CN114929857A - 心肌细胞和组合物及其产生方法 - Google Patents

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CN114929857A CN202080055085.7A CN202080055085A CN114929857A CN 114929857 A CN114929857 A CN 114929857A CN 202080055085 A CN202080055085 A CN 202080055085A CN 114929857 A CN114929857 A CN 114929857A
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杰西卡·加伯恩
道格拉斯·A·梅尔顿
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Abstract

本文公开了用于产生成熟心肌细胞的方法和包含成熟心肌细胞的组合物。本文还公开了用于增强静止心肌细胞的成熟的方法和包含成熟静止心肌细胞的组合物。

Description

心肌细胞和组合物及其产生方法
相关申请
本申请要求2019年11月11日提交的美国临时申请号62/933,962、2019年8月8日提交的美国临时申请号62/884,592和2019年6月6日提交的美国临时申请号62/858,302的优先权。所述申请的全部教义以引用的方式并入本文。
背景技术
由人诱导型多能干细胞(iPSC)产生心肌细胞的目前分化方案能够产生如通过心肌肌钙蛋白T表达确定的高纯心肌细胞群体。然而，这些心肌细胞仍然不成熟，更接近类似于胎儿状态，与成人心肌细胞相比，最大收缩力较低、上行速度较慢并且线粒体功能不成熟。iPSC来源的心肌细胞的不成熟可能是用于心脏病的心肌细胞疗法的临床转化的重要障碍，因为未成熟心肌细胞表现出自律性或起搏器样活性，其在递送至成年动物模型时导致可能危及生命的室性心律失常，以及具有更少组构的肌小节结构，从而阻止足够的收缩力。在发育过程中，心肌细胞经历从胎儿的增殖状态至出生后更成熟但静止状态的转变。雷帕霉素机制性靶标(mTOR)信号传导途径在营养素感应和生长中起关键作用。mTOR信号传导途径的瞬时抑制可引导心肌细胞进入静止状态并增强心肌细胞成熟。对于用于引导心肌细胞进入静止状态且由此增强分化过程中的心肌细胞成熟的改进的方法存在需要。
发明内容
需要用于产生用于细胞疗法和筛选以及其他用途中的成熟心肌细胞的方法或方案。通过引导心肌细胞进入静止状态，可增强心肌细胞的成熟。
本文公开了由未成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞的方法。所述方法包括使所述未成熟心肌细胞与mTOR抑制剂接触。
在一些实施方案中，所述mTOR抑制剂是mTORC1和mTORC2两者的抑制剂。在一些实施方案中，所述mTOR抑制剂抑制4E-BP1的磷酸化。在一些实施方案中，所述mTOR抑制剂抑制核糖体蛋白S6和4E-BP1的磷酸化。在一些实施方案中，所述mTOR抑制剂选自：雷帕霉素、Torinl、Torin2、依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司、任何ATP竞争性mTOR激酶抑制剂(例如，达托里昔布、BGT226、SF1126、PKI-587或其他双重mTOR/PI3K抑制剂；沙帕色替、AZD8055、AZD2014或其他mTORC1/mTORC2双重抑制剂)以及前述中任一者的任何类似物或衍生物。
在一些实施方案中，所述未成熟心肌细胞来源于iPS细胞、ES细胞、T细胞和/或成纤维细胞。在一些实施方案中，所述未成熟心肌细胞类似于胎儿心肌细胞。
在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种成熟基因(例如，TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR和/或SCN5a)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种肌小节蛋白(例如，TNNT2、TNNI3、MYH6和/或MYH7)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种离子通道基因(例如，KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和/或SERCA2a)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出REST和/或GATA4的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出搏动频率降低。
在一些实施方案中，所述成熟心肌细胞是电成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，所述成熟心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，所述成熟心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，所述成熟心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟的心肌细胞中的一者或多者。
在一些实施方案中，在未成熟心肌细胞开始搏动后(例如，1至30天、1至15天或1至3天)，使所述未成熟心肌细胞与所述mTOR抑制剂接触。在一些实施方案中，在所述未成熟心肌细胞开始表达肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌球蛋白重链6或肌球蛋白重链7中的至少一者后，使所述未成熟心肌细胞与所述mTOR抑制剂接触。
本文还公开了非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是成熟心肌细胞。
在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种成熟基因(例如，TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR和/或SCN5a)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种肌小节蛋白(例如，TNNT2、TNNI3、MYH6和/或MYH7)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种离子通道基因(例如，KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出REST和/或GATA4的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出搏动频率降低。
在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞是电成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟的心肌细胞中的一者或多者。
本文还公开了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用包含本文所述的非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的组合物(例如，其中所述受试者患有室性心律失常或心脏收缩功能降低，例如慢性心力衰竭或先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险)。
本文还公开了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用使用本文所述的一种或多种非天然存在的心肌细胞(例如，一种或多种成熟心肌细胞)的分离群体产生的药物组合物(例如，其中所述受试者患有室性心律失常或心脏收缩功能降低，例如慢性心力衰竭或先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险)。
本文还公开了一种药盒，所述药盒包含未成熟心肌细胞或其前体；至少一种心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂，例如雷帕霉素、Torin1、Torin2、依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司、任何ATP竞争性mTOR激酶抑制剂(例如，达托里昔布、BGT226、SF1126、PKI-587或其他双重mTOR/PI3K抑制剂；沙帕色替、AZD8055、AZD2014或其他mTORC1/mTORC2双重抑制剂)，和/或前述中任一者的任何类似物或衍生物)；和使用所述未成熟心肌细胞或其前体和所述至少一种心肌细胞成熟因子来产生心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的说明书(例如，其中所述药盒还包含用于检测成熟心肌细胞的标志物的组分)。
本文还公开了一种药盒，所述药盒包含组合物，所述组合物包含本文所述的至少一种非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)；以及在治疗方法中使用所述组合物的说明书(例如，治疗室性心律失常或心脏收缩功能降低，例如慢性心力衰竭或先天性心脏病或其他心脏病)。
本文还公开了组合物在制造用于治疗心脏疾患(例如室性心律失常或心脏收缩功能降低，例如慢性心力衰竭或先天性心脏病)的药物中的用途，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用所述药物，其中所述组合物包含本文所述的至少一种非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
本文还公开了一种包含条件培养基的组合物，其中所述培养基已经通过本文所述的非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)进行调节。
本文还公开了一种组合物，所述组合物包含本文所述的一种或多种非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)和一种或多种未成熟心肌细胞。
本文还公开了一种细胞群体，所述细胞群体包含本文所述的一种或多种非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)，其中所述群体中至少10％的细胞是本文所述的非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实施方案中，所述细胞群体还包含未成熟心肌细胞。
本文公开了一种细胞膜片，所述细胞膜片包含本文所述的非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞在膜上生长。
本文还公开了一种三维结构，所述三维结构包含本文所述的非天然存在的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
在一些实施方案中，所述三维结构是基质或支架。在一些实施方案中，所述三维结构是细胞膜片。在一些实施方案中，所述三维结构是微组织。在一些实施方案中，将所述三维结构施用于受试者。在一些实施方案中，所述三维结构通过移植施用于受试者。
本文公开了诱导心肌细胞静止的方法。所述方法包括使衰老心肌细胞与心肌细胞成熟因子接触，从而诱导所述衰老心肌细胞转变为静止心肌细胞。
在一些实施方案中，所述心肌细胞成熟因子是p53的上调剂，是mTOR信号传导途径抑制剂，或者是p53的上调剂和mTOR抑制剂。在一些实施方案中，所述心肌细胞成熟因子是Torin1和/或nutlin-3a。在一些实施方案中，所述心肌细胞成熟因子不是mTOR抑制剂，例如，不是Torinl。
在一些实施方案中，所述静止心肌细胞表现出一种或多种静止标志物(例如，p16和p130)的表达增加。在一些实施方案中，所述静止心肌细胞表现出一种或多种增殖标志物(例如，Ki67、细胞周期蛋白C1和E2F1)的表达降低。在一些实施方案中，所述静止心肌细胞表现出一种或多种抑制性E2F因子(例如，E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8)的表达增加。在一些实施方案中，所述静止心肌细胞表现出一种或多种刺激性E2F因子(例如，E2F1、E2F2和E2F3)的表达降低。
在一些实施方案中，所述静止心肌细胞是成熟心肌细胞。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种肌小节蛋白(例如，TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种离子通道基因(例如，KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a)的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出REST和/或GATA4的表达增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出搏动频率降低。在一些实施方案中，所述成熟心肌细胞是电成熟的心肌细胞、收缩性成熟的心肌细胞和/或代谢成熟的心肌细胞。
本文还公开了非天然存在的心肌细胞。所述非天然存在的心肌细胞是成熟的静止心肌细胞。
在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种静止标志物(例如，p16和p130)的表达增加。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种增殖标志物(例如，Ki67、细胞周期蛋白C1和E2F1)的表达降低。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种抑制性E2F因子(例如，E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8)的表达增加。在一些实施方案中，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种刺激性E2F因子(例如，E2F1、E2F2和E2F3)的表达降低。
本文还公开了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用包含本文所述的非天然存在的心肌细胞的组合物。在一些实施方案中，所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
本文还公开了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用包含根据本文所述的方法产生的静止心肌细胞的组合物。在一些实施方案中，所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
本文还公开了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用使用根据本文所述的方法产生的一种或多种静止心肌细胞产生的药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
除非另有说明，否则本发明的实践将通常采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如，DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术，所述常规技术在本领域的技术范围内。这些技术中的某些技术的非限制性描述见于以下出版物中：Ausubel,F.,等人,(编),Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols in Immunology,Current Protocols in Protein Science,andCurrent Protocols in Cell Biology,全部由John Wiley&Sons,N.Y.出版,版本截至2008年12月；Sambrook,Russell,和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies–A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells,A Manual ofBasic Technique”,第5版,John Wiley&Sons,Hoboken,NJ,2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息见于Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第11版,McGraw Hill,2005，Katzung,B.(编)Basic and ClinicalPharmacology,McGraw-Hill/Appleton&Lange；第10版(2006)或第11版(2009年7月)中。关于基因和遗传病症的非限制性信息见于McKusick,V.A.:Mendelian Inheritance inMan.A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders.Baltimore:Johns HopkinsUniversity Press,1998(第12版)或更新近在线数据库：Online Mendelian Inheritancein Man,OMIMTM.McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns HopkinsUniversity(Baltimore,MD)和National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine(Bethesda,MD),截至2010年5月1日,World Wide WebURL:ncbi.nlm.nih.gov/omim/中，以及作为动物物种中的基因、遗传病症和性状的数据库，在omia.angis.org.au/contact.shtml处的Online Mendelian Inheritance in Animals(OMIA)中。本文提及的所有专利、专利申请和其他出版物(例如科学文章、书籍、网站和数据库)都以引用的方式整体并入本文。在说明书与任何并入参考文献之间起冲突的情况下，应以说明书(包括其任何修正，所述修正可基于并入的参考文献)为准。除非另外指示，否则在本文中使用术语的标准本领域接受含义。在本文中使用各种术语的标准缩写。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。
图1A-1I展示Torin1处理增加诱导型多能干细胞(iPSC)来源的心肌细胞(CM)的细胞静止。图1A提供分化方案的示意图，除非另有说明，否则Torin1处理从开始搏动后约2天开始进行7天。图1B提供在基线以及在用Torin1(200nM)单次处理iPSC来源的CM(BJRiPS-CM)后30分钟以及2小时、4小时、10小时、24小时和48小时磷酸化-S6和磷酸化-Akt的蛋白质印迹分析。图1C示出分化期间12孔板的每孔细胞计数。Torin1处理在第9天开始，在CM搏动开始后大约2天，BJRiPS-CM，每个时间点每组n＝3。图1D示出通过流式细胞术，活细胞群体中TNNT2+CM的百分比，Gibco iPS-CM，每种条件n＝3，通过单因素ANOVA不显著。图1E示出在开始搏动后约2天用Torin1(10nM、50nM或200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后iPSC来源的心肌细胞的选定静止标志物(TP53、RB1、RBL2(p130)、CDKN1a(p21)、CDKN1b(p27)、CDKN2a(p16)和HES1)和增殖标志物(MKI67、CCNA1、CCNB1、CCNC1、CCND1、CDK3和E2F1)的qPCR。每种条件n＝3，通过使用Holm-Sidak方法的多重t检验与每种基因的对照进行比较，*p<0.05，****p<0.001，BJRiPS-CM。图1F提供用赫斯特33342和派诺宁Y染色的iPSC来源的CM的代表性流式细胞术图，以区分对照、10nM Torin1处理的细胞或200nM Torin1处理的细胞中的G0、G1和S/G2/M期，Gibco iPS-CM。图1G示出在搏动开始后约2天开始，Torin1-处理(200nM)1周后G0、G1或S/G2/M期中的TNNT2+心肌细胞的百分比。每种条件n＝3，通过采用Tukey多重比较测试的双因素ANOVA，***p<0.001，****p<0.0001，Gibco iPS-CM。图1H示出从搏动开始后约2天开始，0.02％DMSO处理1周、随后10％FBS或无血清对照处理后，对照CM中G0、G1或S/G2/M期中TNNT2+CM的百分比。每组n＝3，通过采用Sidak多重比较检验的双因素ANOVA，**p<0.01，Gibco iPSC-CM。图1I示出从搏动开始后约2天开始，Torin1处理(200nM)1周、随后10％FBS或无血清对照处理后，G0、G1或S/G2/M期中TNNT2+CM的百分比。每组n＝3，通过采用Sidak多重比较检验的双因素ANOVA，**p<0.01，Gibco iPSC-CM。DMSO，二甲亚砜；IWP-4，Wnt产生-4的抑制剂；RI，ROCK(Rho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶)抑制剂(Y-27632)；RPMI，洛斯维公园纪念所1640培养基。
图2A-2I展示Torin1处理增加肌小节基因的表达并增强iPSC来源的心肌细胞的收缩性。图2A提供在搏动开始后约2天开始，用Torin1(10nM、50nM或200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后，iPSC来源的心肌细胞的选定肌小节基因(MYH6、MYH7、TNNT2、TNNI3)的qPCR。每种条件n＝3，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，****p<0.001，BJRiPS-CM。图2B提供在搏动开始后约2天开始，Torin1处理7天后，TNNT2和TNNI3的代表性蛋白质印迹分析，β-微管蛋白描绘为负载对照，Gibco iPS-CM。图2C示出TNNT2+细胞的TNNT2-Alexa Fluor 647的平均荧光强度。每种条件n＝3，通过采用Tukey多重比较测试的单因素ANOVA，**p<0.01，****p<0.0001，Gibco iPS-CM。图2D提供在舒张期和收缩期MTF的代表性图像，以及在舒张期和收缩期MTF的侧视图示意图。图2E提供用iPSC来源的心肌细胞接种的肌肉薄膜(MTF)的代表性力与时间图，所述心肌细胞在开始搏动后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物处理7天，BJRiPS-CM。图2F示出如使用肌肉薄膜定量的相对最大收缩力(针对对照归一化)。每组n＝8-9，通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)，**p<0.01，与来自BJRiPS-CM(2个批次)和Gibco iPS-CM(1个批次)的3个批次合并。图2G提供代表性的免疫染色图像，所述免疫染色图像示出用或不用Torin1(200nM x 7天)处理的心肌细胞，蓝色＝DAPI，绿色＝α-辅肌动蛋白，黄色＝F-肌动蛋白，洋红色＝TNNT2，BJRiPS-CM，比例尺＝10μm。图2H示出对照(n＝13个细胞)和Torin1处理(n＝17个细胞)的BJRiPS-CM的肌小节长度，通过未配对t检验不显著。图2I示出在用DMSO x 7天(对照)；DMSOx 7天、随后10％胎牛血清(FBS)x 2天；Torin1(200nM)x 7天；或Torin1(200nM)x 7天、随后10％FBS x 2天处理后TNNT2+细胞的TNNT2-Alexa Fluor 647的平均荧光强度。每种条件n＝3，通过使用Sidak多重比较检验的单因素ANOVA，*p<0.01，**p<0.0001，UCSD-CM。DMSO，二甲亚砜；TBP，TATA结合蛋白。
图3A-3F展示Torin1增加iPSC来源的心肌细胞的耗氧速率和线粒体极化。图3A提供如通过Seahorse Mito应力测试评估的针对基线归一化的平均耗氧速率对比时间的曲线。空心圆圈＝对照(n＝70个孔)，实心正方形＝Torin1(69个孔，200nM x 7天；BJRiPS-CM在测定前重新接种到Seahorse板中持续24-48小时)，来自两个独立实验的数据合并。图3B示出对于最大OCR、呼吸储备能力和非线粒体OCR，针对对照(空心条形，n＝70个孔)对比实心条形(空心条形，n＝69个孔)的基线归一化的耗氧速率，通过采用Sidak多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，***p<0.001，BJRiPS-CM。图3C示出在开始搏动后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后BJRiPS-CM的Mitotracker Green FM的平均荧光强度。通过未配对t检验，*p<0.05，每组n＝3，BJRiPS细胞系。图3D示出在开始搏动后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后BJRiPS-CM的线粒体(ND1)与核(B2M)DNA比率。通过未配对t检验，*p<0.05，每组n＝3，BJRiPS细胞系。图3E示出在开始搏动后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后BJRiPS-CM中的红色与绿色荧光的MitoProbe JC-1相对比率，在Torin1处理的最后一天运行测定。每组n＝6，通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验，**p<0.01。图3F提供在开始搏动后约2天开始用Torin1(10nM、50nM或200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后BJRiPS-CM的与脂肪酸代谢(PPARGC1a(PGC1α)、CD36、SLC27A1(FATP1)、SLC27A6(FATP6)和LPIN1)或葡萄糖代谢(GLUT1、GLUT4、PFK和PYGM)相关的选定基因的qPCR。通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，每组n＝3。DMSO，二甲亚砜；FCCP，2-[2-[4-(三氟甲氧基)苯基]亚肼基]-丙二腈。
图4A-4J展示Torin1处理增加选定离子通道的表达并增加动作电位分布图的峰值上升时间和下行速度。图4A提供在搏动开始后约2天开始，用Torin1(10nM或200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后，iPSC来源的心肌细胞的选定离子通道(KCNJ2、CACNA1c、RY2、ATP2a2、SCN5a、HCN4)的qPCR。每组n＝3，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，****p<0.001，BJRiPS细胞系。图4B提供在搏动开始后约2天开始，Torin1处理7天后Kir2.1(由KCNJ2编码)的平均荧光强度的流式细胞术分析。每组n＝3，通过未配对t检验*p<0.01，BJRiPS细胞系。图4C示出有或没有Torin1处理的心肌细胞的自发搏动速率，每种条件n＝6-10个孔，通过采用Tukey多重比较检验的单因素ANOVA，*p<0.05，***p<0.001。图4D提供代表性图像，其示出通过CyteSeer软件自动执行的细胞分割。蓝色＝Hoechst染色剂，绿色＝FluoVolt。图4E示出描绘Torin1处理的心肌细胞的代表性动作电位分布图，与对照相比具有更长的平台相。CTD25(钙瞬变的25％持续时间，或从最大幅值下降25％的持续时间)，CTD75(钙瞬变的75％持续时间，或从最大幅值下降75％的持续时间)，T75-25(电压从最大值的75％衰减至25％的时间)。图4F示出峰值上升时间(msec)，****p<0.0001，UCSD-CM。图4G示出下行速度(msec)，****p<0.0001，UCSD-CM。图4H示出CTD25时间(msec)，不显著，UCSD-CM。图4I示出CTD75时间(msec)，*p<0.05，UCSD-CM。图4J示出T75-25时间(msec)，***p<0.001，UCSD-CM。对于Fluovolt数据，对照n＝531个细胞，Torin1 n＝315个细胞，通过未配对t检验进行分析。
图5A-5D证明Torin1增加p53表达并且效果通过pifithrin-α抑制。图5A提供来自在搏动开始后约2天开始，用0(DMSO)、10、50或200nM Torin1处理7天的Gibco iPS-CM裂解物的p53、磷酸化-53、p21(CDKN1a)、GATA4、NKX2.5和β-微管蛋白的代表性蛋白质印迹。在处理的最后一天收获细胞。图5B提供细胞周期分析，其示出在搏动开始后约2天开始，用媒介物(DMSO、二甲亚砜)、pifithrin-α(10μM)处理1周、Torin1(200nM)处理7天，或用pifithrin-α(10μM)和Torin1(200nM)同时处理7天后G0、G1或S/G2/M期中的TNNT2+BJRiPS-CM的百分比。每组n＝3，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。图5C提供来自在搏动开始后约2天开始，用对照(DMSO)、Torin1(200nM)、pifithrin-α(10μM)或Torin1(200nM)+pifithrin-α(10μM)处理7天的BJRiPS来源的心肌细胞裂解物的p53、TNNI3、p21和β-微管蛋白的代表性蛋白质印迹。在处理的最后一天收获细胞。图5D示出通过蛋白质印迹分析进行的TNNI3条带的光密度测定，每组n＝3，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，**p<0.01，BJRiPS-CM。
图6A-6E展示用nutlin-3a上调p53增强TNNI3表达并且与Torin1具有协同作用。图6A提供示出所提出的心肌细胞成熟机制的示意图。T3，三碘甲腺原氨酸。图6B提供细胞周期分析，其示出在搏动开始后约2天开始，用媒介物(DMSO、二甲亚砜)、nutlin-3a(10μM)处理24小时、Torin1(200nM)处理7天，或用nutlin-3a(10μM，用于Torin1处理的前24小时)与Torin1(200nM)同时处理7天后G0、G1或S/G2/M期中的TNNT2+BJRiPS-CM的百分比。每组n＝3，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。图6C提供来自在搏动开始后约2天开始，用对照(DMSO)、nutlin-3a x 24小时(10μM)、Torin1 x 7天(200nM)或Torin1 x 7天(200nM)+nutlin-3a(10μM)持续24小时处理的BJRiPS来源的心肌细胞裂解物的MDM2、p53、TNNI3和β-微管蛋白的代表性蛋白质印迹(nutlin-3a仅在Torin1处理的前24小时期间施用)。在处理的最后一天收获的细胞，BJRiPS-CM。图6D示出通过蛋白质印迹分析进行的p53条带的光密度测定，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，**p<0.01，每种条件n＝3。图6E示出通过蛋白质印迹分析进行的TNNI3条带的光密度测定，通过采用Tukey多重比较检验的双因素ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，每种条件n＝3，BJRIPS-CM。
图7A-7H展示来自PanCancer途径组的NanoString基因表达分析，其比较用或不用Torin1处理、随后用或不用10％胎牛血清(FBS)处理的细胞，Gibco iPS-CM。图7A示出细胞周期途径基因的无监督分级聚类。图7B示出蛋白质代谢途径基因的无监督分级聚类。图7C-7E提供火山图，其示出细胞周期途径基因的差异基因表达分析(图7C，对照+FBS对比对照；图7D，对照对比Torin1；图7E，Torin1+FBS对比Torin1)。图7F-7H提供火山图，其示出蛋白质代谢途径基因的差异基因表达分析(图7F，对照+FBS对比对照；图7G，对照对比Torin1；图7H，Torin1+FBS对比Torin1)。QC，质量控制。
图8A-8C提供对未解离细胞中增殖的评估。使心肌细胞在12孔板中分化，然后在原始板中固定和染色，以使选择解离后存活细胞的可能性最小化。图8A提供用Ki67/TNNT2/DAPI或磷酸化-H3/TNNT2/DAPI染色的细胞的代表性图像。比例尺＝100μm。蓝色＝DAPI，黄色＝Ki67，绿色＝pH3，洋红色＝TNNT2。图8B提供饼形图，其描绘对照(n＝1088个细胞)对比Torin1处理的细胞(n＝837个细胞)中为Ki67+或Ki67-的总DAPI/TNNT+心肌细胞的百分比。通过卡方分析****p<0.0001。图8C提供饼形图，其描绘对照(n＝962个细胞)对比Torin1处理的细胞(n＝779个细胞)中为pH3+或pH3-的总DAPI/TNNT+心肌细胞的百分比。DMSO，二甲亚砜。
图9A-9I提供与市售人胎儿和成人心脏RNA的基准样品相比，选定基因的qPCR分析(图9A，TNNT2；图9B，TNNI3；图9C，PPARGC1a；图9D，RYR2；图9E，KCNJ2；图9F，CACNA1c；图9G，TP53；图9H，CDKN1a(p21)；图9I，GATA4)。每组N＝6-12，数据从2-4个独立实验合并。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验*p<0.05，**p<0.01，BJRiPS-CM。垂直线表示由于缺乏生物重复样品，胎儿和成人心脏RNA未包括在统计分析中(两者均来自从商业供应商处购买的单管)。由于缺乏生物重复样品，胎儿和成人心脏RNA上未显示误差条。DMSO，二甲亚砜；TBP，TATA结合蛋白。
图10A-10B提供对不同时间段的Torin1处理的评估。图10A示出从分化的第8-11天、第8-15天、第9-11天、第9-16天、第11-14天或第11-18天用对照(DMSO媒介物)或200nMTorin1处理后TNNT2-AlexaFluor647的平均荧光强度。每组n＝3，通过采用Dunnett多重比较检验的单因素ANOVA以与对照进行比较，*p<0.05。图10B示出从分化的第8-11天、第8-15天、第9-11天、第9-16天、第11-14天或第11-18天用对照(DMSO媒介物)或200nM Torin1处理后Kir2.1(细胞外)的平均荧光强度。每组n＝3，通过采用Dunnett多重比较检验的单因素ANOVA以与对照进行比较，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
图11A-11D展示用Torin1进行的晚期处理增加TNNI3的表达并降低p21的表达。图11A提供用于晚期Torin1处理的方案的示意图。图11B提供在分化的第22天收获前用0、10、50或200nM Torin1处理4天、然后用针对TNNI3、p21或b-微管蛋白(负载对照)的抗体评价的BJRiPS来源的心肌细胞的代表性蛋白质印迹图像。图11C示出TNNI3条带的相对条带强度光密度测定分析，每组n＝3，通过采用Tukey多重比较检验的单因素ANOVA，*p<0.05。图11D示出p21条带的相对条带强度光密度测定分析，每组n＝3，*p<0.05，通过采用Tukey多重比较检验的单因素ANOVA，**p<0.01。DMSO，二甲亚砜；IWP-4，Wnt产生-4的抑制剂；RI，ROCK(Rho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶)抑制剂(Y-27632)；RPMI，洛斯维公园纪念所1640培养基。
图12A-12C展示Torin1处理的细胞中的细胞外酸化速率(ECAR)。图12A提供在Seahorse Mito应力测试期间针对基线归一化的平均ECAR的曲线。对照(空心圆圈，n＝70个孔)，Torin1(200nM)x 7天(实心正方形，n＝69个孔)，BJRiPS细胞系，数据从两个独立实验合并。图12B提供在Seahorse糖酵解应力测试期间针对基线归一化的平均ECAR的曲线，每种条件n＝4-6，BJRiPS细胞系。图12C示出对照(DMSO)对比Torin1(200nM x 7天)(每组n＝4-6)的糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备和非糖酵解酸化的ECAR值，通过采用Sidak多重比较检验的双因素ANOVA，****p<0.0001。FCCP，2-[2-[4-(三氟甲氧基)苯基]亚肼基]-丙二腈。
图13A-13C展示对线粒体基因和蛋白质表达以及脂肪酸作用的评估。图13A提供选定线粒体基因(TFAM、DNML1、MFN1、MFN2、OPA1、PHB2)的qPCR分析。每组n＝3。图13B提供在搏动开始后约2天开始，Torin1处理7天后选定线粒体蛋白(MFN1、OPA1、DRP1、TFAM1)的代表性蛋白质印迹分析，b-微管蛋白描绘为负载对照，Gibco iPS-CM。图13C提供在搏动开始后约2天开始，Torin1处理+/-脂肪酸(1:100稀释的化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco))7天后选定的代谢相关蛋白(OPA1、磷酸化-AMPK、CD36)的代表性蛋白质印迹分析，b-微管蛋白描绘为负载对照，BJRiPS-CM。DMSO，二甲亚砜；TBP，TATA结合蛋白。
图14A-14C展示使用Vala动态图像细胞计数器的钙瞬变分析。Fluo-4 AM染料用于评估钙处理。向一些孔中添加异丙肾上腺素(1μM，“iso”)以评估异丙肾上腺素反应性。图14A示出钙峰值上升时间。图14B示出钙半峰全宽(FWHM，钙幅值为其最大值一半时的轮廓的宽度)时间。图14C示出钙峰值衰减时间。对照n＝129个细胞，对照+1μM iso n＝41个细胞，Torin1 n＝274个细胞，Torin1+1μM iso n＝65个细胞。通过采用Sidak多重比较检验的单因素ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
图15A-15I展示来自PanCancer途径组的NanoString基因表达分析，其比较用或不用Torin1处理、随后用或不用10％胎牛血清(FBS)处理的细胞。图15A提供所有基因的无监督分级聚类。图15B提供所有基因的主成分分析。图15C-15E提供火山图，其示出所有基因的差异基因表达分析(图15C，对照+FBS对比对照；图15D，对照对比Torin1；图15E，Torin1+FBS对比Torin1)。图15F提供细胞周期途径的主成分分析。图15G示出如通过nSolver软件分析确定的细胞周期途径评分。图15H提供蛋白质代谢途径的主成分分析。图15I示出如通过nSolver软件分析确定的蛋白质代谢途径评分。
图16示出细胞静止是可持续生物体的整个生命周期的暂时非增殖状态。伴随瞬时mTOR抑制的细胞周期停滞可导致细胞静止。细胞静止可以是不同的状态，具有不同的静止深度和符合整体静止概念的其他分子条件。
图17A-17B展示Torin1抑制S6K和Akt的磷酸化，并增加AMPK的磷酸化。图17A提供mTORC1和mTORC2的下游途径的示意性图示。图17B提供展示在向BJRiPS iPSC来源的人心肌细胞施用Torin1(200nM)后0-48小时，mTORC1和mTORC2的选定下游途径的磷酸化和表达的蛋白质印迹分析。
图18A-18G展示Torin1增强来源于三种不同细胞系的心肌细胞中的选定成熟标志物的表达。图18A提供心肌细胞分化和成熟方案的示意图。在搏动开始后大约2天添加Torin1。图18B-18D提供定量PCR，其展示在分化(BJRiPS来源的心肌细胞)的第9天用媒介物(0.02％DMSO)、10、50或200nM Torin1处理后TNNI3(图18B)、CACNA1c(图18C)和ATP2a2(SERCA2a)(图18D)的剂量依赖性增加。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验与邓恩多重比较检验*p<0.05，**p<0.01。图18E示出在源自BJRiPS、GCaMP或Gibco细胞系的心肌细胞中，在用媒介物或Torin1处理后TNNT2的平均荧光强度增加，从而表明TNNT2表达增加。通过双因素ANOVA，*p<0,05，**p<0.01。图18F-18G提供蛋白质印迹(图18F)和光密度测定分析(图18G)，其展示在BJRiPS来源的心肌细胞中用媒介物或Torin1(10、50、200nM)处理4天后，TNNI3的表达增加。通过单因素ANOVA，*p<0.05。
图19提供EIF4E对帽依赖性蛋白质翻译的调控的示意图。mTORC1对4E-BP1的磷酸化从4E-BP1释放EIF4E，从而促进EIF4E与EIF4G之间的相互作用，导致mRNA翻译。Torin1处理可减少EIF4E依赖性蛋白质翻译。
图20A-20D提供BJRIPS来源的心肌细胞中选定基因的qPCR。图20A示出当Torin1起始在搏动开始后约2天发生时，TNNI3表达更高的趋势。图20B-20D示出对照(未处理的)细胞在分化的第9天左右显示峰值EIFG1mRNA表达(图20B)，在分化的第7-9天左右显示峰值EIF4EmRNA表达(图20C)，并且在分化的第11天左右显示峰值4EBP1表达(图20D)。这些数据表明EIF4E/4EBP1的化学计量在整个分化过程中发生变化，这可能使细胞或多或少对mTOR抑制有反应。
图21提供EIF4E和EIF4E2依赖性mRNA翻译的示意图。与EIF4E结合的4E-BP1抑制蛋白质翻译，而mTORC1对4E-BP1的磷酸化释放EIF4E，从而使其与EIF4G结合。EIF4E/EIF4G复合物起始EIF4E依赖性mRNA翻译。相比之下，EIF4E2与HIF2α结合以起始EIF4E2依赖性翻译。雷帕霉素增加HIF2a表达。
图22A-22B展示Gibco iPSC来源的心肌细胞中的Seahorse mito应力测试。图22A示出在基线时以及在用寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A(有或没有Torin1)处理7天后的耗氧速率(OCR)。图22B示出Torin1处理持续7天显著增加最大OCR。通过学生t检验，**p<0.01。这些结果表明，Torin1处理增加iPSC来源的心肌细胞的氧化能力。
图23提供静止G0状态的示意图，不是静态表型，而是细胞可在更深的静止状态与更浅的静止状态之间循环的表型。mTOR控制细胞是保持静止还是进展至衰老，因为没有mTOR抑制的细胞周期停滞导致衰老，而伴随的细胞周期停滞和mTOR抑制导致静止(31)。
图24提供Rb-E2F静止调节剂的示意图。浅静止需要低水平的生长刺激，而深静止需要更高水平的生长刺激来开启E2F并重新进入细胞周期。
图25A-25F提供在有或没有Torin1处理的情况下通过qPCR对(图25A)E1F2、(图25B)E2F4、(图25C)RBL2(成视网膜细胞瘤样蛋白2，也称为asp130)、(图25D)MDM2(小鼠双突变体2同源物，一种E3泛素蛋白连接酶)、(图25E)CDKN1a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1a，也称为p21)和(图25F)CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶2)的mRNA表达的评估。来源于BJRiPS细胞的心肌细胞在约第8天开始搏动且在第9天开始用Torin1(200nM)处理。这些结果表明，Torin1调节细胞周期调控因子的表达。
图26A-26B示出在3D悬浮培养中分化的GCaMP来源的心肌细胞。图26A示出在分化的第0天的代表性球体，展示在分化开始时约300μm的理想尺寸。图26B示出在分化第10天的TNNT2+心肌细胞％。Torin1处理在测定前在第9天开始持续24小时，在Torin1处理的孔中具有更高TNNT2+细胞％的趋势。
图27提供用于产生心肌细胞的分化方案的示意图。基线分化方案(上图)是基于Lian等人,Nature Protocols 2013，并进行修改以包括在心肌细胞搏动开始后抑制mTOR途径。小分子用于依次激活，然后抑制Wnt途径，以从人iPS细胞生成人心肌细胞。使用先前公布的方案，细胞仍然不成熟，并且更接近类似于胎儿心肌细胞。在细胞开始搏动后(分化的第8-10天左右)，mTOR途径被抑制以增强心肌细胞的成熟。
图28展示mTOR复合物1(mTORC1)受Torin1抑制，如通过核糖体蛋白S6的磷酸化减少所指示。mTORC1复合物导致核糖体蛋白S6的磷酸化，并且当mTOR受到抑制时，这导致S6的磷酸化减少。在第25-29天(在乳酸盐富集后)用Torin1(10nM、50nM和200nM)处理的蛋白质印迹显示当mTOR受到抑制时，S6的磷酸化减少。
图29展示mTOR抑制降低心肌细胞搏动速率。正常成熟的成人心肌细胞自然地以每分钟20-30次搏动进行搏动，并且由于起搏组织驱动心率，人的心率更快。未成熟人心肌细胞以较快的速率搏动，当递送至心力衰竭的动物模型时可能导致潜在危及生命的心律失常。自律性降低的心肌细胞(即自发搏动的驱动力降低)可降低细胞疗法方法中心律失常的风险。较慢的内在搏动速率可表明自律性降低。评估了mTOR抑制剂Torin1(10nM、50nM和200nM)和Torin2(200nM)，并且结果表明mTOR抑制降低了心肌细胞的搏动速率。BJRiPS-CM在两个独立批次中进行处理。在分化方案的第11天开始处理并持续4-5天。每组N＝4-10个孔。
图30展示Torin1增加心肌细胞中收缩蛋白质的RNA表达。心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链蛋白6(MYH6)和肌球蛋白重链蛋白7(MYH7)是心肌细胞的收缩装置的组分，并且成熟心肌细胞具有更多这些蛋白质。Torin1以剂量依赖性方式(10nM、50nM和200nM)增加这些蛋白质的RNA表达。这些蛋白质的表达增加可增强心肌细胞的收缩性。进行qPCR以测量相对mRNA表达。BJRiPS来源的心肌细胞在分化方案的第11-18天用RBI中的Torin1进行处理。N＝3/组，单批细胞。
图31A-31B展示在Torin1处理后TNNI3蛋白的表达增加。蛋白质印迹(图31A)和光密度测定分析(图31B)展示在BJRiPS来源的心肌细胞中在Torin1处理(10nM、50nM和200nM)4天后，TNNI3(一种关键的心脏肌小节蛋白)的蛋白质表达增加。乳酸盐纯化进行3天，Torin1在第25-29天施用，并负载了50μg蛋白质。
图32展示在Torin1处理后离子通道的表达增加。更成熟的离子通道表达谱被认为是心肌细胞的电成熟所必需的。离子通道基因表达随着Torin1处理(10nM、50nM和200nM)而增加。所检查的离子通道基因表达包括KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a(ATP2a2)。使用qPCR测量相对mRNA表达。BJRiPS来源的心肌细胞在分化方案的第11-18天用RBI中的Torin1进行处理。N＝3/组，单批细胞。
图33展示在Torin1处理后NPPB(BNP)的表达增加。脑利钠肽(BNP)在发育过程中由心肌细胞产生。用Torin1(10nM、50nM和200nM)处理后，心肌细胞中脑利钠肽(BNP)的表达增加。使用qPCR测量相对mRNA表达。BJRiPS来源的心肌细胞在分化方案的第11-18天用RBI中的Torin1进行处理。N＝3/组，单批细胞。
图34展示在Torin1处理后转录因子REST的表达增加。REST是调控心脏细胞中的某些离子通道的表达的转录因子。Torin1(10nM、50nM和200nM)增加REST的基因表达。通过mTOR抑制增加REST基因表达可激活心肌细胞的成熟。使用qPCR和流式细胞术测量相对mRNA表达。qPCR：1个批次，n＝3/组；流式细胞术：1-3个批次。
图35展示在Torin1处理(10nM、50nM和200nM)后氧化磷酸化途径的调控因子PGC1-α(PPARGC1a)的表达增加。成熟心肌细胞由从糖酵解获取能量转变为氧化磷酸化。PGC1α的上调可增强与氧化磷酸化相关的途径，从而表明更成熟的表型。使用qPCR测量相对mRNA表达。BJRiPS来源的心肌细胞在分化方案的第11-18天用RBI中的Torin 1进行处理。N＝3/组，单批细胞。
图36示出在源自BJRiPS、GCaMP或Gibco细胞系的心肌细胞中，在用媒介物或Torin1处理后TNNT2的平均荧光强度增加，从而表明在源自多种细胞系的心肌细胞中TNNT2表达增加。通过双因素ANOVA，*p<0,05，**p<0.01。
图37A-37B展示Torin1处理可增加iPSC来源的心肌细胞的氧化能力。在GibcoiPSC来源的心肌细胞中进行了seahorse mito应力测试。图37A示出在基线时以及在用寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A(有或没有Torin1)处理7天后的耗氧速率(OCR)。图37B示出Torin1处理持续7天显著增加最大OCR。通过学生t检验，**p<0.01。
图38A-38B展示Torin1抑制S6K和Akt的磷酸化，并增加AMPK的磷酸化。图38A提供mTORC1和mTORC2的下游途径的示意性图示。图38B提供展示在向BJRiPS来源的人心肌细胞施用Torin1(200nM)后0-48小时，mTORC1和mTORC2的选定下游途径的磷酸化和表达的蛋白质印迹分析。
图39A-39B展示在3D悬浮培养中分化的GCaMP来源的心肌细胞。图39A示出在分化的第0天的代表性球体，展示在分化开始时约300μm的理想尺寸。图39B示出分化第10天的TNNT2+心肌细胞％。Torin1处理在第9天开始并在测定前持续24小时，在Torin1处理的孔中具有更高TNNT2+细胞％的趋势。
图40提供mTOR抑制剂的说明性结构。
具体实施方式
由人诱导型多能干细胞(iPSC)产生心肌细胞的目前分化方案能够产生如通过心肌肌钙蛋白T表达确定的高纯心肌细胞群体。然而，这些心肌细胞仍然不成熟，更接近类似于胎儿状态，与成人心肌细胞相比，最大收缩力较低、上行速度较慢并且线粒体功能不成熟。iPSC来源的心肌细胞的不成熟可能是用于心脏病的心肌细胞疗法的临床转化的重要障碍。在发育过程中，心肌细胞经历从胎儿的增殖状态至出生后更成熟但静止状态的转变。雷帕霉素机制性靶标(mTOR)信号传导途径在营养素感应和生长中起关键作用。mTOR信号传导途径的瞬时抑制可引导心肌细胞进入静止状态并增强心肌细胞成熟。
使用小分子调节Wnt途径使心肌细胞从iPSC细胞系分化。在一些实施方案中，在不同时间点使用mTOR途径的抑制剂，并对成熟的iPSC来源的心肌细胞的收缩性、代谢和电生理性质进行定量。在一些实施方案中，使用小分子抑制剂来抑制p53信号传导，并且在一些实施方案中，使用不同的小分子抑制剂来上调和增加p53的激活。
在一些实施方案中，与媒介物对照相比，mTOR抑制剂使静止细胞(G0期)的百分比增加(例如，从24％到48％；p<0.05)。此外，当mTOR抑制剂在心肌细胞搏动开始后启动时，mTOR抑制剂可以剂量依赖性方式增加选定肌小节蛋白(包括TNNI3)和离子通道(包括Kir2.1)的表达。在一些实施方案中，经处理的细胞具有增加的相对最大收缩力、增加的最大耗氧速率、减少的峰值上升时间和增加的下行速度。用mTOR抑制剂治疗可使得p53的蛋白质表达增加，这可通过施加p53的抑制剂来进行抑制。相比之下，p53激活剂可独立上调p53，导致TNNI3表达增加，并与mTOR抑制剂协同作用以进一步增加p53和TNNI3两者的表达。
本公开的方面涉及用于由至少一种干细胞产生心肌细胞(本文称为非天然存在的心肌细胞、非天然心肌细胞、静止心肌细胞或成熟心肌细胞)的组合物、方法、药盒和剂，以及用于细胞疗法、测定和各种治疗方法中的由那些组合物、方法、药盒和剂产生的成熟或静止心肌细胞。
根据本文所述的方法产生的体外产生的心肌细胞展示出许多优点；例如，它们是电成熟的(例如，表现出降低的自律性)、收缩性成熟的和代谢成熟的。此外，所产生的心肌细胞可为细胞疗法(例如，移植到需要额外和/或功能性心肌细胞的受试者中)和研究提供新的平台。
定义
为了方便起见，在此集中了本文在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所用，术语“体细胞”是指形成生物体的身体的任何细胞，与种系细胞相反。在哺乳动物中，种系细胞(也称为“配子”)是***和卵子，它们在受精过程中融合产生称为合子的细胞，整个哺乳动物胚胎由合子发育。哺乳动物体内的所有其他细胞类型——除了***和卵子、制造它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞——都是体细胞类型：内脏器官、皮肤、骨骼、血液和***都由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚性体细胞”，其意指不存在于胚胎中或不从胚胎获得并且不是由这种细胞在体外的增殖产生的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，其意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从所述生物体获得或由这种细胞在体外的增殖产生的细胞。
如本文所用，术语“成体细胞”是指在胚胎发育后在全身发现的细胞。
术语“祖细胞”或“前体”细胞在本文中可互换使用，并且是指相对于它可通过分化所产生的细胞，具有更原始的细胞表型(即，与完全分化的细胞相比，在发育途径或进展中处于较早的步骤)的细胞。通常，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜力。祖细胞可产生多种不同的分化细胞类型或单一分化细胞类型，这取决于发育途径和细胞发育并分化的环境。
术语“表型”是指在一组特定的环境条件和因素下定义细胞或生物体的一种或多种总生物学特征，而与实际基因型无关。
如本文所用的术语“多能”是指具有分化为多于一种分化细胞类型并且优选分化为所有三个生殖细胞层所特有的细胞类型的能力的细胞。多能细胞的特征主要在于它们能够分化成多于一种细胞类型，优选分化成所有三个胚层，例如使用裸小鼠畸胎瘤形成测定。胚胎干(ES)细胞标志物的表达也证明了多能性，尽管针对多能性的优选测试是证明分化成三个胚层中的每一个的细胞的能力。应该注意的是，仅仅培养此类细胞本身并不能使它们具有多能性。与原代细胞亲本相比，重新编程的多能细胞(例如，iPS)还具有延长的传代能力而不丧失生长潜力的特征，所述原代细胞亲本通常具有在培养物中仅有限数量的***的能力。
如本文所用，术语“iPS细胞”和“诱导型多能干细胞”可互换使用，并且是指从非多能细胞，通常是成体体细胞(例如，诱导或通过完全逆转)(例如，通过诱导一种或多种基因的强制表达)人工获得的多能干细胞。
如本文所用，术语“干细胞”是指能够增殖并产生更多祖细胞的未分化细胞，所述祖细胞具有产生大量母细胞的能力，所述母细胞进而可产生分化的或可分化的子细胞。可诱导子细胞本身增殖并产生子代，所述子代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留具有亲本发育潜力的一种或多种细胞。术语“干细胞”是指在特定情况下具有分化成更特化或分化的表型的能力或潜力的细胞，并且所述细胞在某些情况下保持增殖能力而基本上不分化。在一个实施方案，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其后代(子代)通常在不同方向上通过分化，例如通过获得完全个体特征而特化，如在胚胎细胞和组织的进行性多样化中发生的那样。细胞分化是通常通过许多细胞***发生的复杂过程。分化细胞可源自多潜能细胞，所述多潜能细胞本身源自多潜能细胞，等等。虽然这些多潜能细胞中的每一者可被认为是干细胞，但是每种细胞类型的范围可变化很大。一些分化细胞也有产生具有更大发育潜力的细胞的能力。这种能力可以是天然的，或者可在用各种因子处理后人工诱导。在许多生物学实例中，干细胞也可以是“多潜能的”，因为它们可产生多于一种不同细胞类型的子代，但这不是“干细胞性”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，并且如在本文件中所用，它是必不可少的。理论上，自我更新可通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞可不对称***，其中一个子代保留茎状态，并且另一个子代表达一些不同的其他特定功能和表型。或者，群体中的一些干细胞可对称地***两个茎，从而在作为整体的群体中维持一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。形式上，有可能以干细胞开始的细胞可朝着分化表型行进，但然后“逆转”并重新表达干细胞表型，这一术语通常被本领域的普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“反分化”。如本文所用，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、胎盘干细胞等。
如本文所用，“静止”或“细胞静止”用于指由营养剥夺触发的细胞静止状态，并且其特征在于响应于适当刺激重新进入细胞周期的能力。静止细胞保留代谢和转录活性。细胞可具有不同的静止深度，包括进入G0的过渡进入期、深度G0和G警戒状态，其是更浅的静止状态，在此期间细胞对触发返回细胞周期的刺激反应性更强。静止心肌细胞可表现出一种或多种静止标志物(包括p16和p130)的表达。
术语“内源性心肌细胞”或“内源性成熟心肌细胞”在本文中用于指成熟心肌细胞。成熟心肌细胞可表现出电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟。心肌细胞的表型为本领域普通技术人员所熟知，并且包括例如自发搏动的能力，诸如心肌肌钙蛋白、TNNT2、TNNI3、肌球蛋白重链、MYH6、MYH7、兰尼碱受体(RyR)、钠通道蛋白SCN5a、钾电压门控通道KCNJ2、ATP2A2、PPARGC1a、Cx43的标志物的表达，以及不同的形态特征，如有组织的肌小节、具有杆状细胞且具有T小管。
如本文所用，“心肌细胞”、“非天然存在的心肌细胞”、“非天然心肌细胞”、“静止心肌细胞”和“成熟心肌细胞”都指通过如本文公开的方法产生的心肌细胞。心肌细胞可以是心室型、心房型和/或结型心肌细胞，或心肌细胞的混合群体。心肌细胞可表现出可与内源性心肌细胞共有的一种或多种特征，包括但不限于自发搏动的能力，为电成熟的、代谢成熟的、收缩性成熟的，表现出一种或多种基因标志物(例如，TNNI3、TNNT1、MYH6、MYH7、KCNJ2、RyR和REST)的适当表达，表现出一种或多种静止标志物(例如，p16和p130)的适当表达，表现出适当的形态特征(例如，杆状细胞和有组织的肌小节)，以及在培养中的可扩增性。然而，非天然存在的心肌细胞与如本文所述的内源性心肌细胞不相同且可区别于所述内源性心肌细胞，包括基于基因表达的区别。
术语“心肌细胞标志物”是指但不限于蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件以及在内源性心肌细胞中特异性地表达或存在的其他分析物。示例性心肌细胞标志物包括但不限于心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、钾通道KCNJ2、阻遏子元件1沉默转录因子(REST)、兰尼碱受体(RyR)、钠通道(SCN5a)，以及Yang等人Circ.Res.2014；114(3):511-23中描述的那些。
如本文所用的术语“未成熟心肌细胞”是指未成熟(例如，电、代谢和/或收缩性未成熟的)心肌细胞。未成熟心肌细胞表现出自律性或起搏器样活性，具有较高的静止膜电位和较慢的上行速度，具有更少组构的肌小节结构和较低的最大收缩力，没有T小管，主要通过糖酵解(而不是氧化磷酸化)获得能量，并且可能是衰老状态而不是静止状态。
如本文所用，术语“增殖”是指细胞的生长和***。在一些实施方案中，如本文关于细胞所用的术语“增殖”是指在一段时间内数量可增加的一组细胞。
在细胞个体发生的背景下，形容词“分化的(differentiated)”或“分化(differentiating)”是相对术语，意指“分化的细胞”是与它所比较的细胞相比，在发育途径上进一步向下进展的细胞。因此，干细胞可分化成谱系限制性前体细胞(如中胚层干细胞)，所述谱系限制性前体细胞进而可在所述途径上进一步向下分化成其他类型的前体细胞(如心肌细胞前体)，且然后至终末期分化的细胞，所述终末期分化的细胞在某种组织类型中起特征性作用，并且可保留或可不保留进一步增殖的能力。
如本文所用的术语“剂”意指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“剂”可以是任何化学物质、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白质实体和非蛋白质实体。在一些实施方案中，剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体、以及它们的修饰形式和组合等。在某些实施方案中，剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代的或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯(macrolide)、来普霉素(leptomycin)、以及它们的相关天然产物或类似物。可已知化合物具有所需活性和/或性质，或化合物可选自不同化合物的文库。
如本文所用，术语“接触”(即，使至少一种未成熟心肌细胞或其前体与成熟因子或成熟因子的组合接触)意图包括将分化培养基和/或剂与细胞一起在体外孵育(例如，将成熟因子添加至培养中的细胞)。在一些实施方案中，术语“接触”不意图包括可在受试者中自然发生的细胞在体内暴露于如本文所公开的化合物(即，可能由于自然生理过程而发生的暴露)。如在本文所述的实施方案中使至少一种未成熟心肌细胞或其前体与成熟因子接触的步骤可以任何合适的方式进行。例如，可在贴壁培养或悬浮培养中处理细胞。在一些实施方案中，在促进心肌细胞形成的条件下处理细胞。本公开考虑促进成熟心肌细胞形成的任何条件。促进成熟心肌细胞形成的条件的实例包括但不限于在低附着组织培养板、旋转烧瓶、aggrewell板中的悬浮培养。在一些实施方案中，发明人观察到成熟心肌细胞在培养基中保持稳定。在一些方面，在使细胞解离和重新涂铺之前添加血清(例如，热灭活的胎牛血清)。
应当理解，与成熟因子(例如心肌细胞成熟因子)接触的细胞也可同时或随后与另一种剂(如其他分化剂或环境)接触以使细胞稳定，或使细胞进一步分化或成熟。
类似地，可使至少一种未成熟心肌细胞或其前体与至少一种心肌细胞成熟因子接触，然后与至少另一种心肌细胞成熟因子接触。在一些实施方案中，使细胞与至少一种心肌细胞成熟因子接触，并且所述接触是暂时分开的，并且在一些实施方案中，使细胞与至少一种心肌细胞成熟因子基本上同时接触。在一些实施方案中，使细胞与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少10种心肌细胞成熟因子接触。
如本文所提及的术语“细胞培养基”(本文也称为“培养基(culture medium)”或“培养基(medium)”)是用于培养细胞的培养基，其含有维持细胞活力和支持增殖的营养物。细胞培养基可含有适当组合的以下物质中的任一者：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物，以及其他组分，如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。
术语“细胞系”是指在很大程度上或基本上相同的细胞群体，所述细胞群体通常来源于单个祖先细胞或来源于限定的和/或基本上相同的祖先细胞群体。细胞系可能已经或可能能够在培养物中维持延长的时间段(例如，数月、数年、无限的时间段)。它可能经历了自发或诱导的转化过程，从而赋予细胞无限的培养寿命。细胞系包括本领域公认如此的所有那些细胞系。应当理解，细胞随时间推移获得突变和可能的表观遗传变化，使得细胞系的单独细胞的至少一些性质可相对于彼此不同。在一些实施方案中，细胞系包含本文所述的心肌细胞。
术语“外源性”是指存在于细胞或生物体中的除其天然来源以外的物质。例如，术语“外源性核酸”或“外源性蛋白质”是指已经通过涉及人工的过程引入到生物***(如细胞或生物体)中的核酸或蛋白质，在所述生物***中所述核酸或蛋白质通常不存在或以较低量存在。如果将物质引入细胞或遗传所述物质的细胞的祖先中，则所述物质将被视为外源性的。相比之下，术语“内源性”是指生物***所天然具有的物质。
如本文所用的术语“遗传修饰的”或“工程化的”细胞是指已通过涉及人工的过程将外源性核酸引入其中的细胞(或遗传了所述核酸的至少一部分的这种细胞的后代)。核酸可例如含有对细胞来说是外源性的序列，它可含有天然序列(即，天然存在于细胞中的序列)、但处于非天然存在的排列(例如，与来自不同基因的启动子连接的编码区)，或天然序列的改变型式等。将核酸转移至细胞中的过程可通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中，将多核苷酸或其一部分整合到细胞的基因组中。核酸可随后从基因组中去除或切除，条件是这种去除或切除导致细胞相对于未修饰但在其他方面等同的细胞发生可检测的改变。应当理解，术语遗传修饰意图包括将修饰的RNA直接引入细胞中(例如，合成的、修饰的RNA)。此类合成修饰的RNA包含防止被核酸内切酶和核酸外切酶快速降解以及避免或减少细胞对RNA的先天免疫或干扰素反应的修饰。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用修饰的碱基、稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩增的配偶体库碱基配对的碱基、或缀合碱基置换；(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖的置换；以及(d)核苷间键联修饰，包括磷酸二酯键联的修饰或置换。就此类修饰干扰翻译的程度而言(即，相对于缺乏修饰导致翻译减少50％或更多——例如，在兔网织红细胞体外翻译测定中)，所述修饰不适用于本文描述的方法和组合物。
术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及在适当情况下分泌蛋白质的细胞过程，包括在适当情况下但不限于例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。
如本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”在核酸或多肽的情况下是指与在其天然来源中发现的核酸或多肽一起存在和/或当由细胞表达时将与核酸或多肽一起存在或在分泌多肽的情况下分泌的至少一种其他组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“分离的”。
如本文所用的术语“分离的细胞”是指从最初发现它的生物体中除去的细胞，或这种细胞的后代。任选地，所述细胞已经在体外培养，例如在其他细胞存在下培养。任选地，随后将所述细胞引入第二生物体中或重新引入从其分离所述细胞的生物体(或所述细胞自其传代的细胞)中。
如本文所用的关于分离的细胞群体的术语“分离的群体”是指已从混合或异质的细胞群体中除去并分离的细胞群体。在一些实施方案中，与从其分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体是基本上纯的细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群体的细胞，至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％且最优选至少约95％纯的细胞群体。重述，关于心肌细胞群体的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指含有少于约20％、更优选少于约15％、10％、8％、7％、最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的不是由本文的术语定义的心肌细胞的细胞的细胞群体。在一些实施方案中，本发明涵盖扩增心肌细胞群体的方法，其中所述扩增的心肌细胞群体是基本上纯的心肌细胞群体。
术语“富集”或“富集的”在本文中可互换使用，并且是指一种类型的细胞的产量(级分)与起始培养物或制剂中所述类型细胞的级分相比增加至少10％。
术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可互换使用，并且用于指干细胞通过在长时间段和/或数月至数年内***成相同的非特化细胞类型而自我更新的能力。在一些情况下，增殖是指通过将单个细胞重复***成两个相同的子代细胞来扩增细胞。
术语“调节”与其在本领域中的使用一致地使用，即意指引起或促进目标过程、途径或现象中的定性或定量变化、改变或修改。非限制性地，这种变化可以是过程、途径或现象的不同组分或分支的相对强度或活性的增加、减少或变化。“调节剂”是引起或促进目标过程、途径或现象中的定性或定量变化、改变或修改的剂。
如本文所用，术语“DNA”被定义为脱氧核糖核酸。
如本文所用的“标志物”用于描述细胞的特征和/或表型。标志物可用于选择包含目标特征的细胞。标志物因特定细胞而异。标志物是特征性的，无论是特定细胞类型的细胞的形态、功能或生物化学(酶)特征，还是由所述细胞类型表达的分子。优选地，此类标志物是蛋白质，更优选地，具有抗体或本领域可用的其他结合分子的表位。然而，标志物可由在细胞中发现的任何分子组成，包括但不限于蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态特征或性状的实例包括但不限于形状、大小和核质比。功能特征或性状的实例包括但不限于粘附至特定底物的能力、掺入或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力以及沿特定谱系分化或去分化的能力。可通过本领域技术人员可用的任何方法检测标志物。标志物也可以是形态特征的缺失或蛋白质、脂质等的缺失。标志物可以是多肽的存在和缺失的一组独特特征与其他形态特征的组合。
术语“选择性标记物”是指当表达时赋予细胞选择性表型的基因、RNA或蛋白质，所述选择性表型如对细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的抗性(例如抗生素抗性)、营养原养型、或可用作区分表达所述蛋白质的细胞与不表达所述蛋白质的细胞的基础的特定蛋白质的表达。其表达可容易地检测到的蛋白质，如荧光或发光蛋白或作用于底物以产生有色、荧光或发光物质的酶(“可检测标记物”)构成选择性标记物的子集。与通常在多能细胞中选择性或排他性表达的基因天然的表达控制元件连接的选择性标记物的存在使得鉴定和选择已重编程为多能状态的体细胞成为可能。可使用多种选择性标记物基因，如新霉素抗性基因(neo)、嘌呤霉素抗性基因(puro)、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因(hyg)、多药抗性基因(mdr)、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)和hisD基因。可检测的标记物包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色、天蓝色、黄色、红色、橙色和青色荧光蛋白以及这些中任一者的变体。诸如荧光素酶(例如萤火虫或海肾荧光素酶)的发光蛋白也是有用的。如本领域技术人员显而易见的，如本文所用的术语“选择性标记物”可指基因或基因的表达产物，例如编码的蛋白质。
在一些实施方案中，相对于不表达选择性标记物或以显著较低水平表达选择性标记物的细胞，选择性标记物赋予表达它的细胞增殖和/或存活优势。这种增殖和/或存活优势通常发生在细胞维持在某些条件，即“选择性条件”下时。为确保有效选择，细胞群体可在条件下维持足够长的时间段，以使不表达标记物的细胞不增殖和/或不存活并从群体中消除，或者它们的数量减少至所述群体的仅一小部分。通过将细胞群体维持在选择性条件下以在很大程度上或完全消除不表达标记物的细胞来选择表达赋予增殖和/或存活优势的标记物的细胞的过程在本文中称为“阳性选择”，并且所述标记物被称为“可用于阳性选择”。在本文所述的某些方法中，阴性选择和可用于阴性选择的标记物也是令人感兴趣的。相对于不表达标记物或以显著较低水平表达标记物的细胞，此类标记物的表达赋予表达所述标记物的细胞增殖和/或存活劣势(或者，考虑另一种方式，相对于表达标记物的细胞，不表达所述标记物的细胞具有增殖和/或存活优势)。因此，当在选择性条件下维持足够长的时间段时，表达标记物的细胞可在很大程度上或完全从细胞群体中消除。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如人，可从其获得细胞和/或向其提供用如本文所述的细胞进行的治疗，包括预防性治疗的人。对于对特定动物如人受试者具有特异性的那些感染、疾患或疾病状态的治疗，术语受试者是指所述特定动物。如本文可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物，如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物如人；或其他哺乳动物，如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等；或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等。
当应用于分离的细胞时，术语“处理(treat)”、“处理(treating)”、“处理(treatment)”等包括使细胞经受任何种类的过程或条件或对细胞进行任何种类的操作或程序。当应用于受试者时，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指向个体提供医疗或手术照护、护理或管理。个体通常生病或受伤，或者相对于群体的平均成员患病的风险增加并且需要这种照护、护理或管理。它可包括向受试者施用有效量的组合物，以使得受试者表现出疾病的至少一种症状的减轻或疾病的改善，例如，有益的或所需的临床结果。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可指与未接受治疗时预期的存活期相比延长存活期。因此，本领域技术人员认识到治疗可改善疾病状态，但可能不是疾病的完全治愈。术语“治疗”包括预防。需要治疗的那些包括已被诊断患有疾患(例如肌肉病症或疾病)的那些，以及可能由于遗传易感性或其他因素而发展疾患的那些。
术语“组织”是指一起执行某些特定功能的特化细胞的组或层。术语“组织特异性”是指来自特定组织的细胞来源。
术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”或“抑制”在本文一般均用于意指减少统计学上显著的量。然而，为了避免疑问，“减少的”、“减少”或“降低”或“抑制”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达并包括100％的减少(即与参考样品相比不存在的水平)，或介于10％-100％之间的任何减少。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文一般均用于意指增加统计学上显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加，或多达并包括100％的增加，或介于10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加，或介于2倍与10倍或更大之间的任何增加。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且一般意指低于正常或更低的标记物浓度的两个标准偏差(2SD)。术语是指存在差异的统计证明。它被定义为当无效假设实际上为真时作出否决所述无效假设的决定的可能性。通常使用p值做出决定。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”关于本发明所必需的组合物、方法及其对应组分使用，其仍然为包括未指定的要素的开放式的术语，无论所述要素是否必需。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语允许存在不会实质上影响本发明的所述实施方案的一种或多种基本特征和新颖特征或功能特征的另外要素。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应组分不包括实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本说明书以及随附权利要求书中所用，，除非上下文另外明确指示，否则单数形式的“一(个/种)”和“所述”包括复数提及形式。因此，例如提及“所述方法”包括本文所述类型的和/或在阅读本公开内容后对于本领域技术人员将变得清楚的一种或多种方法，和/或步骤。
干细胞
干细胞是保留通过有丝细胞***自我更新的能力且能够分化成各种各样的特化细胞类型的细胞。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：在囊胚中发现的胚胎干细胞(ES)和在成体组织中发现的成体干细胞。在发育中胚胎中，干细胞可分化成所有特化胚胎组织。在成体生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复***，补充特化细胞，但也维持再生器官(如血液、皮肤或肠道组织)的正常更新。多能干细胞可分化成来源于三个胚层中的任一者的细胞。
尽管下文参考干细胞用于产生心肌细胞(例如成熟心肌细胞)或其前体的用途描述了某些实施方案，但生殖细胞可用于代替干细胞或与干细胞一起使用以使用与本文描述的说明性方案类似的方案提供至少一种心肌细胞。例如，可从末次月经日期后约8-11周采集的人胎儿材料中存在的原始生殖细胞制备合适的生殖细胞。示例性生殖细胞制备方法描述于，例如，Shamblott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998和美国专利号6,090,622中。
具有几乎无限的复制能力和分化成大多数细胞类型的潜力的ES细胞，例如人胚胎干细胞(hESC)或小鼠胚胎干细胞(mESC)，原则上提供无限的起始材料来生成分化的细胞用于临床疗法(stemcells.nih.gov/info/scireport/2006report.htm,2006)。ES细胞的一种可能应用是通过首先从例如hESC产生心脏祖细胞、然后使心脏祖细胞进一步分化成至少一种未成熟心肌细胞或其前体、然后使所述至少一种未成熟心肌细胞或其前体进一步分化成心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)来生成用于心力衰竭(例如，慢性心力衰竭)的细胞替代疗法的新的心肌细胞。
hESC细胞例如由Cowan等人(N Engl.J.Med.350:1353,2004)和Thomson等人(Science 282:1145,1998)描述；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，恒河猴干细胞(Thomson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)、狨猴肝细胞(Thomson等人,Biol.Reprod.55:254,1996)和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shamblott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)也可用于本文公开的方法中。mESC例如由Tremml等人(Curr Protoc Stem Cell Biol.第1章:单元1C.4,2008)描述。干细胞可以是例如单能的、全能的、多潜能的或多能的。在一些实施例中，能够产生作为至少一个生发层或所有三个生发层的衍生物的子代的灵长类动物来源的任何细胞都可用于本文公开的方法中。
在某些实例中，可分离ES细胞，例如，如Cowan等人(N Engl.J.Med.350:1353,2004)和美国专利号5,843,780以及Thomson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995中所描述。例如，hESC细胞可使用由Thomson等人(美国专利号6,200,806；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998)和Reubinoff等人,Nature Biotech.18:399,2000描述的技术从人囊胚细胞制备。hESC的等效细胞类型包括它们的多能衍生物，如原始外胚层样(EPL)细胞，如例如WO 01/51610(Bresagen)中所概述。hESC也可从人植入前胚胎获得。可替代地，可使用体外受精(IVF)胚胎，或者可将单细胞人胚胎扩增至囊胚阶段(Bongso等人,Hum Reprod 4:706,1989)。胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养至囊胚阶段(Gardner等人,Fertil.Steril.69:84,1998)。通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)从发育的囊胚中除去透明带。内细胞团可通过免疫手术分离，其中囊胚暴露于兔抗人脾细胞抗血清的1:50稀释液持续30分钟，然后在DMEM中洗涤5分钟3次，并暴露于豚鼠补体(Gibco)的1:5稀释液持续3分钟(Solter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:5099,1975)。在DMEM中进一步洗涤两次后，通过轻轻吸移从完整内细胞团(ICM)中除去裂解的滋养外胚层细胞，并将ICM涂铺在mEF饲养层上。9至15天后，通过暴露于含有1mM EDTA的无钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、暴露于分散酶或胰蛋白酶或通过用微量移液器机械解离，可使内细胞团来源的长出物解离成团块；且然后在新鲜培养基中重新涂铺在mEF上。具有未分化形态的生长集落可通过微量移液器单独选择，机械解离成团块，并且重新涂铺。ES样形态被表征为具有明显高核质比和突出核仁的致密集落。然后可每1-2周常规***所得的hESC，例如通过短暂的胰蛋白酶消化、暴露于杜尔贝科氏PBS(含有2mM EDTA)、暴露于IV型胶原酶(约200U/mL；Gibco)或通过经由微量移液器选择个体集落。在一些实例中，约50至100个细胞的团块大小是最佳的。mESC细胞可使用由例如Conner等人(Curr.Prot.in Mol.Biol.Unit 23.4,2003)描述的技术来制备。
可从灵长类动物物种的成员的囊胚分离胚胎干细胞(美国专利号5,843,780；Thomson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)。人胚胎干(hES)细胞可使用由Thomson等人(美国专利号6,200,806；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998)和Reubinoff等人,Nature Biotech.18:399,2000描述的技术由人囊胚细胞制备。与hES细胞等效的细胞类型包括它们的多能衍生物，如原始外胚层样(EPL)细胞，如WO01/51610(Bresagen)中所概述。
可替代地，在一些实施方案中，hES细胞可从人植入前胚胎获得。可替代地，可使用体外受精(IVF)胚胎，或者可将单细胞人胚胎扩增至囊胚阶段(Bongso等人,Hum Reprod 4:706,1989)。胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养至囊胚阶段(Gardner等人,Fertil.Steril.69:84,1998)。通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)从发育的囊胚中除去透明带。内细胞团通过免疫手术分离，其中囊胚暴露于兔抗人脾细胞抗血清的1:50稀释液持续30分钟，然后在DMEM中洗涤5分钟3次，并暴露于豚鼠补体(Gibco)的1:5稀释液持续3分钟(Solter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:5099,1975)。在DMEM中进一步洗涤两次后，通过轻轻吸移从完整内细胞团(ICM)中除去裂解的滋养外胚层细胞，并将ICM涂铺在mEF饲养层上。
9至15天后，通过暴露于含有1mM EDTA的无钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、暴露于分散酶或胰蛋白酶或通过用微量移液器机械解离，使内细胞团来源的长出物解离成团块；且然后在新鲜培养基中重新涂铺在mEF上。具有未分化形态的生长集落通过微量移液器单独选择，机械解离成团块，并且重新涂铺。ES样形态被表征为具有明显高核质比和显著核仁的致密集落。然后通过短暂的胰蛋白酶消化、暴露于杜尔贝科氏PBS(含有2mM EDTA)、暴露于IV型胶原酶(约200U/mL；Gibco)或通过经由微量移液器选择单个集落来每1-2周常规地***所得的ES细胞。约50至100个细胞的团块大小是最佳的。
在一些实施方案中，人胚胎生殖(hEG)细胞是多能干细胞，其可用于如本文公开的方法中以分化成原始内胚层细胞。可使用从末次月经日期后约8-11周采集的人胎儿材料中存在的原始生殖细胞制备hEG细胞。合适的制备方法描述于Shamblott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998和美国专利号6,090,622中，所述文献以引用的方式整体并入本文。
简言之，生殖嵴加工以形成解聚细胞。EG生长培养基是DMEM，4500mg/L D-葡萄糖，2200mg/L mM NaHCO3；15％ES合格胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/mL人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/mL人重组bFGF(Genzyme)；以及10μM毛喉素(在10％DMSO中)。制备九十六孔组织培养板，其中饲养细胞(例如，STO细胞，ATCC编号CRL 1503)的亚汇合层在不含LIF、bFGF或毛喉素的改良EG生长培养基中培养3天，用5000拉德γ-照射灭活，将约0.2mL原始生殖细胞(PGC)悬浮液添加至每个孔中。第一次传代在EG生长培养基中7-10天后进行，将每个孔转移至用经照射的STO小鼠成纤维细胞预先制备的24孔培养皿的一个孔中。培养细胞，每天更换培养基，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4代后。
在某些实例中，根据本文公开的方法，在暴露于至少一种心肌细胞成熟因子之前，干细胞可以是未分化的(例如，未定向至特定谱系的细胞)，而在其他实例中，可能需要在暴露于本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子之前使干细胞分化成一种或多种中间细胞类型。例如，干细胞可展示未分化细胞的形态学、生物学或物理特征，所述特征可用于将它们与胚胎或成体来源的分化细胞区分开来。在一些实例中，未分化细胞可在具有高核/质比和突出核仁的细胞集落中在微观视图的二维中出现。干细胞可以是它们本身(例如，基本上不存在任何未分化细胞)，或者可在分化细胞存在的情况下使用。在某些实例中，干细胞可在存在合适的营养物和任选的其他细胞的情况下培养，使得干细胞可生长且任选地分化。例如，胚胎成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可存在于培养物中以有助于干细胞的生长。成纤维细胞可在干细胞生长的一个阶段期间存在，但不一定在所有阶段存在。例如，成纤维细胞可在第一培养阶段添加至干细胞培养物中，并且在一个或多个后续培养阶段不添加至干细胞培养物中。
在本发明的所有方面中使用的干细胞可以是源自任何种类的组织(例如胚胎组织，如胎儿或胎前期组织，或成体组织)的任何细胞，所述干细胞具有能够在适当条件下产生不同细胞类型的子代，例如3个生发层(内胚层、中胚层和外胚层)中的至少一者的全部的衍生物的特征。这些细胞类型可以已建立的细胞系的形式提供，或者它们可直接从原代胚胎组织获得并立即用于分化。包括在NIH人胚胎干细胞记录中列出的细胞，例如hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen,Inc.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International)；Miz-hES1(MizMedi Hospital-Seoul NationalUniversity)；HSF-1、HSF-6(University of California at San Francisco)；以及H1、H7、H9、H13、H14(Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute))。在一些实施方案中，用于化学诱导分化成成熟心肌细胞的人干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人胚胎。
在另一个实施方案中，干细胞可从包括实体组织的组织中分离。在一些实施方案中，组织是皮肤、脂肪组织(fat tissue)(例如脂肪组织(adipose tissue))、肌肉组织、心脏(heart)或心脏(cardiac)组织。在其他实施方案中，组织是例如但不限于脐带血、胎盘、骨髓或软骨。
目标干细胞还包括各种类型的胚胎细胞，例如由Thomson等人(1998)Science282:1145描述的人胚胎干(hES)细胞；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，如恒河猴干细胞(Thomson等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844)；狨猴干细胞(Thomson等人(1996)Biol.Reprod.55:254)；和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shambloft等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)。还令人感兴趣的是谱系定向干细胞，如中胚层干细胞和其他早期心源性细胞(参见Reyes等人(2001)Blood 98:2615-2625；Eisenberg和Bader(1996)Circ Res.78(2):205-16；等)。干细胞可从任何哺乳动物物种获得，例如人、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物等。在一些实施方案中，人胚胎没有被破坏用于如本文公开的方法和组合物中使用的多能细胞的来源。
当ES细胞尚未定向至特定分化谱系时，它们被认为是未分化的。此类细胞表现出使它们与胚胎或成体来源的分化细胞区分开来的形态特征。未分化的ES细胞容易被本领域技术人员识别，并且通常在具有高核/质比和突出核仁的细胞集落中在微观视图的二维中出现。未分化的ES细胞表达可用作标志物以检测未分化细胞的存在的基因，并且所述基因的多肽产物可用作阴性选择的标志物。例如，参见美国申请序列号2003/0224411A1；Bhattacharya(2004)Blood 103(8):2956-64；和Thomson(1998)，同上，所述文献均以引用的方式并入本文。人ES细胞系表达表征未分化的非人灵长类动物ES和人EC细胞的细胞表面标志物，包括阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶。携带SSEA-4表位的globo系列糖脂GL7是通过将唾液酸添加至携带SSEA-3表位的globo系列糖脂GbS中形成的。因此，GL7与针对SSEA-3和SSEA-4两者的抗体发生反应。未分化的人ES细胞系不针对SSEA-1染色，但分化的细胞针对SSEA-I强烈染色。用于以未分化的形式增殖hES的方法描述于WO 99/20741、WO01/51616和WO 03/020920中。
可通过本领域已知的方法从哺乳动物供体收获来自内皮、肌肉和/或神经干细胞的合适来源的细胞混合物。合适的来源是造血微环境。例如，可从受试者中取出循环外周血，优选动员的(即，募集的)。可替代地，骨髓可获自进行自体移植的哺乳动物，如人患者。在一些实施方案中，干细胞可从受试者的脂肪组织获得，例如使用来自Cytori的CELUTIONTM***，如美国专利号7,390,484和7,429,488中所公开的，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，人脐带血细胞(HUCBC)可用于本文公开的方法中。人UBC细胞被认为是造血和间充质祖细胞的丰富来源(Broxmeyer等人,1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4109-4113)。以前，脐带血和胎盘血被认为是婴儿出生时通常丢弃的废物。脐带血细胞被用作可移植干细胞和祖细胞的来源以及骨髓再生细胞的来源，用于治疗恶性疾病(即急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和成神经细胞瘤)和非恶性疾病如范科尼氏贫血(Fanconi's anemia)和再生障碍性贫血(Kohli-Kumar等人,1993Br.J.Haematol.85:419-422；Wagner等人,1992Blood 79；1874-1881；Lu等人,1996Crit.Rev.Oncol.Hematol 22:61-78；Lu等人,1995Cell Transplantation 4:493-503)。HUCBC的显著优点是这些细胞与胎儿细胞非常相似的不成熟免疫性，这显著降低宿主排斥的风险(Taylor和Bryson,1985J.Immunol.134:1493-1497)。人脐带血含有间充质和造血祖细胞，以及可在组织培养中扩增的内皮细胞前体(Broxmeyer等人,1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4109-4113；Kohli-Kumar等人,1993Br.J.Haematol.85:419-422；Wagner等人,1992Blood 79；1874-1881；Lu等人,1996Crit.Rev.Oncol.Hematol22:61-78；Lu等人,1995Cell Transplantation 4:493-503；Taylor和Bryson,1985J.Immunol.134:1493-1497；Broxmeyer,1995Transfusion 35:694-702；Chen等人,2001Stroke 32:2682-2688；Nieda等人,1997Br.J.Haematology 98:775-777；Erices等人,2000Br.J.Haematology 109:235-242)。脐带血中造血祖细胞的总含量等于或超过骨髓，并且此外，HUCBC中高度增殖的造血细胞比骨髓中高8倍，并切表达诸如CD14、CD34和CD45的造血标志物(Sanchez-Ramos等人,2001Exp.Neur.171:109-115；Bicknese等人,2002CellTransplantation 11:261-264；Lu等人,1993J.Exp Med.178:2089-2096)。
在另一个实施方案中，多能细胞是造血微环境如循环外周血中的细胞，优选来自哺乳动物的外周血、脐带血、骨髓、胎肝或卵黄囊的单核级分。干细胞，尤其是神经干细胞，也可来源于中枢神经***，包括脑膜。
在另一个实施方案中，存在于胚状体中的多能细胞是通过用短暂蛋白酶消化收获ES细胞并允许未分化人ESC的小团块在悬浮培养中生长而形成的。通过除去条件培养基诱导分化。将所得胚状体涂铺到半固体基底上。约7天至约4周后可观察到分化细胞的形成。通过使胚状体或类似结构部分解离以提供细胞聚集体，从干细胞的体外培养物中选择活分化细胞。使用在聚集体中基本上保持细胞与细胞接触的方法来针对表型特征选择包含目标细胞的聚集体。
在另一个实施方案中，干细胞可以是重编程的干细胞，如源自体细胞或分化细胞的干细胞。在这种实施方案中，去分化的干细胞可以是例如但不限于赘生性细胞、肿瘤细胞和癌细胞，或者可替代地诱导型重编程细胞，如诱导型多能干细胞或iPS细胞。
克隆和细胞培养
用于可在本文描述的技术中使用的分子遗传学和基因工程化的说明性方法可例如在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Sambrook等人,Cold Spring Harbor)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller和Calos编)；以及CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,Wiley&Sons)的当前版本中找到。细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可例如在Current Protocols in Protein Science(J.E.Colligan等人编,Wiley&Sons)；Current Protocols in Cell Biology(J.S.Bonifacino等人,Wiley&Sons)和Current protocols in Immunology(J.E.Colligan等人编,Wiley&Sons.)中找到。用于遗传操作的示例性试剂、克隆载体和试剂盒可例如从BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech和Sigma-Aldrich Co.商购获得。
合适的细胞培养方法可例如Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique(R.I.Freshney编,Wiley&Sons)；General Techniques of Cell Culture(M.A.Harrison和I.F.Rae,Cambridge Univ.Press)和Embryonic Stem Cells:Methodsand Protocols(K.Turksen编,Humana Press)的当前版本中找到。合适的组织培养用品和试剂是可商购的，例如从Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.和ICN Biomedicals商购。
多能干细胞可由本领域普通技术人员使用促进增殖而不促进分化的培养条件在培养中连续增殖。示例性的含血清ES培养基用80％DMEM(如敲除DMEM、Gibco)、20％确定的胎牛血清(FBS、Hyclone)或血清替代物(WO 98/30679)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制备。就在临用前，将人bFGF添加至4ng/mL(WO 99/20741，GeronCorp.)中。传统上，ES细胞在饲养细胞层上培养，通常是源自胚胎或胎儿组织的成纤维细胞。
可替代地，即使没有饲养细胞，多能SC也可保持在未分化状态。用于无饲养细胞培养物的环境包括合适的培养基底，特别是细胞外基质，如
Figure BDA0003493705460000451
(凝胶状蛋白质混合物)或层粘连蛋白。通常，酶消化在细胞变得完全分散之前停止(胶原酶IV约5分钟)。然后将约10至2,000个细胞的团块直接涂铺到基底上，无需进一步分散。
产生心肌细胞
本公开的方面涉及产生心肌细胞(例如，成熟的、静止的心肌细胞)。一般而言，根据本文公开的方法产生的心肌细胞表现出功能成熟的静止心肌细胞的若干特征，包括但不限于电成熟(例如，表现出降低的自律性)、收缩性成熟和代谢成熟。
可根据任何合适的培养方案或一系列培养方案来产生心肌细胞，以使干细胞或多能细胞分化至所需的分化阶段。在一些实施方案中，通过持续一段时间且在适合于至少一种多能细胞分化成心肌细胞或其前体的条件下培养至少一种多能细胞来产生心肌细胞或其前体。在一些实施方案中，通过使未成熟心肌细胞从衰老状态转变为静止状态来产生心肌细胞，从而增强心肌细胞的成熟。
在一些实施方案中，心肌细胞是基本上纯的心肌细胞群体。在一些实施方案中，心肌细胞或其前体的群体包含多能细胞或分化细胞的混合物。在一些实施方案中，心肌细胞或其前体的群体基本上不含或不含胚胎干细胞或多能细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)可分离自受试者，例如作为组织活检物，例如皮肤活检物，并重编程为诱导型多能干细胞以进一步分化来产生用于本文所述的组合物和方法中的心肌细胞或其前体。在一些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)通过本领域普通技术人员已知的方法保持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过如本文公开的方法转化为心肌细胞之前增殖。
在一些实施方案中，心肌细胞或其前体通过本领域普通技术人员已知的方法保持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过如本文公开的方法转化为心肌细胞之前增殖。
此外，心肌细胞或其前体(例如未成熟心肌细胞)可来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠科动物、牛科动物、猿、猪科动物、马科动物、羊科动物或人细胞。为清楚和简单起见，本文中的方法的描述是指哺乳动物心肌细胞或其前体，但应理解本文描述的所有方法可容易地应用于心肌细胞或其前体的其他细胞类型。在一些实施方案中，心肌细胞或其前体来源于人个体。
本公开的方面涉及未成熟、衰老的心肌细胞。本文使用的未成熟心肌细胞可来源于任何来源或根据任何合适的方案产生。在一些方面，多能干细胞(例如iPSC或hESC)分化为未成熟心肌细胞。在一些方面，未成熟心肌细胞进一步成熟为成熟心肌细胞。在一些实施方案中，使用由Lian等人(Nat Protoc.2012；8(1):162-175)描述的分化方案使多能干细胞分化成未成熟心肌细胞，所述文献以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，由Lian描述的分化方案如本文所述进行修改。在一些实施方案中，使多能干细胞与一种或多种小分子接触以操纵Wnt途径，从而使多能干细胞分化成未成熟心肌细胞。在一些方面，一种或多种小分子选自CHIR 99021和IWP4。在一些实施方案中，使多能干细胞群体与第一Wnt途径调节剂(例如，CHIR 99021)接触，然后与第二Wnt途径调节剂(例如，IWP4)接触。
本公开的方面涉及心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。本文使用的心肌细胞可来源于任何来源或根据任何合适的方案产生。在一些方面，将衰老心肌细胞(例如，未成熟心肌细胞)诱导为静止心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。细胞静止可促进心肌细胞成熟。在一些方面，对未成熟心肌细胞进行诱导以成熟为成熟心肌细胞。
在一些方面，本公开提供了一种用于在心肌细胞中诱导静止(例如，使心肌细胞转变为静止状态)的方法。在某些方面，在心肌细胞中诱导静止增强心肌细胞的成熟。在一些实施方案中，通过上调心肌细胞中的细胞周期调控因子的表达而使心肌细胞转变为静止状态。在某些实施方案中，通过上调心肌细胞中p53的表达而使心肌细胞转变为静止状态。通过使心肌细胞与p53的激活剂接触，p53的表达可在心肌细胞中上调。在一些实施方案中，p53的激活剂是小分子。在某些实施方案中，p53的激活剂是Torin1。在某些实施方案中，p53的激活剂不是Torin1。在某些实施方案中，p53的激活剂是nutlin-3a。在一些实施方案中，p53的激活剂是两种或更多种剂的组合。在一些实施方案中，通过抑制mTOR信号传导并上调p53的表达而使心肌细胞转变为静止状态。在一些实施方案中，通过上调p53的表达而不抑制mTOR信号传导而使心肌细胞转变为静止状态。在一些方面，可通过使心肌细胞与mTORC1和mTORC2的抑制剂接触来抑制心肌细胞中的mTOR信号传导。在一些实施方案中，mTORC1和mTORC2的抑制剂是Torin1。在一些实施方案中，mTORC1和mTORC2的抑制剂不是Torin1。在某些实施方案中，通过使心肌细胞与单一剂接触，p53表达得到上调并且mTOR信号传导受到抑制。在某些实施方案中，所述单一剂是Torin1。在其他实施方案中，所述单一剂不是Torin1。
在一些方面，本公开提供了一种用于由未成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞(例如，电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟)的方法，所述方法包括在心肌细胞中诱导静止(即，使心肌细胞向静止状态，即成熟状态转变)。在一些实施方案中，通过上调p53表达而使心肌细胞向静止状态(例如成熟状态)转变。通过使未成熟心肌细胞与p53的激活剂(例如，nutlin-3a)接触，可使心肌细胞向静止状态转变。在一些实施方案中，通过上调p53表达并下调mTOR信号传导而使心肌细胞向静止状态(例如，成熟状态)转变。在一些实施方案中，通过上调p53表达而不下调mTOR信号传导而使心肌细胞向静止状态转变。在一些实施方案中，通过使未成熟、衰老心肌细胞与Torin1接触而使心肌细胞向静止状态转变。在一些实施方案中，通过使未成熟、衰老心肌细胞与不是Torin1的剂接触而使心肌细胞向静止状态转变。
在一些方面，本公开提供了一种用于由未成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞(例如，电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟)的方法，所述方法包括使包含未成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种心肌细胞成熟因子(包括p53激活剂和mTOR抑制剂)接触，以诱导所述群体中的至少一种未成熟心肌细胞成熟(例如，体外成熟)为心肌细胞。在一些实施方案中，使包含未成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种心肌细胞成熟因子(例如p53激活剂和mTOR抑制剂)接触。在一些方面，p53表达上调与mTOR抑制组合以增强源自干细胞的心肌细胞的成熟。
本公开考虑使用任何p53激活剂，所述激活剂促进未成熟心肌细胞从衰老状态转变为静止状态(例如，分化和/或成熟为心肌细胞(例如，单独或与另一种心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂)组合))。在一些实施方案中，p53激活剂是p53表达的上调剂。p53的上调可包括总p53和磷酸化p53蛋白的增加。p53激活剂或上调剂的实例包括小分子、核酸、氨基酸、代谢物、多肽、抗体和抗体样分子、适体、大环化合物和其他分子。在一些方面，p53的上调剂是nutlin-3a。在一些方面，p53的上调剂是Torin1。在一些方面，p53的上调剂是不为Torin1的剂。在一些方面，p53的上调剂是不为mTOR抑制剂的剂。在一些方面，p53的上调剂是nutlin-3a与Torin1的组合。
在一些方面，本公开提供了一种用于由未成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞(例如，电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟)的方法，所述方法包括使包含未成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种心肌细胞成熟因子(包括mTOR抑制剂)接触，以诱导所述群体中的至少一种未成熟心肌细胞成熟(例如，体外成熟)为心肌细胞。在一些实施方案中，使包含未成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或Akt抑制剂)接触。在一些方面，操纵(例如，抑制)PI3K/Akt/mTOR途径以增强源自干细胞的心肌细胞的成熟。
本公开考虑使用促进未成熟心肌细胞分化和/或成熟为心肌细胞的任何mTOR抑制剂(例如，单独或与另一种心肌细胞成熟因子(例如，p53上调剂)组合)。在一些实施方案中，mTOR包含mTORC1和/或mTORC2。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTORC1和/或mTORC2的抑制剂。在一些实施方案中，mTOR抑制剂抑制4E-BP1的磷酸化。抑制4E-BP1的磷酸化可影响对氧化磷酸化途径的调控。抑制4E-BP1的磷酸化可使p21降解，从而上调p53。氧化磷酸化途径的调节剂的非限制性实例包括4EGI-1、JR-AB2-011(一种mTORC2抑制剂)、AICAR(一种AMPK激活剂)、二甲双胍(一种AMPK激活剂和mTORC1/2抑制剂)和HLM006474(一种E2F抑制剂)。在一些实施方案中，mTOR抑制剂抑制4E-BP1和核糖体蛋白S6的磷酸化。在一些实施方案中，mTOR抑制剂包括Torin1、Torin2、雷帕霉素、依维莫司和/或替西罗莫司。在某些实施方案中，使包含未成熟心肌细胞的细胞群体与Torinl接触，以诱导所述群体中的至少一种未成熟心肌细胞成熟为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实施方案中，使包含未成熟心肌细胞的细胞群体与Torin2接触，以诱导所述群体中的至少一种未成熟心肌细胞成熟为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
在一些实施方案中，可通过将至少一种未成熟心肌细胞或其前体维持在包含一种或多种心肌细胞成熟因子的培养基中来进行接触。在一些实施方案中，可对至少一种未成熟心肌细胞或其前体进行遗传工程化。在一些实施方案中，可将至少一种未成熟心肌细胞或其前体遗传工程化以表达如本文公开的一种或多种心肌细胞(例如成熟心肌细胞)标志物，例如表达选自TNNI3、KCNJ2、REST/NRSF、Ryr和SCN5a的至少一种多肽，或其基本上同源的氨基酸序列，或其功能片段或功能变体。
在将未成熟心肌细胞或其前体维持在体外条件下的情况下，可使用常规组织培养条件和方法，并且是本领域技术人员已知的。用于各种细胞的分离和培养方法完全在本领域技术人员的能力范围内。
在本公开的方法中，至少一种心肌细胞或其前体通常可在温度、pH和其他环境条件的标准条件下培养，例如在含有5-10％CO2的气氛中在37℃下在组织培养板中作为贴壁细胞培养。对细胞和/或培养基进行适当地修改以实现转化为如本文所述的心肌细胞。
在某些实例中，心肌细胞成熟因子可用于通过以下方式诱导至少一种未成熟心肌细胞或其前体的分化：使至少一种未成熟心肌细胞或其前体与有效量的本文所述的心肌细胞成熟因子暴露或接触以使所述至少一种未成熟心肌细胞或其前体分化成至少一种心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
因此，本文包括通过本文所述的方法制备的细胞和组合物。心肌细胞成熟因子的确切量和类型可取决于未成熟心肌细胞或其前体的数量、所需的分化阶段和已经进行的先前分化阶段的数量而变化。
在某些实例中，心肌细胞成熟因子以有效量存在。如本文所用，“有效量”是指为了使未成熟心肌细胞或其前体的群体中至少10％或至少20％或至少30％的细胞分化成心肌细胞而应该存在的化合物的量。
在另外的实例中，心肌细胞成熟因子可存在于至少一种未成熟心肌细胞或其前体的培养基中，或者可替代地，心肌细胞成熟因子可在某些生长阶段期间添加至至少一种未成熟心肌细胞或其前体中。
在一些实施方案中，在未成熟心肌细胞开始搏动之后，使所述未成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。在一些方面，未成熟心肌细胞在与心肌细胞成熟因子接触之前搏动1至5天、1至4天、1至3天、1至2天、1天、2天、3天、4天或5天的时间段。在一些方面，未成熟心肌细胞在与心肌细胞成熟因子接触之前搏动1至40天、2至35天、3至30天、4至25天、5至20天、7至35天、14至30天或21至28天的时间段。在一些方面，如果未成熟心肌细胞尚未开始搏动，则所述未成熟心肌细胞不与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。
在一些实施方案中，在未成熟心肌细胞开始表达肌钙蛋白T(TNNT2)和肌球蛋白重链6(MYH6)之后，使所述未成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。在一些实施方案中，在未成熟心肌细胞开始表达肌钙蛋白T(TNNT2)、肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链6(MYH6)和肌球蛋白重链7(MYH7)之后，使所述未成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。
在将至少一种未成熟心肌细胞或其前体维持在体外条件下的情况下，可使用常规组织培养条件和方法，并且是本领域技术人员已知的。用于各种细胞的分离和培养方法完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一些方面，多能干细胞在RPMI+B27中培养，并在分化方案的第0天与GSK3抑制剂/WNT激活剂(例如，CHIR 99021)接触。在方案的第2天，除去WNT激活剂(例如，CHIR99021)。在方案的第3天，添加WNT抑制剂(例如，IWP4)，并在第5天除去WNT抑制剂(例如，IWP4)。在第7天，将胰岛素添加至培养物中，并且每2-3天更换培养基。在第11天，添加mTOR抑制剂(例如，Torin1)并维持在培养物中直到第18天。在分化方案完成时，从培养基获得成熟心肌细胞。
在一些方面，多能干细胞在RPMI+B27中培养，并且从分化方案的第0天至第2天与GSK3抑制剂/WNT激活剂(例如，CHIR 99021)接触。从方案的第2天至第4天，添加WNT抑制剂(例如，IWP4)。在第7天，将胰岛素添加至培养物中，并且每2-3天更换培养基。搏动后，在搏动开始后大约2天开始用Torin1处理心肌细胞，持续7天的时间段。在完成Torin1处理后，将培养基转换回RPMI/B27/胰岛素并维持，每2-3天更换培养基。在分化方案完成时，从培养基获得成熟心肌细胞。
在一些实施方案中，用于由未成熟心肌细胞或其前体获得心肌细胞的分化方案在二维培养***中发生。在一些实施方案中，用于由未成熟心肌细胞或其前体获得心肌细胞的分化方案在三维培养***(例如，使用3D生物反应器***)中发生。
本公开的方面涉及产生在形式和功能上类似于内源性成熟心肌细胞、但与天然心肌细胞不同的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞的形态类似于内源性心肌细胞的形态。在一些实施方案中，心肌细胞是静止的。在一些实施方案中，心肌细胞表现出静止标志物(例如，p16和p130)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出增殖标志物(例如，细胞周期蛋白C1、E2F1和Ki67)的表达降低。在一些实施方案中，心肌细胞表现出抑制剂E2F因子(例如，E2F3b-8)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出刺激性E2F因子(例如，E2F1-3a)的表达降低。
在一些实施方案中，心肌细胞是成熟的。在一些实施方案中，心肌细胞表现出肌小节蛋白(例如，TNNT2、TNNI3、MYH6和/或MYH7)的表达增加。在一些实施方案中，与胎儿或未成熟心肌细胞相比，心肌细胞表现出搏动频率降低。在一些实施方案中，心肌细胞表现出离子通道(例如，KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和/或SERCA2a(ATP2a2))的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出脑利钠肽的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出核转录因子(例如，REST/NRSF、GATA4、TBX20、BRG1、YAP、ERBB2、PITX2、MEIS1、ATA4、Nkx2-5、TBX5、NFAT、TEAD、HAND、CHF1、FoxO3/FoxO4、CHF1/Hey2、CHF1/Hey2、FoxO1、Mef2C、SRF、p53、NFkB以及它们的组合)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出氧化磷酸化途径的调控因子(例如，PGC1-α)的表达增加。
使用本公开的方法通过至少一种未成熟心肌细胞或其前体的转化或成熟来产生心肌细胞具有许多优点。首先，本公开的方法允许产生自体心肌细胞，所述自体心肌细胞对个体是细胞特异性的并且与个体遗传匹配。一般而言，与非自体细胞相比，自体细胞不太可能经受免疫排斥。细胞来源于至少一种未成熟心肌细胞或其前体，例如通过以下方式获得的心脏祖细胞：将来自个体的体细胞(例如，成纤维细胞)重编程为诱导型多能状态，然后培养多能细胞以使至少一些多能细胞转化为至少一种未成熟心肌细胞或前体，随后将所述至少一种未成熟心肌细胞在体外诱导成熟为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
在一些实施方案中，从其获得至少一种未成熟心肌细胞或其前体的受试者是哺乳动物受试者，如人受试者。在一些实施方案中，受试者患有心脏病症。在一些实施方案中，受试者患有慢性心力衰竭。在一些实施方案中，受试者患有室性心律失常。在此类实施方案中，至少一种未成熟心肌细胞或其前体可通过如本文所述的方法离体分化成心肌细胞，然后在用于治疗受试者的心脏病症(例如，心力衰竭)的方法中施用于从其收获细胞的受试者。
在一些实施方案中，至少一种未成熟心肌细胞或其前***于受试者体内(体内)并通过如本文公开的方法在体内转化以变成心肌细胞。在一些实施方案中，可通过向受试者施用包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多种如本文所述的心肌细胞成熟因子的组合物来实现至少一种未成熟心肌细胞或其前体在体内转化为心肌细胞。在一些实施方案中，可通过向受试者施用包含至少一种、至少两种、至少三种或至少四种如本文所述的心肌细胞成熟因子的组合物来实现至少一种未成熟心肌细胞或其前体在体内转化为心肌细胞。
心肌细胞
在一些实施方案中，本公开提供成熟心肌细胞。本文公开的心肌细胞具有天然心肌细胞的许多显著特征，但在某些方面(例如，基因表达谱)不同。在一些实施方案中，心肌细胞是非天然的或非天然存在的。如本文所用，“非天然的”或“非天然存在的”是指心肌细胞在某些方面明显不同于天然存在的心肌细胞，即天然心肌细胞。然而，应理解，这些显著差异通常与可导致心肌细胞表现出某些功能差异的结构特征有关，例如，尽管心肌细胞的基因表达模式与天然心肌细胞不同，但心肌细胞以与天然心肌细胞类似的方式起作用，但与天然心肌细胞相比，某些功能可能改变(例如，改善)。
本公开的心肌细胞具有天然心肌细胞的许多特征性特征，所述特征对于正常心肌细胞功能是重要的。成熟心肌细胞的特征描述于Yang等人Circ.Res.2014；114(3):511-23中。
在一些实施方案中，心肌细胞是静止的。在一些实施方案中，心肌细胞在静止状态下保留代谢和转录活性。在一些实施方案中，静止状态促进心肌细胞成熟。在一些实施方案中，心肌细胞表达或以增加的水平(即，与对照相比)表达某些静止标志物，包括p16和p130。在一些实施方案中，心肌细胞不表达或以降低的水平(即，与对照相比)表达增殖标志物，如Ki67、细胞周期蛋白C1和E2F1。在一些实施方案中，心肌细胞表现出抑制性E2F因子(例如，E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出刺激性E2F因子(例如，E2F1、E2F2和E2F3)的表达降低。
在一些实施方案中，心肌细胞是电成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞表现出降低的自律性。天然的成熟成体心肌细胞以每分钟20-30次搏动自然搏动。在一些方面，本文所述的心肌细胞表现出较慢的固有搏动频率。在一些实施方案中，心肌细胞以每分钟15至35次搏动、每分钟15至20次搏动或每分钟30至35次搏动而搏动。较慢的固有搏动频率可表明自律性降低，并且自律性降低的心肌细胞(即自发搏动的驱动力降低)可降低细胞疗法中心律失常的风险。
在一些实施方案中，心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞表现出收缩蛋白质(例如，肌小节收缩蛋白质)的RNA和蛋白表达增加(即，与未成熟心肌细胞相比)。在一些方面，心肌细胞表现出心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链蛋白6(MYH6)和肌球蛋白重链蛋白7(MYH7)中的至少一者的RNA和蛋白质表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出以剂量依赖性方式增加所述蛋白质的RNA表达(例如，在用mTOR抑制剂处理未成熟心肌细胞时)。一种或多种肌小节蛋白的表达增加可增强心肌细胞的收缩性。在一些方面，心肌细胞表现出TNNI3的总体含量或量增加，并且在一些方面，相对于TNNI3的慢骨骼形式，TNNI3的含量或量增加。在一些方面，心肌细胞表现出相对于MYH6含量或蛋白质(例如，在人中)，MYH7含量或蛋白质增加。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，心肌细胞中的TNNI3表达增加近5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍。在一些方面，心肌细胞的收缩性可通过测量细胞运动(例如，使用一种或多种成像方法)来测量。将随着心肌细胞收缩而弯曲的软基底可与一种或多种成像方法结合使用以定量收缩性。在一些方面，与未成熟心肌细胞相比，心肌细胞具有增加的收缩性。
在一些实施方案中，心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。在一些方面，与未成熟心肌细胞相比，心肌细胞具有增加的代谢活性。在一些实施方案中，与未成熟心肌细胞相比，心肌细胞具有增加的耗氧量和/或细胞外酸化速率。代谢成熟度可使用Seahorse mito应力代谢测定(Agilent)进行定量。所述测定可用于测量响应于影响线粒体功能的一种或多种化合物(例如，小分子化合物)的耗氧速率和细胞外酸化速率。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出类似于内源性成熟心肌细胞形态的形态。在一些实施方案中，心肌细胞形成杆状细胞。在一些实施方案中，心肌细胞表现出有组织的肌小节结构。在一些方面，平均肌小节长度是1.0至4.0μm、1.5至3.5μm或2.0至3.0μm。在一些方面，平均肌小节长度是约1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm或3.0μm。
在一些方面，心肌细胞表现出成熟的离子通道表达谱。在一些实施方案中，心肌细胞表现出增加的离子通道表达(即，与未成熟心肌细胞相比)。对于KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c或SERCA2a(ATP2a2)中的一者或多者，离子通道表达可增加。在一些方面，心肌细胞中的KCNJ2表达以剂量依赖性方式增加(例如，在用mTOR抑制剂处理未成熟心肌细胞时)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出SCN5a、KCNJ2和RYR2的表达增加(即，与未成熟心肌细胞相比)。在一些实施方案中，心肌细胞的静止膜电位在-70至-150mV、-75至-125mV、-80至-100mV或-85至-95mV的范围内。在一些实施方案中，心肌细胞的静止膜电位是约-85mV、-86mV、-87mV、-88mV、-89mV、-90mV、-91mV、-92mV、-93mV、-94mV或-95mV。在一些实施方案中，心肌细胞的上行速度在150至350V/sec、175至325V/sec、200至300V/sec或225至275V/sec的范围内。在一些实施方案中，心肌细胞的上行速度是约200V/sec、210V/sec、220V/sec、230V/sec、240V/sec、250V/sec、260V/sec、270V/sec、280V/sec、290V/sec或300V/sec。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出转录因子(例如，核转录因子)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出一种或多种转录因子的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出核转录因子阻遏子元件-1沉默转录因子(REST)，也称为神经元限制性沉默子因子的表达增加(即，与未成熟心肌细胞相比)。在一些方面，REST的表达遏制HCN4的表达。在一些实施方案中，心肌细胞表现出以剂量依赖性方式增加REST的表达(例如，在用mTOR抑制剂处理未成熟心肌细胞时)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出选自以下的转录因子的表达增加：REST/NRSF、GATA4、TBX20、BRG1、YAP、ERBB2、PITX2、MEIS1、ATA4、Nkx2-5、TBX5、NFAT、TEAD、HAND、CHF1、FoxO3/FoxO4、CHF1/Hey2、CHF1/Hey2、FoxO1、Mef2C、SRF、p53、NFkB以及它们的组合。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出氧化磷酸化途径的调控因子的表达增加(即，与未成熟心肌细胞相比)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出氧化磷酸化途径的调控因子PGC1-α(PPARGC1a)的表达增加。成熟心肌细胞由从糖酵解获取能量转变为氧化磷酸化。PGC1α的上调可增强与氧化磷酸化相关的途径。在一些实施方案中，代谢主要发生自脂肪酸，例如脂肪酸β-氧化(例如，代替糖酵解)。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出脑利钠肽(BNP)的表达增加(即，与未成熟心肌细胞相比)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出利钠肽B(NPPB)的表达增加。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出增加的线粒体含量(即，与未成熟心肌细胞相比)。例如，心肌细胞可具有增加的线粒体长度和增加的线粒体膜电位。在一些实施方案中，线粒体占心肌细胞体积的约5％至70％、10％至60％、15％至50％或20％至40％。在一些方面，线粒体以晶体状晶格图案分布在整个心肌细胞中。
在一些实施方案中，心肌细胞具有约0.15至2.5米/秒、0.2至2.0米/秒、0.25至1.5米/秒或0.3至1.0米/秒的传导速度。在一些实施方案中，心肌细胞具有约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0米/秒的传导速度。
在一些实施方案中，心肌细胞表达内源性成熟心肌细胞所特有的选自以下的至少一种标志物：TNNT2、TNNI3、MYH7、MYH6、KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c、SERCA2a(ATP2a2)、NPPB(BNP)、REST和PPARGC1a(PGC1a)。在一些实施方案中，心肌细胞表达内源性成熟心肌细胞所特有的选自以下的至少一种标志物：TNNT2、TNNI3、KCNJ2、REST、RyR和SCN5a。
心肌细胞在体外从任何起始细胞分化，因为本发明不意图受限于心肌细胞所来源于的起始细胞。示例性起始细胞包括但不限于未成熟心肌细胞或其任何前体，如心脏祖细胞、多能干细胞、胚胎干细胞和诱导型多能干细胞。在一些实施方案中，心肌细胞在体外从重编程细胞、部分重编程细胞(即，体细胞，例如，已经部分重编程以使其以介于诱导型多能性细胞与心肌细胞所来源于的体细胞之间的中间状态存在的成纤维细胞)或转分化细胞分化。在一些实施方案中，本文公开的心肌细胞可在体外从未成熟心肌细胞或其前体分化。在一些实施方案中，心肌细胞在体外从选自未成熟心肌细胞、心脏祖细胞和多能干细胞的前体分化。在一些实施方案中，多能干细胞选自胚胎干细胞和诱导型多能干细胞。在一些实施方案中，心肌细胞或心肌细胞所来源于的多能干细胞是人的。在一些实施方案中，心肌细胞是人的。
在一些实施方案中，心肌细胞未进行遗传修饰。在一些实施方案中，心肌细胞在不存在细胞的遗传修饰的情况下获得其与天然心肌细胞所共有的特征。在一些实施方案中，心肌细胞进行遗传修饰。
在一些方面，本公开提供了包含本文所述的心肌细胞的细胞系。在一些实施方案中，可将心肌细胞冷冻、解冻和传代。心肌细胞可传代至少5次而没有显著形态变化。
本公开的方面涉及根据本文所述的方法产生的分离的心肌细胞群体。在一些实施方案中，通过使至少一种未成熟心肌细胞与本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子接触来产生心肌细胞群体。
本公开的方面涉及包含本文所述的分离的细胞群体(例如，心肌细胞)的微囊。微囊在本领域中是众所周知的。微囊的合适实例描述于文献中(例如，Orive等人,“Application of cell encapsulation for controlled delivery of biologicaltherapeutics”,Advanced Drug Delivery Reviews(2013),dx.doi.org/10.1016/j.addr.2013.07.009；Hernandez等人,“Microcapsules and microcarriers for in situcell delivery”,Advanced Drug Delivery Reviews 2010；62:711-730；Murua等人,“Cellmicroencapsulation technology:Towards clinical application”,Journal ofControlled Release 2008；132:76-83；以及Zanin等人,“The development ofencapsulated cell technologies as therapies for neurological and sensorydiseases”,Journal of Controlled Release 2012；160:3-13)。微囊可以多种方式配制。示例性微囊包含由聚阳离子层包围的海藻酸盐核心，所述聚阳离子层由外部海藻酸盐膜覆盖。聚阳离子膜形成赋予稳定性和生物相容性的半透膜。聚阳离子的实例包括但不限于聚L-赖氨酸、聚L-鸟氨酸、壳聚糖、经乳糖修饰的壳聚糖、以及光聚合生物材料。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生包含具有共价缀合的寡肽的海藻酸盐核心的支架，所述寡肽具有RGD序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生以共价方式强化的微囊，所述微囊具有稳定性增强的以化学酶法工程化的海藻酸盐。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合来组装的膜模拟薄膜。在一些实施方案中，微囊由使用差向异构酶以酶法修饰的海藻酸盐组成。在一些实施方案中，微囊在微囊膜的相邻层之间包含共价键。在某一实施方案中，微囊包含含有与酚部分偶联的海藻酸盐的亚筛尺寸囊。在一些实施方案中，微囊包含含有海藻酸盐-琼脂糖的支架。在一些实施方案中，心肌细胞在囊封于海藻酸盐内之前用PEG进行修饰。在一些实施方案中，经分离的细胞群体(例如心肌细胞)被囊封在光反应性脂质体和海藻酸盐中。应了解，微囊中采用的海藻酸盐可用其他合适的生物材料替代，所述生物材料包括但不限于PEG、壳聚糖、PES中空纤维、胶原、透明质酸、具有RGD的右旋糖酐、EHD和PEGDA、PMBV和PVA、PGSAS、琼脂糖、具有明胶的琼脂糖、PLGA、以及这些生物材料的多层实施方案。
在一些实施方案中，包含根据本文所述的方法产生的心肌细胞群体的组合物也可用作机械装置中的功能部件。例如，装置可在防止细胞群体通过的半透膜后面含有心肌细胞群体(例如，由未成熟心肌细胞群体或其前体产生)，从而将它们保留在装置中。装置的其他实例包括考虑用于植入心脏病患者或用于体外治疗的那些装置。
本公开的方面涉及包括本文所述的分离的心肌细胞群体(例如，成熟心肌细胞)的测定。在一些实施方案中，所述测定可用于鉴定促进或抑制成熟心肌细胞命运的一种或多种候选剂。在一些实施方案中，所述测定可用于鉴定促进至少一种未成熟心肌细胞或其前体分化成心肌细胞的一种或多种候选剂。在一些实施方案中，所述测定可用于鉴定促进从处于衰老状态的未成熟心肌细胞转变为处于静止状态的成熟心肌细胞的一种或多种候选剂。
本公开考虑了方法，其中根据本文所述的方法由iPS细胞产生心肌细胞，所述iPS细胞来源于从患有疾病(例如，心力衰竭或心脏相关病症)的个体提取或分离的细胞，并且将那些心肌细胞与来自未患疾病的健康个体的正常心肌细胞进行比较，以鉴定所述心肌细胞与正常心肌细胞之间的差异，所述差异可用作疾病的标志物(例如，表观遗传和/或遗传)。在一些实施方案中，从患有心力衰竭的个体获得心肌细胞并与正常心肌细胞进行比较，然后将所述心肌细胞重编程为iPS细胞并且分析所述iPS细胞中存在于从患有心力衰竭的个体获得的心肌细胞中、但不存在于正常心肌细胞中的遗传和/或表观遗传标志物，以鉴定标志物(例如，前心力衰竭)。在一些实施方案中，源自患者的iPS细胞和/或心肌细胞用于筛选剂(例如，能够调节促成心力衰竭表型的基因的剂)。
心肌细胞的存在的确认和鉴定
可使用本领域普通技术人员常用的任何手段来与衰老心肌细胞的存在相比确认静止心肌细胞的存在。可使用本领域普通技术人员常用的任何手段来确认通过暴露于如本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子使至少一种未成熟心肌细胞或其前体分化而产生的心肌细胞(例如成熟心肌细胞)的存在。
在一些实施方案中，静止标志物的存在可通过检测一种或多种指示静止状态的标志物的存在或不存在来完成。在一些实施方案中，所述方法可包括检测静止标志物p16和/或p130的阳性表达。在一些实施方案中，所述方法可包括检测增殖标志物Ki67、细胞周期蛋白C1和/或E2F的阴性表达。
在一些实施方案中，心肌细胞标志物(例如化学诱导型心肌细胞)的存在可通过检测一种或多种指示内源性心肌细胞的标志物的存在或不存在来完成。在一些实施方案中，所述方法可包括检测心肌细胞的标志物的阳性表达(例如存在)。在一些实施方案中，所述方法可包括检测一种或多种肌小节蛋白(例如，心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链蛋白6(MYH6)和肌球蛋白重链蛋白7(MYH7))的阳性表达。在一些实施方案中，所述方法可包括检测一种或多种离子通道(例如，KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a(ATP2a2))的阳性表达。在一些实施方案中，所述方法可包括检测脑利钠肽(BNP)的阳性表达。在一些实施方案中，所述方法可包括检测一种或多种转录因子(例如，REST)的阳性表达。在一些实施方案中，所述方法可包括检测氧化磷酸化途径的一种或多种调控因子(例如PGC1-α(PPARGC1a))的阳性表达。在一些实施方案中，可使用试剂，例如用于检测TNNI3和/或KCNJ2的试剂来检测标志物。具体地，本文中的心肌细胞表达TNNI3和KCNJ2，并且不表达显著水平的将指示未成熟心肌细胞的其他标志物。心肌细胞也可通过特定标志物的下调来表征。例如，心肌细胞可通过HCN4的统计上显著的下调来表征。
用于标志物的试剂可以是例如针对标志物的抗体或用于RT-PCR或PCR反应(例如半定量或定量RT-PCR或PCR反应)的引物。此类标志物可用于评估是否已经产生了心肌细胞。抗体或其他检测试剂可连接至标记，例如用于检测的放射标记、荧光标记(例如，GFP)或比色标记。如果检测试剂是引物，则它可以干制剂(例如冻干)的形式提供，或以溶液的形式提供。
可通过确定静止心肌细胞所特有的标志物的表达来监测至少一种未成熟心肌细胞从衰老状态至静止状态的进展。在一些方法中，某些标志物的表达是通过检测标志物的存在或不存在来确定的。可替代地，某些标志物的表达可通过测量标志物存在于细胞培养物或细胞群体的细胞中的水平来确定。在某些方法中，确定静止心肌细胞所特有的标志物的表达以及其所来源于的衰老心肌细胞所特有的标志物的显著表达的缺乏。
可通过确定成熟心肌细胞所特有的标志物的表达来监测至少一种未成熟心肌细胞或其前体至心肌细胞的进展。在一些方法中，某些标志物的表达是通过检测标志物的存在或不存在来确定的。可替代地，某些标志物的表达可通过测量标志物存在于细胞培养物或细胞群体的细胞中的水平来确定。在某些方法中，确定成熟心肌细胞所特有的标志物的表达以及其所来源于的未成熟心肌细胞或其前体所特有的标志物的显著表达的缺乏。
如结合监测由未成熟心肌细胞产生心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)所描述的，定性或半定量技术(如印迹转移方法和免疫细胞化学)可用于使用本领域普通技术人员公知的方法测量标志物表达。可替代地，可通过本领域通常已知的方法通过使用诸如定量PCR的技术准确地定量标志物表达。此外，可使用用于测量细胞外标志物含量的技术，如ELISA。
应理解，本发明不限于本文列为心肌细胞标志物的那些标志物，并且本发明还涵盖诸如细胞表面标志物、抗原和其他基因产物的标志物，包括EST、RNA(包括微小RNA和反义RNA)、DNA(包括基因和cDNA)以及其部分。
心肌细胞的富集、分离和纯化
本发明的另一个方面涉及从异质细胞群体中分离心肌细胞群体(例如，成熟心肌细胞)，这种混合细胞群体包含成熟心肌细胞和成熟心肌细胞所来源于的未成熟心肌细胞或其前体。在一些方面，静止心肌细胞群体分离自异质细胞群体，如包含衰老心肌细胞和静止心肌细胞的混合细胞群体。可通过使用存在于心肌细胞上的任何细胞表面标志物来富集、分离和/或纯化由任何上述方法产生的心肌细胞群，所述细胞表面标志物不存在于它所来源于的未成熟心肌细胞或其前体上。此类细胞表面标志物也被称为对心肌细胞(例如成熟心肌细胞)具有特异性的亲和标签。对心肌细胞具有特异性的亲和标签的实例是对存在于心肌细胞的细胞表面上、但基本上不存在于其它细胞类型(例如未成熟心肌细胞)上的标志物分子如多肽具有特异性的抗体、配体或其它结合剂。在一些方法中，与心肌细胞上的细胞表面抗原结合的抗体用作亲和标签，以用于富集、分离或纯化由本文所述的方法产生的化学诱导型(例如通过与如本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子接触)心肌细胞。此类抗体是已知的并且可商购获得。
熟练的技术人员将容易地了解使用抗体富集、分离和/或纯化心肌细胞的方法。例如，在一些实施方案中，将诸如抗体的试剂与包含心肌细胞的细胞群体一起孵育，其中所述细胞群体已进行处理以减少细胞间和基底粘附。然后将所述细胞群体洗涤、离心并重悬。在一些实施方案中，如果抗体尚未用标记进行标记，则然后将细胞悬浮液与第二抗体(如能够与第一抗体结合的FITC缀合的抗体)一起孵育。然后将心肌细胞洗涤、离心并重悬于缓冲液中。然后使用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析和分选心肌细胞悬浮液。抗体结合的荧光重编程细胞与未结合的非荧光细胞分开收集，从而使心肌细胞与细胞悬浮液中存在的其他细胞(例如未成熟的心肌细胞或其前体)分离。
在本文所述的方法的另一个实施方案中，包含心肌细胞的分离的细胞组合物可通过使用替代的基于亲和力的方法或通过使用对心肌细胞具有特异性的相同或不同标志物的额外轮次分选来进一步纯化。例如，在一些实施方案中，FACS分选用于首先使细胞群体中单独或与KCNJ2表达或可替代地与本文公开的心肌细胞标志物一起表达TNNT2的心肌细胞与不表达那些标志物之一的细胞(例如阴性细胞)分离。在一些方面，TNNI3和/或MYH7也用作FACS分选的标志物，单独或与TNNT2和/或KCNJ2组合。第二FACS分选(例如使用FACS再次分选阳性细胞以分离与第一分选相比对不同标志物呈阳性的细胞)富集重编程细胞的细胞群体。
在一个替代实施方案中，FACS分选用于通过对存在于大多数未成熟心肌细胞上、但不存在于心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)上的标志物进行阴性分选来分离细胞。
在本文所述的方法的一些实施方案中，心肌细胞在不使用抗体的情况下进行荧光标记，然后通过使用荧光激活细胞分选仪(FACS)与未标记的细胞分离。在此类实施方案中，编码GFP、YFP的核酸或编码可表达荧光标记物基因(如编码荧光素酶的基因)的另一种核酸用于使用上述方法标记重编程细胞。
除了刚刚描述的程序外，化学诱导型心肌细胞也可通过用于细胞分离的其他技术进行分离。此外，心肌细胞也可通过在促进心肌细胞的选择性存活或选择性扩增的生长条件下进行连续继代培养的方法来富集或分离。此类方法是本领域普通技术人员已知的。
使用本文所述的方法，可在体外由未成熟心肌细胞或其前体(其通过本文所述的方法从多能干细胞分化)产生富集的、分离的和/或纯化的心肌细胞群体。在一些实施方案中，优选的富集、分离和/或纯化方法涉及由人未成熟心肌细胞或其前体体外产生人心肌细胞，所述人未成熟心肌细胞或其前体是从人多能干细胞或从人诱导型多能干(iPS)细胞分化的。在此类实施方案中，在心肌细胞从先前源自iPS细胞的未成熟心肌细胞分化的情况下，心肌细胞对于从其获得细胞以产生iPS细胞的受试者而言可以是自体的。
使用本文所述的方法，与化学诱导未成熟心肌细胞或前体之前的细胞群体相比，分离的心肌细胞群体的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)含量富集至少约1至约1000倍。在一些实施方案中，与化学诱导未成熟心肌细胞或前体群体之前的细胞群体相比，心肌细胞群体诱导、增强、富集或增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100-倍或更多。
包含心肌细胞的组合物
本发明的一些实施方案涉及包含心肌细胞的细胞组合物，如细胞培养物或细胞群体，其中所述心肌细胞来源于至少一种未成熟心肌细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含未成熟心肌细胞。
在一些实施方案中，细胞组合物包含静止心肌细胞，其中所述静止心肌细胞来源于至少一种衰老心肌细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含衰老心肌细胞。
根据某些实施方案，化学诱导型心肌细胞是哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，此类心肌细胞是人心肌细胞。在一些实施方案中，未成熟心肌细胞来源于多能干细胞(例如，人多能干细胞)。
本发明的其他实施方案涉及包含通过如本文公开的方法产生的心肌细胞的组合物，如分离的细胞群体或细胞培养物。在此类实施方案中，所述心肌细胞占心肌细胞群体中总细胞的小于约90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约12％、小于约10％、小于约8％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。在一些实施方案中，组合物包含占细胞群体中总细胞的超过约90％的心肌细胞群体，例如细胞群体中总细胞的约至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少约99％或约至少100％是心肌细胞。
本发明的某些其他实施方案涉及包含心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)和所述心肌细胞所来源于的未成熟心肌细胞或其前体的组合的组合物，如分离的细胞群体或细胞培养物。在一些实施方案中，心肌细胞所来源于的未成熟心肌细胞占分离细胞群体或培养物中总细胞的小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。
本发明的另外的实施方案涉及通过本文所述的方法产生并且包含化学诱导型心肌细胞作为主要细胞类型的组合物，如分离的细胞群体或细胞培养物。在一些实施方案中，本文所述的方法和工艺产生包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约87％、至少约86％、至少约85％、至少约84％、至少约83％、至少约82％、至少约81％、至少约80％、至少约79％、至少约78％、至少约77％、至少约76％、至少约75％、至少约74％、至少约73％、至少约72％、至少约71％、至少约70％、至少约69％、至少约68％、至少约67％、至少约66％、至少约65％、至少约64％、至少约63％、至少约62％、至少约61％、至少约60％、至少约59％、至少约58％、至少约57％、至少约56％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约52％、至少约51％或至少约50％心肌细胞的分离的细胞培养物和/或细胞群体。
在另一个实施方案中，分离的细胞群体或细胞组合物(或细胞培养物)包含人心肌细胞。在其他实施方案中，如本文所述的方法和工艺可产生包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％心肌细胞的分离的细胞群体。在优选的实施方案中，分离的细胞群体可包含人心肌细胞。在一些实施方案中，计算细胞培养物或群体中心肌细胞的百分比，而不考虑培养物中剩余的饲养细胞。
本发明的其他实施方案涉及包含心肌细胞和所述心肌细胞从其分化或成熟的未成熟心肌细胞或其前体的混合物的组合物，如分离的细胞群体或细胞培养物。例如，对于约每95个未成熟心肌细胞或其前体，可产生包含至少约5个心肌细胞的细胞培养物或细胞群体。在其他实施方案中，对于约每5个未成熟心肌细胞或其前体，可产生包含至少约95个心肌细胞的细胞培养物或细胞群体。此外，考虑了包含其他比例的心肌细胞与未成熟心肌细胞或其前体的细胞培养物或细胞群体。例如，对于约每1,000,000个、或至少100,000个细胞、或至少10,000个细胞、或至少1000个细胞或500个、或至少250个或至少100个或至少10个未成熟心肌细胞或其前体，可产生包含至少约1个心肌细胞的组合物。
本发明的其他实施方案涉及包含人细胞，包括人心肌细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群体，所述人心肌细胞展现内源性心肌细胞的至少一种特征。
在本发明的优选实施方案中，心肌细胞的细胞培养物和/或细胞群体包含为非重组细胞的人心肌细胞。在此类实施方案中，细胞培养物和/或细胞群体不含或基本上不含重组人心肌细胞。
心肌细胞成熟因子
本公开的方面涉及使未成熟心肌细胞或其前体与心肌细胞成熟因子接触，例如以诱导未成熟心肌细胞成熟或其前体分化成心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。术语“心肌细胞成熟因子”是指促进或有助于至少一种未成熟心肌细胞或其前体转化为心肌细胞的剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子诱导多能细胞(例如，iPSC或hESC)分化成未成熟心肌细胞，例如，根据本文所述的方法。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子诱导未成熟心肌细胞成熟为心肌细胞，例如，根据本文所述的方法。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子诱导衰老心肌细胞转变为静止心肌细胞。
一般而言，本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子可单独使用，或与其他心肌细胞成熟因子组合使用，以根据如本文公开的方法产生心肌细胞。在一些实施方案中，本文描述的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种心肌细胞成熟因子用于产生心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的方法中。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR途径的调节剂(例如，抑制剂)。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括mTOR途径的抑制剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括PI3K和/或Akt的抑制剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括小分子、核酸、氨基酸、代谢物、多肽、抗体和抗体样分子、适体、大环化合物或其他分子。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自：Torin1、Torin2、雷帕霉素、依维莫司和替西罗莫司。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是Torin1。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是Torin2。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是雷帕霉素。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是依维莫司。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是替西罗莫司。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括细胞周期调控因子p53的调节剂(例如，上调剂)。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包含p53的上调剂或激活剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括小分子、核酸、氨基酸、代谢物、多肽、抗体和抗体样分子、适体、大环化合物或其他分子。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自Torin1和nutlin-3a。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是Torin1。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是nutlin-3a。在一些实施方案中，通过施用nutlin-3a和Torin1的组合来(例如，协同地)上调p53。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子不是Torin1。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子不是mTOR抑制剂。
组合物和药盒
本文描述了包含本文所述的心肌细胞(例如成熟和/或静止心肌细胞)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含本文所述的成熟因子和/或细胞培养基。本文还描述了包含本文所述的化合物的组合物(例如，包含一种或多种本文所述的化合物的细胞培养基)。
本文还描述了用于实施本文公开的方法和用于制备本文公开的心肌细胞(例如成熟和/或静止心肌细胞)的药盒。本文还描述了用于治疗慢性心力衰竭和降低室性心律失常的发生率的药盒。在一个方面，药盒包括至少一种未成熟和/或衰老心肌细胞或其前体和至少一种如本文所述的成熟因子，并且任选地，所述药盒还可包括用于使用本文描述的方法将至少一种未成熟心肌细胞或其前体转化为成熟心肌细胞群体的说明书。在一些实施方案中，药盒包括至少两种成熟因子。在一些实施方案中，药盒包括至少三种成熟因子。在一些实施方案中，药盒包括成熟因子的任何组合。
在一些实施方案中，药盒中的化合物可提供在防水或气密容器中，在一些实施方案中所述容器基本上不含药盒的其他组分。化合物可提供在多于一个容器中，例如，它可提供在具有用于预定数量的反应(例如1、2、3或更多数量的单独反应)以将未成熟和/或衰老心肌细胞或其前体诱导为成熟和/或静止心肌细胞的足够试剂的容器中。成熟因子可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式。优选本文所述的一种或多种化合物(例如成熟因子)是基本上纯的和/或无菌的。当本文所述的一种或多种化合物以液体溶液形式提供时，所述液体溶液优选是水溶液，优选无菌水溶液。当本文所述的一种或多种化合物以干燥形式提供时，通常通过添加合适的溶剂来进行重构。溶剂(例如，无菌水或缓冲剂)可任选地提供于药盒中。
在一些实施方案中，药盒进一步任选地包括信息材料。信息材料可以是涉及本文所述的方法和/或本文所述的一种或多种化合物用于本文所述的方法的用途的描述性、指导性、销售性或其它材料。
药盒的信息材料不限于其说明书或信息材料。在一个实施方案中，信息材料可包括关于如下的信息：化合物的生产、化合物的分子量、浓度、有效日期、批次或生产地点信息等等。在一个实施方案中，信息材料涉及施用化合物的方法。此外，药盒的信息材料的形式不受限制。在许多情况下，信息材料(例如说明)以印刷品，例如印刷文本、图画和/或照片，例如标签或印刷单(printed sheet)的形式提供。然而，信息材料也可以其它格式，如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录来提供。在另一个实施方案中，药盒的信息材料是联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中药盒的使用者可获得关于本文所述的化合物和/或所述化合物在本文所述的方法中的用途的大量信息。当然，信息材料也可以任何格式组合来提供。
在一个实施方案中，信息材料可包括以合适的方式施用如本文所述的一种或多种化合物(例如，成熟因子)以进行本文所述的方法的说明，例如以合适的剂量、剂型或施用模式(例如本文所述的剂量、剂型或施用模式)(例如，至体外细胞或体内细胞)。在另一个实施方案中，信息材料可包括向合适的受试者(例如人，例如患有本文所述的病症或处于本文所述的病症的风险中的人)或向体外细胞施用本文所述的一种或多种化合物的说明。
除了本文所述的一种或多种化合物之外，药盒的组合物还可包含其它成分，诸如溶剂或缓冲剂、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如，苦味拮抗剂或甜味剂)、香料或其它化妆品成分，和/或用于治疗本文所述的疾患或病症的另外的剂。可替代地，其它成分可包括在药盒中，但在与本文所述的化合物不同的组合物或容器中。在此类实施方案中，药盒可包括用于将本文所述的一种或多种化合物与其他成分混合或用于与其他成分一起使用本文所述的一种或多种化合物的说明，例如关于在施用之前将两种剂合并的说明。
药盒可包括用于含有如本文所述的至少一种成熟因子的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，药盒含有用于一种或多种组合物和信息材料的单独容器(例如，用于两种剂的两个单独的容器)、分隔器或隔室。例如，组合物可容纳在瓶、小瓶或注射器中，并且信息材料可容纳在塑料套或包装中。在其他实施方案中，药盒的单独元件容纳在单个未分隔的容器中。例如，组合物容纳于其上附有呈标签形式的信息资料的瓶、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，药盒包括多个(例如一套)单独容器，其各自容纳本文所述的化合物的一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)。例如，药盒包括多个注射器、安瓿、箔包或泡罩包装，其各自容纳本文所述的化合物的单个单位剂量。药盒的容器可以是气密的、防水的(例如，对于水分或蒸发的变化为不可渗透的)，和/或为不透光的。
药盒任选地包括适合用于组合物的施用的装置，例如注射器、吸入器、吸移管、镊子、量匙、滴管(例如滴眼管)、拭子(例如棉拭子或木拭子)或任何此类递送装置。在一个优选实施方案中，装置是例如包装用于手术***的医疗植入装置。
药盒还可包括用于检测心肌细胞的标志物的组分，例如用于本文所述的标志物，例如用于检测成熟心肌细胞的试剂。或者在一些实施方案中，药盒还可包括用于检测心肌细胞的阴性标志物的试剂，以用于成熟心肌细胞的阴性选择或用于鉴定不表达这些阴性标志物的细胞(例如，心肌细胞)的目的。试剂可以是例如针对标志物的抗体或用于RT-PCR或PCR反应(例如半定量或定量RT-PCR或PCR反应)的引物。此类标志物可用于评估是否已经产生了iPS细胞。如果检测试剂是抗体，则它可以干制剂(例如冻干)的形式提供，或以溶液的形式提供。抗体或其他检测试剂可连接至标记，例如用于检测的放射标记、荧光标记(例如，GFP)或比色标记。如果检测试剂是引物，则它可以干制剂(例如冻干)的形式提供，或以溶液的形式提供。
药盒可包括心肌细胞，例如源自相同类型的未成熟和/或衰老心肌细胞或其前体的成熟和/或静止心肌细胞，例如用作阳性细胞类型对照。
施用细胞的方法
在一个实施方案中，本文所述的细胞，例如，成熟心肌细胞群体是可移植的，例如，心肌细胞群体可施用于受试者。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如，成熟、静止心肌细胞群体是可移植的，例如，心肌细胞群体可施用于受试者。在一些实施方案中，施用了心肌细胞群体的受试者是从其获得用于分化成心肌细胞的多能干细胞(例如用于自体细胞疗法)的同一受试者。在一些实施方案中，受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，受试者患有慢性心力衰竭，或者是正常受试者。例如，用于移植的细胞(例如包含心肌细胞群体的组合物)可以是适合用于移植的形式。
所述方法还可包括将细胞施用于有需要的受试者，例如哺乳动物受试者，例如人受试者。细胞的来源可以是哺乳动物，优选人。细胞的来源或接受者也可以是非人受试者，例如动物模型。术语“哺乳动物”包括生物体，其包括小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、兔、山羊、马、猴、狗、猫，并且优选人。同样，可移植细胞可从这些生物体中的任一者获得，包括非人转基因生物体。在一个实施方案中，对可移植细胞进行遗传工程化，例如，细胞包含外源基因或已进行遗传工程化以灭活或改变内源性基因。
可使用可植入装置将包含心肌细胞群体的组合物施用于受试者。可植入装置和相关技术在本领域中是已知的并且可用作递送***，其中需要本文所述的化合物或组合物的连续或定时释放递送。此外，可植入装置递送***可用于靶向化合物或组合物递送的特定点(例如，局部部位、器官)。Negrin等人,Biomaterials,22(6):563(2001)。在本发明中也可使用涉及替代递送方法的定时释放技术。例如，基于聚合物技术、持续释放技术和囊封技术的定时释放制剂(例如聚合物、脂质体)也可用于递送本文所述的化合物和组合物。
药物组合物
对于向受试者施用，通过如本文公开的方法产生的细胞群体，例如心肌细胞群体(通过使至少一种未成熟心肌细胞与至少一种成熟因子(例如，如本文所述的任一种、两种、三种或更多种成熟因子)接触而产生)可例如以药学上可接受的组合物施用于受试者。这些药学上可接受的组合物包含治疗有效量的与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的如上所述的成熟心肌细胞群体。在一些方面，药学上可接受的组合物包含治疗有效量的与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的如上所述的成熟、静止心肌细胞群体。
如下文中详细描述，本发明的药物组合物可被特别配制来以固体或液体形式施用，所述形式包括适合于以下的那些：(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、锭剂、糖衣丸、胶囊、丸剂、片剂(例如以经颊、舌下和全身性吸收为目标的那些)、大丸剂、粉末、颗粒剂、用于向舌施加的糊剂；(2)胃肠外施用，例如通过以例如无菌溶液或悬浮液、或持续释放制剂形式进行皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部施用，例如以乳膏、软膏或受控释放贴剂或向皮肤施加的喷雾剂的形式；(4)***内或直肠内，例如以子宫托、乳膏或泡沫的形式；(5)舌下；(6)眼部；(7)经皮；(8)经粘膜；或(9)经鼻。此外，化合物可植入患者体内或使用药物递送***注射。参见例如，Urquhart,等人,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis,编“Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press,New York,1981)；美国专利号3,773,919；和美国专利号35 3,270,960。
如在此所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如在此所用，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂囊封材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输至身体的另一个器官或部分)。各载体在可与制剂的其它成分相容、并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；以及(25)药物制剂中所采用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。
如本文关于细胞群体所用的短语“治疗有效量”是指细胞群体中相关细胞(例如成熟心肌细胞)的量，或包含本发明的成熟心肌细胞的组合物的量，所述量对于以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比在动物体内的至少一个细胞亚群中产生某种所需的治疗效果是有效的。例如，向受试者施用的成熟心肌细胞群体的量足以产生慢性心力衰竭的至少一种症状(例如心脏收缩功能或室性心律失常的发生率等)的统计学上显著的、可测量的变化。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。一般而言，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、状况、性别以及受试者的医学疾患的严重性和类型以及其他药物活性剂的施用而变化。
疾病或病症的“治疗”、“预防”或“改善”意指延迟或预防这种疾病或病症的发作，逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与这种疾病或病症相关的疾患的进展或严重性。在一个实施方案中，疾病或病症的症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
如本文所用，术语“施用”是指通过使得组合物至少部分定位在所需部位、从而产生所需效果的方法或途径将组合物置于受试者体内。适用于本发明方法的施用途径包括局部施用和全身施用。一般而言，与受试者的整个身体相比，局部施用使得更多的施用的心肌细胞被递送至特定位置，而全身施用使得心肌细胞基本上被递送至受试者的整个身体。
在施用化合物处理的细胞的上下文中，术语“施用”还包括将这种细胞移植到受试者中。如本文所用，术语“移植”是指将至少一种细胞植入或转移至受试者的过程。术语“移植”包括例如自体移植(将细胞从患者的一个位置移除和转移至同一患者的相同或另一个位置)、同种异体移植(同一物种的成员之间的移植)和异种移植(不同物种的成员之间的移植)。
成熟心肌细胞或包含成熟心肌细胞的组合物可通过本领域已知的任何适当的途径施用，包括但不限于口服或胃肠外途径，包括静脉内、肌肉内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、肺部、经鼻、直肠和局部(包括经颊和舌下)施用。
示例性施用模式包括但不限于注射、输注、滴注、吸入、摄取或局部施加。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、脑室内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在优选实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射来施用。在其他优选的实施方案中，组合物通过细胞膜片施用。在一些实施方案中，组合物通过三维结构(例如，基质或支架)施用。在一些实施方案中，组合物通过微组织施用。
如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拔鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种例如家猫，犬科物种例如狗、狐狸、狼，鸟类物种例如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或受试者包括前述各者的任何子组，例如以上全部，但排除一个或多个群组或物种诸如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文所述的方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以是雄性或雌性。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作代表与心脏收缩功能降低或室性心律失常相关的病症的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法和组合物可用于治疗驯养动物和/或宠物。
受试者可以是先前已被诊断患有或鉴定为患有或患有以心脏收缩功能降低或室性心律失常为特征的病症的受试者。受试者可以是先前已被诊断患有或被鉴定为患有心力衰竭(例如，慢性心力衰竭)的受试者。在一些方面，受试者可以是先前已被诊断患有或被鉴定为患有心脏相关疾病或病症的受试者。在一些方面，受试者可以是先前已被诊断患有先天性心脏病(例如，收缩性心脏病或由于组织工程化导致的心脏病)的受试者。
在本文所述的方面的一些实施方案中，所述方法还包括在治疗受试者之前诊断和/或选择受试者的心脏收缩功能降低或室性心律失常。在一些方面，所述方法还包括在治疗受试者之前诊断和/或选择受试者的心脏相关疾病或病症。在一些方面，所述方法还包括在治疗受试者之前诊断和/或选择受试者的先天性心脏病。
本文所述的心肌细胞组合物可与机械支持装置(例如，用于支持心室恢复的心室辅助装置(VAD)或体外膜肺氧合(ECMO)***)组合施用，或与心脏导管***术组合施用以使心脏血运重建(例如，冠状动脉支架置入或球囊血管成形术，或外科旁路移植术)。本文所述的心肌细胞组合物可与药物活性剂组合共同施用于受试者。示例性药物活性化合物包括但不限于在以下文献中发现的那些：Harrison’s Principles of Internal Medicine,第13版,T.R.Harrison等人编McGraw-Hill N.Y.,NY；Physicians’Desk Reference,第50版,1997,Oradell New Jersey,Medical Economics Co.；Pharmacological Basis ofTherapeutics,第8版,Goodman和Gilman,1990；United States Pharmacopeia,TheNational Formulary,USP XII NF XVII,1990；Goodman和Oilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics的当前版本；以及The Merck Index的当前版本，所述文献全部的完整内容整体并入本文。
包含心肌细胞和/或药物活性剂的组合物可以相同的药物组合物或不同的药物组合物(在同时或不同时间)施用于受试者。当在不同时间施用时，包含心肌细胞和/或药物活性剂的组合物可在施用另一者的5分钟、10分钟、20分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、8小时、12小时、24小时内施用。当包含心肌细胞和/或药物活性剂的组合物以不同的药物组合物施用时，施用途径可不同。在一些实施方案中，向受试者施用包含心肌细胞的组合物。在其他实施方案中，向受试者施用包含药物活性剂的组合物。在另一个实施方案中，向受试者施用包含与药物活性剂混合的心肌细胞群体的组合物。在另一个实施方案中，向受试者施用包含心肌细胞群体的组合物和包含药物活性剂的组合物，其中施用基本上同时或彼此相继。
包含心肌细胞群体的组合物的施用的毒性和治疗功效可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。包含表现出大治疗指数的心肌细胞群体的组合物是优选的。
包含心肌细胞群体的组合物的量可使用几种公认的动物模型进行测试。
在一些实施方案中，从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包括ED50、同时具有极小或无毒性的循环浓度范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在此范围内变化。
包含心肌细胞群体的组合物的治疗有效剂量也可初始从细胞培养测定来估计。可替代地，可通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的效果。
至于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常对受试者进行监测以确定治疗提供治疗益处的时间，并且确定是增加还是减小剂量；增加还是降低施用频率；是中止治疗、恢复治疗还是对治疗方案做出其他改变。给药时间表可取决于许多临床因素从每周一次至每天一次变化。所需剂量可一次性施用或分成亚剂量(例如2-4个亚剂量)并且在一段时间内，例如在全天以适当间隔或其他适当时间表进行施用。此类亚剂量可作为单位剂型施用。在一些实施方案中，施用是长期的，例如，在数周或数月的时间段内每天一个或多个剂量。给药时间表的实例是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间的时间段内每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或更多次施用。
在本发明的另一个方面，所述方法提供如本文公开的分离的心肌细胞群体的用途。在本发明的一个实施方案中，如本文公开的分离的心肌细胞群体可用于产生药物组合物，以用于移植到需要治疗的受试者中，例如，患有室性心律失常或心脏收缩功能降低(例如慢性心力衰竭)或有发展室性心律失常或心脏收缩功能降低的风险的受试者。在一个实施方案中，可对分离的心肌细胞群体进行遗传修饰。在另一个方面，受试者可能患有室性心律失常或心脏收缩功能降低或有发展室性心律失常或心脏收缩功能降低的风险。在一些实施方案中，如本文公开的分离的心肌细胞群体可以是自体的和/或同种异体的。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在其他实施方案中，哺乳动物是人。
本发明的一个实施方案涉及一种治疗受试者的慢性心力衰竭的方法，所述方法包括向患有慢性心力衰竭的受试者施用有效量的包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。其他实施方案涉及一种治疗受试者的室性心律失常的方法，所述方法包括向患有室性心律失常的受试者施用有效量的包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。在另一实施方案中，本发明提供了一种用于治疗心脏收缩功能降低的方法，所述方法包括向患有心脏收缩功能降低的受试者施用包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗先天性心脏病的方法，所述方法包括向患有先天性心脏病的受试者施用有效量的包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。
在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可在任何生理学上可接受的赋形剂中施用，其中心肌细胞可找到用于复制、增殖和/或植入的适当部位。在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可通过注射、导管等引入。在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可在液氮温度下冷冻并储存长时间段，并且能够在解冻时使用。如果冷冻，则心肌细胞群体通常将储存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基或其他冷冻保护溶液中。一旦解冻，就可通过使用与本文公开的培养心肌细胞相关的生长因子和/或饲养细胞来扩增细胞。
在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可以药物组合物的形式提供，所述药物组合物包含在足够无菌的条件下制备以用于人施用的等渗赋形剂。关于药物制剂的一般原则，读者可参考Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,G.Morstyn和W.Sheridan编,Cambridge University Press,1996；和Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.D.Ball,J.Lister和P.Law,ChurchillLivingstone,2000。将根据用于施用的途径和装置调整包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物的细胞赋形剂和任何伴随要素的选择。在一些实施方案中，包含心肌细胞群体的组合物还可包含或伴随有促进心肌细胞的植入或功能动员的一种或多种其他成分。合适的成分包括支持或促进心肌细胞或互补细胞类型的粘附的基质蛋白。在另一个实施方案中，组合物可包含可再吸收或可生物降解的基质支架。
基因疗法可用于修饰细胞以替代基因产物、促进组织再生、治疗疾病或改善细胞在植入受试者后的存活(即预防排斥)。
在本发明的一个方面，如本文公开的心肌细胞群体适合于全身施用或施用至目标解剖部位。例如，可将心肌细胞群体移植到受试者的心脏中或附近，或者可全身施用，例如但不限于动脉内或静脉内施用。在替代实施方案中，本发明的心肌细胞群体可以适合植入心脏***中的各种方式施用，包括但不限于胃肠外，包括静脉内和动脉内施用、鞘内施用、心室内施用、实质内施用、颅内、脑池内、纹状体内和黑质内施用。任选地，心肌细胞群体与免疫抑制剂结合施用。
在一些实施方案中，可根据良好的医学实践，考虑到个体患者的临床状况、施用部位和方法、施用时间安排、患者年龄、性别、体重和医疗从业者已知的已知的其他因素来对心肌细胞群体进行施用和给药。出于本文目的的药学“有效量”因此通过本领域已知的此类考虑因素确定。所述量必须有效以实现改善，所述改善包括但不限于如由本领域技术人员选择作为适当的量度的提高的存活率或更快的恢复、或改善或消除症状和其它指示。心肌细胞群体可在以下位置施用于受试者：诊所、临床办公室、急诊室、医院病房、重症监护室、手术室、导管***套件和放射学套件。
在其他实施方案中，储存心肌细胞群体以供以后植入/输注。心肌细胞群体可分成多于一个等分试样或单位，使得心肌细胞群体的一部分被保留以供以后应用，而一部分立即应用于受试者。在细胞库中中等至长期储存全部或部分细胞也在本发明的范围内，如美国专利公布号2003/0054331和专利公布号WO 03/024215中所公开，并且以引用的方式整体并入在加工结束时，可将浓缩细胞负载至递送装置，如注射器中，以通过本领域普通技术人员已知的任何方式放置到接受者中。
在一些实施方案中，心肌细胞群体可单独或与其他细胞、组织、组织片段、生长因子如VEGF和其他已知的血管生成或动脉生成生长因子、生物活性或惰性化合物、可再吸收塑料支架或旨在增强所述群体的递送、功效、耐受性或功能的其他添加剂组合施加。在一些实施方案中，心肌细胞群体也可通过***DNA或通过放置在细胞培养物中以改变、增强或补充细胞功能的方式进行修饰，以达到结构或治疗目的。例如，用于干细胞的基因转移技术是本领域普通技术人员已知的，如(Morizono等人,2003；Mosca等人,2000)中所公开，并且可包括病毒转染技术，且更具体地腺相关病毒基因转移技术，如(Walther和Stein,2000)和(Athanasopoulos等人,2000)中所公开。也可如(Murarnatsu等人,1998)中所公开进行基于非病毒的技术。
在另一个方面，在一些实施方案中，心肌细胞群体可与编码促血管生成生长因子的基因组合。也可应用编码抗凋亡因子或剂的基因。可通过本领域已知的任何技术添加基因(或基因的组合)，包括但不限于腺病毒转导、“基因枪”、脂质体介导的转导和逆转录病毒或慢病毒介导的转导、质粒腺相关病毒。细胞可与携带基因递送载体的载体材料一起植入，所述基因递送载体能够随时间推移释放和/或呈递基因给细胞，使得可继续或起始转导。特别是当将细胞和/或含有所述细胞的组织施用于除从其获得细胞和/或组织的患者以外的患者时，可将一种或多种免疫抑制剂施用于接受所述细胞和/或组织的患者以减轻且优选预防移植排斥。如本文所用，术语“免疫抑制药物或剂”意图包括抑制或干扰正常免疫功能的药剂。适用于本文公开的方法的免疫抑制剂的实例包括抑制T细胞/B细胞共刺激途径的剂，如通过CTLA4和B7途径干扰T细胞和B细胞的偶联的剂，如在美国专利公布号2002/0182211中所公开，所述专利公布以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，免疫抑制剂是环孢菌素A。其他实例包括吗替麦考酚酯、雷帕霉素和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方案中，免疫抑制药物与至少一种其他治疗剂一起施用。免疫抑制药物以与给施用途径相容的制剂施用，并以足以实现所需治疗效果的剂量施用于受试者。在另一个实施方案中，将免疫抑制药物瞬时施用足够长的时间以诱导对本发明的心肌细胞的耐受性。
本发明还考虑了包含有效量的心肌细胞群体的药物组合物。这些组合物包含有效数量的心肌细胞，任选地与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合。在本发明的某些方面，在无菌盐水中向需要移植的受试者施用心肌细胞群体。在本发明的其他方面，心肌细胞群体在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)或Isolyte S(pH 7.4)中施用。也可使用其他方法，包括使用无血清细胞培养基。在一个实施方案中，在血浆或胎牛血清和DMSO中施用心肌细胞群体。在某些适应症中，向受试者全身施用心肌细胞群体可能是优选的，而在其他适应症中，在患病和/或受损组织的部位处或附近直接施用可能是优选的。
在一些实施方案中，心肌细胞群体可任选地包装在具有用于所需目的(如在施用于受试者之前重构或解冻(如果冷冻)心肌细胞群体)的书面说明的合适容器中。
鉴定增加成熟心肌细胞的产生的心肌细胞成熟因子的方法
本文描述了一种鉴定增加心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的产生的心肌细胞成熟因子或剂的方法。在某些实例中，提供了高含量和/或高通量筛选方法。所述方法包括使至少一种未成熟心肌细胞或其前体暴露于至少一种化合物(例如文库化合物或本文所述的化合物)并确定所述化合物是否增加由所述至少一种未成熟心肌细胞或其前体产生心肌细胞(例如成熟心肌细胞)。可使用本文所述的一种或多种标志物将细胞鉴定为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实例中，至少一种未成熟心肌细胞或其前体可在暴露于文库之前分化。在其他实例中，两种或更多种化合物可单独或一起用于筛选测定中。在另外的实例中，可将至少一种未成熟心肌细胞或其前体置于多孔板中，并且可通过将文库的各种成员置于多孔板的不同孔中来筛选化合物文库。这种文库筛选可快速鉴定能够由至少一种未成熟心肌细胞或其前体产生心肌细胞(例如成熟心肌细胞)的化合物。
本文还描述了一种鉴定增加心肌细胞(例如，静止心肌细胞)的产生的心肌细胞成熟因子或剂的方法。在某些实例中，提供了高含量和/或高通量筛选方法。所述方法包括使至少一种衰老心肌细胞暴露于至少一种化合物(例如文库化合物或本文所述的化合物)并确定所述化合物是否增加由所述至少一种衰老心肌细胞产生心肌细胞(例如静止心肌细胞)。可使用本文所述的一种或多种标志物将细胞鉴定为心肌细胞(例如，静止心肌细胞)。在其他实例中，两种或更多种化合物可单独或一起用于筛选测定中。在另外的实例中，可将至少一种衰老心肌细胞置于多孔板中，并且可通过将文库的各种成员置于多孔板的不同孔中来筛选化合物文库。这种文库筛选可快速鉴定能够由至少一种衰老心肌细胞产生心肌细胞(例如成熟心肌细胞)的化合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括分离心肌细胞，例如成熟心肌细胞群体(例如，其中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、50％、75％或更多属于主题细胞类型)。
在一些实施方案中，所述方法还包括将通过如本文公开的方法产生的心肌细胞植入受试者(例如，患有慢性心力衰竭的受试者)中。在一些实施方案中，心肌细胞来源于从受试者获得的干细胞。在一些实施方案中，心肌细胞来源于来自与受试者不同的供体，例如受试者的亲属的干细胞。
在一个方面，本发明的特征是一种通过本文所述的方法制备的心肌细胞，例如成熟心肌细胞。在另一个方面，本发明的特征是一种包含通过本文所述的方法制备的心肌细胞的组合物。
在另一个方面，本发明的特征是一种药盒，所述药盒包括：未成熟心肌细胞或其前体；本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子；以及使用所述未成熟心肌细胞或其前体和所述至少一种心肌细胞成熟因子来产生心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的说明书。在一些实施方案中，药盒还包括：用于检测成熟心肌细胞标志物，例如用于本文所述的标志物的组分，例如用于检测心肌细胞成熟度的标志物的试剂，例如针对标志物的抗体；和成熟心肌细胞，例如用作对照。
在一个方面，本发明的特征是一种促进未成熟心肌细胞或其前体分化为心肌细胞的方法，所述方法包括提供至少一种未成熟心肌细胞或其前体，以及提供至少一种心肌细胞成熟因子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种本文所述的心肌细胞成熟因子)，以在干细胞暴露于至少一种成熟因子后使所述至少一种未成熟心肌细胞或其前体成熟或分化为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实施方案中，至少一种未成熟心肌细胞或其前体来自哺乳动物。在一些实施方案中，至少一种未成熟心肌细胞或其前体来自小鼠或人。在一些实施方案中，至少一种未成熟心肌细胞或其前体来源于培养胚胎干细胞(例如，哺乳动物胚胎干细胞，如小鼠或人胚胎干细胞)。在一些实施方案中，至少一种未成熟心肌细胞或其前体来源于培养诱导型多能干细胞(例如，哺乳动物iPs细胞，如小鼠或人iPs细胞)。
在一些实施方案中，使多个未成熟心肌细胞或其前体分化或成熟为多个成熟心肌细胞，例如，通过使所述多个未成熟心肌细胞或其前体与至少一种、至少两种、至少三种或更多种如本文所述的心肌细胞成熟因子接触。
在一些实施方案中，使多个衰老心肌细胞成熟为多个静止心肌细胞，例如，通过使所述多个衰老心肌细胞与至少一种、至少两种、至少三种或更多种如本文所述的心肌细胞成熟因子接触。
在一些实施方案中，使多个未成熟心肌细胞或其前体暴露于心肌细胞成熟因子持续约1、2、4、6、8、10、12、14、16天或更多天。在一些实施方案中，使多个未成熟心肌细胞或其前体暴露于约25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM或10μM浓度的心肌细胞成熟因子。在一些实施方案中，使多个未成熟心肌细胞或其前体暴露于约250nM、400nM、500nM、600nM、700nM或800nM浓度的心肌细胞成熟因子。在一些实施方案中，使大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的未成熟心肌细胞或其前体分化或成熟为成熟心肌细胞。
应理解，上述具体实施方式和以下实施例仅是说明性的，并且不应被视为对本发明范围的限制。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行对本领域技术人员而言显而易见的对公开的实施方案的各种改变和修改。此外，出于描述和公开的目的，所有鉴定的专利、专利公布和出版物均明确地以引用的方式并入本文，例如，此类出版物中描述的方法可与本公开结合使用。这些出版物仅仅由于其在本申请的提交日期之前公开而提供。就此而言，任何事物都不应解释为认可由于先前发明或因为任何其他原因而使发明者无权先于所述公开。所有关于这些文件的日期的说明或内容的陈述均是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
实施例
实施例1–对mTOR信号传导的抑制通过p53诱导的静止增强源自人诱导型多能干细胞的心肌细胞的成熟
人胚胎干细胞(ESC)或诱导型多能干细胞(iPSC)能够产生高度纯的心肌细胞群体，如通过心肌肌钙蛋白的表达所确定(1)。然而，这些方案产生的未成熟心肌细胞更接近类似于胎儿状态，具有更少组构的肌小节结构，最大收缩力较低，上行速度较慢，静止电位较高，没有T小管，并且持续依赖于糖酵解作为主要能量来源(2)。值得注意的是，与媒介物对照相比，将未成熟ESC来源的心肌细胞递送至大型动物模型(猕猴或约克夏猪)导致潜在危及生命的室性心律失常的风险增加(3，4)。干细胞来源的心肌细胞的不充分成熟是用于心脏病的细胞疗法的临床转化的主要障碍。
增强干细胞来源的心肌细胞的成熟的先前方法取得的成功有限。生物工程化底物(5)、延长培养时间(2)、外部起搏(6，7)、共培养(8)、机械刺激(9)和生物活性分子如三碘甲腺原氨酸(10)、糖皮质激素(11)或脂肪酸(12)已显示成熟的一些改善。然而，导致心肌细胞成熟增强的潜在分子机制仍不清楚。在含高葡萄糖的培养基背景下观察到的缺氧诱导因子-1α(HIF1α)信号传导的异常上调可导致心肌细胞不成熟(13)。这表明营养传感器可能负责心肌细胞成熟的起始。
出生时，哺乳动物经历显著生理变化，因为新生儿适应从胎盘获取氧气和营养物至通过自发呼吸获取氧气和通过肠内喂养获取营养物。这些生理变化调控心脏表型的潜在分子机制仍不清楚。在小鼠中，心肌细胞在出生后的最初几天内保留心肌损伤后再生的能力(14)。然而，超过这个时期，心肌细胞退出细胞周期并变得静止(15)。尽管静止细胞没有活跃增殖，但在这种状态下细胞远未处于休眠状态-相反，细胞保留代谢和转录活性(16)。这一静止期与心肌细胞的成熟增加、更多组构的肌小节结构、动作电位持续时间延长以及从糖酵解至脂肪酸氧化的转变相一致(15)。
雷帕霉素机制性靶标(mTOR)是生长和代谢的中心调控因子(17)。mTOR充当营养传感器，其可刺激细胞增殖并且可充当糖酵解与氧化磷酸化之间的代谢开关(18)。mTOR蛋白与其他蛋白质形成复合物以形成mTOR复合物1(mTORC1)或mTOR复合物2(mTORC2)，其各自起到互补或有时竞争的作用(17)。mTOR***在确定退出细胞周期的细胞是否进入静止与衰老(与衰老相关的不可逆细胞周期停滞状态)方面也是重要的(19)。无伴随mTOR抑制的细胞周期停滞导致衰老，而伴随mTOR抑制的细胞周期停滞导致静止(19，20)。mTOR还被证明可调控其他细胞类型的成熟，包括胰腺β细胞(21)、红细胞(22)和自然杀伤细胞(23)。在心脏中，mTOR信号传导已被证明可调控心脏肥大(24)，并且从心肌细胞中缺失mTOR导致发育过程中的心肌细胞凋亡(25)。然而，mTOR调控是否以及如何影响心肌细胞的成熟尚不清楚。
mTOR受到小分子雷帕霉素抑制(17)。雷帕霉素在在分化前和早期分化期间使用时通过减少p53依赖性细胞凋亡来增强心肌细胞分化效率(26)。雷帕霉素主要抑制mTORC1，但是当长期使用时雷帕霉素对mTORC2具有一定抑制作用(27)。相比之下，双重mTORC1/2抑制剂Torin1对mTORC1和mTORC2两者均具有急性抑制作用，并且对翻译起始因子4E-BP1磷酸化的抑制作用也比雷帕霉素更完全(28，29)。4E-BP1可与细胞周期调控因子p53串扰相互作用，p53是指导细胞静止的重要介质(30)。测试了用Torin1瞬时抑制mTOR途径导致细胞静止并增强iPSC来源的心肌细胞成熟的假设。
结果
用Torin1进行的双重mTORC1/2抑制导致细胞静止
mTOR在不同分化阶段和不同浓度的Torin1(0-200nM)下受到瞬时抑制，然后评估对细胞周期状态和心肌细胞纯度的影响。基于来自这些方案优化步骤的结果，对于大多数后续实验，将细胞在搏动开始后约2天开始用200nM Torin1对媒介物(0.02％DMSO)处理7天(图1A)，除非另有说明。
当施用于分化的心肌细胞时，用Torin1处理导致S6K和Akt两者的磷酸化急剧减少，从而证明其对mTORC1(S6K)和mTORC2(Akt)两者的下游影响(图1B)。在用Torin1单次处理后的2天内，观察到S6K而不是Akt的磷酸化状态恢复，从而表明可能需要重复处理以维持mTORC1抑制(图1B)。使用Torin1处理，每孔细胞的绝对数量减少和TNNT2+细胞的纯度增加的趋势不显著(分别图1C和1D)。观察到细胞周期蛋白C1和E2F1增殖标志物的显著减少，以及包括p16和p130的静止标志物的表达增加的非显著趋势(图1E)。
与媒介物对照相比，用Torin1处理搏动心肌细胞导致静止(G0)细胞从24％增加至48％和G1细胞从47％减少至27％(图1F中的代表性流式细胞术图，图1G中的分析)。由于担心通过流式细胞术进行的细胞周期分析可能受到解离的选择偏差或由于成熟时DNA/RNA含量的变化而产生假阳性，因此还在原始12孔培养板中对增殖标志物Ki67和磷酸化-组蛋白H3(pH3)进行了免疫染色。与对照相比，Torin1处理显著降低了Ki67+心肌细胞的百分比，但没有改变pH3+心肌细胞的百分比(图8)。在完成Torin1处理后两天开始用10％FBS刺激48小时导致G0(图1I)而不是对照(图1H)中Torin1处理的细胞的百分比显著降低，从而表明至少一些Torin1处理的细胞仍然保留在适当刺激下重新进入细胞周期的能力，并且没有进入细胞衰老或更深的静止。
在晚期分化过程中用Torin1对mTORC1/2进行双重抑制增强iPSC来源的心肌细胞的收缩性
Torin1处理趋向于增加MYH6、MYH7、TNNT2mRNA的表达，并且以剂量依赖性方式显著增加TNNI3 mRNA表达(图2A)，尽管TNNT2和TNNI3 RNA水平仍显著低于胎儿或成体心脏RNA表达水平(图9A-9B)。此外，Torin1处理导致TNNT2和TNNI3蛋白表达(通过蛋白质印迹分析(图2B中所示的代表性印迹))和TNNT2 MFI(通过流式细胞术(图2C))的剂量依赖性增加。测试了Torin1处理的另外时间点，并且当Torin1处理较短(5天处理)(图10)或更晚(搏动开始后10天开始)(图11)时，通过流式细胞术观察到对TNNT2 MFI的有益效果；然而，为了一致性，本研究选择了在搏动开始后约2天开始的7天Torin1处理的单一方案用于实验。还观察到TNNI1蛋白质水平(图2B)(而不是RNA水平，图2A)的增加——肌钙蛋白I的这种同种型将预期随着心肌细胞成熟而减少(35)；然而，鉴于总体TNNI3水平仍远低于甚至胎儿心脏的水平，可能仍需要进一步增加所有肌钙蛋白同种型以实现提高的成熟度。在完成1周的Torin1处理后，将心肌细胞解离并重新接种到明胶肌肉薄膜(MTF)上以评估收缩力(图2D)。与对照相比，含有Torin1处理的心肌细胞的MTF产生的相对最大收缩力增加近2倍(图2F，其中图2E中示出代表性力跟踪对比时间)。Torin1处理的心肌细胞在肌小节长度方面与对照相比没有表现出差异(图2H，图2G中示出的代表性图像)。令人感兴趣地，在完成Torin1处理后，通过与10％FBS一起孵育2天，用Torin1处理的TNNT2 MFI增加被逆转(图2I)，从而表明用生长刺激重新激活mTOR信号传导可能对心肌细胞表型有害。
在晚期分化过程中用Torin1对mTORC1/2进行双重抑制增强iPSC来源的心肌细胞的代谢成熟
使用Seahorse Mito应力测试来评估线粒体功能(图3A)，与对照相比，观察到Torin1处理的心肌细胞的归一化最大OCR的显著增加(图3B)，从而表明更成熟的心肌细胞表现出向氧化磷酸化的转变。还观察到细胞外酸化速率(ECAR)降低的趋势(图12A和12B)。这种变化似乎是由于来自非糖酵解酸化的ECAR减少(图12C)，如在糖原分解减少情况下可能发生的情况(36)。出人意料地，通过流式细胞术观察到线粒体与核DNA比率(图3C)降低和MitoTracker的MFI降低(图3D)，这可能反映了细胞静止状态。然而，观察到线粒体膜极化的显著增加，如通过用Torin1持续1周，MitoProbe JC-1红色:绿色荧光比的增加所示(图3E)，从而表明存在的线粒体更成熟。用Torin1处理观察到PPARGC1a(也称为PGC1α，调控线粒体生物发生和成熟的转录共激活因子(37))的mRNA表达的剂量依赖性增加(图3F)。这伴随着脂肪酸转运蛋白6(FATP6)的mRNA表达的增加。没有观察到选定线粒体基因(图13A)或蛋白质(图13B)的显著变化，尽管用Torin1观察到脂肪酸受体CD36的表达增加的趋势(图13C)。在脂肪酸处理情况下，观察到OPA1的表达增加的趋势。
在晚期分化过程中用Torin1双重抑制mTORC1/2可增强成熟离子通道的表达并增加峰值上升时间和下行速度
Torin1处理导致KCNJ2、CACNA1c、RYR2、ATP2A2(SERCA2A)和SCN5A mRNA表达的显著剂量依赖性增加(图4A)。还存在不显著的HCN4增加趋势(图4A)——虽然预计更成熟的非起搏心肌细胞的HCN4表达水平降低，但HCN4的倍数变化仍然低于针对测试的其他离子通道所观察到的倍数变化。观察到RYR2、KCNJ2和CACNA1c的mRNA水平仍远低于在成体心脏中发现的水平，并且RYR2和KCNJ2表达水平也明显低于胎儿心脏水平(图9)。这表明所有离子通道的表达仍需要增加以达到更高的成熟度。此外，通过流式细胞术，Torin1显著增加了细胞外Kir2.1(由KCNJ2编码)的MFI(图4B)。观察到Torin1处理的细胞的自发收缩率降低(图4C)——这将Kir2.1表达增加的情况下预期，Kir2.1是抑制自律性的关键离子通道(38)。Torin1处理影响离子通道表达与肌小节蛋白表达的最佳时间窗口可能不同(图10)。使用FluoVolt生成的动作电位分布图(图4C中示出CyteSeer软件细胞分割的代表性图像)表明，Torin1处理的细胞通常具有更长的平台相和更尖锐的上行和下行(图4E)，这由数值参数反映,其中峰值上升时间(图4F)、CTD75(图4I)和T75-25时间(图4J)显著降低，并且下行速度显著增加(图4G)，CTD25没有变化(图4H)。此外，观察到用Torin1处理，钙峰值上升时间、峰值衰减时间和FWHM(半峰全宽)时间显著降低，其中在异丙肾上腺素刺激的情况下这些参数进一步降低(图14)。
用Torin1进行双重mTORC1/2抑制增强p53和GATA4的表达，同时抑制p21的表达
使用Torin1，观察到肿瘤抑制蛋白和细胞周期调控因子p53(总蛋白和磷酸化蛋白)的剂量依赖性增加，以及p21蛋白表达的剂量依赖性降低(图5A)。已知p53上调p21(39)，但在mTORC1抑制的背景下，p21也可被低磷酸化的4E-BP1降解(40)。因此，数据表明Torin1起作用以直接降低p21的水平，这可能导致p53上调的次要效应。用Torin1处理还存在心脏转录因子GATA4(而不是NKX2.5)的蛋白质表达增加的趋势(图5A)，这与p53调控心脏转录组的先前证据一致(41)。与单独Torin1相比，与Torin1处理的细胞一起使用pifithrin-α(抑制p53活性的小分子抑制剂(42))降低了静止(G0)心肌细胞的百分比并增加了细胞周期(G1，S/G2/M)中的心肌细胞的百分比)(图5B)。此外，pifithrin-α抑制了Torin1诱导的p53和TNNI3两者的增加(图5C，代表性蛋白质印迹；图5D，p53的光密度测定分析)。
用nutlin-3a上调p53独立地且以与Torin1协同的方式增强TNNI3的表达
为了确定单独的p53上调是否足以促进细胞静止或者是否需要伴随mTOR抑制(图6A中的示意图)，用nutlin-3a处理细胞，nutlin-3a通过抑制E3泛素连接酶MDM2增加p53，独立于mTOR。与对照相比，用单独nutlin-3a(10μM持续24小时)、单独200nM Torin1(200nM持续7天)或nutlin-3a(10μM持续Torin1处理的前24小时)和Torin1(200nM持续7天)增加了静止(G0)TNNT2+心肌细胞的百分比并降低了G1期的TNNT2+心肌细胞的百分比(图6B)。此外，nutlin-3a独立于Torin1增加p53和TNNI3蛋白表达(图6C)。当用nutlin-3a与Torin1的组合处理心肌细胞时，与单独nutlin-3a或单独Torin1相比，观察到p53表达水平的显著增加(图6D)。此外，用nutlin-3a和Torin1两者组合处理存在TNNI3表达的进一步增加(图6E)。因此，单独p53上调可促进有限的心肌细胞成熟，但与mTOR抑制组合，这种效应进一步增强。
Torin1处理使细胞从衰老表型转变为静止表型
NanoString PanCancer途径组用于提供在用Torin1处理、然后用FBS对比对照处理的细胞中与细胞周期、生长和代谢相关的基因的多重分析。通过无监督分级聚类和主成分分析(PCA)，在组中所有基因的水平下(图15A(热图)和15B(PCA))以及某些基因亚组中观察到四个处理组(对照组、对照组+FBS、Torin1、Torin1+FBS)的聚类，包括如通过NanoString描绘的“细胞周期”(图7A(热图)、图15F(PCA))和“蛋白质代谢”(图7B(热图)，图15H(PCA))途径。对于细胞周期(图15G)和蛋白质代谢(图15I)途径，观察到通过途径评分(分配以总结特定途径内所有基因的总体变化的数值)的聚类。
所有基因(图15C-15E)以及细胞周期(图7C-7E)和蛋白质代谢(图7F-7H)途径的差异基因表达表明四组之间细胞静止对比衰老的差异。特别地，Torin1处理导致白细胞介素-8(IL8)和SPP1(骨桥蛋白)的表达显著降低(图7G)，这两种分泌因子都被视为衰老相关分泌表型(SASP)的一部分(43)，从而表明Torin1可重新引导细胞远离衰老表型。当用FBS刺激对照细胞时，这导致细胞周期抑制剂CDKN1a(p21)的上调，以及细胞周期蛋白A2、B1、D2和E2的下调，这在衰老表型中也是预期的。在先前用Torin1处理的细胞中，用FBS没有观察到CDKN1a(p21)的显著增加。然而，在Torin1处理的细胞中血清处理的情况下，观察到SPP1的增加和细胞周期蛋白B1的减少，从而表明使用FBS处理，至少一些细胞可被引导朝向衰老而不是静止表型。令人感兴趣地，用FBS处理，通过流式细胞术观察到TNNT2的MFI降低(图2I)，从而表明在Torin1处理情况下观察到的成熟增益可在引导朝向衰老命运后逆转。
论述
在这项研究中，发现双重mTORC1/2抑制剂Torin1增加了处于静止(G0)状态的细胞的百分比，并增强了与心肌细胞成熟相关的基因(包括TNNI3和KCNJ2)的表达。Torin1处理使得由iPSC来源的心肌细胞产生的相对收缩力增加，以及动作电位分布图的峰值上升时间和下行速度增加。此外，观察到用Torin1瞬时处理的心肌细胞的OCR增加，从而表明这些细胞在代谢上比对照细胞更成熟。还观察到，Torin1处理显著降低了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的mRNA表达，同时增加细胞周期调控因子p53的表达。GATA4的表达也有增加的趋势，之前已证明它受p53的调控(41)。此外，nutlin-3a(一种p53激活剂)独立地增加了TNNI3表达，并与Torin1具有协同作用。这些数据表明增加p53的表达对诱导心肌细胞静止和成熟具有双重作用。
由于担心未成熟心肌细胞刺激室性心律失常，干细胞来源的心肌细胞的不充分成熟仍然是临床转化的重大障碍(3，4)。已使用各种策略来促进源自干细胞的心肌细胞的成熟(6，9)。与或不与***一起添加三碘甲腺原氨酸(10，11)或下调HIF1α(13)改善心肌细胞成熟-值得注意的是，***可抑制mTOR信号传导(44)，HIF1α受mTOR调控(45)，并且三碘甲腺原氨酸可下调mTOR信号传导(46)。对mTOR信号传导的刺激实际上可抑制心肌细胞成熟——诸如葡萄糖的生长信号刺激mTOR，并且葡萄糖刺激已被证明可阻止心肌细胞成熟(47)。此外，胰岛素也是可刺激mTOR并支持心肌细胞的未成熟状态的生长刺激分子(48)。最后，虽然缺氧可抑制mTOR信号传导(49)，但缺氧也可上调成体鼠心肌细胞的糖酵解，同时刺激心肌细胞增殖(即减少静止)。显示抑制mTOR信号传导可促进心肌细胞成熟的数据与这些先前研究一致。
在立即新生儿期之后，心肌细胞退出细胞周期并且在很大程度上不增殖，心肌形成瘢痕组织而不是在损伤后再生(14)。认为出生后心肌细胞是衰老的，具有不可逆的细胞周期退出。然而，最近的数据表明，成体心肌细胞能够以每年约1％的心肌细胞更新率在成人中增殖(50)。这表明成体哺乳动物心肌细胞实际上可能处于深度静止(G0)状态，而不是衰老。细胞静止是由营养剥夺触发的静止状态，并且其特征在于响应于适当刺激重新进入细胞周期的能力(16)。然而，尽管没有发生增殖，但在这种状态下细胞远未处于休眠状态-相反，细胞保留代谢和转录活性(16)。在G0状态内，细胞可具有不同的静止深度，包括进入G0的过渡进入期、深度G0和G警戒状态，其是更浅的静止状态，在此期间细胞对触发返回细胞周期的刺激反应性更强(16)。数据表明静止状态促进心肌细胞成熟，而衰老状态抑制心肌细胞成熟。
在Torin1处理后，观察到肿瘤抑制因子p53的蛋白质表达的剂量依赖性增加，但p21蛋白表达不是增加而是出人意料的降低。已知p53上调p21的表达，并且p53进而受到p21的反调控，因为p53的稳定性被p21降低(39)。p21表达的降低可能是由于4E-BP1对p21的调控，因为Torin1对mTORC1的抑制阻止4E-BP1的磷酸化，并且4E-BP1的非磷酸化状态可结合至并降解p21(40)。这表明iPSC来源的心肌细胞中的Torin1处理间接导致p53表达和活性增加，其可指导心肌细胞成熟。Torin1对p53和TNNI3表达的影响被p53抑制剂pifithrin-α抑制。最近，p53被鉴定为维持心肌细胞表型的核心(41)。全基因组分析将p53鉴定为诱导其他心脏转录因子(包括GATA4、NKX2.5、MEF2a和SRF的表达)的心脏转录组调控因子(41)。通过对关键心脏转录因子的这种中枢调控，这可解释跨收缩、电生理和代谢结构域，心肌细胞成熟的普遍改善。
p53可起始衰老或静止，并且这一决定部分受mTOR调控(19)。观察到用小分子nutlin-3a上调p53增加了G0中细胞的数量并增加了TNNI3蛋白表达，与Torin1组合具有进一步协同作用。在小鼠胚胎成纤维细胞中，用nutlin-3a上调p53导致衰老(19)。然而，当这些细胞同时用雷帕霉素处理以抑制mTOR及用nutlin-3a处理以上调p53时，细胞被引导朝向细胞静止，而不是衰老(19)。因此，在某些细胞类型中，p53的伴随上调和mTOR信号的下调对于将细胞引导朝向静止表型是必要的。在iPSC来源的心肌细胞中使用nutlin-3a和Torin1的这种组合处理导致与单独任一者相比，TNNI3表达的进一步增强，从而表明p53的进一步激活可对心肌细胞成熟具有额外的有益作用。
多重基因表达分析揭示，Torin1处理降低了与衰老相关分泌表型(SASP)相关的选定基因的表达，SASP是与细胞衰老相关的促炎状态(43)。这表明Torin1可通过p21下调使分化心肌细胞重定向远离衰老状态，并通过p53的伴随上调和mTOR的下调重定向朝向静止表型。然而，在除去Torin1并同时用血清刺激后mTOR重新激活的情况下，Torin1处理的细胞朝向衰老表型转变。这伴随着TNNT2 MFI的降低，从而表明在静止期间发生的成熟增益可在过渡至衰老状态时逆转。未来的研究应探索促进更深的静止状态是否能够防止转化为衰老或增殖状态并维持心肌细胞成熟。
总之，结果证明，在晚期分化过程中用Torin1处理诱导细胞静止并改善iPSC来源的心肌细胞的选定成熟参数。这种效应似乎至少部分地由p53的上调驱动，p53可同时诱导细胞静止并调控心脏转录组。这表明mTOR信号传导途径是心肌细胞成熟的关键调控因子。
方法
细胞系
本研究中使用了三种人iPSC系。BJ-RiPS细胞系(雄性供体，成纤维细胞来源的)获自哈佛干细胞研究所(HSCI)诱导型多能干细胞(iPSC)核心设施。UCSD142i-86-1iPSC系(雌性供体，成纤维细胞来源的)由加州大学圣地亚哥分校的Kelly Frazer博士实验室生成，并由WiCell分销。市售Gibco附加型来源的iPSC系(CD34+脐带血单核细胞来源的)购自ThermoFisher Scientific。每种细胞系的总传代数少于70，并且当自上次解冻后传代数接近20时，解冻新的更低传代小瓶。将细胞维持在StemFlex(ThermoFisher)中，***后每3-4天使用ROCK抑制剂传代持续24小时。图中描绘的代表性数据来自单个细胞系的单独实验；每个图使用的细胞系在图例中指示(缩写为BJRIPS-CM、Gibco iPS-CM或UCSD-CM)。在所有三种细胞系中进行了关键实验以确认再现性。
诱导型多能干细胞来源的心肌细胞的分化
为了准备分化，在分化开始前4天，将iPSC以12孔板的每孔介于20,000至80,000个细胞的密度(取决于细胞系)涂铺。根据Lian等人先前描述的方案使细胞分化，具有一些修改(图1A)(1)。在分化的第0天，将基础培养基从StemFlex更换为RPMI/B27。GSK3抑制剂CHIR99021(6μM)从分化的第0天至第2天在细胞大约70％-80％汇合时添加持续48小时。从分化的第2天至第4天添加Wnt拮抗剂IWP4(5μM)。从分化的第7天开始将胰岛素(10μg/ml)添加至培养基中，每2-3天更换培养基。一般而言，在分化第10天之前开始搏动时观察到更高纯度(TNNT2+)心肌细胞，因此本研究中仅包括在分化的第7-10天之间开始搏动的批次。搏动心肌细胞在搏动开始后约2天开始用Torin1(200nM，除非另有说明)或媒介物(0.02％二甲亚砜(DMSO))处理7天(每2-3天用新鲜Torin1或DMSO更换培养基)，除非另有说明。在Torin1处理后，将培养基转换回RPMI/B27/胰岛素并维持，每2-3天更换培养基直至终点测定。在一些测定中，脂肪酸以1:1000稀释的化学成分确定的脂质(Gibco)的形式与Torin1处理同时添加。在一些其他测定中，在完成Torin处理持续2-4天后，将胎牛血清(10％FBS)添加至细胞中。
定量逆转录酶聚合酶链反应
使用RiboZol(VWR)、然后E.Z.N.A.从细胞中提取RNA。然后根据制造商的说明书，使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将总RNA I试剂盒(Omega)逆转录为cDNA。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)和表1中列出的引物对与Bio-Rad CFX384实时热循环仪进行定量PCR(qPCR)。TATA结合蛋白(TBP)用作管家基因。
蛋白质印迹分析
用裂解缓冲液(1％Triton X、0.35％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、1％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)、1％磷酸酶抑制剂混合物2(Sigma)、1％磷酸酶抑制剂混合物3(Sigma)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF))裂解细胞，并用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒测量总蛋白质。将具有相等总蛋白质量的样品(在Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)中制备)负载到Mini-Protean TGXPrecast Gel(Bio-Rad)中并在100V下电泳1小时，然后使用Trans-Blot Turbo转移***(Bio-Rad)转移至PVDF膜。Precision Plus蛋白质双色标准品分子量梯用于估计检测条带的分子量(Bio-Rad)。用5％乳或牛血清白蛋白封闭膜，然后与第一抗体(表2)一起在4摄氏度下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(表2)一起在室温下孵育1小时。使用Amersham ECL蛋白质印迹检测试剂盒通过化学发光检测蛋白质信号，并使用ImageJ软件(NIH)定量条带密度。
流式细胞术
将细胞解离，并且每种条件使用5x105至1x106个细胞。对于细胞周期分析，将每种条件5x105个细胞在70％冷乙醇中固定至少2小时至在-20℃下过夜。细胞首先在透化缓冲液(Thermo)中用AlexaFluor647-TNNT2、然后用赫斯特33342(2μg/ml)和派诺宁Y(4μg/ml)染色20分钟，以区分G0、G1和S-G2-M期中的细胞。对于其他染色，将细胞在eBioscience细胞内固定缓冲液中固定30分钟，然后在eBioscience透化缓冲液中洗涤两次，并在eBioscience FACS染色缓冲液中用适当的第一抗体(表2)染色30-60分钟。如果使用第二抗体，则将细胞与适当的第二抗体(表2)一起孵育30-60分钟。对TNNT2和Kir2.1抗体的几何平均荧光强度(MFI)进行了定量。通过BD LSRII仪器获取数据并使用FlowJo软件进行分析。
免疫细胞化学
用0.1％胰蛋白酶-EDTA分化后，将细胞从12孔板中解离，并重新涂铺到Geltrex包被的4室显微镜载玻片中。将细胞固定在4％多聚甲醛中，然后用0.5％Triton X-100透化。用5％BSA封闭后，将细胞在室温下与第一抗体(表2)一起孵育30分钟，然后在室温下在黑暗中与第二抗体(表2)一起孵育45分钟。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后，施加具有DAPI的Vectashield封固剂(用于载玻片)或DAPI(用于板)，并用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 700)可视化细胞。肌肉薄膜(MTF)以类似方式染色，不同之处在于DAPI(1μg/ml)施加5分钟，然后冲洗并将MTF转移至PBS中直到成像。
增殖心肌细胞的成像定量
使心肌细胞在12孔板中分化，然后在原始板中固定和染色，以使选择解离后存活细胞的可能性最小化。如免疫染色方法中所述，用Ki67/TNNT2/DAPI或磷酸化-H3/TNNT2/DAPI对细胞进行染色。用荧光显微镜获取图像。含有TNNT2+细胞的单层区域是用10倍物镜从板中的5个视野中随机选择的。ImageJ的粒子分析特征用于定量每个视野中对DAPI、Ki67或pH3呈阳性的细胞的数量。为了控制样品间的变异性，将DAPI和pH3(488nm)通道的信号阈值设置为<500，并将Ki67(488nM)的信号阈值设置为<600。分析中包括10-1000像素2的粒度。对通过DAPI和TNNT2标记的细胞总数中Ki67+细胞或pH3+细胞的百分比进行定量。卡方检验用于评估统计显著性。
肌肉薄膜
如先前所述制备明胶肌肉薄膜(MTF)(32)。用低粘胶带(Patco 5560可移除保护薄膜胶带)覆盖方形22x22 mm玻璃盖玻片，并使用Epilog Mini 24激光雕刻仪器切割胶带，使得两个内矩形(悬臂区域为3x 10mm，并且基区为7x 10mm)被外边界包围。将较大的内矩形被剥离，并且将此区域用0.1M NaOH激活5分钟，然后用95％乙醇中的0.5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)激活5分钟，然后用0.5％戊二醛溶液激活30分钟。然后冲洗并干燥玻璃盖玻片。接下来，将覆盖较小内矩形区域的胶带剥离。将蒸馏水溶液中的20％w/v储备明胶(175g布卢姆，A型，Sigma)在65℃下溶解30分钟，并且将蒸馏水溶液中的8％w/v储备微生物转谷氨酰胺酶(MTG)(Ajinomoto)在37℃下溶解30分钟。将储备明胶和储备MTG溶液在使用前立即以1:1的比例混合，最终浓度为10％w/v明胶和4％w/v MTG。将溶液吸移到盖玻片上暴露的方形区域中。将具有25μm脊宽x 4μm槽宽线特征的聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard184，Dow Corning)***放置在明胶上，并在PDMS***顶部放置500g砝码。使明胶在室温下静置过夜。第二天，移除砝码并将带有明胶和PDMS***的玻璃盖玻片置于蒸馏水中30分钟，以在移除PDMS***之前使明胶重新水合。除去沿明胶边界的剩余胶带。用Kimwipe将MTF擦干，然后使用Epilog Mini 24激光雕刻机以3％功率、7％速度和2000Hz的频率切割悬臂(1mm长x 3mm长)6-7次。将MTF在70％乙醇中灭菌5分钟，然后在PBS中的生物安全柜中暴露于UV光过夜。在接种细胞之前，将MTF在室温下用Geltrex(Invitrogen)包被30分钟。在完成Torin1或媒介物处理后，将iPSC来源的心肌细胞从12孔板解离，并以每100μL 800,000个细胞的密度重新接种到MTF上。让细胞在37℃下在100μL体积中粘附1-2小时，然后将额外的4ml RPMI/B27/胰岛素+10％FBS添加至6孔板的每个孔中。第二天，将培养基更换回不含血清的RPMI/B27/胰岛素。在成像/起搏之前，允许细胞粘附并从重新涂铺中恢复4-5天。在分析当天，将明胶MTF转移至含有台罗德氏(Tyrode’s)溶液(1.8mM CaCl2、5mM葡萄糖、5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、1mM MgCl、5.4mM KCl、135mM NaCl、0.33mM的NaH2PO4，pH 7.4)的35mm皮氏培养皿中。在解剖显微镜(Leica MZ9.5)下小心除去每个悬臂周围的多余明胶，并使用细镊子小心地将悬臂从玻璃中释放出来。在测量期间，将MTF在加热块中保持在37℃。将两个间距为2cm的铂电极放置在培养皿中，并使用MyoPacer细胞刺激剂(IonOptix)在20V下使MTF从1-4Hz起搏。使用Basler A601f-2相机以每秒20帧获取图像。使用ImageJ定量每个MTF的曲率半径。使用Zeiss LSM共聚焦显微镜确定MTF的厚度。修改的Stoney方程用于使用曲率半径、厚度和弹性模量计算每个MTF的力(33)。计算每个MTF的最大和平均收缩、舒张和抽动(收缩-舒张应力)应力。
Seahorse Mito应力测试和糖酵解应力测试
Seahorse XFe96分析仪(Agilent)用于评估分化心肌细胞的代谢活性。将Seahorse XFe96细胞培养微孔板用Geltrex(在DMEM:F12中1:100稀释)包被。如上所述分化心肌细胞，然后在搏动开始后大约两天开始用DMSO或Torin1(200nM)处理一周(对于大多数批次，分化的约第9-16天)。处理后，将所有细胞更换回RPMI/B27/胰岛素培养基中，直到测定准备(在分化的第35天或之前进行)。测定前一天，将心肌细胞用0.1％胰蛋白酶-EDTA解离5分钟，然后用RPMI/B27/胰岛素+10％胎牛血清(FBS)中和，并以每孔20,000-30,000个细胞的密度涂铺。将心肌细胞在含血清培养基中保持过夜以促进细胞粘附。在测定前一小时，将板更换为Seahorse测定培养基(补充有25mM葡萄糖、1mM丙酮酸钠和1mM GlutaMAX的XF基础培养基)，然后在37℃下在不含CO2的孵育箱中与Seahorse测定培养基一起孵育。根据制造商的说明书使用XF Cell Mito应力测试试剂盒，使用注射化合物的以下最终浓度：2μM寡霉素、2μM 2-[2-[4-(三氟甲氧基)苯基]亚肼基]-丙二腈(FCCP)和0.5μM鱼藤酮/抗霉素A。根据制造商的说明书使用XF糖酵解应力测试，使用10mM葡萄糖、1μM寡霉素和50mM 2-脱氧葡萄糖。在测量响应于连续注射应力测试试剂盒化合物的耗氧速率(OCR)和细胞外酸化速率(ECAR)后，使用CyQUANT测定(Thermo Fisher Scientific)确定最终细胞密度，以说明洗涤过程中的细胞损失。未用于Seahorse测定但在相似分化日的心肌细胞用于创建CyQUANT测定的标准曲线以定量绝对细胞数，以说明洗涤/混合步骤期间的细胞损失。将OCR值针对通过CyQUANT测定确定的绝对细胞数归一化。将数据针对每个孔的平均基线值归一化。通过对化合物注射前的前三个OCR测量值(0-12分钟)求平均值来计算基线OCR值，通过从注射解偶联剂FCCP后的OCR值中减去平均非线粒体OCR值(鱼藤酮/放线菌素A之后的OCR)来计算最大OCR值，并且通过从添加FCCP后的OCR值中减去基线OCR值来计算呼吸储备能力值。对于糖酵解应力测试，根据制造商的说明书，通过从葡萄糖施用后的值中减去平均非糖酵解酸化值(2-DG后)来计算糖酵解ECAR，通过从添加寡霉素后的ECAR值中减去非糖酵解酸化ECAR值来计算糖酵解能力，并且通过从添加寡霉素后的ECAR值中减去添加葡萄糖后的ECAR值来计算糖酵解储备。
线粒体DNA与核DNA比率
用qPCR定量线粒体DNA与核DNA比率。使用PureLink基因组DNA微型试剂盒(Invitrogen)从心肌细胞中提取DNA。使用了用于线粒体基因NADH脱氢酶1(ND1)和核基因脂蛋白脂肪酶基因(LPL)的DNA的引物(10)。
MitoTracker和MitoProbe JC-1测定
根据制造商的说明书，使用MitoTracker Green FM(Invitrogen)或MitoProbeJC-1测定试剂盒(Invitrogen)对活iPSC来源的心肌细胞进行染色。通过流式细胞术评估细胞并定量所有活细胞的平均荧光强度(MFI)。对于JC-1，媒介物对比Torin1处理的细胞的红色与绿色MFI的比率被定量并针对对照归一化。
使用Vala动态图像细胞计数器进行电压分析
在完成Torin1处理后，如上所述使心肌细胞解离，然后以每孔20,000-30,000个细胞的密度重新涂铺到Geltrex包被的Greiner Cellstar黑色96孔板中。将RPMI1640(无酚红)(补充有OxyFluor(Oxyrase，1:100稀释)、10mM乳酸钠)中的FluoVolt染料(从FluoVolt膜电位试剂盒中的储备液1:1000稀释，Thermo)和赫斯特33258染色剂(20μg/ml)在测定前15分钟添加至每个孔中。使用IC200动态图像细胞计数器(Vala)用15V以0.5脉冲/秒的频率和5msec的脉冲宽度对细胞进行电刺激持续5个脉冲。图像以20倍和每秒70帧的帧速率获取。使用CyteSeer图像分析软件进行电压分析，所述软件自动识别Hoechst染色的细胞核，分割并鉴定每个细胞，以定量视野中捕获的每个细胞的电压数据(34)。通过Hoechst染色的细胞核鉴定细胞，分割成单个细胞并通过CyteSeer软件自动编号(图4C)。在每个细胞内，从每个编号的有核细胞内的圆形区域内记录荧光强度。如果检测到四个电压峰值，则包括细胞(成像***仅部分捕获第一起搏搏动)；具有少于四个峰值的细胞表明捕获不足，并且具有多于四个峰值的细胞表明细胞的自发搏动速率比起搏搏动更快。包括来自大约300-500个单个细胞的数据，用于每种条件的分析。基线荧光用于针对单个细胞之间荧光强度的变异性进行归一化。使用CyteSeer图像分析软件定量峰值上升时间，CTD25(钙瞬变的25％持续时间，或从最大幅值下降25％的持续时间)、CTD75(钙瞬变的75％持续时间，或从最大幅值下降75％的持续时间)、T75-25(电压从最大值的75％衰减至25％的时间)和下行速度。
使用Vala动态图像细胞计数器进行钙瞬变分析
为了进行钙瞬变分析，将50ul的10ug/ml Hoeschst 33258和5μM Fluo-4 AM添加至96孔板的每个孔中，并在37度下孵育10分钟。将培养基更换为不含酚红的RPMI，补充有1:100Oxyfluor和10uM乳酸钠。将异丙肾上腺素(1μM)添加至培养基中用于异丙肾上腺素实验。起搏方案是不起搏情况下的5秒延迟，然后以1Hz起搏5秒，和不起搏情况下的5秒成像。使用Vala动态图像细胞以30fps进行成像，以14.25强度曝光33.30ms。刺激脉冲为5ms，使用15V电压。通过CyteSeer分析程序收集数据。
NanoString分析
根据制造商的说明书使用NanoString技术进行基因表达分析，所述技术采用荧光条形编码RNA的光学计数方法。选择nCounter PanCancer途径组以提供来自多种生长和细胞周期相关途径的770种基因的多重分析，包括细胞周期、细胞凋亡、Wnt、转录调控、PI3K和TGF-β。选择此组以提供与细胞周期调控、代谢、静止和衰老相关的途径的多重分析。使心肌细胞在12孔板中分化，然后在搏动开始后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物(DMSO)处理心肌细胞持续1周(对于这一批次，第9-16天)。在完成Torin1处理后，将细胞转换回维持培养基(RPMI+B27+胰岛素)。从分化第18天开始，将10％胎牛血清(FBS)添加至每个处理组的一半孔中，并继续FBS处理4天(直到分化第22天)。将细胞收获在RiboZol中，然后如上文所述从每个孔中提取总RNA用于qPCR制备。制备200ng总RNA，然后根据nCounter XT基因表达测定将样品与PanCancer途径组试剂在65℃下杂交16小时。将样品在NanoString制备站上进行加工，然后使用nCounter仪器(NanoString Technologies)进行成像。使用带有高级分析模块2.0的nSolver 4.0软件分析数据，包括在组中针对内部管家基因进行归一化以使用R统计包执行无监督分级聚类、差异表达分析和途径评分。
统计数据
除非另有说明，否则数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用GraphPadPrism软件分析数据。使用学生未配对t检验、单因素ANOVA或双因素ANOVA(视情况而定)评估正态分布数据。非正态分布的数据在适当情况下使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行分析。NanoString数据使用带有高级分析模块2.0的nSolver软件和采用未配对t检验的开源R进行评估，以使用Benjamini-Yekutieli方法评估表达分析以控制错误发现率。对于p<0.05，检验被认为具有统计学显著性。
表1.用于qPCR的引物
Figure BDA0003493705460001041
Figure BDA0003493705460001051
Figure BDA0003493705460001061
Figure BDA0003493705460001071
表2.研究中使用的第一抗体和第二抗体
Figure BDA0003493705460001072
Figure BDA0003493705460001081
Figure BDA0003493705460001091
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实施例2：分子静止和心肌细胞成熟
治疗心力衰竭的干细胞方法将需要产生成熟心肌细胞(CM)以改善心脏收缩功能并降低室性心律失常的发生率。然而，使用当前分化方案，源自胚胎或诱导型多能干细胞(分别为ESC或iPSC)的CM在功能上仍然不成熟(1)。这些未成熟CM在递送至成体大型动物模型时导致可能危及生命的室性心律失常(2-4)。用于心血管疾病的细胞疗法的成功转化将需要改进的方法来使干细胞来源的CM成熟。
在发育过程中，CM经历从作为胎儿的增殖状态至出生后更成熟但静止状态的转变(5)。这种转变伴随着能量代谢的变化，其中胎儿CM主要通过糖酵解获得能量，而成体CM主要通过脂肪酸氧化获得能量(5)。雷帕霉素机制性靶标(mTOR)信号传导途径在营养素感应和生长中起关键作用，并且mTOR的调控影响从糖酵解至脂质代谢的代谢转变(6)。据推测，在这个关键的围产期窗口期间改变的mTOR途径调控是通过驱动细胞进入静止状态的CM成熟的关键驱动因素(图16)。此外，营养物可用性也有助于确定细胞静止，其可调控CM成熟。
背景
干细胞来源的心肌细胞
由人胚胎干细胞(ESC)或人诱导型多能干细胞(iPSC)分化心肌细胞(CM)的方案能够产生高度纯的CM群体，如通过心肌肌钙蛋白的表达所确定(7-10)。然而，这些方案产生具有收缩性、电生理和代谢特征的未成熟CM，所述特征不足以重现成体CM的特征(1，11)。由于移植细胞与天然心肌的整合不足(可能是成熟不足的结果)，将这些干细胞来源的CM递送至心力衰竭动物模型的尝试一直具有挑战性。在大型动物模型中，干细胞来源的CM的心肌内递送导致了可能危及生命的心律失常，可能是由于成熟不足所致(2，4，12)。这些挑战极大地阻碍了开发用于临床使用的干细胞来源的CM的进展。
心肌细胞的成熟是关键的未解决问题
与成熟的成体CM相比，干细胞来源的CM更接近类似于胎儿状态，具有更少组构的肌小节结构，最大收缩力较低，上行速度较慢，静止电位较高，没有T小管，并且持续依赖于糖酵解作为主要能量来源(1)。已经研究了各种增强成熟的策略，如在不同硬度的基底上培养、长期培养、电刺激或与小分子如三碘-L-甲状腺素或***1一起孵育(1，13，14)。然而，这些策略仅部分增强了成熟，并且成熟所涉及的潜在分子机制尚未充分描述。
创新
新生儿心肌细胞在出生后变得静止
出生时，哺乳动物经历显著生理变化，因为新生儿适应从胎盘获取全部氧气和营养物至通过自发呼吸获取氧气和通过肠内喂养获取营养物。这些生理变化调控心脏表型的潜在分子机制仍不清楚。在小鼠(15)和猪(16)中，心肌细胞在出生后的最初1-2天内保留心肌损伤后再生的能力。然而，在此时间段之后，心肌细胞退出细胞周期并且在很大程度上不增殖，心脏形成瘢痕组织而不是在损伤后再生(15，16)。这一出生后期也与心肌细胞的成熟增加、更多组构的肌小节结构、动作电位持续时间延长以及从糖酵解至脂肪酸氧化的转变相一致(1，5，17)。
心肌细胞静止是否为心肌细胞成熟所需？
长期以来，一直认为出生后心肌细胞是衰老的，具有不可逆的细胞周期退出。细胞衰老(Cellular senescence)或细胞衰老(cellular aging)的特征在于衰老相关分泌表型(SASP)，其特征是促炎性细胞因子的分泌(18，19)。这种状态已被证明与雷帕霉素机制性靶标(mTOR)途径的活性增加相关(19，20)，而mTOR的抑制与寿命增加相关(20)。然而，最近的数据表明，成体心肌细胞能够以每年约1％的心肌细胞更新率在成人中增殖(21，22)，并且能够响应于诸如运动的刺激而增加增殖(23)。这表明成体哺乳动物心肌细胞实际上可能处于深度静止(G0)状态，而不是衰老。
细胞静止是由营养剥夺触发的静止状态，并且其特征在于响应于适当刺激重新进入细胞周期的能力(24)。然而，尽管没有发生增殖，但在这种状态下细胞远未处于休眠状态-相反，细胞保留代谢和转录活性(25)。在G0状态内，细胞可具有不同的静止深度，包括进入G0的过渡进入期、深度G0和G警戒状态，其是更浅的静止状态，在此期间细胞对触发返回细胞周期的刺激反应性更强(25)。有证据表明，出生后心肌细胞保持在G0状态而不是衰老状态，因为某些刺激如条件性Meis1缺失(26)、Notch重新激活(27)或运动(23)触发重新进入细胞周期。缺乏定义静止状态的明确转录组特征使得理解在静止期间发生的基础活性具有挑战性。假设进入静止状态是起始心肌细胞成熟所必需的，并且对静止深度的调节调控成熟程度。
mTOR活性决定细胞静止与衰老
雷帕霉素机制性靶标(mTOR)是生长和代谢的中心调控因子(6)。mTOR充当营养传感器，其可刺激细胞增殖并且可充当糖酵解与氧化磷酸化之间的代谢开关(28-30)。mTOR蛋白与其他蛋白质形成复合物以形成mTOR复合物1(mTORC1)或mTOR复合物2(mTORC2)，其各自起到互补或有时竞争的作用(图17)(6)。mTOR***在确定退出细胞周期的细胞是否进入静止与衰老方面也是重要的(31，32)。无伴随mTOR抑制的细胞周期停滞将导致衰老，而伴随mTOR抑制的细胞周期停滞将导致静止(31，32)。mTOR还被证明可调控其他细胞类型的成熟，包括胰腺β细胞(33)、树突细胞(34)、红细胞(35)和NK细胞(36)。在心脏中，mTOR信号传导已被证明可调控心脏肥大(37)，并且从心肌细胞中缺失mTOR导致发育过程中的心肌细胞凋亡和坏死(38)。然而，mTOR调控是否以及如何影响心肌细胞的成熟尚不清楚。
Torin1是同时抑制mTORC1和mTORC2的小分子抑制剂，相比之下雷帕霉素主要抑制mTORC1(39)。用Torin1抑制mTOR导致下游途径的快速变化(图17A)，包括S6K的磷酸化降低、Akt的磷酸化降低和AMP激酶(AMPK)的磷酸化增加(图17B)。已经证明，用Torin1抑制mTOR以剂量依赖性方式增强iPSC来源的心肌细胞的成熟。对使用的时间和剂量进行了优化，并且发现在搏动开始后大约两天向iPSC来源的心肌细胞添加200nM Torin1(图18A)导致CM成熟的选定标志物(包括TNNI3、CACNA1c和SERCA2a)的mRNA表达显著增加(分别图18B-18D)。通过流式细胞术在三种细胞系(BJRiPS、GCaMP、Gibco)中定量的平均荧光强度，还观察到TNNT2的蛋白质表达的显著增加(图18E)。通过蛋白质印迹分析，在BJRiPS细胞系中也观察到TNNTI3的显著增加(图18F(印迹)和图18G(光密度测定分析))。这些结果表明，mTOR的抑制增强源自iPSC的心肌细胞的成熟。
概述
源自iPSC的心肌细胞表现出不成熟表型，其在植入大型动物模型时可增加危及生命的心律失常的风险(2-4)。出生后心肌细胞自然地经历从增殖状态至静止状态的转变，尽管这种转变如何影响成熟的意义尚不清楚(5)。静止至少部分受mTOR信号传导途径的调控，所述途径已被证明促进其他细胞类型的成熟(31，35)。初步数据表明，iPSC来源的心肌细胞中mTOR的药理学抑制增强心肌细胞成熟的选定标志物(包括TNNT2、TNNI3、CACNA1c和SERCA2a)的表达。
检查心肌细胞成熟
研究了mTOR下游的两种***的作用，以确定它们是否在增强心肌细胞成熟方面发挥特定作用。首先，将研究4E-BP1在Torin1诱导的心肌细胞成熟中的作用。其次，将研究通过调控E2F转录因子家族来调节静止深度如何影响心肌细胞的成熟。最后，由于三维(3D)悬浮培养可能将是未来规模扩大和临床转化所必需的，并且由于mTOR在2D对比3D中可能受到差异地调控(40)，因此将寻求了解3D培养中的mTOR抑制是否也调控心肌细胞成熟。
确定4E-BP1激活在Torin1诱导的iPSC来源的CM成熟中的作用
mTOR途径是通过抑制4E-BP1对mRNA翻译的中枢调控因子(41)。4E-BP1竞争性地结合至真核起始因子4E(EIF4E)以防止EIF4E与EIF4G相互作用(41)。当mTORC1磷酸化4E-BP1(在Thr37/46处)时，EIF4E被释放并与EIF4G相互作用，从而导致帽依赖性蛋白质翻译的起始(41)。Torin1对mTORC1的抑制导致4E-BP1的低磷酸化和EIF4E依赖性蛋白质翻译的抑制(图19)。将检查用瞬时Torin1处理对4E-BP1的时间依赖性激活如何导致iPSC来源的CM的成熟增强。
检查EIF4E/4E-BP1的相对丰度比是否决定Torin1在不同分化阶段增强CM成熟方 面的功效
有证据表明，EIF4E与4E-BP1的相对比率以及EIF4E的活性水平可预测癌症治疗中对mTOR抑制剂的敏感性(42)。具体而言，具有高EIF4E水平或低4E-BP1水平的细胞对mTOR抑制剂的抗肿瘤作用具有抗性，而具有较低EIF4E水平的细胞对使用mTOR抑制剂的处理更敏感(42)。此外，具有较高EIF4E活性的细胞(如通过蛋白质翻译效率所证明)对通过雷帕霉素处理更敏感(如通过用雷帕霉素处理后活细胞的百分比降低所测量)(43)。数据表明，Torin1处理的最佳窗口是心肌细胞搏动开始后大约2天(图20A)。在这个时间窗口中，显示在对照条件(没有mTOR抑制)下的分化心肌细胞经历EIF4G1、EIF4E和4E-BP1(EIF4EBP1)的动态变化，在心肌细胞搏动开始后大约5天内所有三种蛋白质均减少(分别图20B-20D)。然而，数据表明EIF4G1 mRNA表达可在约第9天下降，其在约第10天EIF4E下降之前——在约第14天EIF4EBP1下降之前，并且因此可能存在最佳窗口，在所述最佳窗口期间EIF4E/4EBP1比率较低，并且细胞对Torin1处理的反应更强。将评估EIF相对于4E-BP1的化学计量在整个分化过程中如何变化，以及这如何影响Torin1在增强心肌细胞成熟方面的功效。
真核起始因子(EIF)表达的定量。将在不同的分化时间点收获细胞，以评估EIF(包括EIF4E、EIF4E2、EIF4G1/2/3)和4E-BP1以及4E-BP2在不同时间点的mRNA和蛋白质表达的动力学。4E-BP的磷酸化状态将通过蛋白质印迹分析在分化的第0-28天之间的不同时间点在有或没有Torin1处理的情况下进行检查。已经表明，Torin1的最佳处理条件是在心肌细胞搏动开始后大约2天开始200nM持续1周。Torin1将在不同的时间点施用，以评估Torin1的有效性是否需要特定比例的EIF4E与4E-BP1或其他化合物。此外，将检查小分子4EGI-1，其抑制EIF4E与EIF4G之间的相互作用，同时使4E-BP1与EIF4E之间的相互作用稳定(44)。4EGI-1对4E-BP1下游途径的影响应与Torin1相似。将收获细胞用于qPCR和蛋白质印迹分析，以了解Torin1的整体影响。将评估4E-BP和EIF以及心肌细胞成熟的选定标志物(包括TNNT2、TNNI3、KCNJ2、RYR2、PPARGC1a)的表达。所有实验将一式四份进行，并且将在三个不同的场合进行测试，以确保每种细胞系的再现性。将使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验分析数据。
Torin1处理的细胞和4EGI-1处理的细胞的单细胞RNAseq。将执行单细胞RNA-seq以了解细胞群体(心肌细胞对比非心肌细胞)的分布以及不同细胞群体对Torin1处理的反应。此外，将评估EIF4E与4E-BP1的表达比率相对较低的个体心肌细胞是否在Torin1处理情况下下增加选定成熟标志物(如TNNI3、KCNJ2、RYR2、PPARGC1a)的表达。数据将从至少三种细胞系(批准用于基因组数据共享的DiPS 1016SevA、Gibco和UCSD142i-86-1细胞系)获取。数据将公开存入NIH基因表达综合数据库(GEO)。
EIF的过表达或下调以改变EIF4E与4E-BP1的相对丰度比。慢病毒技术将用于过表达，或者小干扰RNA(siRNA)用于下调选定EIF蛋白或在不同时间点改变4E-BP与EIF的相对比率。预计每种细胞系对于Torin1或4EGI-1处理的最佳分化时间段可能略有不同，因此这些实验将在每种细胞系中进行。此外，将评估心肌细胞成熟的选定参数，包括通过qPCR和流式细胞术进行的基因和蛋白质表达分析、通过基于视频的分析在二维培养中的收缩性(45)、通过高通量成像的动作电位动力学和钙瞬变以及通过Seahorse测定的代谢参数。
检查4E-BP1/EIF4E的稳定化是否减少EIF4E依赖性翻译并增加EIF4E2依赖性翻 译，从而产生更成熟的基因表达谱(图21)
先前已经表明，与EIF4E2(也称为4EHP)依赖性RNA翻译相比，缺氧可充当触发EIF4E依赖性RNA翻译的开关(46)。虽然EIF4E与EIF4G相互作用以起始EIF4E依赖性蛋白质的翻译，但EIF4E2不与EIF4G相互作用，而是与缺氧诱导因子2α(HIF2α)相互作用以起始EIF4E2依赖性蛋白质的翻译(46)。已显示雷帕霉素可增加羊水干细胞中HIF2α的表达(47)。令人感兴趣地，据报告HIF1α的下调可增强iPSC来源的心肌细胞的代谢成熟(48)。HIF1α和HIF2α转录受缺氧的差异调控(49)，因此HIF2α仍有可能随着心肌细胞的成熟度增加而增加。据推测，Torin1增加HIF2α的表达，同时抑制EIF4E从4E-BP1释放，从而导致EIF4E2而非EIF4E1依赖性蛋白质的翻译(图21)，并且EIF4E2依赖性蛋白质表达产生更成熟的心肌细胞表型。
在mTOR抑制后评估EIF4E对比EIF4E2依赖性蛋白质翻译。EIF4E、EIF4G、EIF4E2或HIF2α的siRNA将用于选择性地评估在不同时间点有或没有mTOR抑制的情况下来自每种***的蛋白质翻译。将在每种条件下进行与心肌细胞成熟相关的选定蛋白质(TNNT2、TNNI3、KCNJ2、RYR2、CACNA1c、PGC1a)的蛋白质印迹分析，以评估EIF4E2对比EIF4E依赖性翻译是否存在更成熟的蛋白质表达谱。来自单个时间点(分化第14天)的样品(培养基和细胞裂解物)将通过定量质谱法进行评估，以确定哪些蛋白质在EIF4E对比EIF4E2依赖性翻译机制下差异表达。将从所有五种细胞系中获取质谱数据。
研究由EIF4E对比EIF4E2依赖性翻译机制调控的基因编码的微小RNA。有证据表明EIF4E2直接与微小RNA(miRNA)相互作用以影响蛋白质翻译(50)。具体而言，EIF4E2是miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)机制的组分，其用于抑制EIF4E依赖性蛋白质翻译(50)。此外，已显示miRNA抑制离子通道表达(51)，并且特别地，miRNA-26抑制Kir2.1(由KCNJ2编码)的表达(52)，其是维持Ik1电流所需的主要离子通道，是心肌细胞静止膜电位的关键决定因素(53)。siRNA将用于选择性地抑制EIF4E、EIF4G、EIF4E2或HIF2α，然后将进行miRNA-seq以评估具有EIF4E对比EIF4E2依赖性翻译机制的miRNA的差异表达。将从所有五种细胞系获取数据。所鉴定的任何潜在miRNA都将进行单独测试，以评估它们是否改变离子通道表达并增强心肌细胞成熟。
心肌细胞成熟度的表征
细胞系和分化方案。至少2种不同原始细胞类型(例如，成纤维细胞来源的或外周血单核细胞来源的iPSC)并且来自雄性和雌性供体两者的至少5种人iPSC系(BJRiPS-A、DiPS 1016SevA、GCaMP、Gibco、UCSD142i-86-1)将用于每个实验，除非另有说明。这将提供信心，即研究结果在细胞系中是稳健的。将使用Lian等人(8)所概述的分化方案。CHIR浓度(3-12μM)和时间(CHIR暴露24-48小时)将针对每种细胞系进行优化，并且将针对每种细胞系使用最有效的CHIR浓度分化方案。除非另有说明，否则实验将在单层贴壁培养中进行。所有实验将在每种细胞系中以每组至少3次重复进行，并且数据将通过未配对学生t检验分析进行分析，统计显著性水平为p<0.05，除非另有说明。
肌小节蛋白和收缩性的评估。将对从用mTOR途径小分子调节剂(包括Torin1、Torin2、4EGI-1)处理后的2D培养物收获的细胞进行qPCR。流式细胞术分析将鉴定在存在或不存在Torin1或mTOR途径的其他调节剂的情况下产生的TNNT2+CM的百分比和选定标志物(包括TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7)的平均荧光强度。将进行蛋白质印迹分析以定量在不同时间点mTOR抑制后选定肌小节蛋白的表达。对于每种细胞系，每个分化方案将在至少三个不同的批次中重复。数据将一式四份进行，并通过单因素ANOVA分析参数数据或通过克鲁斯卡尔-沃利斯分析来分析非参数数据。如先前报告的，将使用基于视频的分析和随附的MATLAB脚本来定量2D培养物中的收缩性(45)。肌小节比对将使用先前报告的基于图像的SarcOmere结构分析(SOTA)基于MATLAB的方法进行定量(54)。将如前所述(14)定量细胞面积和圆度。将使用粘着斑蛋白，粘着斑蛋白(vinculin)的抗体染色来定量粘着斑的数量和面积(55)。
离子通道表达和电生理测量值的评估。将分别用选定离子通道(包括KCNJ2、CACNA1c、SERCA2a、RYR2和HCN4)的qPCR和蛋白质印迹分析/流式细胞术评估mRNA和蛋白质表达。将使用Fluo-4(56)分析钙瞬变，并且使用FluoVolt技术(57)分析动作电位时程。将使用Vala动态图像细胞计数器(KIC)获取图像(58)。钙瞬变和动作电位数据将在每种细胞系每种条件的至少五十个单个细胞中记录。动作电位形态和时程以及钙瞬变将在自发和起搏条件下记录。测量的参数将包括动作电位时程、上行速度、动作电位分布和钙衰减时间。将使用CyteSeer(Vala Biosciences)进行图像分析。
代谢图谱和线粒体功能的评估。选定葡萄糖转运蛋白(例如GLUT1-4)、脂肪酸转运蛋白(FATP1-6)和代谢调控因子(例如PPARa、PPARg和PGC1a)的mRNA和蛋白质表达将分别用qPCR和蛋白质印迹分析进行评估。将在有或没有mTOR抑制的情况下定量细胞中的线粒体与核DNA含量。将使用线粒体染料评估线粒体体积分数。Seahorse XFe96分析仪将用于评估用mTOR途径调节剂(包括雷帕霉素、Torin1、Torin2、4EGI1)处理的分化CM的代谢活性，以评估耗氧速率(OCR)和细胞外酸化速率(ECAR)。将根据制造商的说明书使用XF Cell Mito应力测试试剂盒来定量基线OCR、最大OCR、非线粒体OCR和呼吸储备能力(图22)。XF糖酵解应力测试将定量糖酵解能力和糖酵解储备。XF脂肪酸氧化试剂盒将根据制造商的说明书定量mTOR抑制是否改变脂肪酸的利用。条件将在每个板每种条件下至少四次重复进行，并且每种细胞系将用独立的细胞批次测试至少3次。
预期结果
预计EIF和4E-BP1的表达将随着细胞系的分化时间而变化。取决于细胞系同，可能存在可变的最佳时间窗口。据预测，在心肌细胞搏动开始后不久存在时间窗口，在此期间EIF4E水平相对较低，而4EBP1水平同时相对较高，表明对mTOR抑制的窗口最佳反应性。预期通过单细胞RNA分析，按不同EIF4E/4EBP1比率分组的心肌细胞将具有不同的转录组，在抑制后在较低EIF4E/4EBP1比率下观察到更成熟的谱。还预期mTOR抑制将使蛋白质翻译的倾向从EIF4E依赖性转变为EIF4E2依赖性蛋白质翻译。预计EIF4E2依赖性蛋白质翻译将与同心肌细胞成熟相关的蛋白质的表达增加相关，包括TNNI3、KCNJ2、RYR2、PGC1a。预计EIF4E对比EIF4E2依赖性蛋白质翻译将差异地调控微小RNA表达，从而导致离子通道和可能的其他心肌细胞成熟蛋白(如收缩或代谢标志物)的差异调控。
通过E2F确定静止深度如何影响iPSC来源的心肌细胞的成熟。
在哺乳动物中，心肌细胞在出生后不久就从胎儿的增殖状态转变为基本上非增殖状态(5)。这种转变尚未充分了解，并且目前尚不清楚心肌细胞是否衰老且不能返回细胞周期，或者它们是否仍处于深度静止状态(60)。细胞静止是细胞的静止状态，被认为是由营养物中止、生长因子的缺乏或接触抑制起始的(61，62)。静止不应被视为单一的静态状态，并且事实上，有人提出了“静止周期”的概念，以强调静止细胞在这种状态下可表现出不同的表型(图23)(63，64)。特别地，静止细胞可能需要不同程度的刺激以便重新进入细胞周期(65)。静止骨骼肌卫星细胞以更深的静止状态(称为G0)或以更浅的静止状态(称为G警戒)存在(66)。在G警戒中，与处于较深形式的G0中的细胞相比，细胞对促使返回细胞周期的刺激更敏感(65，66)。这种转变至少部分由mTORC1控制，其中mTORC1的激活是细胞从G0转变为G警戒所必需的(66)。类似于个体如何在一夜过程内多次循环通过不同深度的睡眠(即在非快速眼动睡眠与快速眼动睡眠之间循环——其意义尚未充分了解，但每个阶段似乎都有不同的目的)(67)，也许不同深度的细胞静止在维持细胞表型方面各自具有不同的目的。
较长时间的血清饥饿可触发静止深度(65)。处于更深静止的细胞需要更强的生长刺激(即更高的血清浓度)以便重新进入细胞周期(65)。静止的深度通过Rb蛋白与E2F转录因子家族之间的相互作用调控(65)。Rb-E2F***充当“双稳态开关”，其中E2F充当二元开启/关闭开关，取决于静止深度对Rb做出可变响应。对于处于较深静止的细胞，需要由Rb蛋白家族翻译的更强的生长信号来开启E2F，而对于处于较浅静止的细胞，由Rb蛋白家族翻译的生长信号不需要那么强来开启E2F(图24)。
mTOR抑制结合细胞周期停滞导致细胞静止(31)。数据表明，Torin1调节E2F转录因子家族以及细胞周期的其他调控因子的表达水平(图25)。E2F家族由若干分子组成，其中一些分子刺激(E2F1-3a)并且一些抑制(E2F3b-8)细胞周期。用Torin1处理，观察到抑制性E2F成员E2F4的mRNA表达增加(图25B)，RBL2(成视网膜细胞瘤样蛋白2，也称为p130)的mRNA表达增加(图25C)，并且E2泛素蛋白连接酶MDM2的mRNA表达降低(图25D)(68)，所有这些都与静止状态一致。然而，还观察到在Torin1处理后细胞周期蛋白抑制剂CDKN1a(p21)的mRNA表达降低(图25E)和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2的mRNA表达增加(图25F)的出人意料的趋势，这将与增殖状态更一致。可能存在非常特定的时间依赖性效应-例如，在Torin1处理后立即存在刺激性E2F成员E2F1的mRNA表达降低的趋势，随后在处理开始后约5天E2F1短暂增加，其然后到处理开始后约8天趋向回落至未处理条件(图25A)。
将确定用Torin1抑制mTOR是否导致G0中的细胞周期停滞，并且这是否改变E2F转录因子家族的表达以促进心肌细胞的成熟。
检查G1/G0中的细胞周期停滞是否是成熟所必需的，而G2/M中的细胞周期停滞是否 阻止CM的成熟
先前的研究证明，mTOR抑制导致从G1期可逆的细胞周期退出(69，70)。此外，用雷帕霉素处理延迟了用血清刺激后的细胞周期进程(69)。相比之下，单独用紫杉醇(一种微管分解抑制剂)进行的细胞周期停滞(因此预期将使M期的细胞周期停滞)并未发现增强心肌细胞成熟(71)。假设心肌细胞在G2或M期停滞时将不会成熟，并且将仅在G1/G0中存在可逆的细胞周期停滞时成熟。
分化心肌细胞中的细胞周期状态的评估。使用流式细胞术，分化心肌细胞的细胞周期状态将在有或没有mTOR活性的小分子调节(例如，使用Torin1、Torin2或雷帕霉素)的情况下在不同时间点进行表征。基于总DNA含量(2n)和细胞是否积极参与增殖(Ki67+)区分G0和G1期将通过同时用针对Ki67和碘化丙啶的抗体染色来进行检查(72)。所述方法还将允许区分S(2n-4n)和G2/M期(4n)。此外，将基于细胞周期在每个亚群中评估心肌细胞成熟的选定标志物的表达。将执行单细胞RNA-seq，并基于选定细胞周期标志物的表达推断细胞周期状态(73)。将评估是否存在基于细胞的细胞周期状态的心肌细胞成熟基因的差异调控。RNA-seq数据将存入NIH GEO数据库中。数据将从所有五种细胞系(BJRiPS-A、DiPS1016SevA、GCaMP、Gibco、UCSD142i-86-1)获取，深度测序数据除外，其将在至少三种细胞系(批准用于基因组数据共享的DiPS 1016SevA、Gibco和UCSD142i-86-1系)中获得。
细胞周期停滞对心肌细胞成熟的影响。小分子将用于使细胞周期停滞在不同的状态(例如用C6-神经酰胺停滞在G1，用诺考达唑停滞在G2，用紫杉醇停滞在M)，然后将评估心肌细胞成熟度的选定标志物(TNNT2、TNNI3、KCNJ2)的表达(通过TNNT2+细胞的平均荧光强度)。将使用Fluidigm Biomark仪器对与细胞周期或成熟相关的选定基因进行传统的qPCR以及单细胞RNA分析。将在所有五种细胞系中进行实验，每种条件至少一式三份进行测试。
分化的心肌细胞的增殖能力的评估。在用mTOR抑制剂起始静止后，细胞将被刺激以重新进入含血清培养基的细胞周期。将使用EdU评估细胞重新进入细胞周期所需的血清浓度和时间，以鉴定增殖细胞。需要较高水平的生长刺激的细胞是否也表现出更成熟的表型将通过使用Fluidigm Biomark***的传统qPCR和单细胞qPCR进行评估。将在所有五种细胞系中进行实验，每种条件至少一式三份进行测试。
检查刺激性E2F1/2/3a转录因子的表达是否阻止CM的成熟。
E2F转录家族由细胞周期刺激性成员(E2F1-3a)和细胞周期抑制性成员(E2F3b-8)组成。据推测，E2F1/2/3a转录因子的表达将促进细胞周期的恢复并诱导心肌细胞增殖。在这样做时，预期这将阻止心肌细胞的成熟。
刺激性E2F转录因子的过表达。将引入慢病毒载体以在不同分化阶段的分化心肌细胞中过表达E2F1、E2F2和E2F3a。心肌细胞增殖将通过流式细胞术和显微术通过对TNNT2+、EdU-+细胞进行定量来评估。心肌细胞成熟将在有或没有E2F1/2/3a的过表达的情况下通过选定成熟标志物的qPCR和蛋白质印迹分析来进行评估。将如本文所述表征细胞的收缩、电生理和代谢表型。所有实验将在所有细胞系中进行，每种条件至少一式三份进行测试。
刺激性E2F转录因子的抑制。E2F转录因子将被小分子(例如HLM006474，泛E2F抑制剂)或小干扰RNA抑制以靶向E2F1、E2F3和E2F3a分子。将如本文所述评估心肌细胞增殖和成熟。所有实验将在所有细胞系中进行，每种条件至少一式三份进行测试。
检查抑制性E2F3a/4/5/6/7/8的上调是否是CM成熟所必需的。
据推测，抑制性E2F3b-8转录因子的表达将阻止心肌细胞增殖并维持静止状态。预期这是心肌细胞成熟所必需的。
抑制性E2F转录因子的过表达。将引入慢病毒载体以在不同分化阶段的分化心肌细胞中过表达E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8。将如本文所述评估心肌细胞增殖和成熟。所有实验将在所有细胞系中进行，每种条件至少一式三份进行测试。
抑制性E2F转录因子的靶向缺失。E2F转录因子将被小分子(例如HLM006474，泛E2F抑制剂)或小干扰RNA抑制以靶向E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8分子。将如本文所述评估心肌细胞增殖和成熟。所有实验将在所有细胞系中进行，每种条件至少一式三份进行测试。
用mTOR抑制调节静止深度。心肌细胞将被mTOR抑制剂抑制，然后将在分化的不同时间点评估E2F转录因子家族的表达。将评估额外的生长刺激(如葡萄糖或生长因子)的中止是否进一步加深静止，以及这是否提供心肌细胞成熟的进一步增强。还将评估mTOR抑制与抑制性E2F分子的过表达组合是否为心肌细胞提供额外的成熟益处。将如本文所述评估心肌细胞增殖和成熟。所有实验将在所有细胞系中进行，每种条件至少一式三份进行测试。
预期结果
预计刺激性E2F分子的过表达将不会增强心肌细胞成熟，并且可能对心肌细胞表型有害。预计抑制性E2F分子的过表达将导致增强的心肌细胞成熟，尽管可能需要同时发生mTOR抑制以实现完全成熟效应。相比之下，预期刺激性E2F分子的下调可导致心肌细胞成熟，而抑制性E2F分子的下调将阻止心肌细胞的成熟。
探索mTOR的瞬时抑制在三维(3D)培养中iPSC来源的心肌细胞成熟中的作用
急性心肌梗死后，人的心脏损失大约10亿或更多的心肌细胞(78)。为了将心肌细胞细胞疗法发展为可行的治疗选择，将有必要通过良好的生产实践来培养和维持大量干细胞来源的心肌细胞。使用当前的二维(2D)培养***，维持10亿个心肌细胞将是劳动密集型的，并且经常观察到显著的用户间、批次间且甚至孔间变异性，这通常在很大程度上是由于整个孔中的可变接种密度以及在特定汇合范围开始分化的必要性(8)。因此，许多组正在转向在三维(3D)生物反应器***中维持和分化多能干细胞，其更易于扩大规模，显著减少劳动时间，并且小体积取样允许改善的质量控制(79)。然而，随着从2D至3D培养的这种转变，可能发现，由于不同培养几何形状中各种信号传导途径的差异调控，这改变细胞的表型。
检查通过Torin1抑制mTOR是否增强在3维悬浮培养中分化的iPSC来源的CM的成熟
已显示AKT-mTOR-S6K途径在癌细胞系的2D对比3D培养物中受到差异调控(40)。特别地，与2D相比，在3D中生长的细胞通过AKT-mTOR-S6K途径的基线信号传导总体较低，其中在3D中生长的多种细胞系中观察到AKT和S6K的磷酸化降低(40)。此外，3D球体对雷帕霉素的影响比在2D中生长的细胞更敏感(40，80)。在3D球体中，磷酸化-RPS6的梯度是明显的，与球体核心相比，球体表面处展示更高的磷酸化，从而表明核心中存在较低的mTOR信号传导(40)。表面对比球体核心的差异mTOR活性可反映获取营养物的差异，其是增加mTOR活性的主要信号。3D培养可更准确地复制发育过程中体内发现的条件。然而，目前尚不清楚在3D悬浮培养中生长的iPSC来源的心肌细胞中的瞬时mTOR抑制是否增强心肌细胞的成熟，并且如果是，在处理3D培养物时是否需要不同的条件。此外，3D环境允许对更接近类似于移植心肌细胞所寻求的最终体内状态的工程化心脏组织的研究。
悬浮培养中iPSC的心肌细胞分化。Kempf等人(79)所概述的悬浮分化方案将在一些修改生物情况下使用。将30ml和125ml一次性旋转烧瓶设置在置于37℃、5％CO2孵育箱中的旋转板上，旋转速度介于40-70rpm之间。将细胞以750,000个细胞/ml接种并在维持培养基中生长4天，直到球体直径为大约300μm，然后用7.5μM CHIR99021起始分化。在分化的第2天，从培养基中除去CHIR，并向培养基中添加Wnt途径抑制剂IWP4(5μM)，在分化的第4天，从培养基中除去IWP4，并且从第7天开始，胰岛素包含于培养基中。在GCaMP细胞系中，已经用这种方案获得了通过流式细胞术定量的具有约70％TNNT2+的搏动心肌细胞，在Torin1处理24小时后具有更高纯度的趋势(图26)。将优化所有五种细胞系(BJRiPS-A、DiPS 1016SevA、GCaMP、Gibco、UCSD142i-86-1)的分化条件。心肌细胞纯度将通过检测TNNT2+细胞的流式细胞术进行定量。
3D悬浮培养对于2D培养中心肌细胞成熟度的比较。将通过定量成熟基因的mRNA和蛋白质表达的程度以及进行如本文所述的收缩性、电生理学和Seahorse测定来评估成熟，以比较在2D对比3D环境中生长后的心肌细胞表型。3D球体将在研究前不久解离并重新涂铺在2D中，以便对2D和3D生长的细胞使用相同的测定，所述测定是针对2D***设计的。与在2D环境中分化的心肌细胞相比，将在3D环境中的不同分化时间点对心肌细胞进行单细胞RNA-seq。所有实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
瞬时mTOR抑制对3D悬浮培养中生长的心肌细胞的影响。将测试瞬时mTOR抑制(使用雷帕霉素、Torin1、Torin2)是否也增强3D悬浮培养中的心肌细胞成熟。心肌细胞将同时在2D中生长，以便与2D培养直接比较。心肌细胞将在从接种日至分化第28天的不同时间点暴露于不同浓度的mTOR抑制剂。将收获心肌细胞用于分析心肌细胞成熟的选定标志物的mRNA和蛋白质表达。将如本文所述评估收缩性、电生理性质和代谢参数。在石蜡包埋和切片(40)之前，3D球体也将被浇铸在琼脂糖凝胶中，以便通过参与mTOR信号传导和心肌细胞成熟的选定标志物的免疫染色进行评估，以确定mTOR信号传导或心肌细胞表型是否存在空间差异。将如本文所述研究下游信号传导，包括评估4E-BP1活性。实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
3D悬浮培养中的静止的评估。将如本文所述评估在3D培养中生长的心肌细胞的细胞周期状态。将比较在2D对比3D环境中生长的细胞中G0、G1、S、G2和M中的细胞分布是否不同。将在有或没有mTOR抑制剂的情况下在不同时间点用含血清培养基刺激细胞，以评估静止的深度。实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
检查通过Torin1抑制mTOR是否增强3维工程化心脏组织(EHT)的收缩性
工程化心脏组织(EHT)是由心肌细胞和细胞外基质支架组成的3D结构，有或没有额外的支持细胞类型(81，82)。EHT能够改善体外心脏建模，提供空间线索以及来自其他细胞类型(如成纤维细胞)的信号传导，以更好地重现心脏(81，83)。与2D单层培养物相比，在EHT中生长的心肌细胞展示增强的成熟，如通过与出生后心肌相似的收缩抽动力、对β-肾上腺素能刺激的反应性增强和更成熟的转录组所证明(83)。mTOR抑制是否对EHT的成熟表现出协同作用仍不清楚。
EHT的制备和表征。将使用工程化心脏组织(EHT)模型评估收缩性(83)。iPSC来源的CM将与成纤维细胞和胶原蛋白组合以制造工程化的心脏组织，然后孵育达4周。将使用如先前针对EHT描述的基于视频的分析响应于递增的钙浓度测量收缩力(84)。如先前所述(85)，将在来自完整EHT的细胞中进行膜片钳和动作电位测量。将对组织进行加工以分别通过qPCR和蛋白质印迹分析以及用于收缩蛋白质的免疫细胞化学分析mRNA和蛋白质表达。每个实验将至少重复3次以在每种细胞系中进行确认。
瞬时mTOR抑制对EHT的影响。将测试瞬时mTOR抑制(使用雷帕霉素、Torin1、Torin2)是否也增强心肌细胞成熟EHT。EHT将在不同时间点暴露于不同浓度的mTOR抑制剂。将收获EHT用于分析整个EHT中心肌细胞成熟的选定标志物的mRNA和蛋白质表达。此外，为了评估心肌细胞与成纤维细胞之间调控的潜在差异，将使EHT解离，然后将在mRNA和蛋白质分析之前使用FACS分选使心肌细胞与成纤维细胞分离。宏观尺度收缩性和电生理性质将如本文所述在整个EHT中以及也使用本文所述的方法以具有解离细胞的2D格式进行评估。EHT将包埋于石蜡中，然后切片以通过参与mTOR信号传导和心肌细胞成熟的选定标志物的免疫染色进行评估，以确定EHT中mTOR信号传导或心肌细胞表型是否存在空间差异。将如本文所述研究下游信号传导，包括评估4E-BP1活性。实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
EHT中静止的评估。将如本文所述评估在EHT中生长的心肌细胞的细胞周期状态。将比较用或不用mTOR抑制剂处理的EHT中G0、G1、S、G2和M中的细胞分布是否不同。将在有或没有mTOR抑制剂的情况下在不同时间点用含血清培养基刺激细胞，以评估静止的深度。实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
预期结果
预计3D环境中心肌细胞的分化将允许提高的分化效率并减少劳动时间，同时与2D环境相比还可提供改善的心肌细胞成熟。此外，预计3D生长的心肌细胞将继续对mTOR抑制有反应，其中Torin1进一步增强3D中心肌细胞的成熟。可能需要较低剂量的Torin1在2D中实现相同的效果，并且给定剂量可提供成熟表型的进一步增强。预计对3D球体内的mTOR活性将存在空间影响，这可能是由于球体中不同深度的营养物可用性不同。预计这也可能影响球体内不同位置的细胞的静止分布。此外，预期在用mTOR抑制剂处理时，EHT也将经历增强的心肌细胞成熟。EHT中成纤维细胞的存在可改变对mTOR抑制的反应性。
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实施例3-操纵PI3K/Akt/m TOR途径以增强源自干细胞的心肌细胞的成燃
背景
治疗慢性心力衰竭的干细胞方法将需要产生心室心肌细胞以改善心脏收缩功能并降低室性心律失常的发生率。然而，使用当前分化方案，源自胚胎或诱导型多能干细胞(分别为ESC或iPSC)的心肌细胞在功能上仍然不成熟。这些未成熟心肌细胞展现自律性或起搏器样活动，当递送至成体动物模型时导致潜在危及生命的室性心律失常，并且还具有更少组构的肌小节结构，从而阻碍了足够的收缩力(1，2)。用于治疗心血管疾病的干细胞来源的疗法的成功转化将需要开发用于干细胞来源的心肌细胞成熟的改进的方法。
概述
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR途径是调控细胞增殖、蛋白质合成和自噬的信号传导途径(3，4)。此***的失调在癌症中可见，并且因此这种途径的抑制剂已被广泛研究作为潜在癌症疗法。由于扩张型心肌病的发展，小鼠心肌细胞缺失mTOR导致早期死亡(5)。然而，这种途径在从干细胞分化心肌细胞中的作用仍不清楚。初步数据表明，在通过小分子(CHIR 99021、IWP2、IWP4以操纵Wnt途径)分化为心肌细胞后，施用mTOR抑制剂(包括雷帕霉素、Torin1和Torin2)可增强心肌细胞的成熟，如通过选定成熟标志物(包括TNNI3和KCNJ2)的RNA表达增加所证明。使用此类化合物抑制mTOR途径和上游分子PI3K和Akt可增强心肌细胞成熟，从而降低自律性并降低细胞递送至心肌后可能危及生命的室性心律失常的风险。这将使用于心力衰竭的细胞疗法的临床转化成为更安全且更可行的治疗选择。
方法
BJRiPS细胞系用于生成初步数据。根据先前公布的方案(6)，使BJRiPS细胞分化为心肌细胞。搏动开始后(第10天左右)，将心肌细胞用媒介物(DMSO)或不同浓度的雷帕霉素、Torin1或Torin2处理不同时间段。手动计算搏动频率。在处理5-7天后收获一些细胞用于流式细胞术分析。处理7天后收获其他细胞用于qPCR。
初步数据
初步数据证明用Torin1或Torin2处理的心肌细胞在1周时以剂量依赖性方式显著降低搏动频率(图29)。此外，选定成熟基因的基因表达在所测试的最高Torin1剂量(200nM)下增加近10倍，特别是TNNI3(图30)，更成熟形式的心肌肌钙蛋白(与TNNT2相比，图30)。此外，用Torin1处理存在KCNJ2表达的剂量依赖性增加的趋势(图32)。KCNJ2负责Kir2.1电流，Kir2.1电流主要负责遏制成熟心肌细胞的自律性(7)。此外，Torin1处理以剂量依赖性方式增加核转录因子REST/NRSF (阻遏子元件1沉默转录因子，也称为神经元限制性沉默子因子)的表达(图34)。REST抑制由HCN4编码的离子通道的表达(8)，所述离子通道主要负责增加起搏细胞的自律性(9)。最后，还观察到心肌细胞成熟性的另外标志物的RNA表达增加的趋势，即兰尼碱受体(RyR)和钠通道SCN5a(图32)(10)。
总之，用Torin1和Torin2抑制mTOR可增强源白干细胞的心肌细胞的成熟，如通过选定基因，包括TNNI3(心肌细胞成熟性的有力标志物)的表达增加所证明。此外，用Torin1处理增加核转录因子REST的表达，所述核转录因子据报告抑制HCN4表达。总之，这些初步结果表明，Torin1可通过增加KCNJ2和REST的表达来抑制自律性，从而增强干细胞来源的心肌细胞的电成熟。
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实施例4：心肌细胞的三维培养
急性心肌梗死后，人的心脏损失大约10亿或更多的心肌细胞。为了将心肌细胞细胞疗法发展为可行的治疗选择，将有必要通过良好的生产实践来培养和维持大量干细胞来源的心肌细胞。使用当前的二维(2D)培养***，维持10亿个心肌细胞将是劳动密集型的，并且经常观察到显著的用户间、批次间且甚至孔间变异性，这通常在很大程度上是由于整个孔中的可变接种密度以及在特定汇合范围开始分化的必要性。因此，许多组正在转向在三维(3D)生物反应器***中维持和分化多能干细胞，其更易于扩大规模，显著减少劳动时间，并且小体积取样允许改善的质量控制。然而，随着从2D至3D培养的这种转变，可能发现，由于不同培养几何形状中各种信号传导途径的差异调控，这改变细胞的表型。
将评估mTOR抑制(例如，通过Torin1)增强在3D悬浮培养中分化的iPSC来源的心肌细胞成熟的能力。已显示AKT-mTOR-S6K途径在癌细胞系的2D对比3D培养物中受到差异调控。特别地，与2D相比，在3D中生长的细胞通过AKT-mTOR-S6K途径的基线信号传导总体较低，其中在3D中生长的多种细胞系中观察到AKT和S6K的磷酸化降低。此外，3D球体对雷帕霉素的影响比在2D中生长的细胞更敏感。在3D球体中，磷酸化-RPS6的梯度是明显的，与球体核心相比，球体表面处展示更高的磷酸化，从而表明核心中存在较低的mTOR信号传导。表面对比球体核心的差异mTOR活性可反映获取营养物的差异，其是增加mTOR活性的主要信号。3D培养可更准确地复制发育过程中体内发现的条件。在3D悬浮培养中生长的iPSC来源的心肌细胞中的瞬时mTOR抑制可增强心肌细胞成熟。将在处理3D培养物时评估不同的条件。3D环境允许对更接近类似于移植心肌细胞所寻求的最终体内状态的工程化心脏组织的研究。
从悬浮培养中的iPSC产生心肌细胞的分化方案的一个实例详述如下。使用了30ml和125ml一次性旋转烧瓶，并将其设置在旋转速度介于40-70rpm之间的旋转板上，其中旋转板放置于37℃、5％CO2孵育箱中。将细胞以750,000个细胞/ml接种并在维持培养基中生长4天，直到球体直径为大约300μm，然后用7.5μM CHIR99021起始分化。在分化的第2天，从培养基中除去CHIR，并将Wnt途径抑制剂IWP4(5μM)添加至培养基中。在分化的第4天，从培养基中除去IWP4，并且从第7天开始，胰岛素包含于培养基中。在GCaMP细胞系中，获得了通过流式细胞术定量的具有约70％TNNT2+的搏动心肌细胞，在Torin1处理24小时后具有更高纯度的趋势(39A-39B)。分化条件可针对至少五种细胞系(BJRiPS-A、DiPS 1016SevA、GCaMP、Gibco、UCSD142i-86-1)进行优化。心肌细胞纯度将通过检测TNNT2+细胞的流式细胞术进行定量。
将通过定量成熟基因的mRNA和蛋白质表达的程度以及进行收缩性、电生理学和Seahorse测定来评估心肌细胞的成熟，以比较在2D对比3D环境中生长后的心肌细胞表型。3D球体将在研究前不久解离并重新涂铺在2D中，以便对2D和3D生长的细胞使用相同的测定，所述测定是针对2D***设计的。此外，与在2D环境中分化的心肌细胞相比，将在3D环境中的不同分化时间点对心肌细胞进行单细胞RNA-seq。所有实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
将检查瞬时mTOR抑制(使用雷帕霉素、Torin1、Torin2)以确定它是否也增强3D悬浮培养中的心肌细胞成熟。心肌细胞将同时在2D中生长，以便与2D培养直接比较。心肌细胞将在从接种日至分化第28天的不同时间点暴露于不同浓度的mTOR抑制剂。将收获心肌细胞用于分析心肌细胞成熟的选定标志物的mRNA和蛋白质表达。将评估收缩性、电生理性质和代谢参数。在石蜡包埋和切片之前，3D球体也将被浇铸在琼脂糖凝胶中，以便通过参与mTOR信号传导和心肌细胞成熟的选定标志物的免疫染色进行评估，以确定mTOR信号传导或心肌细胞表型是否存在空间差异。将研究下游信号传导，包括评估4E-BP1活性。实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
此外，将评估mTOR抑制(例如，通过Torin1)增强三维工程化心脏组织(EHT)的收缩性的能力。工程化心脏组织(EHT)是由心肌细胞和细胞外基质支架组成的3D结构，有或没有额外的支持细胞类型。EHT能够改善体外心脏建模，提供空间线索以及来自其他细胞类型(如成纤维细胞)的信号传导，以更好地重现心脏。与2D单层培养物相比，在EHT中生长的心肌细胞展示增强的成熟，如通过与出生后心肌相似的收缩抽动力、对β-肾上腺素能刺激的反应性增强和更成熟的转录组所证明。
工程化心脏组织(EHT)模型将用于评估收缩性。iPSC来源的CM将与成纤维细胞和胶原蛋白组合以制造工程化的心脏组织，然后孵育达4周。将使用基于视频的分析响应于递增的钙浓度测量收缩力。将在来自完整EHT的细胞中进行膜片钳和动作电位测量。将对组织进行加工以分别通过qPCR和蛋白质印迹分析以及用于收缩蛋白质的免疫细胞化学分析mRNA和蛋白质表达。每个实验将至少重复3次以在每种细胞系中进行确认。
将测试瞬时mTOR抑制(使用雷帕霉素、Torin1、Torin2)是否也增强心肌细胞成熟EHT。EHT将在不同时间点暴露于不同浓度的mTOR抑制剂。将收获EHT用于分析整个EHT中心肌细胞成熟的选定标志物的mRNA和蛋白质表达。此外，为了评估心肌细胞与成纤维细胞之间调控的潜在差异，将使EHT解离，然后将在mRNA和蛋白质分析之前使用FACS分选使心肌细胞与成纤维细胞分离。宏观尺度收缩性和电生理性质将在整个EHT中以及以具有解离细胞的2D格式进行评估。EHT将包埋于石蜡中，然后切片以通过参与mTOR信号传导和心肌细胞成熟的选定标志物的免疫染色进行评估，以确定EHT中mTOR信号传导或心肌细胞表型是否存在空间差异。还将研究下游信号传导，包括评估4EBP1活性。实验将在每种细胞系中每组至少重复3次进行。
预期3D环境中心肌细胞的分化将允许提高的分化效率并减少劳动时间，同时与2D环境相比还可提供改善的心肌细胞成熟。此外，预计3D生长的心肌细胞将继续对mTOR抑制有反应，其中Torin1进一步增强3D中心肌细胞的成熟。在一些情况下，可能需要较低剂量的Torin1在2D中实现相同的效果，并且给定剂量可提供成熟表型的进一步增强。预计对3D球体内的mTOR活性将存在空间影响，这可能是由于球体中不同深度的营养物可用性不同。预期在用mTOR抑制剂处理时，EHT也将经历增强的心肌细胞成熟。EHT中成纤维细胞的存在可改变对mTOR抑制的反应性。

Claims (105)

1.一种由未成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞的方法，所述方法包括使所述未成熟心肌细胞与mTOR抑制剂接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是mTORC1和mTORC2两者的抑制剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述mTOR抑制剂抑制4E-BP1的磷酸化。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述mTOR抑制剂抑制核糖体蛋白S6和4E-BP1两者的磷酸化。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述mTOR抑制剂选自：雷帕霉素、Torin1、Torin2、依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司、ATP竞争性mTOR激酶抑制剂以及前述中任一者的任何类似物或衍生物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述ATP竞争性mTOR激酶抑制剂是双重mTOR/PI3K抑制剂或mTORC1/mTORC2双重抑制剂。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述ATP竞争性mTOR激酶抑制剂选自：达托里昔布、BGT226、SF1126、PKI-587、沙帕色替、AZD8055、AZD2014以及它们的任何类似物或衍生物。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是Torin1。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述未成熟心肌细胞来源于iPS细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述未成熟心肌细胞来源于ES细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述未成熟心肌细胞来源于T细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述未成熟心肌细胞来源于成纤维细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述未成熟心肌细胞类似于胎儿心肌细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种成熟基因的表达增加。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种成熟基因选自：TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR以及SCN5a。
16.如权利要求1所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种肌小节蛋白的表达增加。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种肌小节蛋白选自：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。
18.如权利要求1所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种离子通道基因选自：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。
20.如权利要求1所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出REST和/或GATA4的表达增加。
21.如权利要求1所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出搏动频率降低。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是电成熟的心肌细胞。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟的心肌细胞。
26.如权利要求1所述的方法，其中在所述未成熟心肌细胞开始搏动后，使所述未成熟心肌细胞与所述mTOR抑制剂接触。
27.如权利要求1所述的方法，其中在所述未成熟心肌细胞开始搏动后1至30天，使所述未成熟心肌细胞与所述mTOR抑制剂接触。
28.如权利要求1所述的方法，其中在所述未成熟心肌细胞开始搏动后1至3天，使所述未成熟心肌细胞与所述mTOR抑制剂接触。
29.如权利要求1所述的方法，其中在所述未成熟心肌细胞开始表达肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌球蛋白重链6或肌球蛋白重链7中的至少一者后，使所述未成熟心肌细胞与所述mTOR抑制剂接触。
30.一种非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是成熟心肌细胞。
31.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种成熟基因的表达增加。
32.如权利要求31所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种成熟基因选自：TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR以及SCN5a。
33.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种肌小节蛋白的表达增加。
34.如权利要求33所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种肌小节蛋白选自：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。
35.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。
36.如权利要求35所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种离子通道基因选自：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。
37.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出REST和/或GATA4的表达增加。
38.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中与未成熟心肌细胞相比，所述非天然存在的心肌细胞表现出搏动频率降低。
39.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是电成熟的心肌细胞。
40.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。
41.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。
42.如权利要求30所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟的心肌细胞。
43.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含根据权利要求30至42中任一项所述的非天然存在的心肌细胞的组合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
45.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含根据如权利要求1至29中任一项所述的方法产生的成熟心肌细胞的组合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
47.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用使用根据权利要求30至42中任一项所述的一种或多种非天然存在的心肌细胞的分离群体产生的药物组合物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
49.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用使用根据如权利要求1至29中任一项所述的方法产生的一种或多种成熟心肌细胞产生的药物组合物。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
51.一种药盒，所述药盒包括：未成熟心肌细胞或其前体；至少一种心肌细胞成熟因子；以及使用所述未成熟心肌细胞或其前体和所述至少一种心肌细胞成熟因子来产生成熟心肌细胞的说明书。
52.如权利要求51所述的药盒，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子是mTOR抑制剂。
53.如权利要求51所述的药盒，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子是ATP竞争性mTOR激酶抑制剂。
54.如权利要求51所述的药盒，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子是mTOR/PI3K抑制剂和mTORC1/mTORC2双重抑制剂。
55.如权利要求51所述的药盒，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子选自：雷帕霉素、Torinl、Torin2、依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司、达托里昔布、BGT226、SF1126、PKI-587、沙帕色替、AZD8055、AZD2014和/或前述中任一者的任何类似物或衍生物。
56.如权利要求51所述的药盒，其中所述药盒还包括用于检测成熟心肌细胞的标志物的组分。
57.一种药盒，所述药盒包括：组合物，所述组合物包含根据权利要求30至42中任一项所述的至少一种非天然存在的心肌细胞和/或根据如权利要求1至29中任一项所述的方法产生的至少一种成熟心肌细胞；以及在如权利要求43至50中任一项所述的治疗方法中使用所述组合物的说明书。
58.组合物在制造用于治疗心脏疾患的药物中的用途，其中所述治疗包括向有需要的受试者施用所述药物，其中所述组合物包含根据权利要求30至42中任一项所述的至少一种非天然存在的心肌细胞和/或根据如权利要求1至29中任一项所述的方法产生的至少一种成熟心肌细胞。
59.如权利要求28所述的用途，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
60.一种包含条件培养基的组合物，其中所述培养基已经通过根据权利要求30至42中任一项所述的非天然存在的心肌细胞进行调节。
61.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求30至42中任一项所述的一种或多种非天然存在的心肌细胞和一种或多种未成熟心肌细胞。
62.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据权利要求30至42中任一项所述的一种或多种非天然存在的心肌细胞，其中所述群体中至少10％的细胞是根据权利要求30至42中任一项所述的非天然存在的心肌细胞。
63.如权利要求62所述的细胞群体，所述细胞群体还包含未成熟心肌细胞。
64.一种细胞膜片，所述细胞膜片包含根据权利要求30至42中任一项所述的非天然存在的心肌细胞。
65.如权利要求64所述的细胞膜片，其中所述非天然存在的心肌细胞在膜上生长。
66.一种三维结构，所述三维结构包含根据权利要求30至42中任一项所述的非天然存在的心肌细胞。
67.如权利要求66所述的三维结构，其中所述三维结构是基质或支架。
68.如权利要求66所述的三维结构，其中所述三维结构是细胞膜片。
69.如权利要求6所述的三维结构，其中所述三维结构是微组织。
70.根据权利要求66至69中任一项所述的三维结构，其中所述三维结构施用于受试者。
71.根据权利要求66至69中任一项所述的三维结构，其中所述三维结构通过移植施用于受试者。
72.一种诱导心肌细胞的静止的方法，所述方法包括使衰老心肌细胞与心肌细胞成熟因子接触，从而诱导所述衰老心肌细胞转变为静止心肌细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子是p53的上调剂。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子是mTOR信号传导途径抑制剂。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子是p53的上调剂和mTOR抑制剂。
76.如权利要求72所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子是Torin1。
77.如权利要求72所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子是Torin1和nutlin-3a的组合。
78.如权利要求72所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子不是Torin1。
79.如权利要求72所述的方法，其中所述静止心肌细胞表现出一种或多种静止标志物的表达增加。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述一种或多种静止标志物选自：p16和p130。
81.如权利要求72所述的方法，其中所述静止心肌细胞表现出一种或多种增殖标志物的表达降低。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述一种或多种增殖标志物选自：Ki67、细胞周期蛋白C1和E2F1。
83.如权利要求72所述的方法，其中所述静止心肌细胞是成熟心肌细胞。
84.如权利要求83所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种肌小节蛋白的表达增加。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述一种或多种肌小节蛋白选自：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。
86.如权利要求83所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述一种或多种离子通道基因选自：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。
88.如权利要求83所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出REST和/或GATA4的表达增加。
89.如权利要求83所述的方法，其中与未成熟心肌细胞相比，所述成熟心肌细胞表现出搏动频率降低。
90.如权利要求83所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是电成熟的心肌细胞。
91.如权利要求83所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。
92.如权利要求83所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。
93.如权利要求83所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟的心肌细胞。
94.一种非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是成熟的静止心肌细胞。
95.如权利要求94所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种静止标志物的表达增加。
96.如权利要求95所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种静止标志物选自：p16和p130。
97.如权利要求94所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞表现出一种或多种增殖标志物的表达降低。
98.如权利要求97所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种增殖标志物选自：Ki67、细胞周期蛋白C1和E2F1。
99.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含根据权利要求94至98中任一项所述的非天然存在的心肌细胞的组合物。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
101.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含根据如权利要求72至93中任一项所述的方法产生的静止心肌细胞的组合物。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
103.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用使用根据如权利要求72至93中任一项所述的方法产生的一种或多种静止心肌细胞产生的药物组合物。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏病或其他心脏病，或有发展前述疾病的风险。
105.一种诱导心肌细胞的成熟的方法，所述方法包括使不太成熟的或衰老的心肌细胞与心肌细胞成熟因子接触，从而诱导所述不太成熟的或衰老的心肌细胞转变为静止心肌细胞，从而诱导所述心肌细胞的成熟。
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