WO2010021396A1 - Ｄｎａを定量又は検出する方法 - Google Patents

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WO2010021396A1
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base sequence
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seq
dna
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PCT/JP2009/064688
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冨ケ原祥隆
佐藤日出夫
樽井弘和
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住友化学株式会社
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    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying or detecting DNA having a target DNA region contained in a specimen.
  • Examples of a method for quantifying or detecting DNA having a target DNA region contained in a specimen include, for example, extracting a biological genomic DNA contained in a specimen and then a DNA synthesis chain reaction (Polymerase Chain Reaction; Hereinafter, a method of amplifying and detecting DNA by PCR may also be described, and a method of detecting by hybridizing a fluorescently labeled oligonucleotide to a target DNA region of DNA in a biological specimen are known. (See, for example, J. Cataract. Refract. Surg., 2007; 33 (4): 635-641, Environ. Mol. Mutagen., 1991; 18 (4): 259-262).
  • An object of the present invention is to provide a method for easily quantifying or detecting DNA having a target DNA region contained in a specimen.
  • the present invention includes the following inventions.
  • [Invention 1] A method for quantifying or detecting a DNA having a target DNA region present in a genome and contained in a specimen, (1) a first step of preparing a specimen containing a test oligonucleotide, which is a DNA having a target DNA region present in a plurality of genomes; (2) a test oligonucleotide contained in the specimen prepared in the first step, and a detection oligonucleotide that can bind complementarily to the test oligonucleotide; A specific oligonucleotide capable of complementary binding to the test oligonucleotide; A support capable of binding to the specific oligonucleotide, and A second step of forming a detection complex comprising the test oligonucleotide, the detection oligonucleot
  • a third step of quantifying or detecting the DNA having the target DNA region by detecting the nucleotide by its identification function A method characterized by comprising: [Invention 2] The method according to invention 1, wherein the detection oligonucleotide is a composite detection oligonucleotide composed of a plurality of oligonucleotides including a plurality of methylation sites. [Invention 3] The method according to the invention 1 or 2, wherein the identification function of the detection oligonucleotide is the identification function of a methylated DNA antibody that binds to the methylated DNA of the detection oligonucleotide.
  • [Invention 4] The method according to any one of the inventions 1 to 3, wherein the DNA having a target DNA region present in plural in the genome comprises a base sequence constituting a repetitive sequence in the genome or a part thereof.
  • [Invention 5] The method according to any one of the inventions 1 to 3, wherein the DNA having a target DNA region present in plural in the genome is a DNA comprising a base sequence of a duplicate gene or pseudogene in the genome or a part thereof.
  • [Invention 6] The method according to any one of the inventions 1 to 3, wherein the DNA having a plurality of DNA regions of interest present in the genome is a DNA comprising a base sequence classified into a LINE or Alu sequence.
  • invention 7 The method according to invention 4, wherein the base sequence constituting the repetitive sequence in the genome comprises any one of the base sequences shown below.
  • Base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (2) Base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence having 80% or more sequence identity (3 )
  • invention 8 The method according to any one of Inventions 1 to 7, wherein the detection oligonucleotide has any one of the base sequences shown below.
  • a partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 80% or more sequence identity thereto (2) A complementary sequence of the partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 80% or more thereof Base sequence having sequence identity (3) Partial sequence of base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or base sequence having 80% or more sequence identity with it (4) Complementation of partial sequence of base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Sequence or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (5) a partial sequence of the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (6) shown by SEQ ID NO: 3 A complementary sequence of a partial sequence of the nucleotide sequence or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity (7) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity ( ) A nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID
  • a partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 80% or more sequence identity thereto (2) A complementary sequence of the partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 80% or more thereof Base sequence having sequence identity (3) Partial sequence of base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or base sequence having 80% or more sequence identity with it (4) Complementation of partial sequence of base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Sequence or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (5) a partial sequence of the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (6) shown by SEQ ID NO: 3 A complementary sequence of a partial sequence of the nucleotide sequence or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity (7) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity ( ) A nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID
  • invention 11 The method according to any one of Inventions 1 to 10, wherein the discrimination function of the detection oligonucleotide is detection of methylcytosine, detection with a methylated DNA antibody, or detection with a methylcytosine antibody.
  • invention 12 The method according to any one of Inventions 1 to 11, wherein the specimen is any of the following specimens.
  • A Mammal blood, body fluid, urine, body secretion, cell lysate or tissue lysate
  • b Mammal blood, body fluid, urine, body secretion, cell lysate and tissue lysate DNA extracted from one selected from the group
  • C DNA prepared using a template derived from RNA extracted from one selected from the group consisting of mammal-derived tissue, cells, tissue lysate, and cell lysate
  • D DNA extracted from bacteria, fungi or virus, or (e) DNA prepared using RNA extracted from bacteria, fungus or virus as a template
  • A DNA previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site
  • B DNA having a target DNA region purified in advance
  • C Free DNA having a target DNA region in blood
  • D DNA having a target DNA region derived from a microbial genome, or
  • e DNA having a target DNA region generated from RNA by reverse transcriptase [Invention 14] 14.
  • invention 15 The method according to any one of Inventions 1 to 13, wherein the concentration of the sodium salt in the solution used in the DNA extraction operation for preparing DNA as a specimen in the first step is 100 mM or more and 200 mM or less.
  • invention 16 A method for selecting a specimen derived from a cancer patient, the quantification result or detection result of DNA quantified or detected using a specimen derived from a subject by the method according to any one of inventions 1 to 15, and the same method.
  • the specimen derived from the subject is evaluated as a specimen derived from a cancer patient, and cancer based on the result of the evaluation
  • a method comprising identifying a patient-derived specimen.
  • the method according to invention 16 wherein the specimen is a serum derived from a mammal.
  • the DNA having the target DNA region is free DNA having the target DNA region in a serum derived from a mammal.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of an experiment for detecting a target DNA region X in Example 1.
  • A indicates a value obtained by measuring the fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 500 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1.
  • B shows a value obtained by measuring fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 50 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1.
  • C shows a value obtained by measuring fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 5 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region Y in Example 2.
  • A indicates a value obtained by measuring fluorescence with respect to a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 500 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M2.
  • B shows a value obtained by measuring fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 50 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region X in Example 3.
  • A indicates a value obtained by measuring the fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 500 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region X in Example 4.
  • A shows a value obtained by measuring the fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 500 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M3.
  • B shows a value obtained by measuring fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 50 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M3.
  • C shows a value obtained by measuring fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 5 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M3.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region X in Example 5.
  • A shows a value obtained by measuring the fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 500 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1 and the methylated oligonucleotide M3.
  • B shows a value obtained by measuring fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 50 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1 and the methylated oligonucleotide M3.
  • C shows a value obtained by measuring fluorescence with respect to a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 5 ng / 20 ⁇ L using the methylated oligonucleotide M1 and the methylated oligonucleotide M3.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region Z in Example 6.
  • A shows a value obtained by measuring the fluorescence of a TE buffer solution having a genomic DNA concentration of 500 ng / 20 ⁇ L using methylated oligonucleotide M4.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region Z in Example 7.
  • solution A shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 1 on serum sample A using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution B shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 1 on serum sample B using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution C shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 1 on serum sample C using methylated oligonucleotide M4.
  • D shows the value which measured the fluorescence intensity of the sample which performed operation including the process 1 about the serum sample D (negative control liquid) using the methylated oligonucleotide M4.
  • solution A indicates a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 2 on serum sample A using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution B shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 2 on serum sample B using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution C shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 2 on serum sample C using methylated oligonucleotide M4.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region Z in Example 8.
  • solution A shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 1 on serum sample A using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution B shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 1 on serum sample B using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution C shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 1 on serum sample C (negative control solution) using methylated oligonucleotide M4.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of an experiment for detecting the target DNA region Z in Example 8.
  • solution A indicates a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 2 on serum sample A using methylated oligonucleotide M4.
  • Solution B shows a value obtained by measuring the fluorescence intensity of a sample obtained by performing an operation including treatment 2 on serum sample B using methylated oligonucleotide M4.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of an experiment for detecting a target DNA region Z contained in human serum in Example 9.
  • it is the figure which compared the result quantified by real-time PCR with the result detected using the methylcytosine antibody, methylated oligonucleotide M4, and 5 'terminal biotin labeled oligonucleotide B4.
  • the detection results were plotted on the vertical axis, and the quantitative results by real-time PCR were plotted on the horizontal axis.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of an experiment for detecting a target DNA region Z contained in human serum in Example 9.
  • the results of DNA detection using methylcytosine antibody, methylated oligonucleotide M4 and 5′-terminal biotin-labeled oligonucleotide B4 are plotted separately for cancer patients and healthy subjects. The average value and the standard deviation are shown for each.
  • the method of the present invention comprises a first step of preparing a sample containing a test oligonucleotide, which is a DNA having a target DNA region present in the genome, and (2) contained in the sample prepared in the first step.
  • the detection oligonucleotide contained in the detected detection complex is detected by its discriminating function, so that the target DNA region is present. That the DNA is a third step, a method for quantifying or detecting DNA having a target DNA region a plurality present in the genome contained in a specimen having a quantifying or detecting.
  • the “specimen” in the method of the present invention include foods, rivers, soils, and surface deposits of general commercial products, and such specimens include contaminated microorganisms such as fungi, bacteria, viruses, and nucleic acids. May be included. In foods, it is important to check for the presence of food poisoning bacteria and to identify the causative bacteria. Usually, immunization using antigens on the surface of microorganisms is used.
  • the immunization method requires a great deal of labor to produce an antigen, and further requires identification of pathogenic bacteria.
  • the immunization method in the microbiology test utilizes the specificity of the microbe species, it is not only difficult to test the presence or absence of multiple bacterial species in a single test, but also to establish an immunology method.
  • much labor is required for testing, such as using the PCR method.
  • the method of the present invention can provide a test method that can first establish a test method from genes even when it is difficult to test by an immunological method, and then can detect a plurality of microorganisms simultaneously.
  • the method of the present invention can be used for testing fungi, microorganisms, viruses and the like present in non-biological samples. Further, by using the method of the present invention, it is possible to detect, for example, mixed microorganisms and viruses in foods, which can be expected to be used for infectious disease inspections and food contamination inspections.
  • Samples include: (a) mammal-derived blood, body fluid, urine, body secretions, cell lysate or tissue lysate, (b) mammal-derived blood, body fluid, urine, body secretions, cell lysate, and DNA extracted from one selected from the group consisting of tissue lysate, (c) Mammalian tissue, cells, RNA extracted from one selected from the group consisting of tissue lysate and cell lysate And (d) DNA extracted from bacteria, fungi or virus, (e) DNA prepared using RNA extracted from bacteria, fungus or virus as a template.
  • tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, and the like. Examples of the body fluid include plasma, serum, lymph, and the like.
  • Examples of the body secretion include urine and milk.
  • Examples of the DNA contained in the specimen include genomic DNA obtained by extraction from the biological sample and the mixed microorganism, a DNA fragment derived from genomic DNA, RNA, and the like.
  • the mammal-derived specimen is human blood, body fluid, body secretion, or the like, it is possible to use a sample collected in a clinical test or the like in a regular human medical examination.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a normal method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (derived from cancer cells such as stomach cancer cells) Analysis of cancer cells such as gastric cancer cells, avoiding blood cell-derived DNA, and improving sensitivity to detect cancer cells such as gastric cancer cells and tissues containing them Can be made.
  • a commercially available DNA extraction kit may be used.
  • DNA from RNA a kit that synthesizes DNA from RNA using reverse transcriptase such as a commercially available cDNA production kit may be used.
  • the specimen may be artificially synthesized DNA.
  • the “mammal” in the method of the present invention is an animal classified into the animal kingdom Chordidae vertebrate submammals (Mammalia), specifically, human, monkey, marmoset, guinea pig, rat, mouse, Examples include cattle, sheep, dogs and cats.
  • the “body fluid” in the present invention is a fluid existing between cells constituting an individual, and can include plasma and interstitial fluid. In many cases, it functions to maintain the homeostasis of the individual.
  • lymph fluid tissue fluid (interstitial fluid, intercellular fluid, interstitial fluid), body cavity fluid, serous cavity fluid, pleural effusion, ascites, pericardial fluid, cerebrospinal fluid (spinal fluid), joint fluid (synovial fluid) ), Aqueous humor (aqueous humor), cerebrospinal fluid, and the like.
  • body secretion in the present invention is a secretion from an exocrine gland. Specific examples include saliva, gastric juice, bile, pancreatic juice, intestinal juice, sweat, tears, runny nose, semen, vaginal fluid, amniotic fluid, and milk.
  • the “cell lysate” in the present invention is, for example, a lysate containing intracellular fluid obtained by destroying cells cultured on a 10 cm plate for cell culture, that is, cell lines, primary cultured cells, blood cells and the like. It is.
  • the method for destroying the cell membrane include a method using ultrasonic waves, a method using a surfactant, and a method using an alkaline solution.
  • various kits may be used.
  • the culture medium is discarded, and 0.6 mL of RIPA buffer (1 ⁇ TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxyphosphate, 0 Add 1% SDS, 0.004% sodium azide) to a 10 cm plate.
  • RIPA buffer 1 ⁇ TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxyphosphate, 0
  • SDS 1% sodium azide
  • adherent cells on the 10 cm plate are peeled off using a scraper or the like, and the lysate on the plate is transferred to a microtube.
  • Add 1/10 volume of 10 mg / mL PMSF of the lysate then leave on ice for 30-60 minutes. Centrifuge at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C.
  • tissue lysate in the present invention is a lysate containing an intracellular fluid obtained by destroying cells in a tissue collected from an animal such as a mammal. More specifically, after measuring the weight of the tissue obtained from the animal, the tissue is cut into small pieces using a razor or the like. When slicing frozen tissue, it is necessary to make smaller pieces. After cutting, ice-cold RIPA buffer (protease inhibitor, phosphatase inhibitor, etc. may be added, for example, 10 mg / mL PMSF of 1/10 volume of RIPA buffer may be added) at a ratio of 3 mL per 1 g of tissue. Add and homogenize at 4 ° C.
  • RIPA buffer prote inhibitor, phosphatase inhibitor, etc.
  • target DNA region (hereinafter sometimes referred to as target region) in the method of the present invention is a DNA region to be detected or quantified by the method of the present invention (DNA) contained in a sample. It is.
  • the target DNA region when the specimen is DNA is a predetermined base sequence on the base sequence of DNA, and when the specimen is RNA, the base on the DNA prepared from RNA by reverse transcriptase A sequence that is a complementary base sequence of a predetermined base sequence to be detected or quantified on RNA.
  • the first step is a step of preparing a specimen containing a test oligonucleotide, which is DNA having a target DNA region present in the genome.
  • the “test oligonucleotide” in the method of the present invention is an oligonucleotide containing a plurality of target DNA regions existing in the genome.
  • the “target DNA region present in plural in the genome” may be any base sequence that can be found in the genome (hereinafter sometimes referred to as a repetitive sequence). If there is more.
  • the test oligonucleotide is an oligonucleotide having a repetitive sequence or a partial sequence in free DNA in blood. Nucleotides are mentioned. The quantified value of the oligonucleotide having these repetitive sequences or partial sequences thereof can be used as an index representing the degree of progression of cancer.
  • the repetitive sequence may be a simple repetitive sequence (referred to as a tandem repetitive sequence or tandem repeat), a scattered repetitive sequence, a duplicate gene or a pseudogene.
  • genomic DNA including the base sequence of the target DNA region
  • a commercially available DNA extraction kit Genefind v2 Kit (manufactured by Beckman Coulter), FastPure DNA Kit) (Takara Bio Inc.)
  • a general yeast genome preparation method or the like described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press) may be used.
  • DNA may be obtained after separating microorganisms from the food, and for example, genomic DNA other than microorganisms contained in food such as viruses and genomic DNA derived from microorganisms may be obtained simultaneously. Also good.
  • RNA extraction kit ISOGEN (311-02501) manufactured by NIPPON GENE
  • RNA may be extracted using FastRNA Pro Green Kit (Funakoshi), FastRNA Pro Blue Kit (Funakoshi), FastRNA Pro Red Kit (Funakoshi), etc.
  • DNA may be obtained by reverse transcriptase.
  • the viral DNA may be extracted after extracting the viral particles, or a commercially available kit (Quick Gene RNA tissue kit SII, Fuji Film).
  • Virus RNA may be extracted using a reverse transcriptase and the virus-derived DNA may be obtained.
  • RNA from a virus-infected tissue may be extracted and virus-derived DNA may be obtained by reverse transcriptase, or DNA may be obtained from a virus-infected tissue to obtain virus-derived DNA.
  • DNA is obtained from RNA by reverse transcriptase
  • a commercially available kit transcription high fidelity cDNA synthesis kit, manufactured by Roche Diagnostics
  • the specimen is DNA prepared using RNA from a mammal-derived tissue or cell line as a template
  • RNA extracted from the tissue or cell line or the like with a commercially available RNA extraction kit is used as a template for reverse transcriptase. DNA may be obtained.
  • the “DNA having the target DNA region” in the method of the present invention is DNA that has been previously digested with a restriction enzyme that does not have a recognition cleavage site in the base sequence in the target DNA region of the DNA.
  • it may be a DNA sample purified in advance.
  • the DNA obtained in the first step may be free DNA in blood, DNA derived from a microbial genome, DNA synthesized by reverse transcriptase from RNA in a sample, and the like.
  • the “DNA having the target DNA region” includes ribosomal RNA, messenger RNA, transfer RNA, and microRNA. And the like synthesized from the above.
  • the RNA includes not only those transcribed from RNA polymerase from a host genome but also viral genomes using RNA as a genome, and any RNA may be used.
  • the “DNA having the target DNA region” in the method of the present invention includes DNA derived from bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria, fungi, viruses, microorganisms such as pathogenic protozoa, and RNA derived from these microorganisms. To DNA obtained by reverse transcriptase.
  • Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae, Borrelia burgdorferi B31, Rickettsia prowazekii, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori J99, Helicobacter pylori 26695, Haemophilus influenzae Rd, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Escherichia co i, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Campylobacter jejuni subsp.
  • Jejuni Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Bacillusu cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberuculosis, Trichophyton ruburum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Pneumocystis carinii, Coccidioides immitis, Cytomegalovirus, hum n herpesvirus 5, Epstein-Barr virus, Human Immunodeficiency Virus, Human Papilloma Virus, Enterovirus, Norovirus Influenza Virus, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, DNA which has been produced by reverse transcriptase from genomic DNA or RNA of Entamoeba histolytica is in the sample It can be used to detect infection-causing
  • Examples of the base sequence to be detected include a CRISPR (Clustered regularly interspaced short linear repeats) region, which is a base sequence found in the genome.
  • Identification / detection of microorganisms using the method of the present invention includes diagnosis of infectious diseases, identification of food poisoning bacteria, identification of types and numbers of microorganisms present in soil, rivers, lake sediments, etc. (microbiological survey in the environment, etc.) Identification of industrially useful microorganisms such as microorganisms that produce useful compounds and microorganisms that can be used in food fermentation, etc., and mycelia in the state in which microorganisms such as sewage treatment and food fermentation are used industrially (microorganisms) It can be used for confirmation of layer).
  • CRISPR Clustered regularly interspaced short linear repeats
  • the “repetitive sequence” in the method of the present invention means a base sequence in which a plurality of the same predetermined sequences are found in the genome.
  • a simple repetitive sequence referred to as a tandem repeat sequence or a tandem repeat
  • a scattered repetitive sequence or the like is known.
  • Simple repetitive sequences are characterized by the fact that the same sequences are adjacent to each other in the same direction, and a series of base sequences such as satellite DNA, minisatellite, microsatellite, centromere, telomere, centromere, ribosome population gene, etc. are known.
  • Interspersed repetitive sequences are characterized by being scattered adjacent to each other, and are considered to be DNA derived from retrotransposons.
  • the scattered repetitive sequence is composed of SINE (Short Interpersed Repeatable Element) and LINE (short interspersed repetitive element).
  • SINE Short Interpersed Repeatable Element
  • LINE short interspersed repetitive element
  • Alu sequences and LINE-1 sequences are known as typical repetitive sequences, respectively.
  • inactive processed pseudogenes reversely transferred from RNA and proteins, and gene sequences amplified by gene duplication.
  • An overlapping gene refers to a case where a plurality of highly homologous genes exist on one genome, and in many cases, is a base sequence that is arranged in tandem near one gene. It is known that pseudogenes are also included in duplicate genes.
  • a repeat consisting of a relatively short base sequence can be mentioned.
  • MER1-Charlie and Zaphod are known as the hAT group
  • MER2-Tiger, Tc-1, and Mariner are known as the Tc-1 group
  • Tigger1, Tigger2a, Tigger5, Charlie4a, Charlie7, etc. are known.
  • Satellite DNA, minisatellite, microsatellite, and the like are repetitive sequences classified into simple repetitive sequences, and can be used in the method of the present invention as long as a specific adhesion sequence and a detection adhesion sequence described later can be set. is there.
  • ALR6 is present as a sequence present in the centromere
  • U2 and U6 are present as snRNAs
  • nucleotide sequences having biological functions such as tRNA and rRNA are also present in the genome. It is known that there are base sequences that exist in multiple copies.
  • An example of such a gene is a duplicate gene that is a gene having multiple copies in the genome due to gene duplication.
  • the duplicate gene means a gene or a gene fragment thereof generated by doubling a specific gene or gene fragment in the genome due to gene duplication.
  • Gene duplication is a phenomenon in which a certain region of DNA containing a gene overlaps. causes of gene duplication include abnormal genetic recombination, retrotransposon transfer, and duplication of the entire chromosome. For example, when one gene is copied and inserted into genomic DNA, it may be inserted at a different chromosomal position or inserted in the vicinity of the original gene. A place where copied genes are lined up by insertion in the vicinity of the original gene is called a tandem repeat, and a group of genes created by gene duplication is called a gene family (gene family).
  • a pseudogene is a gene that has a characteristic base sequence that makes it imagine that it encoded a gene product (especially a protein) among DNA sequences, but has lost its function now. . It is thought to have arisen as a result of mutations in the sequence having the original function. For example, when a stop codon is generated due to mutation and the peptide chain of the protein is shortened so that it cannot function as a protein, or when a regulatory sequence necessary for normal transcription is lost due to mutation such as single base substitution There is. Pseudogenes often remain the original normal genes, but some become pseudogenes alone. Pseudogenes can be classified into three types according to gene sequence characteristics.
  • pseudogenes When DNA produced by retrotransposon reverse transcriptase from mRNA is inserted into the genome (process-type pseudogene), the original gene sequence is duplicated in the genome, and a part of the copy functions due to mutation, etc. May become pseudogenes due to loss of function (duplicate or non-processed pseudogenes), and genes in the genome may become pseudogenes due to loss of function (no single duplicate gene) .
  • pseudogenes are known to be transcribed or have a gene function (whether or not they should be called pseudogenes).
  • “pseudogene” does not mean the presence or absence of gene function or whether or not it is transcribed, but means the above “process-type pseudogene” and “duplicate pseudogene (non-process-type pseudogene)”.
  • “repetitive sequence” in the method of the present invention “a plurality of nucleotide sequences found in the genome” include retroviruses, retrotransposons having LTR (Lominal terminal repeat) at the end, MaLRs (Mammalian apparent LTR-Retrotransposons). Examples thereof include endogenous sequences that are considered to be derived from viruses, LTRs derived from retroviruses, and the like.
  • LTR1, LTR1B, LTR5, LTR7, LTR8, LTR16A1, LTR16A1, LTR16C, LTR26, LTR26E, MER48, MLT2CB and the like are known as retrovirus-derived LTRs.
  • LTRs derived from retrotransposons are classified into ERV, ERVK, and ERVL classes, specifically, LTR8A, LTR28, MER21B, MER83, MER31B, MER49, MER66B, HERVH, ERVL, LTR16A1, LTR33A, LTR50, A subfamily such as LTR52, MLT2A1, MLT2E, MER11C, and MER11C can be exemplified.
  • MaLRs refer to DNA elements that contain LTRs at both ends of the sequence in the same manner as typical retrotransposons, but whose internal sequences sandwiched between LTRs are not derived from retroviruses.
  • a “scattered repeat sequence” is characterized by being scattered without being adjacent to each other, and is thought to be derived from a retrotransposon. Further, the scattered repeats are classified into SINE (Short Interspersed Repeatable Element) and LINE (Long Interspersed Elements) according to their lengths. Most of the SINEs are sequences belonging to the Alu family.
  • the Alu family has a 3SL sequence or 5 'sequence of 7SL RNA, and has an AT-Rich region sandwiched between regions called Left-monomer and Right-monomer.
  • Alu, AluJb, AluJo, AluSc, AluSg, AluSp, AluSq, AluSx, AluY, and FAM (Fossil Alu Monomer) and FLAM (Free Left Alu Mlu) having the FAM sequence are included.
  • FRAM Free Right Alu Monomer.
  • MIR and Ther / MIR3 are known as SINEs other than the Alu family, and MIR and MIR3 are known as subfamilies, respectively.
  • B1, B2, B4, PB1, PB1D, etc. are known as subfamilies of the Alu family of other species.
  • LINE a subfamily of LINE1 to Line23 has been reported, but LINE-1, LINE2, and LINE3 are widely known to exist in the genome.
  • LINE-1 for example, L1M1, L1M2, L1M3, L1M3d, L1M4, L1M4c, L1MA2, L1MA7, L1MA8, L1MA9, L1MB1, L1MB1, L1MB3, L1MB4, L1MB5, L1MB6, L1MB7, L1MB6 L1MC3, L1MC4, L1MC4a, L1MC5, L1MDa, L1ME, L1MEc, L1MEd, L1MEg, L1ME1, L1ME2, L1ME3, L1ME3A, L1ME3B, L1ME4a, L1PB3, L1P4, L1PA2, L1PA4 L1PA13, L1PA14, L1PA16, L1PB1, L1PB3, L1PB4, L1PREC It is known subfamilies of HAL1, as the LINE-2, L2, subfamily L2c are known.
  • a specific adhesion sequence and a detection adhesion sequence described below can be set for a sequence common to the Alu family or the Alu subfamily, or a sequence common to the LINE-1 family or the LINE-1 subfamily, one genome Since a plurality of detection targets can be set inside, genome detection can be made more sensitive.
  • Specific examples of the target DNA region include a partial sequence of LINE-1 (base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2), a partial sequence of Alu (base sequence shown in SEQ ID NO: 3), or their homology. Can be mentioned. For example, when it is desired to examine a repetitive sequence in a certain region, it is difficult to search using a general sequence search database such as PubMed.
  • Repbase www.girinst.org/repbase/
  • RepeatMasker www. A database such as repeatmasker.org/
  • Measuring these repetitive sequences can be treated as a surrogate marker for the amount of free DNA in the blood, for example, and when focusing on species-specific repetitive sequences, identification of the species, etc. Can be used.
  • Specific examples of repetitive sequences in the genome include those consisting of the base sequences shown below.
  • test oligonucleotide contained in the specimen prepared in the first step the detection oligonucleotide that can bind complementarily to the test oligonucleotide, and the test oligonucleotide that binds complementarily
  • a detection oligonucleotide comprising the test oligonucleotide, the detection oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the support by mixing a specific oligonucleotide capable of binding to a support capable of binding to the specific oligonucleotide.
  • the “detection oligonucleotide” in the second step is capable of complementary binding to the test oligonucleotide, and the nucleotide base constituting the oligonucleotide is identified for detecting or quantifying the detection oligonucleotide. It has a detection adhesive sequence that is a base sequence for binding to DNA (test oligonucleotide) having a function and a target DNA region by complementarity, and a detection sequence linked to the detection adhesive sequence. Oligonucleotide.
  • the “detection oligonucleotide” may be composed of a repetitive sequence in the human genome described later, a base sequence of a duplicate gene or pseudogene, or a base sequence capable of complementary binding.
  • the “detection oligonucleotide” in the second step of the method of the present invention may take the form of a composite detection oligonucleotide described later.
  • the detection oligonucleotide may be an oligonucleotide containing a plurality of methylated DNAs or a methylated oligonucleotide containing methylated cytosine.
  • the “adhesion sequence for detection” in the detection oligonucleotide is an oligonucleotide composed of a part of a base sequence complementary to the base sequence having the target DNA region, and is intended to be paired with the detection adhesive sequence. It is a sequence having 75% or more, preferably 90% or more homology with a DNA base sequence portion having a DNA region.
  • the detection adhesive sequence has a base sequence that binds to the target DNA region or the vicinity of the target DNA region in the test oligonucleotide, and is set so that a detection complex described later can be formed in the second step. It only has to be done.
  • the detection adhesion sequence may be any base sequence as long as it can form a detection complex formed by binding a detection oligonucleotide, a test oligonucleotide, a specific oligonucleotide described later and a support, and will be described in particular later. Those that do not inhibit the binding between the specific oligonucleotide and the test oligonucleotide are preferred.
  • One detection adhesive sequence may be designed in the same repetitive sequence (in the target DNA region), or two or more may be designed. When two or more are designed, it is preferable that the plurality of adhesion sequences for detection and the specific adhesion sequence described below do not inhibit the binding of DNA having the target DNA region to each other.
  • the length of the base sequence of the detection adhesive sequence is 5 bp to 50 bp, preferably 10 bp to 30 bp.
  • the “detection sequence” may be any base sequence that can be used by binding to the detection adhesive sequence and has a discrimination function. That is, it may be an oligonucleotide having a unique base sequence for detection or quantification, or may be a molecule itself having a discrimination function, or an oligonucleotide to which a molecule having a discrimination function is bound. For example, it may be an oligonucleotide labeled with FITC, radiolabel, FITC or radioisotope.
  • the detection sequence may be methylated DNA.
  • the detection sequence can be detected and quantified by binding a methylcytosine antibody having a discrimination function.
  • the detection sequence may be a base sequence that can bind complementarily to the methylated oligonucleotide.
  • the “molecule capable of binding an identification function” is a molecule other than an oligonucleotide that is bound to the oligonucleotide in order to impart the identification function to the detection oligonucleotide.
  • the discriminating function is horseradish peroxidase (HRP) labeled on a FITC antibody described later
  • FITC is a “molecule that can bind the discriminating function”.
  • the “discriminating function” is a function capable of detecting or quantifying the detection oligonucleotide.
  • the identification function may be anything as long as it is a detection oligonucleotide.
  • the identification function based on the label of the detection oligonucleotide and the identification function given to the detection oligonucleotide by a detection molecule that binds to the detection oligonucleotide may be mentioned. it can.
  • europium label gold colloid label, latex bead label, radioisotope label, fluorescent substance (FITC, etc.) label, horseradish peroxidase (HRP) label, alkaline phosphatase label, etc.
  • FITC fluorescent substance
  • HRP horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase label alkaline phosphatase label, etc.
  • Enhancement Solution manufactured by PerkinElmer
  • fluorescence excitation 340 nm / fluorescence 612 nm
  • the detection oligonucleotide is a methylated oligonucleotide
  • specific examples of the detection molecule include methylated DNA antibodies and osmium complexes (J. Am. Chem. Soc., 2007; 129: 5612- 5620).
  • a methylated oligonucleotide is an oligonucleotide in which at least one of the nucleotide bases constituting the oligonucleotide is methylated, and specifically includes oligonucleotides containing 5-methylcytosine, 6-methyladenine, and the like.
  • a FITC antibody can be used as the detection molecule.
  • the “detection molecule” only needs to have the property of detecting or quantifying the detection oligonucleotide. Further, the detection molecule may be one that recognizes the detection sequence of the detection oligonucleotide, and may be previously bound to the detection oligonucleotide. The detection molecule has a property of specifically binding to the detection oligonucleotide, and has a “discrimination function” that is a function / characteristic used for quantification or detection, or can be given a discrimination function. If it is.
  • the detection molecule when the detection sequence is a methylated oligonucleotide, the detection molecule only needs to be capable of detecting the methylated oligonucleotide by binding to the methylated oligonucleotide, and is specific to the methylated oligonucleotide. Any device may be used as long as it has an identification function in combination. Alternatively, for example, the detection molecule may be a methylated DNA antibody. Further, when the detection sequence is the detection molecule itself, it is not necessary to add a new detection molecule in order to detect the detection oligonucleotide, and the detection oligonucleotide is detected by detecting the detection molecule incorporated in the detection oligonucleotide.
  • the detection molecule is a methylated DNA antibody
  • it can be used as an identification function used for quantification or detection by the following method. Specifically, europium label, gold colloid label, latex bead label, radioisotope label, fluorescent substance (FITC, etc.) label, horseradish peroxidase (HRP) label, alkaline phosphatase label, biotin label, etc. It is a function that uses.
  • the discrimination function may be directly coupled to the antibody that is the detection molecule, or a secondary antibody or a tertiary antibody having the discrimination function is detected. May be bound to the antibody.
  • antibodies labeled with fluorescent substances horseradish peroxide (HRP) labeled antibodies, alkaline phosphatase labeled antibodies, biotin labeled antibodies, europium labeled antibodies are used as secondary antibodies or tertiary antibodies. can do.
  • HRP horseradish peroxide
  • alkaline phosphatase labeled antibodies alkaline phosphatase labeled antibodies
  • biotin labeled antibodies europium labeled antibodies
  • europium labeled antibodies are used as secondary antibodies or tertiary antibodies.
  • an antibody bound with a substrate detectable by an enzyme cycle method may be used. Examples of the quantification or detection means for these identification functions include measurement with a radiation detector, a spectrophotometer, etc., or visual observation.
  • enhancement Solution manufactured by PerkinElmer
  • fluorescence excitation 340 nm / fluorescence 612 nm
  • fluorescence detector When the methylated DNA antibody is bound to the methylated DNA on the detection oligonucleotide and the function is detected or quantified, specifically, the methylated DNA antibody is bound to the detection complex, and then the methylated DNA is bound.
  • a secondary antibody against the antibody for example, Eu-N1-labeled mouse IgG antibody: manufactured by PerkinElmer
  • Enhancement Solution manufactured by PerkinElmer
  • fluorescence excitation 340nm / fluorescence 612nm
  • an antibody to which FITC is bound can be used as a secondary antibody.
  • the fluorescence of FITC can be measured and detected or quantified by a known method, and the anti-FITC antibody can be detected or quantified as a secondary antibody.
  • FITC can be used as a discriminating function, such as a horseradish peroxidase (HRP) labeled FITC antibody, an alkaline phosphatase labeled FITC antibody, or a biotin labeled
  • HRP horseradish peroxidase
  • a labeling function can also be imparted by a FITC antibody, a europium-labeled FITC antibody, or the like.
  • a detection complex immobilized on a support which will be described later, containing the detection oligonucleotide is added to a horseradish peroxide (HRP).
  • a labeled antibody for example, HRP-labeled FITC antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) is added, and allowed to stand at room temperature for about 1 to 2 hours to promote the binding of the FITC antibody to the detection complex.
  • FITC antibody solution is washed away, and then an appropriate substrate (for example, Substrate Reagent Pack # DY999: manufactured by R & D SYSTEMS) is added and mixed.
  • an appropriate substrate for example, Substrate Reagent Pack # DY999: manufactured by R & D SYSTEMS
  • a stop solution (2N H2SO4 aqueous solution) is added to stop the reaction of horseradish peroxide (HRP), and the absorbance at 450 nm may be measured within 30 minutes after the reaction is stopped.
  • HRP horseradish peroxide
  • biotinylated detection oligonucleotides can be used for detection or quantification.
  • biotinylated detection oligonucleotide for example, HRP-labeled streptavidin is added to and mixed with an immobilized detection complex, and a conjugate of biotinylated detection oligonucleotide and HRP-labeled streptavidin After forming / separating, biotinylated methylated DNA antibody can be detected or quantified by measuring the activity of HRP by a known method.
  • a substrate or the like used in a highly sensitive detection method such as an enzyme cycle method may be used.
  • an antibody to which an enzyme used in the enzyme cycle method is bound may be bound to the detection complex as a detection molecule.
  • a “methylated DNA antibody” is an antibody that binds with a methylated base in DNA as an antigen.
  • a specific example is a methylcytosine antibody, which has the property of recognizing and binding to cytosine methylated at the 5-position in single-stranded DNA.
  • a commercially available methylated DNA antibody may be any antibody that can specifically recognize and specifically bind to the methylated DNA described in this specification.
  • a methylated DNA antibody can be prepared by a conventional method using a methylated base, methylated DNA or the like as an antigen.
  • a specific antibody from 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or an antibody prepared using DNA containing 5-methylcytosine as an antigen to methylcytosine in DNA It can produce by selecting as a parameter
  • the target DNA region includes a number of methylated bases. It is desirable to select a region where (cytosine), that is, CpG, is present, and improvement in quantitative accuracy and detection sensitivity can be expected.
  • an antibody obtained by contacting an animal with an antigen, after immunizing a purified antigen from the animal a method using an IgG fraction antibody (polyclonal antibody) and an antibody that produces a single clone (monoclonal antibody)
  • polyclonal antibody an antibody that produces a single clone
  • the antibody is capable of specifically recognizing methylated DNA or methylcytosine, and therefore it is desirable to use a monoclonal antibody.
  • a method for producing a monoclonal antibody a cell fusion method can be mentioned.
  • a hybridoma is prepared by cell fusion of a spleen cell (B cell) derived from an immunized mouse and a myeloma cell, an antibody produced by the hybridoma is selected, and a methylcytosine antibody (monoclonal antibody) is selected. Can be produced.
  • B cell spleen cell
  • a methylcytosine antibody monoclonal antibody
  • 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or a mixture of DNA containing 5-methylcytosine is used as an antigen for immunization. It can be administered to the animals used.
  • 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine is directly administered to a mouse producing an antibody.
  • immunization may be performed by binding an antigen to a support.
  • an adjuvant solution for example, liquid paraffin and Aracel A mixed, mixed with killed tuberculosis bacteria as an adjuvant
  • antigen for example, liquid paraffin and Aracel A mixed, mixed with killed tuberculosis bacteria as an adjuvant
  • an adjuvant solution for example, liquid paraffin and Aracel A mixed, mixed with killed tuberculosis bacteria as an adjuvant
  • the immunity of the antigen can be increased.
  • an antigen-containing solution and an adjuvant solution to make it sufficiently milky, then inject it subcutaneously or intraperitoneally into mice, or mix well with alum water and add pertussis killed as an adjuvant There is a way to do it. It is also possible to boost the mouse intraperitoneally or intravenously after an appropriate period after the first immunization. Further, when the amount of antigen is small, a solution in which the antigen is suspended may be directly injected into the mouse spleen for immunization. A few days after the final immunization, the spleen is removed and the adipose tissue is removed, and then a spleen cell suspension is prepared.
  • the spleen cells are fused with, for example, HGPRT-deficient myeloma cells to produce a hybridoma.
  • Any cell fusion agent may be used as long as it can efficiently fuse spleen cells (B cells) and myeloma cells. Examples thereof include methods using Sendai virus (HVJ) and polyethylene glycol (PEG).
  • cell fusion may be performed by a method using a high voltage pulse. After the cell fusion operation, the cells are cultured in HAT medium, a hybridoma clone in which spleen cells and myeloma cells are fused is selected, and the cells are allowed to grow until screening becomes possible.
  • An antigen-antibody reaction system can be used for an antibody detection method or antibody titer measurement method for selecting a hybridoma producing the target antibody.
  • Specific examples of antibody measurement methods for soluble antigens include radioisotope immunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (ELISA).
  • the “specific oligonucleotide” in the method of the present invention is an oligonucleotide having a base sequence that can bind by complementarity with DNA containing the target DNA region, and has a function of binding to a support described later. Just do it. Specifically, it has a specific adhesion sequence that complementarily binds to DNA having a target DNA region, and can bind to a support to form a detection complex described later.
  • the “specific adhesion sequence” is an oligonucleotide having a base sequence that can be complementarily bound to a base sequence having a target DNA region (test oligonucleotide).
  • the complementary base sequence of the base sequence portion of the test oligonucleotide to which the specific adhesion sequence can pair has 75% or more, preferably 90% or more homology with the base sequence of the specific adhesion sequence.
  • the length of the base sequence of the specific adhesion sequence is 5 bp to 50 bp, preferably 10 bp to 30 bp.
  • the specific adhesion sequence has a base sequence that binds to the target DNA region or the vicinity of the target DNA region in the test oligonucleotide, and is set so that a detection complex described later can be formed in the second step. It only has to be.
  • the specific adhesion sequence may be any base sequence as long as it can form a detection complex formed by combining the detection oligonucleotide, the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the support, and particularly the specific oligonucleotide and the target oligonucleotide. Those that do not inhibit binding to the test oligonucleotide are preferred.
  • “Complementary binding” means that two single-stranded DNAs form a double-stranded DNA by base pairing by hydrogen bonding between bases.
  • a base constituting a single-stranded DNA causes a base pairing of purine and pyrimidine with a base constituting another single-stranded DNA, so that the single-stranded DNA becomes a double-stranded DNA.
  • a double-stranded DNA is formed by a base bond by a hydrogen bond between a plurality of continuous thymines and adenine and guanine and cytosine.
  • “Complementary binding” may be expressed as “bonding by complementary base pairing”, “complementary base pairing”, or “binding by complementarity”.
  • base sequences that can be complementarily bound may be expressed as “complementary” or [complementary].
  • Complementary binding also includes that inosine contained in an artificially produced oligonucleotide binds to cytosine, adenine, or thymine by hydrogen bonding.
  • Single-stranded DNA containing a base sequence that is complementary to the target DNA region means to form a conjugate (double-stranded DNA) with the single-stranded DNA containing the target DNA region.
  • DNA having a target DNA region and a specific oligonucleotide are “coupled by complementarity”, a part of the base sequence constituting the specific adhesion sequence of the specific oligonucleotide has the target DNA region. The case where DNA does not base pair is also included.
  • the bases constituting the specific adhesion sequence 75% or more, preferably 80% or more of the bases are base-paired with DNA having the target DNA region, and the target DNA region has the target DNA region.
  • a DNA having a target DNA region and a detection oligonucleotide are “combined by complementarity”, a part of the base sequence constituting the detection adhesion sequence of the detection oligonucleotide has a target DNA region.
  • the case where the base pairing is not performed is also included.
  • the bases constituting the detection adhesive sequence 75% or more, preferably 80% or more of the bases are base-paired with DNA having the target DNA region, and the target DNA region is It also includes the case where it can bind to the oligonucleotide having the homology of 75% or more, desirably 80% or more.
  • the repetitive sequence is a group of base sequences having homology, so that it is identified as DNA having the target DNA region. Complementary base pairing of the adhesion sequence may occur when a part of the base sequence does not base pair with DNA having the target DNA region.
  • the specific adhesion sequence is a base sequence having a homology of 80% or more. Also included are specific adhesion sequences that can bind by complementarity.
  • the “base sequence exhibiting homology” means a base sequence having sequence identity.
  • the sequence homology ratio is not described in the method of the present invention, it means a base sequence having a sequence identity of 75% or more, preferably 80% or more.
  • the “base sequence showing homology with SEQ ID NO: 1” is the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 75% or more sequence identity with the base sequence of SEQ ID NO: 1, preferably 80% or more It means that the nucleotide sequence has the same sequence identity.
  • the “support” in the method of the present invention the material and shape are not specified as long as the detection complex described later can be bound thereto.
  • the shape may be suitable for the purpose of use, and examples thereof include a tube shape, a test plate shape, a filter shape, a disk shape, and a bead shape.
  • the material is a material used as a normal support for immunoassay, for example, a synthetic resin such as polystyrene, polypropylene, polyacrylamide, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyacrylonitrile, nylon, or a sulfone group on the synthetic resin. Those having a reactive functional group such as an amino group may be introduced. Further, glass, polysaccharides or derivatives thereof (cellulose, nitrocellulose and the like), silica gel, porous ceramics, metal oxides and the like may be used.
  • a synthetic resin such as polystyrene, polypropylene, polyacrylamide, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyacrylonitrile, nylon, or a sulfone group on the synthetic resin. Those having a reactive functional group such as an amino group may be introduced.
  • glass, polysaccharides or derivatives thereof (cellulose, nitrocellulose and the like), silica gel, porous ceramics, metal oxides and the like may
  • the “detection complex” refers to a complex in which the test oligonucleotide, the detection oligonucleotide, the specific oligonucleotide, and the support are bound.
  • an aqueous genomic DNA solution containing the test oligonucleotide 0.1 pmol / 10 ⁇ l, in the case of genomic DNA, the DNA should be fragmented by treating with an appropriate restriction enzyme in advance.
  • the thus formed conjugate of the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide is transferred to an avidin plate as a support and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to be bound to the support. That's fine. Thereafter, the remaining solution is removed and washed. Wash buffer [e.g., phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] is added at a rate of 200 ⁇ L / well and the solution is removed. This washing operation is repeated several times to form a detection complex using the avidin plate as a support.
  • Wash buffer e.g., phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • a specific oligonucleotide may be fixed to the support according to a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit / device (binding to a solid phase). Specifically, after biotinylating the 5 ′ end of a specific oligonucleotide, the obtained biotinylated specific oligonucleotide is coated with streptavidin (for example, a streptavidin-coated PCR tube or streptavidin. Examples thereof include a method of fixing to coated magnetic beads, a chromatostrip partially coated with streptavidin, and the like.
  • streptavidin for example, a streptavidin-coated PCR tube or streptavidin. Examples thereof include a method of fixing to coated magnetic beads, a chromatostrip partially coated with streptavidin, and the like.
  • a method of covalently bonding to a support made of silica or a heat-resistant plastic via a spacer, a crosslinker, or the like, such as a structure in which five triglycerides are connected in series may be mentioned.
  • a method of chemically synthesizing directly from the terminal side of a specific oligonucleotide on a glass or silicon support is also included.
  • a test oligonucleotide, a biotinylated specific oligonucleotide, and a detection oligonucleotide are added simultaneously to obtain a conjugate of the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide, and then in the conjugate Although it is immobilized (selected) using a biotinylated specific oligonucleotide, the order is not particularly limited.
  • the biotinylated specific oligonucleotide is first immobilized on the avidin plate (support), then the test oligonucleotide and the detection oligonucleotide are added, and the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide are bound.
  • the body may be acquired and immobilized (selected).
  • the 5 ′ end or 3 ′ end of the test oligonucleotide obtained in advance is biotinylated and the same method as described above is performed.
  • the conjugate of the test oligonucleotide and the detection oligonucleotide may be directly bound to the support and selected.
  • the same fine particles as those used as a support may be bound to these oligonucleotides as a discrimination function for detection oligonucleotides and composite detection oligonucleotides described later.
  • the fine particles include latex beads and gold colloids (gold nanoparticles).
  • the microparticles that are the support and the microparticles bound to the detection oligonucleotide are placed on the microparticles that are the support on the test oligonucleotide.
  • Can be detected as an aggregate of fine particles by forming a detection complex by complementary binding of the test oligonucleotide and the detection oligonucleotide. In this case, if the fine particles are latex beads, the aggregate can be detected by a change in turbidity.
  • the aggregate can be detected by a change in color tone (from pink to purple).
  • the binding of multiple detection oligonucleotides with fine particles bound to the target DNA region can be supported by the binding of multiple detection oligonucleotides with fine particles bound to the target DNA region.
  • the body can agglomerate. In this case, the same result as when the specific oligonucleotide is added can be obtained even if the specific oligonucleotide is not added.
  • the method of the present invention adds a specific oligonucleotide when a plurality of base sequences capable of binding complementarily to the “adhesion sequence for detection” capable of binding to the detection oligonucleotide exist on the target DNA region.
  • a method capable of detecting aggregation of fine particles is also included.
  • a plurality of specific oligonucleotides with fine particles bound as a support bind to the target DNA region. By doing so, the support can be agglomerated.
  • the same result as when the detection oligonucleotide is added can be obtained even when the detection oligonucleotide is not added. Therefore, in the method of the present invention, when a plurality of base sequences capable of binding complementary to the specific adhesion sequence of the specific oligonucleotide exist on the target DNA region, the aggregation of the fine particles is performed without adding the detection oligonucleotide.
  • the method which can detect is also included.
  • the amount detected as a fine particle aggregate can be used as an index correlated with the amount of the target DNA region contained in the test oligonucleotide in the sample.
  • the “adhesion sequence for detection” and the “specific adhesion sequence” are only the difference between the base sequence contained in the detection oligonucleotide or the base sequence contained in the specific oligonucleotide, the detection oligonucleotide and the specific oligonucleotide, respectively. Is an oligonucleotide that can simultaneously bind to the test oligonucleotide. That is, the “detection adhesive arrangement” can also be used as the “specific adhesion arrangement”, and the “specific adhesion arrangement” can also be used as the “detection adhesion arrangement”.
  • the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 12 are set as “specific adhesion sequence” and “adhesion sequence for detection” that can bind to SEQ ID NO: 1, respectively.
  • the detection sequence shown in SEQ ID NO: 5 is prepared by continuously synthesizing the detection sequence with the detection adhesion sequence shown in SEQ ID NO: 12 by biotinylating the adhesion sequence to make a specific oligonucleotide
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be detected using the detection oligonucleotide.
  • the base sequences of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 4 are set as “specific adhesive sequence” and “detection adhesive sequence” that can bind to SEQ ID NO: 1, respectively, and the specific adhesive sequence shown in SEQ ID NO: 12 is A specific oligonucleotide is obtained by biotinylation, and a detection sequence is prepared by continuously synthesizing the detection sequence with the base sequence of the detection adhesion sequence shown in SEQ ID NO: 5. Using the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide, Similarly, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be detected.
  • examples of the combination of “specific adhesion sequence” and “detection adhesion sequence” that can bind to SEQ ID NO: 1 include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 14, and can bind to SEQ ID NO: 2.
  • examples of the combination of “specific adhesion sequence” and “adhesion sequence for detection” include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 13, and “specific adhesion sequence” and “adhesion for detection” that can bind to SEQ ID NO: 3
  • Examples of the combination with “sequence” include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 15.
  • a specific oligonucleotide that can form a detection complex by binding to the test oligonucleotide and a “specific adhesion sequence” and a “adhesion sequence for detection” that constitute the detection oligonucleotide are a test oligonucleotide that can form a detection complex Can be treated as a combination of base sequences that can be complementarily bound to each other, and when one of them is used as a specific adhesion sequence, the remaining one may be used as a detection adhesion sequence.
  • the “composite detection oligonucleotide” in the method of the present invention is a nucleotide that binds complementarily to a test oligonucleotide and binds (complexes) with a plurality of oligonucleotides having an identification function.
  • each of the oligonucleotides may be bonded by an adhesive base sequence comprising base sequences complementary to each other, and individual oligonucleotides constituting the composite detection oligonucleotide. All or some of the nucleotides may be methylated.
  • a compound in which at least a part of the composite detection oligonucleotide is methylated may be referred to as a methylated composite detection oligonucleotide.
  • the methylated composite detection oligonucleotide may be a composite detection oligonucleotide containing a methylated oligonucleotide.
  • the methylated composite detection oligonucleotide for example, may be formed by binding only a methylated oligonucleotide.
  • Non-methylated (unmethylated) oligonucleotides may be combined and bound, and the number of each oligonucleotide is not limited.
  • the “methylated oligonucleotide” is an oligonucleotide in which the nucleotide base constituting the oligonucleotide is methylated, and may be artificially synthesized in the present invention. Alternatively, it may be prepared by modifying an artificially synthesized oligonucleotide or an oligonucleotide obtained by fragmenting genomic DNA with a methyltransferase.
  • methyltransferases are known to methylate the 5-position of cytosine in “CpG” in oligonucleotides. Specific examples of such methyltransferases include , Sssl methylase, Dmnt1 methylase, and the like. Since genomic DNA is partially methylated, when genomic DNA obtained from a cell or the like is fragmented, the methylated region in the genome may be obtained as a methylated oligonucleotide.
  • the methylated oligonucleotide in which the 5-position of cytosine is methylated may be a methylated oligonucleotide that is artificially synthesized using 5-methylcytosine instead of cytosine.
  • cytosine of “CpG” not only cytosine of “CpG” but all cytosines (for example, 5′-CA-3 ′, 5′-CT-3 ′, 5′-CC-3 ′, etc.) are synthesized as 5-methylcytosine.
  • the “DNA methylase” is an enzyme that methylates a base in DNA, and various DNA methylases have been isolated from mammalian cells, bacteria, and the like.
  • DNA methylases are classified into several types, such as adenine methylase and cytosine methylase, based on the type of substrate base.
  • Cytosine methylase is an enzyme that recognizes a specific sequence in a DNA base sequence and methylates cytosine in the vicinity of the sequence, and different cytosine methylases are known depending on the base sequence to be recognized.
  • a number of DNA methylation reactions catalyzed by DNA methylases have been found in the primitive immune system called a restriction modification system.
  • a restriction modification system is a method in which a whole genome that functions in bacteria is periodically methylated so that it is not digested by a restriction enzyme that recognizes a specific sequence (restriction endonuclease), and then foreign DNA (especially bacteriophage). ) Is a system that protects the microbial genome from bacteriophage infection. Enzymes that function in methylation of the genome are known to methylate cytosine or adenine, and many of them purify the nitrogen at position 6 (N6) or the carbon at position 5 (C5). Yes. Among such enzymes, SssI (M.
  • SssI SssI methylase, AluI methylase, HhaI methylase, HpaII methylase, MspI methylase, HaeIII methylase and the like are known as cytosine methylases that methylate C5 of cytosine.
  • the enzymes that methylate the C5 position of cytosine have different base sequences to recognize, and SssI is the only cytosine methylase that recognizes CpG.
  • epigenetics a mechanism that produces diversity of gene expression independent of gene sequence.
  • a DNA methyltransferase is known as such a cytosine methylase.
  • DnmtI methyltransferase is known as a DNA methyltransferase. Since the Cp position of cytosine in the CpG sequence is methylated in human cells, when artificially methylating the genome, the same sequence (CpG) as methylation in human cells can be obtained by using SssI. It is possible to methylate the same position of the same cytosine. In order to obtain DNA methylated by cytosine methylase, specifically, for example, the following may be carried out.
  • the oligonucleotides constituting the composite detection oligonucleotide are coupled (linked) in series in a complementary manner (also referred to as “series type”)
  • the oligonucleotides constituting the composite detection oligonucleotide (Including methylated oligonucleotides)
  • an oligonucleotide having a detection adhesion sequence that binds to a test oligonucleotide by complementarity is referred to as a first oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide has the detection adhesive sequence and does not bind complementary to the base sequence other than the detection adhesive sequence of the test oligonucleotide, and binds complementary to the first oligonucleotide.
  • a first adhesion base sequence which is an adhesion base sequence capable of complementary binding with a complementary adhesion sequence of a second oligonucleotide which is a possible oligonucleotide (including a methylated oligonucleotide).
  • an oligonucleotide (including a methylated oligonucleotide) having a complementary first adhesive base sequence composed of a base sequence that can be complementarily bound to the first adhesive base sequence is referred to as a second oligonucleotide.
  • the second oligonucleotide has the complementary first adhesion base sequence and does not form a complementary bond with the test oligonucleotide and the first oligonucleotide other than the first adhesion sequence, and the second oligonucleotide It has the 2nd adhesion base sequence which is an adhesion base sequence which can be complementarily bound with the 3rd oligonucleotide which is an oligonucleotide (including a methylated oligonucleotide) which can bind complementarily.
  • Oligonucleotides having a complementary second adhesion base sequence composed of a base sequence capable of complementary binding to the second adhesion base sequence are referred to as third oligonucleotides.
  • oligonucleotides having a complementary Nth adhesion base sequence consisting of a base sequence capable of complementary binding to the Nth adhesion base sequence are referred to as (N + 1) th oligonucleotide.
  • the (N + 1) th oligonucleotide has the complementary (N) adhesion base sequence and is complementary to the test oligonucleotide other than the Nth adhesion sequence and the oligonucleotides from the first oligonucleotide to the Nth oligonucleotide. It is an adhesion base sequence that can bind complementarily to the (N + 2) oligonucleotide, which is an oligonucleotide (including a methylated oligonucleotide) that can bind complementarily to the (N + 1) oligonucleotide without performing specific binding. It has the (N + 1) th adhesive base sequence.
  • Oligonucleotides having a complementary (N + 1) adhesion base sequence consisting of a base sequence capable of complementary binding with the (N + 1) adhesion base sequence are referred to as (N + 2) oligonucleotides.
  • oligonucleotides having a complementary (N-1) adhesion base sequence consisting of a base sequence capable of complementary binding to the (N-1) adhesion base sequence are converted into Nth oligos. Called nucleotides.
  • the Nth oligonucleotide has the complementary (N-1) adhesion base sequence, and the test oligonucleotide other than the (N-1) adhesion sequence, the first oligonucleotide to the (N-1) th oligonucleotide Complementary binding to the (N + 1) th oligonucleotide, which is an oligonucleotide (including methylated oligonucleotides) that can bind complementary to the Nth oligonucleotide without complementary binding to the oligonucleotide up to the nucleotide.
  • an N-th adhesion base sequence which is a possible adhesion base sequence.
  • the Nth oligonucleotide is called a terminal oligonucleotide, and the Nth oligonucleotide may not have the Nth adhesion base sequence. That is, in one form of the composite detection oligonucleotide in the method of the present invention, the first oligonucleotide to the terminal oligonucleotide are linked by a complementary bond between the adhesive base sequence and the complementary adhesive base sequence.
  • the first oligonucleotide may not have an adhesive base sequence, and may be a methylated oligonucleotide. There may be.
  • the adhesion base sequence and the complementary adhesion base sequence may be any base sequence that can be complementarily bound by oligonucleotides (including methylated oligonucleotides), and may be located at the end of the oligonucleotide or in the middle. You may do it.
  • the Nth adhesion base sequence does not form a complementary bond with a base sequence other than the complementary Nth adhesion base sequence, and the Nth adhesion base sequence is any complementary other than the complementary Nth adhesion base sequence. It is desirable to be characterized by not inhibiting any binding.
  • the N-th adhesion base sequence is a base sequence of an oligonucleotide constituting a composite detection oligonucleotide other than a complementary N-th adhesion base sequence, a nucleic acid contained in a specimen, a test oligonucleotide, and other oligonucleotides including a specific oligonucleotide. It is desirable not to make a complementary bond with.
  • the composite detection oligonucleotide when the oligonucleotides constituting the composite detection oligonucleotide can be branched (combined) in a complementary manner (other than in series), the composite detection oligonucleotide can be linked (linked).
  • oligonucleotides including methylated oligonucleotides constituting nucleotides
  • a plurality of adhesion base sequences may exist on the Nth oligonucleotide. For example, when there are M adhesion base sequences in the Nth oligonucleotide, the (N, 1) adhesion base sequence, the (N, 2) adhesion base sequence, and the (N, 3) adhesion, respectively.
  • N, (M-1) adhesion base sequence
  • N, M adhesion base sequence
  • oligonucleotides that bind to the adhesion base sequence by complementarity No. (N + 1), 1) oligonucleotide, ((N + 1), 2) oligonucleotide, ((N + 1), 3) oligonucleotide, ..., ((N + 1), (N-1)) oligonucleotide, Called the ((N + 1), M) oligonucleotide.
  • the ((N + 2), 1) oligonucleotide when the ((N + 2), 1) oligonucleotide does not exist, the ((N + 1), 1) oligonucleotide is the terminal oligonucleotide and the ((N + 1), 1) adhesion base sequence exists. You don't have to.
  • the adhesion base sequences on the (N, 1) oligonucleotide for example, when there are L adhesion base sequences in the (N, 1) oligonucleotide, respectively.
  • Adhesive base sequence referred to as the (N, 1, L) adhesive base sequence
  • the oligonucleotides that bind to the adhesive base sequence by complementarity are the ((N + 1), 1,1) oligonucleotide, ((N + 1), 1,2) oligonucleotide, ((N + 1), 1,3) oligonucleotide,..., ((N + 1), 1, (L ⁇ 1)) oligonucleotide, ((N + 1) ), 1, L) oligonucleotide.
  • the ((N + 2), 1,1) oligonucleotide when the ((N + 2), 1,1) oligonucleotide does not exist, the ((N + 1), 1,1) oligonucleotide is a terminal oligonucleotide and the ((N + 1), 1,1) 1)
  • the adhesive base sequence may not exist.
  • the branched complex oligonucleotide is not only a complex detection oligonucleotide that is branched, but also includes several types of first oligonucleotides, and a plurality of first oligonucleotides (methylated oligonucleotides) on the test oligonucleotide. Including nucleotides).
  • the first linking sequence, the second linking sequence,... Complementary to the M linking sequence on the test oligonucleotide.
  • (N + 1, M) adhesive array 1) Oligonucleotide, (N + 1, 2) oligonucleotide, (N + 1, 3) oligonucleotide,... (N + 1, M) oligonucleotide may be used.
  • (N + 1, N) , ⁇ , X, P) may be an oligonucleotide.
  • various combinations can be performed to increase the sensitivity of the composite detection oligonucleotide, and the combination of each oligonucleotide and terminal oligonucleotide can be adjusted according to the sensitivity or accuracy desired to be detected.
  • these adhesion base sequences may be the same or different.
  • the base sequences of the (N, 1) adhesive base sequence, the (N, 2) adhesive base sequence, and the (N, 3) adhesive base sequence may all be the same or different. It may be.
  • the linked adhesion sequence and the complementary linked base sequence, and the bonded base sequence and the linked base sequence may be any base sequence that can be complementarily bound to each other, and specifically, as long as they have 90% or more homology. There is no problem, usually 5 to 100 bp, preferably 10 to 50 bp.
  • the base sequence is preferably designed so as not to make complementary binding to the genome, and more preferably artificially synthesized DNA.
  • a Blast search is performed in a genome database of a public institution such as PubMeD. What is necessary is just to confirm that there is no base sequence which shows the homology of more than%.
  • the “composite detection oligonucleotide” is linked to the test oligonucleotide by a complementary bond between the linked base sequence and the complementary linked base sequence to form a detection complex.
  • the detection complex may be one in which one detection oligonucleotide is bound to one test oligonucleotide, or may be one in which a plurality of complex detection oligonucleotides are bound.
  • the composite detection oligonucleotide may be a methylated composite detection oligonucleotide.
  • each composite detection oligonucleotide may be the same composite detection oligonucleotide or different composite detection oligonucleotides.
  • the linking base sequence on the test oligonucleotide may be one of several types of linking base sequences, or a plurality of one type of linking base sequences.
  • the “test oligonucleotide which is a DNA having a target DNA region” obtained in the first step of the present invention may be a single-stranded DNA. Any method may be used for obtaining the test oligonucleotide as single-stranded DNA from the specimen.
  • the target DNA region is an aqueous genomic DNA solution (0.1 pmol / 10 ⁇ l, in the case of genomic DNA, it is desirable to treat the DNA with an appropriate restriction enzyme in advance to fragment the DNA) or a test.
  • An optimal 10 ⁇ buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc) was added to the oligonucleotide aqueous solution (0.1 pmol / 10 ⁇ l). 2 10 ⁇ l of 5 mM Dithothreitol) is added, and then sterilized ultrapure water is added to the mixture to make a liquid volume of 100 ⁇ L.
  • the target DNA region may exist in a single-stranded DNA or a hybrid with RNA in the sample, such as viral genomic DNA (single-stranded DNA) or DNA synthesized from RNA with reverse transcriptase.
  • RNA single-stranded DNA
  • “to form a detection complex consisting of the test oligonucleotide, the detection oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the support” means, for example, an aqueous genomic DNA solution containing the test oligonucleotide (0 In the case of 1 pmol / 10 ⁇ l genomic DNA, it is desirable to preliminarily treat the DNA with an appropriate restriction enzyme to fragment the DNA.) Or a test oligonucleotide aqueous solution (0.1 pmol / 10 ⁇ l) Add 5 ⁇ L of 0.02 ⁇ M biotinylated specific oligonucleotide as a specific oligonucleotide that binds by complementarity, add 5 ⁇ L each of detection oligonucleotide aqueous solution (0.02 ⁇ M) that binds by complementarity to the test oligonucleotide, and further add 100 mM.
  • wash buffer e.g., phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)
  • Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • the third step is a step of quantifying or detecting the DNA having the target DNA region by detecting the detection oligonucleotide contained in the detection complex formed in the second step by its identification function.
  • the quantitative determination or detection of the DNA having the target DNA region by detecting the detection oligonucleotide contained in the detection complex formed in the second step by its identification function which is the third step, Specifically, for example, when the detection oligonucleotide is a methylated oligonucleotide, a methylated DNA antibody is added as a detection molecule to the avidin plate to which a conjugate of the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide is bound.
  • a detection oligonucleotide contained in the detection complex And bound to a detection oligonucleotide contained in the detection complex. Thereafter, the remaining solution is removed, and washing is performed using a washing buffer to leave a detection complex. More specifically, for example, a methylcytosine antibody (1 mg / ml) prepared at 1 ⁇ g / mL is immobilized on a plate on which a conjugate of the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide obtained in the above method specific example is immobilized. mL) is added at a rate of 100 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the remaining solution is removed and washed.
  • a methylcytosine antibody (1 mg / ml) prepared at 1 ⁇ g / mL is immobilized on a plate on which a conjugate of the test oligonucleotide, the specific oligonu
  • Wash buffer e.g., phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)
  • This washing operation is repeated several times, leaving the methylcytosine antibody bound to the detection complex.
  • Other specific examples include, for example, a detection complex to which a methylated DNA antibody is bound, a europium (hereinafter sometimes referred to as “Eu”) labeled antibody (secondary) that binds to the methylated DNA antibody.
  • fluorescence may be measured at excitation 340 nm / fluorescence 612 nm.
  • a FITC label can be used instead of the Eu label.
  • the FITC-labeled antibody (secondary antibody) can be further detected by the HRP enzyme activity by binding the HRP-labeled FITC antibody.
  • a substrate R & D, # DY999
  • a stop solution (1M H 2 SO 4 : 50 ⁇ L / well
  • absorbance at 450 nm (Reference 650 nm) may be measured.
  • an antibody bound with a substrate detectable by the enzyme cycle method may be used as the secondary antibody. More specifically, for example, the mouse IgG antibody Eu ⁇ prepared at 0.25 ⁇ g / mL was added to the detection complex (support is an avidin plate) to which the methylated DNA antibody obtained in the above method specific example was bound.
  • N1 (Perkin Elmer) was added at a rate of 100 ⁇ L / well, allowed to stand at room temperature for 1 hour, the remaining solution was removed, and the washing buffer [for example, 0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH) 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] is added at a rate of 200 ⁇ L / well and the solution is removed. This washing operation is repeated several times. Enhancement solution is added at 200 ⁇ L / well and stirred for 45 minutes at room temperature. Subsequently, measurement is performed at excitation 340 nm / fluorescence 612 nm (Lag Time 400 msec, Integration 400 msec).
  • the washing buffer for example, 0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH) 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • a mouse IgG antibody (goat) labeled with FITC prepared to 2 ⁇ g / mL is applied to the detection complex (support is an avidin plate) to which the methylated DNA antibody obtained in the above-described method specific example is bound.
  • the remaining solution was removed and washed buffer [for example, phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] is added at a rate of 200 ⁇ L / well and the solution is removed. This washing operation is repeated several times.
  • a secondary antibody against FITC (for example, HRP-labeled anti-FITC antibody: manufactured by Jackson ImmunoResearch Laboratories) is added to the avidin-coated plate at a rate of 100 ⁇ L / well and incubated at room temperature.
  • Wash buffer e.g., phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Substrate (R & D, # DY999) is added at a rate of 100 ⁇ L / well and stirred for about 10 seconds.
  • the present invention may be used in the following situations. For example, in the diagnosis of cancer or the like, it can be used as a screening test in a regular health checkup by quantifying free DNA in blood. In the diagnosis of infectious diseases, etc., simple methods for identifying causative bacteria, causative viruses, and food poisoning bacteria by infecting diseases by quantifying or detecting disease-causing bacteria, viral DNA, and DNA prepared using RNA as a template. Can be provided.
  • DNA synthesized using free DNA in the blood DNA derived from microorganisms or RNA as a template has been quantified or detected after PCR is performed and the DNA is amplified.
  • DNA can be quantified or detected without performing complicated methods such as PCR.
  • immunological measurement methods are widely used.
  • the so-called immunochromatography method using chromatography is simple in operation and requires a short time for the assay. Therefore, many methods such as clinical tests in hospitals and laboratory tests in laboratories are currently used. Widely used in scenes.
  • the measurement method of the present invention conceptually enables a method in which the immunochromatography method and the hybrid chromatography method are mixed.
  • the order of complex formation and complex acquisition is not particularly limited, and various methods are possible. Specifically, for example, it may be carried out as follows.
  • a detection oligonucleotide having a discrimination function with a biotinylated specific oligonucleotide is added to a sample immediately after the end of the second step, and a detection oligo having a discrimination function with a methylated single-stranded DNA containing the target DNA region Nucleotide and a specific biotinylated oligonucleotide were bound, and a conjugate of a single-stranded DNA containing the target DNA region, a detection oligonucleotide having a discrimination function, and a biotinylated specific oligonucleotide was bound to the support.
  • a detection complex is formed.
  • the detection complex moves through the development part by capillary action and is captured by the part previously coated with streptavidin. Thereafter, the detection oligonucleotide contained in the obtained complex is detected or quantified based on its identification function, whereby the DNA having the target DNA region can be detected or quantified.
  • a test oligonucleotide having each target DNA region, and each specific oligonucleotide that binds complementarily to the test oligonucleotide If the formation of a conjugate with a detection oligonucleotide can also be formed in the presence of another test oligonucleotide, a specific oligonucleotide, and a detection oligonucleotide, DNA having multiple target DNA regions can be detected simultaneously. It is also possible to do.
  • the detection oligonucleotide and the specific oligonucleotide have, for example, any of the base sequences shown below.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (2) A complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with it (3) The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (4) A complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (5) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with it (6) A complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with it (7) The base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a base sequence having 80% or more sequence identity with it (8) A complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence having 80% or
  • a detection complex is obtained by binding a detection oligonucleotide, a biotinylated specific oligonucleotide, and a target DNA region or a test oligonucleotide that is DNA prepared from a target RNA region to a support.
  • the method for performing the process is not limited to the above-described method, and any method using an immunoantibody method may be used.
  • the ELISA method uses the same principle as the chromatographic strip method, the process of forming a conjugate of the test oligonucleotide, the specific oligonucleotide and the detection oligonucleotide and binding them to the support is performed in the order described. Is possible.
  • the first step of the method of the present invention it is preferable to extract DNA as a specimen by a system in which a high concentration sodium salt is present.
  • the concentration of sodium salt in the solution (for example, buffer solution) used in the DNA extraction operation for obtaining the sample DNA in the first step of the method of the present invention is at least 50 mM, preferably 100 mM or more can be mentioned. More specifically, 50 mM or more and 1000 mM or less, preferably 100 mM or more and 1000 mM or less, more preferably 100 mM or more and 200 mM or less.
  • the salt contains sodium ions, NaCl, NaCO 3 , Na 2 SO 4 Although any salt containing etc. may be sufficient, NaCl can be mentioned preferably.
  • the present invention is a method for selecting a specimen derived from a cancer patient, and a quantification result or detection result of DNA quantified or detected using a specimen derived from a subject by the method according to any one of the inventions 1 to 13. If the difference between the quantification result or the detection result of the DNA quantified or detected using a specimen derived from a healthy person by the same method is significant, the specimen derived from the subject is evaluated as a specimen derived from a cancer patient, and the evaluation A method comprising identifying a specimen from a cancer patient based on the results.
  • Preferred embodiments of the invention include an invention in which the specimen is a mammal-derived serum, and an invention in which the DNA having the target DNA region is a free DNA having the target DNA region in the mammal-derived serum. Can be mentioned. If these inventions are used, it will be possible to easily identify cancer patients by blood tests.
  • cancer patient means a subject who has developed cancer
  • examples of cancer include lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer), esophageal cancer, gastric cancer, duodenal cancer, colon cancer, rectal cancer, Liver cancer (hepatocellular carcinoma, cholangiocellular carcinoma), gallbladder cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, anal cancer, breast cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, prostate cancer, kidney cancer, urine Duct cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, maxillary cancer, tongue cancer, (upper, middle, lower) pharyngeal cancer, laryngeal cancer, acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphoid Solid cancers that develop in human and mammalian organs such as leukemia, chronic lymphocytic leukemia, malignant lymphoma, myel
  • Example 1 For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following TE buffer solutions were prepared in duplicate.
  • Solution A Human blood-derived genomic DNA 500 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • B Human blood-derived genomic DNA 50 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • C Human blood-derived genomic DNA 5 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each of the prepared solutions, 10 U of restriction enzyme XspI, and 10 ⁇ buffer solution suitable for XspI (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 10 ⁇ m Dithiothreitol, 1000 mM KCl) was mixed with 5 ⁇ l, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • target DNA regions X, a region corresponding to base numbers 1142-1473 shown in SEQ ID NO: 1, Genbank Accession No. M80340
  • LINE1 region known as a human transposon on human genomic DNA.
  • a 5′-terminal biotinylated oligonucleotide B1 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 that binds to the target DNA region X by complementarity was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region X by complementarity for detecting the target DNA region X a methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies.
  • Oligonucleotide M1 was synthesized and a 0.2 pmoL / 10 ⁇ L TE buffer solution was prepared.
  • the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • 100 ⁇ L of the resulting reaction solution is transferred to a streptavidin-coated 8-well strip and allowed to stand at room temperature for about 30 minutes.
  • the detection complex consisting of the target DNA region, specific oligonucleotide and detection oligonucleotide is placed on the 8-well strip. -Immobilized via streptavidin binding. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 4 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Methylcytosine antibody [Aviva Systems Biology, 0.5 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH) was added to each well. 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Eu-N1 labeled mouse IgG antibody [manufactured by Perkin Elmer, 0.05 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Enhancement Solution manufactured by Perkin Elmer
  • solution A human blood-derived genomic DNA 0 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 50 ng
  • solution C human blood-derived genomic DNA 5 ng
  • a target DNA region is selected by a specific oligonucleotide and a detection oligonucleotide having a site to which a methylcytosine antibody can bind, forms a complex, and detects and quantifies the target region. It has been shown that the DNA region can be detected and quantified. It was also shown that genomic DNA can be detected and quantified by detecting and quantifying the target DNA region.
  • Example 2 For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following TE buffer solutions were prepared in duplicate.
  • Solution A Human blood-derived genomic DNA 500 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • B Human blood-derived genomic DNA 50 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • C Human blood-derived genomic DNA 5 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each of the prepared solutions, 10 U of restriction enzyme XspI, and 10 ⁇ buffer solution suitable for XspI (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 10 ⁇ m Dithiothreitol, 1000 mM KCl) was mixed with 5 ⁇ l, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 50 ⁇ l.
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • target DNA regions designed in the LINE1 region known as human transposon (Y, a region corresponding to nucleotide numbers 2692-2958 shown in SEQ ID NO: 2, Genbank Accession No. M80340) on human genomic DNA.
  • Y a region corresponding to nucleotide numbers 2692-2958 shown in SEQ ID NO: 2, Genbank Accession No. M80340
  • a 5′-terminal biotinylated oligonucleotide B2 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 that binds to the target DNA region Y by complementarity was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region Y by complementarity for detecting the target DNA region Y a methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 capable of binding 12 methylcytosine antibodies.
  • Oligonucleotide M2 was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • Methylcytosine antibody [Aviva Systems Biology, 0.5 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH) was added to each well. 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Eu-N1 labeled mouse IgG antibody [manufactured by Perkin Elmer, 0.05 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Enhancement Solution manufactured by Perkin Elmer
  • solution A human blood-derived genomic DNA 0 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 50 ng
  • solution C human blood-derived genomic DNA 5 ng
  • a target DNA region is selected by a specific oligonucleotide and a detection oligonucleotide having a site to which a methylcytosine antibody can bind, forms a complex, and detects and quantifies the target region. It has been shown that the DNA region can be detected and quantified. It was also shown that genomic DNA can be detected and quantified by detecting and quantifying the target DNA region.
  • Example 3 For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following TE buffer solutions were prepared in duplicate.
  • Solution A Human blood-derived genomic DNA 500 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • B Human blood-derived genomic DNA 50 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • C Human blood-derived genomic DNA 5 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each of the prepared solutions, 10 U of restriction enzyme XspI, and 10 ⁇ buffer solution suitable for XspI (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 10 ⁇ m Dithiothreitol, 1000 mM KCl) was mixed with 5 ⁇ l, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 50 ⁇ l.
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • target DNA regions X, a region corresponding to base numbers 1142-1473 shown in SEQ ID NO: 1, Genbank Accession No. M80340
  • LINE1 region known as a human transposon on human genomic DNA.
  • a 5′-terminal biotinylated oligonucleotide B3 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 that binds to the target DNA region X by complementarity was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region X by complementarity for detecting the target DNA region X a methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies.
  • Oligonucleotide M1 was synthesized and a 0.2 pmoL / 10 ⁇ L TE buffer solution was prepared.
  • the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • Methylcytosine antibody [Aviva Systems Biology, 0.5 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH) was added to each well. 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Eu-N1 labeled mouse IgG antibody [manufactured by Perkin Elmer, 0.05 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Enhancement Solution manufactured by Perkin Elmer
  • solution A human blood-derived genomic DNA 0 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 50 ng
  • solution C human blood-derived genomic DNA 5 ng
  • a target DNA region is selected by a specific oligonucleotide and a detection oligonucleotide having a site to which a methylcytosine antibody can bind, forms a complex, and detects and quantifies the target region. It has been shown that the DNA region can be detected and quantified. It was also shown that genomic DNA can be detected and quantified by detecting and quantifying the target DNA region.
  • Example 4 For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following TE buffer solutions were prepared in duplicate.
  • Solution A Human blood-derived genomic DNA 500 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • B Human blood-derived genomic DNA 50 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • C Human blood-derived genomic DNA 5 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each of the prepared solutions, 10 U of restriction enzyme XspI, and 10 ⁇ buffer solution suitable for XspI (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 10 ⁇ m Dithiothreitol, 1000 mM KCl) was mixed with 5 ⁇ l, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 50 ⁇ l.
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • target DNA regions X, a region corresponding to base numbers 1142-1473 shown in SEQ ID NO: 1, Genbank Accession No. M80340
  • LINE1 region known as a human transposon on human genomic DNA.
  • a 5′-terminal biotinylated oligonucleotide B3 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 that binds to the target DNA region X by complementarity was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region X by complementarity for detecting the target DNA region X methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies.
  • Oligonucleotide M3 was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • Methylcytosine antibody [Aviva Systems Biology, 0.5 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH) was added to each well. 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Eu-N1 labeled mouse IgG antibody [manufactured by Perkin Elmer, 0.05 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Enhancement Solution manufactured by Perkin Elmer
  • solution A human blood-derived genomic DNA 0 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 50 ng
  • solution C human blood-derived genomic DNA 5 ng
  • a target DNA region is selected by a specific oligonucleotide and a detection oligonucleotide having a site to which a methylcytosine antibody can bind, forms a complex, and detects and quantifies the target region. It has been shown that the DNA region can be detected and quantified. It was also shown that genomic DNA can be detected and quantified by detecting and quantifying the target DNA region.
  • Example 5 For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following TE buffer solutions were prepared in duplicate.
  • Solution A Human blood-derived genomic DNA 500 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • B Human blood-derived genomic DNA 50 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • C Human blood-derived genomic DNA 5 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each of the prepared solutions, 10 U of restriction enzyme XspI, and 10 ⁇ buffer solution suitable for XspI (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 10 ⁇ m Dithiothreitol, 1000 mM KCl) was mixed with 5 ⁇ l, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 50 ⁇ l.
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • target DNA regions X, a region corresponding to base numbers 1142-1473 shown in SEQ ID NO: 1, Genbank Accession No. M80340
  • LINE1 region known as a human transposon on human genomic DNA.
  • a 5′-terminal biotinylated oligonucleotide B3 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 that binds to the target DNA region X by complementarity was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region X by complementarity for detecting the target DNA region X methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region X by complementation a methylated oligonucleotide M3 consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies was synthesized.
  • a TE buffer solution having a concentration of each detection oligonucleotide of 0.2 pmoL / 10 ⁇ L was prepared.
  • the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • Methylcytosine antibody [Aviva Systems Biology, 0.5 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH) was added to each well. 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Eu-N1-labeled mouse IgG antibody [manufactured by Perkin Elmer, 0.05 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Enhancement Solution manufactured by Perkin Elmer
  • solution A human blood-derived genomic DNA 0 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 50 ng
  • solution C human blood-derived genomic DNA 5 ng
  • a target DNA region is selected by a specific oligonucleotide and a detection oligonucleotide having a site to which a methylcytosine antibody can bind, forms a complex, and detects and quantifies the target region. It has been shown that the DNA region can be detected and quantified. It was also shown that genomic DNA can be detected and quantified by detecting and quantifying the target DNA region.
  • Example 6 For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following TE buffer solutions were prepared in duplicate.
  • Solution A Human blood-derived genomic DNA 500 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • B Human blood-derived genomic DNA 50 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • C Human blood-derived genomic DNA 5 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution
  • D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each of the prepared solutions, 4 U of restriction enzyme MspI, and 10 ⁇ buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl optimal for MspI) 2 10 ⁇ m Dithiothreitol, 500 mM NaCl) was mixed with 5 ⁇ l, and sterilized ultrapure water was added thereto to adjust the volume to 50 ⁇ l.
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • target DNA regions regions corresponding to base numbers 178-262 shown in Z, SEQ ID NO: 3, Genbank Accession No. AF458110
  • a 5′-terminal biotinylated oligonucleotide B4 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 that binds to the target DNA region Z by complementarity was synthesized, and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region Z by complementarity for detecting the target DNA region Z a methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies.
  • Oligonucleotide M4 was synthesized and a 0.2 pmoL / 10 ⁇ L TE buffer solution was prepared.
  • the mixture was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • Methylcytosine antibody [Aviva Systems Biology, 0.5 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH) was added to each well. 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4
  • Eu-N1-labeled mouse IgG antibody [manufactured by Perkin Elmer, 0.05 ⁇ g / mL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and left at room temperature for 1 hour. After standing, the solution was removed by decantation, and each well was washed with a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • a washing buffer [phosphate buffer containing 0.05% Tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was washed 3 times with 200 ⁇ L.
  • Enhancement Solution manufactured by Perkin Elmer
  • solution A human blood-derived genomic DNA 0 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 50 ng
  • solution C human blood-derived genomic DNA 5 ng
  • a target DNA region is selected by a specific oligonucleotide and a detection oligonucleotide having a site to which a methylcytosine antibody can bind, forms a complex, and detects and quantifies the target region. It has been shown that the DNA region can be detected and quantified. It was also shown that genomic DNA can be detected and quantified by detecting and quantifying the target DNA region.
  • Example 7 As serum samples, TE buffer solutions of human blood-derived genomic DNA (Human Genomic DNA, # 636401, Clontech) and serum collected from rats (Wistar Hanover) were prepared in quadruplicate as follows.
  • Serum sample A Genomic DNA derived from human blood 100 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + rat serum 10 ⁇ L
  • Serum sample B Human blood-derived genomic DNA 10 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + rat serum 10 ⁇ L
  • Serum sample C Human blood-derived genomic DNA 1 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + rat serum 10 ⁇ L
  • Serum sample D Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + rat serum 10 ⁇ L (negative control solution)
  • the following treatment 1 or treatment 2 was performed in duplicate.
  • Process 1 20 ⁇ L of serum sample and buffer (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1000 mM NaCl) and 4 ⁇ L of sterilized ultrapure water to the mixture to make a liquid volume of 40 ⁇ L and mixed. Thereafter, the PCR tube was kept at 95 ° C. for 10 minutes, kept at 4 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature. After centrifugation at 9100 g for 10 minutes, the supernatant was collected.
  • buffer 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1000 mM NaCl
  • Process 2 20 ⁇ L of serum sample and buffer (330 mM Tris-Acetate (pH 7.9), 100 mM Mg (OAc) 2 , 5 mM DTT, 660 mM KOAc) and 4 ⁇ L of the mixture, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make a volume of 40 ⁇ L and mixed. Thereafter, the PCR tube was kept at 95 ° C. for 10 minutes, kept at 4 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature. After centrifugation at 9100 g for 10 minutes, the supernatant was collected.
  • buffer 330 mM Tris-Acetate (pH 7.9), 100 mM Mg (OAc) 2 , 5 mM DTT, 660 mM KOAc
  • the target DNA region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base number 178-262 shown in Z, SEQ ID NO: 3, Genbank Accession No. AF458110)
  • a 5′-terminal biotin-labeled oligonucleotide B4 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 that binds to the target DNA region Z by complementarity as a specific oligonucleotide used for obtaining (region)
  • 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • Oligonucleotide M4 was synthesized to prepare a 0.2 pmol / ⁇ L TE buffer solution.
  • ⁇ Methylated oligonucleotide> N represents methylated cytosine.
  • the mixture was kept at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • a streptavidin-coated 8-well strip (StreptaWell, # 11645692001, Roche), left at room temperature for about 30 minutes, and the target DNA region, specific oligonucleotide and detection were performed on the 8-well strip.
  • the detection complex consisting of the oligonucleotide was immobilized via a biotin-streptavidin bond.
  • a complex of a methylcytosine antibody, a methylated oligonucleotide, and a 5′-terminal biotin-labeled oligonucleotide is formed and selected, and the methylcytosine antibody in the complex is detected by its function, It was shown that human genomic DNA in serum can be detected and quantified with high sensitivity. Compared to treatment 2, human genomic DNA in serum was detected with higher sensitivity in treatment 1.
  • a serum sample a mixture of a human blood-derived genomic DNA (Human Genomic DNA, # 636401, Clontech) TE buffer solution and human serum (Individual Human Serum) purchased from Kojin Bio Co., Ltd. is used in quadruplicate as follows. Prepared.
  • Serum sample A Human blood-derived genomic DNA 10 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + human serum 40 ⁇ L
  • Serum sample B Human blood-derived genomic DNA 1 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + human serum 40 ⁇ L
  • Serum sample C Human blood-derived genomic DNA 0 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution + human serum 40 ⁇ L (negative control solution)
  • the following treatment 1 or treatment 2 was performed in duplicate.
  • Serum sample 50 ⁇ L and buffer 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1000 mM NaCl) and 20 ⁇ L, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make a volume of 100 ⁇ L and mixed. Thereafter, the mixture was kept at 95 ° C. for 10 minutes, kept at 4 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature. After centrifugation at 9100 g for 10 minutes, the supernatant was collected.
  • buffer 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1000 mM NaCl
  • Process 2 Serum sample 50 ⁇ L and buffer (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1000 mM NaCl) and 10 ⁇ L of the mixture, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make a volume of 100 ⁇ L and mixed. Thereafter, the mixture was kept at 95 ° C. for 10 minutes, kept at 4 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature. After centrifugation at 9100 g for 10 minutes, the supernatant was collected.
  • buffer 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1000 mM NaCl
  • the target DNA region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base number 178-262 shown in Z, SEQ ID NO: 3, Genbank Accession No. AF458110)
  • a 5′-terminal biotin-labeled oligonucleotide B4 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 that binds to the target DNA region Z by complementarity as a specific oligonucleotide used for obtaining (region)
  • 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • a detection oligonucleotide that binds to the target DNA region Z by complementarity for detecting the target DNA region Z a methyl consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 capable of binding to 12 methylcytosine antibodies.
  • Oligonucleotide M4 was synthesized and a 0.2 pmol / 10 ⁇ L TE buffer solution was prepared.
  • ⁇ Methylated oligonucleotide> N represents methylated cytosine.
  • the mixture was kept at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • a streptavidin-coated 8-well strip (StreptaWell, # 11645692001, Roche), left at room temperature for about 30 minutes, and the target DNA region, specific oligonucleotide and detection were performed on the 8-well strip.
  • the detection complex consisting of the oligonucleotide was immobilized via a biotin-streptavidin bond.
  • solution C human blood-derived genomic DNA 0 ng: control solution
  • solution A human blood-derived genomic DNA 10 ng
  • solution B human blood-derived genomic DNA 1 ng
  • the fluorescence intensity increased in a concentration-dependent manner.
  • a complex of a methylcytosine antibody, a methylated oligonucleotide, and a 5′-terminal biotin-labeled oligonucleotide is formed and selected, and the methylcytosine antibody in the complex is detected by its function, It was shown that human genomic DNA in serum can be detected and quantified with high sensitivity. Compared to treatment 2, human genomic DNA in serum was detected with higher sensitivity in treatment 1.
  • Example 9 As a serum sample, the following human serum was used. Human serum purchased from Kojin Bio (Individual Human Serum) Lot No. : N51438 (Healthy person) N51439 (Healthy person) N51441 (Healthy person) Human serum purchased from ProMedDx (Individual Human Serum) Lot No.
  • 11171268 (Healthy person, 56 years old, male) 11171292 (Healthy person, 62 years old, male) 111712297 (Healthy person, 67 years old, male) 1117314 (Healthy person, 75 years old, male) 11171327 (Healthy person, 70 years old, male) 11202510 (Healthy person, 67 years old, female) 11202522 (Healthy person, 64 years old, female) 11202527 (Healthy person, 52 years old, female) 11220215 (Healthy person, 75 years old, female) 11220218 (Healthy person, 78 years old, female) 10958886 (healthy person, 56 years old, male) 10958979 (healthy person, 39 years old, male) 10958980 (healthy person, 45 years old, male) 10960268 (Healthy person, 37 years old, male) 10960272 (Healthy person, 50 years old, male) 10960276 (healthy person, 30 years old, male) 10960285 (Healthy person, 39
  • a 5′-terminal biotin-labeled oligonucleotide B4 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 that binds to the target DNA region Z by complementarity as a specific oligonucleotide used for obtaining (region)), and 0.2 pmoL / 10 ⁇ L of TE buffer solution was prepared.
  • Oligonucleotide M4 was synthesized and a 0.2 pmol / 10 ⁇ L TE buffer solution was prepared.
  • ⁇ Methylated oligonucleotide> N represents methylated cytosine.
  • the mixture was kept at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • a streptavidin-coated 8-well strip (StreptaWell, # 11645692001, Roche), left at room temperature for about 30 minutes, and the target DNA region, specific oligonucleotide and detection were performed on the 8-well strip.
  • the detection complex consisting of the oligonucleotide was immobilized via a biotin-streptavidin bond.
  • An MspI-treated human genomic DNA solution was prepared as follows as a standard sample for concentration measurement.
  • a 5 ng / ⁇ L TE buffer solution of human blood-derived genomic DNA (Human Genomic DNA, # 636401, Clontech) was prepared.
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • the obtained reaction solution was diluted with TE buffer to give 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1
  • a 1, 10 ng / 5 ⁇ L solution was prepared.
  • the target DNA region designed in the Alu region known as human transposon (Z, region corresponding to base number 178-262 shown in SEQ ID NO: 3, Genbank Accession No. AF458110) is amplified and quantified by real-time PCR.
  • a forward primer (F) and a reverse primer (R) were designed for this purpose.
  • PCR reaction solution 5 ⁇ L of the above-prepared MspI-treated human genomic DNA solution prepared as a template or a standard sample for concentration measurement prepared above and a primer consisting of the base sequences represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 1.5 ⁇ L each, SYBR (registered trademark) Green I (Lonza) 0.1 ⁇ min, 2.5 ⁇ L each 2 mM dNTP, 10 ⁇ PCR buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM) MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 0.125 ⁇ L of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, 5 U / ⁇ L, ABI) are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 25 ⁇ L.
  • SYBR registered trademark
  • Green I Likanza
  • the present invention can provide a method for easily quantifying or detecting DNA having a target DNA region.

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Abstract

本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。

Description

ＤＮＡを定量又は検出する方法
　本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。
　検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法としては、例えば、検体に含まれる生物由来ゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲと記すこともある。）によってＤＮＡを増幅させて検出する方法や、生物由来検体中のＤＮＡが有する目的のＤＮＡ領域に蛍光標識したオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて検出する方法等が知られている（例えば、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ．Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．，２００７；３３（４）：６３５−６４１、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．，１９９１；１８（４）：２５９−２６２参照）。
　本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを簡便に定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
　検体中に含まれる、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する第一工程、
（２）第一工程で調製された検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、
該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、
該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、
該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成させる第二工程、及び
（３）第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
［発明２］
　検出オリゴヌクレオチドが、メチル化部位を複数含む、複数のオリゴヌクレオチドからなる複合検出オリゴヌクレオチドである発明１に記載の方法。
［発明３］
　検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、検出オリゴヌクレオチドのメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体の識別機能である発明１又は２に記載の方法。
［発明４］
　ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列又はその一部からなる発明１~３のいずれか一に記載の方法。
［発明５］
　ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列又はその一部からなるＤＮＡである発明１~３のいずれか一に記載の方法。
［発明６］
　ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＬＩＮＥ又はＡｌｕ配列に分類される塩基配列からなるＤＮＡである発明１~３のいずれか一に記載の方法。
［発明７］
　ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列が以下に示されるいずれかの塩基配列からなる発明４に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
［発明８］
　検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する発明１~７のいずれか一に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
［発明９］
　特定オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する発明１~７のいずれか一に記載の方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
［発明１０］
　検出オリゴヌクレオチドがメチル化シトシンを含むメチル化オリゴヌクレオチドである発明１~９のいずれか一に記載の方法。
［発明１１］
　検出オリゴヌクレオチドの識別機能がメチルシトシンの検出、メチル化ＤＮＡ抗体による検出、又はメチルシトシン抗体による検出である発明１~１０のいずれか一に記載の方法。
［発明１２］
　検体が、下記のいずれかの検体である発明１~１１のいずれか一に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｄ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、または
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
［発明１３］
　目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ生物由来検体が、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである発明１~１２のいずれか一に記載の方法。
（ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ
（ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
（ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ
（ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ、または
（ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ
［発明１４］
　第一工程において検体であるＤＮＡを調製するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以上１０００ｍＭ以下である発明１~１３のいずれか一項に記載の方法。
［発明１５］
　第一工程において検体であるＤＮＡを調製するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以上２００ｍＭ以下である発明１~１３のいずれか一項に記載の方法。
［発明１６］
　癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１~１５のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
［発明１７］
　検体が、哺乳動物由来の血清である発明１６に記載の方法。
［発明１８］
　目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明１６~１７のいずれか一項に記載の方法。
　図１は、実施例１において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
　図２は、実施例２において、目的とするＤＮＡ領域Ｙを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を用いてゲノムＤＮＡ濃度が０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
　図３は、実施例３において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を用いてゲノムＤＮＡ濃度が０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
　図４は、実施例４において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
　図５は、実施例５において、目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ１及びメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を用いてゲノムＤＮＡ濃度が０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
　図６は、実施例６において、目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液について蛍光を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いてゲノムＤＮＡ濃度が０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）について蛍光を測定した値を示している。
　図７は、実施例７において、目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＡについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＢについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＣについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＤ（ネガティブコントロール液）について処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
　図８は、実施例７において、目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＡについて処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＢについて処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＣについて処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。Ｄはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＤ（ネガティブコントロール液）について処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
　図９は、実施例８において、目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＡについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＢについて処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＣ（ネガティブコントロール液）について処理１を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
　図１０は、実施例８において、目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、溶液Ａはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＡについて処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｂはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＢについて処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。溶液Ｃはメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を用いて血清サンプルＣ（ネガティブコントロール液）について処理２を含む操作を施したサンプルの蛍光強度を測定した値を示している。
　図１１は、実施例９において、ヒト血清中に含まれる目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、メチルシトシン抗体とメチル化オリゴヌクレオチドＭ４および５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いて検出した結果と、リアルタイムＰＣＲにより定量した結果を比較した図である。検出結果を縦軸に、リアルタイムＰＣＲによる定量結果を横軸にとり、プロットした。またグラフ中の直線は回帰直線（太線）および標準誤差範囲（細線）を示している。
　図１２は、実施例９において、ヒト血清中に含まれる目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出する実験を実施した結果を示した図である。図中、５９歳以下のヒト血清サンプルについて、メチルシトシン抗体とメチル化オリゴヌクレオチドＭ４および５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を用いてＤＮＡを検出した結果を、がん患者と健常者に分けてプロットしたものであり、それぞれについて平均値および標準偏差を示している。
　本発明方法は、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する第一工程、（２）第一工程で調製した検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する第二工程、及び、（３）第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第三工程、を有する検体中に含まれるゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法である。
　本発明方法における「検体」としては、例えば食品、河川、土壌、一般市販製品の表面付着物等をあげることができ、このような検体には、真菌、細菌、ウイルス等の混入微生物や核酸が含まれ得る。
　食品においては食中毒菌の有無の検査と原因菌の特定が重要であり、通常は微生物表面の抗原を利用した免疫法が使用される。しかし、免疫法は、抗原を作るために多大の労力を必要とし、更に病原菌の特定が必要となる。即ち、微生物検査における免疫法は、微生物種の特異性を利用しているため、一回の検査で複数菌種をまとめて、その有無を検査することが難しいだけでなく、免疫法を確立できない微生物に対しては、ＰＣＲ法等を用いる等、検査には多大の労力が必要となる。本発明方法は、まず、免疫法による検査が難しい場合でも、遺伝子から検査方法を確立でき、次に、複数の微生物を同時に検出することが可能な検査方法を提供できる。即ち、本発明方法は、非生物由来検体中に存在する真菌類、微生物類、ウイルス等の検査に利用できる。また、本発明方法を用いることにより、例えば食品中の混入微生物やウイルスを検出することが可能となり、感染症の検査や食品汚染検査等で利用が期待できる。
　検体としては、（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ、（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、（ｄ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、等も挙げられる。尚、前記組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味であり、前記体液としては血漿、血清、リンパ液等が挙げられ、前記体分泌物としては尿や乳汁等を挙げることができる。
　検体中に含まれるＤＮＡとしては、前記生体試料や前記混入微生物から抽出して得られたゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片、若しくはＲＮＡ等を挙げることができる。また、哺乳動物由来の検体がヒトの血液、体液又は体分泌物等である場合には、ヒトの定期健康診断における臨床検査等で採取したものを利用することができる。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
　ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いればよい。また、ＲＮＡからＤＮＡを得るためには、市販のｃＤＮＡ作製キット等の逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成するようなキットを用いればよい。また、本発明方法においては、検体としては、人工的に合成されたＤＮＡであってもよい。
　本発明方法における「哺乳動物」とは、動物界　脊索動物門　脊椎動物亜門　哺乳綱（Ｍａｍｍａｌｉａ）に分類される動物であり、具体的には、ヒト、サル、マーモセット、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
　本発明における「体液」とは、個体を構成する細胞間に存在する液体であって、血漿と間質液を挙げることができ、多くの場合、個体の恒常性の維持機能を果たす。より具体的には、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）、脳脊髄液、等を挙げることができる。
　本発明における「体分泌液」とは、外分泌腺からの分泌液である。具体的には、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液、汗、涙、鼻水、***、膣液、羊水、乳汁、等が挙げられる。
　本発明における「細胞溶解液」とは、例えば、細胞培養用の１０ｃｍプレート等で培養した細胞、即ち細胞株や初代培養細胞、血球細胞等を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液である。細胞膜を破壊する方法としては、超音波による方法、界面活性剤を用いる方法、アルカリ溶液をを用いる方法等が挙げられる。尚、細胞を溶解するためには、様々なキット等を利用してもよい。
　例えば具体的には、１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで細胞を培養した後、培養液を捨てて、０．６ｍＬのＲＩＰＡバッファー（１ｘ　ＴＢＳ，１％　ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｓｈｏｌａｔｅ，０．１％　ＳＤＳ，０．００４％　ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ）を１０ｃｍプレートに加える。４℃で１５分間プレートをゆっくり揺り動かしてから、１０ｃｍプレート上の接着細胞を、スクレーパー等を用いて剥がし、プレート上の溶解液をマイクロチューブに移す。溶解液の１／１０容量の１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＭＳＦを添加してから、氷上で３０−６０分間放置する。４℃で１０分間、１０，０００ｘｇで遠心し、上清を細胞溶解液として取得する。
　本発明における「組織溶解液」とは、哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壊することにより取得する細胞内液を含む溶解液である。
　より具体的には、動物から取得した組織の重量を測定した後、カミソリ等を用いて組織を小片に裁断する。凍結組織をスライスする場合は、更に小さい小片にする必要がある。裁断後、氷冷ＲＩＰＡバッファー（プロテアーゼインヒビター、フォスファターゼインヒビター等を添加してもよく、例えば、ＲＩＰＡバッファーの１／１０容量の１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＭＳＦを添加してもよい）を組織１ｇあたり３ｍＬの比率で添加し、４℃でホモジナイズする。ホモジナイズには、ソニケーターや加圧型細胞破砕装置を用いる。ホモジナイズの作業では、溶液を常に４℃に維持し、発熱を抑えるようにする。ホモジナイズ液を、マイクロチューブに移して、４℃で１０分間、１０，０００ｘｇで遠心し、上清を組織溶解液として取得する。
　本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）とは、検体中に含まれるＤＮＡのうち、本発明方法により検出又は定量したい（目的とする）ＤＮＡ領域である。検体がＤＮＡである場合の目的とするＤＮＡ領域とは、ＤＮＡの塩基配列上の所定の塩基配列であり、検体がＲＮＡである場合には、ＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡ上の塩基配列であって、ＲＮＡ上の検出又は定量対象となる所定の塩基配列の相補的塩基配列である。
　第一工程は、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する工程である。
　本発明方法における「被検オリゴヌクレオチド」とは、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を含むオリゴヌクレオチドである。
　「ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域」としては、ゲノム中に複数見られる塩基配列（以下、反復配列と記すこともある。）であればなんでも良く、疾患の指標となる塩基配列であれば更によい。例えば、癌においては、血液中のゲノムＤＮＡ由来の遊離ＤＮＡが増加することが知られており、この場合、被検オリゴヌクレオチドとは血液中の遊離ＤＮＡ中の反復配列やその部分配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これら反復配列やその部分配列を有するオリゴヌクレオチドの定量された値は、癌の進行程度を表す指標とすることができる。尚、後述するが反復配列としては、単純反復配列（縦列反復配列又はタンデムリピートと呼ばれる）、散在反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子等でもよい。
　目的とするＤＮＡ領域の塩基配列を含むゲノムＤＮＡを取得するには、例えば、検体が哺乳動物由来の場合は、市販のＤＮＡ抽出用キット（Ｇｅｎｆｉｎｄ　ｖ２　Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）、ＦａｓｔＰｕｒｅ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製））等を用いればよい。
　また、検体が真菌等の微生物である場合、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法等を用いればよく、検体が大腸菌のような原核生物である場合、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載されているような一般的な微生物ゲノム調製法等を用いればよい。
　また、検体が食品である場合、食品から微生物等を分離してからＤＮＡを取得してもよく、食品に含まれる微生物以外の例えばウイルス等のゲノムＤＮＡと微生物由来のゲノムＤＮＡを同時に取得してもよい。
　また、検体が哺乳動物由来の組織であり、目的とするＤＮＡ領域がウイルス由来のＤＮＡである場合は、組織中から市販のＲＮＡ抽出用キット（ＩＳＯＧＥＮ（３１１−０２５０１）ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製）、或いは、ＦａｓｔＲＮＡ　Ｐｒｏ　Ｇｒｅｅｎ　Ｋｉｔ（フナコシ社製）、ＦａｓｔＲＮＡ　Ｐｒｏ　Ｂｌｕｅ　Ｋｉｔ（フナコシ社製）、ＦａｓｔＲＮＡ　Ｐｒｏ　Ｒｅｄ　Ｋｉｔ（フナコシ社製）等を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によってＤＮＡを取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の検体である場合、ウイルス粒子を抽出してからウイルスのＤＮＡを抽出してもよく、或いはウイルス粒子を抽出してから市販のキット（ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ　ＲＮＡ　ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ　ＳＩＩ、富士フィルム社製）等を用いてウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得してもよい。ウイルスが感染した組織からＲＮＡを抽出し逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得してもよいし、ウイルスが感染した組織からＤＮＡを取得して、ウイルス由来のＤＮＡを取得してもよい。尚、ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを取得する場合には、市販のキット（トランスクリプターハイフィデリティｃＤＮＡ合成キット、ロシュディアグノスティク社製）等を用いてもよい。
　また、検体が哺乳類由来の組織や細胞株等からのＲＮＡを鋳型として調製されたＤＮＡである場合、組織や細胞株等から市販のＲＮＡ抽出用キットで抽出したＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりＤＮＡを取得してもよい。
　本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」は、該ＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域内の塩基配列に認識切断部位を有さない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡであってもよく、また予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。他に、第一工程で取得されるＤＮＡとしては、血液中の遊離ＤＮＡ、微生物ゲノム由来のＤＮＡ、検体中のＲＮＡから逆転写酵素によって合成されたＤＮＡ等であってもよい。
　「目的とするＤＮＡ領域」として、ＲＮＡから逆転写酵素により合成されたＤＮＡ領域を用いる場合、「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」としては、リボソーマルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、及び、マイクロＲＮＡ等から合成されたＤＮＡ等が挙げられる。ＲＮＡとしては宿主のゲノムからＲＮＡポリメラーゼから転写されたものだけでなく、ＲＮＡをゲノムとするウイルスゲノム等も含むものであり、ＲＮＡであれば何でもよい。
　本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌、真菌、ウイルス、病原性原虫等の微生物等由来のＤＮＡや、これら微生物等由来のＲＮＡから逆転写酵素により取得したＤＮＡを挙げることができる。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　Ｂ３１、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　Ｊ９９、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｒｄ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒｖ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｕ　ｃｅｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｕｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ｈｕｍａｎ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　５、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ、Ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのゲノムＤＮＡ又はＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡは、検体中の感染症原因菌や食品中の食中毒原因菌等の検出に利用できる。
　検出対象の塩基配列としては、ゲノム中に複数見出される塩基配列であるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ）領域等が挙げられる。
　本発明方法を用いた微生物の同定・検出は、感染症診断、食中毒菌の同定、土壌や河川や湖沼の底質等に存在する微生物の種類と数の同定（環境中の微生物調査等）や、有用な化合物を生産する微生物や食品醗酵等に利用できる微生物等の産業上有用な微生物の同定や、汚水処理、食品醗酵等の微生物を工業的に利用している状態での菌層（微生物層）の確認等に利用可能である。
　本発明方法における「反復配列」とは、ゲノム中に同じ所定の配列が複数個見られる塩基配列を意味している。このような反復配列としては、単純反復配列（縦列反復配列又はタンデムリピートと呼ばれる）や散在反復配列等が知られている。
　単純反復配列は、同じ配列が同じ向きに隣り合って存在することを特徴とし、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト、セントロメア、テロメア、動原体、リボソーム集団遺伝子のような一連の塩基配列等が知られている。
　散在反復配列は、隣り合わず散在することを特徴とし、レトロトランスポゾンに由来するＤＮＡと考えられている。散在反復配列は、塩基配列の長さにより、ＳＩＮＥ（Ｓｈｏｒｔ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Ｌｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ：長鎖散在反復配列）に分類され、ヒトの塩基配列としては、各々、Ａｌｕ配列やＬＩＮＥ−１配列が代表的な反復配列として知られている。また、ＲＮＡやタンパク質から逆転移した不活性なプロセッシング済みの偽遺伝子、遺伝子重複により増幅した遺伝子配列も知られている。
　重複遺伝子とは、一つのゲノム上に複数の高い相同性を有する遺伝子が存在する場合を指し、多くの場合は、一遺伝子の近傍にタンデムに並んで存在する塩基配列である。尚、偽遺伝子にも重複遺伝子に含まれるものが知られている。
　ゲノム中に複数個見られる塩基配列としては、まず、比較的短い塩基配列からなる繰り返しが挙げられる。具体的には、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（ＧＡ）ｎ、（ＣＡ）ｎ、（ＴＡＡ）ｎ、（ＧＧＡ）ｎ、（ＣＡＧＣ）ｎ、（ＣＡＴＡ）ｎ、（ＧＡＡＡ）ｎ、（ＴＡＴＧ）ｎ、（ＴＴＴＧ）ｎ、（ＴＴＴＡ）ｎ、（ＴＴＴＣ）ｎ、（ＴＡＡＡ）ｎ、（ＴＴＣＡ）ｎ、（ＴＡＴＡＡ）ｎ、（ＴＣＴＣＣ）ｎ、（ＴＴＴＣＣ）ｎ、（ＴＴＴＡＡ）ｎ、（ＴＴＴＴＣ）ｎ、（ＴＴＴＴＡ）ｎ、（ＴＴＴＴＧ）ｎ、（ＣＡＡＡＡ）ｎ、（ＣＡＣＣＣ）ｎ、（ＴＡＴＡＴＧ）ｎ、（ＣＡＴＡＴＡ）ｎ、（ＴＣＴＣＴＧ）ｎ、（ＡＧＧＧＧＧ）ｎ、（ＣＣＣＣＣＡ）ｎ、（ＴＧＧＧＧＧ）ｎ（ｎは繰返し数を意味する）等の配列が挙げられる。次に、転写因子に由来する配列が挙げられる。具体的には、ｈＡＴグループとして、ＭＥＲ１−Ｃｈａｒｌｉｅ、Ｚａｐｈｏｄが知られており、Ｔｃ−１グループとして、ＭＥＲ２−Ｔｉｇｇｅｒ、Ｔｃ−１、Ｍａｒｉｎｅｒが知られている。その他、Ｔｉｇｇｅｒ１、Ｔｉｇｇｅｒ２ａ、Ｔｉｇｇｅｒ５、Ｃｈａｒｌｉｅ４ａ、Ｃｈａｒｌｉｅ７等が知られている。これらの「比較的短い塩基配列」、「転写因子に由来する配列」は、後述の特定接着配列及び検出用接着配列が設定可能であれば、本発明方法にも利用可能である。また、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト等は、単純反復配列に分類される反復配列であり、後述の特定接着配列及び検出用接着配列が設定可能であれば、本発明方法にも利用可能である。また、遺伝子中に多コピー存在する配列として、セントロメアに存在する配列としてＡＬＲ６が、またｓｎＲＮＡとしてＵ２やＵ６が、ｔＲＮＡやｒＲＮＡのように生物的な機能を有する塩基配列の中にもゲノム中に多コピー存在する塩基配列があることが知られている。このような遺伝子としては、遺伝子重複によりゲノム中に複数コピー存在する遺伝子である重複遺伝子を挙げることができる。
　重複遺伝子とは、遺伝子重複によりゲノム中の特定の遺伝子や遺伝子断片が倍加することにより生じた遺伝子又はその遺伝子断片を意味する。遺伝子重複とは、遺伝子を含むＤＮＡのある領域が重複する現象のことである。遺伝子重複が起こる原因としては、遺伝的組換えの異常、レトロトランスポゾンの転移、染色体全体の重複等がある。例えば、１つの遺伝子がコピーされてゲノムＤＮＡに挿入される際に、異なる染色***置へ挿入される場合と元の遺伝子の近傍に挿入される場合がある。元の遺伝子の近傍への挿入により、コピーされた遺伝子が並んでいる場所をタンデムリピートと呼び、遺伝子重複によって作り出された遺伝子のグループを遺伝子族（遺伝子ファミリー）と呼ぶ。
　偽遺伝子とは、ＤＮＡの配列のうち、遺伝子産物（特にタンパク質）をコードしていたことを想像させるような特徴のある塩基配列を有しているが、現在は機能を失っている遺伝子をいう。元の機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと考えられている。例えば、突然変異によりストップコドンが生じてタンパク質のペプチド鎖が短くなってしまいタンパク質として機能を果たせなくなる場合や、一塩基置換等の突然変異により正常な転写に必要な調節配列が機能を失う場合等がある。偽遺伝子は元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、単独で偽遺伝子になるものもある。偽遺伝子は、遺伝子配列の特徴により３タイプに分類できる。ｍＲＮＡからレトロトランスポゾンの逆転写酵素によって作られたＤＮＡがゲノムに挿入される場合（プロセス型偽遺伝子）、ゲノム内で元の遺伝子配列が重複し、そのコピーのうち一部が突然変異等により機能を喪失して偽遺伝子になる場合（重複偽遺伝子又は非プロセス型偽遺伝子）、及びゲノム内の遺伝子が（重複遺伝子がなく単独の遺伝子のまま）機能を失うことにより偽遺伝子になる場合がある。
　現在、偽遺伝子として知られる遺伝子の中には、転写されている例や、遺伝子機能を有する例（偽遺伝子と呼ぶべきかどうかは定まっていない）も知られるようになっていることから、本発明方法における、「偽遺伝子」とは、遺伝子機能の有無、或いは転写されるか否かではなく、前記の「プロセス型偽遺伝子」と「重複偽遺伝子（非プロセス型偽遺伝子）」を意味する。
　本発明方法における「反復配列」である「ゲノム中に複数個見られる塩基配列」としては、レトロウイルスや、末端にＬＴＲ（Ｌｏｍｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）を有するレトロトランスポゾン、ＭａＬＲｓ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ＬＴＲ−Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ）のような、ウイルス由来と考えられる内在配列や、レトロウイルス由来のＬＴＲ等を挙げることができる。
　例えば、レトロウイルス由来のＬＴＲとしては、具体的には、ＬＴＲ１、ＬＴＲ１Ｂ、ＬＴＲ５、ＬＴＲ７、ＬＴＲ８、ＬＴＲ１６Ａ１、ＬＴＲ１６Ａ１、ＬＴＲ１６Ｃ、ＬＴＲ２６、ＬＴＲ２６Ｅ、ＭＥＲ４８、ＭＬＴ２ＣＢ等のサブファミリーが知られている。また、レトロトランスポゾン由来のＬＴＲは、ＥＲＶ、ＥＲＶＫ、ＥＲＶＬの各クラスに分類され、具体的には、ＬＴＲ８Ａ、ＬＴＲ２８、ＭＥＲ２１Ｂ、ＭＥＲ８３、ＭＥＲ３１Ｂ、ＭＥＲ４９、ＭＥＲ６６Ｂ、ＨＥＲＶＨ、ＥＲＶＬ、ＬＴＲ１６Ａ１、ＬＴＲ３３Ａ、ＬＴＲ５０、ＬＴＲ５２、ＭＬＴ２Ａ１、ＭＬＴ２Ｅ、ＭＥＲ１１Ｃ、ＭＥＲ１１Ｃ等のサブファミリーを挙げることができる。更に、ＭａＬＲｓは、典型的なレトロトランスポゾンと同様にその配列の両端にＬＴＲを含むが、ＬＴＲにはさまれた内部配列がレトロウイルス由来ではない配列のＤＮＡ因子を指す。例えば、ＭＬＴ１Ａ１、ＭＬＴ１Ａ２、ＭＬＴ１Ｂ、ＭＬＴ１Ｃ、ＭＬＴ１Ｄ、ＭＬＴ１Ｆ、ＭＬＴ１Ｇ、ＭＬＴ１Ｈ、ＭＬＴ１Ｊ、ＭＬＴ１Ｋ、ＭＬＴ１Ｉ、ＭＬＴ２ＣＢ、ＭＳＴＡ、ＭＳＴＡ−ｉｎｔ、ＭＳＴＢ、ＴＨＥ１Ａ、ＴＨＥ１Ｂ、ＴＨＥ１Ｂ−ｉｎｔｅｒｎａｌ、ＴＨＥ１等のサブファミリーを挙げることができる。
　「散在反復配列」は、隣り合わず散在することを特徴としており、レトロトランスポゾンに由来すると考えられている。また、散在反復配列は、その長さにより、ＳＩＮＥ（Ｓｈｏｒｔ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Ｌｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ：長鎖散在反復配列）に分類されてる。ＳＩＮＥのうち、大部分はＡｌｕファミリーに属する配列である。特徴としては、７ＳＬ　ＲＮＡの３’側の配列或いは５’側の配列を有し、尚且つＬｅｆｔ−ｍｏｎｏｍｅｒとＲｉｇｈｔ−ｍｏｎｏｍｅｒと呼ばれる領域にはさまれたＡＴ−Ｒｉｃｈ領域を有している。Ａｌｕファミリーのサブファミリーとしては、Ａｌｕ、ＡｌｕＪｂ、ＡｌｕＪｏ、ＡｌｕＳｃ、ＡｌｕＳｇ、ＡｌｕＳｐ、ＡｌｕＳｑ、ＡｌｕＳｘ、ＡｌｕＹを、更には、ＦＡＭ（Ｆｏｓｓｉｌ　Ａｌｕ　Ｍｏｎｏｍｅｒ）と、ＦＡＭの配列を有するＦＬＡＭ（Ｆｒｅｅ　Ｌｅｆｔ　Ａｌｕ　Ｍｏｎｏｍｅｒ）とＦＲＡＭ（Ｆｒｅｅ　Ｒｉｇｈｔ　Ａｌｕ　Ｍｏｎｏｍｅｒ）を挙げることができる。Ａｌｕファミリー以外のＳＩＮＥとしては、ＭＩＲ、及びＴｈｅｒ／ＭＩＲ３が知られており、夫々、サブファミリーとして、ＭＩＲ、ＭＩＲ３が知られている。その他、他の生物種のＡｌｕファミリーのサブファミリーとしては、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、ＰＢ１、ＰＢ１Ｄ等が知られている。ＬＩＮＥとしては、ＬＩＮＥ１からＬｉｎｅ２３のサブファミリーが報告されているが、ＬＩＮＥ−１、ＬＩＮＥ２、ＬＩＮＥ３が広くゲノム中に存在することが知られている。尚、ＬＩＮＥ−１については、例えば、Ｌ１Ｍ１、Ｌ１Ｍ２、Ｌ１Ｍ３、Ｌ１Ｍ３ｄ、Ｌ１Ｍ４、Ｌ１Ｍ４ｃ、Ｌ１ＭＡ２、Ｌ１ＭＡ７、Ｌ１ＭＡ８、Ｌ１ＭＡ９、Ｌ１ＭＢ１、Ｌ１ＭＢ１、Ｌ１ＭＢ３、Ｌ１ＭＢ４、Ｌ１ＭＢ５、Ｌ１ＭＢ６、Ｌ１ＭＢ７、Ｌ１ＭＣａ、Ｌ１ＭＣｂ、Ｌ１ＭＣ２、Ｌ１ＭＣ３、Ｌ１ＭＣ４、Ｌ１ＭＣ４ａ、Ｌ１ＭＣ５、Ｌ１ＭＤａ、Ｌ１ＭＥ、Ｌ１ＭＥｃ、Ｌ１ＭＥｄ、Ｌ１ＭＥｇ、Ｌ１ＭＥ１、Ｌ１ＭＥ２、Ｌ１ＭＥ３、Ｌ１ＭＥ３Ａ、Ｌ１ＭＥ３Ｂ、Ｌ１ＭＥ４ａ、Ｌ１ＰＢ３、Ｌ１Ｐ４、Ｌ１ＰＡ２、Ｌ１ＰＡ３、Ｌ１ＰＡ４、Ｌ１ＰＡ５、Ｌ１ＰＡ６、Ｌ１ＰＡ７、Ｌ１ＰＡ１０、Ｌ１ＰＡ１２、Ｌ１ＰＡ１３、Ｌ１ＰＡ１４、Ｌ１ＰＡ１６、Ｌ１ＰＢ１、Ｌ１ＰＢ３、Ｌ１ＰＢ４、Ｌ１ＰＲＥＣ２、ＨＡＬ１のサブファミリーが知られており、ＬＩＮＥ−２としては、Ｌ２、Ｌ２ｃのサブファミリーが知られている。尚例えば、Ａｌｕファミリー又はＡｌｕのサブファミリーに共通の配列、ＬＩＮＥ−１ファミリー或いはＬＩＮＥ−１のサブファミリーに共通の配列に対して、後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定できれば、一ゲノム中に複数の検出対象を設定することができるため、ゲノムの検出をより高感度にすることができる。
　目的とするＤＮＡ領域としては、具体的に例えばＬＩＮＥ−１の部分配列（配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列）やＡｌｕの部分配列（配列番号３に示す塩基配列）又はそれらの相同性を示す塩基配列等を挙げることができる。
　尚、例えばある領域中の反復配列を調べたい場合、ＰｕｂＭｅｄ等の一般的な配列検索のデータベースで検索することは難しく、通常は、Ｒｅｐｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｇｉｒｉｎｓｔ．ｏｒｇ／ｒｅｐｂａｓｅ／）、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ／）等のデータベースを用いればよい。これらの反復配列を測定することは、例えば、血液中の遊離ＤＮＡ量のサロゲートマーカーとして扱うことが可能であり、また例えば、生物種特異的な反復配列に注目する場合は、生物種の特定等に利用することができる。
　ゲノム中の反復配列としては、具体的に以下に示される塩基配列からなるものを挙げることができる。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号９で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
　第二工程は、第一工程で調製した検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する工程である。
　第二工程における「検出オリゴヌクレオチド」とは、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得るものであり、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基が、該検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量するための識別機能を有し、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ（被検オリゴヌクレオチド）と相補性によって結合するための塩基配列である検出用接着配列と、該検出用接着配列に連結した検出配列とを有しているオリゴヌクレオチドである。また、「検出オリゴヌクレオチド」は、後述するヒトゲノム中の反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなってもよい。尚、本発明方法の第二工程における「検出オリゴヌクレオチド」は、後述する複合検出オリゴヌクレオチドの形態をとってもよい。また、検出オリゴヌクレオチドはメチル化ＤＮＡを複数含むオリゴヌクレオチドであってもよく、メチル化シトシンを含むメチル化オリゴヌクレオチドであってもよい。
　検出オリゴヌクレオチドにおける「検出用接着配列」とは、目的とするＤＮＡ領域を有する塩基配列に相補的な塩基配列の一部分からなるオリゴヌクレオチドであって、検出用接着配列が対合し得る目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡの塩基配列部分と７５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する配列である。また、検出用接着配列は、被検オリゴヌクレオチドにおける目的とするＤＮＡ領域又は目的とするＤＮＡ領域の近傍に結合する塩基配列を有し、第二工程で後述する検出複合体を形成できるように設定されていればよい。
　尚、検出用接着配列は、検出オリゴヌクレオチド、被検オリゴヌクレオチド、後述する特定オリゴヌクレオチド及び支持体が結合してなる検出複合体を形成できればどのような塩基配列であっても良く、特に後述する特定オリゴヌクレオチドと被検オリゴヌクレオチドとの結合を阻害しないものが好ましい。また、検出用接着配列は同一反復配列中（目的とするＤＮＡ領域中）に一つ設計されていてもよく、二つ以上設計されていてもよい。二つ以上設計する場合、複数の検出用接着配列と後述する特定接着配列は、互いに目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡとの結合を阻害しないものが好ましい。検出用接着配列の塩基配列の長さは、５ｂｐ~５０ｂｐ、望ましくは１０ｂｐ~３０ｂｐである。
　「検出配列」とは、前記検出用接着配列に結合させて使用でき、識別機能を有する塩基配列であればよい。即ち、検出或いは定量するために特有の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、或いは識別機能を有する分子そのもの、或いは識別機能を有する分子が結合したオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、ＦＩＴＣ、放射性標識、ＦＩＴＣ又は放射性同位体で標識されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
　また、例えば、検出配列はメチル化されたＤＮＡであってもよい。具体的には、メチル化オリゴヌクレオチドが５−メチルシトシンである場合には、識別機能を有するメチルシトシン抗体を結合させることで、検出配列を検出・定量することができる。また、検出配列は、メチル化オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る塩基配列であってもよい。
　「識別機能を結合しうる分子」とは、識別機能を検出オリゴヌクレオチドに付与させるために、当該オリゴヌクレオチドに結合させる、オリゴヌクレオチド以外の分子である。例えば、識別機能が、後述のＦＩＴＣ抗体に標識されたｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）である場合、検出オリゴヌクレオチドにＦＩＴＣが結合された場合、ＦＩＴＣは「識別機能を結合しうる分子」である。
　「識別機能」とは、検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量できる機能である。識別機能は検出オリゴヌクレオチドの有する機能であれば何でも良く、例えば、検出オリゴヌクレオチドの標識に基づく識別機能や、検出オリゴヌクレオチドに結合する検出分子によって検出オリゴヌクレオチドに付与される識別機能を挙げることができる。具体的には、その５’末端若しくは３’末端にユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識等がなされた検出オリゴヌクレオチドの蛍光・発色等の特性を挙げることができる。
　ユーロピウムの検出のためには、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加・混合し、約４５分間室温で静置した後、蛍光検出器で蛍光（励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍ）を測定すればよい。また、検出オリゴヌクレオチドがメチル化オリゴヌクレオチドである場合には、検出分子としては、具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体や、オスミウム錯体（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７；１２９：５６１２−５６２０）等が挙げられる。メチル化オリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基の少なくとも一つがメチル化されているオリゴヌクレオチドであり、具体的には５−メチルシトシン、６−メチルアデニン等を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。検出オリゴヌクレオチドがＦＩＴＣ標識されている場合には、検出分子としてＦＩＴＣ抗体を挙げることができる。
　「検出分子」とは、検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する性質を有していればよい。また、検出分子は、検出オリゴヌクレオチドの検出配列を認識するものであっても良く、予め検出オリゴヌクレオチドに結合されていても構わない。検出分子は、検出オリゴヌクレオチドに特異的に結合する性質を有し、且つ、定量又は検出のために利用される機能・特性である「識別機能」を有するか、或いは識別機能を付与され得るものであればよい。具体的には、検出分子は、検出配列がメチル化オリゴヌクレオチドの場合、該メチル化オリゴヌクレオチドに結合して該メチル化オリゴヌクレオチドを検出できるものであれば良く、該メチル化オリゴヌクレオチドに特異的に結合して識別機能を示すものであればよい。他に例えば、検出分子はメチル化ＤＮＡ抗体であってもよい。また、検出配列が検出分子そのものである場合、検出オリゴヌクレオチドを検出するために、新たな検出分子を添加しなくとも良く、検出オリゴヌクレオチドに組み込まれた検出分子を検出することにより、該検出オリゴヌクレオチドの検出が可能になる。
　検出分子がメチル化ＤＮＡ抗体である場合には、以下の方法により、定量又は検出のために利用される識別機能として利用することができる。具体的には、ユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識等、標識が蛍光・発色等を利用した機能である。尚、これら検出分子としての抗体に識別機能を付与する方法としては、検出分子である抗体に直接に識別機能を結合させてもよいし、識別機能を有した二次抗体又は三次抗体を検出分子である抗体に結合させてもよい。具体的には、蛍光物質で標識された抗体、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識された抗体、アルカリホスファターゼ標識された抗体、ビオチン標識された抗体、ユーロピウム標識された抗体を二次抗体又は三次抗体として利用することができる。また、酵素サイクル法で検出可能な基質を結合した抗体を利用してもよい。これら識別機能の定量又は検出手段としては、例えば、放射線検出器、分光光度計等による測定、又は目視等が挙げられる。例えば、検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能により検出又は定量する場合として、具体的にユーロピウムが付加された二次抗体を使用する場合、後述する検出複合体に二次抗体を結合させた後、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加・混合し、約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍ）を測定すればよい。
　検出オリゴヌクレオチド上のメチル化ＤＮＡにメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、その機能により検出又は定量する場合には、具体的には検出複合体にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させた後、メチル化ＤＮＡ抗体に対する二次抗体（例えば、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加し、室温で約１時間静置し、二次抗体の複合体への結合を促す。その後、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加・混合し、例えば約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍ）を測定することにより、検出又は定量する。
　また、検出オリゴヌクレオチド上のメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体をＦＩＴＣで標識する場合には、二次抗体としてＦＩＴＣを結合させた抗体を用いることもできる。この場合、公知の方法により、ＦＩＴＣの蛍光を測定し、検出又は定量することもでき、抗ＦＩＴＣ抗体を二次抗体として検出又は定量することもできる。更に、検出オリゴヌクレオチドにＦＩＴＣを直接結合させた場合は、ＦＩＴＣを識別機能として利用することもできるし、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識されたＦＩＴＣ抗体、アルカリホスファターゼ標識されたＦＩＴＣ抗体、ビオチン標識されたＦＩＴＣ抗体、ユーロピウム標識されたＦＩＴＣ抗体等により標識機能を付与することもできる。具体的には、検出オリゴヌクレオチドとして、ＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドを検出オリゴヌクレオチドとして使用する場合は、該検出オリゴヌクレオチドを含む後述する支持体に固定化された検出複合体に、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識された抗体（例えば、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製））を添加し、室温で約１時間~２時間静置し、ＦＩＴＣ抗体の検出複合体への結合を促す。その後、ＦＩＴＣ抗体溶液を洗浄除去してから、適切な基質（例えば、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐａｃｋ　＃ＤＹ９９９：Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を添加・混合する。約５~６０分間室温で静置した後、ストップ溶液（２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４水溶液）を添加してｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）の反応を停止させ、反応停止後３０分以内に４５０ｎｍの吸光度を測定すればよい。また、メチル化ＤＮＡ抗体の固定化にビオチンを利用しない場合、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量に用いることができる。ビオチン化された検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する場合には、例えば、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを固定化された検出複合体に添加・混合し、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドとＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの結合体を形成・分離した後、公知の方法によりＨＲＰの活性を測定することによりビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出又は定量できる。
　また、識別機能としては、酵素サイクル法等の高感度検出法で用いられる基質等を利用するものであってもよい。具体的には、酵素サイクル法で用いられる酵素を結合した抗体を検出分子として、検出複合体に結合させればよい。尚、本発明方法において検出分子に付与される識別機能としては、上記の記載の方法に限定されるものではない。
　本発明において「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体である。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作製できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。尚、このようなメチル化ＤＮＡ抗体の性質（１つのメチル化された塩基（シトシン）に１つの抗体が結合すること）から考えると、目的とするＤＮＡ領域としては、数多くのメチル化された塩基（シトシン）、即ちＣｐＧ、が存在する領域を選抜することが望ましく、また、定量精度及び検出感度の向上が期待できる。
　動物に抗原を接触させて得られる抗体として、動物から精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本発明においてはメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
　モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫してもよい。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ　Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原を混合して投与することや、抗原をリポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫してもよい。最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法等が挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしてもよい。細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
　本発明方法における「特定オリゴヌクレオチド」とは、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡと相補性により結合しうる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ、後述する支持体に結合する機能を有していればよい。具体的には、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと相補的に結合する特定接着配列を有し、支持体に結合して後述する検出複合体を形成できるものである。
　「特定接着配列」とは、目的とするＤＮＡ領域を有する塩基配列（被検オリゴヌクレオチド）に相補的に結合し得る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。特定接着配列が対合しうる被検オリゴヌクレオチドの塩基配列部分の相補的塩基配列は、特定接着配列の塩基配列と７５％以上、望ましくは９０％以上の相同性を有している。特定接着配列の塩基配列の長さは、５ｂｐ~５０ｂｐ、望ましくは１０ｂｐ~３０ｂｐである。また、特定接着配列は、被検オリゴヌクレオチドにおける目的とするＤＮＡ領域又は目的とするＤＮＡ領域の近傍に結合する塩基配列を有し、第二工程で後述する検出複合体を形成できるように設定されていればよい。また、特定接着配列は、検出オリゴヌクレオチド、被検オリゴヌクレオチド、特定オリゴヌクレオチド及び支持体が結合してなる検出複合体を形成できればどのような塩基配列であってもよく、特に特定オリゴヌクレオチドと被検オリゴヌクレオチドとの結合を阻害しないものが好ましい。尚、特定接着配列は同一反復配列中（目的とするＤＮＡ領域中）に通常は一つ設計されていればよいが、二つ以上設計されていてもよい。二つ以上設計する場合、互いに目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡとの結合を阻害しないものが好ましい。
　「相補的に結合する」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により、２本の一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、他の一本鎖ＤＮＡを構成する塩基との間で、プリンとピリミジンの塩基対合を生ずることにより、これら一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡを形成することであり、より具体的には、複数の連続したチミンとアデニン、グアニンとシトシンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。「相補的に結合」は、「相補的な塩基対合による結合」、「相補的な塩基対合」、又は「相補性によって結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」、［相補性である］と表現することもある。人工的に作製されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンが、シトシン、又はアデニン、又はチミンと水素結合で結合することも相補的な結合に含まれる。「目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖ＤＮＡ）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。
　本発明方法において、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定オリゴヌクレオチドが「相補性により結合」する場合、特定オリゴヌクレオチドの特定接着配列を構成する塩基配列の一部が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合も含まれる。例えば、特定接着配列を構成する塩基のうち、７５％以上、望ましくは８０％以上の塩基が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しており、尚且つ、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと、７５％以上、望ましくは８０％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドと結合できる場合も含まれる。
　同様に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドが「相補性により結合」する場合、検出オリゴヌクレオチドの検出用接着配列を構成する塩基配列の一部が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合も含まれる。例えば、検出用接着配列を構成する塩基のうち、７５％以上、望ましくは８０％以上の塩基が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しており、尚且つ、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと、７５％以上、望ましくは８０％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドと結合できる場合も含める。
　尚、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがゲノム中の前述する反復配列である場合には、反復配列が相同性を有する一群の塩基配列であることから、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと特定接着配列の相補的な塩基対合は、塩基配列の一部が目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合が発生する可能性がある。本発明方法においては、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがＬＩＮＥ配列やＳＩＮＥ（Ａｌｕ）配列等の反復配列である場合では、特定接着配列として、８０％以上の相同性を有する塩基配列に対して相補性により結合しうる特定接着配列も含む。
　本発明方法において「相同性を示す塩基配列」とは、配列同一性を有する塩基配列を意味する。本発明方法において、配列相同性の比率を記述しない場合は、７５％以上、望ましくは８０％以上の配列同一性を有する塩基配列のことを言う。具体的に「配列番号１と相同性を示す塩基配列」とは、配列番号１の塩基配列或いは配列番号１の塩基配列と７５％以上の配列同一性を有する塩基配列で、望ましくは８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であることを意味する。
　本発明方法における「支持体」としては、後述する検出複合体が結合可能な支持体であれば材質や形状は特定されない。例えば、形状は使用目的に適っていればよく、チューブ状、テストプレート状、フィルター状、ディスク状、ビーズ状等が挙げられる。また、材質は通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ナイロン等の合成樹脂、或いは前記合成樹脂にスルホン基、アミノ基等の反応性官能基を導入したものでもよい。また、ガラス、多糖類又はその誘導体（セルロース、ニトロセルロース等）、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等でもよい。
　「検出複合体」とは、前記被検オリゴヌクレオチドと前記検出オリゴヌクレオチドと前記特定オリゴヌクレオチドと前記支持体とが結合した複合体のことをいう。検出複合体を調製するには具体的に例えば、被検オリゴヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ水溶液（０．１ｐｍｏｌ／１０μｌ、ゲノムＤＮＡの場合、予め適切な制限酵素で処理し、ＤＮＡを断片化しておくことが望ましい。）又は被検オリゴヌクレオチド水溶液（０．１ｐｍｏｌ／１０μｌ）に、被検オリゴヌクレオチドと相補性により結合する特定オリゴヌクレオチドとして０．０２μＭのビオチン化された特定オリゴヌクレオチドを５μＬ加え、被検オリゴヌクレオチドと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチド水溶液（０．０２μＭ）を夫々５μＬ加え、更に１００ｍＭのＭｇＣｌ２を２０μＬ、及び最適な１０×緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μｌ加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、支持体の存在下で、９５℃で１０分間加熱し、７０℃で１０分間保温の後、更に５０℃で１０分間保温してから、３７℃で１０分間冷却処理することにより、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を形成させればよい。
　このようにして形成された被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を、支持体であるアビジンプレートに移し、３０分間、室温で静置することにより、支持体へ結合させればよい。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー［例えば、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］を、２００μＬ／ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、アビジンプレートを支持体とした検出複合体を形成させる。
　「支持体に結合」させる方法としては、例えば特定オリゴヌクレオチドを通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従い、支持体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には、特定オリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化された特定オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップ等）に固定する方法を挙げることができる。
　また、特定オリゴヌクレオチドの５’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを５個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。また更に、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、特定オリゴヌクレオチドの末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
　上記方法では、被検オリゴヌクレオチド、ビオチン化特定オリゴヌクレオチド、検出オリゴヌクレオチドを同時に添加し、該被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を取得し、その後、該結合体中のビオチン化特定オリゴヌクレオチドを用いて固定化（選択）しているが、その順番は、特に限定されない。即ち、先にビオチン化特定オリゴヌクレオチドをアビジンプレート（支持体）に固定化しておき、その後、被検オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドを添加し、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を取得し、固定化（選択）してもよい。
　また、前記被検オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を取得し選択する場合に、予め得られている被検オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端をビオチン化し、上記と同様の方法を実施することにより、被検オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を、直接、支持体へ結合させ、選択してもよい。
　本発明方法においては、検出オリゴヌクレオチドや後述する複合検出オリゴヌクレオチドの識別機能として、支持体として用いられる微粒子と同じ微粒子がこれらのオリゴヌクレオチドに結合されていても構わない。微粒子としては、ラテックスビーズ、金コロイド（金ナノ粒子）等が挙げられる。本発明方法において支持体と検出オリゴヌクレオチドの識別機能として同一種類の微粒子を用いる場合、支持体である微粒子と検出オリゴヌクレオチドに結合されている微粒子は、支持体である微粒子上に被検オリゴヌクレオチドが固定化され、且つ、被検オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドが相補的な結合により検出複合体を形成することにより微粒子の凝集体として検出できる。この場合、微粒子がラテックスビーズであれば、凝集体は濁度の変化によって検出することが可能となる。また、微粒子が金コロイド（金ナノ粒子）であれば、凝集体は、色調変化（ピンクから紫色）によって検出することが可能となる。
　また、目的とするＤＮＡ領域上に「検出用接着配列」に相補的な塩基配列が複数存在する場合には、目的とするＤＮＡ領域に微粒子が結合された検出オリゴヌクレオチドが複数結合することにより支持体が凝集しうる。この場合、特定オリゴヌクレオチドを添加せずに実施しても特定オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の結果を得ることができる。従って、本発明方法は、目的とするＤＮＡ領域上に検出オリゴヌクレオチドが結合可能な「検出用接着配列」と相補的に結合しうる塩基配列が複数存在する場合には、特定オリゴヌクレオチドを添加せずに微粒子の凝集を検出できる方法も含むものである。
　同様に、目的とするＤＮＡ領域上に「特定接着配列」に相補的な塩基配列が複数存在する場合には、目的とするＤＮＡ領域に、支持体として微粒子が結合された特定オリゴヌクレオチドが複数結合することにより支持体が凝集しうる。この場合、検出オリゴヌクレオチドを添加せずに実施しても検出オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の結果を得ることができる。従って、本発明方法は、目的とするＤＮＡ領域上に、特定オリゴヌクレオチドの特定接着配列と相補的に結合しうる塩基配列が複数存在する場合には、検出オリゴヌクレオチドを添加せずに微粒子の凝集を検出できる方法も含むものである。
　尚、微粒子凝集体として検出される量を被検オリゴヌクレオチドに含まれる目的とするＤＮＡ領域の検体中の量に相関した指標とすることができる。
　「検出用接着配列」と「特定接着配列」は、検出オリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列か、特定オリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列かの違いのみであるため、夫々該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドは、被検オリゴヌクレオチドへ同時に結合可能なオリゴヌクレオチドである。即ち、「検出用接着配列」は「特定接着配列」としても利用できるし、「特定接着配列」は「検出用接着配列」としても利用可能である。
　例えば具体的には、配列番号１に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」として、夫々配列番号４および配列番号１２の塩基配列を設定して、配列番号４に示される特定接着配列をビオチン化して特定オリゴヌクレオチドとし、また、配列番号１２に示される検出用接着配列に検出配列を連続して合成して配列番号５に示す検出オリゴヌクレオチドを作製すると、該特定オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドを用いて、配列番号１に示す塩基配列を検出することができる。一方で、配列番号１に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」として、夫々配列番号１２および配列番号４の塩基配列を設定して、配列番号１２に示される特定接着配列をビオチン化して特定オリゴヌクレオチドとし、配列番号５に示される検出用接着配列の塩基配列に検出配列を連続して合成して検出オリゴヌクレオチドを作製し、該特定オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドを用いて、同様に、配列番号１に示す塩基配列を検出することができる。同様に、配列番号１に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」との組合せとして、配列番号８および配列番号１４の塩基配列を挙げることができ、配列番号２に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」との組合せとして、配列番号６および配列番号１３の塩基配列を挙げることができ、配列番号３に結合しうる「特定接着配列」と「検出用接着配列」との組合せとして、配列番号１０および配列番号１５の塩基配列を挙げることができる。
　被検オリゴヌクレオチドに結合して検出複合体を構成しうる特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドを構成する「特定接着配列」と「検出用接着配列」は、検出複合体を形成しうる被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合可能な塩基配列の組み合わせとして扱うことが可能であり、片方を特定接着配列として利用する場合には、残り片方は検出用接着配列として利用すればよい。
　本発明方法における「複合検出オリゴヌクレオチド」とは、被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し、且つ、識別機能を有する複数のオリゴヌクレオチドが結合（複合）したヌクレオチドである。この複合検出オリゴヌクレオチドの形態としては、各々のオリゴヌクレオチドが有する互いに相補的な塩基配列からなる接着塩基配列により結合させてなるものであってもよく、また複合検出オリゴヌクレオチドを構成する個々のオリゴヌクレオチドの全て或いはその一部がメチル化されていても構わない。本発明方法において、複合検出オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がメチル化されたものを、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドと呼ぶこともある。また、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドは、メチル化オリゴヌクレオチドを含む複合検出オリゴヌクレオチドであってもよい。メチル化オリゴヌクレオチドを相補的に結合させて複合検出オリゴヌクレオチドを形成させる場合は、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドは、例えばメチル化オリゴヌクレオチドのみを結合させてなるものでもよく、メチル化オリゴヌクレオチドとメチル化されていない（非メチル化）オリゴヌクレオチドを組み合せて結合させてなるのもでもよく、夫々のオリゴヌクレオチドの数は制限されない。
　「メチル化オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基がメチル化されたオリゴヌクレオチドであり、本発明においては人工的に合成されたものであってもよい。また、人工的に合成されたオリゴヌクレオチドやゲノムＤＮＡを断片化して得られたオリゴヌクレオチドを、メチル基転移酵素で修飾することで調製してもよい。いくつかのメチル基転移酵素（メチル化酵素）は、オリゴヌクレオチド中の「ＣｐＧ」中のシトシンの５位をメチル化することが知られており、このようなメチル基転移酵素の具体例としては、ＳｓｓＩ　ｍｅｔｈｙｌａｓｅ、Ｄｍｎｔ１　ｍｅｔｈｙｌａｓｅ等を挙げることができる。尚、ゲノムＤＮＡは部分的にメチル化されているので、細胞等から取得したゲノムＤＮＡを断片化すると、ゲノム中でメチル化されている領域がメチル化オリゴヌクレオチドとして取得できる場合もある。また、シトシンの５位がメチル化されたメチル化オリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシンをシトシンの代わりに用いて人工的に合成されたメチル化オリゴヌクレオチドであってもよい。この場合、「ＣｐＧ」のシトシンだけでなく全てのシトシン（例えば、５’−ＣＡ−３’、５’−ＣＴ−３’、５’−ＣＣ−３’等）を、５−メチルシトシンとして合成することが可能である。
　「ＤＮＡメチル化酵素」とは、ＤＮＡ中の塩基をメチル化する酵素であり、哺乳動物細胞、細菌等から、多種のＤＮＡメチル化酵素が単離されている。ＤＮＡメチル化酵素は、基質の塩基の種類から、アデニンメチル化酵素、シトシンメチル化酵素等、数種類に分類される。シトシンメチル化酵素は、ＤＮＡ塩基配列中の特定の配列を認識し、その配列の近くのシトシンをメチル化する酵素であり、認識する塩基配列により異なったシトシンメチル化酵素が知られている。
　また、ＤＮＡメチル化酵素の触媒するＤＮＡのメチル化反応は、制限修飾系と呼ばれる原始的な免疫系から多数見出されている。制限修飾系とは、細菌で機能するゲノム全体を定期的にメチル化することにより、特定の配列を認識する制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）によって消化されないようにした上で、外来ＤＮＡ（特にバクテリオファージ）を制限酵素によって消化する機能で、バクテリオファージ感染から微生物ゲノムを防御するシステムのことである。ゲノムのメチル化に機能している酵素は、シトシン又はアデニンをメチル化し、多くはプリン残基の６位の窒素（Ｎ６）、或いは５位の炭素（Ｃ５）をメチル化することが知られている。このような酵素のうち、シトシンのＣ５をメチル化するシトシンメチル化酵素としては、ＳｓｓＩ（Ｍ．ＳｓｓＩ）メチラーゼ、ＡｌｕＩメチラーゼ、ＨｈａＩメチラーゼ、ＨｐａＩＩメチラーゼ、ＭｓｐＩメチラーゼ、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ等が知られている。また、これらシトシンのＣ５位をメチル化する酵素は、認識する塩基配列が異なっており、ＣｐＧを認識するシトシンメチル化酵素は、ＳｓｓＩのみである。
　ヒトゲノム中のＤＮＡのメチル化反応としては、エピジェネティクス（遺伝子配列によらない遺伝子発現の多様性を生みだす仕組み）として、ＣｐＧのシトシンの５位（Ｃ５）のメチル化が知られており、このようなシトシンメチル化酵素として、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが知られている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとしては、ＤｎｍｔＩメチルトランスフェラーゼが知られている。
　ヒト細胞中ではＣｐＧ配列のシトシンのＣ５位がメチル化されているため、人為的にゲノムをメチル化する場合には、ＳｓｓＩを用いることで、ヒト細胞内でのメチル化と同じ配列（ＣｐＧ）の、同じシトシンの、同じ位置をメチル化することが可能となる。
　シトシンメチル化酵素によりメチル化されたＤＮＡにするためには、具体的には例えば、以下のように実施すればよい。ＤＮＡ試料に、最適な１０×緩衝液（ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ社製））を５μＬ、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（３．２ｍＭ，ＮＥＢ社製）を０．５μｌ、シトシンメチル化酵素ＳｓｓＩ（ＮＥＢ社製）を夫々０．５μＬ加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、３７℃で３０分間インキュベーションすればよい。
　本発明方法では、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドが相互に相補的に直列に結合（連結）する場合（「直列型」と呼ぶこともある）、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）のうち、被検オリゴヌクレオチドと相補性によって結合する検出用接着配列を有するオリゴヌクレオチドを第１オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
　第１オリゴヌクレオチドは、前記検出用接着配列を有し、且つ、被検オリゴヌクレオチドの前記検出用接着配列以外の塩基配列とは相補的な結合をせず、第１オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第２オリゴヌクレオチドの相補接着配列と相補的に結合しうる接着塩基配列である第１接着塩基配列を有する。
　また、第１接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第１接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を第２オリゴヌクレオチドと呼ぶ。第２オリゴヌクレオチドは、前記相補第１接着塩基配列を有し、且つ、第１接着配列以外の、被検オリゴヌクレオチド及び第１オリゴヌクレオチドとは相補的な結合をせず、第２オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第３オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうる接着塩基配列である第２接着塩基配列を有する。第２接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第２接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を第３オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
　同様に、第Ｎ接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第Ｎ接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドと呼ぶ。第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドは、該相補第（Ｎ）接着塩基配列を有し、且つ、第Ｎ接着配列以外の被検オリゴヌクレオチド及び第１オリゴヌクレオチドから第Ｎオリゴヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドとは相補的な結合をせず、第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第（Ｎ＋２）オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうる接着塩基配列である第（Ｎ＋１）接着塩基配列を有する。第（Ｎ＋１）接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第（Ｎ＋１）接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を、第（Ｎ＋２）オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
　同様に、第（Ｎ−１）接着塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列からなる相補第（Ｎ−１）接着塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）を、第Ｎオリゴヌクレオチドと呼ぶ。第Ｎオリゴヌクレオチドは、該相補第（Ｎ−１）接着塩基配列を有し、且つ、第（Ｎ−１）接着配列以外の被検オリゴヌクレオチド、第１オリゴヌクレオチドから第（Ｎ−１）オリゴヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドとは相補的な結合をせず、第Ｎオリゴヌクレオチドと相補的に結合しうるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）である第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドと相補的に結合しうる接着塩基配列である第Ｎ接着塩基配列を有する。
　尚、第（Ｎ＋１）オリゴヌクレオチドが存在しない場合には、第Ｎオリゴヌクレオチドを、終末オリゴヌクレオチドと呼び、該第Ｎオリゴヌクレオチドは第Ｎ接着塩基配列を有していなくても構わない。
　即ち、本発明方法における複合検出オリゴヌクレオチドの一つの形態は、第１オリゴヌクレオチドから終末オリゴヌクレオチドまでが、接着塩基配列と相補接着塩基配列との相補的な結合により連結されたものである。尚、複合検出オリゴヌクレオチドが、第１オリゴヌクレオチドのみで形成されている場合は、上記に従い、その第１オリゴヌクレオチドは、接着塩基配列を有していなくても良く、更に、メチル化オリゴヌクレオチドであってもよい。
　接着塩基配列と相補接着塩基配列は、オリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）が相補的に結合しうる塩基配列であればよく、該オリゴヌクレオチドの末端に位置していてもよく、中間に位置していてもよい。
　更に、第Ｎ接着塩基配列は、相補第Ｎ接着塩基配列以外の塩基配列と相補的な結合をせず、且つ、第Ｎ接着塩基配列は、相補第Ｎ接着塩基配列以外の、いずれの相補的な結合も阻害しないことを特徴とすることが望ましい。第Ｎ接着塩基配列は、相補第Ｎ接着塩基配列以外の、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチド、検体中に含まれる核酸、被検オリゴヌクレオチド及び特定オリゴヌクレオチドを含むその他のオリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な結合をしないことが望ましい。
　本発明方法では、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドが相互に相補的に分岐して（直列以外で）結合（連結）しうる場合（「分岐型」と呼ぶこともある）、複合検出オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）のうち、第Ｎオリゴヌクレオチド上に、複数の接着塩基配列が複数存在してもよい。例えば、第Ｎオリゴヌクレオチドに、接着塩基配列が、Ｍ個存在する場合には、夫々、第（Ｎ，１）接着塩基配列、第（Ｎ，２）接着塩基配列、第（Ｎ，３）接着塩基配列、・・・、第（Ｎ，（Ｍ−１））接着塩基配列、第（Ｎ，Ｍ）接着塩基配列、と呼び、その接着塩基配列に相補性によって結合するオリゴヌクレオチドを夫々第（（Ｎ＋１），１）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１），２）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１），３）オリゴヌクレオチド、・・・、第（（Ｎ＋１），（Ｎ−１））オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１），Ｍ）オリゴヌクレオチド、と呼ぶ。この際例えば、第（（Ｎ＋２），１）オリゴヌクレオチドが存在しない場合、第（（Ｎ＋１），１）オリゴヌクレオチドは、終末オリゴヌクレオチドであり、第（（Ｎ＋１），１）接着塩基配列は存在しなくともよい。
　更に、同様に、第（Ｎ，１）オリゴヌクレオチド上に複数の接着塩基配列が存在する場合は、例えば第（Ｎ，１）オリゴヌクレオチドに、接着塩基配列がＬ個存在する場合には、夫々第（Ｎ，１，１）接着塩基配列、第（Ｎ，１，２）接着塩基配列、第（Ｎ，１，３）接着塩基配列、・・・、第（Ｎ，１，（Ｌ−１））接着塩基配列、第（Ｎ，１，Ｌ）接着塩基配列、と呼び、その接着塩基配列に相補性によって結合するオリゴヌクレオチドを夫々、第（（Ｎ＋１），１，１）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１），１，２）オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１），１，３）オリゴヌクレオチド、・・・、第（（Ｎ＋１），１，（Ｌ−１））オリゴヌクレオチド、第（（Ｎ＋１），１，Ｌ）オリゴヌクレオチド、と呼ぶ。この際、例えば、第（（Ｎ＋２），１，１）オリゴヌクレオチドが存在しない場合、第（（Ｎ＋１），１，１）オリゴヌクレオチドは、終末オリゴヌクレオチドであり、第（（Ｎ＋１），１，１）接着塩基配列は存在しなくともよい。
　分岐型の複合オリゴヌクレドとは、複合検出オリゴヌクレオチドが分岐型であるだけでなく、第１オリゴヌクレオチドが数種類存在し、被検オリゴヌクレオチド上に複数の第１オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド（メチル化オリゴヌクレオチドを含む）が結合する場合も含むものである。この場合、被検オリゴヌクレオチド上にＭ個の第１オリゴヌクレオチドがある場合には、被検オリゴヌクレオチド上の第１連結配列、第２連結配列・・・・第Ｍ連結配列に対して相補的に結合しうる、第（１，１）接着配列、第（１，２）接着配列、第（１，３）接着配列・・・第（１、Ｍ）接着配列を有する、第（１，１）オリゴヌクレオチド、第（１，２）オリゴヌクレオチド、第（１，３）オリゴヌクレオチド・・・第（１、Ｍ）オリゴヌクレオチドであればよい。また、第１オリゴヌクレオチド上にＭ個の第２オリゴヌクレオチドがある場合には、第１オリゴヌクレオチド上の第１連結配列、第２連結配列・・・・第Ｍ連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（２，１）接着配列、第（２，２）接着配列、第（２，３）接着配列・・・第（２，Ｍ）接着配列を夫々有する、第（２，１）オリゴヌクレオチド、第（２，２）オリゴヌクレオチド、第（２，３）オリゴヌクレオチド・・・第（２、Ｍ）オリゴヌクレオチドであればよい。
　さらに、第Ｎオリゴヌクレオチド上にＭ個の第Ｎ＋１オリゴヌクレオチドがある場合には、第Ｎオリゴヌクレオチド上の第１連結配列、第２連結配列・・・・第Ｍ連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（Ｎ＋１，１）接着配列、第（Ｎ＋１，２）接着配列、第（Ｎ＋１，３）接着配列・・・第（Ｎ＋１，Ｍ）接着配列を夫々有する、第（Ｎ＋１，１）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１，２）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１，３）オリゴヌクレオチド・・・第（Ｎ＋１、Ｍ）オリゴヌクレオチドであればよい。
　なお、第（Ｎ，Ｍ）オリゴヌクレオチド上にＰ個の第Ｎ＋１オリゴヌクレオチドがある場合には、第（Ｎ，Ｍ）オリゴヌクレオチド上の第（Ｎ＋１，Ｍ，１）連結配列、第（Ｎ＋１，Ｍ，２）連結配列・・・・第（Ｎ＋１，Ｍ，Ｐ）連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（Ｎ＋１，Ｍ，１）接着配列、第（Ｎ＋１，Ｍ，２）接着配列、第（Ｎ＋１，Ｍ，３）接着配列・・・第（Ｎ＋１，Ｍ，Ｐ）接着配列を夫々有する、第（Ｎ＋１，Ｍ，１）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１，Ｍ，２）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１，Ｍ，３）オリゴヌクレオチド・・・第（Ｎ＋１，Ｍ，Ｐ）オリゴヌクレオチドであればよい。
　さらに、第（Ｎ，Ｍ，・・・，Ｘ）オリゴヌクレオチド上にＰ個の第Ｎ＋１オリゴヌクレオチドがある場合には、第（Ｎ，Ｍ，・・・，Ｘ）オリゴヌクレオチド上の第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，１）連結配列、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，２）連結配列・・・・第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，Ｐ）連結配列に対して夫々相補的に結合し得る、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，１）接着配列、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，２）接着配列、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，３）接着配列・・・第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，Ｐ）接着配列を夫々有する、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，１）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，２）オリゴヌクレオチド、第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，３）オリゴヌクレオチド・・・第（Ｎ＋１，Ｍ，・・・，Ｘ，Ｐ）オリゴヌクレオチドであればよい。
　以上の如く、様々な組み合わせを行い複合検出オリゴヌクレオチドを高感度化することが可能であり、検出したい感度又は精度に応じ、各オリゴヌクレオチド、終末オリゴヌクレオチドの組み合わせを調整することができる。
　尚、一つのオリゴヌクレオチド上に、複数の接着塩基配列が存在する場合、それら接着塩基配列は、同じでもよく、異なっていてもよい。具体的に例えば、前記第（Ｎ，１）接着塩基配列、第（Ｎ，２）接着塩基配列、第（Ｎ，３）接着塩基配列の塩基配列は、全て同じでもよいし、夫々異なる塩基配列であってもよい。連結接着配列と相補連結塩基配列、及び、接着塩基配列と連結塩基配列は互いに相補的に結合しうる塩基配列であればよく、具体的には、９０％以上の相同性を有していれば差し支えなく、通常５~１００ｂｐ、望ましくは１０~５０ｂｐであればよい。塩基配列は、ゲノムとの相補的な結合をしないように設計されることが望ましく、より望ましくは人工的に合成したＤＮＡが望ましい。設計された接着塩基配列と連結塩基配列等が、ゲノムとの相補的な結合をしないことを簡便に確認するためには、ＰｕｂＭｅＤ等の公的機関等のゲノムデータベースでＢｌａｓｔ検索を実施し、８０％以上の相同性を示す塩基配列がないことを確認すればよい。
　即ち、「複合検出オリゴヌクレオチド」は、連結塩基配列と相補連結塩基配列との相補的な結合により被検オリゴヌクレオチドと連結され、検出複合体をを形成する。検出複合体は、一つの被検オリゴヌクレオチドに一つの検出オリゴヌクレオチドが結合したものであっても良く、或いは複数の複合検出オリゴヌクレオチドが結合したものであってもよい。複合検出オリゴヌクレオチドは、メチル化複合検出オリゴヌクレオチドであってもよい。また、複数の複合検出オリゴヌクレオチドが、一つの被検オリゴヌクレオチドに結合する場合は、各々複合検出オリゴヌクレオチドは、同一の複合検出オリゴヌクレオチドであってもよく、異なる複合検出オリゴヌクレオチドであってもよい。また、被検オリゴヌクレオチド上の連結塩基配列は、数種類の連結塩基配列が各々一つずつであっても良く、一種類の連結塩基配列が複数あってもよい。
　本発明の第一工程で取得される「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡであってもよい。被検オリゴヌクレオチドを、検体中から一本鎖ＤＮＡとして取得するための方法は何でもよい。具体的には、目的とするＤＮＡ領域が、ゲノムＤＮＡ水溶液（０．１ｐｍｏｌ／１０μｌ、ゲノムＤＮＡの場合、予め適切な制限酵素で処理し、ＤＮＡを断片化しておくことが望ましい。）或いは被検オリゴヌクレオチド水溶液（０．１ｐｍｏｌ／１０μｌ）に、最適な１０×緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μｌ加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとして、９５℃で１０分間加熱し、４℃で急冷処理をすればよい。緩衝液を使用せずに滅菌超純水のみで１００μＬとして、９５℃で１０分間加熱し、４℃で急冷処理をしてもよい。また、目的とするＤＮＡ領域が、ウイルスゲノムＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）やＲＮＡから逆転写酵素で合成されたＤＮＡ等、検体中では一本鎖ＤＮＡ、又は、ＲＮＡとのハイブリッドで存在する可能性のあるＤＮＡの場合、同様に、緩衝液或いは滅菌超純水の溶液中で、９５℃で１０分間加熱し、４℃で急冷処理をすることが望ましい。
　本発明方法において「該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成する」とは、例えば、被検オリゴヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ水溶液（０．１ｐｍｏｌ／１０μｌ、ゲノムＤＮＡの場合、予め適切な制限酵素で処理し、ＤＮＡを断片化しておくことが望ましい。）或いは被検オリゴヌクレオチド水溶液（０．１ｐｍｏｌ／１０μｌ）に、被検オリゴヌクレオチドと相補性により結合する特定オリゴヌクレオチドとして０．０２μＭのビオチン化された特定オリゴヌクレオチドを５μＬ加え、被検オリゴヌクレオチドと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチド水溶液（０．０２μＭ）を夫々５μＬ加え、更に１００ｍＭのＭｇＣｌ２を２０μＬ、及び最適な１０×緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μｌ加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、９５℃で１０分間加熱し、７０℃で１０分間保温の後、更に５０℃で１０分間保温してから、３７℃で１０分間冷却処理すればよい。
　このようにして形成された被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を支持体であるアビジンプレートに移し、３０分間、室温で静置することで、検出複合体を取得すればよい。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー［例えば、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］を、２００μＬ／ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、アビジンプレートを支持体とした検出複合体を取得する。
　第三工程は、第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する工程である。第三工程である「第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する」方法としては、具体的に例えば、前記検出オリゴヌクレオチドがメチル化オリゴヌクレオチドである場合、前記被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体が結合されたアビジンプレートに検出分子としてメチル化ＤＮＡ抗体を添加し、検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドに結合させる。その後、残溶液を除去し、洗浄バッファーを用いて洗浄を行い検出複合体を残す。より具体的に例えば、前記の方法具体例で得られた被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体が固定化されたプレートに、１μｇ／ｍＬに調製したメチルシトシン抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬ／ウェルの割合で添加し、１時間室温で静置する。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー［例えば、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］を、２００μＬ／ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、検出複合体に結合したメチルシトシン抗体を残す。
　他に具体的には例えば、メチル化ＤＮＡ抗体が結合している検出複合体に、メチル化ＤＮＡ抗体と結合するユーロピウム（以下、「Ｅｕ」と記載することもある）標識された抗体（二次抗体）を結合させ、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を添加後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定すればよい。Ｅｕ標識の代わりに、ＦＩＴＣ標識を用いることもできる。また、ＦＩＴＣ標識した抗体（二次抗体）は、更に、ＨＲＰ標識したＦＩＴＣ抗体を結合させ、ＨＲＰの酵素活性により検出することもできる。ＨＲＰの酵素活性を利用して検出する場合、基質（Ｒ＆Ｄ社、＃ＤＹ９９９）を添加して室温でインキュベーションした後、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｍ　Ｈ２ＳＯ４：５０μＬ／ｗｅｌｌ）を添加して、吸光４５０ｎｍ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　６５０ｎｍ）を測定すればよい。また、酵素サイクル法で検出可能な基質を結合した抗体を二次抗体としてもよい。
　より具体的に例えば、前記の方法具体例で得られたメチル化ＤＮＡ抗体が結合している検出複合体（支持体は、アビジンプレート）に、０．２５μｇ／ｍＬに調製したマウスＩｇＧ抗体Ｅｕ−Ｎ１（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を、１００μＬ／ウェルの割合で添加し、１時間室温で静置後、残溶液を除去し、洗浄バッファー［例えば、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］を、２００μＬ／ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返す。Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、攪拌してから４５分間、室温でインキュベーションする。続いて、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで測定（Ｌａｇ　Ｔｉｍｅ　４００ｍｓｅｃ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　４００ｍｓｅｃ）する。
　また、前記の方法具体例で得られたメチル化ＤＮＡ抗体が結合している検出複合体（支持体は、アビジンプレート）に、２μｇ／ｍＬに調製したＦＩＴＣで標識したマウスＩｇＧ抗体（ヤギ）を、１００μＬ／ウェルの割合で添加し、１時間室温で静置後、残溶液を除去し、洗浄バッファー［例えば、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］を、２００μＬ／ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返す。更に、ＦＩＴＣに対する二次抗体（例えば、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体：Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ウェルの割合でアビジンコートプレートに添加し室温でインキュベーションする。洗浄バッファー［例えば、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］を、２００μＬ／ウェルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返す。基質（Ｒ＆Ｄ社、＃ＤＹ９９９）を１００μＬ／ウェルの割合で添加し、１０秒ほど攪拌する。室温でインキュベーションし、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｍ　Ｈ２ＳＯ４：５０μＬ／ｗｅｌｌ）を添加し、１０秒ほど攪拌する。３０分以内に吸光４５０ｎｍ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　６５０ｎｍ）を測定する（遮光が望ましい）。
　本発明は、下記のような場面において利用すればよい。
　例えば、癌等の診断においては、血液中の遊離ＤＮＡの定量により定期健康診断におけるスクリーニング検査として利用が可能である。また、感染症等の診断においては、疾患原因となる細菌、ウイルスのＤＮＡ、ＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡの定量又は検出により、感染症の原因菌や原因ウイルス、食中毒菌の簡易な特定方法の提供が可能となる。また、従来の技術では、これら血液中の遊離ＤＮＡや微生物由来のＤＮＡ或いはＲＮＡを鋳型として合成されるＤＮＡは、ＰＣＲ等を実施してＤＮＡを増幅した後に定量又は検出していた。しかし、本発明方法を用いることによりＰＣＲ等の煩雑な方法を行わずともＤＮＡの定量又は検出を可能にする。
　血液、尿等の生体試料中に含まれるタンパク質や低分子生体物質の検出若しくは定量する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。当該免疫学的測定方法のうち、クロマトグラフィーを用いた所謂イムノクロマト法は操作が簡単であり、検定に要する時間も短いため、現在、例えば、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の多くの場面で広く利用されている。また、近年、標識されたＤＮＡ（遺伝子）をクロマトストリップ上で展開し、目的ＤＮＡ（遺伝子）を捕獲できるプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、目的ＤＮＡ（遺伝子）を検出する、所謂ハイブリッドクロマト法が利用されるようになってきた。この方法も操作が簡便であり、検定に要する時間も短いため、現在、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の場面で広く利用され始められている。本発明測定方法は、上記のイムノクロマト法とハイブリッドクロマト法とを混合した方法を概念的に可能としている。本発明測定方法では、複合体形成及び複合体取得に関して、その順序は特に限定されないため、種々の方法が可能である。具体的には例えば、以下のように実施すればよい。
　例えば、第二工程終了直後の試料に、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドとビオチン化特定オリゴンクレオチドとを結合させて、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化特定オリゴヌクレオチドの結合体が支持体に結合した検出複合体を形成させる。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記検出複合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域有するＤＮＡを検出若しくは定量できる。
　目的とするＤＮＡ領域に複数の検出用塩基配列と相補的に結合しうる塩基配列（目的とするＤＮＡ領域上の夫々異なる塩基配列と相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いる）を設定し、各目的とするＤＮＡ領域を順次検出若しくは定量することも可能であり、また、複数の目的とするＤＮＡ領域と検出複合体を形成できるように、ゲノム中の反復配列や重複遺伝子或いは複数の異なる遺伝子を同時に検出するような、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いても、検出感度を飛躍的に上げることができる。
　また、複数の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが複数存在する場合、夫々の目的とするＤＮＡ領域を有する被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合する夫々の特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の形成が、他の、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの存在下でも形成可能であるならば、複数の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを同時に検出することも可能である。
　検出オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドは、例えば、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（５）配列番号３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（６）配列番号３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（９）配列番号５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１０）配列番号５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１１）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１２）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１３）配列番号７で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１４）配列番号７で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１５）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（１６）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
　例えば配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約２８０コピーあり、配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約２６０コピーあり、配列番号３で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約８２０コピーある。従って、夫々の塩基配列中に検出用接着配列と特定接着配列を設定できれば、ゲノムの中に一種類しかない配列に対して検出用接着配列と特定接着配列を設定する場合に比べると、ゲノムの検出感度を、理論上で２６０~８２０倍上げることが可能となる。
　検出オリゴヌクレオチド、ビオチン化特定オリゴヌクレオチド、及び、目的とするＤＮＡ領域或いは目的とするＲＮＡ領域から作成されたＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドとの結合体を支持体へ結合させて検出複合体を取得する過程を実施する方法としては、前記の方法に限定されるものではなく、免疫抗体法を用いる方法であれば何でもよい。例えば、ＥＬＩＳＡ法では、クロマトストリップ法と同様の原理を用いるため、被検オリゴヌクレオチドと特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドの結合体を形成させて支持体へ結合させる過程を記載の順番で実施することは可能である。
　本発明方法の第一工程において、高濃度のナトリウム塩が存在する系により検体であるＤＮＡを抽出することが好ましい。具体的には、本発明方法の第一工程において検体であるＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液（例えば、緩衝液）中のナトリウム塩の濃度としては、少なくとも５０ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ以上を挙げることができる。より具体的には、５０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以上１０００ｍＭ以下、より好ましくは１００ｍＭ以上２００ｍＭ以下が挙げられる。また、ナトリウムイオンを含む塩であれば、ＮａＣｌ、ＮａＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４等を含むどのような塩でも構わないが、好ましくは、ＮａＣｌを挙げることができる。
　本発明は、癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１~１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法を含む。当該発明の好ましい態様としては、検体が哺乳動物由来の血清である発明、また更に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明を挙げることができる。これら発明を利用すれば、血液検査により、癌患者を簡便に特定することが可能となろう。
　ここで「癌患者」とは、癌を発症した被験者を意味しており、癌としては、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌（肝細胞癌、胆管細胞癌）、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、結腸癌、肛門癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、前立腺癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣（睾丸）癌、上顎癌、舌癌、（上、中、下）咽頭癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、甲状腺癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌）等の、ヒトおよび哺乳類の臓器で発症する固形癌と、ヒトおよび哺乳類の血液で発症する非固形癌のいずれの癌も含むことを意味する。
　このような本発明における、メチル化オリゴヌクレオチド等は、検出用キットの試薬として有用である。また、本発明方法の権利範囲は、該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットのような形態での使用も含むものである。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
　クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のＴＥバッファー溶液を夫々２連で調製した。
　溶液Ａ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｂ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｃ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｄ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
　上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０００ｍＭ　ＫＣｌ）５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＬＩＮＥ１領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８０３４０に示される塩基番号１１４２−１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在する。これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
＜５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　前記で得たゲノムＤＮＡの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　その結果を図１に示した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ）、及び溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
　本実施例において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
実施例２
　クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のＴＥバッファー溶液を夫々２連で調製した。
　溶液Ａ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｂ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｃ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｄ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
　上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０００ｍＭ　ＫＣｌ）５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＬＩＮＥ１領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｙ、配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８０３４０に示される塩基番号２６９２−２９５８に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在する。これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするＤＮＡ領域Ｙと相補性によって結合する配列番号６で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ２を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｙを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｙと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ２を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
＜５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　前記で得たゲノムＤＮＡの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図２に示した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ）、及び溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
　本実施例において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
実施例３
　クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のＴＥバッファー溶液を夫々２連で調製した。
　溶液Ａ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｂ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｃ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｄ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
　上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０００ｍＭ　ＫＣｌ）５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＬＩＮＥ１領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８０３４０に示される塩基番号１１４２−１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在する。これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号８で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ１を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
＜５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　前記で得たゲノムＤＮＡの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図３に示した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ）、及び溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
　本実施例において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
実施例４
　クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のＴＥバッファー溶液を夫々２連で調製した。
　溶液Ａ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｂ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｃ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｄ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
　上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０００ｍＭ　ＫＣｌ）５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＬＩＮＥ１領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８０３４０に示される塩基番号１１４２−１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在する。これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号８で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
＜５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　前記で得たゲノムＤＮＡの反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図４に示した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ）、及び溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
　本実施例において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
実施例５
　クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のＴＥバッファー溶液を夫々２連で調製した。
　溶液Ａ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｂ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｃ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｄ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
　上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０００ｍＭ　ＫＣｌ）５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＬＩＮＥ１領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｘ、配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８０３４０に示される塩基番号１１４２−１４７３に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在する。これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する配列番号８で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｘを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ１、及び目的とするＤＮＡ領域Ｘと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ３を合成し、夫々の検出オリゴヌクレオチドの濃度が０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
＜５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　上記で得た反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図５に示した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ）、及び溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
　本実施例において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
実施例６
　クロンテック社より購入したヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下のＴＥバッファー溶液を夫々２連で調製した。
　溶液Ａ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｂ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｃ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液
　溶液Ｄ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／２０μＬ　ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
　上記の調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを４Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ）５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｚ、配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ４５８１１０に示される塩基番号１７８−２６２に相当する領域）はヒトゲノムＤＮＡ上に複数存在する。これを取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性によって結合する配列番号１０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。また目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性によって結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
＜５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　上記で得た反応液３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、更に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（即ち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ　７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図６に示した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５０ｎｇ）、及び溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　５ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加し、その程度は濃度依存的であった。
　本実施例において、目的とするＤＮＡ領域が特定オリゴヌクレオチド、及びメチルシトシン抗体が結合可能な箇所を有する検出オリゴヌクレオチドにより選択され、複合体を形成し、これを検出及び定量することによって、目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量できることが示された。また目的とするＤＮＡ領域を検出及び定量することによって、ゲノムＤＮＡの検出及び定量できることが示された。
実施例７
　血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ、＃６３６４０１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＴＥバッファー溶液とラット（Ｗｉｓｔａｒ　Ｈａｎｎｏｖｅｒ）より採取した血清の混合液を以下のとおり夫々４連で調製した。
　血清サンプルＡ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１００ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ラット血清１０μＬ
　血清サンプルＢ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１０ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ラット血清１０μＬ
　血清サンプルＣ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ラット血清１０μＬ
　血清サンプルＤ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ラット血清１０μＬ（ネガティブコントロール液）
上記に調製した血清サンプルＡ~Ｄについて、以下に示す処理１または処理２を夫々２連でおこなった。
処理１：
血清サンプル２０μＬと、緩衝液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＤＴＴ，１０００ｍＭ　ＮａＣｌ）を４μＬと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を４０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間保温し、４℃で１０分間保温した後、室温に戻した。９１００ｇで１０分間遠心してから上清を回収した。
処理２：
血清サンプル２０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９），１００ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２，５ｍＭ　ＤＴＴ，６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ）を４μＬと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を４０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間保温し、４℃で１０分間保温した後、室温に戻した。９１００ｇで１０分間遠心してから上清を回収した。
上記の処理１または処理２により調製した溶液を２０μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを４Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ）５μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとしたものを夫々調製した。当該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された、配列番号３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域（Ｚ、配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ４５８１１０に示される塩基番号１７８−２６２に相当する領域）を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性により結合する配列番号１０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性により結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．２ｐｍｏｌ／μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　上記で得た反応液を３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（すなわち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間保温し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ、＃１１６４５６９２００１、Ｒｏｃｈｅ社）に移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μｌの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図７および図８に示した。処理１では、ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１００ｎｇ）、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１０ｎｇ）、および溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が濃度依存的に増加した（図７）。いっぽう処理２では、ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１００ｎｇ）において、溶液Ｄ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が増加したが、溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１０ｎｇ）および溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１ｎｇ）において、蛍光強度の増加は見られなかった。
　本実施例において、メチルシトシン抗体と、メチル化オリゴヌクレオチドと、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、血清中ヒトゲノムＤＮＡが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理２に比べて処理１では血清中ヒトゲノムＤＮＡが感度よく検出された。
実施例８
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ、＃６３６４０１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＴＥバッファー溶液とコージンバイオ社より購入したヒト血清（個体別Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ）の混合液を以下のとおり夫々４連で調製した。
　血清サンプルＡ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１０ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ヒト血清４０μＬ
　血清サンプルＢ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ヒト血清４０μＬ
　血清サンプルＣ：ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ／１０μＬ　ＴＥバッファー溶液＋ヒト血清４０μＬ（ネガティブコントロール液）
上記に調製した血清サンプルＡ~Ｃについて、以下に示す処理１または処理２を夫々２連でおこなった。
処理１：
血清サンプル５０μＬと、緩衝液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＤＴＴ，１０００ｍＭ　ＮａＣｌ）を２０μＬと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、９５℃で１０分間保温し、４℃で１０分間保温した後、室温に戻した。９１００ｇで１０分間遠心してから上清を回収した。
処理２：
血清サンプル５０μＬと、緩衝液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＤＴＴ，１０００ｍＭ　ＮａＣｌ）を１０μＬと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、９５℃で１０分間保温し、４℃で１０分間保温した後、室温に戻した。９１００ｇで１０分間遠心してから上清を回収した。
　上記の処理１または処理２により調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを２Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ）５μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとしたものを調製した。当該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された、配列番号３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域（Ｚ、配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ４５８１１０に示される塩基番号１７８−２６２に相当する領域）を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性により結合する配列番号１０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
また目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性により結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．２ｐｍｏｌ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
上記で得た反応液を３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（すなわち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間保温し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ、＃１１６４５６９２００１、Ｒｏｃｈｅ社）に移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　結果を図９および図１０に示した。処理１および処理２のいずれでも、ヒト血液由来ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１０ｎｇ）および溶液Ｂ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　１ｎｇ）において、溶液Ｃ（ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ　０ｎｇ：コントロール溶液）に比べて蛍光強度が濃度依存的に増加した。
　本実施例において、メチルシトシン抗体と、メチル化オリゴヌクレオチドと、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、血清中ヒトゲノムＤＮＡが感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理２に比べて処理１では血清中ヒトゲノムＤＮＡが感度よく検出された。
実施例９
血清サンプルとして、以下に示すヒト血清を用いた。
コージンバイオ社より購入したヒト血清（個体別　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ）
Ｌｏｔ　Ｎｏ．：
Ｎ５１４３８（健常者）
Ｎ５１４３９（健常者）
Ｎ５１４４１（健常者）
ＰｒｏＭｅｄＤｘ社より購入したヒト血清（個体別　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ）
Ｌｏｔ　Ｎｏ．：
１１１７１２６８（健常者、５６歳、男性）
１１１７１２９２（健常者、６２歳、男性）
１１１７１２９７（健常者、６７歳、男性）
１１１７１３１４（健常者、７５歳、男性）
１１１７１３２７（健常者、７０歳、男性）
１１２０２５１０（健常者、６７歳、女性）
１１２０２５２２（健常者、６４歳、女性）
１１２０２５２７（健常者、５２歳、女性）
１１２０２６１５（健常者、７５歳、女性）
１１２０２６１８（健常者、７８歳、女性）
１０９５８８８６（健常者、５６歳、男性）
１０９５８９７９（健常者、３９歳、男性）
１０９５８９８０（健常者、４５歳、男性）
１０９６０２６８（健常者、３７歳、男性）
１０９６０２７２（健常者、５０歳、男性）
１０９６０２７６（健常者、３０歳、男性）
１０９６０２８５（健常者、３９歳、男性）
１１００３４５７（健常者、３８歳、男性）
１１００３４７９（健常者、５１歳、男性）
１１００３４８０（健常者、４８歳、男性）
１１３２４９９７（健常者、５９歳、男性）
１１３２５００１（健常者、６１歳、男性）
１０３２５０２２（健常者、６１歳、男性）
１１３２５０３２（健常者、６０歳、男性）
１１３２５０６２（健常者、６９歳、男性）
１０８７０６２３（乳がん患者、３３歳、女性）
１０９２９５２１（乳がん患者、５５歳、女性）
１０９８９６４４（乳がん患者、４５歳、女性）
１１２０９４３０（乳がん患者、８０歳、女性）
１０９２９５１４（乳がん患者、５７歳、女性）
１０８４３０５５（乳がん患者、５９歳、女性）
１０９８４６８０（乳がん患者、６４歳、女性）
１１２０９４２８（乳がん患者、５５歳、女性）
１０８４０４１４（肺がん患者、５４歳、女性）
１０９２９５０６（肺がん患者、５５歳、男性）
１１０９１９５５（肺がん患者、７６歳、女性）
１１１０３３４６（肺がん患者、６６歳、女性）
１１１４２３２２（肺がん患者、６２歳、女性）
１１１５２５６４（肺がん患者、６７歳、男性）
１１１５２５７１（肺がん患者、６７歳、男性）
１１１５３１９８（肺がん患者、６９歳、女性）
１１２０９４３５（肺がん患者、６１歳、男性）
１１２３０６２１（肺がん患者、７１歳、女性）
１１１５３１９２（肺がん患者、５９歳、男性）
１０７１５９４２（肺がん患者、６４歳、男性）
１０８４０４２２（肺がん患者、７８歳、女性）
１０９３５５４７（前立腺がん患者、８３歳、男性）
１１０００２４３（前立腺がん患者、７８歳、男性）
１１０７１２２６（前立腺がん患者、８４歳、男性）
上記の血清サンプルについて、以下に示す処理をおこなった。
　血清サンプル２０μＬと、緩衝液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＤＴＴ，１０００ｍＭ　ＮａＣｌ）を４μＬと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を４０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間保温し、４℃で１０分間保温した後、室温に戻した。９１００ｇで１０分間遠心してから上清を回収した。
　上記の処理により調製した夫々の溶液を２０μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを２Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ）５μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとしたものを調製した。当該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された、配列番号３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域（Ｚ、配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ４５８１１０に示される塩基番号１７８−２６２に相当する領域）を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性により結合する配列番号１０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、０．２ｐｍｏＬ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　目的とするＤＮＡ領域Ｚを検出するための、目的とするＤＮＡ領域Ｚと相補性により結合する検出オリゴヌクレオチドとして、メチルシトシン抗体が１２箇所結合可能な配列番号１１で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ４を合成し、０．２ｐｍｏｌ／１０μＬのＴＥバッファー溶液を調製した。
＜メチル化オリゴヌクレオチド＞　Ｎはメチル化シトシンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　上記で得た反応液を３０μＬと、特定オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、検出オリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　ｐＨ７．９、６６０ｍＭ　ＫＯＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ２、５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を１０μＬと、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、また同時に目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる（すなわち、目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体を形成させる）ために、上記混合液を９５℃で１０分間保温し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
　得られた反応液１００μＬをストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ、＃１１６４５６９２００１、Ｒｏｃｈｅ社）に移し、約３０分間、室温で放置し、８ウェルストリップに目的とするＤＮＡ領域と特定オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドからなる検出複合体をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　各ウェルにメチルシトシン抗体［Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ社製、０．５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を１００μＬを添加し、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２００μＬで３回洗浄した。
　その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、０．０５μｇ／ｍＬ　０．１％　ＢＳＡ含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）溶液］を各ウェルに１００μＬの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー［０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸バッファー（１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ・７Ｈ２Ｏ、１５４ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．４）］２０μＬで３回洗浄した。
　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を各ウェルに１５０μＬの割合で添加、混合し、約５分間室温で振盪した。その後、励起３４０ｎｍ／蛍光６１２ｎｍで蛍光を測定した。
　上記の酵素処理（ＭｓｐＩ処理）により得られた溶液中のＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより定量した。
　濃度測定用スタンダードサンプルとしてＭｓｐＩ処理ヒトゲノムＤＮＡ溶液を以下のとおり調製した。ヒト血液由来ゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ、＃６３６４０１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の５ｎｇ／μＬ　ＴＥバッファー溶液を調製し、この溶液を２０μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを２Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ）５μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとしたものを夫々の処理について調製した。当該反応液を、３７℃にて１時間インキュベーションした。得られた反応液について、ＴＥバッファーによる希釈により、１０−５、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１、１、１０ｎｇ／５μＬ溶液を調製した。
　ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された目的とするＤＮＡ領域（Ｚ、配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ４５８１１０に示される塩基番号１７８−２６２に相当する領域）を増幅してリアルタイムＰＣＲで定量するためにフォワードプライマー（Ｆ）およびリバースプライマー（Ｒ）を設計した。
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
＜フォワードプライマー＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
＜リバースプライマー＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　ＰＣＲの反応液としては、鋳型とする上記に調製したＭｓｐＩ処理ヒトゲノムＤＮＡ溶液５μＬあるいは上記に調製した濃度測定用スタンダードサンプルと、配列番号１６および配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーの５μＭ溶液をそれぞれ１．５μＬと、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（Ｌｏｎｚａ社）を０．１ｘ分と、ｅａｃｈ　２ｍＭ　ｄＮＴＰを２．５μＬと、１０ｘＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％　Ｇｅｌａｔｉｎ）を２．５μＬと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ，５Ｕ／μＬ，ＡＢＩ社）を０．１２５μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μＬとしたものを用いた。リアルタイムＰＣＲは、Ｍｘ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて実施した。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間、６１℃にて３０秒間、７２℃にて４５秒間を１サイクルとして４０サイクル繰り返すことにより、目的とするＤＮＡ領域を増幅した。当該リアルタイムＰＣＲの結果により、血清サンプル中のＤＮＡを定量した。
　結果を図１１および図１２に示した。本手法による測定値と、リアルタイムＰＣＲにより定量した値を比較したところ、相関があることが示された（相関係数：Ｒ＝０．８８）（図１１）。また、５９歳以下のヒト血清サンプルについて定量した結果を、がん患者と健常者で比較したところ、がん患者では血清中ＤＮＡ濃度が上昇していることが示された（図１２）。
　本発明により、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを簡便に定量又は検出する方法等を提供することができる。
配列番号４
　固定化のために設計されたビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号５
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号６
　固定化のために設計されたビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号７
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号８
　固定化のために設計されたビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号９
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０
　固定化のために設計されたビオチン化オリゴヌクレオチド
配列番号１１
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１４
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１５
　設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１６
　増幅のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１７
　増幅のために設計されたオリゴヌクレオチド

Claims (18)

  1. 検体中に含まれる、ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
    （１）ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである被検オリゴヌクレオチドを含有する検体を調製する第一工程、
    （２）第一工程で調製された検体中に含有される被検オリゴヌクレオチドと、該被検オリゴヌクレオチドと相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドと、
    該被検オリゴヌクレオチドに相補的に結合し得る特定オリゴヌクレオチドと、
    該特定オリゴヌクレオチドに結合し得る支持体と、を混合させて、
    該被検オリゴヌクレオチドと該検出オリゴヌクレオチドと該特定オリゴヌクレオチドと該支持体とから成る検出複合体を形成させる第二工程、及び
    （３）第二工程で形成した検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により検出することにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第三工程、
    を有することを特徴とする方法。
  2. 検出オリゴヌクレオチドが、メチル化部位を複数含む、複数のオリゴヌクレオチドからなる複合検出オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
  3. 検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、検出オリゴヌクレオチドのメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体の識別機能である請求項１又は２に記載の方法。
  4. ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列又はその一部からなる請求項１~３のいずれかに記載の方法。
  5. ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ゲノム中の重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列又はその一部からなるＤＮＡである請求項１~３のいずれかに記載の方法。
  6. ゲノム中に複数存在する目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＬＩＮＥ又はＡｌｕ配列に分類される塩基配列からなるＤＮＡである請求項１~３のいずれかに記載の方法。
  7. ゲノム中の反復配列を構成する塩基配列が以下に示されるいずれかの塩基配列からなる請求項４に記載の方法：
    （１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２）配列番号２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
    （３）配列番号３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
  8. 検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する請求項１~７のいずれかに記載の方法：
    （１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
    （２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
  9. 特定オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列を有する請求項１~７のいずれかに記載の方法：
    （１）配列番号１で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２）配列番号１で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （３）配列番号２で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （４）配列番号２で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （５）配列番号３で示される塩基配列の部分配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （６）配列番号３で示される塩基配列の部分配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （７）配列番号４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （８）配列番号４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （９）配列番号６で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１０）配列番号６で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１１）配列番号８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１２）配列番号８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１３）配列番号１０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１４）配列番号１０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１５）配列番号１２で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１６）配列番号１２で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１７）配列番号１３で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１８）配列番号１３で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （１９）配列番号１４で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２０）配列番号１４で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、
    （２１）配列番号１５で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は
    （２２）配列番号１５で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
  10. 検出オリゴヌクレオチドがメチル化シトシンを含むメチル化オリゴヌクレオチドである請求項１~９のいずれかに記載の方法。
  11. 検出オリゴヌクレオチドの識別機能がメチルシトシンの検出、メチル化ＤＮＡ抗体による検出、又はメチルシトシン抗体による検出である請求項１~１０のいずれかに記載の方法。
  12. 検体が、下記のいずれかの検体である請求項１~１１のいずれかに記載の方法：
    （ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、
    （ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ、
    （ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、
    （ｄ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、または
    （ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ。
  13. 目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ生物由来検体が、下記のいずれかの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである請求項１~１２のいずれかに記載の方法：
    （ａ）目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ、
    （ｂ）予め精製されてなる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ、
    （ｃ）血液中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡ、
    （ｄ）微生物ゲノム由来の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ、または
    （ｅ）ＲＮＡから逆転写酵素によって生成された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ。
  14. 第一工程において検体であるＤＮＡを調製するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以上１０００ｍＭ以下である請求項１~１３のいずれかに記載の方法。
  15. 第一工程において検体であるＤＮＡを調製するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以上２００ｍＭ以下である請求項１~１３のいずれかに記載の方法。
  16. 癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１~１５のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
  17. 検体が、哺乳動物由来の血清である請求項１６に記載の方法。
  18. 目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである請求項１６~１７のいずれかに記載の方法。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130115616A1 (en) * 2010-07-15 2013-05-09 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Detection of nucleic acids by agglutination
JP6095058B2 (ja) * 2013-03-14 2017-03-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 メチルシトシン検出法
JP2016512698A (ja) * 2013-03-15 2016-05-09 イムコア ジーティーアイ ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 尿中セルフリーｄｎａを用いて腎状態を評価するための方法および組成物
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
EP2970986B1 (en) 2013-03-15 2020-05-06 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
DE212013000295U1 (de) 2013-05-06 2016-02-02 Hitachi Chemical Co. America, Ltd. Vorrichtungen zum Einfangen von Zielmolekülen
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
WO2015070083A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
US10266895B2 (en) 2014-11-05 2019-04-23 Hitachi Chemical Company Ltd. Exosomes and microvesicles in intestinal luminal fluids and stool and use of same for the assessment of inflammatory bowel disease
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
DE112016003948T5 (de) 2015-08-31 2018-05-09 City Of Sapporo Molekulare verfahren zum beurteilen einer urothelialen erkrankung
US11781173B2 (en) * 2017-04-19 2023-10-10 Albert Einstein College Of Medicine RNA tagging system for visualization of single mRNA molecules
KR102179034B1 (ko) * 2018-06-29 2020-11-16 연세대학교 산학협력단 세포 내재 반복 서열을 대상으로 탈아미노효소를 이용한 세포 바코딩 기술 개발
CN111855990B (zh) * 2019-04-29 2023-06-27 华南师范大学 一种基于CRISPR/Cas***的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用
WO2024048659A1 (ja) * 2022-08-30 2024-03-07 国立大学法人秋田大学 ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセット、ヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法、及び腎細胞癌又は前立腺癌の有無の予測を補助する方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06311899A (ja) * 1993-04-16 1994-11-08 Becton Dickinson & Co 核酸分析法
WO1998018959A1 (fr) * 1996-10-30 1998-05-07 Institut Pasteur Procede de diagnostic de maladies genetiques par peignage moleculaire et coffret de diagnostic

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0678499A (ja) * 1992-08-21 1994-03-18 Tokyo Electric Co Ltd 回転電機用整流子
US20040009506A1 (en) * 2002-03-29 2004-01-15 Genentech, Inc. Methods and compositions for detection and quantitation of nucleic acid analytes
AU2003900368A0 (en) * 2003-01-24 2003-02-13 Human Genetic Signatures Pty Ltd Assay for nucleic acid molecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06311899A (ja) * 1993-04-16 1994-11-08 Becton Dickinson & Co 核酸分析法
WO1998018959A1 (fr) * 1996-10-30 1998-05-07 Institut Pasteur Procede de diagnostic de maladies genetiques par peignage moleculaire et coffret de diagnostic

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Methods in Yeast Genetics", COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Molecular Cloning -A Laboratory Manual", COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ENVIRON. MOL. MUTAGEN., vol. 18, no. 4, 1991, pages 259 - 262
J. AM. CHEM. SOC., vol. 129, 2007, pages 5612 - 5620
J. CATARACT. REFRACT. SURG., vol. 33, no. 4, 2007, pages 635 - 641
PARKKINEEN S. ET AL.: "Detection of human papillomavirus DNA by the nucleic acid sandwich hybridization method from cervical scraping", J. MED. VIROL., vol. 20, no. 3, November 1986 (1986-11-01), pages 279 - 288, XP008144264 *
RAUTIO J. ET AL.: "Sandwich hybridisation assay for quantitative detection of yeast RNAs in crude cell lysates", MICROB. CELL FACT., vol. 2, no. 1, 28 April 2003 (2003-04-28), pages 4 - 12, XP021017768 *
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