JP6445422B2 - ゼブラフィッシュ割球細胞培養物における高スループット画像ベース化学スクリーニング - Google Patents

ゼブラフィッシュ割球細胞培養物における高スループット画像ベース化学スクリーニング Download PDF

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Description

関連出願
本願は、35 U.S.C. §119(e)に基づき、2012年3月14日に出願された米国仮出願第61/610,668号および2012年10月31日に出願された米国仮出願第61/720,713号の恩典を主張し、その両方の内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
政府の支援
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された助成金第5P30 DK49216-19号、同第5R01CA103846-10号、同第DP2OD004345号および同第DK31036号の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有している。
技術分野
本開示は、概して、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導するための組成物および方法ならびにそれらの使用に関する。より具体的に、本開示は、人工多能性幹細胞（iPSC）および胚性幹細胞（ESC）から筋原細胞への分化を誘導する組成物および方法に関する。本開示はまた、衛星細胞の増殖を誘導する方法およびその使用を提供する。本開示はまた、臓器発生のモジュレーターをアッセイするためのスクリーニングアッセイを提供する。
背景
骨格筋は、制御された定向性の様式で力を発生させるよう収縮する非***性、多核性の筋線維から構成される高度に専門化された組織である。骨格筋は、胚形成時に、筋節として知られる胚の領域で見られる筋前駆細胞のサブセットから形成される。分化した筋線維を生成することに加えて、これらの細胞はまた、生涯を通じて筋線維に付随した状態で維持され筋肉の成長および修復を担う、衛星細胞として知られている専門化された筋形成性幹細胞を生成する（Gros et al., 2006; Seale et al., 2000）。受傷によって誘導される衛星細胞の増殖は、衛星細胞のプールを補充し、かつ既存の筋線維と相互融合して筋組織を再生する分化した筋芽細胞を生成する。
衛星細胞は、解剖学的には、それらが筋線維の基底膜下に局在することによって（Mauro, 1961）、そして分子的には、それらがペアードボックス転写因子Pax7を発現することによって（Seale et al., 2000）定義される。安静時の筋肉では、衛星細胞は大部分が休眠状態で維持されるが、筋肉の損傷に応じて、これらの細胞は活性化状態となり、これはそれらのMyoDの上方調節によって示される現象であり、そして細胞周期に入る（Seale et al., 2000）。動物モデルにおける移植ベースの研究は、罹患した筋肉の再生における生着された衛星細胞の有用性を実証し（Cerletti et al., 2008; Sherwood et al., 2004）、マウスおよびヒト筋肉の分析は、加齢によるそれらの喪失が加齢に伴う筋力低下に寄与することを示している（Cerletti., 2012）。したがって、筋衛星細胞は、細胞の置換または内因性修復機構の活性化のいずれかに関係する細胞治療の有力な標的である。しかし、この可能性の実現は、成体骨格筋から単離することができる衛星細胞の少なさおよびそれらのエクスビボ拡大培養を支援する方法の欠如により妨げられている。
衛星細胞とは対象的に、胚性幹細胞（ESC）およびより最近のiPSCは、培養下で無限の増殖性を有しており、理論上、筋原細胞を含む分化細胞型を無制限に供給することができる。その大部分が遺伝子操作および細胞選別アプローチを通じたものであるものの（Barberi et al., 2007; Darabi et al., 2008; Mizuno et al., 2010; Zheng et al., 2006）、ESC/iPSCを筋形成分化に向かわせることはいくつか成功しているが、ヒトまたはマウス多能性細胞から十分に分化した筋細胞を生成することは、非常に困難であることが分かっている。したがって、この幹細胞アプローチまたは筋肉の生物学および再生の可能性を実現するために、これらの細胞の筋形成特異化（myogenic specification）を調節する分子経路を解明することおよびエクスビボシステムでそれらを強固かつ選択的に分化させることができるシステムを開発することが必須である。
要旨
本開示は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含む幹細胞の分化に関する。より具体的には、本開示は、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導する方法に関する。
1つの局面において、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導する方法であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む培地中で細胞を培養する工程を含む方法、が提供される。
幹細胞を、筋原細胞を生じることができる多分化能性幹細胞に変換する方法であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つの存在下で幹細胞を培養する工程を含む方法、もまた提供される。
別の局面において、本発明は、筋原細胞へのさらなる分化のために幹細胞を前処置する方法であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つの存在下で細胞を培養する工程を含む方法、を提供する。
1つの態様において、筋原細胞は、骨格筋形成系譜の細胞である。
1つの態様において、筋原細胞は、最終分化した骨格筋細胞である。
さらなる局面において、本開示は、本明細書に開示される方法にしたがい調製された筋原細胞を提供する。1つの態様において、筋原細胞は、筋肉量を増加させるためまたは筋疾患を予防もしくは処置するために対象に移植するためのものであり、幹細胞は、植え込み前に、幹細胞を筋原細胞に変換（すなわち、形質転換／分化）させるために、本明細書に開示される方法にしたがう分化処置に供される。本発明はまた、筋原細胞を対象に移植する方法であって、本明細書に開示される方法にしたがい調製された筋原細胞を対象に植え込む工程を含む方法、に関する。
別の局面において、本開示は、対象において筋肉量を増加させるまたは筋疾患を予防もしくは処置する方法であって、本明細書に開示される方法にしたがい調製された筋原細胞を対象に植え込む工程を含む方法、を提供する。
別の局面において、本開示は、対象への移植のための、本明細書に開示される方法にしたがい調製された筋原細胞の使用を提供する。
別の局面において、本開示は、対象において筋肉量を増加させるためまたは筋疾患を予防もしくは処置するための、本明細書に開示される方法にしたがい調製された筋原細胞の使用を提供する。
1つの局面において、衛星細胞の増殖を増加させる方法であって、3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物の存在下で衛星細胞を培養する工程を含む方法、が提供される。
さらなる局面において、本開示は、本明細書に開示される方法にしたがい調製された衛星細胞を提供する。1つの態様において、衛星細胞は、筋肉量を増加させるためまたは筋疾患を予防もしくは処置するために対象に植え込むためのものであり、衛星細胞は、植え込み前に、変換（すなわち、形質転換／分化）させるために、本明細書に開示される方法にしたがう増殖処置に供される。本発明はまた、衛星細胞を対象に移植する方法であって、本明細書に開示される方法にしたがい調製された衛星細胞を対象に植え込む工程を含む方法、に関する。
別の局面において、本開示は、対象において筋肉量を増加させるまたは筋疾患を予防もしくは処置する方法であって、本明細書に開示される方法にしたがい調製された衛星細胞を対象に植え込む工程を含む方法、を提供する。
別の局面において、本開示は、対象に移植するための、本明細書に開示される方法にしたがい調製された衛星細胞の使用を提供する。
別の局面において、本開示は、対象において筋肉量を増加させるまたは筋疾患を予防もしくは処置するための、本明細書に開示される方法にしたがい調製された衛星細胞の使用を提供する。
別の局面において、本開示は、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導するための組成物であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む組成物、を提供する。
本開示はまた、損傷した筋組織または筋肉量の増加のために対象を処置する方法であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを、それを必要とする対象に共投与する工程を含む方法、を提供する。
1つの局面において、本明細書には、ゼブラフィッシュ割球細胞において化学化合物または組成物をスクリーニングするための方法であって、試験化合物の存在下でゼブラフィッシュ割球細胞の集団を培養する工程であって、割球細胞が、蛍光タンパク質に融合された細胞系譜特異的マーカー（CLSM）（すなわち、CSLM::FPコンストラクト）を含む、工程、およびFPを可視化する工程、を含む方法、が提供される。FPのレベルまたは量の変化は、試験化合物が、その細胞系譜特異的マーカーを発現する臓器の発生を調節することを示す。FPのレベルまたは発現は、参照または対照に対して相対的に決定され得る。
[本発明1001]
幹細胞の筋原細胞への分化を誘導する方法であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つと共に幹細胞を培養する工程を含む、方法。
[本発明1002]
培養する工程が、GSK3経路阻害物質、3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物、およびFGF経路活性化物質の存在下で行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞または多分化能性幹細胞である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
GSK3経路阻害物質が、GSK3β阻害物質である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
GSK3経路阻害物質が、6-ブロモインジルビン-3'-オキシム（BIO）、CHIR98014；CHIR99021；ARA014418；ヒメニアルジシン（hymenialdisine）；フラボピリドール；アロイジンA；アロイジンB；CT20026；SU9516；スタウロスポリン；GF109203x；RO318220；SB216763；SB415286；I5；CGP60474；ケンパウロン（9-ブロモパウロン）；アルスターパウロン；2-シアノエチル-アルスターパウロン；1-アザ-アルスターパウロン；1-アザ-ケンパウロン；9-シアノ-2,3-ジメトキシパウロン；2-ヨードパウロン；2-ブロモ-9-ニトロパウロン；2,3-ジメトキシ-9-ニトロパウロン；7-ブロモ-5-(4-ニトロフェニルヒドラゾノ)-4,5-ジヒドロ-1-H-[1]ベンゾアゼピン2(3H)-オン；7,8-ジメトキシ-5-(4-ニトロフェニルヒドラゾノ)-4,5ジヒドロ-1H-[1]ベンゾアゼピン-2-(3H)-オン；9-シアノパウロン；9-クロロパウロン；9-トリフルオロメチルパウロン；2,3-ジメトキシ-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-メチルオキシカルボニルメチルパウロン；9-フルオロパウロン；9-ブロモ-2,3-ジメトキシパウロン；9-ブロモ-2,3-ジメトキシパウロン；9-メチルパウロン；10-ブロモパウロン；2-ブロモパウロン；11-クロロパウロン；2-(3-ヒドロキシ-1-プロピニル)-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-(2-ヒドロキシエチル)-パウロン；ケンパウロン；アルスターパウロン；2-シアノエチル-アルスターパウロン；1-アザ-ケンパウロン；1-アザ-アルスターパウロン；9-ブロモ-12-メチルパウロン；9-ブロモ-5-(メチルオキシカルボニルメチル)パウロン；11-メチルパウロン；パウロン；11-エチルパウロン；9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-6-(ヒドロキシアミノ)-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン；2,9-ジブロモパウロン；11-ブロモパウロン；2,3-ジメトキシパウロン；9-ブロモ-7,12ジヒドロ-6-メチルチオ-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン；(E)-2(3-オキソ-1-ブテニル)-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12エチルパウロン；9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン-6(5H)-チオン；2-ブロモ-9-トリフルオロメチルパウロン；2-[2-(1-ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]-9-トリフルオロメチル-パウロン；9-ブロモ-5メチルパウロン；9-メトキシパウロン；2-ヨード-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；9-ブロモ-12-(2-プロペニル)パウロン；9-ブロモ-4-ヒドロキシパウロン；8,10-ジクロロパウロン；5-ベンジル-9-ブロモパウロン；9-ブロモ-4-メトキシパウロン；9-ブロモ-5-エチルパウロン；9-ブロモ-5,7ビス-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；4-メトキシパウロン；9-ブロモ-5,6,7,12-テトラヒドロベンゾ[6-7]シクロヘプト[1,2.b]インドール；2-フェニル-4-(2-チエニル)-5H-ピリド[2-3d][1]ベンゾアゼピン-6(7H)-チオン；9-ブロモ-5,7,12-トリ-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；9-ブロモ-5,12-ビス-(tert-ブチルオキシカルボニル)パウロン；4-(4-クロロフェニル)-2-(2-ナフチル)-5H-ピリド[23-d][1]ベンゾアゼピン-6(7H)-チオン；5,6,7,12-テトラヒドロベンゾ[6-7]シクロヘプト[1,2-b]インドール；N-ブチル-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ペンタンアミド；1-{4-アミノ-2-[(4-メトキシフェニル)アミノ]-1,3-チアゾール-5-イル}エタノン；N-ベンジル-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；3-(4-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)プロパンアミド；4-(4-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ブタンアミド；2-(3-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2イル)アセトアミド；2-(4-フルオロフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)プロパンアミド；2-(3-メチルフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)アセトアミド；1-ベンジル-3-ナフタレン-1-イル-ウレアまたは1-ベンジル[1,3]ジオキソール-5-イル-3-ベンジル-ウレア；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
GSK3経路阻害物質の濃度が、約0.05μM〜約50μMである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物が、アデニリルシクラーゼの活性化物質である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物が、フォルスコリン；フォルスコリン誘導体およびアナログ；cAMPの非加水分解性アナログ；イソプロテレノール（isoprotenol）；血管作動性腸管ペプチド；カルシウムイオノフォア；膜脱分極；cAMPを刺激するマクロファージ由来因子；マクロファージの活性化を刺激する作用物質；ホスホジエステラーゼ阻害物質；下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（PACAP）；コレラ毒素；プロスタグランジン化合物；ベータ2-アドレナリン受容体アゴニスト；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物の濃度が、約0.1μM〜約500μMである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
FGF経路活性物質が、ホスファチジルイノシチド 3-キナーゼ（PI3K）PI3K活性化物質である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
FGF経路活性化物質が、線維芽細胞成長因子（bFGF、FGF2またはFGF-β）；TGFα；TGFβ；EGF；NGF；Akt活性化物質；ニコチン；カルバコール；4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン（NNK）；アドレノメデュリン；リゾホスファチジン酸；血小板活性化因子；マクロファージ刺激因子；スフィンゴシン-1-リン酸；インスリンおよびインスリン成長因子-1；血小板由来成長因子；ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1000のいずれかの方法。
[本発明1012]
FGF経路活性化物質の濃度が、約0.25 ng/ml〜約100 ng/mlである、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
GSK3経路阻害物質がBIOであり、3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物がフォルスコリンであり、かつFGF経路活性化物質がbFGFである、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
筋原細胞が、骨格筋形成系譜の細胞である、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
筋原細胞が、Pax3、Pax7、MyoD、Myf5、ミオゲニン、GATA2、MHCおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞マーカーを発現する、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
筋原細胞が、中胚葉細胞である、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
接触の前に幹細胞から胚様体を形成する工程をさらに含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
接触が、少なくとも1日間行われる、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
幹細胞が、損傷した筋組織または筋肉量の増加の処置を必要とする対象由来である、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
損傷した筋組織が、身体的受傷または事故、疾患、感染、酷使、血液循環の喪失または筋萎縮もしくは筋消耗の結果である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
本発明1001〜1020のいずれかの方法にしたがい生成される筋原細胞。
[本発明1022]
本発明1001〜1020のいずれかの方法のいずれかにしたがい生成される筋原細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
[本発明1023]
（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む、組成物。
[本発明1024]
GSK3経路阻害物質、3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物およびFGF経路活性化物質を含む、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
幹細胞をさらに含む、本発明1023または1024の組成物。
[本発明1026]
（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）bFGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む、細胞培養培地。
[本発明1027]
GSK3経路阻害物質、3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物およびFGF経路活性化物質を含む、本発明1026の細胞培養培地。
[本発明1028]
多能性幹細胞をさらに含む、本発明1006または1027の細胞培養培地。
[本発明1029]
（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む、多能性細胞から骨格筋前駆細胞への分化を誘導するための試薬キット。
[本発明1030]
GSK3経路阻害物質、3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物およびFGF経路活性化物質を含む、本発明1029のキット。
[本発明1031]
幹細胞をさらに含む、本発明1029または1030のキット。
[本発明1032]
3',5'-環状アデノシン一リン酸の細胞内レベルを増加させる化合物の存在下で衛星細胞を培養する工程を含む、衛星細胞の増殖を増加させる方法。
[本発明1033]
該化合物がアデニリルシクラーゼの活性化物質である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
該化合物が、フォルスコリン；フォルスコリン誘導体およびアナログ；cAMPの非加水分解性アナログ；イソプロテレノール；血管作動性腸管ペプチド；カルシウムイオノフォア；膜脱分極；cAMPを刺激するマクロファージ由来因子；マクロファージの活性化を刺激する作用物質；ホスホジエステラーゼ阻害物質；下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（PACAP）；コレラ毒素；プロスタグランジン化合物；ベータ2-アドレナリン受容体アゴニスト；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1032または1033の方法。
[本発明1035]
該化合物の濃度が、約0.01nM〜約100μMである、本発明1032〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
接触が少なくとも1日間である、本発明1032〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
衛星細胞が、損傷した筋組織または筋肉量の増加の処置を必要とする対象由来である、本発明1032〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
損傷した筋組織が、身体的受傷または事故、疾患、感染、酷使、血液循環の喪失または筋萎縮もしくは筋消耗の結果である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
本発明1032〜1038のいずれかの方法により生成される衛星細胞。
[本発明1040]
本発明1032〜1038のいずれかの方法により生成される衛星細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
[本発明1041]
本発明1032〜1038のいずれかの方法にしたがい生成される衛星細胞を対象に植え込む工程を含む、対象に衛星細胞を移植する方法。
[本発明1042]
本発明1001〜1020のいずれかの方法にしたがい生成される筋原細胞を対象に植え込む工程を含む、対象に筋原細胞を移植する方法。
[本発明1043]
対象が、損傷した筋組織または筋肉量の増加の処置を必要としている、本発明1041または1042の方法。
[本発明1044]
損傷した筋組織または筋肉量の増加のために対象を処置する方法であって、それを必要とする対象に、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを共投与する工程を含む、方法。
[本発明1045]
スクリーニングアッセイであって、試験化合物の存在下で割球を培養する工程であって、割球がレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子が細胞系譜特異的マーカーをコードしておりかつ発現されたときに検出可能なシグナルを生成する、工程；および検出可能なシグナルを測定／検出する工程であって、検出可能なシグナルのレベルまたは量の変化が、試験化合物が細胞系譜特異的マーカーを発現する細胞系譜の発生または機能を調整することを示す、工程、を含む、スクリーニングアッセイ。
[本発明1046]
レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質に融合された細胞系譜特異的マーカーを含む融合タンパク質をコードする、本発明1045のスクリーニングアッセイ。
[本発明1047]
割球が2つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が異なる細胞系譜特異的マーカーをコードしておりかつ発現されたときに検出可能なシグナルを生成する、本発明1045または1046のスクリーニングアッセイ。
[本発明1048]
割球が、ゼブラフィッシュの割球である、本発明1045〜1047のいずれかのスクリーニングアッセイ。
[本発明1049]
試験化合物が、有機または無機低分子；サッカリン；オリゴ糖；多糖；ペプチド；タンパク質；ペプチドアナログおよび誘導体；ペプチド模倣体；核酸；核酸アナログおよび誘導体；生物材料から得られる抽出物；動物組織；天然に存在するまたは合成性の組成物；ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1045〜1048のいずれかのスクリーニングアッセイ。
[本発明1050]
試験化合物が、0.01nm〜約10mMの最終濃度でインキュベートされる、本発明1045〜1049のいずれかのスクリーニングアッセイ。
[本発明1051]
高スループットスクリーニング（HTS）アッセイである、本発明1045〜1040のいずれかのスクリーニングアッセイ。
[本発明1052]
本発明1045〜1051のいずれかのスクリーニングアッセイによって選択される化合物。
図1A〜1Eは、骨格筋発生の調整物質を同定するための化学遺伝的スクリーニングを示している。図1Aは、myf5-GFP;mylz2-mCherryの2重トランスジェニック発現が、それぞれの遺伝子の内因的発現を再現することを示している。myf5-GFPは、新たに形成される体節において11体節期に最初に検出される。2重トランスジェニック胚の卵黄は、mCherry陽性であるが、これはおそらくmCherryタンパク質の母体への堆積によるものである。mylz2-mCherry発現は、32hpfまで観察されない。その発現は、前方体節で最初に検出され、その後に後方体節に徐々に広がっていく。図1Bは、myf5-GFP;mylz2-mCherry胚を楕円期（oblong stage）で解体し、bFGFを含むまたは含まないzESC培地中で培養したことを示している。画像は、プレーティングの48時間後に撮影した。スケールバーは、250μMを表している。図1Cは、定量RT-PCRによって測定された筋形成遺伝子の発現を示している。myf5-GFP;mylz2-mCherry胚由来の割球細胞を、bFGF存在下または非存在下で培養し、そして24時間で収集した。bFGF処置細胞の結果が、未処置細胞の発現に対して正規化されている。エラーバーは、3つ組の定量RT-PCR反応からの標準偏差（SD）を表している。すべての実験が、β-アクチンに対して正規化されている。図1Dは、定量RT-PCRによって測定された筋形成遺伝子の発現を示している。myf5-GFP;mylz2-mCherry胚由来の割球細胞をbFGF存在下で培養し、そして24時間で収集した。異なる集団をFACSによって単離した。結果が、2重陰性集団の細胞の発現に対して正規化されている。エラーバーは、3つ組の定量RT-PCR反応からの標準偏差（SD）を表している。すべての実験が、β-アクチンに対して正規化されている。図1Eは、ATRAがインビトロで筋発生をブロックすることを示している。myf5-GFP;mylz2-mCherry胚を楕円期で解体し、bFGFを含むzESC培地中で培養した。0.1％ DMSOまたは100nM ATRAを直ちに添加した。画像は、プレーティングの48時間後に撮影した。スケールバーは、250μMを表している。 図2A〜2Cは、骨格筋発生の調整物質を同定するための化学遺伝的スクリーニングを示している。図2Aは、高スループット画像ベース化学スクリーニングアッセイの概略図である。およそ800個のmyf5-GFP;mylz2-mCherry 2重トランスジェニック胚を回収し、楕円期で解体した。得られた割球細胞を、化学物質を予め添加しておいた4つの384ウェルプレートに等分した。我々は、擬陽性を抑制するために各化学物質につき2つ組で実験を行った。2日後、384ウェルプレートを、Celigoサイトメーターを用いて画像化した。各ウェルにつき、各シグナルチャネルの画像を読み込んだ。GFPおよびmCherryのシグナルを、Celigoサイトメーターのビルトインソフトウェアによって決定し、かつ目視により確認した。図2Bは、調整物質スクリーニングのサンプル画像を示している。ヒットの大部分を3つのカテゴリーにグループ化することができた。カテゴリーIは、myf5-GFP発現のみを示すものであり、例はTCPOBOPおよびCA-074-Meである。この表現型は、おそらく、筋前駆体から成熟筋肉への分化が阻害されることに起因するものである。カテゴリーIIは、両方の蛍光色を少量示すものであり、例はRo 41-1049およびチロホスチンAG 879である。この表現型は、おそらく、筋前駆体拘束がブロックされたことに起因するものである。カテゴリーIIIは、おそらく筋発生の加速に起因して、両マーカーの高発現を示すものである。スケールバーは、250μMを表している。図2Cは、培養培地にbFGFを補充しないスクリーニングにおけるヒットを示している。6個の化学物質が、GFPおよびmCherryのシグナルを増加することが同定された。スケールバーは、250μMを表している。 図3A〜3Fは、フォルスコリン処置がcAMPレベルを上昇させ、健常マウスおよびジストロフィー性マウスの両方由来の衛星細胞の増殖を増加させることを示している。図3A、C57BL/6Jマウス由来の衛星細胞を培養し、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）の非存在下または存在下でDMSOまたはフォルスコリン処置した。5日後に総細胞数を計数し、それをbFGFの非存在下でDMSO処置された細胞に対する変化倍率として示している（平均+/-SEM、n=4）。フォルスコリンは、衛星細胞を、bFGFの非存在下または存在下でDMSO処置された細胞に対してそれぞれ約2または約2.3倍増殖させる。図3Bは、5日間の培養およびフォルスコリン処置の後のmdxマウス由来の衛星細胞数の、DMSO処置衛星細胞に対する変化倍率を示している。フォルスコリンは、mdx衛星細胞を、培養中に約3.6倍増殖させる（平均+/-SEM、n=4）。図3Cは、培養された衛星細胞中のcAMP濃度が25μM、50μMまたは100μMのフォルスコリン処置後に、DMSO処置マウスに対してそれぞれ約4.5、約5.2または約5.7倍増加することを示している（平均+/-SD、n=5）。図3D、衛星細胞をC57BL/6Jマウスから単離し、単一細胞を96ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を6日間培養し、そしてDMSOまたはフォルスコリンで処置した。筋形成コロニーを含むウェル数および各コロニーにおける細胞数を6日後に計数した。図3Eは、衛星細胞のインビトロクローンプレーティング効率が、DMSO処置細胞と比較して、フォルスコリン処置に影響されないことを示している（平均+/-SD、n=4）。図3Fは、フォルスコリン処置が、各ウェルの単一の衛星細胞から生じる筋原細胞の数を増加させることを示しており、したがって細胞増殖を増加させることを示している。★：P＜0.05、★★：P＜0.01（平均+/-SD、n=4） 図4A〜4Fは、フォルスコリン処置衛星細胞が、化合物への暴露のタイミングに関わらず、インビトロで分化不良を示さないことを示している。図4A、C57BL/6Jマウス由来の衛星細胞を、5日間、bFGFの存在下で培養した。衛星細胞のインビトロ分化に対するフォルスコリンの効果を試験するために、細胞を5日目に収集し、等しい数の細胞をフォルスコリンまたはDMSOの存在下で分化するよう誘導した。図4Bは、DMSO（左）またはフォルスコリン（右）の存在下で分化させ、そしてミオシン重鎖（MHC、赤色）および核（青色）に関して染色した衛星細胞の写真を示している。スケールバー：200μm。図4Cは、フォルスコリンまたはDMSOの存在下での衛星細胞の分化後の筋管における核の百分率の定量を示している（平均+/-SEM、n=4）。衛星細胞の分化能は、DMSOと比較して、培地中にフォルスコリンが存在することによって影響されない。図4D、C57BL/6Jマウス由来の衛星細胞をbFGFの存在下で培養し、そして5日間フォルスコリン／DMSO処置した。フォルスコリン処置衛星細胞の分化能を試験するため、細胞を5日目に収集し、等しい数の細胞を化合物の非存在下で分化するよう誘導した。図4Eは、化合物の非存在下で分化させ、そしてMHC（赤色）および核（青色）に関して染色したDMSO（左）またはフォルスコリン（右）処置衛星細胞の写真を示している。スケールバー：200μm。図4Fは、フォルスコリンまたはDMSO処置細胞の分化後の筋管における核の百分率の定量を示している（平均+/-SEM、n=5）。フォルスコリン処置衛星細胞は、DMSO処置細胞と比較して、インビトロでの筋管形成においていかなる欠陥も示さない。 図5A〜5Eは、フォルスコリン処置された培養衛星細胞が新しく単離される衛星細胞の免疫表現型の特徴を保持しており、インビボで骨格筋に生着することを示している。図5Aは、CD45-SCA-1-MAC1-細胞を示す代表的なFACSプロットを示しており、新しく単離された（左パネル）またはDMSO（中央パネル）もしくはフォルスコリン（右パネル）で処置された培養衛星細胞のCXCR4+およびβ-1インテグリン+細胞のゲーティングを示している。図5Bは、DMSOまたはフォルスコリン処置された培養衛星細胞におけるCXCR4+β-1インテグリン+細胞の平均出現率（平均+/-SEM、n=6）をFACSによって定量したことを示している。結果は、DMSOまたはフォルスコリンのいずれかで処置された培養衛星細胞は細胞表面マーカーCXCR4およびβ-1インテグリンの発現を約80％保持していることを示している。図5C、GFP+衛星細胞をβ-アクチンGFPマウスから収集し、これを、単離直後またはDMSOもしくはフォルスコリン処置を含む5日間の培養後のいずれかに、心臓毒の注射によって事前に1日受傷させておいたレシピエントmdxマウスのTA筋に移植した。図5Dは、新しく単離された、培養されDMSO処置されたまたは培養されフォルスコリン処置された衛星細胞（n=6）を移植されたmdx筋肉におけるドナー由来筋線維の定量を示している。図5Eは、6000個の新しく単離された衛星細胞（左パネル）、6000個の新しく単離された細胞から拡大培養され培養されたDMSO処置された衛星細胞（中央パネル）または6000個の新しく単離された細胞から拡大培養され培養されたフォルスコリン処置された衛星細胞（右パネル）を移植されたmdxマウス由来のTA筋の横断凍結切片を示している。スケールバーは200μmを表す。 図6A〜6Eは、筋促進カクテルによるヒトiPSCの処置が骨格筋分化を誘導することを示している。図6Aおよび6Bは、EB（図6A）および単層細胞（図6B）の遺伝子発現分析を示している。RNA抽出のために、細胞を示されている時点で収集した。外胚葉、内胚葉および中胚葉遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いる定量RT-PCRによって分析した。遺伝子発現レベルの変化は、未分化のiPSC（0日目）に対して相対的に表されている。バーは、3回の独立した実験の標準偏差を表す（*p<0.05、**<0.01、***<0.001）。図6Cは、分化したiPSCの免疫染色を示している。最終分化手順（36日目）の下で、大部分の細胞が、デスミン（赤色）およびミオゲニン（緑色）を発現し、多核化した筋線維を形成している。細胞を、ヘキスト（青色）によっても染色した。各パネル上の数値は、デスミンおよびミオゲニンを発現する細胞の百分率を表す。スケールバーは、100μMを表す。図6Dは、36日目の分化したBJ細胞の代表的な電子顕微鏡画像を示しており、倍率は52700倍である。図6Eは、骨格筋特異的抗ミオシン重鎖および軽鎖を用いた免疫電子顕微鏡染色を示している。黒色の点は、2次抗体に対する金架橋粒子を示しており、倍率は52700倍である。 図7は、免疫無防備マウスへのヒトiPSC由来筋前駆体の生着を示している。分化12日目に1 x 105個のiPSCを注射した受傷したNSGマウスの前脛骨筋（TA）切片における免疫染色およびヘマトキシリン／エオシンの代表的な画像。BJ、00409、05400株は、生着を示すヒトδ-サルコグリカン（赤色）タンパク質に関して陽性を示した。PBS注射マウスにおいてはおよび線維芽細胞株が移植された場合は、染色が観察されなかった。スケールバーは、100μMを表す。サンプルあたりn=3。 図8A〜8Cは、インビトロで同定された筋形成抑制物質がインビボでの筋発生にも影響を及ぼすことを示している（図1に関連する）。図8Aは、bFGFを含むzESC培地中で培養されたmyf5-GFP;mylz2-mCherry割球細胞のより大きな拡大図を示している。図8Bは、400pgのcon-MOを注射したまたは200pgのmyf5-MOおよび200pgのmyoD-MOを共注射したmyf5-GFP;mylz2-mCherry胚がmyf5-GFPおよびmylz2-mCherryの両方の発現を欠いていることを示している。画像は、30hpfで撮影した。図8Cは、400pgのcon-MOを注射したまたは200pgのmyf5-MOおよび200pgのmyoD-MOを共注射したmyf5-GFP;mylz2-mCherry胚を楕円期で解体し、bFGFを含むzESC培地中で培養したことを示している。myf5-GFPまたはmylz2-mCherryの発現は、2重モルファントの培養物中で検出されなかった。画像は、プレーティングから26時間後に撮影した。 図9A〜9Cは、骨格筋発生の調整物質を同定するための化学遺伝的スクリーニングを示している（図2に関連する）。図9A、胚を、球形期で、ヒット化合物により処置した。対照の胚が6体節期に達したときに、それらをmyoDリボプローブを用いるホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションのために回収した。ヒットの例が、インビボで筋発生をかく乱することを検証した。6体節期でmyoDリボプローブによって染色した平面に置かれた胚が、左側が前方になるように示されている。胚を、(±)-6-クロロ-PB臭化水素酸塩、LY-294002、1-アシル-PAFまたはATRAで処置した。すべての化学物質はCHBライブラリ由来であり、これらを300倍希釈した。myoD減少のレベルを、これらの胚におけるmyoD発現の強度とDMSO処置した対照の胚におけるそれを比較することによって決定した。図9B、myf5-GFP;mylz2-mCherry胚を楕円期で回収し、解体した。得られた割球細胞を、化学物質を予め添加しておいた96ウェルプレートに等分した。培養培地は、筋発生を促進するために10 ng/mlのbFGFを含むものとした。細胞を、50μMチロホスチンAG 879、50μMチロホスチンAG 808、50μMチロホスチンAG 555、50μM PD 98059、10μM U0126、10μM LY-294002、10μMワートマニンまたは20μMラパマイシンで処置した。細胞を、2日後に、GFP、mCherryおよび明視野シグナルに関して、Celigoサイトメーターによって画像化した。図9C、1細胞期のmyf5-GFP;mylz2-mCherry胚に、250pgのfgf8-MOおよび250pgのfgf24-MOを注射し、そしてドーム期に10μMフォルスコリンを添加することによって救済した。 図10Aおよび10Bは、フォルスコリン処置がmdx衛星細胞の増殖を回復させること、およびフォルスコリン処置衛星細胞の移植がジストロフィー性mdx筋のジストロフィン発現を回復させることを示している（図3に関連する）。図10A、C57BL/6J（野生型）またはmdxマウス由来の衛星細胞を培養し、bFGFの存在下でDMSOまたはフォルスコリンにより処置した。5日目に細胞数を計数し、それが、DMSO処置された野生型細胞に対する変化倍率として示されている。mdx衛星細胞は、エクスビボ拡大培養の不良を示し、フォルスコリン処置は培養衛星細胞の数を回復する（平均+/-SEM、n=4）。図10Bは、培養されフォルスコリン処置されたGFP+衛星細胞を移植されたmdx筋の横断凍結切片を示しており、生着された線維におけるGFP（左、緑色）およびジストロフィン（右、赤色）が示されている。 図11A〜11Dは、00409および05400 iPSCの多能性を示している（図6に関連する）。図11Aは、未分化の00409および05400 iPSCにおける核のNANOG、OCT4および細胞質のSSEA3、SSEA4、TRA1-60の発現を示している。画像は、青色（ヘキスト）と赤色（示されているタンパク質）を合わせた色を示している。図11Bは、BJ、00409、05400 iPSCコロニーの明視野画像を示している。図11Cは、未分化の00409および05400 iPSCの遺伝子発現分析を示している。示されている多能性遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いる定量RT-PCRによって分析した。遺伝子発現レベルの変化は、未分化のBJ iPSCに対して相対的に表されている。バーは、3回の独立した実験の標準偏差を表す。図11Dは、7日間の分化後のBJ、00409および05400 iPSCのEB形成を示す明視野画像を示している。スケールバーは、100μMを表す。 図12A〜12Eは、筋促進培地による00409および05400 iPSCの処置が骨格筋分化を誘導することを示している（図6に関連する）。図12Aおよび12Bは、EB（図12A）および単層細胞（図12B）の遺伝子発現分析を示している。RNA抽出のために、細胞を示されている時点で収集した。外胚葉、内胚葉および中胚葉遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いる定量RT-PCRによって分析した。遺伝子発現レベルの変化が、未分化のiPSC（0日目）に対して相対的に表されている。バーは、3回の独立した実験の標準偏差を表す（*p<0.05、**<0.01、***<0.001）。図12Cは、分化した05400 iPSCの免疫染色を示している。最終分化手順（36日目）の下で、大部分の細胞が、デスミン（赤色）およびミオゲニン（緑色）を発現し、多核化した筋線維を形成している。細胞を、ヘキスト（青色）によっても染色した。図12Dは、36日目の分化した00409および05400細胞の代表的な電子顕微鏡画像を示しており、倍率は52700倍である。図12Eは、骨格筋特異的抗ミオシン重鎖および軽鎖を用いた免疫電子顕微鏡染色を示している。黒色の点は、2次抗体に対する金架橋粒子を示しており、倍率は52700倍である。 図13Aおよび13Bは、EBの分化に対するbFGF + BIOおよびbFGF + フォルスコリンの組み合わせの効果を示している（図6に関連する）。図13Aおよび13B、BJ iPSC由来EBを、bFGF + BIO（図13A）およびbFGF + フォルスコリン（図13B）で刺激した。RNA抽出のために、細胞を示されている時点で収集した。外胚葉、内胚葉および中胚葉遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いる定量RT-PCRによって分析した。遺伝子発現レベルの変化が、未分化のBJ iPSC（0日目）に対して相対的に表されている。
詳細な説明
本開示は、一部、幹細胞を遺伝子操作なしに骨格筋細胞に分化するよう誘導することができるという本発明者らの驚くべき予想外の発見に基いている。したがって、1つの局面において、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導する方法が、本明細書に提供される。概して、この方法は、幹細胞と、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質の少なくとも2つを接触させる工程を含む。非限定的に、接触させる幹細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボであり得る。
いくつかの態様において、接触は、FGF経路活性化物質およびGSK3経路阻害物質との接触である。ある態様において、接触は、FGF経路活性化物質およびcAMPの細胞内レベルを増加させる化合物との接触である。いくつかの態様において、接触は、GSK3経路阻害物質およびcAMPの細胞内レベルを増加させる化合物との接触である。
いくつかの態様において、この方法は、幹細胞を3つすべてと接触させる、すなわち、GSK3経路阻害物質、3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物およびFGF経路活性化物質と接触させる工程を含む。
幹細胞は、細胞培養下、例えばインビトロもしくはエクスビボで筋原細胞への分化を誘導する化合物の組み合わせと接触させることができ、または、これらの化合物を対象に、すなわちインビボで、共投与することができる。いくつかの態様において、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導する化合物の組み合わせは、損傷した筋組織を修復または再生するために対象に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、そのもととなった生物の多くの細胞型に分化することができる細胞を表し、全能性細胞、多能性（pluripotent）細胞および多分化能性（multipotent）細胞（例えば、胚起源の幹細胞（例えば、ESC）、人工幹細胞（iPSC）および多分化能性前駆細胞）を含む。
いくつかの態様において、幹細胞は、Rex-1、OCT4、SOX2およびNanogの少なくとも1つを発現する。いくつかの態様において、幹細胞は、CD73を発現する。いくつかの態様において、幹細胞は、CD73ならびにRex-1、OCT4、SOX2およびNanogの少なくとも1つを発現する。
本明細書で使用される場合、「筋原細胞」という用語は、筋組織を生じるまたは形成する細胞を表し、以下のマーカーPax3、Pax7、MyoD、Myf5、ミオゲニン、GATA2およびMHCの1つまたは複数および低レベルの胚マーカー、例えばRex-1を発現する細胞を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される筋原細胞は、少なくとも10個（例えば10、15、20、25個またはそれ以上）の核を含む筋管を融合および形成することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される筋原細胞は、5〜20個の核を含む筋管を融合および形成することができる。
いくつかの態様において、筋原細胞は、骨格筋形成系譜の細胞である。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、以下の筋形成マーカーの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つおよび好ましくはすべてを発現する：Pax3、Pax7、MyoD、Myf5、ミオゲニン、GATA2、CD56、デスミンおよびMHC。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、少なくともミオゲニン、MyoDおよびMHCを発現する。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、少なくともMyoD1およびMyf5を発現する。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、少なくともMyoD1、Myf5およびPax7を発現する。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、少なくともMyoD1、Myf5、Pax7およびGATA2を発現する。
1つの態様において、本明細書に開示される筋原細胞は、本明細書に開示される方法にしたがい処置されなかった幹細胞よりも低レベルのRex-1、OCT4、SOX2および／またはNanogを発現する。
いくつかの態様において、幹細胞は、多能性細胞である。本明細書で使用される「多能性」という用語は、異なる条件下で3つすべての生殖細胞層（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を表す。多能性細胞は、主として、例えばヌードマウステトラーマ形成アッセイを用いることで、3つすべての胚葉に分化するそれらの能力によって特徴づけられる。多能性はまた、胚性幹（ES）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、好ましい多能性試験は、3つの胚葉の各々の細胞へと分化する能力の実証である。いくつかの態様において、多能性細胞は、未分化細胞である。
本明細書に開示される方法にしたがい使用され得る幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞および多分化能性前駆細胞を含む。いくつかの態様において、幹細胞は、哺乳動物幹細胞である。1つの態様において、幹細胞は、ヒト幹細胞である。
いくつかの態様において、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「iPSC」または「iPS細胞」という用語は、分化した細胞（例えば、体細胞）の分化状態を完全に逆戻しするまたは再プログラムすることによって得られる細胞を表す。本明細書で使用される場合、iPSCは、十分に再プログラムされたものであり、完全な後成的再プログラムが行われた細胞である。本明細書で使用される場合、iPSCは、さらに再プログラムすることができない細胞である（例えば、iPSC細胞は、最後まで再プログラムされたものである）。ヒト多能性細胞株は、初期胚に類似するレベルの発生可塑性を示し、3つすべての胚生殖層にインビトロ分化させることができる。同時に、これらの多能性細胞株は、何世代も未分化状態で維持することが可能である。これらの独特の特徴が、ヒト胚性幹（ES）細胞およびヒト人工多能性幹（iPS）細胞を、生物医学研究における魅力的なツールにしている。ES細胞株は、単一遺伝子性のヒト疾患の細胞的基礎を解明するためのモデルシステムとしてすでに確立されている。明確な再プログラム法の発見（Takahashi and Yamanaka, Cell, 2006, 126: 663-676）および患者特異的なiPS細胞株の誘導におけるそれらの使用（Dimos et al., Science, 2008, 321: 1218-1221；およびPark et al., Cell, 2008, 1'34: 877-886）は、単一遺伝子疾患のモデル化における多能性細胞の有用性をさらに拡張させた。
1つの態様において、幹細胞は、筋肉の修復または損傷の処置を必要とする対象から得られるiPSCである。
いくつかの態様において、幹細胞は、胚性幹細胞である。本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を表す（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,780号、同第6,200,806号を参照のこと）。そのような細胞は、同様に、体細胞核移入から得られる胚盤胞の内部細胞塊からも得ることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,945,577号、同第5,994,619号、同第6,235,970号を参照のこと）。胚性幹細胞の識別性のある特徴が、胚性幹細胞の表現型を定義する。したがって、細胞は、もしそれが胚性幹細胞の独特の特徴の1つまたは複数を保持している場合、胚性幹細胞の表現型を有し、その細胞は他の細胞から識別され得る。例示的な識別性のある胚性幹細胞の特徴は、非限定的に、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定培養条件への応答性等を含む。
1つの態様において、幹細胞は、筋肉の修復または損傷の処置を必要とする対象から得られるESである。
いくつかの態様において、幹細胞は、多分化能性幹細胞である。「多分化能性細胞」に関連して使用される「多分化能性」という用語は、3つすべての生殖層から派生する細胞のすべてではないがいくつかに分化することができる細胞を表す。したがって、多分化能性細胞は、部分的に分化した細胞である。多分化能性細胞は、当技術分野で周知であり、そして多分化能性細胞の例は、成体幹細胞、例えば造血幹細胞および神経幹細胞を含む。多分化能性は、幹細胞が、所定の系譜内の多くの細胞型を形成し得るが、他の系譜の細胞は形成しないことを意味する。例えば、多分化能性血液幹細胞は、多くの異なる血液細胞型（赤血球、白血球、血小板等）を形成することができるが、神経細胞を形成することはできない。
1つの態様において、幹細胞は、筋肉の修復または損傷の処置を必要とする対象から得られる多分化能性幹細胞である。
いくつかの態様において、幹細胞は、胚様体または胚様体類似の細胞凝集物中に存在する。したがって、いくつかの態様において、この方法は、化合物および活性化物質との接触の前に、幹細胞から胚様体を形成する工程を含む。
「胚様体」（EB）という用語は、「凝集体」と同義の当技術分野の用語である。この用語は、ES細胞を単層培養下で過成長させたときまたは懸濁培養下で維持されたときに出現する分化した細胞および未分化の細胞の凝集物を表す。胚様体は、典型的にはいくつかの生殖層由来の、異なる細胞型の混合物であり、形態学的基準によって識別可能である；下記も参照のこと。本明細書で使用される場合、「胚様体」、「EB」または「EB細胞」は、典型的に、その大部分が分化を経た胚性幹（ES）細胞由来の細胞の集団から構成される形態学的構造物を表す。EB形成に適した培養条件（例えば、白血病阻止因子またはその他の類似のブロック因子の除去）の下で、ES細胞は増殖して小さな細胞塊を形成し、これが分化を開始する。通常ヒトの場合の分化の約1〜4日目に対応する分化の第1フェーズにおいて、この小さな細胞塊は、その外層に内胚葉細胞の層を形成し、これは「単純胚様体（simple embryoid body）」とみなされる。通常ヒトの場合の分化後約3〜20日目に対応する第2フェーズにおいて、「複合胚様体（complex embryoid body）」が形成され、これは外胚葉および中胚葉細胞ならびに派生組織の大規模な分化によって特徴づけられる。本明細書で使用される場合、「胚様体」または「EB」という用語は、そうでないことが文脈によって要求されていない限り、単純および複合の両方の胚様体を包含する。多能性細胞の培養物中でいつ胚様体が形成されたかの決定は、当業者によって慣用的に、例えば形態の目視検査によって、行われる。約20個またはそれ以上の細胞の浮遊塊は、胚様体とみなされる；例えばSchmitt et al., Genes Dev. 5 (1991), 728-740; Doetschman et al., Embryol. Exp. Morph. 87 (1985), 27-45を参照のこと。本明細書で使用される「胚様体」、「EB」または「EB細胞」という用語が、その大部分が適切な条件下で培養されたときに異なる細胞系譜を発生させることができる多能性細胞である細胞集団を包含することも理解される。本明細書で使用される場合、この用語はまた、胚の性腺領域から抽出された始原細胞である始原生殖細胞由来の等価構造も表す；例えば、Shamblott, et al., (1988), 前記を参照のこと。当技術分野においてEG細胞または胚性生殖細胞と称されることもある始原生殖細胞は、適当な因子で処置されると、胚様体を得ることができる多能性ES細胞を形成する；例えば、米国特許第5,670,372号を参照のこと。
幹細胞から筋原細胞への分化は、例えば、1つまたは複数の筋原細胞マーカーの発現を分析することによって確認され得る。筋原細胞に特徴的なマーカーは、細胞表面タンパク質またはそのコード遺伝子の発現、細胞内タンパク質またはそのコード遺伝子の発現、細胞の形態学的特徴等を含む。当業者は、公知の免疫蛍光、免疫化学、ポリメラーゼ連鎖反応、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、化学または放射線化学または生物学的方法により、衛星細胞特異的な特徴の存在または非存在を容易に確認できることを理解しているであろう。
所望の場合、細胞集団内の細胞型が、当技術分野で周知の技術を用いて決定され得る。例えば、細胞型特異的染色の使用。あるいは、様々な衛星細胞特異的タンパク質に対する抗体を用いる免疫蛍光染色が行われ得る。加えて、細胞型は、例えば光学顕微鏡または電子顕微鏡等の技術を用いて、その形態により決定され得る。例示的な筋原細胞マーカーは、Pax3、Pax7、MyoD、Myf5、ミオゲニンおよびMHCを含むがこれらに限定されない。
幹細胞（または幹細胞の集団）との接触に関連して本明細書で使用される「接触」または「接触させる」という用語は、幹細胞を、示された化合物を含む適当な培養培地に供することを含む。幹細胞がインビボの場合、「接触」または「接触させる」は、同一または異なる薬学的組成物中の化合物を適当な投与経路を介して対象に共投与し、インビボで該化合物を幹細胞と接触させることを含む。
分化の誘導ための細胞培養培地は、無血清最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地、それらの混合物、および一般に公知となっている共通利用される適当濃度の培地添加物［例えば、血清アルブミン、2-メルカプトエタノール、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）等］を上記の培地のいずれか1つに補給することによって調製される培地［例えば、S-Clone培地（例えば、SF-03、Sanko Junyaku）］等を含むがこれらに限定されない。
幹細胞は、任意の所望の期間、化合物の組み合わせと接触させることができる。例えば、分化を誘導するため、接触は、数時間、数日間または数週間であり得る。いくつかの態様において、接触は、少なくとも1日間、例えば、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、4週間またはそれ以上、であり得る。
本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、移植のために使用され得る。いくつかの態様において、この方法にしたがい調製される筋原細胞は、その移植を受ける対象にとって自家のものである。本明細書に開示される方法にしたがい調製される筋原細胞は、対象の損傷した筋組織を修復もしくは再生するまたは筋肉量を増加させるための対象への移植のために使用され得る。
本開示はまた、本明細書に記載される方法にしたがい調製される筋原細胞および集団を提供する。この細胞集団は、精製された筋原細胞集団であり得る。筋原細胞は、本明細書に開示される方法によって得られた細胞培養物を選別することによって得ることができる。いくつかの態様において、筋原細胞以外の1つまたは複数の種類の細胞が、細胞集団内に共存し得る。本開示はさらに、本明細書に記載される方法にしたがい調製される筋原細胞および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
本開示はまた、対象の損傷した筋組織を修復もしくは再生するまたは筋肉量を増加させるための方法を提供する。この方法は、治療有効量の（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質の少なくとも2つを対象に共投与する工程を含む。
GSK3経路
本明細書で使用される場合、「GSK3経路の阻害物質」は、GSK3経路の少なくとも1つの成分の活性を阻害することができる化合物および組成物を表す。GSK3経路の定義および詳細は、当技術分野で、例えばBiondi R.M. and Nebreda A.R. Biochem J. 372, 1-13 (2003); Jope R.S. and Johnson G.V. Trends Biochem Sci. 29, 95-102 (2004); and Polakis P. Curr. Biol. 12, R499-R501 (2002)に開示されており、これらすべての内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、GSK3経路阻害物質は、GSK阻害物質、例えばGSK3β阻害物質である。GSK阻害物質は、当技術分野で周知であり、異なる化学物質クラス、例えばピロロアゼピン、フラボン、ベルアゼピノン（beruazepinone）、ビス-インドール、ピロロピラジン、ピリジルオキサジアゾール、ピラゾロピリジン、ピラゾロピリダジン、アミノピリジン、ピラゾロキノキサリン、オキシインドール（インドリノン）、チアゾール、ビスインドリルマレイミド、アザインドリルマレイミド、アリールインドールマレイミド、アニリノマレイミド（aniliomaleimide）、フェニルアミノピリジン、トリアゾール、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジンおよびクロロメチルチエニルケトンにグループ分けすることができる。
例示的なGSK3経路阻害物質は、6-ブロモインジルビン-3'-オキシム（BIO）、CHIR98014；CHIR99021；ARA014418；ヒメニアルジシン（hymenialdisine）；フラボピリドール；アロイジンA；アロイジンB；CT20026；SU9516；スタウロスポリン；GF109203x；RO318220；SB216763；SB415286；I5；CGP60474；ケンパウロン（9-ブロモパウロン）；アルスターパウロン；2-シアノエチル-アルスターパウロン；1-アザ-アルスターパウロン；1-アザ-ケンパウロン；9-シアノ-2,3-ジメトキシパウロン；2-ヨードパウロン；2-ブロモ-9-ニトロパウロン；2,3-ジメトキシ-9-ニトロパウロン；7-ブロモ-5-(4-ニトロフェニルヒドラゾノ)-4,5-ジヒドロ-1-H-[1]ベンゾアゼピン2(3H)-オン；7,8-ジメトキシ-5-(4-ニトロフェニルヒドラゾノ)-4,5ジヒドロ-1H-[1]ベンゾアゼピン-2-(3H)-オン；9-シアノパウロン；9-クロロパウロン；9-トリフルオロメチルパウロン；2,3-ジメトキシ-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-メチルオキシカルボニルメチルパウロン；9-フルオロパウロン；9-ブロモ-2,3-ジメトキシパウロン；9-ブロモ-2,3-ジメトキシパウロン；9-メチルパウロン；10-ブロモパウロン；2-ブロモパウロン；11-クロロパウロン；2-(3-ヒドロキシ-1-プロピニル)-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-(2-ヒドロキシエチル)-パウロン；ケンパウロン；アルスターパウロン；2-シアノエチル-アルスターパウロン；1-アザ-ケンパウロン；1-アザ-アルスターパウロン；9-ブロモ-12-メチルパウロン；9-ブロモ-5-(メチルオキシカルボニルメチル)パウロン；11-メチルパウロン；パウロン；11-エチルパウロン；9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-6-(ヒドロキシアミノ)-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン；2,9-ジブロモパウロン；11-ブロモパウロン；2,3-ジメトキシパウロン；9-ブロモ-7,12ジヒドロ-6-メチルチオ-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン；(E)-2(3-オキソ-1-ブテニル)-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12エチルパウロン；9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン-6(5H)-チオン；2-ブロモ-9-トリフルオロメチルパウロン；2-[2-(1-ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]-9-トリフルオロメチル-パウロン；9-ブロモ-5メチルパウロン；9-メトキシパウロン；2-ヨード-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；9-ブロモ-12-(2-プロペニル)パウロン；9-ブロモ-4-ヒドロキシパウロン；8,10-ジクロロパウロン；5-ベンジル-9-ブロモパウロン；9-ブロモ-4-メトキシパウロン；9-ブロモ-5-エチルパウロン；9-ブロモ-5,7ビス-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；4-メトキシパウロン；9-ブロモ-5,6,7,12-テトラヒドロベンゾ[6-7]シクロヘプト[1,2.b]インドール；2-フェニル-4-(2-チエニル)-5H-ピリド[2-3-d][1]ベンゾアゼピン-6(7H)-チオン；9-ブロモ-5,7,12-トリ-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；9-ブロモ-5,12-ビス-(tert-ブチルオキシカルボニル)パウロン；4-(4-クロロフェニル)-2-(2-ナフチル)-5H-ピリド[23-d][1]ベンゾアゼピン-6(7H)-チオン；5,6,7,12-テトラヒドロベンゾ[6-7]シクロヘプト[1,2-b]インドール；N-ブチル-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ペンタンアミド；1-{4-アミノ-2-[(4-メトキシフェニル)アミノ]-1,3-チアゾール-5-イル}エタノン；N-ベンジル-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；3-(4-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)プロパンアミド；4-(4-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ブタンアミド；2-(3-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2イル)アセトアミド；2-(4-フルオロフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)プロパンアミド；2-(3-メチルフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)アセトアミド；1-ベンジル-3-ナフタレン-1-イル-ウレアまたは1-ベンジル[1,3]ジオキソール-5-イル-3-ベンジル-ウレアを含むがこれらに限定されない。
本発明において利用可能なさらなるGSK3経路阻害物質、例えばGSK-3ベータ阻害物質は、米国特許第7,056,939号、同第7,045,519号、同第7,037,918号、同第6,989,382号、同第6,949,547号、同第6,872,737号、同第6,800,632号、同第6,780,625号、同第6,608,063号、同第6,489,344号、同第6,479,490号、同第6,441,053号、同第6,417,185号、同第6,323,029号、同第6,316,259号、同第7,232,814号、同第7,393,953号および同第6,057,117号；PCT特許出願公開第WO07/017145号、同第WO03/089419号、同第WO99/65910号および同第WO09/010298号；ならびにLeost at al., Paullones Are Potent inhibitors of Glycogen Synthase Kinase-3B and Cyclin-dependent Kinase 5/p25, Eur. J. Biochem. (2000), 267, 5983-5994に記載されており、これらすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられ各々が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
1つの態様において、GSK3経路阻害物質は、BIOである。
いくつかの態様において、GSK3経路阻害物質は、Wntシグナル伝達を活性化する。Wntシグナル伝達経路は、成長および分化を調節する誘導性の相互作用におけるその重要な役割に関して公知であり、後胚期の組織完全性の恒常的維持においても重要な役割を果たしていると考えられている。Wntは、c-myc、c jun、fra-1およびサイクリンD1を含む遺伝子の発現を刺激する細胞質p-カテニンを安定化する。加えて、Wntシグナル伝達の誤調節は、発育不全を引き起こし得、いくつかのヒトの癌の発生に関連づけられている。より最近になって、Wnt経路は、現時点で皮膚、血液、腸、前立腺、筋肉および神経系を含む、今も拡大を続けるリストの成体組織の幹細胞または前駆細胞の維持に関連づけられた。Wntシグナル伝達は、細胞の増殖および分化を調節することによって、基本的な発生経路に影響する。このように、Wntシグナル伝達経路は、細胞の増殖、分化および形態形成の調節において有用であり得る。Wnt活性化物質の非限定的な例は、β-カテニン、APC、アキシン1、アキシン2、GSK3、GSK-3β阻害物質、Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled、Wntタンパク質（例えば、Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5aおよびWnt-8a）を含む。
いくつかの態様において、幹細胞と接触させるGSK3経路阻害物質の濃度は、約0.05μM〜約50μM、約0.1μM〜約25μM、約0.2μM〜約15μM、約0.3μM〜約5μM、約0.1μM〜約1μMまたは約0.25μM〜約0.75μMである。1つの態様において、幹細胞と接触させるGSK3経路阻害物質の濃度は、約0.5μMである。
cAMP
いくつかの態様において、cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、アデニリルシクラーゼの活性化物質である。アデニリルシクラーゼは、ATPから3',5'-環状AMP（cAMP）およびピロホスフェートへの変換を触媒する。通常、2価カチオン（通常Mg）が必要とされ、その酵素メカニズムに深く関与しているようである。アデニリルシクラーゼによって生成されたcAMPはその後、転写因子または他の酵素（例えば、cAMP依存性キナーゼ）のいずれかである特異的なcAMP結合タンパク質を介する調節シグナルとして機能する。
アデニリルシクラーゼの「活性化物質」は、アデニリルシクラーゼをより活性な状態にし、それによって細胞のcAMPレベルまたはシグナルを上昇させる化合物または組成物である。活性化物質の作用様式は、例えばシクラーゼへの結合を通じた、直接的なもの、または、例えばそうでなければシクラーゼと相互作用する別の分子への結合を通じた、間接的なもの、であり得る。
例示的なアデニル酸シクラーゼの活性化物質は、フォルスコリン；フォルスコリン誘導体およびアナログ；8-ブロモ-cAMP、8-クロロ-cAMPまたはジブチリルcAMP（db-cAMP）を含むcAMPの非加水分解性アナログ；イソプロテレノール（isoprotenol）；血管作動性腸管ペプチド；カルシウムイオノフォア；膜脱分極；cAMPを刺激するマクロファージ由来因子；マクロファージの活性化を刺激する作用物質、例えばザイモサンまたはIFN-γ；ホスホジエステラーゼ阻害物質、例えばペントキシフィリンおよびテオフィリン；特異的ホスホジエステラーゼIV（PDE IV）阻害物質；下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（PACAP）；コレラ毒素；プロスタグランジン化合物、例えばプロスタグランジンE2（PGE2）；およびベータ2-アドレナリン受容体アゴニスト、例えばサルブタモールを含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、細胞内cAMPを増加せることができる化合物は、G共役受容体活性化物質、例えばGPCRリガンドである。Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、アミノ末端の細胞外ドメイン、カルボキシル末端の細胞内ドメインおよび細胞膜を7回通過する蛇行構造によって特徴づけられる巨大な細胞表面受容体スーパーファミリーを形成する。したがって、そのような受容体は、ときどき、7回膜貫通（7TM）受容体とも称される。これらの7回膜貫通ドメインは、そのアミノおよびカルボキシ末端ドメインに加えて、3つの細胞外ループおよび3つの細胞内ループを規定する。この受容体の細胞外部分は、1つまたは複数の細胞外結合パートナー（例えば、リガンド）の認識および結合における役割を有し、その細胞内部分は、シグナル伝達カスケードにおける下流の分子の認識および該分子との連絡における役割を有する。
本明細書で使用される場合、「GPCRリガンド」という用語は、GPCRに結合する分子を表す。Gタンパク質共役受容体は、カルシウムイオン、ホルモン、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、臭気物質さらには光子を含む様々なリガンドに結合し、多くの細胞型の正常な（および時には異常な）機能に重要となる［一般論については、Strosberg, Eur. J. Biochem. 196:1-10 (1991)およびBohm et al, Biochem J. 322:1-18 (1997)を参照のこと］。特定のリガンドがその対応する受容体に結合すると、そのリガンドは典型的に、その受容体を刺激し、その受容体の細胞内部分に連結されている特定のヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合性調節タンパク質（G-タンパク質）を活性化する。Gタンパク質はその後、細胞内のエフェクター分子に対して、そのエフェクター分子の活性の刺激または阻害のいずれかによって、シグナルを伝達する。これらのエフェクター分子は、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼおよびイオンチャネルを含む。アデニル酸シクラーゼおよびホスホリパーゼは、セカンドメッセンジャー分子であるcAMP、イノシトール三リン酸およびジアシルグリセロールの生成に関与する酵素である。細胞外リガンドの刺激がGタンパク質共役受容体を通じて細胞内の変化を起こすのは、この連続イベントを通じてである。そのような受容体は各々、それ独自の特徴的な1次構造、発現パターン、リガンド結合プロファイルおよび細胞内エフェクターシステムを有している。
GPCRは、感覚シグナル媒介物質（例えば、光および嗅覚刺激分子）の受容体；アデノシン、ボンベシン、ブラジキニン、エンドセリン、γ-アミノ酪酸（GABA）、肝細胞成長因子（HGF）、メラノコルチン、神経ペプチドY、オピオイドペプチド、オプシン、ソマトスタチン、GH、タキキニン、血管作動性腸管ペプチドファミリーのメンバーおよびバソプレシン；生体アミン（例えば、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ヒスタミン、グルタメート（代謝調節作用）、グルカゴン、アセチルコリン（ムスカリン性作用）およびセロトニン）；ケモカイン；炎症の脂質性媒介物質（例えば、プロスタグランジン、プロスタノイド、血小板活性化因子およびロイコトリエン）；ならびにペプチドホルモン（例えば、カルシトニン、C5aアナフィラトキシン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、ニューロキニン、チロトロピン放出ホルモン（TRH）、カンナビノイドおよびオキシトシン）を含む。現時点で同定されていない刺激に対する受容体として作用するGPCRは、オーファン受容体として公知である。リガンドが膜外から結合する研究されている他のタイプの受容体において、GPCRのリガンドは、典型的に、膜貫通ドメイン内で結合する。しかし、プロテアーゼにより活性化される受容体は、それらの細胞外ドメインの一部の切断によって活性化される。
GPCRリガンドのタイプは、その平衡を活性状態の方にシフトさせるアゴニスト；その平衡を不活性状態の方にシフトさせる逆アゴニスト；およびその平衡に影響しない中性アンタゴニストを含むがこれらに限定されない。活性状態のGPCRがGタンパク質と遭遇したとき、それはそのGタンパク質を活性化させることができる。GPCRは、市場のすべての処方薬の約40％の標的である（Filmore, Modern Drug Discovery, November 2004, pp.11）。一般に処方されるGPCRベースの薬の例は、アテノロール（TENORMIN（登録商標））、アルブテロール（VENTOLIN（登録商標））、ラニチジン（ZANTAC（登録商標））、ロラタジン（CLARITIN（登録商標））、ヒドロコドン（VICODIN（登録商標））テオフィリン（THEODUR（登録商標））およびフルオキセチン（PROZAC（登録商標））を含む。
例示的なGPCR活性化物質は、カルシトニン、PGE2、コルチコトロピン放出因子（CRF）、ウロコルチン1、ウロコルチン2、ウロコルチン3、副甲状腺ホルモン、PTH関連ホルモン、TIP39、アミリン、CGRP（CALCAおよびCALCB）、アドレノメデュリン、セクレチン、VIP、PACAP、グルカゴン、GHRH、GLP-1、GLP-2、ダイノルフィンA、ダイノルフィンAアミド、ダイノルフィンA(1-6)、ダイノルフィンA(1-13)、ダイノルフィンA(2-13)、ダイノルフィンA(2-17)、MetEnk、Met-Enk-RF-アミド、Met-Enk-Arg-Phe、Met-Enk-Glyleu、[D-pGlu1, D-Phe2, D-Trp3,6]-LH-RH、gl-MSHアミド、g2-MSH、[N-MePhe1, D-Pro4]-モルフィセプチン（PL017）、ACTH（ヒト）、Leu-Enk、アドレノメデュリン(22-52)、アドレノメデュリン(26-52)（ヒト）（ADMアンタゴニスト）、アグーチ1-40アミド、アグーチ関連タンパク質(87-132)-アミド、アルファ-MSH、アルファ-ネオ-エンドルフィン、アミリンアミド、BAM(1-20)、BAM(1-22)、BAM(2-22)、BAM(6-22)、BAM(1-20)、ANP（心房性ナトリウム利尿ペプチド）、抗炎症ペプチド1、抗炎症ペプチド2、（3-エンドルフィン、ベンジルウレイド-Met-Leu-Phe、ベータ-ANP、ベータ-エンドルフィン、ベータ-MSH、ビッグエンドセリン-1、ビッグガストリン-1、BNP（脳性ナトリウム利尿ペプチド-32）、BNP-45（心臓性ナトリウム利尿ペプチド、ボンベシン、BAM(8-25)、BAM(8-20)、FLRF、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、NPFF、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(8-37)、CART(55-1,02)、CART(55102)[Met(O)67、CART(61-102)、CGRP(8-37)、CGRP II、コレシストキニンオクタペプチド[CCK(26-33]、コレシストキニン-33、CNP-22（C型ナトリウム利尿ペプチド）、コルチコトロピン放出因子、コルチスタチン-14、NPAF、SST、NPY、FMRFアミド、オルファニンFQFMRFアミド関連ペプチド（OrpaninFQFMRF amide related peptide）、YMRFアミド、YLPLRFアミド、YFMRFアミド、LPLRFアミド、dFMRFアミド、W-Nle-R-F-アミドおよびACEPを含むがこれらに限定されない。GPCRのポリペプチド活性化物質は、バソプレシン、オキシトシン、ソマトスタチン、神経ペプチドY、GnRH、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、オレキシン、ウロテンシンII、エンドルフィン、エンケファリン等を含むがこれらに限定されない。活性化物質を含むGPCRモジュレーターのリストは、ウェブ上のpharminfo.pharm.kyoto-u.ac.jp/services/glida/ligand_classification.phpにコンパイルされている。
いくつかの態様において、G共役受容体活性化物質は、カルシトニンまたはPGE2である。
いくつかの態様において、細胞内cAMPを増加させることができる化合物は、フォルスコリンである。
いくつかの態様において、細胞内cAMPを増加させることができる化合物の濃度は、約0.1μM〜約500μM、約1μM〜約250μM、約2.5μM〜約150μM、約5μM〜約100μM、約7.5μM〜約75μM、約10μM〜約50μMまたは約15μM〜約25μMである。1つの態様において、化合物の濃度は、約20μMである。
FGF経路
本明細書で使用される場合、「FGF経路活性化物質」は、FGF経路の少なくとも1つの成分の活性を増加または増強することができる化合物または組成物を表す。FGF経路の定義および詳細は、当技術分野で、例えばLee P.L. et al., Science. 245, 57-60 (1989); Mignatti P. et al., J. Cell Physiol. 151, 81-93 (1992); Miki T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 246-250 (1992); Gringel S. et al., J. Biol. Chem. 385, 1203-1208 (2004); Ornitz D. M. and Ioth, N. Genome Biol. 2, 1-12 (2001); Sorensen V. et al., Bioessays. 28, 504-514 (2006); Coulson E. J. Prog. Brain Res. 146, 41-62 (2004); Huang E. J. and Reichardt L. F. Annu. Rev. Biochem. 72, 609-642 (2003); Miller F. D. and Kaplan D. R. Cell Mol. Life Sci. 58, 1045-1053 (2001); およびRabizadeh S. and Bredesen D. E. Cytokine Growth Factor Rev. 14, 225-239 (2003)に開示されており、これらすべての内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、FGF経路活性化物質は、PI-3K経路の活性化物質である。PI3Kは、IRS（インスリン受容体基質）と相互作用し、一連のリン酸化イベントを通じてグルコース取り込みを調節する。ホスホイノシトール-3-キナーゼファミリーは、クラスI、IIおよびクラスIIIから構成され、クラスIが唯一、細胞膜の内側リーフレットにおいてPI(4,5)P2をPI(3,4,5)P3に変換することができる。クラスI PI3Kは、調節および触媒サブユニットから構成されるヘテロ二量体分子であり；それらはさらに、配列の類似性に基づきIAおよびIBサブセットに分けられる。PI3K経路はまた、mTOR、GSK3βおよびPSD-95を含む多くの他のタンパク質を下流に動員する。PI3K-mTOR経路は、翻訳活性を促進するキナーゼであるp70S6Kのリン酸化をもたらす。
いくつかの態様において、PI-3K経路の活性化物質は、ホスファチジルイノシチド 3-キナーゼ（PI3K）、ホスホイノシチド依存性キナーゼ（PDK）またはプロテインキナーゼB（PKB、aka Akt）を活性化する。ホスホイノシチド 3-キナーゼ（PI 3-キナーゼまたはPI3K）は、ホスファチジルイノシトール（PtdIns）のイノシトール環の3位のヒドロキシル基をリン酸化することができる関連酵素のファミリーである。それらはまた、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼとしても公知である。PI3Kの「活性化物質」は、PI3Kをより活性な状態にする化合物または組成物である。活性化物質の作用様式は、例えばシクラーゼへの結合を通じた、直接的なもの、または、例えばそうでなければシクラーゼと相互作用する別の分子への結合を通じた、間接的なもの、であり得る。
いくつかの態様において、FGF経路の活性化物質は、成長因子、例えば線維芽細胞成長因子（FGF）、上皮成長因子（EGF）、神経成長因子（NGF）または形質転換成長因子（腫瘍成長因子、TGF）である。
FGF経路の例示的な活性化物質は、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、FGF2またはFGF-β）；TGFα；TGFβ；EGF；NGF；Akt活性化物質、例えばRo-31-8220（Wen, H. et al., Cellular signaling, 15:37-45 (2003)）；ニコチン（West, K. et al., J. Clinical Investigation, 111:81-90 (2003)）；カルバコール（Cui Q L, Fogle E & Almazan G Neurochem Int, 48:383-393 (2006)）；4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン（NNK）（West, K. et al., J. Clinical Investigation, 111:81-90 (2003)）；アドレノメデュリン（AM）（Nikitenko, L L et al, British J. Cancer, 94:1-7 (2006)）；リゾホスファチジン酸；血小板活性化因子、マクロファージ刺激因子；スフィンゴシン-1-リン酸；cAMPを上昇させる作用物質、例えばフォルスコリン、クロロフェニルチオ-cAMP、プロスタグランジン-E1および8-ブロモ-cAMP（Song et al., J. Cell. Mol. Med., 9(1):59-71 (2005)）、インスリンおよびインスリン成長因子-1（Datta, S. R., et al., Cell, 91:231-241 (1997)）ならびに血小板由来成長因子を含むがこれらに限定されない。
1つの態様において、FGF経路の活性化物質は、bFGFである。他の例示的なFGF経路は、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10等を含む。
いくつかの態様において、幹細胞と接触させるFGF経路活性化物質の濃度は、約0.25 ng/ml〜約100 ng/ml、約0.5 ng/ml〜約75 ng/ml、約1 ng/ml〜約50 ng/ml、約2.5 ng/ml〜約25 ng/ml、約5 ng/ml〜約15 ng/mlまたは約7.5 ng/ml〜約12.5 ng/mlである。1つの態様において、活性化物質の濃度は、約10 ng/mlである。
衛星細胞の増殖
1つの局面において、本開示は、衛星細胞の増殖を誘導、増強または増加させる方法を提供する。この方法は、衛星細胞を、3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物と接触させる工程を含む。接触させる衛星細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボであり得る。cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、本明細書の他箇所に記載されている。
本明細書で使用される場合、「増殖する」および「増殖」という用語は、細胞***による集団内の細胞の数の増加（成長）を表す。細胞増殖は、一般に、成長因子およびその他のマイトジェンを含むその環境に応じた複数のシグナル伝達経路の協調的な活性化の結果であると理解される。細胞増殖はまた、細胞増殖をブロックするまたは細胞増殖に負の影響を及ぼす細胞内または細胞外シグナルおよび機構の作用からの解放によって促進され得る。
本明細書で使用される場合、衛星細胞の増殖を「誘導する」、「増強する」または「増加させる」は、衛星細胞がより早い速度および／またはより高い頻度で複製することを意味する。本明細書に記載されるこのおよびその他の局面のいくつかの態様において、衛星細胞の増殖は、未処置の対照に対して少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上増加する。衛星細胞の増殖における増加％または増加倍率は、本明細書に記載される化合物に接触させた複製した衛星細胞の数を、衛星細胞を該化合物に接触させない対照に対して相対的に測定することによって決定され得る。増殖の増加はまた、処置および未処置対照のそれぞれにおける複製細胞 対 総細胞数の比に基づくものであり得る。いくつかの態様において、処置および未処置対照における総細胞数が、増殖を決定するために使用される。衛星細胞の増殖は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許公開第2009/0136481号に記載されるBrdU取り込み法を用いて決定され得る。
筋衛星細胞または衛星細胞は、成熟した筋肉において見出される細胞質をほとんど有さない小さな単核性の前駆細胞である。それらは基底膜と個々の筋線維の筋線維鞘（細胞膜）との間にサンドイッチされた状態で見出され、そして該線維の筋線維鞘下の核と区別するのが困難であり得る。衛星細胞は、既存の筋線維を補強するためおよび新たな線維を形成するために分化および融合することができる。これらの細胞は、最も古くから公知となっている成体幹細胞ニッチであり、筋肉の正常な成長および受傷または疾患後の再生に関与する。
損傷を受けていない筋肉では、衛星細胞の大部分が休眠状態にあり；それらは分化しないし細胞***も起こさない。機械的歪みに応答して、衛星細胞は活性化状態になる。活性化された衛星細胞はまず、骨格筋芽細胞として増殖し、その後に筋形成分化を起こす。
衛星細胞に特徴的なマーカーは、細胞表面タンパク質またはそのコード遺伝子の発現、細胞内タンパク質またはそのコード遺伝子の発現、細胞の形態学的特徴等を含む。当業者は、公知の免疫蛍光、免疫化学、ポリメラーゼ連鎖反応、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、化学もしくは放射線化学または生物学的方法により、衛星細胞特異的な特徴の存在または非存在を容易に確認できることを理解しているであろう。
所望の場合、衛星集団の細胞型が、当技術分野で周知の技術を用いて決定され得る。例えば、細胞型特異的染色の使用。あるいは、様々な衛星細胞特異的タンパク質に対する抗体を用いる免疫蛍光染色が行われ得る。加えて、細胞型は、例えば光学顕微鏡または電子顕微鏡等の技術を用いて、その形態により決定され得る。
衛星細胞は、多くの特有の遺伝子マーカーを発現する。例えば、最新の学説は、すべての衛星細胞がPAX7およびPAX3を発現するというものである（F. Rlaix et al. Nature, 2005, 435 (7044): 898-899）。活性化された衛星細胞は、筋形成転写因子、例えばMyf5およびMyoDを発現する。それらはまた、それらの分化に伴い、筋特異的フィラメントタンパク質、例えばデスミンを発現し始める。本明細書中に提示されているデータは、CXCR4およびβ-1インテグリンもまた衛星細胞、特に生着可能な筋原細胞の有用な代理マーカーであることを示している。
衛星細胞の調節についてはほとんど知られていない。現時点ではPAX3およびPAX7が共に明確な衛星マーカーを形成しているが、Pax遺伝子は乏しい転写活性化物質であり得る。筋形成調節因子であるMyf5、MyoD、ミオゲニンおよびMRF4を通じた活性化および沈静化のダイナミクスならびに筋形成プログラムの誘導が、決定されなければならない状態のままである。衛星細胞がミオスタチンと呼ばれるタンパク質によって負に調節されることを示す研究もいくつか存在する。
いくつかの態様において、衛星細胞は、安定化された状態にある、例えば、該細胞は対象から採取され、そしてそれらを一定期間保管できるよう処置されたものである。例えば、細胞は、例えば初代細胞の凍結に関する当技術分野で公知の方法を用いて、該細胞が解凍したときに生存しているように凍結され得る。例えば、胚を凍結するそしてそれを生きた哺乳動物を生み出すために解凍する当技術分野で公知の方法が、本発明の方法で使用できるよう適合され得る。そのような方法は、例えば1つまたは複数の凍結保護物質、例えば凍結解凍時の損傷から細胞を保護する剤を含む、液体窒素の使用を含み得る。
衛星細胞集団は、細胞培養下で、例えばインビトロまたはエクスビボで、cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物と接触させることができ、または該化合物を、例えばインビボで、対象に投与することができる。本発明のいくつかの態様において、cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、損傷した筋組織を修復または再生するために対象に投与され得る。
衛星細胞の集団との接触に関連して本明細書で使用される「接触」または「接触させる」という用語は、衛星細胞を、示された化合物を含む適当な培養培地に供することを含む。衛星細胞集団がインビボの場合、「接触」または「接触させる」は、薬学的組成物中の化合物を適当な投与経路を介して対象に投与し、インビボで該化合物を衛星細胞集団と接触させることを含む。
インビボ方法では、治療有効量の示された化合物が、対象に投与され得る。化合物を対象に投与する方法は、当技術分野で公知であり、当業者はそれを容易に利用することができる。対象における衛星細胞の増殖の促進は、損傷した筋組織によって引き起こされる多くの疾患、障害または状態の処置、予防または改善をもたらし得る。
エクスビボ方法において使用するのに適した衛星細胞は、当業者に周知の方法にしたがい対象から得ることができる。「エクスビボ」という用語は、生きた有機体から取り出され該有機体の外で（例えば、試験管内で）培養された細胞を表す。エクスビボ方法において、衛星細胞は、自家衛星細胞、すなわち、筋肉の損傷または修復の処置を必要とする対象から採取された細胞または細胞群、を含み得る。自家衛星細胞は、細胞の任意の免疫ベースの拒絶を回避するという利点を有する。あるいは、細胞は、例えばドナーから採取された、異種であり得る。第2の対象は、同一または異なる種であり得る。典型的に、細胞がドナーから得られる場合、免疫抑制の必要性を縮小または排除するため、それらは十分にレシピエントと免疫学的に適合するドナー由来であろう、すなわち、移植拒絶を起こさないものであろう。いくつかの態様において、細胞は、異種供給源、すなわち、十分にレシピエントまたはレシピエント種と免疫学的に適合するよう遺伝子操作された非ヒト哺乳動物から採取される。免疫学的適合性を決定する方法は、当技術分野で公知であり、ドナー・レシピエントのHLAおよびABO決定因子の適合性を評価する組織タイピングを含む。例えば、Transplantation Immunology, Bach and Auchincloss, Eds. (Wiley, John & Sons, Incorporated 1994)を参照のこと。
学説に拘束されることを望まないが、本明細書に記載されるインビトロまたはエクスビボ方法では、任意の適当な細胞培養培地が使用され得る。cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物とのインビトロまたはエクスビボ接触の後、衛星細胞が所望の集団数または密度、例えば約1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107個の細胞またはそれ以上に達したとき、細胞が、筋肉の修復または損傷の処置を必要とする対象に移植され得る。細胞は、その細胞を取得した元の対象にまたは異なる対象に移植され得る。
本明細書に開示される方法にしたがい調製される衛星細胞は、移植のために使用され得る。いくつかの態様において、該方法にしたがい調製される衛星細胞は、移植を受ける予定の対象にとって自家のものである。本明細書に開示される方法にしたがい調製される衛星細胞は、対象の損傷した筋組織を修復もしくは再生するまたは筋肉量を増加させるための対象への移植のために使用され得る。
本開示はまた、本明細書に開示される方法によって生成された衛星細胞を含む細胞集団を提供する。この細胞集団は、精製された衛星細胞集団であり得る。精製された衛星細胞は、本明細書に開示される方法によって得られる細胞培養物を選別することによって得ることができる。いくつかの態様において、衛星細胞以外の1つまたは複数の種類の細胞が細胞集団内に共存し得る。
別の局面において、本明細書には、対象の損傷した筋組織を修復もしくは再生するためまたは筋肉量を増加させるための方法が提供される。この方法は、cAMPの細胞内レベルを増加させる治療有効量の化合物を対象に投与する工程を含む。
組成物
1つの局面において、本明細書には、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む、幹細胞から筋原細胞への分化を誘導するための組成物が提供される。
学説により拘束されることを望まないが、本明細書に開示される組成物の成分は、幹細胞から筋原細胞への分化に対する相乗的な効果を有し得る。本明細書で使用される「相乗的」という用語は、その組み合わせの活性が該組み合わせの各成分の個別の活性の和よりも高い成分の組み合わせを意味するものと定義される。いくつかの態様において、組み合わせの活性は、該組み合わせの各成分の個別の活性の和よりも少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍またはそれ以上高い。
組成物の成分比は、最適な活性を提供するよう選択され得る。例えば、存在する場合、GSK3経路阻害物質およびcAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、約10:1〜約1:1,000；約5:1〜約1:500；約1:1〜約1:250；約1:5〜約1:200；約1:10〜約1:100；約1:20〜約1:75；または約1:25〜1:75の比であり得る。1つの態様において、GSK3経路阻害物質およびcAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、約1:40の比であり得る。比は、モル比または質量比であり得る。
存在する場合、FGF経路活性化物質およびGSK3経路阻害物質は、約1:50〜約1:2,000；約1:100〜約1:1,750；約1:200〜約1:1,500；約1:500〜約1:1,250；または約1:750〜約1:1,000の比であり得る。1つの態様において、FGF経路活性化物質 対 GSK3経路阻害物質は、約1:875の比であり得る。比は、モル比または質量比であり得る。
存在する場合、FGF経路活性化物質およびcAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、約1:10,000〜約1:100,000、約1:15,000〜約1:75,000；約1:20,000〜約1:50,000；約1:25,000〜約1:45,000または約1:30,000〜約1:40,000の比であり得る。1つの態様において、FGF経路活性化物質 対 cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物は、約1:35,000の比であり得る。比は、モル比または質量比であり得る。
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体（添加物）を用いて製剤化される、すなわち、薬学的に許容される組成物である。いくつかの態様において、薬学的に許容される組成物は、治療有効量の、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つを含む。組成物は、固体または液体形態で投与されるよう特別に製剤化され得、以下に適合されたものを含む：（1）経口投与、例えばドレンチ剤（水性または非水性の溶液または懸濁物）、ロゼンジ剤、ドラジェ剤、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、口腔、舌下および全身吸収を標的としたもの）、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、舌へ適用するためのペースト剤；（2）非経口投与、例えば皮下、筋内、静脈内もしくは硬膜外注射によるもの、例えば滅菌溶液もしくは懸濁物、または持続放出製剤；（3）局所適用、例えば皮膚に適用されるクリーム剤、軟膏剤または制御放出パッチ剤もしくは噴霧剤；（4）膣内または直腸内、例えばペッサリー剤、クリーム剤または発泡剤；（5）舌下；（6）眼内；（7）経皮；（8）経粘膜；または（9）鼻内。加えて、化合物は、患者に移植または薬物送達システムを用いて注射され得る。例えば、Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); 米国特許第3,773,919号；および米国特許第35 3,270,960号を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／危険比が保たれる、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物および／または剤形を表す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、1つの臓器または身体の部分から別の臓器または身体の部分への対象化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸（steric acid））または溶媒カプセル化材料、を意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合しかつ患者に有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例は：（1）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース；（4）トラガカント末；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（8）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤用ワックス；（9）油、例えばピーナツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（10）グリコール、例えばプロピレングリコール；（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）；（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）発熱物質非含有水；（17）等張食塩水；（18）リンガー溶液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（22）バルク剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（23）血清成分、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDL；（22）C2〜C12アルコール、例えばエタノール；ならびに（23）薬学的製剤において使用されるその他の非毒性、適合性の物質、を含む。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化物質もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等の用語は、本明細書において言い換え可能に使用される。
キット
1つの局面において、本明細書には、（i）（a）GSK3経路阻害物質；（b）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（c）FGF経路活性化物質、の少なくとも2つ；ならびに（ii）使用説明書を含む、多能性幹細胞から骨格筋細胞への分化を誘導するための試薬キットが提供される。いくつかの態様において、キットは、GSK3経路阻害物質、3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；およびFGF経路活性化物質を含む。
いくつかの態様において、キットはさらに、幹細胞を含む。
スクリーニングアッセイ
1つの局面において、本明細書には、割球細胞、例えばゼブラフィッシュ割球において化学化合物または組成物をスクリーニングするための方法が提供される。この開示の態様は、臓器発生モジュレーターをスクリーニングするためのシステムを提供する。より詳細に、本開示は、臓器の発生および機能に影響するモジュレーターのための、高スループットスクリーニングを含む、スクリーニングを提供する。いくつかの態様において、スクリーニングアッセイは、ゼブラフィッシュ割球を利用する。
本発明を用いることで、臓器の発生および機能を増加、減少またはそれ以外の方法で調節する少なくとも3つの異なるクラスの化合物を区別することができる。この十分に確立された新規のアッセイにおける特異性は高く、多能性細胞から特定系譜の前駆細胞への分化を誘導することができる化合物；前駆細胞から完全分化細胞への分化を阻害することができる化合物；および前駆細胞から完全分化細胞への分化を誘導する化合物の入手を含む、より深く広い情報を提供する。したがって、学説により拘束されることを望まないが、このスクリーニングアッセイは、多能性細胞から完全分化細胞への経路およびその経路のモジュレーターを調査するために使用することができる。
通常、この方法は、試験化合物の存在下で割球を培養する工程であって、細胞培養物中の少なくとも1つの細胞がレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子が細胞系譜特異的マーカーをコードし、発現されたときに検出可能なシグナルを生成する、工程；および検出可能なシグナルを測定／検出する工程、を含む。検出可能なシグナルのレベルまたは量の変化は、試験化合物がレポーター遺伝子を発現する細胞を含む細胞系譜ならびに臓器および組織の発生を調節することを示す。検出可能なシグナルのレベルまたは量は、参照または対照に対して相対的に決定され得る。いくつかの態様において、参照または対照は、試験化合物を含まない割球培養物であり得る。
本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」という用語は、細胞系譜特異的な様式で発現され検出可能な応答またはシグナルを生成する細胞マーカーを発現する遺伝子を表す。本明細書で使用される場合、「検出可能」という用語は、その分子の存在の検出、画像化および／または監視を可能にする分子または要素または分子内の官能基を表す。レポーター遺伝子は、内因性遺伝子、外因性遺伝子または導入遺伝子であり得る。検出可能な応答は、概ね、観察または機器のいずれかにより検出可能なシグナルの変化または発生を表す。非限定的に、発現される分子は直接的に検出され得、またはその分子は試薬の存在下で検出可能なシグナルを生成し得る。さらに、培養物中のレポーターの量を決定するための任意の利用可能な方法が使用され得る。いくつかの態様において、検出可能な応答は光学シグナルである、すなわちレポーターは光学レポーターである。適当な光学レポーターは、蛍光レポーターおよび化学発光基を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、検出可能な応答は、蛍光または蛍光の変化、例えば蛍光の強度、蛍光の励起もしくは発光波長分布、蛍光の寿命および／または蛍光の偏光の変化である。いくつかの態様において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質に融合された細胞系譜特異的マーカー（CLSM）を含む融合タンパク質（すなわち、CLSM::FPコンストラクトまたは融合タンパク質）をコードする。
細胞系譜特異的マーカーは、該系譜の前駆細胞でのみ発現される；該系譜の最終分化細胞でのみ発現される；または該系譜の前駆細胞および最終分化細胞の両方で発現されるマーカーであり得る。
したがって、いくつかの態様において、割球細胞は、各々が異なる検出可能な細胞系譜特異的マーカーをコードする2つまたはそれ以上の異なるレポーター遺伝子を含み得る。1つのレポーター遺伝子は最終分化細胞で発現され得、第2のレポーター遺伝子は前駆細胞で発現され得、そして2つのレポーター遺伝子の少なくとも一方は前駆細胞および最終分化細胞の両方では発現されない。いくつかの態様において、割球細胞は、各々が異なる蛍光タンパク質に融合された細胞系譜特異的マーカーを含む融合タンパク質をコードする2つの異なるレポーター遺伝子を含む。例えば、細胞は、第1のCLSM::FPコンストラクト／融合タンパク質をコードする第1のレポーター遺伝子および第2のCLSM::FPコンストラクト／融合タンパク質をコードする第2のレポーター遺伝子を含み得、第1のコンストラクト／融合タンパク質のCLSMおよびFPは、第2のコンストラクト／融合タンパク質のCLSMおよびFPと異なるものである。このいくつかのさらなる態様において、CLSM::FPコンストラクトの1つはその細胞系譜の前駆細胞でも発現されるマーカーを含み得、第2のCLSM::FPコンストラクトはその細胞系譜の最終分化細胞で優先的に発現されるマーカーを含む。例えば、第1のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質に融合された細胞系譜前駆細胞特異的マーカー（CLPCSM）（すなわち、CLPCSM::FPコンストラクト）をコードし得、第2のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質を含む最終分化細胞系譜特異的マーカー（すなわち、DCSLM::FPコンストラクト）をコードし得る。「最終分化細胞系譜マーカー」は、最終分化細胞にのみ存在する細胞マーカーを意味する。非限定的に、2つの異なるレポーター遺伝子を含む細胞が、多能性細胞から前駆細胞への分化；前駆細胞から完全分化細胞への分化；または多能性細胞から完全分化細胞への分化を調節する化合物のスクリーニングに使用され得る。
いくつかの態様において、細胞系譜特異的マーカーは、筋原細胞のマーカーであり得る。いくつかの態様において、細胞系譜特異的マーカーは、筋形成前駆細胞のマーカーである。いくつかの態様において、細胞系譜特異的マーカーは、中胚葉細胞のマーカーである。筋形成、筋形成前駆体および中胚葉系譜マーカーは、本開示の他箇所に記載されている。
使用に適した蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質（例えば、DsRed）、黄色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質およびそれらの変種を含むがこれらに限定されない（例えば、米国特許第6,403,374号、同第6,800,733号および同第7,157,566号を参照のこと）。GFP変種の具体例は、高感度型GFP（EGFP）、脱安定化型EGFP、Doan et al, Mol. Microbiol, 55:1767-1781 (2005)に記載されるGFP変種、Crameri et al, Nat. Biotechnol., 14:315319 (1996)に記載されるGFP変種、Rizzo et al, Nat. Biotechnol, 22:445 (2004)およびTsien, Annu. Rev. Biochem., 67:509 (1998)に記載される濃青色（cerulean）蛍光タンパク質ならびにNagal et al, Nat. Biotechnol., 20:87-90 (2002)に記載される黄色蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない。DsRed変種は、例えばShaner et al, Nat. Biotechnol., 22:1567-1572 (2004)に記載されており、mStrawberry、mCherry、morange、mBanana、mHoneydewおよびmTangerineを含む。さらなるDsRed変種は、例えばWang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:16745-16749 (2004)に記載されており、mRaspberryおよびmPlumを含む。DsRed変種のさらなる例は、Fischer et al, FEBS Lett., 577:227-232 (2004)に記載されるmRFPmarsおよびFischer et al, FEBS Lett, 580:2495-2502 (2006)に記載されるmRFPrubyを含む。
蛍光タンパク質の他の非限定的なリストは、AceGFP、AcGFP1、AmCyan 1、AQ143、AsRed2、Azami-Green（mAG）、Cerulean、Cerulean、Citrine、cOFP、CopGFP、Cyan、CyPet、Dronpa、DsRed/DsRed2/DsRed-Express、DsRed-Monomer、EBFP、ECFP、EGFP、Emerald、eqFP611、EYFP、GFPs、HcRed1、HcRed-tandem、J-Red、Kaede、KFP、KikGR、mBanana、mCFP、mCherry、mCitrine、mEosEP、mHoneydew、MiCy、mKO、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mYFP、mYFP、mYFP、PA-GFP、PA-mRFP、PhiYFP、PS-CFP-2、Renilla、tdEosFP、tdTomato、T-Sapphire、TurboGFP、UV-T-Sapphire、Venus、YPet、ZsYellow 1ならびにそれらの誘導体およびアナログを含む。1つの態様において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）である。
当業者は、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードするレポーター遺伝子を構築する方法を熟知している。
例えば発蛍光団または蛍光タンパク質からの蛍光を検出するための当技術分野で公知の具体的な装置または方法は、インビボ近赤外蛍光（例えば、Frangioni, Curr. Opin. Chem. Biol, 7:626-634 (2003)を参照のこと）、Maestro（商標）インビボ蛍光画像化システム（Cambridge Research & Instrumentation, Inc.; Woburn, Mass.）、フライングスポットスキャナを用いるインビボ蛍光画像化（例えば、Ramanujam et al, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 48:1034-1041 (2001)を参照のこと）等を含むがこれらに限定されない。光学応答を検出する他の方法または装置は、非限定的に、目視検査、CCDカメラ、映像カメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、フルオロメーター、光ダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーまたは光電子増倍管を用いるシグナル増幅を含む。
いくつかの態様において、FPは、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはmCherryであり得る。
いくつかの態様において、レポーター遺伝子は、Myf5およびGFPを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの態様において、レポーター遺伝子は、mylz2およびmCherryを含む融合タンパク質をコードする。
「割球」という用語は、本明細書を通じて、胚から得られる少なくとも1つの割球（例えば1、2、3、4個等）を表す。「2つまたはそれ以上の割球のクラスター」という用語は、「割球由来増殖物（blastomere-derived outgrowth）」と言い換え可能に使用され、割球のインビトロ培養の間に生成する細胞を表す。例えば、割球は、胚から取得され初期培養された後、通常少なくとも1度***して2つまたはそれ以上の割球のクラスター（割球由来増殖物としても公知）を生成する。このクラスターは、胚または胎児細胞と共にさらに培養され得る。最終的に、割球由来増殖物は、***を継続するであろう。この培養法の過程で、これらの構造物からES細胞、TS細胞および部分分化した細胞型が発生し得る。
割球は、桑実胚の収縮前、桑実胚の収縮中、桑実胚の収縮直後、胞胚腔の形成前または胚盤胞期の間を含むがこれらに限定されない着床前の様々な発生段階で胚から取り出され得る。いくつかの態様において、割球（1個の割球、2個の割球または2個超の割球）は、楕円期の胚由来である。楕円期の胚は、割球を得るために解体され得る。
本明細書に開示されるスクリーニングアッセイのために、割球は、実施者または当業者に利用可能な任意の供給源から取得され得る。いくつかの態様において、割球は、ゼブラフィッシュ由来である。本明細書で使用される場合、「ゼブラフィッシュ」という用語は、ダニオ・レリオ（Danio rerio）の属および種であるとみなされる任意の魚または魚の系列を表す。いくつかの態様において、割球は、蛍光タンパク質に融合された細胞系譜特異的マーカーを発現するトランスジェニック種由来であり得る。当業者は、トランスジェニックゼブラフィッシュを作製する方法を熟知しており、これらの方法を、スクリーニングアッセイのための割球を得ることができるトランスジェニックゼブラフィッシュを作製するために容易に使用することができる。例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるGabriela, et al., BMC Developmental Biology 2007, 7:62 (doi;10.1186/1471-213X-7-62)を参照のこと。
割球を培養するための培養培地は、割球を培養するために当業者に利用可能な任意の適当な培地であり得る。例えば、本明細書の実施例の節で議論されている、70％LDF培地および30％RTS34st馴化培地から構成されるzESC培地が使用され得る。
アッセイのために、割球を、任意で、試験化合物との接触前に一定期間増殖させることができる。いくつかの態様において、実施者は、すでに適当な容器に植えられている割球を入手し、そしてこれを一定期間増殖させることができる。他の態様において、実施者は、割球を適当な容器にプレーティングし、そしてこれを、試験化合物との接触前に、一定期間、例えば少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間またはそれ以上増殖させる。
試験化合物を十分な期間細胞と接触させた後、レポーターの量（例えば、発現または活性）が測定され、そして対照または参照と比較される。例えば、接触時間は、数秒間から数日間または数週間であり得る。実施者は、最適なシグナル対ノイズ比を得るための接触時間、時間的制約、試験する試験化合物の量、細胞数、試験ボリューム、アッセイにおける試薬の利用性等を最適化することができる。
本明細書で使用される場合、「試験化合物」という用語は、運動神経細胞の生存を刺激および／または増加および／または促進するそれらの能力についてスクリーニングされる化合物および／または組成物を表す。試験化合物は、化学化合物および化学化合物の混合物、例えば有機または無機低分子；サッカリン；オリゴ糖；多糖；生体高分子、例えばペプチド、タンパク質ならびにペプチドアナログおよび誘導体；ペプチド模倣体；核酸；核酸アナログおよび誘導体；生物材料、例えば細菌、植物、真菌または動物細胞から得られる抽出物；動物組織；天然に存在するまたは合成性の組成物；ならびにそれらの任意の組み合わせを含む多種の異なる化合物を含み得る。いくつかの態様において、試験化合物は、低分子である。
候補試験化合物の数は、数百万に及ぶ。低分子、ポリマーおよびゲノムベースのライブラリを開発する方法は、例えばDing, et al. J Am. Chem. Soc. 124: 1594-1596 (2002)およびLynn, et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 8155-8156 (2001)に記載されている。市販の化合物ライブラリを、例えばArQule、Pharmacopia、graffinity、Panvera、Vitas-M Lab、Biomol InternationalおよびOxfordから入手することができる。これらのライブラリを、本明細書に記載されるスクリーニング装置および方法を用いてスクリーニングすることができる。化学化合物ライブラリ、例えばNIH Roadmap, Molecular Libraries Screening Centers Network (NLSCN)製のもの、を使用することもできる。化合物ライブラリの総合的なリストは、www.broad.harvard.edu/chembio/platform/screening/compound_libraries/index.htmにおいて見出すことができる。化学物質ライブラリまたは化合物ライブラリは、通常最終的に高スループットスクリーニングまたは工業生産において使用される保管化学物質の集合である。化学ライブラリは、簡単に言うと、一組の保管化学物質からなるものであり得る。各化学物質は、化合物の化学構造、純度、量および物理化学的特徴等の情報を有するデータベースのようなものに保存されている付随情報を有する。
本明細書で使用される場合、「低分子」という用語は、「天然産物様」である化合物を表し得るが、この「低分子」という用語は「天然産物様」化合物に限定されない。そうではなく、低分子は、典型的に、いくつかの炭素・炭素結合を含み、かつ約50超であるが約5000ダルトン（5kD）未満である分子量を有する点で特徴づけられる。好ましくは、低分子は、3kD未満、さらにより好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。いくつかの場合において、低分子は、700ダルトンに等しいまたはそれ未満の分子質量を有することが好ましい。
実施される個々の態様に依存して、試験化合物は、溶液中で遊離した状態で提供され得、または担体もしくは固体支持体、例えばビーズに付加され得る。多くの適当な固体支持体が、試験化合物の固定化のために使用され得る。適当な固体支持体の例は、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、セファデックス、セファロースとして市販されているもの）カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（PEG）、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、ガラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン・マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルク等を含む。加えて、本明細書に記載される方法において、試験化合物は、個別にまたはグループでスクリーニングされ得る。グループスクリーニングは、有効な試験化合物のヒット率が低いことが予想され所定のグループあたり1つより多い陽性結果が予想されない場合に特に有用である。グループスクリーニングはまた、相乗的に作用し得るヒットを決定するためにも有用である。
試験化合物は、任意の所望の濃度で試験され得る。例えば、試験化合物は、0.01nm〜約10mMの最終濃度で試験され得る。さらに、試験は、2つまたはそれ以上（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の異なる濃度で試験され得る。これは、試験化合物がある範囲濃度でのみ活性である場合に役立ち得る。試験化合物が2つまたはそれ以上の異なる濃度で試験される場合、その濃度差は、10〜10,000倍（例えば、10〜5000倍、10〜1000倍、10〜500倍または10〜250倍）の範囲であり得る。
スクリーニングアッセイは、細胞培養のために当業者に利用可能な任意の適当な容器または装置において行われ得る。例えば、アッセイは、24、96または384ウェルプレートにおいて行われ得る。1つの態様において、アッセイは384ウェルプレートにおいて行われる。
いくつかの態様において、スクリーニング方法は、高スループットスクリーニングである。高スループットスクリーニング（HTS）は、ロボット操作、データ処理および制御ソフトウェア、液体操作装置および高感度検出装置を使用する科学実験方法である。高スループットスクリーニングまたはHTSにより、研究者は、数百万の生化学、遺伝子または薬理学試験を迅速に行うことができる。高スループットスクリーニングは、当業者に周知であり、例えば、各々の内容の全体が参照により本明細書に組入られる米国特許第5,976,813号；同第6,472,144号；同第6,692,856号；同第6,824,982号および同第7,091,048号に記載されているものがある。
HTSは、候補化合物のライブラリに対するアッセイのスクリーニングの自動実施を使用する。アッセイは、比活性に関する試験であり；通常、生化学または生物学的機構の阻害または刺激である。典型的なHTSスクリーニングライブラリまたは「デッキ（deck）」は、100,000〜2,000,000超の化合物を含み得る。
HTSの鍵となる実験機器または試験容器は、マイクロタイタープレート：ウェルと呼ばれる小さな開放型のくぼみのグリッドが特徴的な、通常使い捨てされるプラスチック製の小さな容器、である。最新のHTS用マイクロプレートは、一般に、384、1536または3456個のいずれかのウェルを有する。これらはすべて96の倍数であり、これは8x12個の9mm間隔のウェルを有する初期の96ウェルマイクロプレートを反映している。
アッセイの準備のため、研究者は、プレートの各ウェルに、彼または彼女が行おうとする実験、例えば割球細胞または集団を用いる実験に適した試薬を満たす。試薬がウェル内の化合物を吸収する、該化合物に結合するまたはそれ以外の方法で該化合物と反応する（もしくは反応しない）よう一定のインキュベート時間を経た後、プレートのウェルすべてを対象とする測定が手作業でまたは機械により行われる。手作業による測定は、研究者自身が顕微鏡を用いて（例えば）コンピュータが容易に決定することができない変化を調査するためにしばしば必要となる。それ以外では、専用の自動分析機がウェル上で多数の実験、例えば比色測定、放射活性測定等、を実行し得る。この場合、機械は、各々の数値が単一のウェルから得られた値に対応している、数値のグリッドとして各実験の結果を出力する。高処理分析機は、このようにして数分で数ダースのプレートを測定し、非常に迅速に数千の実験データ点を生成することができる。
ゼブラフィッシュ胚を用いるスクリーニングは、発生、疾患および幹細胞生物学の研究に有用である。しかし、ゼブラフィッシュ胚の手作業による操作が必要となることが、高速ピペッティングおよび画像化における近年のイノベーションの利用を妨げている。ゼブラフィッシュ胚を用いるスクリーニングと比較して、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイは、高度に自動化され、6分の1の時間しか要さず、そしてわずか10分の1の胚しか消費しない。そのようなスループットは、より大きな化学ライブラリのスクリーニングを可能にし、そして遺伝的変異抑制物質のスクリーニングに使用することができる。例えば、cia、edyおよびwehを含むいくつかのゼブラフィッシュ貧血変異体は、鉄代謝の欠陥を抱えており、成熟赤血球のマーカーであるベンジジン染色を示さない。本開示のスクリーニングアッセイは、ベンジジン染色を回復する化学物質をスクリーニングするよう設計され得る。学説により拘束されることを望まないが、同定された化学物質は、これらの鉄代謝欠陥を処置するために使用され得る。
関心対象の細胞または組織を標識する蛍光レポーターを有するトランスジェニックゼブラフィッシュは、発生および幹細胞生物学の研究において広く使用されている。トランスジェニックレポーター系によるスクリーニングは先進的であるが、通常はWISHによる読み取りが好ましい。WISHと比較して、トランスジェニックレポーターは、通常、差異を検出する感度が低いと考えられている。さらに、トランスジェニック胚は、直ちに固定されスコア付けされる必要がある。しかし、本発明者らは、驚くべきことにかつ予想外に、主として2次元培養下のトランスジェニックレポーターが3-D胚におけるそれよりも好感度であることが理由で、トランスジェニックレポーターが本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに有用であることを見出した。さらに、画像はイメージングサイトメーターによって自動的に取り込まれ保存されるので、細胞を直ちに固定またはスコア付けする必要がない。さらに、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイでは、異なる色のレポーターを組み合わせることができ、異なる発生状態または系譜を同時に決定することができる。
培養下の割球細胞は空間的および時間的情報を欠いているので、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイは、トランスジェニック蛍光レポーター等の細胞マーカーを使用する。系譜または状態をより明確に定義するために、異なる色のレポーターを組み合わせることが有益であり得る。細胞形態および細胞数に関する追加情報を獲得するために、F-アクチンおよびMembrane-GFP等の細胞膜マーカーならびにDAPIおよびH2B-Tomato等の核マーカーも使用され得る。トランスジェニックレポーターがインビトロで異なる挙動を示す可能性があるため、研究者は、培養下のレポーター系がインビボ発現パターンを再現していることを確認する必要がある。最後に、いくつかの系譜は、ゼブラフィッシュ割球細胞から誘導することが困難であり得る。本発明者らは、後期段階で胚を解体することによってこの問題を回避した。例えば、赤血球分化を研究するため、本発明者らは、24hpf、27hpfまたは30hpfで胚を解体し、細胞をベンジジンで染色した。本発明者らは、これらの様々な段階で解体された細胞が高い染色性を示し、それらが赤血球発生の異なる段階にあることを示すことを発見した（データ示さず）。したがって、学説による拘束を望まないが、赤血球発生を研究するための本開示に開示される方法を用いる化学スクリーニングは、ベンジジン染色を用いて設計され得る。
本明細書に開示されるスクリーニングアッセイはまた、系譜分化および組織の自己再生の研究においてESC/iPSCに取って代わるものである。ESC/iPSCは、理論上、臓器修復のために任意の所望の組織に誘導され得るので、それらは細胞の欠陥によって引き起こされる疾患および受傷を処置する可能性を秘めている。1つの大きな困難は、ESC/iPSCを関心対象の細胞または組織に効率的に分化させることができるようにすることである。発生生物学において得られた知識から、胚発生の進行を再現する様式でESC/iPSCを分化させるプロトコルが設計された。しかし、均質、機能的かつ移植可能な関心対象の細胞または組織を得るためには、系譜分化のより正確な理解が必要である。この目的で、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイは、いくつかの大きな利点を提供する。第1に、ゼブラフィッシュ割球細胞は、おそらく胚形成プログラムがゼブラフィッシュにおいて促進されることが理由で、マウスおよびヒトESC/iPSCよりもずっと早く発達する。例えば、ゼブラフィッシュ割球細胞は48時間以内に骨格筋を形成するのに対して、マウスESC/iPSCはおよそ20日間を要する。これにより、変動の小さいより高速なスクリーニングが実現する。第2に、ゼブラフィッシュ割球細胞は、化学物質がより安定する低い温度である28度で培養される。第3に、スクリーニングアッセイは培養の維持または滅菌操作を必要としない。新たに生まれた胚から多数の細胞を容易に得ることができるという事実は、このシステムを非常に経済的なものにしている。最後に、透明な成体ゼブラフィッシュカスパー（casper）変異体が、インビボ幹細胞生着分析のために開発された。関心対象の細胞または組織は、組織の生着性をインビボで研究するために、カスパーに移植され得る。
割球細胞を用いる堅牢性のある化学スクリーニングシステムの開発は、胚を用いる研究の重要な補完物である。学説による拘束を望まないが、モルフォリノ/siRNAノックダウンおよびmRNA過剰発現等の他の遺伝的ツールが、割球細胞を用いるゲノム規模の機能喪失および機能獲得遺伝的スクリーニングを実現するために使用され得る。カスパーベースの移植システムは、このシステムから得られた細胞の生着および自己再生の研究のために利用され得る。要約すると、本明細書に提示されているデータは、本明細書に記載されるシステムが十分に確立された蛍光トランスジェニック系を用いるスクリーニングを可能にし、かつ高速ピペッティングおよび画像化システムの利点を活用することを示している。このシステムは、任意の細胞系譜のために改変され得、そして我々の発生生物学の理解を高め、多くの疾患の細胞ベースの治療に関する知見を提供し得る。
本開示はまた、各々のコンストラクトが蛍光タンパク質に融合された細胞系譜特異的マーカーを含む、2つの異なる融合タンパク質コンストラクトを含む解体された割球細胞の集団を含む細胞培養システムを提供する。
本開示はまた、本開示に開示されるスクリーニングアッセイによって選択される化合物を提供する。
いくつかの選択された定義
利便性を考慮して、本願の、詳細な説明、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられている特定の用語をここにまとめる。そうでないことが示されていない限り、またはそれが文脈から暗示されていない限り、以下の用語およびフレーズは以下に提供される意味を含んでいる。そうでないことが明示的に示されていない限り、またはそれが文脈から明白でない限り、以下の用語およびフレーズは、その用語またはフレーズがそれらの属する技術分野において獲得している意味を排除しない。これらの定義は、個々の態様の説明を補助するために提供されるものであり、特許請求の範囲に記載の発明を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、そうでないことが文脈によって必要とされない限り、単数形の用語はその複数形を包含し、複数形の用語はその単数形を包含している。
そうでないことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施および試験には、任意の公知の方法、装置および材料が使用され得るが、その観点で、方法、装置および材料が本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、その発明に必須となる組成物、方法およびそれらの各成分を参照する際に使用されるが、特定されていない要素についても、それが必須であるかそうでないかによらず、含む余地を残している。
単数形（「a」、「an」および「the」）は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を包含する。同様に、「または、もしくは（or）」という単語は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、「および、ならびに（and）」を包含することが意図されている。
作業実施例以外では、または他に示されている場合以外は、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての場合において、「約」という用語によって修飾されることを理解されたい。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、参照される値の±5％（例えば、±4％、±3％、±2％または±1%）を意味し得る。
本開示の実施または試験においては、本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適当な方法および材料が記載されている。「含む（comprises）」という用語は、「含む（includes）」を意味する。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語のexempli gratiaを語源とするものであり、本明細書においては非限定的な例を示すのに使用される。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義である。
本明細書で使用される場合、「本明細書に（herein）」という用語は、本開示全体を表すために使用され、本開示の特定の節または小節に限定する意味はない。
「低下」、「減少した」、「減少」、「低下」または「阻害」という用語はすべて、本明細書において、概ね、実質的に有意な量の低下を意味するものとして使用される。しかし、疑念を避けるために言うと、「減少」、「低下」または「阻害」は、参照レベルとの比較で少なくとも10％の低下、例えば参照レベルとの比較で少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の低下または最大100％（例えば、参照サンプルとの比較で非存在レベル）を含む低下、または10〜100％の間の任意の低下を意味する。
「増加した」、「増加」または「増強」または「活性化」という用語はすべて、本明細書において、概ね、実質的に有意な量の増加を意味するものとして使用され；疑念を避けるために言うと、「増加した」、「増加」または「増強」または「活性化」は、参照レベルとの比較で少なくとも10％の増加、例えば参照レベルとの比較で少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、もしくは最大100％を含む増加、もしくは10〜100％の間の任意の増加、または参照レベルとの比較で少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍〜10倍の間の任意の増加、もしくはそれ以上を意味する。
「統計的に有意」または「有意」という用語は、統計的有意性を表し、概ね参照レベルから少なくとも2標準偏差（2SD）離れていることを意味する。この用語は、そこに差が存在することの統計的証拠を表す。これは、帰無仮説が実際に真であったときにその帰無仮説を却下する決定が為される蓋然性と定義される。
本明細書で使用される場合、「処置する」および「処置」という用語は、対象が疾患の少なくとも1つの症状の減少または疾患における改善、例えば有益または所望の臨床結果を示すよう、対象に有効量の組成物を投与することを表す。本発明の目的上、有益または所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不可能であるかによらず、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の減退、疾患の安定化された（悪化していない）状態、疾患の進行の遅延または鈍化、疾患状態の向上または緩和および寛解（部分的なものか全体的なものかによらず）を含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、処置は、処置を受けない場合に予想される生存と比較して延長された生存を表し得る。したがって、当業者は、処置が疾患状態を改善するかもしれないがその疾患を完全には治癒しないかもしれないことを理解している。本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、予防を含む。あるいは、処置は、疾患の進行が減少または停止する場合に「有効」である。いくつかの態様において、「処置」という用語はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比較して延長された生存を意味し得る。処置を必要とする者は、すでに疾患または状態を有すると診断された者および遺伝的感受性またはその疾患もしくは状態に寄与するその他の因子に起因して疾患または状態を発症する可能性のある者を含み、例えば、非限定的な例として、対象の体重、食事および健康は、真性糖尿病を発症する可能性のある対象に寄与し得る因子である。処置を必要とする者は、医学的または外科的注意、看護または管理を必要とする対象を含む。対象は、通常、疾患状態であるもしくは受傷しているか、またはその集団の平均的なメンバーよりも疾患状態になる危険が高く、そのような注意、看護もしくは管理を必要とする。
本明細書で使用される場合、「投与」、「導入」および「移植」という用語は、対象への細胞、例えば本明細書に開示される筋原細胞もしくは衛星細胞またはそれらの分化した子孫の、その細胞またはそれらの分化した子孫の所望の部位への少なくとも部分的な局在化を実現する方法または経路による設置に関して、言い換え可能に使用される。細胞またはそれらの分化した子孫は、関心対象の組織に直接投与され得、あるいはその細胞もしくはそれらの子孫またはその細胞の成分の少なくとも一部分が生存状態で維持される対象の所望の場所への送達を実現する任意の適当な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、短いものでは数時間、例えば24時間から、数日間、長いものでは数年間であり得る。
本明細書で使用される「移植」という用語は、宿主（すなわち、移植レシピエントまたは移植対象）への新しい細胞（例えば、筋原細胞または衛星細胞）、組織（例えば、該細胞から生成される分化細胞）または臓器の導入を表す。
本明細書で参照される「細胞培養培地」という用語（本明細書で「培養培地」または「培地」とも称される）は、細胞の生存を維持し増殖を支援する栄養分を含む細胞を培養するための媒体である。細胞培養培地は、以下のいずれかを適当な組み合わせで含み得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースもしくはその他の糖、抗生物質、血清または血清代用物およびその他の成分、例えばペプチド成長因子等。特定の細胞型のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
「細胞株」という用語は、典型的に単一の原細胞からまたは定義されたおよび／もしくは実質的に同一の原細胞集団から得られるほとんどまたは実質的に同一の細胞の集団を表す。細胞株は、長期間（例えば、数ヶ月間、数年間、無制限の期間）培養下で維持されたものまたは維持することができるものであり得る。それは、細胞に無制限の培養寿命を付与する自然発生的なまたは人工的な形質転換プロセスを経たものであり得る。細胞株は、当技術分野でそのように認識されているすべての細胞株を含む。細胞は時間と共に変異およびおそらく後成的変化を獲得し、そのため細胞株の個々の細胞の少なくともいくつかの特性が相互に相違し得ることが理解されるであろう。
本明細書で使用される「系譜」という用語は、共通の祖先を有する細胞または共通の発生運命を有する細胞を表す。例にすぎないが、内胚葉起源のまたは「内胚葉系譜」である細胞は、その細胞が内胚葉細胞由来であり、そして内胚葉系譜限定経路、例えば、やがて肝細胞、胸腺、膵臓、肺および腸に分化し得ることが決定的な内胚葉細胞を生じる1つまたは複数の発生系譜の経路、に沿って分化し得ることを意味する。中胚葉起源のまたは「中胚葉系譜」である細胞は、その細胞が筋原細胞由来であり、そして中胚葉系譜限定経路、例えば、筋肉細胞、例えば骨格筋細胞を生じる1つまたは複数の筋形成系譜の経路に沿って分化し得ることを意味する。
本明細書で使用される「分化」という用語は、原始的な段階からより成熟した（すなわち、原始性の低い）細胞への細胞の細胞的発達を表す。本明細書で使用される「定向分化（directed differentiation）」は、非遺伝的操作を介して、未分化（例えば、より原始的な細胞）からより成熟した細胞型（すなわち、原始性の低い細胞）へと細胞を分化させることを表す。いくつかの態様において、幹細胞は、筋原細胞への定向分化に供される。
本明細書で使用される「多能性」または「多能状態」という用語は、3つすべての胚生殖層：内胚葉（腸組織）、中胚葉（血液、筋肉および血管を含む）ならびに外胚葉（例えば、皮膚および神経）、に分化する能力を有する細胞を表し、典型的にはインビトロで長期間、例えば1年超または30継代超、***する能力を有する。
「多分化能性」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生上の多目的性を有する細胞を表す。
「全能性」という用語は、成体のすべての細胞および胎盤を含む胚外組織を生成する能力を示す分化性を有する細胞を表す。受精卵（接合体）は全能性であり、その早期に分割された細胞（割球）も同様である。
「分化細胞」という用語は、その自然形態では本明細書で定義される意味での多能性でない任意の初代細胞を意味する。「分化細胞」という用語はまた、部分的に分化した細胞、例えば多分化能性細胞、または安定な非多能性の部分的に再プログラムされた細胞を包含する。多くの初代細胞は培養下に置くと完全分化の特徴をある程度喪失し得ることに留意されたい。したがって、そのような細胞を単に培養することは、分化細胞という用語に包含され、これらの細胞を非分化細胞（例えば未分化細胞）または多能性細胞にするものではない。分化細胞から多能性細胞への移行は、培養下で分化の特徴を部分的に喪失させる刺激を超える再プログラム刺激を必要とする。再プログラム細胞はまた、一般に培養下で限られた回数のみ***する能力を有する親の初代細胞と比較して、成長力を喪失せずに長期の継代を行うことができるという特徴を有する。いくつかの態様において、「分化細胞」という用語はまた、細胞分化プロセスを経て専門性の低い細胞型の細胞から（例えば、未分化細胞または再プログラム細胞から）得られるより専門化された細胞型の細胞を表す。
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖細胞、着床前の胚に存在するまたは該胚から得られる細胞以外の任意の細胞またはそのような細胞のインビトロでの増殖から得られる細胞を表す。別の言い方をすると、体細胞は、生殖系細胞の対語としての、生物の身体を形成する任意の細胞を表す。哺乳動物において、生殖系細胞（「配偶子」としても公知）は、***および卵子であり、これらは受精時に融合して接合体と呼ばれる細胞を生じ、そこから哺乳動物の全胚が発生する。***および卵子、それらを生成する細胞（生殖母細胞）および未分化幹細胞以外の哺乳動物体内のあらゆる他の細胞型は、体細胞であり；内蔵器官、皮膚、骨、血液および結合組織はすべて体細胞から構成されている。いくつかの態様において、体細胞は、胚に存在しないまたは胚から得られないおよびそのような細胞のインビトロでの増殖から生じない体細胞を意味する「非胚性体細胞」である。いくつかの態様において、体細胞は、胚もしくは胎児以外の生物に存在するもしくは該生物から得られるまたはそのような細胞のインビトロでの増殖から生じる細胞を意味する「成体体細胞」である。
本明細書で使用される場合、「成体細胞」は、胚形成後に全身で見出される細胞を表す。
細胞の個体発生学との関連で、「分化する」または「分化」という用語は、相対的な語であり、「分化細胞」は、その前駆細胞よりも発生経路をさらに下流に進行した細胞であることを意味する。したがって、いくつかの態様において、本明細書で定義される意味での再プログラム細胞は、系譜限定前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化し得、これはその後にその経路をさらに下った他のタイプの前駆細胞（例えば、組織特異的前駆体、例えば、心筋細胞前駆体）に、そして特定の組織型において特徴的な役割を果たす最終段階の分化細胞に分化し得、そしてこれはさらに増殖する能力を保持している場合もしていない場合もある。
「表現型」という用語は、実際の遺伝子型に関係なく、特定の環境条件および因子のセットの下でその細胞または生物を定義する1つまたは多数の全体的な生物学的特徴を表す。
「外因性」という用語は、その物質がその天然供給源以外の細胞中に存在することを表す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、人間の手が関与するプロセスによってそれが本来は見出されないまたはそれが少量でしか見出されない生物学的系、例えば細胞または生物に導入された核酸（例えば、sox2転写因子をコードする核酸）またはタンパク質（例えば、sox2ポリペプチド）を表す。物質（例えば、sox2転写因子をコードする核酸またはタンパク質、例えばsox2ポリペプチド）は、細胞またはその物質を引き継いだ細胞の祖先に導入される場合、外因性とみなされるであろう。対照的に、「内因性」という用語は、その物質がその生物学的系または細胞（例えば、分化細胞）にとってネイティブであることを表す。
本明細書で使用される「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリペプチドの場合、核酸またはポリペプチドが、その天然供給源において見出される場合にその核酸もしくはポリペプチドと共に存在するおよび／または細胞によって発現される場合もしくは分泌型ポリペプチドの例では分泌される場合にその核酸もしくはポリペプチドと共に存在するであろう少なくとも1つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離されていることを表す。化学合成された核酸もしくはポリペプチドまたはインビトロ転写／翻訳を用いて合成されたものは、「単離されている」とみなされる。
本明細書で使用される「単離された細胞」という用語は、それが本来見出される生物から取り出された細胞またはそのような細胞の子孫を表す。任意で、細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されたものである。任意で、細胞は、後に、第2の生物に導入されるまたはそれ（もしくはその子孫である細胞）を単離した生物に再導入される。
本明細書で使用される単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、細胞の混在集団または異種集団から取り出され分離された細胞の集団を表す。いくつかの態様において、単離された集団は、細胞を単離または濃縮する元となった異種集団と比較して実質的に純粋な細胞集団である。いくつかの態様において、単離された集団は、再プログラム細胞および再プログラム細胞を得る元となった細胞を含む細胞の異種集団と比較して実質的に純粋な再プログラム細胞集団である再プログラム細胞の単離された集団である。
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋」という用語は、細胞集団全体を構成する細胞に対して少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、そして最も好ましくは少なくとも約95％純粋である細胞の集団を表す。換言すると、再プログラム細胞の集団に関する「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書で定義される意味で再プログラム細胞またはそれらの子孫でない細胞を約20％未満、より好ましくは約15％、10％、8％、7％未満、最も好ましくは約5％、4％、3％、2％、1％未満または1％未満含む細胞の集団を表す。いくつかの態様において、本発明は、再プログラム細胞の集団を拡大培養する方法を包含し、拡大培養された再プログラム細胞集団は実質的に純粋な再プログラム細胞集団である。
本明細書で使用される場合、「マーカー」という用語は、細胞の特徴および／または表現型を表す。マーカーは、関心対象の特徴を含む細胞の選択のために使用され得る。マーカーは個々の細胞で異なるであろう。マーカーは、特定の細胞型の細胞の形態学的、機能的もしくは生化学的（酵素的）特徴、またはその細胞型によって発現される分子、のような特徴である。好ましくは、そのようなマーカーは、タンパク質であり、より好ましくは、抗体または当技術分野で入手可能な他の結合分子に対するエピトープを含む。しかし、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸およびステロイドを含むがこれらに限定されない細胞内で見出される任意の分子からなるものであり得る。形態学的特徴または特質の例は、形状、サイズおよび核 対 細胞質比を含むがこれらに限定されない。機能的特徴または特質の例は、特定の物質に接着する能力、特定の色素を取り込むまたは排除する能力、特定の条件下で遊走する能力および特定の系譜に沿って分化する能力を含むがこれらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な方法によって検出され得る。マーカーはまた、形態学的特徴の非存在またはタンパク質、脂質等の非存在であり得る。マーカーは、ポリペプチドおよびその他の形態学的特徴の存在および非存在の固有の特徴のパネルの組み合わせであり得る。
「選択可能マーカー」という用語は、発現されたときに、選択可能な表現型、例えば、細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制剤に対する耐性（例えば抗生物質耐性）、栄養要求性（nutritional prototrophy）またはそのタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞を識別する基礎として使用することができる特定タンパク質の発現、を細胞に付与する遺伝子、RNAまたはタンパク質を表す。その発現を容易に検出することができるタンパク質、例えば蛍光もしくは発光タンパク質または色を生じる基質、蛍光もしくは発光物質（「検出可能マーカー」）に対して作用する酵素は、選択可能マーカーの下位集団を構成する。通常多能性細胞において選択的または排他的に発現される遺伝子にネイティブな発現制御エレメントに連結された選択可能マーカーの存在が、多能性状態に再プログラムされた体細胞の同定および選択を可能にする。様々な選択可能マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（neo）、ピューロマイシン耐性遺伝子（puro）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、アデノシンデアミナーゼ（ada）、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ（PAC）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hyg）、多剤耐性遺伝子（mdr）、チミジンキナーゼ（TK）、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）およびhisD遺伝子、が使用され得る。検出可能マーカーは、緑色蛍光タンパク質（GFP）青色、サファイア色、黄色、赤色、オレンジ色およびシアン色蛍光タンパク質ならびにこれらのいずれかの変種を含む。発光タンパク質、例えばルシフェラーゼ（例えば、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼ）も使用される。当業者に明らかなことであろうが、本明細書で使用される「検出可能マーカー」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現産物、例えばコードされるタンパク質、を表し得る。
いくつかの態様において、選択可能マーカーは、それを発現しない細胞またはそれを有意に低いレベルで発現する細胞と比較して、それを発現する細胞に対して増殖および／または生存上の利益を与える。そのような増殖および／または生存上の利益は、典型的に、その細胞が特定条件、例えば「選択条件」下で維持される場合に得られる。効果的な選択を確実に行うために、細胞の集団は、そのマーカーを発現しない細胞が増殖および／もしくは生存せずその集団から排除されるまたはその数がその集団のごくわずかな割合にまで減少する条件の下でおよびそれに十分な期間、維持され得る。増殖および／または生存上の利益を付与するマーカーを発現する細胞を、その細胞集団を選択的条件下で維持しマーカーを発現しない細胞をほぼまたは完全に排除することによって選択するプロセスは、本明細書で「陽性選択」と称され、そのマーカーは「陽性選択に有用」であると表現される。陰性選択および陰性選択に有用なマーカーもまた、本明細書に記載される特定の方法において利用される。そのようなマーカーの発現は、そのマーカーを発現しない細胞またはそれを有意に低いレベルで発現する細胞と比較して、そのマーカーを発現する細胞に対して増殖および／または生存上の不利益を与える（または、別の見方をすると、そのマーカーを発現しない細胞は、そのマーカーを発現する細胞と比較して、増殖および／または生存上の利益を有する）。そのマーカーを発現する細胞は、したがって、選択的条件下で十分な期間維持されたときに細胞の集団からほぼまたは完全に排除され得る。
本明細書で使用される「薬物スクリーニング」という用語は、特定の機能を有する薬物を同定するための研究施設における細胞および組織の使用を表す。いくつかの態様において、本発明は、疾患または疾病（例えば、ヒトの疾患または疾病）の治療剤として有用な化合物または薬物を同定するための本明細書に開示される方法により製造された筋原細胞または衛星細胞における薬物スクリーニングを提供する。
「共投与する」または「共投与」という用語は、2つまたはそれ以上の化合物を対象に投与することを表し、ここで、2つまたはそれ以上の化合物は、それらが相加的または相乗的に作用するかぎり、同時にまたは異なる時点で投与され得る。化合物は、同一の製剤でまたは別個の製剤で投与され得る。別個の製剤で投与される場合、化合物は、相互に対して任意の時間内に投与され得る。例えば、化合物は、相互に対して24時間、12時間、6時間、5時間、4時間、3時間、2時間、1時間、45分間、30分間、25分間、20分間、15分間、10分間、5分間またはそれ未満の時間内に投与され得る。別個の製剤で投与される場合、任意の化合物が先に投与され得る。加えて、共投与は、異なる化合物が同一経路によって投与されることを必要とするものではない、すなわち、その組み合わせの化合物は、同一または異なる投与経路によって対象に投与され得る。したがって、各々は、独立してまたは共通の剤形として投与され得る。
本開示は以下の実施例によってさらに説明されるがこれらは限定をなすものと解釈されるべきではない。実施例は説明目的のみで提供され、どのような形式であれ、本明細書に記載される任意の局面を限定することは意図されていない。以下の実施例は、いかなるかたちであれ、本発明を限定するものではない。
実施例1：ゼブラフィッシュ胚培養システムは種横断的に脊椎動物の筋形成を促進する因子を定義する
衛星細胞のエクスビボ拡大培養および多能性細胞の成熟骨格筋への定向分化は、再生生物学における困難な挑戦であると言われている。初期および後期骨格筋分化のレポーターを含むゼブラフィッシュ胚培養システムを用いて、我々は、2,400個の化学物質の筋形成に対する影響を試験し、3個のGSK3β阻害物質、2個のカルパイン阻害物質および1個のアデニリルシクラーゼ活性化物質フォルスコリンを含む、筋前駆体を拡大培養させる6個を同定した。フォルスコリンはまた、培養下でマウス衛星細胞の増殖を増強し、インビボで生着するそれらの能力を維持した。bFGF、フォルスコリンおよびGSK3β阻害物質BIOの組み合わせは、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）において骨格筋分化を誘導し、インビボで筋肉修復に寄与する生着可能な筋形成前駆体を生成した。遺伝子操作を行わずに衛星細胞を増殖させiPSCを筋肉に分化させるこれらのアプローチの定義は、骨格筋生物学に新しい知見を提供し、代謝および神経筋疾患の新規の治療をもたらし得る。
この研究において、我々は、3つの異なる脊椎動物システムにおいて筋肉への特異化および衛星細胞の増殖を調節する進化的に保存された分子経路を同定する学際的、システム横断的なアプローチを採用した。ゼブラフィッシュにおいて利用可能な強力な化学遺伝的アプローチを利用することにより、我々は最初に、ゼブラフィッシュ割球細胞を用いる高スループット画像ベース化学スクリーニングを行い、筋発生をかく乱する29個の化合物および筋形成を促進する6個を同定した。我々は次に、保存された活性を同定するために、この筋促進化合物を、マウス筋衛星細胞およびヒトiPSCに対して試験した。アデニリルシクラーゼ活性化物質であるフォルスコリンは、培養下で衛星細胞の増殖を有意に増加させ、拡大培養された細胞の大部分は、移植によりジストロフィー性の筋を再生する能力を含む、新たに単離される衛星細胞の表現型および機能の特徴を保持していた。加えて、bFGF、GSK3β阻害物質BIOおよびフォルスコリンの組み合わせは、成熟筋線維への自発的分化および免疫無防備レシピエントマウスに移植したときに生着し成熟筋線維に寄与し得る筋形成前駆体の生成を含む、ヒトiPSCの骨格筋特異化を誘導した。ゼブラフィッシュ胚培養システムを用いる我々の研究は、魚類、マウスおよびヒト細胞集団において筋発生を促進する化学物質の組み合わせを明らかにした。この研究は、正常な筋発生の機能的研究および筋骨格疾患治療の開発のために哺乳動物筋幹細胞を生成および拡大培養する新規かつ扱いやすいシステムを提供する。
材料および方法
ゼブラフィッシュの世話およびトランスジェニック系：myf5-GFP;mylz2-mCherry2重トランスジェニック系を、標準的なゼブラフィッシュ飼育法（Westerfield, 1995）を用いて飼育および維持した。すべてのゼブラフィッシュ実験および手順を、Children's Hospital Boston Institutional Animal Care and Use Committeeの承認の下で行った。
解体された割球細胞の培養：解体された割球細胞を、70％LDF培地および30％RTS34st馴化培地から構成されるzESC培地で成長させた。LDF培地は、50％ Leibowitz's L-15（Invitrogen）、35％ DMEM（Invitrogen）および15％ Ham's F-12（Invitrogen）を含み、0.18g/l炭酸水素ナトリウム、15mM HEPES（Invitrogen）、1％ L-グルタミン（Invitrogen）、10μg/mlシプロフロキサシン（Sigma-Aldrich）、100μg/mlピペラシリン（Sigma-Aldrich）、10μg/mlアムホテリシンB（Sigma-Aldrich）、10nM亜セレン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）、1％ N2（Invitrogen）および2％ B27（Invitrogen）を補充したものである。RTS34st馴化培地は、新しい培地（Leibowitz's L-15プラス15％ FBS）をRTS34st細胞のコンフルエントな培養物上で3日間インキュベートすることによって調製した。
高スループットスクリーニング：4つの384ウェルプレートを0.1％ゼラチンでコーティングした。CHBライブラリ由来の化学物質を、1 ng/ml bFGFを含有するzESC培地で150倍希釈し、ウェルあたり30μlとなるよう等分した。myf5-GFP;mylz2-mCherryトランスジェニック系のオスおよびメスを一晩準備し、それらを交尾のために混合する朝まで分離した状態で置いた。およそ800個の楕円期の胚をE3胚用水で3回洗浄し、これを絨毛膜の除去のためにプロナーゼ処置した。絨毛膜を除去した胚をE3胚用水で3回洗浄し、そして1ng/ml bFGFを含有する25mlのzESC培地が入った50mlファルコンチューブに回収した。胚を、およそ20回振盪することによって解体し、そして70μmナイロンメッシュフィルターを通してろ過した。得られた単一細胞を、1ng/ml bFGFを含有するzESC培地で60mlに希釈し、そして化学物質を事前に添加しておいた4つの384ウェルプレートに、ウェルあたり30μlとなるよう等分した。この細胞を、CO2の非存在下、28度のインキュベーター内で培養した。細胞を、Celigoサイトメーター（Cyntellect）によって、GFP、mCherryおよび透過光のチャネル下で画像化した。この画像を、ビルトインソフトウェアによって分析し、かつ目視により確認した。
ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーション：ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションは、以前に記載されたようにして行った（Belting et al., 2001）。
SMPの単離および培養：SMPの単離は、以前に記載されたようにして行った（Cerletti et al., 2008; Sherwood et al., 2004）。簡単に説明すると、MFA細胞を、インタクトな骨格筋（EDL、腓腹筋、四頭筋、ヒラメ筋、TA、上腕三頭筋、腹筋）から、この筋をコラゲナーゼII型および次いでディスパーゼ酵素で消化することによって調製した。MFA細胞を、FACSによるCD45- Sca-1- Mac-1- CXCR4+ b1-インテグリン+細胞集団の単離のために染色した。インビトロ拡大培養実験のために、SMPを、コラーゲン／ラミニンコートプレート上の、20％ウマ血清（Atlanta Biologics）、1％ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen）および1％グルタマックス（Invitrogen）を含有するF10（Gibco）中に播種した。細胞をbFGF処置した実験においては、5ng/ml bFGF（Sigma）を培地に毎日添加した。プレーティングの24時間後に、50μMフォルスコリン（Santa Cruz）または0.1％ DMSOをウェルに添加し、プレーティングの48時間後に、培地を、該化合物を含有する新しい培地と交換し、そしてこの処置をさらに36時間継続し、その後に培地を、該化合物を含まない新しい培地と交換した。5日間の培養後に細胞を計数するかまたは移植のために使用した。6日間の培養後に、筋形成コロニー形成アッセイのために細胞を固定し、計数した。分化実験のために、化合物処置を行ったまたは行わなかった細胞を5日間培養し、5日目に細胞を収集し、同数の細胞（8,000個の細胞）を96ウェルプレートの各ウェルの成長培地中に再プレーティングした。4時間後に、培地を、2％ウマ血清（Atlanta Biologics）、1％ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen）を含有し、50μMフォルスコリンまたは0.1％DMSOを含むまたは含まないDMEM（gibco）と交換した。分化培地中60時間の後に細胞を固定した。
免疫蛍光および画像化：培養されたSMPを4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、そして10μg/mlヘキスト（Invitrogen）で染色した。全細胞の写真を、Celigoサイトメーター（Cyntellect）を用いてUVチャネル下で撮影した。この画像をビルトインソフトウェアによって分析し、細胞数を計数した。分化細胞を、ミオシン重鎖（1次抗体：抗骨格ミオシンII型（速筋）1:200および抗骨格ミオシンI型（遅筋）1:100、Sigma、2次：ヤギ抗マウスIgG Alexa-555コンジュゲート（Molecular Probes）1:250）についてならびに10μg/mlヘキスト（Invitrogen）で染色し、そしてその全細胞の写真を、Celigoサイトメーター（Cyntellect）を用いてUVおよび赤色チャネルの下で撮影した。独自開発した改良版ImageJマクロを用いてこの画像を分析し、筋管における核の百分率を計算した。移植された筋肉の切片をGFP（ウサギ抗GFP Alexa488コンジュゲート（Invitrogen）1:250）およびジストロフィン（1次：ウサギ抗ジストロフィン（Abcam）1:50、2次：ヤギ抗ウサギIgG Alexa-555コンジュゲート（Molecular probes）1:250）について染色し、正立Zesis蛍光顕微鏡を用いて画像化した。
cAMPアッセイ：cAMPアッセイは、cAMP-Glo（商標）Assayキット（Promega）を製造元のプロトコルにしたがい用いて行った、
フローサイトメトリー：フローサイトメトリー分析は、Harvard Stem Cell Institute Flow Cytometry Core Facilityを通じて提供されたBD LSR IIを用いて行った。フローサイトメトリーデータを、DIVA（Becton Dickinson(BD), Franklin Lakes, NJ）ソフトウェアを用いて回収し、そしてFlowjoソフトウェア（Tree Star, Inc., Macintosh版8.1.1, Ashland, OR）を用いてオフライン分析した。フローサイトメトリーで使用した抗体は、以下を含むものであった：APC/Cy7抗マウスTer119、クローンTer119（1:200、Biolegend 116223）、APC/Cy7抗マウスCD45、クローン30-F11（1:200、Biolegend 103116）、APC/Cy7抗マウスCD11b、クローンM1/70（1:200、Biolegend 101226）、APC抗マウスLy-6A/E（Sca-1）、クローンD7（1:200、Biolegend 108112）、ビオチン抗マウスCD184（CXCR4、Fusin）（1:100、BD Biosciences 551968）、ストレプトアビジンPE-Cy7（1:100、eBioscience 25-4317-82）、PE抗マウス／ラットCD29抗体（1:100、Biolegend 102208）。生きた細胞を、カルセインブルー（1:1000）（Invitrogen, Carlsbad, CA）による陽性染色およびヨウ化プロピジウム（PI、1μg/mL）による陰性染色により同定した。抗体のインキュベートは、染色培地（SM = Hank's Buffered Saline Solution（HBSS,（Gibco））+ 2％ドナーウマ血清）中、氷上で15分間行った。
組織の受傷およびマウス衛星細胞の移植：細胞移植の1日前に、mdxマウスを麻酔し、そしてそれらのTA筋に25μl（0.03 mg/ml）のナジャモザンビカ（Naja mossambica）モザンビカカルジオトキシン（Sigma）を注射した。次の日、6,000個の新しく単離された2重選別GFP+ SMPまたは5日間の培養および化合物処置の後に6,000個のSMPから拡大培養された細胞全体を、これらの事前に受傷させておいた筋肉に20μl PBSを用いて直接注射した。陰性対照として、反対側のTAにPBSのみを注射した。移植から3〜4週間後、移植された筋肉を低温切開および顕微鏡によって収集および分析した。
ヒトiPSC株の作製および維持：BJ iPSCをChad Cowan（Harvard Stem Cell Institute， Cambridge， MA）から入手し、05400および00409ヒトiPSC株を、以前に記載されたように（Takahashi et al. 2007, Park et al. 2008）、KLF4、SOX2、OCT4およびc-MYC再プログラム因子のレトロウイルス導入によって成体皮膚線維芽細胞から作製した。多能性は、形態学、NANOG、OCT4、SSEA3-4およびTra1-60の免疫染色、NANOG、OCT4、SOX2、REX1、TERT、DNｍ3b多能性遺伝子の遺伝子発現ならびに、EB形成によって評価した。iPSCを、マトリゲルコート皿（BD）上で成長させ、mTeSR1培地（STEMCELL technologies）中で維持した。
iPSCの骨格筋分化：細胞を、7日間の懸濁培養によりEBを生成することによって分化させ、次いでさらに29日間、マトリゲルコートプレートに移した。懸濁培養中に、細胞に、10 ng/ml bFGF（Invitrogen）、0.5μM BIO（Santa Cruz Biotechnologies）および20μMフォルスコリン（Santa Cruz Biotechnologies）を補充した分化培地STEMDiff Apel培地（STEMCELL technologies）を与えた。EBのプレーティングの2〜3日後、残りの分化のために、培地を、2％ウマ血清を補充したDMEMに切り換えた。
遺伝子発現分析：総RNAは、RNeasy Miniキット（Qiagen, Mississagua, ON）を用いてiPSCから抽出した。RNA（1μg）を、高効率逆転写キット（Applied Biosystems）を製造元の指示にしたがい用いて逆転写させた。リアルタイムPCRは、SYBRグリーンPCRマスターミックス（Bio-Rad）を用いて行った。蛍光は、マルチカラーリアルタイム検出システム（Cycler IQ: Bio-Rad）を用いて検出した。すべての実験を2つ組で行い、ハウスキーピング対照としてGAPDHを使用した。この研究で使用したプライマーが表3に示されている。
（表３）この研究で使用したプライマー
Figure 0006445422
免疫蛍光：iPSCを4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.1％ Tritonを含有するPBSで15分間透過処理した。次いで細胞を、5％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するPBSで1時間ブロックし、そして抗デスミン（Dako）、ミオゲニン、MYOD1（Santa Cruz Biotechnologies）およびPAX7（DSHB、Iowa大学）1次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。Alexa488およびAlexa594コンジュゲート2次抗体（Invitrogen）を、適宜、検出に使用した。
iPSC由来筋前駆体の移植研究：インビボ移植研究のために、Jackson Laboratories製の5〜6週齢NSGマウス（ストック番号002378）を使用した。筋内細胞移植の1日前に、TA筋を、0.3 mg/mlカルジオトキシンを用いて事前に受傷させた。24時間後、筋形成前駆体（1 x 105細胞/25μl PBS）を左側TA筋に注射し、各マウスの右足に陰性対照として同量のPBSを与えた。移植から1ヶ月後、マウスを屠殺し、筋肉を収集し、そして液体窒素で冷却されたイソペンタン中で凍結させた。連続する凍結切片を4％ PFAで固定し、そして抗δ-サルコグリカン抗体（Leica）で染色した。
電子顕微鏡および免疫金染色：電子顕微鏡観察のために、サンプルを、室温で3時間、0.1Mリン酸緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドの溶液中で固定し、0.1Mリン酸緩衝液で数回洗浄し、そしてその後に室温で1時間、0.1Mリン酸緩衝液中2％四酸化オスミウムの溶液を用いて後固定した。その後、サンプルを脱水してアラルダイト樹脂ブロックに包埋し、そしてLKB Novaウルトラミクロトームおよびディアトームダイアモンドナイフを用いて80ナノメートル刻みにした。このグリッドを酢酸ウラニルおよびレイノルズクエン酸鉛で染色し、その後にこれをPhilips EM-301透過型電子顕微鏡で観察した。
電子免疫金染色のために、サンプルを、室温で3時間、0.1Mリン酸緩衝液中2％パラホルムアルデヒド、1％グルタルアルデヒド中で固定し、洗浄し、そしてこれを直接アラルダイト樹脂ブロックに包埋した。80ナノメートルの切片を、1次抗骨格ミオシン重鎖および軽鎖抗体（AbCam）、次いで金コンジュゲート2次抗体で染色した。次いでこのサンプルをコントラストのために酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、その後にこれをPhilips 301透過型電子顕微鏡で観察した。
結果
骨格筋発生を試験するためのゼブラフィッシュ胚培養システム：筋形成の特異化に関与する因子をスクリーニングするためのプラットフォームを開発するため、我々は、骨格筋形成の異なる発生状態を区別することができる蛍光「レポーターフィッシュ」を構築することを模索した。ゼブラフィッシュの原腸形成時に、中胚葉前駆体は、退縮および収斂伸長運動を起こし、筋形成を開始する。筋形成の拘束は、myoDおよびmyf5の発現によって示され（Weinberg et al., 1996）、これらは機能的に冗長であり、最初期の筋形成前駆体において重複した発現を示す（Hinits et al., 2009）。これらの前駆体の最終分化は、速骨格筋において見られるミオシン軽鎖ポリペプチド2（mylz2）等の筋特異的構造タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞を生じる（Ju et al., 2003）。ゼブラフィッシュ胚において骨格筋細胞の異なる発生状態を標識するため、我々は、myf5-GFP;mylz2-mCherry 2重トランスジェニックゼブラフィッシュ系を作製した。その11体節期において、myf5-GFP発現は、新たに形成される体節に限定され、mylz2-mCherry発現は検出されなかった（図1A）。mylz2-mCherryの発現は受精30時間後（hpf）に前方体節において最初に検出され、その後に後方体節へと広がっていった（図1A）。これらのデータは、myf5-GFPおよびmylz2-mCherryの発現が、それらの対応する内因性遺伝子の発現パターン（Thisse et al., 2001）を再現すること、したがって胚発生時の筋形成の特異化および進行を追跡する有用な代理を提供することを示している。ゼブラフィッシュ割球細胞がインビトロで筋肉を形成することができるかどうかを試験するため、我々は、その楕円期でmyf5-GFP;mylz2-mCherry胚を解体し、それらをゼラチンコート皿にプレーティングした。細胞をゼブラフィッシュESC（zESC）培地中で培養すると（Fan and Collodi, 2006）、1〜10％がGFP陽性となり、それによってmyf5発現の上方調節が示された。GFP陽性細胞の中で、1〜5％はまたmCherry（mylz2）陽性であり、これによって我々のインビトロシステムにおいて筋形成の特異化および分化が起こったことが示唆された（図1B）。
筋形成はfgf24およびfgf8 2重欠損胚において本質的にブロックされることから（Draper et al., 2003）、FGFシグナル伝達は、初期ゼブラフィッシュ胚における筋発生に必要とされているようである。FGFシグナルは、アフリカツメガエルにおいてmyoD発現を直接的に活性化し（Fisher et al., 2002）、速骨格筋誘導に重要である（Groves et al., 2005）。これらのデータに基づき、我々は、bFGFを胚培養物に添加し、大部分の細胞がGFPおよびmCherry 2重陽性となることを見出し、これにより強力な筋促進効果が示された（図1Bおよび8A）。myoD、mrf4およびmyogを含む他の筋形成遺伝子もまた、bFGFと共に培養された割球細胞によって高度に発現された（図1C）。GFPおよびmCherryによって標識されたインビトロ作製細胞が予想される筋発生段階に対応していることを確認するため、我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって各集団を単離し、その遺伝子発現を分析した。GFP/mCherry 2重陰性集団と比較して、myf5-GFP+;mylz2-mCherry-および2重陽性集団は、筋形成遺伝子の発現が豊富であり、血液（胚グロビン）および肝臓（ifabp）遺伝子の低発現を示した。2重陽性細胞はまた、myf5-GFP+:mylz2-mCherry-集団よりも高レベルのmyoDおよびmylz2を発現し、これにより、そのインビボ状況（図1A）と同様、myf5-GFPおよびmylz2-mCherryがインビトロ培養下のこれらにおいても段階特異的筋形成集団を正確に標識することが示された（図1D）。
このインビトロ筋形成システムをさらに検証するため、我々は次に、インビボでの筋発生に必要とされる遺伝子が培養下でも必要とされるかどうかを決定した。myf5およびmyoD 2重モルフォリノを注入されたゼブラフィッシュ胚は、おそらく筋発生不良により、運動不能となる（Schnapp et al., 2009）。ミオゲニンおよびmrf4等の鍵となる筋形成調節因子（mrf）ならびにミオシン重鎖（mhc）およびmylz2等の構造タンパク質をコードする遺伝子の発現は、2重モルファントでは見られない（Schnapp et al., 2009）。これらの以前の観察と合致して、2重モルフォリノを注入された胚は、30hpfでmyf5-GFPおよびmylz2-mCherry発現を欠いている（図8B）。加えて、この2重モルファント由来の培養された割球細胞は、myf5-GFPおよびmylz2-mCherryの発現の劇的な減少を示し、これによりMyf5およびMyoDがインビトロでの筋発生においても同様に必須となることが示された（図8C）。胚の筋形成プログラムは、ゼブラフィッシュ割球のインビトロ分化の間も保存されているようである。
化学遺伝的スクリーニングは骨格筋発生の調整物質を同定する：調整物質のスクリーニングに対するこの胚培養システムの感度を評価するため、我々は、全トランスレチノイン酸（ATRA）を含むFGF中で細胞を処置した。ATRAは神経系譜への分化を促進するためにマウスESC培養物に事前に添加し（Lu et al., 2009）、ATRA処置はゼブラフィッシュにおいて後部中胚葉形成を阻害する（de Jong et al., 2010）。これらの以前の研究と合致して、ATRA処置は、ゼブラフィッシュ割球細胞の培養物において骨格筋発生をブロックした（図1E）。
骨格筋形成の候補調整物質のより高スループットの分析を実現するため、この胚培養システムを、半自動化学スクリーニングプラットフォームに適合させた。myf5-GFP;mylz2-mCherry胚を2重トランスジェニック親から回収し、その楕円期で解体した。得られた個々の割球細胞を、化学物質を事前に添加した4つの384ウェルプレートに等分し、そして筋発生を促進するために培養培地にbFGFを補充した。1日後、細胞を自動的に画像化し、Celigoサイトメーターを用いてGFP、mCherryおよび明視野シグナルについて分析し、そして画像分析を目視検査によって確認した（図2A）。
我々は、2,400個の化学物質をスクリーニングし、検出可能な毒性を示さずにGFPまたはmCherryシグナルをかく乱する29個を同定した。GFP（Myf5）およびmCherry（Mylz2）シグナルの変化に基づき、これらの29個のヒットを3つのカテゴリーに分類することができた。カテゴリーI化合物は、筋前駆体から成熟筋細胞への分化をブロックすることによって生じると考えられる表現型であるmyf5-GFP陽性細胞のみを含む培養物を形成するものである（図2Bおよび表1）。筋肉の形成に必要とされることが以前（Cuenda and Cohen, 1999; Wu et al., 2000; Zetser et al., 1999）に示されているp38経路の阻害物質を含む11個の化学物質が、このカテゴリーに含まれた。カテゴリーIIは、17個の化学物質を含み、いずれかの蛍光色を発現する細胞を少数発生させ、これはおそらくこれらの化学物質が筋前駆体運命への中胚葉前駆体の拘束をブロックするためである（図2Bおよび表2）。カテゴリーIIIには、おそらく筋発生を加速させることによって両方のマーカーの高発現を誘導した1個のみの化合物（GSK3β阻害物質であるSB415286）が分類された（図2B）。
（表１）成熟筋肉への分化をブロックする例示的な化学物質およびそれらの標的経路
Figure 0006445422
表1は、具体的にはmylz2-mCherry発現の減少によって同定される化学物質を列挙している。この表現型は、おそらく筋前駆体分化のブロックに起因するものである。我々は、生物学的に既知の化学物質を含む化学物質ライブラリを使用した。化学物質が標的とする経路が右側に列挙されている。
（表２）骨格筋前駆体の形成をブロックする化学物質およびそれらの標的経路
Figure 0006445422
表2は、myf5-GFPおよびmylz2-mCherrzの両方の発現の減少によって同定される化学物質を列挙している。この表現型は、おそらく骨格筋前駆体形成のブロックに起因するものである。我々は、生物学的に既知の化学物質を含む化学物質ライブラリを使用した。化学物質が標的とする経路が中央に列挙されている。そのヒットがインビボで機能するかどうかを試験するため、発生期の胚を個々の化学物質で処置し、myoD発現についてアッセイした。これらのヒットの3分の2が、異なるレベルのmyoD染色の低下を示し、これが図9Aに示されている。これらの染色結果が3番目のカラムに列挙されている。
これらの化学物質がまたインビボで筋形成を調節し得るかどうかを試験するため、我々は、インビトロで筋形成をブロックしたカテゴリーII化学物質の各々でゼブラフィッシュ胚を処置し、6体節期でのmyoDの発現に対する効果を評価した。試験した17個の化合物の中で、11個がインビボでmyoD発現を低下させた。2個の化学物質は非特異的な毒性を誘導し、4個は明らかな効果を生じなかった（図9Aおよび表2）。したがって、我々の初期インビトロスクリーニングにおいて同定されたヒットの65％が、インビボで筋発生をかく乱させ、これによりこのインビトロスクリーニングがインビボでの筋肉生物学を解明する上で有効かつ効果的であることが示唆された。
bFGFは、FGF受容体チロシンキナーゼを活性化することによって筋発生を誘導する。このコンセプトに基づき、我々は、bFGFの筋促進効果をブロックする3つの受容体チロシンキナーゼ（RTK）阻害物質を同定した（図9B）。bFGFは、MEK/ERKおよびホスホイノシチド-3-キナーゼ（PI3K）-AKTシグナル伝達が関与するものを含むいくつかの細胞内経路を活性化する。筋発生を阻害するMEK/ERK阻害物質は見出されなかった（図9B）。対照的に、bFGFの筋促進効果は、PI3K阻害物質LY-294002によって完全にブロックすることができた（図9B）。別のPI3K阻害物質であるウォルトマンニンも、同様の効果を示した（図9B）。mTOR阻害物質であるラパマイシンによる処置もまた、bFGFにより誘導される筋発生をブロックした（図9B）。これらの結果は、bFGFがMEK/ERK経路ではなくPI3K-mTORシグナル伝達経路を通じて筋形成を促進することを示唆している。
高感度化学遺伝的スクリーニングは骨格筋発生の増感物質を同定する：bFGFの強い筋促進効果は、我々のシステムをそのまま用いて骨格筋発生の増感物質を同定することを困難にする。筋発生を促進する化学物質は、2,400個の中からわずか1個しか同定されなかった。このシステムを骨格筋発生の増感物質の同定のために高感度化させるために、我々は、bFGFの非存在下でスクリーニングを繰り返した。この高感度スクリーニングにおいて、2,400個の中から6個の化学物質がGFPおよびmCherryシグナルを増加させることが同定された（図2C）。6つのヒットのうち、3つはGSK3β阻害物質（ケンパウロン、SB415286およびSB216763）、2つはカルパイン阻害物質（E-64-DおよびMDL28170）、そして1つはcAMP活性化物質であるフォルスコリンであった。
インビボで筋形成を誘導するこれらの化学物質の能力を試験するため、胚を各化学物質と共にインキュベートし、myoD発現に対する影響を評価した。6個の化学物質のいずれも、おそらく強い内因性の筋発生プログラムによるマスキング効果に起因して（データ示さず）、野生型胚においてmyoD発現を増加させなかった。我々は次に、これらの化学物質とFGF経路の相互作用を評価した。以前に報告（Draper et al., 2003）されたように筋形成の欠陥をもたらすfgf8およびfgf24を標的とするモルフォリノを胚に注入し、そしてこの2重fgf8;fgf24モルファントに各化学物質を与え、筋形成を救済するその能力を評価した。試験した6個の化合物のうち、フォルスコリンのみが筋形成の欠陥を救済し、これによりフォルスコリンが他の化合物と比較して特有の活性を有することが示された（図9C）。
フォルスコリン処置はcAMPレベルを上昇させ、インビトロでマウス衛星細胞を拡大培養させる：我々は、ゼブラフィッシュ割球において骨格筋発生を増強するヒット化学物質が同様に他の種においても筋前駆細胞の形成および／または拡大培養を促進するという仮説をたてた。この仮説を試験するため、我々は最初に、成体マウス骨格筋から精製された衛星細胞に対するこれらの化合物の効果を試験した。マウス衛星細胞を、（Cerletti et al., 2008; Sherwood et al., 2004）に記載されるようにしてFACSにより単離し、そしてこれを異なる濃度の（Cerletti et al., 2008; Sherwood et al., 2004）の筋形成促進化学物質の各々の存在下で播種し培養した。5日間の培養後に、生じたコロニー内の細胞数を決定した。試験した6個の化学物質のうち、フォルスコリンのみが用量依存的なマウス衛星細胞培養物の拡大培養を誘導した（データ示さず）。これらの培養物内の細胞数は、bFGFの存在下および非存在下の両方で、フォルスコリン処置によって有意に増加した（図3A）。フォルスコリン処置はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のマウスモデルであるmdxマウス（Sicinski et al., 1989）から播種された衛星細胞培養物内の細胞数を増加させた。mdxマウス由来の衛星細胞は、典型的に、対照条件下で不十分なエクスビボ拡大培養を示し、フォルスコリン処置はそれらの増殖を未処置の野生型衛星細胞の培養物中で通常みられるレベルにまで回復させた（図3Bおよび10A）。
フォルスコリンが衛星細胞培養物における細胞数増加を誘発する機構を評価するため、我々は、フォルスコリン処置培養物においてcAMP産生を評価し、細胞生存および増殖アッセイを行った。アデニル酸シクラーゼの活性化物質としてのフォルスコリンの既知の役割（Metzger and Lindner, 1981; Seamon et al., 1981）に合致して、フォルスコリン処置は、マウス衛星細胞培養物においてcAMPレベルの用量依存的な増加を誘導した（図3C）。衛星細胞の生存および増殖に対するフォルスコリンの効果を試験するため、96ウェルプレートのウェルあたり1つの細胞となるよう単一細胞をプレーティングし、これをフォルスコリンまたはDMSOで処置した。6日間のインビトロ培養の後、我々は、任意の数の筋原細胞を含むウェルの数（細胞生存の尺度）およびそれらのウェル内の細胞の数（細胞増殖の尺度）を定量した（図3D）。筋形成コロニーの形成率は、フォルスコリン処置細胞とDMSO処置細胞の間で相違せず（図3E）、これによりフォルスコリン処置が細胞生存に影響しないことが示された。以前の観察（図3A）と合致して、フォルスコリンの存在下で形成された筋形成コロニーは、DMSO処置マウスと比較してより多くの細胞を含んでおり（図3F）、これは筋原細胞の増殖に対するこの化合物の効果を反映している可能性が高い。
細胞増殖の増加が衛星細胞の分化に対するフォルスコリンの阻害効果に起因するものかどうかを試験するため、我々は、培養衛星細胞を対照条件下で拡大培養し、そしてフォルスコリンの存在下または非存在下でそれらの分化を誘導した。各培養物の筋管における核の百分率を、筋形成分化の指標として定量した（図4A）。これらの条件の下で、衛星細胞からの筋管形成は、フォルスコリン処置群とDMSO処置群の間で相違しなかった（図4Bおよび4C）。同様に、成長時にフォルスコリンに曝され、該化合物の除去後に分化するよう誘導された衛星細胞（図4D）は、対照処置細胞と同じ効率で筋管を形成した（図4Eおよび4F）。したがって、フォルスコリン処置衛星細胞は、化合物暴露のタイミングに関係なく、インビトロで混乱なく分化する。
フォルスコリン処置細胞は衛星細胞の表現型の特徴を保持し、インビボでジストロフィー性骨格筋に生着する：筋衛星細胞は、Cxcr4およびβ-1インテグリンマーカーを共発現する筋線維関連細胞のサブセット内に非常に豊富に存在する（Sherwood et al., 2004）。CXCR4およびβ-1インテグリンを欠く筋原細胞は、mdx筋肉への生着に失敗する（Cerletti et al., 2008）。高レベルのCxcr4発現から高レベルのPax7発現も予想され、これは筋幹細胞様の特性を有する連続移植可能な衛星細胞のサブセットを特定する（Rocheteau et al., 2012）。これらのデータは、CXCR4およびβ-1インテグリンが生着可能な筋原細胞の有用な代理マーカーであることを示唆している。フローサイトメトリー分析は、5日間の培養後にフォルスコリン拡大培養細胞の78.9％ +/- 1.52％がCXCR4およびβ-1インテグリンの両方の共発現を維持していたことを明らかにした（図5Aおよび5B）。したがって、フォルスコリン中で培養された衛星細胞の高い比率が、新しく単離された生着可能な筋幹細胞の表現型の特徴を保持する。
培養されたフォルスコリン処置衛星細胞の生着能力を直接的に評価するため、我々は、移植実験のためにβ-アクチン-GFPトランスジェニックマウス（Wright et al., 2001）から細胞を単離した。6,000個のGFP発現衛星細胞をフォルスコリンと共に5日間培養し、そして得られた細胞を事前に受傷させておいたmdxマウスの筋肉に移植した（図5C）。移植の3〜4週間後にレシピエントの筋肉を収集し、そしてドナー由来GFP発現筋線維の存在について分析した。原始的なおよび生着可能な筋形成の細胞集団を拡大培養させるフォルスコリンの能力に合致して、GFP+線維の数は、元の数の新しく単離された衛星細胞を受け取った動物または拡大培養されたDMSO処置細胞を受け取った動物と比較して、拡大培養されたフォルスコリン処置細胞を受け取った動物において有意に多かった（図5Dおよび5E）。さらに、フォルスコリン処置細胞によって生着された筋線維は、mdx筋肉に通常存在しないジストロフィンについて染色された（図10B）。したがって、フォルスコリン暴露は、培養された衛星細胞から生着可能な筋原細胞を拡大培養する。
bFGF、BIOおよびフォルスコリンの組み合わせはiPSCにおいて骨格筋プログラムを活性化する：我々のゼブラフィッシュスクリーニングにおいて同定された化学物質の筋誘導能力の保存性をさらに試験するため、我々は次に、ヒト多能性細胞の分化に対するそれらの影響を評価した。ヒトiPSCまたはESCを骨格筋系譜に分化させることは現時点で困難であり、主だった成功は、筋特異的転写因子遺伝子の異所導入および過剰発現を用いるもののみである（Darabi et al., 2012; Tedesco et al., 2012）。したがってゲノム改変を使用せず筋形成分化を再現性をもって誘導する戦略には未到達であった。
我々は、健常なヒトドナー由来の3つの異なるiPSC株（00409、05400およびBJ）の分化に対する筋促進化合物の効果を試験した（図11および12）。BJ、00409または05400 iPSC由来の胚様体（EB）を、bFGF（10 ng/ml）、BIO（0.5μM）およびフォルスコリン（20μM）を含有する無血清分化培地に7日間曝した（培地を1、3および5日目に添加した）。我々は、様々なGSK3βアンタゴニストを試験し、BIOがより低い毒性を有していたことから（データ示さず）、本スクリーニングにおいて見出されたGSK3β阻害物質ではないBIOを使用した。7日後、我々は、分化の結果を定量するため、外胚葉、内胚葉または中胚葉に特異的なマーカーのパネルの発現を測定した。中胚葉マーカーであるGATA2、PAX7、MYF5、MYOD1遺伝子は、対応する未分化のiPSC株と比較して、分化の2、4および7日後に有意に上方制御され（図6A、6Bおよび13A）、一方、外胚葉および内胚葉遺伝子は有意に変化しなかった。これらのデータは、この化学混合物が中胚葉系譜に特に有利に働き、筋形成の特異化を促進することを示唆している（図6A、6Bおよび13A）。2種組み合わせ、例えばbFGF + BIOまたはbFGF + フォルスコリンは、bFGF/BIO/フォルスコリン「トリプルカクテル」と比較して有意に低い強度の筋形成誘導を示した（図13Aおよび13B）。
iPSC由来細胞がbFGF/BIO/フォルスコリンによって最終骨格筋分化を起こすかどうかを決定するため、EBをさらなる分化のためにマトリゲルコート皿上にプレーティングした。これらの培養物の遺伝子発現分析は、PAX7、MYOD1およびMYF5発現が培養36日後も増加した状態であったことを明らかにした。筋形成分化後期の2つのマーカーであるミオゲニンおよびMyHCの発現は、20日後に増加し、そしてこの増加は、36日後により大きくなった（図6B）。36日目に、我々は、我々の培養物において、デスミンおよびミオゲニン染色に関して陽性である多くの多核化した筋管を観察した（図6C）。iPSCは自然に心臓細胞に分化することが知られているが、遺伝子発現分析は、分化36日後に心臓マーカー（NKX2.5およびGATA2）が増加せず、処置された培養物において自発的に拍動する細胞が見られないことを明らかにした。対照的に、拍動細胞は、未処置細胞株において12〜14日後に観察された（データ示さず）。したがって、3つの化合物は、心原性プログラムではなく骨格筋形成プログラムを誘導した。
我々はさらに、bFGF/BIO/フォルスコリン中で培養されたiPSC由来細胞の骨格筋運命を、電子顕微鏡（EM）および抗ヒト骨格筋ミオシン重鎖および軽鎖抗体（skミオシンHL鎖）による免疫金染色によって確認した。36日後の培養物から収集されたBJ iPSC由来細胞のEM分析は、skミオシンHL鎖に関して陽性染色された明確なサルコメア構造の存在を明らかにした（図6Dおよび6E）。同様の結果が、00409および05400 iPSCでも得られた（図12C、12Dおよび12E）。
iPSC由来筋前駆体はインビボで骨格筋に生着することができる：bFGF/BIO/フォルスコリンカクテルを用いた筋形成の特異化がヒト多能性細胞から生着可能な筋前駆体を生成または増殖させることができるかどうかを決定するため、我々は、インビボで筋再生を支援するヒトiPSC由来の筋原細胞の能力を評価した。BJ、05400または00409 iPSCを、bFGF/BIO/フォルスコリンで処置することによって分化させ、そして分化12日後に免疫不全マウスに移植した。この時点は、衛星細胞特異的転写因子PAX7の発現が12日目にそのピークに達するという理由で選択した（図6B）。iPSC由来細胞を、移植24時間前にカルジオトキシン注射により事前に受傷させておいたNOD/SCID/IL2Rγ-/-（NSG）マウスの四肢筋に直接移植した。これらのレシピエントマウスの反対側の筋肉は、損傷させたがPBSのみを注射した。移植1ヶ月後、筋肉を収集し、そしてヒト筋特異的δ-サルコグリカン抗体による免疫染色によって生着性について分析した。PBSを注射した筋肉は、ヒトδ-サルコグリカンに関して検出可能な染色を示さなかった（図7）。ヒトδ-サルコグリカン+線維はまた、00409由来線維芽細胞株を移植したとき非存在であった（図7）。対照的に、3つのiPSC株（BJ、05400または00409）のいずれか由来の筋形成前駆体の移植は、細胞の有意な生着性を示し、ヒトδ-サルコグリカンに関して明確な反応性を示した（図7）。加えて、注射された筋肉において腫瘍形成は観察されなかった（データ示さず）。これらの研究により、bFGF/BIO/フォルスコリン処置により生成されるiPSC由来前駆細胞が筋形成の拘束を維持し、インビボ移植後に再生的な筋形成を支援することが確認される。
考察
本研究において、我々は、筋形成前駆細胞の特異化および増殖を制御する保存された機構を明らかにするために、ゼブラフィッシュにおいて利用可能な化学遺伝的アプローチを活用した。このプロセスによって、我々は、マウス衛星細胞の増殖を促進し、ヒトiPSCの筋形成分化を特異化する新しいアプローチを定義した。多くの以前の研究は、発生および疾患を調査するために、ゼブラフィッシュの全胚における化学遺伝学を用いていたが、このアプローチは、胚の手作業による操作を必要とし、かつしばしば時間のかかるホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションによる読み取りを必要とする。いくつかの研究所は高速ピペッティングおよび画像化を用いて全胚をスクリーニングしたが、このアプローチは胚の3次元構造のために非常に困難である。ゼブラフィッシュの全胚を用いるスクリーニングと比較して、本明細書に記載される培養物ベースのスクリーニングシステムは、6分の1の時間しか要さず、かつ10分の1の胚しか使用しない。そのようなスループットは、非常に大きな化学ライブラリのスクリーニングを可能にし、哺乳動物細胞株における従来的な化学スクリーニングの速度を高速化する。インビボで特定の細胞型を標識することが知られている蛍光レポーターを有するトランスジェニックゼブラフィッシュを使用することができ、そして画像をイメージングサイトメーターによって自動的に読み込み保存することができるため、細胞を直ちに固定またはスコア付けする必要がない。最近、我々の胚培養システムに対して一定の類似性を有するゼブラフィッシュ外植片システムが、血管新生前駆体を拡大培養することができる化合物を同定した（Huang et al., 2012）。我々のシステムは、異なる色のレポーターの組み合わせにより、複数の異なる発生状態または系譜を同時に調査することができる。
このスクリーニングシステムの1つの注目すべき局面は、それが胚において利用可能な正常な空間的および時間的情報の非存在下で決定的な発生上の移行を支援するようであることである。いくつかの細胞系譜はゼブラフィッシュ割球細胞から得ることが困難であり得るが、所望の組織を研究するために後期段階での胚の解体が使用され得る。最終的に、我々は、同様のゼブラフィッシュ培養システムが、多くの異なる臓器系における発生に影響する化合物および経路のスクリーニングにおいて高い有用性を証明すると予測する。
ゼブラフィッシュ胚培養システムの別の特筆すべき特質は、種をまたぐ類似のシステムにおいて組織の特異化および前駆細胞の拡大培養に影響する決定的な経路を同定するその能力である。このゼブラフィッシュシステムで見出された化学物質は、マウス由来の出生後筋衛星細胞を拡大培養し、ヒト多能性細胞からの筋形成分化を特異化する。我々のスクリーニングにおいて同定されたこれらの化学物質は、実験用途のためおよびおそらく最終的には細胞治療のための哺乳動物の筋前駆体の製造における多くの厄介な課題のうちの2つに対する取り組みにおいて有用性を証明した。実際、精製された骨格筋衛星細胞を細胞治療に使用する際の大きな障害の1つは、成体組織におけるそれらの非常に低い出現率である。遺伝的な筋障害における全身の骨格筋の機能的回復には、多数の生着可能な細胞が必要となり、それらの生着能力を維持しつつ精製された衛星細胞を培養下で拡大培養する試みは大部分が不成功であった（Montarras et al., 2005）。本願において、我々は、アデニリルシクラーゼ活性化物質であるフォルスコリンで処置されたマウス筋前駆体が、培養下で増強された増殖を示すことを示している。これらのデータは、活性化型のcAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB）を発現するトランスジェニックマウスにおけるcAMPシグナル伝達の活性化物質が初代筋芽細胞のインビトロ増殖を増加させることを示す以前の報告と合致するものである（Stewart et al., 2011）。フォルスコリンは、インビトロで衛星細胞の分化を阻害せず、フォルスコリン処置マウス前駆細胞は、該化合物の除去後に正常に分化する。フォルスコリン処置前駆細胞はまた、新しく単離される衛星細胞のほとんどの表現型の特徴を保持している。フォルスコリンは筋前駆体の生成または維持における天然のGタンパク質共役受容体の活性化を模倣していることが考えられる。事前に受傷させておいたmdx筋肉に移植すると、フォルスコリンで拡大培養された衛星細胞は生着してジストロフィン発現筋線維を生成した。フォルスコリン処置は、対照条件下で不十分なエクスビボ拡大培養を示したジストロフィー性mdxマウスから単離された筋前駆体の増殖を劇的に増加させた。したがって、フォルスコリン処置は、自家治療のためにヒトジストロフィー性衛星細胞のエクスビボ拡大培養を増強するためにまたは筋肉障害のための細胞置換治療の効果を向上させるのに有用であり得る。
機能的な衛星細胞を拡大培養させるフォルスコリンの能力はまた、フォルスコリンに暴露されたゼブラフィッシュ割球およびヒトiPSCにおいて観察される増強された筋形成を説明するものであり得る。培養中、いくつかの多能性細胞は、骨格筋前駆体を形成するよう分化すると考えられ、そしてフォルスコリンは、cAMPシグナル伝達を活性化することによってこれらの筋原細胞の増殖を増加させそれによって培養物の筋肉形成能力を向上させるよう作用し得る。これまでは多能性細胞からの確実に骨格筋分化を行うのが困難であったため、ほとんどの以前の研究はトランスジェニック改変に依存していた（Darabi et al., 2012; Tedesco et al., 2012）。我々のゼブラフィッシュ胚培養スクリーニングから得られる知見を適用することによって、我々は、ゲノム改変または転写因子の過剰発現を使用せずにインビトロおよびインビボでiPSCから成熟筋線維への筋形成分化に成功する新規の化学カクテルを同定した。iPSCを用いてそのような筋発生の化合誘導物質を発見するスクリーニングは、特にヒトシステムにおける筋形成分化が約36日を要することを考えると、非常に試薬および労力を要するものである。これに対して、このゼブラフィッシュ筋分化プロトコルは、わずか1〜2日しか要さず、約1週間で小規模スクリーニングを完了させることができる。
本明細書で定義される筋形成プロトコルの1つの注目すべき特徴は、培養中に骨格筋運命を特異化する選択性である。EB形成時のGSK3β阻害ならびにcAMPおよびbFGF経路活性化の同時実施は、これらの細胞の骨格筋分化への拘束を特異的に促進するのに十分であり、我々のマーカー分析は、このトリプルカクテルに暴露された培養物において心臓および神経系譜を含む別の運命が比較的少数であることを示している。興味深いことに、以前の研究は、cAMPシグナル伝達が胚の筋分化中の異なる時点で増加することならびに衛星細胞において筋肉の再生および代謝の適合を促進することを示している（Carlsen, 1975; Chen et al., 2005; Le Peuch et al., 1979; Zalin and Montague, 1974）。筋幹細胞の筋形成はまた、Wntの活性化によっても誘導され得（Brack et al., 2008; Polesskaya et al., 2003）、PI3K-AKT経路のbFGF媒介活性化も同様に筋分化の強力なメディエーターであることが報告されている（Stitt et al., 2004）。本明細書に提示されているデータは、予想外に、これらの経路が筋分化中に特有の協調をし、エクスビボでの筋形成分化ならびに損傷組織に移植すると宿主の筋肉と混和してヘマトキシリンおよびエオシン染色によっては再生されたマウス筋肉線維から区別できない生着可能な筋形成前駆体の生成を実現することができることを示している。これらの結果は、テトラーマ形成の非存在および外因性因子を与えるだけでiPSCの筋形成の特異化を達成する能力を共に、iPSC由来筋原細胞を筋骨格疾患の処置のための再生細胞治療に適用できることを示している。いずれにしても、報告されている発見は、正常な筋形成の理解にとってならびに様々な実験設定下での筋骨格および代謝疾患のインビトロ研究にとって非常に有益である。
参考文献
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本明細書および実施例で特定されているすべての特許およびその他の刊行物は、すべての目的で、明示的に、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、単に本願の出願日より前の開示物として提供されるにすぎない。これに関するいかなる事情も、先行発明であることまたは任意のその他の理由で本発明者らがそのような開示よりも先の日付を主張する権利を有さないことの承認とされるべきではない。これらの文献の日付に関する言及または内容に関する表示はすべて、出願人が入手し得た情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
本明細書では好ましい態様が示され詳細に説明されているが、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変、付加、置換等を行うことができること、したがってこれらは添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲に含まれるものとみなされることが、関連分野の当業者に明らかであろう。さらに、本明細書に記載され示されている様々な態様の任意の一つはさらに、すでに示されていない程度まで、本明細書に開示される任意の他の態様に示される特徴を組み入れるよう改変され得ることが、当業者に理解されるであろう。

Claims (26)

  1. 幹細胞の筋原細胞への分化を誘導する方法であって、（i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質の存在下で幹細胞を培養する工程を含む方法であり、
    幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞、または多分化能性幹細胞であり、
    cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物がフォルスコリンであり、ならびに
    FGF経路活性化物質が塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）である、方法。
  2. 幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞である、請求項1記載の方法。
  3. GSK3経路阻害物質が、GSK3β阻害物質である、請求項1または２記載の方法。
  4. GSK3経路阻害物質の濃度が、約0.05μM〜約50μMである、請求項1〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物の濃度が、約0.1μM〜約500μMである、請求項1〜４のいずれか一項記載の方法。
  6. FGF経路活性化物質の濃度が、約0.25 ng/ml〜約100 ng/mlである、請求項1〜５のいずれか一項記載の方法。
  7. 筋原細胞が、骨格筋形成系譜の細胞である、請求項1〜６のいずれか一項記載の方法。
  8. 筋原細胞が、Pax3、Pax7、MyoD、Myf5、ミオゲニン、GATA2、MHCおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される細胞マーカーを発現する、請求項1〜７のいずれか一項記載の方法。
  9. 筋原細胞が、中胚葉細胞である、請求項1〜８のいずれか一項記載の方法。
  10. 接触の前に幹細胞から胚様体を形成する工程をさらに含む、請求項1〜９のいずれか一項記載の方法。
  11. 接触が、少なくとも1日間行われる、請求項1〜１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 幹細胞が、損傷した筋組織または筋肉量の増加の処置を必要とする対象由来である、請求項1〜１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 損傷した筋組織が、身体的受傷または事故、疾患、感染、酷使、血液循環の喪失または筋萎縮もしくは筋消耗の結果である、請求項１２記載の方法。
  14. GSK3経路阻害物質がGSK3β阻害物質である、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
  15. GSK3経路阻害物質が、6-ブロモインジルビン-3'-オキシム（BIO）、CHIR98014；CHIR99021；ARA014418；ヒメニアルジシン（hymenialdisine）；フラボピリドール；アロイジンA；アロイジンB；CT20026；SU9516；スタウロスポリン；GF109203x；RO318220；SB216763；SB415286；I5；CGP60474；ケンパウロン（9-ブロモパウロン）；アルスターパウロン；2-シアノエチル-アルスターパウロン；1-アザ-アルスターパウロン；1-アザ-ケンパウロン；9-シアノ-2,3-ジメトキシパウロン；2-ヨードパウロン；2-ブロモ-9-ニトロパウロン；2,3-ジメトキシ-9-ニトロパウロン；7-ブロモ-5-(4-ニトロフェニルヒドラゾノ)-4,5-ジヒドロ-1-H-[1]ベンゾアゼピン2(3H)-オン；7,8-ジメトキシ-5-(4-ニトロフェニルヒドラゾノ)-4,5ジヒドロ-1H-[1]ベンゾアゼピン-2-(3H)-オン；9-シアノパウロン；9-クロロパウロン；9-トリフルオロメチルパウロン；2,3-ジメトキシ-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-メチルオキシカルボニルメチルパウロン；9-フルオロパウロン；9-ブロモ-2,3-ジメトキシパウロン；9-ブロモ-2,3-ジメトキシパウロン；9-メチルパウロン；10-ブロモパウロン；2-ブロモパウロン；11-クロロパウロン；2-(3-ヒドロキシ-1-プロピニル)-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-(2-ヒドロキシエチル)-パウロン；ケンパウロン；アルスターパウロン；2-シアノエチル-アルスターパウロン；1-アザ-ケンパウロン；1-アザ-アルスターパウロン；9-ブロモ-12-メチルパウロン；9-ブロモ-5-(メチルオキシカルボニルメチル)パウロン；11-メチルパウロン；パウロン；11-エチルパウロン；9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-6-(ヒドロキシアミノ)-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン；2,9-ジブロモパウロン；11-ブロモパウロン；2,3-ジメトキシパウロン；9-ブロモ-7,12ジヒドロ-6-メチルチオ-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン；(E)-2(3-オキソ-1-ブテニル)-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12エチルパウロン；9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-インドロ[2-3-d][1]ベンゾアゼピン-6(5H)-チオン；2-ブロモ-9-トリフルオロメチルパウロン；2-[2-(1-ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]-9-トリフルオロメチル-パウロン；9-ブロモ-5メチルパウロン；9-メトキシパウロン；2-ヨード-9-トリフルオロメチルパウロン；9-ブロモ-12-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；9-ブロモ-12-(2-プロペニル)パウロン；9-ブロモ-4-ヒドロキシパウロン；8,10-ジクロロパウロン；5-ベンジル-9-ブロモパウロン；9-ブロモ-4-メトキシパウロン；9-ブロモ-5-エチルパウロン；9-ブロモ-5,7ビス-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；4-メトキシパウロン；9-ブロモ-5,6,7,12-テトラヒドロベンゾ[6-7]シクロヘプト[1,2.b]インドール；2-フェニル-4-(2-チエニル)-5H-ピリド[2-3d][1]ベンゾアゼピン-6(7H)-チオン；9-ブロモ-5,7,12-トリ-(tert-ブチルオキシカルボニル)-パウロン；9-ブロモ-5,12-ビス-(tert-ブチルオキシカルボニル)パウロン；4-(4-クロロフェニル)-2-(2-ナフチル)-5H-ピリド[23-d][1]ベンゾアゼピン-6(7H)-チオン；5,6,7,12-テトラヒドロベンゾ[6-7]シクロヘプト[1,2-b]インドール；N-ブチル-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ペンタンアミド；1-{4-アミノ-2-[(4-メトキシフェニル)アミノ]-1,3-チアゾール-5-イル}エタノン；N-ベンジル-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア；3-(4-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)プロパンアミド；4-(4-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ブタンアミド；2-(3-メトキシフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2イル)アセトアミド；2-(4-フルオロフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)プロパンアミド；2-(3-メチルフェニル)-N-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)アセトアミド；1-ベンジル-3-ナフタレン-1-イル-ウレアまたは1-ベンジル[1,3]ジオキソール-5-イル-3-ベンジル-ウレア；およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜１４のいずれか一項記載の方法。
  16. GSK3経路阻害物質がBIOである、請求項1〜１５のいずれか一項記載の方法。
  17. （i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質を含む、組成物であって、
    cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物がフォルスコリンであり、かつ
    FGF経路活性化物質が塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）である、組成物。
  18. GSK3経路阻害物質がGSK3β阻害物質である、請求項１７記載の組成物。
  19. 幹細胞をさらに含む、請求項１７または１８記載の組成物であって、幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞、または多分化能性幹細胞である、組成物。
  20. （i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質を含む、細胞培養培地であって、
    cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物がフォルスコリンであり、かつ
    FGF経路活性化物質が塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）である、細胞培養培地。
  21. GSK3経路阻害物質がGSK3β阻害物質である、請求項２０記載の細胞培養培地。
  22. 多能性幹細胞をさらに含む、請求項２０または２１記載の細胞培養培地。
  23. （i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質を含む、幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化を誘導するための試薬キットであって、
    幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞、または多分化能性幹細胞であり、
    cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物がフォルスコリンであり、ならびに
    FGF経路活性化物質が塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）である、試薬キット。
  24. GSK3経路阻害物質がGSK3β阻害物質である、請求項２３記載のキット。
  25. 幹細胞をさらに含む、請求項２３または２４記載のキットであって、幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞、または多分化能性幹細胞である、キット。
  26. （i）GSK3経路阻害物質；（ii）3',5'-環状アデノシン一リン酸（cAMP）の細胞内レベルを増加させる化合物；および（iii）FGF経路活性化物質を含む、薬学的組成物であって、
    cAMPの細胞内レベルを増加させる化合物がフォルスコリンであり、かつ
    FGF経路活性化物質が塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）である、薬学的組成物。
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