如[1]～[4]中任一种方法，其中，所述探针包含下述人工核酸，所述人工核酸具有与靶核酸的主链结构不同的主链结构。
[6]如[5]的方法，其中，所述探针为肽核酸(PNA)探针或交联型核酸(BNA)探针。
[7]如[1]～[6]中任一种方法，其中，构成修饰核酸碱基的核酸碱基为胞嘧啶。
[8]如[1]～[7]中任一种方法，其中，修饰核酸碱基为甲基胞嘧啶。
[9]一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法，其包括：
(1)在溶液中对核酸样品、修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针进行孵育；以及
(2)在(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体对修饰核酸碱基进行测定。
[10]如[9]的方法，其中，核酸样品包含含有修饰核酸碱基的靶核酸，且工序(1)及(2)分别通过(1’)及(2’)来进行：
(1’)在溶液中通过孵育使核酸样品、修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针进行反应，形成由所述靶核酸、所述导向探针及捕捉探针构成的异源核酸杂交体；以及
(2’)在含有所述异源核酸杂交体的溶液中，使用所述抗体对修饰核酸碱基进行测定。
[11]如[10]的方法，其中，所述导向探针相对于所述靶核酸为异源，捕捉探针相对于所述靶核酸及所述导向探针这两者为异源。
[12]如[1]～[11]中任一种方法，其中，含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定使用所述抗体通过ELISA来进行。
[13]一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定用试剂盒，其包含：
(I)修饰核酸碱基配对性异源核酸探针；及
(II)针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体。
[14]如[13]的测定用试剂盒，其中，所述探针为修饰核酸碱基配对性异源导向探针，且进一步含有(III)捕捉探针。
发明的效果
根据本发明的方法及试剂盒，可以特异性地测定靶核酸中的修饰核酸碱基。具体而言，根据使用修饰核酸碱基配对性异源核酸探针、及针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体的本发明，可以特异性地对与该探针形成了杂交体的部分中的修饰核酸碱基进行测定。根据本发明，不需要靶核酸的片段化及测定对象外的修饰核酸碱基的掩蔽等操作。
附图说明
图1是表示使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及核酸探针(例如修饰核酸碱基配对性异源核酸探针)的修饰核酸碱基的特异性检测的图；
图2是表示使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的修饰核酸碱基的周边序列非依赖的检测的图；
图3是表示使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的修饰核酸碱基的用量依赖性检测的图；
图4是表示使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体、以及修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针的修饰核酸碱基的特异的检测的图；
图5是表示使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性核酸探针(BNA探针)的修饰核酸碱基的特异的检测(1)的图；
图6是表示使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性核酸探针(BNA探针)的修饰核酸碱基的特异的检测(2)的图；
图7是表示本发明的方法的概要的图；
图8是表示与修饰核酸碱基的测定有关的技术问题(特定技术问题I)的概要的图；双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度比单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的灵敏度低；其认为是因为，相对于含有修饰核酸碱基的靶核酸，互补链及捕捉探针竞争，靶核酸和捕捉探针的混合物形成效率(对靶核酸的固相上的捕捉效率)低；
图9是表示与修饰核酸碱基的测定有关的技术问题(特定技术问题II)的概要的图；在使用捕捉探针测定靶核酸中的修饰核酸碱基的现有的方法中，形成由靶核酸及捕捉探针构成的杂交体；在现有的方法中，通过该杂交体中的非杂交区域(单链区域)形成二次结构，难以测定该二次结构中所含的修饰核酸碱基(即，检测灵敏度低)的技术问题潜在地存在；
图10是表示利用捕捉探针的单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定的图；
图11是表示使用有捕捉探针及导向探针的、单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定的图；导向探针(-)：仅捕捉探针；导向探针(+)：捕捉探针及导向探针；
图12是表示使用捕捉探针及导向探针测定双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的图；导向探针(-)：仅捕捉探针；导向探针(+)：捕捉探针及导向探针；
图13是表示通过离液剂的存在下的导向探针的使用、双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定的图；杂交缓冲液：使用导向探针；硫氰酸胍(-)缓冲液：使用导向探针；硫氰酸胍(+)缓冲液：在离液剂的存在下使用导向探针；
图14是表示通过离液剂的存在下的导向探针使用的、单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定的图；
图15是表示通过导向探针的使用的、单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定的图；本实验为了与图14所示的实验的对比而进行；
图16是表示通过核酸改性剂的存在下的基于导向探针的使用的修饰核酸碱基的测定的图；
图17是表示利用导向探针的、含有修饰核酸碱基的部位中的二次结构的形成的抑制的图；1：导向探针1；2：导向探针2；3：导向探针3；4：导向探针4；2+4：添加导向探针2及4；2+3+4：添加导向探针2、3及4；
图18是表示各种浓度的核酸改性剂的效果的图；
图19是表示导向探针的主链的研究的图；未添加：导向探针的非存在下；2：导向探针2；4：导向探针4；2+4：导向探针2及4的存在下；5：导向探针5；6：导向探针6；5+6：导向探针5及6的存在下；-：导向探针的非存在下；DNA：导向探针的主链为DNA；2’-O-甲基化RNA：导向探针的主链为2’-O-甲基化RNA；RNA；导向探针的主链为RNA；
图20是表示通过核酸改性剂(离液剂及给电子性化合物)或非核酸改性剂(表面活性剂)的存在下的基于导向探针的使用的修饰核酸碱基的测定的图；
图21是表示在核酸改性剂及表面活性剂这两者的存在下使用有导向探针的、靶核酸中的修饰核酸碱基的测定(发光计数)的图；
图22是表示在核酸改性剂及表面活性剂这两者的存在下使用有导向探针的、靶核酸中的修饰核酸碱基的测定(S/N)的图；信号噪音比(S/N)：靶核酸量(fmol)的发光计数/靶核酸的非存在下(即0mol)的发光计数。
具体实施方式
本发明提供含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法。本发明的方法包含以下：
(1)将核酸样品及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针在溶液中进行孵育；以及
(2)在(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体测定修饰核酸碱基。
核酸样品为包含含有修饰核酸碱基的靶核酸的样品或怀疑含有该靶核酸的样品。核酸样品还可以为源自生物的生物学的样品，或可以为环境样品等。作为生物学的样品来源的生物，可列举例如：哺乳动物(例如人、猴子、小鼠、大鼠、兔子、牛、猪、马、山羊、绵羊)、鸟类(例如鸡)等动物、昆虫、微生物、植物、菌类、鱼类。生物学的样品还可以为作为血液自身或作为源自血液的样品的血液关联样品(例如全血、血清、血浆)、唾液、尿、乳汁、组织或细胞提取液、或者它们的混合物。生物学的样品还可以为患有疾病(例如癌、白血病)的哺乳动物、或源自有可能患有疾病的哺乳动物的样品。作为环境样品，可列举例如有可能含有核酸的土壤、海水、淡水来源的样品。这种样品可以在用于本发明的方法之前供给于它处理。作为这种处理，可列举例如：核酸(例如基因组DNA等DNA、RNA)的提取及片段化(例如利用限制酶等酶的处理)。因此，本发明的方法还包含从核酸样品中提取核酸、和/或将核酸片段化。本发明的方法还可以进一步包含通过离心分离、提取、过滤、沉淀、加热、冻结、冷藏、搅拌等对样品进行处理。
靶核酸为DNA或RNA，但优选为DNA。靶核酸还为DNA的编码区域或非编码区域(例如转录调结区域)。靶核酸的核苷酸序列的一部分或整体相对于异源核酸探针的核苷酸序列是互补的。构成靶核酸的核苷酸残基的个数(即靶核酸的长度)只要可与异源核酸探针杂交，就没有特别限定，例如可以为10个以上，优选15个以上，更优选20个以上。构成靶核酸的核苷酸的个数另外没有特别限定，例如可以为有可能通过基因组DNA的片段化处理而产生的任意的个数。例如，构成靶核酸的核苷酸的个数可以为10000个以下、5000个以下、2000个以下、1000个以下、500个以下、200个或100个以下。靶核酸的GC含有率没有特别限定，例如可以为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、或60％以上。靶核酸的GC含有率还可以为例如90％以下、80％以下、或70％以下。只要靶核酸含有的修饰核酸碱基的数量为1个以上(例如1～100个、1～20个、1～10个或1～5个)即可，没有特别限定。
本发明中，修饰核酸碱基是指：具有对选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)中的通常的核酸碱基进行了修饰的结构的核酸碱基。例如，作为“修饰核酸碱基”的表达中的用语“核酸碱基”，在靶核酸为DNA的情况下，可列举例如：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)。另一方面，在靶核酸为RNA的情况下，可列举例如：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。核酸碱基优选为胞嘧啶(C)。作为修饰，可列举例如：向通常的核酸碱基导入取代基，通常的核酸碱基具有的基团(例如氨基、桥氧基、甲基)的脱离，对通常的核酸碱基具有的基团进行取代基的交换。作为取代基，只要可具有天然存在的核酸碱基即可，没有特别限定，可列举例如专利合作条约的行政指南(Administrative Instruction sunder the Patent Cooperation Treaty)(2009年1月1日施行版)，增刊(Annex)C，附录(Appendix)2，表2：修饰碱基列表(Table2：List ofModified Nucleotides)中所记载的修饰核苷酸中的修饰核酸碱基具有的取代基。本资料中所记载的修饰核苷酸可以与由日本专利厅所公开的“用于含有碱基序列或氨基酸序列的说明书等制作的导向线(平成14年7月)或(平成21年12月)”的附属书2、表2：修饰碱基表中所记载的修饰核苷酸相同。因此，关于修饰核酸碱基，还可以参照上述导向线。取代基优选为甲基、羟基甲基。取代等修饰的位置没有特别限定，在具有嘧啶环的核酸碱基(C、T或U)的情况下，例如为2位、4～6位，优选为5位，在具有嘌呤环的核酸碱基(A或G)的情况下，例如为2位、6位、8位。
修饰核酸碱基只要可以天然地存在即可，没有特别限定，可列举例如专利合作条约的行政指南(Administrative Instruction sunder the Patent Cooperation Treaty)(2009年1月1日施行版)，增刊(Annex)C，附录(Appendix)2，表2：修饰碱基列表(Table2：List of Modified Nucleotides)中所记载的修饰核苷酸具有的修饰核酸碱基。本资料中所记载的修饰核苷酸可以与上述指南的附录2、表2：修饰碱基表中所记载的修饰核苷酸相同。因此，关于修饰核酸碱基，还可以参照上述指南。优选修饰核酸碱基为甲基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、羟基甲基胞嘧啶(例如5-羟基甲基胞嘧啶)、羧基胞嘧啶(例如5-羧基胞嘧啶)。更优选修饰核酸碱基为甲基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、羟基甲基胞嘧啶(例如5-羟基甲基胞嘧啶)。已知有修饰核酸碱基导致的核酸功能的变化(例如制定的基因的转录调节能力的变化)。
(修饰核酸碱基配对性异源核酸探针：探针X)
本发明中所使用的修饰核酸碱基配对性异源核酸探针是指：相对于靶核酸由异源核酸构成，且通过杂交而能够检测靶核酸的异源核酸探针，且含有与靶核酸形成异源核酸杂交体时与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的物质。以下，有时将修饰核酸碱基配对性异源核酸探针简称为探针X。因此，在由靶核酸及探针X形成的异源核酸杂交体中，修饰核酸碱基与互补的核酸碱基进行了配对，在修饰核酸碱基部分不形成***或环结构。具体而言，在修饰核酸碱基为腺嘌呤(A)的情况下，探针X中的配对核酸碱基为胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)。在修饰核酸碱基为鸟嘌呤(G)的情况下，探针X中的配对核酸碱基为胞嘧啶(C)。在修饰核酸碱基为胞嘧啶(C)的情况下，探针X中的配对核酸碱基为鸟嘌呤(G)。在修饰核酸碱基为胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的情况下，探针X中的配对核酸碱基为腺嘌呤(A)。用语“异源”是指：将与靶核酸的主链结构(由糖部分及磷酸部分构成的结构)不同的主链结构作为主链结构的一部分或整体而具有探针X。因此，探针X的种类根据靶核酸的种类而确定。例如在靶核酸为DNA的情况下，作为探针X，可以使用DNA探针以外的核酸探针。另一方面，在靶核酸为天然RNA的情况下，作为探针X，可以使用与该天然RNA同种的RNA构成的标准RNA探针以外的核酸探针。作为靶核酸，优选DNA，因此，探针X优选为DNA探针以外的核酸探针。
作为探针X，可列举例如：DNA探针、RNA探针、肽核酸(PNA)探针、锁型核酸(LNA)探针或交联型核酸(BNA)探针、磷硫酰(S化)核酸探针、及上述的2个以上的核酸探针连结成的嵌合体型核酸探针(嵌合体型核酸探针必然相对于靶核酸含有异源核酸)。
交联型核酸(BNA)的构成单元的优选的实例由以下的式子表示。
[化学式1]
上述通式中，X表示连接基团(原子或基团)。作为接头(原子或基)，可列举例如：-O-、-O-CH2-O-、-NR-O-。作为R，可列举例如氢原子及烃基[例如如后所述C1～C6烷基等烷基]。Nucleobase表示如上所述核酸碱基。有时将X为-N(CH3)-O-的BNA记为BNA-NC(N-Me)。
作为RNA探针，可列举例如由2’位上具有羟基的天然核糖核苷酸构成的标准RNA探针，及由2’位的羟基进行了修饰的核糖核苷酸构成的修饰RNA探针。作为修饰RNA探针，可以使用核糖核酸酶耐性的RNA探针。作为修饰RNA探针，可列举例如2’-O-烷基化RNA探针。2’-O-烷基化RNA探针优选为2’-O-C1～C6烷基化RNA探针。C1～C6烷基化的C1～C6烷基为直链、支链或环状的碳原子数1～6个烷基，可列举例如：甲基、乙基、丙基(例如正丙基、异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基、己基等。从制造、获得的容易性等观点出发，2’-O-C1～C6烷基化RNA探针为2’-O-甲基化RNA探针。
优选探针X可以含有具有与天然核酸不同的部分结构的人工核酸。这种探针X优选可以含有人工核酸，所述人工核酸具有与靶核酸的主链结构(由糖部分及磷酸部分构成的结构)不同的主链结构。作为具有这种主链结构的人工核酸，可列举例如：作为主链结构的构成部分的糖部分进行修饰，或与其它部分进行了交换的结构；作为主链结构的构成部分的磷酸部分与其它部分进行了交换的结构；以及糖部分及磷酸部分这两者与其它部分进行了交换的结构。探针X含有人工核酸的情况下，构成探针X的全部的核酸可以为人工核酸。或者，含有在与靶核酸形成异源核酸杂交体时与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸和/或其邻接核苷酸(例如从含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸至5’末端和/或3’末端侧2个或1个的核苷酸)可以为如上所述的人工核酸，但还优选在与靶核酸形成异源核酸杂交体时，仅含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸为如上所述人工核酸。这种探针X还含有任意的核酸碱基，优选可以含有选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、及尿嘧啶(U)中的核酸碱基。
更优选探针X为i)肽核酸(PNA)探针(本探针的其整体或一部分为PNA。一部分为PNA时，在与靶核酸形成异源核酸杂交体时仅含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸可以为PNA)、ii)交联型核酸(BNA)探针(本探针的其整体或一部分为BNA。在一部分为BNA的情况下，在与靶核酸形成异源核酸杂交体时仅含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸可以为BNA)、或者为iii)PNA探针和/或BNA探针与如上所述其它的核酸探针连结成的嵌合体型核酸探针。
构成探针X的核苷酸残基的个数(即探针X的长度)只要是与靶核酸进行杂交所充分的长度即可，没有特别限定，例如可以为10个以上，优选15个以上，更优选20个以上。构成探针X的核苷酸的个数还可以为例如100个以下、80个以下、60个以下、50个以下、40个以下或30个以下。靶核酸的GC含有率没有特别限定，可以为例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、或60％以上。靶核酸的GC含有率还可以为例如90％以下、80％以下、或70％以下。这种探针X例如可以通过该领域中公知的探针合成法来制备。
探针X以游离的形态或在固相(后述)固定后的形态使用。因此，探针X可以用能够进行在固相的固定的物质或基团进行标识。标识在例如5’末端或3’末端的一个末端进行。作为可以进行在固相的固定的基团或物质，可列举例如能够与固相进行共价键键合的基团或物质、及亲和性物质。作为能够进行对共价键的固相进行结合的基团或物质，可列举例如硫醇基或具有硫醇基的物质(导入于探针X的这种硫醇基可以与固相上的马来酰亚胺基结合)、氨基或具有氨基的物质(导入于探针X的这种氨基可以与固相上的马来酸酐结合)。作为亲和性物质，可列举例如：链霉亲和素、生物素、异羟基洋地黄毒苷配基、二硝基苯酚、荧光素、异硫氰酸荧光素。该情况下，作为固相，可以使用用捕捉探针具有的亲和性物质和具有亲和性的其它的用亲和性物质涂敷成的物质。
探针X以游离的形态使用的情况下，探针X可以为修饰核酸碱基配对性异源导向探针。该情况下，作为探针，除修饰核酸碱基配对性异源导向探针(用于支援修饰核酸碱基的检测的探针)之外，可使用捕捉探针(用于将靶核酸固定于固相的探针)。修饰核酸碱基配对性异源导向探针及捕捉探针的组合使用为对不同的探针赋予修饰核酸碱基的检测的作用、及对靶核酸在固相的固定的作用的实施方式。
(异源导向探针：探针Y)
本发明中所使用的修饰核酸碱基配对性异源导向探针除以专门游离的形态使用以外，为关于探针X具有上述的特征的核酸探针。以下，有时将修饰核酸碱基配对性异源导向探针简称为探针Y。探针Y在与捕捉探针杂交的靶核酸中的区域不同的区域中可以与靶核酸杂交。探针Y以不与捕捉探针杂交的方式设计。相对于1个靶核酸可以使用1个或多个(例如2个、3个、4个、或5个)的导向探针。例如多个探针Y可以以与1个靶核酸中的不同的区域继续杂交的方式设计。
(捕捉探针)
本发明中所使用的捕捉探针为具有与靶核酸进行杂交的能力的核酸分子、且可在固相固定的探针。本发明中，捕捉探针以不与探针Y杂交的方式设计。
捕捉探针相对于靶核酸可以由同种和/或由异源核酸构成。在此，用语“同种”是指：将与靶核酸的主链结构(由糖部分及磷酸部分构成的结构)相同的主链结构作为主链结构的整体而具有捕捉探针。另一方面，用语“异源”是指：将与靶核酸的主链结构(由糖部分及磷酸部分构成的结构)不同的主链结构作为主链结构的一部分或整体，具有捕捉探针。因此，捕捉探针的种类可以根据靶核酸的种类而确定。例如，靶核酸为DNA时，作为同种核酸的捕捉探针，可以使用DNA探针，作为异源核酸的捕捉探针，可以使用DNA探针以外的核酸探针。另一方面，靶核酸为天然RNA时，作为同种核酸的捕捉探针，可以使用由与该天然RNA同种的RNA构成的标准RNA探针，作为异源核酸的捕捉探针，可以使用标准RNA探针以外的核酸探针。优选捕捉探针可以相对于靶核酸由异源核酸构成。
作为捕捉探针，可列举例如：DNA探针、RNA探针、肽核酸(PNA)探针、锁型核酸(LNA)探针或交联型核酸(BNA)探针、磷硫酰(S化)核酸探针、及上述2以上的核酸探针连结成的嵌合体型核酸探针(嵌合体型核酸探针必然相对于靶核酸含有异源核酸)。RNA探针与上述的RNA探针相同。
构成捕捉探针的核苷酸残基的个数(即捕捉探针的长度)只要是可与靶核酸杂交的程度所充分的长度，就没有特别限定，例如可以为12个以上，优选15个以上，优选18个以上，更优选20个以上。构成捕捉探针的核苷酸的个数还可以为例如100个以下，80个以下，60个以下或50个以下。捕捉探针中可与靶核酸杂交的区域中的GC含有率例如可以为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、或60％以上。该区域中的GC含有率还可以为例如90％以下，80％以下，或70％以下。捕捉探针例如可以通过该领域中公知的探针合成法来制备。
捕捉探针在工序(1)中使用的情况下，可以以游离的形态或以固相固定的形态使用。因此，捕捉探针可以用能够进行在固相的固定的物质或基团标识。标识例如可以在捕捉探针的5’末端或3’末端的一个末端进行。作为能够进行在固相的固定的基团或物质，可列举例如能够进行对共价键的固相进行结合的基团或物质及亲和性物质。作为能够进行对共价键的固相进行结合的基团或物质，可列举例如硫醇基或具有硫醇基的物质(导入于捕捉探针的这种硫醇基可以与固相上的马来酰亚胺基结合)、氨基或具有氨基的物质(导入于捕捉探针的这种氨基可以与固相上的马来酸酐键)。作为亲和性物质，可列举例如：链霉亲和素、生物素、地谷新配基、二硝基苯酚、荧光素、异硫氰酸荧光素。该情况下，作为固相，可以使用用捕捉探针具有的亲和性物质和具有亲和性的其它的亲和性物质进行了涂敷的物质。捕捉探针在工序(1)中以游离的形态使用的情况下，可以在杂交体形成后在固相进行固定。
探针Y优选为：i)肽核酸(PNA)探针(本探针的其整体或一部分为PNA。一部分为PNA的情况下，在与靶核酸形成异源核酸杂交体时仅含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸可以为PNA)、ii)交联型核酸(BNA)探针(本探针的其整体或一部分为BNA。一部分为BNA的情况下，在与靶核酸形成异源核酸杂交体时仅含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸可以为BNA)、或者iii)PNA探针和/或BNA探针和如上所述其它的核酸探针连结的嵌合体型核酸探针。该情况下，捕捉探针优选相对于靶核酸及探针Y这两者为异源。由于靶核酸优选为DNA，因此，捕捉探针优选为如上所述的修饰RNA探针(例如2’-O-甲基化RNA探针)。
在特定的实施方式中，如上所述，可以使用“探针Y”及“捕捉探针”取代“探针X”。因此，将用语“探针X”交换为“探针Y”及“捕捉探针”的实施方式也是包含在本发明的范围中。
在工序(1)中，孵育在核酸样品中含有靶核酸的情况下，在可进行探针X(游离、或在后述的固相进行固定)(或探针Y及捕捉探针)和核酸样品中的靶核酸的杂交反应的条件下在适当的溶液中进行。作为这种溶液，例如可以使用含有盐(例如柠檬酸钠)及其它的成分(例如表面活性剂)的缓冲液。杂交温度例如为15～95℃(优选25～65℃)。
在核酸样品不含有靶核酸的情况下，即使将核酸样品及探针X(或探针Y及捕捉探针)在溶液中进行孵育，也不会形成异源核酸杂交体。该情况下，后述的工序(2)中，不能检测修饰核酸碱基，但可以判定在核酸样品中不存在修饰核酸碱基。
核酸样品含有不含修饰核酸碱基的靶核酸(即，仅含有非修饰核酸碱基的靶核酸)的情况下，通过将核酸样品及探针X(或探针Y及捕捉探针)在溶液中进行孵育，使不含有修饰核酸碱基的靶核酸及探针X(或探针Y及捕捉探针)进行反应，形成由该靶核酸及探针X(或探针Y及捕捉探针)构成的异源核酸杂交体。该情况下，在后述的工序(2)中，不能检测修饰核酸碱基，但可以判定在核酸样品中不存在(尽管存在靶核酸)修饰核酸碱基，即，靶核酸中的指定的核酸碱基没有被修饰。
核酸样品为包含含有修饰核酸碱基的靶核酸的情况下，通过对核酸样品及探针X(或探针Y及捕捉探针)在溶液中进行孵育，含有修饰核酸碱基的靶核酸及探针X(或探针Y及捕捉探针)进行反应，形成由该靶核酸及探针X(或探针Y及捕捉探针)构成的异源核酸杂交体。该情况下，在后述的工序(2)中，可以判定存在修饰核酸碱基，另外，也可以对修饰核酸碱基进行定量。
本发明中，异源核酸杂交体为具有通过杂交而形成的靶核酸及探针X的双链结构的杂交复合体。或者使用探针Y及捕捉探针代替探针X的情况下，异源核酸杂交体为具有通过靶核酸和探针Y之间的杂交而形成的靶核酸及探针Y的双链结构，以及通过靶核酸和捕捉探针之间的杂交而形成的靶核酸及捕捉探针的双链结构的由靶核酸、探针Y及捕捉探针构成的杂交复合体。
在异源核酸杂交体中，对应于双链结构部分的靶核酸及探针X的核苷酸残基的个数(即双链结构部分的长度)，或者对应于靶核酸及探针Y的双链结构部分的靶核酸及探针Y的核苷酸残基的个数，以及对应于靶核酸及捕捉探针的双链结构部分的靶核酸及捕捉探针的核苷酸残基的个数，只要是可以与靶核酸进行杂交所充分的长度即可，没有特别限定，例如可以为10个以上，优选15个以上，更优选20个以上。对应于双链结构部分的靶核酸及探针X的核苷酸残基的个数，或者对应于靶核酸及探针Y的双链结构部分的靶核酸及探针Y的核苷酸残基的个数，以及对应于靶核酸及捕捉探针的双链结构部分的靶核酸及捕捉探针的核苷酸残基的个数还可以为例如100个以下，80个以下，60个以下，50个以下，40个以下或30个以下。双链结构部分中的GC含有率没有特别限定，例如可以为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、或60％以上。双链结构部分中的GC含有率还可以为例如90％以下，80％以下，或70％以下。靶核酸和探针Y之间的融解温度(Tm1)、及靶核酸和捕捉探针之间的融解温度(Tm2)可以根据探针Y及捕捉探针的长度(即核苷酸残基的个数)适当调整。例如可以以Tm1与Tm2的温度差为20℃、15℃、10℃、或5℃的范围内的方式设计探针Y及捕捉探针。
本发明的方法可以进一步包括：在含有核酸样品的溶液中添加探针X、或探针Y及捕捉探针，制备含有核酸样品及探针X的溶液，或含有核酸样品、探针Y及捕捉探针的溶液。探针X、或探针Y及捕捉探针可以作为固体的形态、或溶液添加于核酸样品。
由包含含有修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品制备上述的孵育用溶液时，溶液中的靶核酸的浓度只要是可以通过本发明的方法进行检测即可，没有特别限定，例如可以为0.01nM以上，优选0.1nM以上，更优选1nM以上，进一步更优选5nM以上，特别优选10nM以上。溶液中的靶核酸的浓度还可以为例如1M以下、100mM以下、10mM以下、1mM以下、100μM以下、10μM以下或1μM以下。
溶液中的探针X的浓度只要是可以通过本发明的方法进行检测靶核酸即可，没有特别限定，例如可以为0.01nM以上，优选0.1nM以上，更优选1nM以上，进一步更优选5nM以上，特别优选10nM以上。溶液中的探针X的浓度还可以为例如1M以下、100mM以下、10mM以下、1mM以下、100μM以下、10μM以下或1μM以下。因此，可以将探针X添加于溶液中，使得达到这种浓度。
或者，孵育溶液中的探针Y的浓度只要是可以通过本发明的方法而检测靶核酸，就没有特别限定，例如可以为0.01nM以上、优选0.1nM以上、更优选1nM以上、进一步更优选5nM以上、特别优选10nM以上。溶液中的捕捉探针的浓度还可以为例如1M以下、100mM以下、10mM以下、1mM以下、100μM以下、10μM以下或1μM以下。因此，可以以达到这种浓度的方式将探针Y添加于溶液中。
孵育溶液中的捕捉探针的浓度只要可以通过本发明的方法检测靶核酸即可，没有特别限定，例如可以为0.01nM以上，优选0.1nM以上，更优选1nM以上，进一步更优选5nM以上，特别优选10nM以上。溶液中的捕捉探针的浓度还可以为例如1M以下、100mM以下、10mM以下、1mM以下、100μM以下、10μM以下或1μM以下。因此，可以将捕捉探针添加于溶液中，使得达到这种浓度。
孵育溶液中的探针Y和捕捉探针的浓度比只要可以测定靶核酸中的修饰核酸碱基即可，没有特别限定。例如浓度比(异源导向探针:捕捉探针)可以为1:100～100:1、1:50～50:1、1:20～20:1、或1:10～10:1。或者，捕捉探针与探针Y相比，可以以高浓度使用。
在优选的实施方式中，靶核酸可以为有可能含有2以上的修饰核酸碱基的靶核酸。在此，有可能包含于靶核酸中的修饰核酸碱基的个数只要为2以上即可，没有特别限定，例如为2～30个、2～20个、2～10个或2～5个(例如2、3、4或5个)。靶核酸中所含的修饰核酸碱基的个数为多个的情况下，确认：即使用于靶核酸和探针X的杂交的溶液中的靶核酸为非常低的浓度，也可以高灵敏度地测定修饰核酸。因此，在本发明的方法中，可以使用设计的探针X(或探针Y)，使得与有可能含有2个以上的修饰核酸碱基的靶核酸进行杂交。如果判明应该待测定的靶核酸中的有可能被修饰的核酸碱基的个数，则可以进行这种设计。
在一个优选的实施方式中，核酸样品为包含含有修饰核酸碱基的单链的靶核酸(优选靶DNA)的样品。该情况下，工序(1)除用于单链的靶核酸、捕捉探针及导向探针的杂交反应而进行孵育之外，可以包含用于单链的靶核酸的改性反应而进行孵育。例如，用于杂交反应的孵育可以在上述的杂交条件下进行，用于改性反应的孵育可以在70～100℃(优选80～98℃)下的1～30分钟(优选2～10分钟)的条件下进行。
在其它的优选的实施方式中，核酸样品为包含含有修饰核酸碱基的双链的靶核酸(优选靶DNA)的样品。该情况下，工序(1)除用于双链的靶核酸、捕捉探针及导向探针的杂交反应而进行孵育之外，可以含有用于双链的靶核酸的解离及改性反应而进行孵育。例如，用于杂交反应的孵育可以在上述的杂交条件下进行，用于解离及改性反应的孵育可以在70～100℃(优选80～98℃)下的1～30分钟(优选2～10分)的条件下进行。
并且，在其它的优选的实施方式中，在核酸改性剂的存在下，将核酸样品、捕捉探针及导向探针在溶液中进行孵育。核酸改性剂是指具有通过破坏核酸的高次结构而使核酸改性的能力的物质。孵育溶液中的核酸改性剂的浓度优选以提高靶核酸(特别、双链的靶核酸)中的修饰核酸碱基的检测灵敏度的方式进行设定。这种浓度例如为超过0.5M的浓度，优选为1M以上。这种浓度还可以为20M以下、10M以下、8M以下、6M以下、4M以下、3M以下或2.5M以下。核酸改性剂可以为1种，也可以为多种(例如2或3种)。
作为核酸改性剂，可列举例如：离液剂、及给电子性化合物。
作为离液剂，可列举例如：胍鎓离子、钡离子、钙离子、镁离子、硫氰酸离子、过氯酸根离子、硝酸根离子、溴离子、碘化物离子、脲、及它们的盐(例如金属盐、无机盐、有机盐)。离液剂优选为硫氰酸胍、胍盐酸盐、或脲。
本发明中，给电子性化合物是指具有核酸的改性作用的给电子性的含杂原子化合物。作为杂原子，可列举例如氮原子、氧原子及硫原子。优选给电子性化合物为具有给电子性的杂环化合物。作为这种杂环化合物，可列举例如非芳香族杂环化合物、及具有π电子过量的芳香族杂环(例如5元环的芳香族杂环)的化合物。作为具有给电子性的杂环化合物，可列举例如具有给电子性、在环中具有含有1个或2个以上的杂原子的5元环结构的单环式芳香族杂环化合物(例如吡咯、吡唑、咪唑)及其缩合环化合物(例如吲哚、苯并咪唑)、以及具有给电子性、在环中含有1个或2个以上的杂原子而成的非芳香族杂环化合物(例如吡咯烷、哌啶、哌嗪)。优选杂原子为氮原子。
在进一步优选的实施方式中，在核酸改性剂及表面活性剂这两者的存在下，将核酸样品、捕捉探针及导向探针在溶液中进行孵育。该情况下，核酸改性剂、孵育溶液中的核酸改性剂的浓度如上所述。孵育溶液中的表面活性剂的浓度优选以降低检测信号的背景值的方式设定。这种浓度例如为0.05％(v/v)以上，优选为0.1％(v/v)以上，更优选为0.5％(v/v)以上。这种浓度还可以为20％(v/v)以下、10％(v/v)以下、8％(v/v)以下、6％(v/v)以下、4％(v/v)以下、或2％(v/v)以下。表面活性剂可以为1种，也可以为多种(例如2或3种)。
作为表面活性剂，可列举例如：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂或非离子性表面活性剂。
作为阴离子性表面活性剂，可列举例如：硫酸己酯、硫酸辛酯、硫酸癸酯、硫酸十二烷基酯、硫酸十四烷基酯、硫酸十六烷基酯、磺酸十二烷基酯、苯磺酸十二烷基酯、正月桂酰肌氨酸、及正十二烷酰基肌氨酸、以及它们的盐(例如钠盐)。
作为阳离子性表面活性剂，可列举例如：季铵化合物(例如十六烷基二甲基乙基铵、十六烷基三甲基铵、十六烷基三甲基铵、及十四烷基三甲基铵)及季鏻化合物、以及它们的盐(例如卤化物)。
作为两性表面活性剂，可列举例如：Zwittergent、ASB-14、3-N(N,N-二甲基辛基铵基)丙烷磺酸、3-n(N,N-二甲基辛基铵基)丙烷磺酸、3-(癸基二甲基铵基)丙烷磺酸、N-十二烷基N,N-二甲基-3铵基-1丙烷磺酸、3-(N,N-二甲基十四烷基铵基)丙烷磺酸、3-(N,N-二甲基棕榈酰铵基)丙烷磺酸、及3-(N,N-二甲基十八烷基铵基)丙烷磺酸、以及它们的盐。
作为非离子性表面活性剂，可列举例如：Tween系表面活性剂(例如Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80)、TritonX系表面活性剂(例如TritonX-100)、MEGA系表面活性剂(例如Mega-8)、NP40。
修饰核酸碱基在含有异源核酸杂交体的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行测定。在测定时，可以直接使用工序(1)中得到的溶液，但通过含有基于抗体的修饰核酸碱基的靶核酸的测定而在适合的溶液中进行测定，因此，可以进行其它的溶液的添加和/或溶液向其它溶液的交换。这种交换例如可以通过向固相添加工序(1)中得到的溶液，将可在溶液中含有的异源核酸杂交体在固相固定化，接着从固相中除去溶液，根据需要用清洗液清洗之后，通过添加其它的溶液(例如含有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体的溶液)而进行。用于测定的溶液只要是适于抗原、抗体反应的溶液即可，没有特别限定。
测定可以通过免疫学的方法而进行。作为这种免疫学的方法，可列举例如：酶免疫测定法(EIA)(例如直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、三明治ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光光免疫测定法(发光IA)、免疫色谱法、发光免疫测定法、旋转免疫测定法、蛋白质印迹法、胶乳凝集法。
针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以为免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)的任一种同种型。针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体还可以为全长抗体。全长抗体是指：包含分别含有可变区域及恒定区域的重链及轻链的抗体(例如含有2个Fab部分及Fc部分的抗体)。针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体还可以为源自上述全长抗体的抗体片段。抗体片段为全长抗体的一部分，可列举例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv。针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体还可以为单链抗体等改造抗体。针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体并且可以在ELISA等免疫测定中用作1次抗体，该情况下，组合使用2次抗体。
针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体中的用语“异源配对性修饰核酸碱基”是指探针X中的互补的与核酸碱基配对的状态下的修饰核酸碱基。因此，针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体不能检测没有形成异源核酸杂交体的靶核酸中的修饰核酸碱基(例如单链核酸中的修饰核酸碱基)，但可以特异性地检测形成异源核酸杂交体的靶核酸中的修饰核酸碱基。例如，作为靶核酸为DNA时的针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体，可列举：1)针对于由选自2’-脱氧修饰腺苷、2’-脱氧修饰鸟苷、2’-脱氧修饰胞苷及2’-脱氧修饰胸苷中的具有修饰核酸碱基的脱氧核糖核苷、以及其互补的异源核酸(非脱氧核糖核苷)构成的配对单元的抗体，2)针对于由选自2’-脱氧修饰腺苷5’-磷酸酯、2’-脱氧修饰鸟苷5’-磷酸酯、2’-脱氧修饰胞苷5’-磷酸酯及2’-脱氧修饰胸苷5’-磷酸酯构成的组中的具有修饰核酸碱基的脱氧核糖核苷酸、以及其互补的异源核酸(非脱氧核糖核苷)构成的配对单元的抗体。另一方面，作为靶核酸为RNA时的针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体，可列举例如：1’)针对于由选自修饰腺苷、修饰鸟苷、修饰胞苷及修饰尿核苷中具有修饰核酸碱基的核苷、以及其互补的异源核酸(非正常RNA)构成的配对单元的抗体，2’)针对于由选自修饰腺苷5’-磷酸酯、修饰鸟苷5’-磷酸酯、修饰胞苷5’-磷酸酯及修饰尿苷5’-磷酸酯中的具有修饰核酸碱基的核糖核苷酸、以及其互补的异源核酸(非标准RNA)构成的配对单元的抗体。
针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以通过将由含有修饰核酸碱基的核酸及探针X(定义、实例、及优选的实例如上所述)构成的异源核酸杂交体用作抗原而制备(例如参照后述的制备例)。例如，可以使用作为单克隆抗体的制作方法的噬菌体展示法(Ulman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，1184-89(1993))、及ADLib***(国际公开第2004/011644号)等活体外部(invitro)法。
然而，本发明中，确认：通过将含有具有回文结构的含修饰核酸碱基的异源双重链的异源核酸杂交体用作抗原，可以有效地获得针对于异源配对性修饰核酸碱基的优质的抗体(例如参照后述的制备例)。因此，针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以为将含有具有回文结构的含修饰核酸碱基的异源双重链的异源核酸杂交体用作抗原而制作的抗体。作为具有回文结构的含修饰核酸碱基的异源双重链，可列举例如以下的式(I)表示的异源双重链。该情况下，由含有修饰核酸碱基的靶核酸及探针X构成的异源核酸杂交体可以具有以下的式(I)或(II)表示的部分结构。
[化学式2]
正义链5’末端…Xs-Ys…3’末端 (I)
反义链3’末端…Xs-Ys…5’末端
[化学式3]
正义链5’末端…Xs-Ys…3’末端 (II)
反义链N末端…Ya-Xa…C末端
[式(I)及(II)中，
s及a分别是指为正义链及反义链中的核苷酸残基，正义链及反义链相互为异源(参照上述“异源”的定义及例示)。
构成Xs及Xa的核苷酸残基中的核酸碱基相同，表示选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)中的残基。
构成Ys及Ya的核苷酸残基中的核酸碱基相同，表示选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)中的残基。
X及Y中的核苷酸残基中的核酸碱基是互补的，Xs与Ya进行了配对，Ys与Xa进行了配对。
构成正义链或反义链的一者的核苷酸残基中的至少1个核酸碱基(优选1个核酸碱基)进行了修饰。优选含有与修饰核酸碱基配对的核酸碱基的核苷酸残基具有与该一者的链的主链结构(含有修饰核酸碱基的核苷酸残基具有的结构)不同的、如上所述的主链结构。]
优选上述式(I)表示的异源双重链可以为以下的式(I-1)或(I-2)表示的异源双重链。另外，上述式(II)表示的异源双重链可以为以下的式(II-1)或(II-2)表示的异源双重链。可以将含有以下的式(I-1)表示的异源双重链及(I-2)表示的异源双重链这两者的异源核酸杂交体、或含有以下的式(II-1)表示的异源双重链及(II-2)表示的异源双重链这两者的异源核酸杂交体用作抗原。这些情况下，由含有修饰核酸碱基的靶核酸及探针X构成的异源核酸杂交体可以具有以下的式(I-1)和/或(I-2)、以及/或者以下的式(II-1)和/或(II-2)表示的部分结构。
[化学式4]
正义链5’末端…G-C…3’末端 (I-1)
反义链3’末端…C-G…5’末端
正义链5’末端…C-G…3’末端 (I-2)
反义链3’末端…G-C…5’末端
[化学式5]
正义链5’末端…G-C…3’末端 (II-1)
反义链N末端…C-G…C末端
正义链5’末端…C-G…3’末端 (II-2)
反义链N末端…G-C…C末端
[式(I-1)、(I-2)、(II-1)及(II-2)中，
G表示鸟嘌呤残基，C表示胞嘧啶残基。
构成正义链的胞嘧啶残基进行了修饰。优选与修饰胞嘧啶残基配对的鸟嘌呤残基具有与正义链的主链结构(修饰胞嘧啶残基具有的结构)不同的、如上所述的主链结构。]
针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以在固相进行固定化而使用，也可不在固相固定而使用。作为固相，可列举例如：粒子(例如磁性粒子)、薄膜(例如硝基纤维素膜)、玻璃、塑料及金属等支撑体、板(例如多孔板)等容器、以及设备。抗体还可以以含浸于铝纸等介质的形态被提供。针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以用标识物质进行标识。作为标识物质，可列举例如：酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶(luciferase)、β半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如链霉亲和素、生物素)、荧光光物质(例如荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明等低分子化合物、以及绿色荧光光蛋白质、红色荧光光蛋白质等荧光光蛋白质)、发光物质(例如荧光素、埃奎明)、放射性物质(例如3H、14C、32P、35S、125I)。或者，标识物质为蛋白质的情况下，针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体可以以与蛋白质(例如如上所述酶或荧光光蛋白质)融合后的形态使用。在本发明的方法中使用2次抗体时，2次抗体可以用这种标识物质进行了标识，另外，也可以以与蛋白质(例如如上所述酶或荧光光蛋白质)融合后的形态使用。
针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体的含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定定性或定量地进行，可以评价修饰核酸碱基的有无或量。需要说明的是，本发明中，含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定不仅是指修饰核酸碱基自身的测定，而且也是指含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定。
例如，修饰核酸碱基的有无的测定可以通过以下方法来进行：
(2-1)在上述工序(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行检测，计测信号值；
(2-2)在不含有含修饰核酸碱基的靶核酸，且含有探针X(或探针Y及捕捉探针)的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行测定，计测背景值；及
(2-3)对信号值与背景值进行比较，评价有无修饰核酸碱基。
在含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定中，信号值及背景值为利用与针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体或2次抗体(使用2次抗体的情况下)进行了结合的标识所计测的值(例如吸光度、荧光光度、显色度及放射活性)。
另外，修饰核酸碱基的量的测定例如可以与背景值的测定同时进行。具体而言，可以通过以下方法来进行：
(2-1’)在上述工序(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行测定，计测信号值；
(2-2’)在不含有含修饰核酸碱基的靶核酸，且含有探针X(或探针Y及捕捉探针)的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行测定，计测背景值；
(2-3’)用背景值修正信号值，得到修正信号值；以及
(2-4’)基于修正信号值，评价修饰核酸碱基的量。
或者，修饰核酸碱基的量的测定可以使用标准品而进行。具体而言，可以通过以下方法来进行：
(2-1”)在上述工序(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行测定，计测信号值；
(2-2”)在含有修饰核酸碱基的靶核酸(标准品)、且含有探针X(或探针Y及捕捉探针)的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体进行测定，计测检量用值；以及
(2-3”)对信号值与检量用值进行对照，评价修饰核酸碱基的量。
使用标准品的上述测定可以与背景值的上述测定组合使用。
在特定的实施方式中，本发明的方法可以通过ELISA来进行。例如，核酸样品包含含修饰核酸碱基的靶核酸时，利用ELISA的本发明的方法可以通过以下方法来进行：
(i-1)将含有含修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品及用第1亲和性物质标识后的探针X(或探针Y及捕捉探针)在溶液中进行孵育，形成由该靶核酸及该探针X(或探针Y及捕捉探针)构成的异源核酸杂交体；
(ii-1)将异源核酸杂交体在用第2亲和性物质进行了处理的固相进行固定；
(iii-1)使针对于修饰核酸碱基的1次抗体与在固相固定了的异源核酸杂交体进行反应，得到1次抗体和异源核酸杂交体的1次复合体；
(iv-1)使用标识物质进行了标识的2次抗体与1次复合体反应，得到2次抗体和1次抗体的2次复合体；以及
(v-1)利用2次复合体中的2次抗体具有的标识物质，测定所形成的异源核酸杂交体(即，靶核酸中的修饰核酸碱基)的存在和/或量。
第1亲和性物质及第2亲和性物质以相互具有亲和性的组合(例如生物素和链霉亲和素的组合)使用。需要说明的是，本发明的方法可以包含：代替上述工序(i-1)及(ii-1)、(i’-1)包含含修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品，及将在固相固定的探针X在溶液中进行孵育，形成由该靶核酸及该探针X构成的异源核酸杂交体。该情况下，可以进一步包括得到在固相进行了固定的探针X(例如将用第1亲和性物质进行了标识的探针X添加至用第2亲和性物质进行了处理的固相)。本发明的方法可以包含在工序(iii-1)之前清洗固相。2次抗体可以为仅识别1次抗体的抗体(例如与1次抗体的恒定区域结合的抗体)，也可以为识别2次复合体中的1次抗体及1次复合体这两者的抗体。包含(i-1)～(v-1)的本发明的方法可以按照本说明书中详细地记载的方法论而进行。
利用ELISA的本发明的方法还可以通过以下方法来进行：
(i-2)将包含含修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品、探针Y、及用第1亲和性物质进行了标识的捕捉探针在溶液中进行孵育，形成由该靶核酸、该探针Y及捕捉探针构成的异源核酸杂交体；
(ii-2)将异源核酸杂交体在用第2亲和性物质进行了处理的固相进行固定；
(iii-2)使针对于异源配对性修饰核酸碱基的1次抗体与在固相固定的异源核酸杂交体进行反应，得到1次抗体与杂交体的1次复合体；
(iv-2)使用标识物质进行了标识的2次抗体与1次复合体进行反应，得到2次抗体和1次抗体的2次复合体；以及
(v-2)利用2次复合体中的2次抗体具有的标识物质，测定所形成的异源核酸杂交体(即，靶核酸中的修饰核酸碱基)的存在和/或量。
第1亲和性物质及第2亲和性物质以相互具有亲和性的组合(例如生物素和链霉亲和素的组合)使用。需要说明的是，本发明的方法可以包含代替上述工序(i-2)及(ii-2)，将包含含有(i’-2)修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品、探针Y、及以在固相进行了固定的捕捉探针在溶液中进行孵育，形成由该靶核酸、探针Y及该捕捉探针构成的异源核酸杂交体。该情况下，可以进一步包括得到在固相固定的捕捉探针(例如将用第1亲和性物质进行了标识的捕捉探针加入至用第2亲和性物质进行了处理的固相)。本发明的方法可以包括在工序(iii-2)之前清洗固相。2次抗体可以为仅识别1次抗体的抗体(例如与1次抗体的恒定区域结合的抗体)，也可以为识别2次复合体中的1次抗体及1次复合体这两者的抗体。含有(i-2)～(v-2)的本发明的方法还可以按照本说明书中详细地记载的方法论而进行。
本发明还提供一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定用试剂盒。本发明的试剂盒例如包含以下步骤：
(I)探针X(或探针Y及捕捉探针)；及
(II)针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体。
探针X(或探针Y及捕捉探针)及修饰核酸碱基如上所述。例如，探针X(或捕捉探针)可以用亲和性物质进行了标识，针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体也可以用标识物质进行了标识。本发明的试剂盒可以还含有亲和性物质、标识物质、2次抗体、2次抗体的检测试剂(例如在用酶标识2次抗体的情况下，为该酶的基质)及固相等如上所述的构成成分。固相可以用亲和性物质进行处理。本发明的试剂盒还可以将修饰核酸碱基的标准品、或含有修饰核酸碱基的靶核酸的标准品作为溶液或作为粉末而含有。
本发明的试剂盒以相互隔离的形态或混合的形态含有各构成成分。例如，在本发明的试剂盒中，各构成成分可以分别以收容于不同的容器(例如管、板)的形态提供。或者，本发明的试剂盒可以以设备的形态提供。具体而言，构成成分的全部可以以收容于设备中的形态提供。或者，构成成分的一部分以收容于设备中的形态提供，残留的物质可以以不会收容于设备中的形态(例如收容于不同的容器的形态)提供。该情况下，没有收容于设备中的构成成分在靶物质的测定的时，可以通过注入于设备中而被使用。
实施例
以下，参照实施例，说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1：使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的修饰核酸碱基的特异的检测
序列1的主链为DNA，序列为5’-[C]GTAGGAGGAGGAAG[C]-3’(序列号1；[C]为5-甲基胞嘧啶；3’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。互补链1(核酸探针)的主链为肽核酸(PNA)，序列为N末端-GCTTCCTCCTCCTACG-C末端(序列号2)，使用由FASMAC株式会社人工合成的物质。
首先，将序列1(500pmol)和互补链1(750pmol)在95℃下反应5分钟之后，在60℃下反应1小时，接着在37℃下反应1小时，由此得到异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)。
除不对胞嘧啶碱基进行甲基化以外，序列2与序列1相同，使用互补链1(核酸探针)，用与序列1同样的方法得到异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)。
序列3的主链为DNA，序列为5’-TTG[C]GCGGCGTC[C]TGTTGACTTC-3’(序列号4；[C]为5-甲基胞嘧啶)，互补链2(核酸探针)的主链为DNA，序列为5’-GAAGTCAACAGGACGCCGCGCAA-3’(序列号5；5’末端为生物素标识)，均使用由北海道SystemScience株式会社人工合成的物质，用与序列1同样的方法得到同种核酸杂交体(双链DNA)。
序列4的主链为PNA，序列为N末端-GGTCTGTGAGTGGTTC-C末端(序列号6；3’末端为生物素标识)，使用由FASMAC株式会社人工合成的物质。
序列5的主链为DNA，序列为5’-CCAGACACTCACCAAG-3’(序列号7；3’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。
[表1]
表1.实施例1中使用的靶核酸的概要
靶核酸 主链 核苷酸序列 序列号
序列1 DNA 5’-[C]GT AGG AGG AGG AAG [C]-3’ 序列号1
序列2 DNA 5’-CGT AGG AGG AGG AAG C-3’ 序列号3
序列3 DNA 5’-TTG [C]GC GGC GTC [C]TG TTG ACT TC-3’ 序列号4
序列4 PNA N末端-GGT CTG TGA GTG GTT C-C末端 序列号6
序列5 DNA 5’-CCA GAC ACT CAC CAA G-3’ 序列号7
[表2]
表2.实施例1中使用的核酸探针的概要
核酸探针 主链 核苷酸序列 序列号
互补链1 PNA N末端-GCT TCC TCC TCC TAC G-C末端 序列号2
互补链2 DNA 5’-GAA GTC AAC AGG ACG CCG CGC AA-3’ 序列号5
首先，通过将上述中制备的异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)、同种核酸杂交体(双链DNA)、单链PNA、及单链DNA溶解于PBS50μL中而制备成20nM，然后，总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(Thermo Scientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此将核酸固定化在链霉亲和素板上。用300μL的PBS-T清洗3次，加入后述的制备例1中得到的细胞孵育的上清液(Clone10-1-6E稀释为5倍，10-1-5-4E、19-3-6H稀释10倍)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次，加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次之后，各加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)50μL，在室温下反应5分钟。其后，加入1N硫酸溶液各50μL，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(ThermoScientific公司制造的MULTISKAN)测定450nm的吸光度。
其结果，确认：通过针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的使用，可以特异性地检测异源核酸杂交体中的修饰核酸碱基(表3、图1)。
[表3]
表3.使用了针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性核酸探针对修饰核酸碱基进行特异性检测
*表示靶序列(序列1及3)包含修饰核酸碱基序列。
异源：修饰核酸碱基配对性核酸探针的主链结构与靶核酸的主链结构不同。
同种：修饰核酸碱基配对性核酸探针的主链结构与靶核酸相同。
实施例2：使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的修饰核酸碱基的周边序列非依赖的检测
由序列1(DNA)和互补链1(PNA)构成的异源核酸杂交体、及由序列2(DNA)和互补链1(PNA)构成的异源核酸杂交体用用与实施例1同样的方法得到。
序列6的主链为DNA，序列为5’-TAGAA[C]GCTTTG[C]GT-3’(序列号8；[C]为5-甲基胞嘧啶；5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。互补链3(核酸探针)的主链为PNA，序列为N末端-ACGCAAAGCGTTCTA-C末端(序列号9)，使用由FASMAC公司人工合成的物质。
首先，使序列6(2nmol)和互补链3(4nmol)溶解于杂交缓冲液4×SSC、0.08％Tween20)100μL中。在99℃下反应5分钟之后，在60℃下反应1小时，接着在37℃下反应1小时，由此得到异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)。
序列7的主链为DNA，序列为5’-GT[C]GTTTT[C]GG[C]GGC[C]GC-3’(序列号10；[C]为5-甲基胞嘧啶)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。互补链4(核酸探针)的主链为PNA，序列为N末端-GCGGCCGCCGAAAACGAC-C末端(序列号11；N末端为生物素标识)，使用由FASMAC公司人工合成的物质。
首先，使序列7(4nmol)和互补链4(2nmol)溶解于杂交缓冲液(4×SSC、0.08％Tween20)100μL中。在99℃下反应5分钟之后，在60℃下反应1小时，接着在37℃下反应1小时，由此得到异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)。
序列8的主链为DNA，序列为5’-GCC[C]GCA[C]GTCCT[C]G[C]GG-3’(序列号12；[C]为5-甲基胞嘧啶；5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。互补链5(核酸探针)的主链为PNA，序列为N末端-CCGCGAGGACGTGCGGGC-C末端(序列号13)，使用由FASMAC株式会社人工合成的物质，用与序列6同样的方法得到异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)。
[表4]
表4.实施例2中使用的靶核酸的概要
靶核酸 主链 核苷酸序列 序列号
序列1 DNA 5’-[C]GT AGG AGG AGG AAG [C]-3’ 序列号1
序列2 DNA 5’-CGT AGG AGG AGG AAG C-3’ 序列号3
序列6 DNA 5’-TAG AA[C] GCT TTG [C]GT-3’ 序列号8
序列7 DNA 5’GT[C] GTT TT[C] GG[C] GGC [C]GC-3’ 序列号10
序列8 DNA 5’-GCC [C]GC A[C]G TCC T[C]G [C]GG-3’ 序列号12
[表5]
表5.实施例2中使用的修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的概要
探针X 主链 核苷酸序列 序列号
互补链1 PNA N末端-GCT TCC TCC TCC TAC G-C末端 序列号2
互补链3 PNA N末端-ACG CAA AGC GTT CTA-C末端 序列号9
互补链4 PNA N末端-GCG GCC GCC GAA AAC GAC-C末端 序列号11
互补链5 PNA N末端-CCG CGA GGA CGT GCG GGC-C末端 序列号13
首先，通过将上述中制备的异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)溶解于PBS50μL中而制备成20nM，然后，总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(ThermoScientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此将核酸固定化在链霉亲和素板上。用300μL的PBS-T清洗3次，加入后述的制备例1中得到的细胞孵育的上清液(Clone19-3-6H、100倍稀释)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次，各加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次之后，各加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)50μL，在室温下反应5分钟。其后，加入1N硫酸溶液各50μL，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Thermo Scientific公司制造的MULTISKAN)测定450nm的吸光度。
其结果，确认：本发明的方法与异源核酸杂交体中的修饰核酸碱基的周边序列没有联系，可以特异性地识别修饰核酸碱基(表6、图2)。
[表6]
表6.使用针对异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针对修饰核酸碱基的周边序列非依赖性进行测定
*表示靶序列(1、6～8)含有修饰核酸碱基。
“序列2+互补链1”：负对照(序列2不含有修饰核酸碱基)
实施例3：使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的修饰核酸碱基的用量依赖的检测
靶核酸的序列为上述的序列6(DNA)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的序列为上述的互补链3，使用由FASMAC公司人工合成的肽核酸(PNA)。
首先，使靶核酸(500pmol)和修饰核酸碱基配对性异源核酸探针(10pmol)溶解于杂交缓冲液(4×SSC、0.08％Tween20)25μL中。在95℃下反应5分钟之后，在60℃下反应1小时，接着在37℃下反应1小时，由此得到异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)。
另外，作为核酸探针，除主链为DNA以外，使用与上述相同的探针，用同样的方法得到同种核酸杂交体(双链DNA)。
[表7]
表7.实施例3中使用的靶核酸的概要
靶核酸 主链 核酸序列 序列号
序列6 DNA 5’-TAG AA[C] GCT TTG [C]GT-3’ 序列号8
[表8]
表7.实施例3中使用的导向探针的概要
探针X 主链 核苷酸序列 序列号
互补链3 PNA N末端-ACG CAA AGC GTT CTA-C末端 序列号9
首先，使上述中制备的异源核酸杂交体(2.5pmol、0.5pmol、或0.1pmol)溶解于PBS50μL中之后，总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(Thermo Scientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此将核酸的混合物固定化在链霉亲和素板上。另外，对不含有上述中制备的同种核酸杂交体(2.5pmol、0.5pmol、或0.1pmol)、没有伴随互补链的单链的靶核酸(2.5pmol、0.5pmol、或0.1pmol)、或不含有靶核酸的溶液也进行同样的操作。用300μL的PBS-T清洗3次，加入后述的制备例1中得到的细胞孵育的上清液(Clone19-3-6H、100倍稀释)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次，各加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次之后，各加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)100μL，在遮光室温下反应10分钟。其后，各加入2N盐酸溶液100μL，利用全自动定量绘图酶标仪(MicroplateReader)(Thermo Scientific公司制造的MULTISKAN)测定450nm的吸光度。
其结果，仅在使用修饰核酸碱基配对性异源核酸探针(PNA)的情况下，靶核酸量依赖性地信号上升。因此，通过本发明的方法而确认可以定量靶核酸(表9、图3)。
[表9]
使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针的修饰核酸碱基第周边序列非依赖性进行检测
实施例4：针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体、以及修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及使用有捕捉探针的修饰核酸碱基的特异的检测
4-1)靶核酸的制备
在靶核酸序列的制备中，使用聚合酶链式反应(PCR)法。作为PCR用的酶，使用东洋纺织株式会社制造的KODPlus(商品编号：KOD-201)，作为核酸扩增用的2种引物，使用由北海道System Science株式会社人工合成的、正向引物：5’-TAGAACGCTTTGCGTCCCGAC-3’(序列号14)、反向引物：5’-CTGCAGGACCACTCGAGGCTG-3’(序列号15)。就PCR扩增的议定书而言，在94℃下加热2分钟之后，将94℃15秒、55℃30秒、68℃1分钟作为1组设为30循环。
将由北海道System Science株式会社人工合成的核酸[序列：5’-TAGAACGCTTTGCGTCCCGACGCCCGCAGGTCCTCGCGGTGCGCACCGTTTGCGACTTGGTGAGTGTCTGGGTCGCCTCGCTCCCGGAAGAGTGCGGAGCTCTCCCTCGGGACGGTGGCAGCCTCGAGTGGTCCTGCA-3’(序列号16)]用作模板进行PCR扩增之后，使用QIAGEN公司的QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，由此制备138碱基对的核酸序列。
关于上述中制备的138碱基对的核酸序列，为了将核酸序列中的CpG的胞嘧啶进行甲基化，用Thermo Scientific公司的CpG Methyltransferase(M.SssI)(商品编号：EM0821)进行处理。反应溶液按照附加文书制备。在37℃下反应20分钟后，在65℃下进一步反应20分钟，其后，使用QIAGEN公司的QIA quick Nucleotide Removal Kit进行纯化，由此得到靶核酸。
4-2)靶核酸的检测
捕捉探针为5’-UGCAGGACCACUCGAGGCUGCCAC-3’(序列号17；核酸的主链为2’-O-甲基化RNA；5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。修饰核酸碱基配对性异源导向探针的序列为N末端-ACGCAAAGCGTTCTA-C末端(序列号18)，使用由FASMAC社人工合成的肽核酸(PNA)。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，分别使用实施例4-1)中制备的靶核酸。
作为同种导向探针，除主链为DNA以外，使用与上述相同的探针，进行同样的操作。同种导向探针使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。
对不含有导向探针的条件也进行同样的操作。
另外，作为靶核酸，对不实施实施例4中记载的Thermo Scientific公司的CpGMethyltransferase(M.SssI)中的处理的物质，即使用将靶核酸序列中的CpG的胞嘧啶没有进行甲基化的序列的条件也进行同样的操作。
首先，使含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸(500fmol)、捕捉探针(1pmol)、及异源或同种导向探针(5pmol)溶解于杂交缓冲液(100mMTris-Cl、1.5M咪唑、50mMEDTA·2Na)50μL中。在95℃下反应5分钟之后，在50℃下反应1小时，由此形成靶核酸、捕捉探针、及异源或同种导向探针的3者的杂交体。另外，制备不含有靶核酸的溶液，进行同样的操作。将杂交反应后的溶液总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(Thermo Scientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此在链霉亲和素板上将核酸的混合物固定化。用300μL的PBS-T清洗3次，加入后述的制备例1中得到的细胞孵育的上清液(Clone19-3-6H、50倍稀释)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次，加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次之后，各加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)100μL，在遮光室温下1反应5分钟。其后，加入2N盐酸溶液各100μL，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Perkin Elmer公司制造的Arvo)测定450nm的吸光度。
其结果，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体、以及修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针的本发明的方法可以特异性地检测修饰核酸碱基(表10、图4)。
[表10]
表10.使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体以及修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针进行修饰核酸碱基特异性检测
实施例5：使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针(BNA探针)的修饰核酸碱基的特异的检测(1)
序列6的主链为DNA，序列为5’-TAGAA[C]GCTTTG[C]GT-3’(序列号8；[C]为5-甲基胞嘧啶；5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。互补链6(核酸探针)的主链为DNA，但在其一部分中含有交联型核酸(BNA)，序列为5’-ACGCAAAGC(G)TTCTA-3’(序列号25；(G)为具有BNA-NC(N-Me)结构的鸟嘌呤碱基)，使用由GeneDesign株式会社人工合成的物质。
首先，将序列6(1nmol)和互补链6(2nmol)在95℃下反应5分钟之后，在42℃下反应1小时，接着在37℃下反应1小时，由此得到异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)。
互补链7(序列号26)除不含有BNA以外，与互补链6相同，使用序列6，用与互补链7同样的方法得到同种核酸杂交体(双链DNA)。
[表11]
表11.实施例5中使用的靶核酸的概要
靶核酸 主链 核苷酸序列 序列号
序列6 DNA 5’-TAG AA[C] GCT TTG [C]GT-3’ 序列8
[表12]
表12.实施例5中使用的核酸探针的概要
核酸探针 主链 核苷酸序列 序列号
互补链6 DNA 5’-ACG CAA AGC (G)TT CTA-3’ 序列25
互补链7 DNA 5’-ACG CAA AGC GTT CTA-3’ 序列26
首先，通过将上述中制备的异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)、或同种核酸杂交体(双链DNA)溶解于PBS50μL中而制备成20nM之后，总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(Thermo Scientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此将核酸固定化在链霉亲和素板上。用300μL的PBS-T清洗3次，加入后述的制备例2中得到的细胞孵育的上清液(Clone20-H2、20-E3、20-G5、20-H7)各50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次，各加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次之后，各加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)50μL，在室温下反应5分钟。其后，加入1N硫酸溶液各50μL，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Thermo Scientific公司制造的MULTISKAN)测定450nm的吸光度。
其结果，确认：通过针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针(BNA探针)的使用，可以特异性地检测异源核酸杂交体(表13、图5)。
[表13]
表13.使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性核酸探针(BNA探针)进行的修饰核酸碱基的特异性检测(1)
实施例6：使用有针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针(BNA探针)的修饰核酸碱基的特异的检测(2)
序列6的主链为DNA，序列为5’-TAGAA[C]GCTTTG[C]GT-3’(序列号8；[C]为5-甲基胞嘧啶；5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。互补链6的主链为DNA，但在其一部分中含有BNA，序列为5’-ACGCAAAGC(G)TTCTA-3’(序列号25；(G)为具有BNA-NC(N-Me)结构的鸟嘌呤碱基)，使用由GeneDesign株式会社人工合成的物质。
首先，将序列6(1nmol)和互补链6(2nmol)在95℃下反应5分钟之后，在42℃下反应1小时，接着在37℃下反应1小时，由此得到异源核酸杂交体(含有5-甲基胞嘧啶的由DNA和BNA构成的双链核酸)。
序列9(序列号27)除胞嘧啶碱基不进行甲基化以外，与序列6相同，使用互补链6，用与序列6同样的方法得到异源核酸杂交体(不含有5-甲基胞嘧啶的由DNA和BNA构成的双链核酸)。
[表14]
表14.实施例6中使用的靶核酸的概要
靶核酸 主链 核酸序列 序列号
序列6 DNA 5’-TAG AA[C] GCT TTG [C]GT-3’ 序列号8
序列9 DNA 5’-TAG AAC GCT TTG CGT-3’ 序列号27
[表15]
表15.实施例6中使用的核酸探针的概要
核酸探针 主链 核酸序列 序列号
互补链6 DNA 5’-ACG CAA AGC (G)TT CTA-3’ 序列号25
首先，通过将上述中制备的2种异源核酸杂交体溶解于PBS50μL中而制备成20nM之后，总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(Thermo Scientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此将核酸固定化在链霉亲和素板上。用300μL的PBS-T清洗3次，各加入后述的制备例2中得到的细胞孵育的上清液(Clone20-H2、20-E3、20-G5、20-H7)50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次，各加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)50μL，在37℃下反应1小时。用300μL的PBS-T清洗3次之后，加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)各50μL，在室温下反应5分钟。其后，加入1N硫酸溶液各50μL，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Thermo Scientific公司制造的MULTISKAN)测定450nm的吸光度。
其结果，确认：通过针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针(BNA探针)的使用，可以特异性地检测异源核酸杂交体中的修饰核酸碱基(表16、图6)。
[表16]
表16.使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体及修饰核酸碱基配对性核酸探针(BNA探针)进行的修饰核酸碱基的特异性检测(2)
制备例1：针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体的获得(1)
识别异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)中的修饰核酸碱基的抗体的获得利用活体外抗体获得技术[(ADLib(Autonomously Diversifying Library)***：例如参照WO2004/011644]、通过以下的方法进行。
1)产生目标抗体的细胞的制备
1-1)鸡B细胞株DT40库的多样化
鸡B细胞株DT40库的多样化通过以下的方法进行。
a)量取9％FBS，含1％鸡血清的IMDM孵育基[CS(Chicken Serum)+孵育基]40mL，加入于生物反应器管。
b)将制滴菌素A(TSA)以成为2.5ng/mL的方式加入于孵育基。
c)将1.5×107个DT40细胞(利用WO2004/011644所公开的技术进行了多样化的DT40细胞的库)加入于孵育基，在设定为39.5℃的CO2孵育箱内孵育1天。
1-2)DT40库的继代
DT40库的继代通过以下的方法进行。
a)将孵育了1天的细胞悬浮液在以4℃下以1000rpm离心10min。
b)除去上清液后，在10mL的CS+孵育基中将细胞再次悬浮。
c)在CS+孵育基950μL中加入细胞悬浮液50μL并稀释20倍，进行搅拌。
d)计数活细胞数。
e)在新的生物反应器管中加入CS+孵育基40mL。
f)将1.5×107个DT40细胞加入于孵育基，在设定为39.5℃的CO2孵育箱内孵育1天。
需要说明的是，直到实施选择为止进行2次TSA处理。
1-3)抗原的制备
抗原的制备通过实施例1所记载的方法而进行。作为抗原，使用由以下所示的异源核酸杂交体[序列1(DNA)和互补链1(PNA)构成的双链核酸]。
核酸(DNA)：5’-CGTAGGAGGAGGAAGC-3’(序列号1)
互补链1(PNA)：3’-GCATCCTCCTCCTTCG-5’(序列号2)
注)上述核酸(DNA)中的2个胞嘧啶残基在5位上甲基化
1-4)抗原结合粒子的制备
抗原结合粒子的制备通过以下的方法进行。
a)在使链霉亲和素固定化的磁性粒子中加入包含含有54pmole的甲基胞嘧啶的DNA和PNA的复合体的溶液。
b)在4℃下反应1h，将DNA和PNA的复合体在磁性粒子中进行固相化。
c)用0.1％BSA/PBS将磁性粒子清洗4次。
1-5)产生目标抗体的细胞的孵育
产生目标抗体的细胞的孵育通过以下的方法进行。
a)在生物反应器管2根中分别加入CS+孵育基40mL。
b)将1.5×107个细胞加入于孵育基，孵育1天。
c)将细胞悬浮液在4℃下以1000rpm离心10min。
d)上清液除去后，用1％BSA/PBS清洗2次，在1.5mL管中回收细胞。
e)在4℃下以3500rpm，将溶液离心5min，除去上清液。
f)将上述1-4)中制备的抗原结合粒子用1％BSA/PBS清洗4次。
g)将细胞和抗原结合粒子进行混合，使它们在4℃下反应30min。
h)将细胞、粒子用1％BSA/PBS清洗5次，除去剩余的细胞。
i)在CS-孵育基中使细胞、粒子分散。
j)将细胞播种于96孔板，孵育1周。
2)产生目标抗体的细胞的选择
产生目标抗体的细胞的选择在抗原固相ELISA中，基于在异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)中含有甲基胞嘧啶时和不含有时的显色之差的评价而进行。
具体而言，方法如下所述。
a)用实施例1所记载的方法调整序列1和互补链1的杂交体、序列2和互补链1的混合物。
b)通过将上述中制备的2种DNA和PNA的杂交体溶解于PBS50μL中而制备成20nM之后，总量加入于用链霉亲和素进行了涂层的板(Thermo Scientific公司制造)，在37℃下反应1小时，由此将核酸固定化在链霉亲和素板上。
c)用300μL的PBS-T清洗3次，加入细胞孵育上清液各50μL，在37℃下反应1小时。
d)用300μL的PBS-T清洗3次，各加入过氧化物酶标识抗雏鸡IgM抗体(自己公司制备)50μL，在37℃下反应1小时。
e)用300μL的PBS-T清洗3次之后，各加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)50μL，在室温下反应5分钟。
f)加入1N硫酸溶液各50μL，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Thermo Scientific公司制造的MULTISKAN)测定450nm的吸光度。
其结果，在异源核酸杂交体(由DNA和PNA构成的双链核酸)含有甲基胞嘧啶的情况和不含有的情况下，在得到反应性上有显著的差异的克隆(Clone10-1-6E、10-1-5-4E、19-3-6H)方面获得成功。
制备例2：针对于异源配对性修饰核酸碱基(由DNA和BNA构成的双链核酸)的抗体的获得
识别异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)中的修饰核酸碱基的抗体的获得与制备例1同样地，利用活体外抗体获得技术(ADLib***)，通过以下的方法进行。
1)产生目标抗体的细胞的制备
产生目标抗体的细胞的制备除将实施例5中所制备的异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)用作抗原之外，通过与制备例1同样的方法来进行。
2)产生目标抗体的细胞的选择
产生目标抗体的细胞的选择与制备例1同样地，基于在异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)中含有甲基胞嘧啶的情况和不含有的情况下的显色之差的评价而进行。具体而言，产生目标抗体的细胞的选择除了用实施例6所记载的方法制备序列6和互补链6的杂交体和序列9和互补链6的杂交体并使用之外，通过与制备例1同样的方法来进行。另外，也进行异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)和同种核酸杂交体(由DNA和DNA构成的双链核酸)中的显色之差的评价。具体而言，产生目标抗体的细胞的选择除了用实施例5所记载的方法制备序列6和互补链6的混合物和序列6和互补链7的混合物并使用之外，通过与制备例1同样的方法来进行。
其结果，在异源核酸杂交体(由DNA和BNA构成的双链核酸)中含有甲基胞嘧啶的情况和不含有的情况下，在得到反应性上有显著的差异的克隆(Clone20-H2、Clone 20-E3、Clone 20-G5、及Clone 20-H7)方面获得成功。
以下，对使用捕捉探针及导向探针的方法(图7)示出参考例。
本发明人等在研究靶核酸中的修饰核酸碱基的测定体系中，确认存在双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度比单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的灵敏度低(约1/10)的技术问题(特定技术问题I)(参考例1)。这是因为，认为相对于含有修饰核酸碱基的靶核酸，互补链及捕捉探针进行竞争，靶核酸和捕捉探针的杂交体形成效率(在靶核酸的固相上的捕捉效率)低(图8)。
另外，在使用捕捉探针测定靶核酸中的修饰核酸碱基的现有的方法中，形成由靶核酸及捕捉探针构成的混合物(图9)。在现有的方法中，由于该杂交体中的靶核酸的非杂交区域(单链区域)形成二次结构，难以测定该二次结构中所含的修饰核酸碱基(即，检测灵敏度低)的技术问题(特定技术问题II)也潜在地存在(图9)。
本发明的目的在于，提高靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度。
本发明的目的还在于，提高双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度(即特定技术问题I的解决)。
本发明的目的在于，通过避免上述的二次结构的形成而提高修饰核酸碱基的检测灵敏度(即特定技术问题II的解决)。
本发明的目的还在于，开发了可以同时解决这些特定技术问题的方法论。
以下，对可以解决上述技术问题的使用捕捉探针及导向探针的方法，示出参考例。
参考例1：利用捕捉探针的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
1-1)靶核酸的制备
靶核酸按照下述所示的步骤制备。
在靶核酸的制备中，使用聚合酶链式反应(PCR)法。作为PCR用的酶，使用东洋纺织株式会社制造的KODPlus(商品编号：KOD-201)，作为核酸扩增用的2种引物，使用由北海道System Science株式会社人工合成的、正向引物：5’-TAGAACGCTTTGCGTCCCGAC-3’(序列号14)、反向引物：5’-CTGCAGGACCACTCGAGGCTG-3’(序列号15)。就PCR扩增的议定书而言，在94℃下加热2分钟之后，将94℃15秒、55℃30秒、68℃1分钟作为1组设为30循环。
将由北海道System Science株式会社人工合成的核酸(核苷酸序列：5’-TAGAACGCTTTGCGTCCCGACGCCCGCAGGTCCTCGCGGTGCGCACCGTTTGCGACTTGGTGAGTGTCTGGGTCGCCTCGCTCCCGGAAGAGTGCGGAGCTCTCCCTCGGGACGGTGGCAGCCTCGAGTGGTCCTGCA-3’(序列号16))用作模板进行PCR扩增之后，使用QIAGEN公司制造的QIA quick PCR Purification Kit进行纯化，由此制备138碱基对的核酸。
为了对上述中制备的138碱基对的核酸中的CpG的胞嘧啶进行甲基化，用ThermoScientific公司制造的CpG Methyltransferase(M.SssI)(商品编号：EM0821)进行处理。反应溶液按照附加文书而制备。在37℃下反应20分钟之后，在65℃下进一步反应20分钟，其后，使用QIAGEN株式会社制造的QIA quick Nucleotide Removal Kit进行纯化，由此得到靶核酸(由序列号16的核苷酸序列构成的甲基化双链DNA)。
1-2)利用捕捉探针的单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为5’-UGCAGGACCACUCGAGGCUGCCAC-3’(序列号17)(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，分别使用将单链的靶核酸(由序列号16的核苷酸序列构成的甲基化单链DNA)由北海道System Science株式会社人工合成的物质、双链的靶核酸(由序列号16的核苷酸序列构成的甲基化双链DNA)为参考例1-1)中制备的靶核酸。
首先，使含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸(100fmol、10fmol、1fmol、0.1fmol、或0.01fmol)和捕捉探针(5pmol)溶解于杂交缓冲液(5×SSC、0.1％(v/v)Tween20)100μL中。在95℃下反应5分钟[改性反应(单链的靶核酸)或解离及改性反应(双链的靶核酸)]之后，在37℃下进行杂交反应1小时，由此形成靶核酸和捕捉探针的杂交体。另外，制备不含有靶核酸的溶液，进行同样的操作。在杂交反应后的溶液中加入375μg/mL的用链霉亲和素进行了涂层的磁性粒子(Invitrogen株式会社制造的DynabeadsM-280Streptavidin)50μL，在37℃下反应30分钟，由此将核酸的混合物固定化在磁性粒子上。用250μL的TBS-T清洗3次，各加入100ng/mL的抗甲基胞嘧啶抗体(NIPPON GENE株式会社制、Clone33D3)125μL，在37℃下反应1小时。用250μL的TBS-T清洗3次，各加入250ng/mL的碱性磷酸酶标识抗IgG抗体(Millipore社制)125μL，在37℃下反应30分钟。用250μL的TBS-T清洗3次之后，各加入化学发光基质AMPPD溶液110μL，在37℃下反应5分钟。其后，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Perkin Elmer公司制造的Arvo)测定发光计数。
其结果，双链的靶核酸的情况下，与单链的靶核酸相比，发光计数低，双链的靶核酸与单链的靶核酸相比，仅约十分之一量在磁性粒子上被捕捉(表17、图10)。该情况下，例如在双链的靶核酸的量为100fmol的情况下测定的发光计数与在单链的靶核酸的量为10fmol的情况下测定的发光计数大致同等，因此可以理解(表17、图10)。这种事实显示：利用捕捉探针的双链的靶核酸的捕捉率(混合物形成率)比单链的靶核酸的捕捉率低。
[表17]
表17.利用捕捉探针测定单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基
S/N：靶核酸量(fmol)的发光计数/靶核酸的非存在下(即，0mol)的发光计数(只要没有特别的说明，以下同样)
由以上确认特定技术问题I。
参考例2：使用有捕捉探针及导向探针的、单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
2-1)使用有捕捉探针及导向探针的测定
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为序列号17的核苷酸序列(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)、导向探针的核苷酸序列为5’-CCCAGGGAGAGCTCCCACTCTTCCGGAGCAGGCACCCAGACACTCACCAAGTCCAAACGTGCCACCCAGGACCTGCGGCTCGGACCAAAGCTTCTA-3’(序列号19)(导向探针1)，分别使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。导向探针1在与捕捉探针杂交的靶核酸中的区域不同的区域中，以可以与靶核酸杂交的方式设计。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，由单链的靶核酸(序列号16的核苷酸序列构成的甲基化单链DNA)使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。
首先，使含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸(10fmol、或1fmol)和捕捉探针(5pmol)、导向探针(1pmol)溶解于杂交缓冲液(5×SSC、0.1％(v/v)Tween20)100μL中。在95℃下进行改性反应5分钟之后，在37℃下进行杂交反应1小时，由此形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体。另外，制备不含有靶核酸的溶液，进行同样的操作。在杂交反应后的溶液中加入375μg/mL的用链霉亲和素进行了涂层的磁性粒子(Invitrogen公司制造的DynabeadsM-280Streptavidin)50μL，在37℃下反应30分钟，由此将核酸的混合物固定化在磁性粒子上。用250μL的TBS-T清洗3次，加入100ng/mL的抗甲基胞嘧啶抗体(NIPPON GENE株式会社制造的、Clone33D3)各125μL，在37℃下反应1小时。用250μL的TBS-T清洗3次，各加入250ng/mL的碱性磷酸酶标识抗IgG抗体(Millipore株式会社制造)125μL，在37℃下反应30分钟。用250μL的TBS-T清洗3次之后，加入化学发光基质AMPPD溶液各110μL，在37℃下反应5分钟。其后，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Perkin Elmer公司制造的Arvo)测定发光计数。
2-2)使用有捕捉探针的测定(不使用导向探针的现有的方法)
除不添加导向探针以外，用与参考例2-1)同样的方法进行试验。
2-3)结果
使用导向探针测定的发光计数与不使用导向探针而进行测定的发光计数相比，显著地提高(表18、图11)。
通过单链的靶核酸和导向探针的杂交体的形成发光计数上升的事实暗示：在导向探针的非存在下，经由捕捉探针而在固相(磁性粒子)上被捕捉的单链的靶核酸形成二次结构，抗体难以识别二次结构中的修饰核酸碱基(图9)。即，认为特定技术问题II潜在地存在。
另一方面，可以确认：导向探针通过与由单链的靶核酸及捕捉探针构成的混合物中的非杂交区域(在导向探针的非存在下可形成二次结构的单链区域)进行杂交，可以解开二次结构，由此抗体可以有效地识别修饰核酸(即，检测灵敏度的提高)(参照表18、图11)。即，通过导向探针的使用，可以解决特定技术问题II。
[表18]
表18.使用捕捉探针及导向探针测定单链的靶核酸中的修饰核酸碱基
-：参考例2-2)不使用导向探针
+：参考例2-1)使用导向探针
由以上显示：导向探针可以提高单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度。
参考例3：使用了捕捉探针及导向探针测定双链的靶核酸中的修饰核酸碱基
3-1)使用有捕捉探针及导向探针的测定
作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，除使用参考例1-1)中制备的双链的靶核酸以外，用与参考例2同样的方法进行试验。
3-2)使用有捕捉探针的测定(不使用导向探针)
除不添加导向探针以外，用与参考例3-1)同样的方法进行试验。
3-3)结果
在双链的靶核酸中，与单链的靶核酸同样地，可以确认导向探针的添加的效果(表19、图12)。其认为是因为，相对于靶核酸，互补链及捕捉探针为竞争的状态，但通过导向探针的添加，倾向于形成靶核酸、捕捉探针及导向探针的杂交体。同时，认为是因为，即使为双链的靶核酸，也通过在与捕捉探针形成杂交体时产生的非杂交区域与导向探针杂交，可以避免二次结构的形成。
[表19]
表19.使用捕捉探针及导向探针测定双链的靶核酸中的修饰核酸碱基
-：参考例3-2)不使用导向探针
+：参考例3-1)使用导向探针
由以上显示：导向探针可以提高双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度。
参考例4：基于离液剂的存在下的导向探针的使用进行的双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
4-1)基于在离液剂的存在下使用导向探针进行测定
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为序列号17的核苷酸序列(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)，导向探针的核苷酸序列为序列号19的核苷酸序列(导向探针1)，分别使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，使用参考例1-1)中制备的双链的靶核酸。作为离液剂，使用硫氰酸胍。
首先，使含有5-甲基胞嘧啶的双链的靶核酸(10fmol、或1fmol)和捕捉探针(5pmol)、导向探针(1pmol)溶解于硫氰酸胍(+)缓冲液(100mMTris-HCl、4.2M硫氰酸胍、50mMEDTA·2Na)100μL中。在95℃下进行解离及改性反应5分钟之后，在37℃下进行杂交反应1小时，由此形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体。另外，制备不含有靶核酸的溶液，进行同样的操作。在杂交反应后的溶液中加入375μg/mL的用链霉亲和素进行了涂层的磁性粒子(Invitrogen株式会社制造的DynabeadsM-280Streptavidin)50μL，在37℃下反应30分钟，由此将杂交体固定化在磁性粒子上。用250μL的TBS-T清洗3次，各加入100ng/mL的抗甲基胞嘧啶抗体(NIPPON GENE株式会社制造、Clone33D3)125μL，在37℃下反应1小时。用250μL的TBS-T清洗3次，各加入250ng/mL的碱性磷酸酶标识抗IgG抗体(Millipore公司制造)125μL，在37℃下反应30分钟。用250μL的TBS-T清洗3次之后，各加入化学发光基质AMPPD溶液110μL，在37℃下反应5分钟。其后，利用全自动定量绘图酶标仪(MicroplateReader)(Perkin Elmer公司制造的Arvo)测定发光计数。
4-2)使用有导向探针的测定[离液剂的非存在下(1)]
在形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体时，使用杂交缓冲液(5×SSC、0.1％(v/v)Tween20)，除此之外，用与3-1)同样的方法进行试验。
4-3)使用有导向探针的测定[离液剂的非存在下(2)]
在形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体时，使用硫氰酸胍(-)缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)，除此之外，用与3-1)同样的方法进行试验。
4-4)结果
在含有离液剂的条件下进行杂交反应时，发光计数显著地上升(表20、图13)。该情况下，显示：促进双链的靶核酸和导向探针的杂交体的形成，在固相(磁性粒子)上的靶核酸的捕捉效率提高。
[表20]
表20.在离液剂的存在下使用导向探针测定靶核酸中的修饰核酸碱基
杂交缓冲液：参考例4-2)不存在离液剂的条件下(1)
-：参考例4-3)不存在离液剂的条件下(2)
+：参考例4-1)在离液剂的存在下
由以上显示：导向探针在离液剂的存在下，可以显著地提高双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度。
参考例5：通过在离液剂的存在下的导向探针的使用的、单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为序列号17的核苷酸序列(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)，导向探针的核苷酸序列为序列号19的核苷酸序列(导向探针1)，分别使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，单链的靶核酸使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质，双链的靶核酸使用参考例1-1)中制备的物质。作为离液剂，使用硫氰酸胍。
首先，使单链或双链的含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸(10fmol、1fmol、0.1fmol、或0.01fmol)和捕捉探针(5pmol)、导向探针(1pmol)溶解于硫氰酸胍(+)缓冲液(100mMTris-HCl、4.2M硫氰酸胍、50mMEDTA·2Na)100μL中。在95℃下反应[改性反应(单链的靶核酸)或解离及改性反应(双链的靶核酸)]5分钟之后，在37℃下进行杂交反应1小时，由此形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体。另外，制备不含有靶核酸的溶液，进行同样的操作。在杂交反应后的溶液中加入375μg/mL的用链霉亲和素进行了涂层的磁性粒子(Invitrogen株式会社制造的DynabeadsM-280Streptavidin)50μL，在37℃下反应30分钟，由此将核酸的杂交体固定化在磁性粒子上。用250μL的TBS-T清洗3次，加入100ng/mL的抗甲基胞嘧啶抗体(NIPPON GENE株式会社制造、Clone33D3)各125μL，在37℃下反应1小时。用250μL的TBS-T清洗3次，加入250ng/mL的碱性磷酸酶标识抗IgG抗体(Millipore社制)各125μL，在37℃下反应30分钟。用250μL的TBS-T清洗3次之后，加入化学发光基质AMPPD溶液各110μL，在37℃下反应5分钟。其后，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Perkin Elmer公司制造的Arvo)测定发光计数。
其结果，意外地得到在单链的靶核酸和双链的靶核酸中大致同等的发光计数(表21、图14)。该情况下，显示：导向探针在离液剂的存在下可以使双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度与单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度大致同等地提高。
[表21]
表21.在离液剂的存在下使用导向探针测定单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基
由以上显示：导向探针在离液剂的存在下，与靶核酸的链数无关，可以高灵敏度地测定靶核酸中的修饰核酸碱基。
参考例6：使用有捕捉探针及导向探针的、单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
在形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的时杂交体，使用杂交缓冲液(5×SSC、0.1％(v/v)Tween20)代替硫氰酸胍(+)缓冲液，除此之外，用与参考例5同样的方法进行试验。
其结果，在使用杂交缓冲液的条件(即仅使用导向探针)下，虽然在双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度上可看到些许得提高(没有在参考例1中可观察到的程度的差异)，但是双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度没有达到单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度(表22、图15)。即，证明：导向探针在离液剂的存在下可以使双链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度与单链的靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度大致同等地提高。
[表22]
表22.使用导向探针测定单链及双链的靶核酸中的修饰核酸碱基
参考例7：通过核酸改性剂的存在下的导向探针的使用的修饰核酸碱基的测定
在形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体时，使用不含有核酸改性剂的缓冲液，或含有4.2M硫氰酸胍、2.7M咪唑、或4M脲的缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)，除此之外，用与参考例4-1)同样的方法进行试验。
其结果，硫氰酸胍以外的核酸改性剂也产生与硫氰酸胍同等的发光计数(表23、图16)。该情况下，显示：导向探针可以在核酸改性剂的存在下提高靶核酸中的修饰核酸碱基的检测灵敏度。
[表23]
表23.在核酸改性剂的存在下使用导向探针测定的修饰核酸碱基
-：无改性剂
由以上显示：导向探针可以在核酸改性剂的存在下高灵敏度地测定靶核酸中的修饰核酸碱基。
参考例8：利用导向探针的、含有修饰核酸碱基的部位中的二次结构的形成的抑制
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为序列号17的核苷酸序列(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)，导向探针的核苷酸序列为表24所示的核苷酸序列，分别使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，使用参考例1-1)中制备的双链的靶核酸。
导向探针除未添加表24所示的序列、或添加1种、2种、或3种各10pmol以外，用与参考例4-1)和同样的方法进行试验。
其结果，在添加与靶核酸中的含修饰核酸碱基的部位具有互补性的导向探针(即导向探针1、2、及4)的情况下，可看到发光计数的上升，在添加与靶核酸中的修饰核酸碱基非含有部位具有互补性的导向探针(即导向探针3)的情况下，没有看到发光计数的上升(表25、图17)。因此，证实：基于导向探针的、含有修饰核酸碱基的部位中的二次结构的形成的抑制对检测灵敏度的提高是重要的。
[表24]
24.导向探针1～4的核苷酸序列
[表25]
表25.导向探针导致的在含有修饰核酸碱基的部位形成二次结构的抑制
2+4：添加导向探针2及4
2+3+4：添加导向探针2、3及4
参考例9：核酸改性剂的浓度的研究
将由于形成含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸(10fmol、或1fmol)和捕捉探针(5pmol)、导向探针1(1pmol)的杂交体的缓冲液(100mMTris-HCl、硫氰酸胍、50mMEDTA·2Na)中所含的硫氰酸胍的浓度设定为表26所示的浓度，除此之外，用与参考例4-1)同样的方法进行试验。另外，用硫氰酸胍(-)缓冲液(即0M)也同样地进行试验。
其结果，确认：在缓冲液中所含的硫氰酸胍为1～2.5M的范围时，是最有效的(表26、图18)。
[表26]
26.各种浓度的核酸改性剂的效果
参考例10：导向探针的主链的研究
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为序列号17的核苷酸序列(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)，使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。另外，导向探针的核苷酸序列为表27所示的核苷酸序列，关于导向探针2及4，使用核酸的主链为DNA的导向探针，关于导向探针5及6，使用核酸的主链为2’-O-甲基化RNA或RNA的导向探针。导向探针5及6分别为与导向探针2及4相同的序列，但由于核酸的主链为2’-O-甲基化RNA或RNA，因此，使用将胸腺嘧啶碱基(T)变更为尿嘧啶碱基(U)的导向探针。各导向探针分别使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，使用参考例1-1)中制备的双链的靶核酸。
导向探针未添加表27所示的核苷酸序列，以各1pmol添加1种、或2种，除此之外，用与参考例4-1)同样的方法进行试验。
即使用作导向探针的核酸的主链变为DNA、RNA、2’-O-甲基化RNA，与导向探针的非存在下的情况相比，也可看到发光计数的上升(表28、图19)。该情况下，导向探针无论其主链结构如何，显示作为导向探针起作用。另外，也确认：导向探针的主链为DNA的情况下，是最有效的(表28、图19)。
[表27]
表27.导向探针2、4～6的核苷酸序列
导向探针 核苷酸序列(序列号)
2 5’-TCC CAG GGA GAG CTC CCA CTC TTC CGG AGC AGG C-3’(序列号20)
4 5’-CAA ACG TGC CAC CCA GGA CCT GCG GCT CCG ACC AAA GC-3’(序列号22)
5 5’-UCC CAG GGA GAG CUC CCA CUC UUC CGG AGC AGG C-3’(序列号23)
6 5’-CAA ACG UGC CAC CCA GGA CCU GCG GCU CCG ACC AAA GC-3’(序列号24)
导向探针5是将导向探针2的序列中的T变为U而得到的导向探针
导向探针6是将导向探针4的序列中的T变为U而得到的导向探针
[表28]
28.导向探针的主链的研究
导向探针2+4：添加导向探针2及4
导向探针5+6：添加导向探针5及6
参考例11：基于核酸改性剂或非核酸改性剂的存在下的导向探针的使用进行的修饰核酸碱基的测定
靶核酸的捕捉探针的核苷酸序列为序列号17的核苷酸序列(核酸的主链为2’-O-甲基化RNA，5’末端为生物素标识)，导向探针的核苷酸序列为序列号19的核苷酸序列(导向探针1)，分别使用由北海道System Science株式会社人工合成的物质。作为含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸，使用参考例1-1)中制备的双链的靶核酸。
首先，使含有5-甲基胞嘧啶的靶核酸(10fmol、或1fmol)和捕捉探针(1pmol)、导向探针(1pmol)溶解于缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)100μL中。另外，在上述缓冲液中，使用含有1.5M硫氰酸胍、1.5M咪唑、1.5M吡唑、1.5M脲、1％(v/v)Tween20、或1％(v/v)月桂基硫酸钠的缓冲液制备同样的溶液。在95℃下进行解离及改性反应5分钟之后，在37℃下进行杂交反应1小时，由此形成由靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体。另外，制备不含有靶核酸的溶液，进行同样的操作。在杂交反应后的溶液中加入375μg/mL的用链霉亲和素进行了涂层的磁性粒子(Invitrogen株式会社制造的DynabeadsM-280Streptavidin)50μL，在37℃下反应30分钟，由此将核酸的杂交体固定化在磁性粒子上。用250μL的TBS-T清洗3次，加入100ng/mL的抗甲基胞嘧啶抗体(NIPPON GENE株式会社制造、Clone33D3)各125μL，在37℃下反应1小时。用250μL的TBS-T清洗3次，加入250ng/mL的碱性磷酸酶标识抗IgG抗体(Millipore公司制造)各125μL，在37℃下反应30分钟。用250μL的TBS-T清洗3次之后，加入化学发光基质AMPPD溶液各110μL，在37℃下反应5分钟。其后，利用全自动定量绘图酶标仪(Microplate Reader)(Perkin Elmer公司制造Arvo)测定发光计数。
其结果，作为非核酸改性剂的表面活性剂(Tween20、SDS)与没有改性剂的条件(-)相比，没有使发光计数显著地上升(表29、图20)。另一方面，作为核酸改性剂的离液剂(胍异硫代氰酸酯、脲)及给电子性化合物(咪唑、吡唑)与没有改性剂的条件(-)相比，使发光计数显著地上升(表29、图20)。
[表29]
表29.在核酸改性剂或非核酸改性剂的存在下使用导向探针进行靶核酸中的修饰核酸碱基的测定
-：无改性剂
由以上显示：导向探针的效果可以在核酸改性剂中增强，但不能在非核酸改性剂中增强。
参考例12：基于核酸改性剂及表面活性剂这两者的存在下的导向探针的使用进行的修饰核酸碱基的测定
由在形成靶核酸、捕捉探针及导向探针构成的杂交体时，使用不含有核酸改性剂的缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)、1.5M硫氰酸胍(+)缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)、含有1.5M硫氰酸胍及1％(v/v)Tween20的缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)、或含有1.5M硫氰酸胍及1％(v/v)Tween80的缓冲液(100mMTris-HCl、50mMEDTA·2Na)，除此之外，用与参考例11同样的方法进行试验。
其结果，含有核酸改性剂及表面活性剂的缓冲液与仅含有核酸改性剂的缓冲液相比，引起发光计数(背景值)的降低及S/N的上升(表30及图21、22)。即，可以认为，在使用导向探针及核酸改性剂的本发明的方法中，表面活性剂有消除由核酸改性剂引起的背景值的上升的效果。
[表30]
表30.Z核酸改性剂及表面活性剂这两者的存在下使用导向探针对修饰核酸碱基进行测定
-：无改性剂
由以上显示：导向探针可以在核酸改性剂及表面活性剂这两者的存在下高灵敏度地测定靶核酸中的修饰核酸碱基。
(导向探针的详细)
为了参考，将实验中使用的导向探针的详细示于表31。
[表31]
薄31.实验中使用的导向探针的详细情况
工业上实用性
本发明的方法及试剂盒可以用于含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定。
SEQUENCE LISTING
<110> FUJIREBIO INC.
<120> 含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法及试剂盒
<130> PRBA-27751
<150> JP2014-197719
<151> 2014-09-29
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列， 第1和第16位核苷酸（胞嘧啶）在5位进行了甲基化.
<400> 1
cgtaggagga ggaagc 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SEQ ID NO：1的DNA互补的肽核酸（PNA）的核苷酸序列
<400> 2
gcttcctcct cctacg 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列
<400> 3
cgtaggagga ggaagc 16
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列，第4和第13核苷酸（胞嘧啶）在5位甲基化。
<400> 4
ttgcgcggcg tcctgttgac ttc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SEQ ID NO：4的DNA互补的DNA的DNA序列
<400> 5
gaagtcaaca ggacgccgcg caa 23
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用作阴性对照的肽核酸（PNA）的核苷酸序列
<400> 6
ggtctgtgag tggttc 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用作阴性对照的DNA序列
<400> 7
ccagacactc accaag 16
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列。，第6位和第13位的核苷酸（胞嘧啶）在5位进行了甲基化。
<400> 8
tagaacgctt tgcgt 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SEQ ID NO：8的DNA互补的肽核酸（PNA）的核苷酸序列
<400> 9
acgcaaagcg ttcta 15
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列， 第3，第9，第12和第16个核苷酸（胞嘧啶）5位进行了甲基化
<400> 10
gtcgttttcg gcggccgc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SEQ ID NO：10的DNA互补的肽核酸（PNA）的核苷酸序列
<400> 11
gcggccgccg aaaacgac 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列，第4，第8，第14和第16个核苷酸（胞嘧啶）在5位进行了甲基化
<400> 12
gcccgcacgt cctcgcgg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SEQ ID NO：12的DNA互补的肽核酸（PNA）的核苷酸序列
<400> 13
ccgcgaggac gtgcgggc 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增SEQ ID NO：16的靶DNA的正向引物
<400> 14
tagaacgctt tgcgtcccga c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增SEQ ID NO：16的靶DNA的反向引物
<400> 15
ctgcaggacc actcgaggct g 21
<210> 16
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过本发明的方法检测的一个靶DNA
<400> 16
tagaacgctt tgcgtcccga cgcccgcagg tcctcgcggt gcgcaccgtt tgcgacttgg 60
tgagtgtctg ggtcgcctcg ctcccggaag agtgcggagc tctccctcgg gacggtggca 120
gcctcgagtg gtcctgca 138
<210> 17
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明要使用的一种捕获探针的核苷酸序列， 构成这个捕获探针的核苷酸进行了2'-O-甲基化
<400> 17
ugcaggacca cucgaggcug ccac 24
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽核酸（PNA）的核苷酸序列用作导向探针
<400> 18
acgcaaagcg ttcta 15
<210> 19
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 导向探针 1
<400> 19
cccagggaga gctcccactc ttccggagca ggcacccaga cactcaccaa gtccaaacgt 60
gccacccagg acctgcggct cggaccaaag cttcta 96
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 导向探针 2
<400> 20
tcccagggag agctcccact cttccggagc aggc 34
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 导向探针 3
<400> 21
acccagacac tcaccaagtc 20
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 导向探针 4
<400> 22
caaacgtgcc acccaggacc tgcggctcgg accaaagc 38
<210> 23
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 导向探针 5
<400> 23
ucccagggag agcucccacu cuuccggagc aggc 34
<210> 24
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 导向探针 6
<400> 24
caaacgugcc acccaggacc ugcggcucgg accaaagc 38
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA的核苷酸序列包含在10位与SEQ ID NO：8的DNA互补交联核酸
<400> 25
acgcaaagcg ttcta 15
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与SEQ ID NO：8的DNA互补的DNA的核苷酸序列
<400> 26
acgcaaagcg ttcta 15
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种靶核酸的DNA序列
<400> 27
tagaacgctt tgcgt 15

Claims (14)

1.一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法，其包括：
(1)将核酸样品及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针在溶液中进行孵育；以及
(2)在(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体对修饰核酸碱基进行测定。
2.如权利要求1所述的方法，其中，核酸样品包含含有修饰核酸碱基的靶核酸，且工序(1)及(2)分别通过(1’)及(2’)来进行：
(1’)在溶液中通过孵育使包含含有修饰核酸碱基的靶核酸的核酸样品、及修饰核酸碱基配对性异源核酸探针进行反应，形成由所述靶核酸及所述探针构成的异源核酸杂交体；以及
(2’)在含有所述异源核酸杂交体的溶液中，使用所述抗体对修饰核酸碱基进行测定。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括：
在含有所述核酸样品的溶液中添加所述探针，制备含有所述核酸样品及所述探针这两者的溶液。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述核酸样品包含含有修饰核酸碱基的靶DNA。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述探针包含下述人工核酸，所述人工核酸具有与靶核酸的主链结构不同的主链结构。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述探针为肽核酸(PNA)探针或交联型核酸(BNA)探针。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，构成修饰核酸碱基的核酸碱基为胞嘧啶。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，修饰核酸碱基为甲基胞嘧啶。
9.一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法，其包括：
(1)在溶液中对核酸样品、修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针进行孵育；以及
(2)在(1)中得到的溶液中，使用针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体对修饰核酸碱基进行测定。
10.如权利要求9所述的方法，其中，核酸样品包含含有修饰核酸碱基的靶核酸，且工序(1)及(2)分别通过(1’)及(2’)来进行：
(1’)在溶液中通过孵育使核酸样品、修饰核酸碱基配对性异源导向探针、及捕捉探针进行反应，形成由所述靶核酸、所述导向探针及捕捉探针构成的异源核酸杂交体；以及
(2’)在含有所述异源核酸杂交体的溶液中，使用所述抗体对修饰核酸碱基进行测定。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述导向探针相对于所述靶核酸为异源，捕捉探针相对于所述靶核酸及所述导向探针这两者为异源。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定使用所述抗体通过ELISA来进行。
13.一种含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定用试剂盒，其包含：
(I)修饰核酸碱基配对性异源核酸探针；及
(II)针对于异源配对性修饰核酸碱基的抗体。
14.如权利要求13所述的测定用试剂盒，其中，所述探针为修饰核酸碱基配对性异源导向探针，且进一步含有(III)捕捉探针。
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