CN110859854A - 治疗神经源性肌肉萎缩的药物组合物及其制法和应用 - Google Patents

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魏佑震
刘中民
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Abstract

本发明提供了治疗外周神经损伤性肌肉萎缩的药物组合物及其制法和应用。具体地，本发明提供了一种生肌细胞的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于治疗神经源性肌肉萎缩，其中，所述的治疗包括改善肌肉萎缩和神经损伤。本发明还提供了治疗神经源性肌肉萎缩的组合物和方法。

Description

治疗神经源性肌肉萎缩的药物组合物及其制法和应用
技术领域
本发明涉及生物治疗领域，更具体地涉及一种治疗外周神经损伤性肌肉萎缩的药物组合物及其制法和应用。
背景技术
肌肉萎缩是指横纹肌营养障碍，肌肉纤维变细甚至消失等导致的肌肉体积缩小。肌肉的力量依托于肌肉纤维的大小，当肌肉萎缩就会出现肌肉虚弱。根据导致肌肉萎缩的原发病变分类，主要可以分为三类：肌源性肌萎缩、神经源性肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩。肌肉神经源性损害疾病是上运动神经源损害、下运动神经源损害，肌萎缩侧索硬化，脊肌萎缩症，进行性延髓麻痹等的总称。外周神经损伤(Peripheral nerve injury,PNI)致肌肉萎缩在临床也较为多见，例如坐骨神经压迫导致的下肢萎缩，面神经炎所致的面部肌肉萎缩等，虽然不致命，但严重影响了患者的生活质量。而且即使外周神经得到治疗和修复，仍然不能改善肌肉的质量和肌肉萎缩的症状。因此，本领域迫切需要开发改善神经源性肌肉萎缩的制剂和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供治疗外周神经损伤性肌肉萎缩的药物组合物及其制法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种生肌细胞的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于治疗神经源性肌肉萎缩，其中，所述的治疗包括改善肌肉萎缩和神经损伤。
在另一优选例中，所述的神经源性肌肉萎缩包括外周神经损伤性肌肉萎缩。
在另一优选例中，所述的生肌细胞由胚胎干细胞、诱导性干细胞、肌肉干细胞分化得到。
在另一优选例中，所述的生肌细胞具有向肌细胞分化的潜能。
在另一优选例中，所述的生肌细胞表达选自下组的标志基因：
PAX3+,NCAM+,Myosin Heavy Chain+,Myogenin+,MRF4+或CD56+/CD146+,和CD45-/CD34-/CD144-。
在另一优选例中，所述的生肌细胞为人或非人哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述的改善肌肉萎缩包括促进肌纤维修复、增加肌肉的重量、改善肌肉功能、或其组合。
在另一优选例中，所述的改善神经损伤是指修复神经的形态和功能。
在另一优选例中，所述的制剂或组合物包含：(a)生肌细胞；和(b)水凝胶。
在另一优选例中，所述的水凝胶为人源水凝胶，较佳地，所述的水凝胶选自下组：胶原蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述的生肌细胞与水凝胶之比为(1×104-1×105)个细胞/μL水凝胶。
在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂型。
在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗神经源性肌肉萎缩的组合物，所述的组合物包含(a)生肌细胞；和(b)水凝胶，其中，所述的生肌细胞表达选自下组的标志基因：
PAX3+,NCAM+,Myosin Heavy Chain+,Myogenin+,MRF4+或CD56+/CD146+,和CD45-/CD34-/CD144-。
在本发明的第三方面，提供了一种非治疗性的改善神经源性肌肉萎缩引起的肌肉萎缩和神经损伤的方法，包括步骤：
(a)提供一胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或肌肉干细胞；
(b)在适合分化的条件下，诱导步骤(a)中的细胞分化，从而获得包含分化的生肌细胞的细胞群体；和
(c)将步骤(b)获得的生肌细胞注射到需要的部位，从而改善肌肉萎缩和神经损伤。
在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括分离所述细胞群体中的生肌细胞的步骤。
在另一优选例中，利用流式细胞术分选CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144-的生肌细胞。
在另一优选例中，通过使用FACS Aria(BD)进行流式细胞术。
在另一优选例中，在步骤(b)中，检测标志基因的表达水平，当PAX3,NCAM,MyosinHeavy Chain,Myogenin,MRF4表达增加时，停止分化并分离所述细胞群体中的生肌细胞。
在另一优选例中，所述的表达增加是指，所述基因的表达量V1与未分化细胞得相应基因的表达量V2之比，V1/V2≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2。
在另一优选例中，在步骤(c)中，包括用水凝胶包裹所述生肌细胞的步骤。
在另一优选例中，在步骤(c)中，每平方厘米肌肉萎缩部位注射50至100个点。
在另一优选例中，在步骤(c)中，每点移植的生肌细胞数为1×104～1×105。
在另一优选例中，在步骤(c)中，每点注射的水凝胶细胞体积为0.8-1.2μL。
在另一优选例中，所述的方法是一种构建动物模型的方法。
在另一优选例中，所述的方法针对非人哺乳动物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了生肌细胞移植后8周的腓肠肌横切面的抗肌萎缩蛋白抗体荧光染色图。其中，Sham：假手术组，Model+mat：基质胶(Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)治疗组，Model+cell：基质胶包裹生肌细胞治疗组。红色：dystrophin，蓝色：DAPI，标尺：100μm。
图2显示了生肌细胞移植后8周的腓肠肌横切面SABC染色和HE染色图。其中，Sham：假手术组，Model+mat：基质胶(Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)治疗组，Model+cell：基质胶包裹生肌细胞治疗组。棕色：anti-GFP，标尺：100μm。
图3显示了生肌细胞移植后8周小鼠腓肠肌纵切面的SABC染色和HE染色图。其中，Sham：假手术组，Model+mat：基质胶(Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)治疗组，Model+cell：基质胶包裹生肌细胞治疗组。棕色：anti-GFP，标尺：100μm。
图4显示了生肌细胞移植后8周的小鼠肌力检测。其中，Sham：假手术组，Model+mat：基质胶(Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)治疗组，Model+cell：基质胶包裹生肌细胞治疗组。
图4A显示了最大抽搐力的检测结果。
图4B显示了最大强直力的检测结果。
图5显示了钳夹坐骨神经2周和10周后的坐骨神经横切面和纵切面HE染色图。其中，Sham：假手术组；Model：构建的外周神经损伤致肌肉萎缩模型组；Model+mat：基质胶(Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)治疗8周组；Model+cell：基质胶包裹生肌细胞治疗8周组。标尺：100μm。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现生肌细胞可以治疗神经源性肌肉萎缩。神经源性肌肉萎缩是由于神经损伤所致肌肉萎缩，即使外周神经得到治疗和修复，仍然不能改善肌肉的质量和肌肉萎缩的症状，治疗难度大。本发明人应用生肌细胞治疗该种肌肉萎缩，结果显示肌肉质量和功能得到显著改善，并且神经损伤也得到修复，取得了非常意外的有益效果。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用，术语“生肌细胞”是具有向肌细胞分化潜能的细胞。生理情况下，成体肌肉干细胞可分化为生肌细胞进一步分化为有功能的肌肉细胞。也可通过特定方法诱导人胚胎干细胞、人诱导性干细胞等获得生肌细胞。
如本文所用，术语“神经源性肌肉萎缩”、“肌肉神经源性损害”具有相同含义，是指由于神经损伤，尤其是外周神经损伤所致的肌肉萎缩。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
肌肉萎缩
肌肉萎缩是指横纹肌营养障碍，肌肉纤维变细甚至消失等导致的肌肉体积缩小。根据导致肌肉萎缩的原发病变分类，主要可以分为三类：神经源性肌肉萎缩、肌源性肌萎缩、废用性肌肉萎缩。其发病原因和病理机制等存在着一些不同。
1.根据病因的不同进行区分：
1)神经源性肌肉萎缩中，以周围神经***为例，可因周围神经干或其分支受到外界直接或间接力量作用发生损伤后其所支配的肌肉发生萎缩。
2)肌源性肌肉萎缩中，肌营养不良为常见症状。进行性肌营养不良(ProgressiveMuscular Dystorphy，PMD)是一组遗传性肌肉疾病，多数是由于肌纤维上特定蛋白缺陷所致。
3)废用性肌肉萎缩是因长期活动停滞削弱了骨骼肌的收缩性和肌肉力量，从而引起了肌肉萎缩。
2.根据病理及分子机制的不同进行区分：
1)对于神经源性肌肉萎缩，在周围神经损伤后，神经纤维损伤处断端变性，髓鞘被破坏，崩溃成碎屑状；
远端轴突发生瓦勒变性，轴突内细胞骨架崩溃，出现部分膨胀和狭窄，发生颗粒状分解，轴浆内颗粒状物质堆积，轴突出现肿胀、断裂、溶解；若损伤处靠近神经元，则可能引起神经元凋亡。
坐骨神经损伤，是常见的周围神经病变,通常导致远端的轴突变性退化和肌肉神经变性，其损伤后产生的纤维化和瘢痕组织会发生继发性肌纤维萎缩,从而限制了肌肉功能的恢复,使得支配肌肉的神经轴突增长缓慢(1-2mm/天),且无论损伤的原因如何,其损伤后的特性和预后都有一些共性。
周围神经对骨骼肌不仅具有支配作用，而且对骨骼肌具有营养作用，因此骨骼肌失神经萎缩既是失营养性萎缩，又是失用性萎缩。
2)对于PMD，其具体发病机制尚不清楚，目前的研究显示可能与炎症反应、氧化应激、自噬、凋亡等有关。越来越多的证据表明炎症反应参与PMD的病理生理过程，已有报道称dysferlinopathies、DMD、FSHD和其他LGMD亚型等患者的肌肉病理中都发现了炎症反应，显示肌营养不良蛋白与炎症反应则存在关系，如在肌膜修复中起至关重要作用的dysferlin，其缺失的肌纤维膜修复功能亦受损，持续释放一些内源性“危险”分子，刺激产生促炎细胞因子如IL-1β；有些可活化补体***，产生促炎介质和调整素C3b并上调炎性体，最终引起细胞损伤和坏死。
另外，很多研究表明在dystrophin缺失的受累肌肉组织(mdx小鼠和DMD患者)中炎症反应相关的基因和一些炎症分子(包括细胞因子和细胞粘附分子)高表达。
综上所述，目前认为炎症反应可导致肌肉损害的发生和发展。
3)对于废用性肌肉萎缩，近年的研究显示，是由于肌肉中活性氧产物ROS的提高以及肌肉抗氧化能力的减弱扰乱了氧化还原反应的信号通路，而此信号通路是骨骼肌中调控蛋白质水解和蛋白合成的最重要的调控者。这表明废用性肌肉萎缩和上述分子机制可能存在着很大的关系。
诱导方法
诱导人胚胎干细胞、人诱导性干细胞、人肌肉干细胞向生肌细胞分化的方法参照本领域的现有技术进行。应用于临床将按照临床细胞治疗标准改用合适的培养试剂和方法进行优化。
优选的诱导人胚胎干细胞的方法如下所示：
1.hESCs培养
在hESCs传代前2天，将辐照过的CF1饲养层细胞接种到Matrigel包被过的培养瓶，密度为30,000个细胞/cm2。饲养层细胞的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。仅在hESCs传代前将培养基换成hESCs培养液，其中包含(80％DMEM/F12，20％Knockout serumreplacement，4ng/ml bFGF，2mmol/L左旋谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，0.1mMβ-巯基乙醇)，hESCs传代时间约为1周/次。
胶原酶IV用于分离饲养层的细胞团块，用hESCs培养液冲洗hESCs两次，使细胞克隆至合适大小，传代铺板至新的饲养层细胞上。最后，hESCs冻存液包含20％高品质的胚胎干细胞用FBS，70％hESCs培养液和10％DMSO。
2.慢病毒载体的构建
通过商品化的RevTet***，克隆出rtTA，TRE和Hygr元件；通过RNAi载体(pSIREN)中克隆Puror片段，通过双顺反子表达载体(pIRES2-GFP)克隆IRE片段；通过培养10天的H1细胞系得到拟胚体(EB)后，提取cDNA后得到MyoD片段。最后使用有启动子EF1α的第二代慢病毒载体作为骨架。
3.慢病毒的生产
1)使用慢病毒载体和辅助载体(Δ8.91和pVSVG)转染293T细胞；
2)转染剂为FuGENE HD；
3)在转染24小时后换液；
4)在转染48、72、96小时后收集慢病毒。
4.Tet-on诱导的基因表达***在hESCs中的建立
1)在HuES 17细胞系上建立Tet-on***；
2)在无饲养层细胞培养的情况下用Lv-EF1a-rtTA-IRES-hygr慢病毒感染HuES-17细胞系；
3)感染24小时后换液，在感染48小时后使用Hygromycin B(50μg/mL)；
4)连续8天使用Hygromycin B培养筛选后，使用TrypLE将培养的克隆分离成单细胞，以500个/cm2的密度接种于CF1包被的培养瓶中；
5)传代2周后，将单细胞培养起来的克隆接种到新鲜的CF1的包被的培养瓶中，这批单克隆称为H17-rtTA；
6)在无饲养层细胞培养的情况下分别用Lv-EF1a-puro-TRE-GFP和Lv-EF1a-GFP-TRE-MyoD慢病毒感染H17-rtTA；
7)按照3)-5)的培养方法得到H17-Tet-on-GFP(H17–iGFP，GFP诱导型)和H17-Tet-on-MyoD(H17-iMyoD，MyoD诱导型)细胞系。
这两种细胞系都具备典型的hESCs形态(细胞核较大)，同时hESCs多能性标记物维持高水平表达；并且使用H17-iGFP系测试了Tet-on***的诱导动力学。
5.过表达MyoD可将hESCs诱导为早期中胚层细胞
1)在无滋养层细胞的情况下培养H17-iMyoD和H17-iGFP细胞，加入1μg/ml的Doxycycline；
2)Doxycycline处理2-4天后，H17-iMyoD细胞显现成纤维细胞的特征，成为两头尖的纺锤状细胞，而iGFP细胞未有变化；
3)免疫染色发现Doxycycline处理4天后的H17-iMyoD的多能干性标志物Oct4和Nanog的表达水平显著下调，mRNA表达水平跟免疫染色相同；
4)检测Doxycycline处理4天后的H17-iMyoD细胞的内胚层标记物Sox17和FoxA2；中胚层标记物T和ACTC1；外胚层标记物Pax6和NFH；滋养外胚层的标记物Hand1和CDX2，发现中胚层的标志物显著上调。说明在hESCs中过表达MyoD可以让细胞丢失干性并朝中胚层进行分化。
6.过表达MyoD可将hESCs诱导为生肌细胞
1)Doxycycline处理hESCs 2天后，使用胰蛋白酶将克隆再次分为单细胞，重新铺在基质胶包被好的培养瓶中；
2)继续用含有1μg/ml Doxycycline的hESCs条件培养基培养，通过Doxycycline的诱导，细胞会变得细长，显现类似于骨骼肌生肌细胞的形状；
3)药物处理3天后，RT-PCR分析显示卫星细胞的标志物Pax7轻微上调，Pax3显著上调，NCAM、内源MyoD的表达也显著上调，另一个早期生肌调节因子Myf5的表达在分化过程未被检测到有上调；
4)结果显示过表达MyoD可诱导hESCs向生肌细胞分化。
优选的诱导人诱导性干细胞和人胚胎干细胞为生肌细胞分化的方法如下所示：
用辐照过的小鼠成纤维细胞作为饲养层培养人诱导性干细胞和人胚胎干细胞，培养基成分包含：F12/DMEM，20％Knock out serum replacer(KOSR)，1×penicillin/streptomycin，1％100mM sodium pyruvate，1×NEAA，0.1％0.1Mβ-mercaptoethanol和2ng/mL FGF-2。用dispase将干细胞集落从小鼠胚胎成纤维细胞层分离，再接种至matrigel包被含有mTESR1培养基的培养皿中。第2天，用TrypLE将贴壁细胞消化成单细胞悬液并按照5000cells/cm2接种至matrigel包被的含有mTESR1培养基的培养皿中，放在37℃，5％O2和5％CO2的培养箱中培养。第3-6天，细胞维持在含有包含1％ITS和0.2％penicillin/streptomycin无血清DMEM/F12基础培养基中；第3–4天时向培养基中加入3μM CHIRON99021和0.5μM LDN193189；第5–6天时同时向培养基中加入3μM CHIRON99021、0.5μM LDN193189和20ng/mL FGF-2。从第7天一直到第30天，更换培养基为DMEM/F12+15％KOSR+0.2％penicillin/streptomycin，并添加10ng/mL HGF(Thermofisher)，2ng/mL IGF-1(R&Dsystems)，20ng/mL FGF-2；此外，7-8天时额外添加0.5μM LDN193189；9–12天时额外添加2ng/mL IGF-1；接下来13–30天的分化过程中，细胞培养在正常O2浓度和5％CO2培养箱中并在培养基中添加10ng/mL HGF和2ng/mL IGF-1。第31天时，用TrypLE将细胞消化下来用DMEM/F12+1％penicillin/streptomycin+1％ITS+1％N2supplement，每10天将细胞重新接种一次。
优选的诱导人肌肉干细胞分化的方法如下所示：
将人骨骼肌切碎并进行酶(0.05％胰蛋白酶-EDTA，Gibco)消化，37℃搅拌60分钟。该过程经加入10％FCS(Life Technologies)终止。然后使用70μm和40μm尼龙过滤器过滤细胞悬液后在生长培养基(GM)中扩增5-7天，GM包含有Ham’s F10(Life Technologies)，15％FCS，牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich；0.5mg/ml)，胎球蛋白(Sigma-Aldrich；0.5mg/ml)，表皮生长因子(Life Technologies；10ng/ml)，***(Sigma-Aldrich；0.39μg/ml)，胰岛素(Sigma-Aldrich；0.04mg/ml)，肌酸(Sigma-Aldrich；1mM)，丙酮酸(Sigma-Aldrich；100μg/ml)，尿苷(Sigma-Aldrich；50μg/ml)，庆大霉素(Life Technologies；5μg/ml)。
为了分离得到纯的人类成肌细胞，将培养的细胞用胰蛋白酶消化并悬浮在GM中，并与以下抗人的单克隆抗体一起在4℃孵育30min，抗体均购自BD Biosciences(富兰克林湖，新泽西，美国)，包括anti CD56-AlexaFluor 488,anti CD45 PE-CF594,anti CD144-PE,anti CD34-APC,anti CD146-PECy7。之后洗涤人成肌细胞并重悬于GM中。通过使用FACSAria(BD)进行流式细胞术分选的人类成肌细胞为CD56+CD146+CD45-CD34-CD144-，并重复分析来检测其纯度。同型对照抗体是PE-CF594-，APC-，PE-Cy7-，Alexa488和PE-conjugated小鼠IgG1(均购自BD Biosciences)。
流式细胞术分析是将成肌细胞或人肌源储备细胞(MRC)和适当稀释的小鼠抗人单抗(均购自BD Biosciences)一起于冰上孵育30分钟，抗体包括CD56-Alexa488,CD146-PE-Cy7,CD73-FITC,CD90-FITC,CD105-FITC,Alkaline phosphatase-PerCP-Cy5.5,HLA ABC-PE,HLA DR-PE,CD82-PE和CD114-PE。阴性对照样品使用相同剂量的FITC-，Alexa488-，PerCPCy5.5，PE-Cy7-和PE标记的同型匹配抗体(均购自BD Biosciences)。
细胞周期分析是将Fix/Perm buffer(BD Biosciences)和细胞一起在冰上孵育20分钟使细胞透化，再用Perm/Wash buffer中洗涤两次后与小鼠抗人抗体Ki67
Figure BDA0001758654730000091
647或同型对照
Figure BDA0001758654730000092
647小鼠IgG1k结合，冰上孵育30分钟。Perm/Wash buffer洗涤后，将细胞在37℃下与5μl的Hoechst 33342(Invitrogen；1mg/ml)一起孵育。使用LSR Fortessa(BD Biosciences)测量荧光，并使用FlowJo 10.2进行数据分析(FlowJo LLC，美国)。
人肌源储备细胞的形成方法如下：
将人成肌细胞在GM中培养至聚集，然后转移到分化培养基(DM)中。DM是在DMEM(Life Technologies)基础培养基中添加牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich；0.5mg/ml)，表皮生长因子(Life Technologies；0.01mg/ml)，胰岛素(Sigma-Aldrich；0.01mg/ml)，肌酸(Sigma-Aldrich；1mM)，丙酮酸(Sigma-Aldrich；100μg/ml)，尿苷(Sigma-Aldrich；50μg/ml)，庆大霉素(Life Technologies；10μg/ml)。在DM中培养2天后，可观察到人肌管和被定义为MRC的非融合细胞。
细胞移植实验和流式细胞术分析前先使用胰酶短暂消化(30秒)特异性得到人MRC。即特异地去除了所有的肌管，只剩下静止的未分化的贴壁细胞。为进一步消除小肌管，可在实验前使用20μm预分离过滤器(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,德国)将经胰酶消化过的MRC进行过滤。所有用于体外和体内实验的细胞***次数少于20。
生肌细胞的鉴定
1.实时定量PCR检测生肌细胞标志基因(PAX3,NCAM,Myosin Heavy Chain,Myogenin,MRF4等)的表达
2.免疫细胞化学染色鉴定生肌细胞标志基因(PAX3,NCAM,Myosin Heavy Chain,Myogenin,MRF4等)的表达
3.流式细胞术签订CD56+/CD146+同时CD45-/CD34-/CD144-的生肌细胞。
细胞移植方法
每平方厘米注射50至100个点；每点移植的生肌细胞数为1×104～1×105；每点注射的水凝胶细胞体积为1μl；细胞浓度范围为1×104～1×105/μl。
使用微量单针头注射器或多针头注射器，针头为27G斜面针头。
组合物
本发明提供了一种用于修复神经源性肌肉萎缩的组合物，其包括本发明的生肌细胞和水凝胶。其中，生肌细胞是由胚胎干细胞、诱导性干细胞、肌肉干细胞分化得到具有向肌细胞分化的潜能的细胞。
包裹生肌细胞的人源水凝胶包括：胶原蛋白、纤维蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、波形蛋白、明胶、蛋白聚糖、壳聚糖、透明质酸等制备的水溶性凝胶。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的方法可以治疗神经源性肌肉萎缩，改善肌肉的质量和肌肉萎缩的症状。
(b)本发明的方法可以修复神经源性肌肉萎缩中的神经损伤。
(c)本发明的方法安全有效，无毒副作用，利于推广。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
生肌细胞移植后的小鼠肌纤维分析
试验方法如下：
1.失神经性肌肉萎缩小鼠模型的构建
选取8周龄Balb/c小鼠(斯莱克实验动物有限公司)，雌雄各半，使用4％水合氯醛将其麻醉，剂量为40mg/Kg。将小鼠背部朝上置于热台，剪去臀浅肌和股直肌上方的皮毛后，用75％酒精消毒。剪开股骨上方表皮，找到股骨位置沿其走向剪开肌肉找到坐骨神经。用显微持针钳夹住坐骨神经10秒后松开，紧挨钳夹部位右侧再次钳夹10秒后松开，看到坐骨神经呈现透明的扁平状时，再将剪开的肌肉和表皮分别进行缝合，之后继续放于SPF级环境下生长。
2.生肌细胞移植
细胞移植前3小时使用1mg/ml环孢霉素A按照1mg/100g的剂量对失神经营养肌肉萎缩的Balb/c小鼠进行注射。使用4％水合氯醛将其麻醉，剂量为40mg/Kg。剪去小鼠左腿腓肠肌上方的皮毛，并用75％酒精消毒。将10μl显微注射器灭菌后在冰上预冷，抽取10μl细胞悬液对准失神经营养肌肉萎缩的Balb/c小鼠的腓肠肌分别进行10次点注射，每点剂量为1μl。细胞移植后每天给小鼠注射环孢霉素A。
3.失神经营养肌肉萎缩的Balb/c小鼠的灌注和取材称重
称取失神经营养肌肉萎缩的Balb/c小鼠的体重，使用4％水合氯醛将其麻醉，剂量为40mg/Kg。剪开雌鼠胸腔，暴露心脏。从心尖处进针，右心耳剪破后输入预冷的生理盐水，待体内血液全部流出后，继续输入预冷的4％多聚甲醛。待体内各脏器充分固定后，取腓肠肌称重后放入4％多聚甲醛中后固定。
4.腓肠肌和坐骨神经冰冻切片的制备
取各组小鼠的腓肠肌和坐骨神经放入4％多聚甲醛中后固定24h后，PBS清洗3次，10min/次。30％蔗糖(PB溶解)脱水48h后使用OCT在-20℃条件下包埋，并置于全自动冷冻切片机(LEICA，CM3050S)内1h后切片，腓肠肌切片厚度为10μm，坐骨神经切片厚度为4μm，-80℃保存。
5.免疫荧光染色
将切片从-80℃冰箱取出，恢复至室温。按照PBS:甲醇:双氧水＝5:4:1的比例混匀后滴于组织30min，用于灭活内源性过氧化物酶；之后PBS清洗3次，10min/次。接下来，用0.25％TritonX-100-PBS透膜5min后，PBS清洗3次，5min/次；染色前选用5％BSA+0.05％TritonX-100-PBS室温封闭1h；接下来用于染色的一抗有GFP(life technology,A11120,1:500)，Dystrophin(abcam,ab15277,1:100)，Pax-7(abcam,ab199010,1:200)按各自的比例稀释后4℃过夜孵育,PBS清洗3次，10min/次；相应的荧光二抗Alexa
Figure BDA0001758654730000121
488(Molecular
Figure BDA0001758654730000122
A21202,1:1000)和Alexa
Figure BDA0001758654730000124
555(Molecular
Figure BDA0001758654730000123
A31572,1:500)按各自的比例稀释后室温避光孵育2h,PBS清洗3次，10min/次；DAPI(1:1000稀释)避光孵育5min，PBS清洗3次，5min/次；滴加抗荧光淬灭剂，盖片后拍照。
6.肌力的检测
在移植生肌细胞8周后,使用活体肌肉测试***(Aurora Scientific lnc,1300A)测试3组小鼠右腿肌力，用于评价在自然状态下肌肉的功能。将3组小鼠分别按照0.056ml/10g的剂量注射1.5％戊巴比妥钠,待麻醉后放于***的动物平台(预热37℃)上。
将右侧小腿的毛发剃掉,并用70％酒精棉球擦拭防止感染。打开DMCv5.420动态肌肉控制软件，将右腿固定于力传感臂(305C-FP)上,电极针轻轻***肌肉中，刺激腓神经。我们做了肌力和刺激频率的方案,连续给予5次短促的电刺激引起肌肉的单收缩,脉冲时长为0.2ms。在一定范围内调整刺激频率，当肌肉产生最大力量时即为此时最佳的刺激频率(100Hz),刺激时程为0.3s，得到最大强直收缩力。最后通过DMAv5.220分析软件分别得出3组小鼠肌力结果。
7.坐骨神经冰冻切片HE染色
将各组横切和纵切的坐骨神经冰冻切片放于蒸馏水中。苏木素染色10min；流水冲洗5min；1％盐酸酒精分色3-6s；流水冲洗5min返蓝；经梯度酒精脱水后(75％5min；85％5min；90％5min；95％I 2s)；伊红染色2min；2次95％酒精各2s；2次纯酒精各5min；2次纯二甲苯各5min。中性树胶封片，拍照。
结果如图1-3所示。
图1显示假手术组小鼠的肌纤维横切面都是大而均匀的；基质胶移植后8周的小鼠肌纤维横切面大小与假手术组差异显著，说明单纯基质胶移植对小鼠肌纤维无修复作用。而基质胶包裹生肌细胞移植后8周的小鼠肌纤维横切面大小已经与假手术组接近，说明生肌细胞移植可以促进肌纤维修复。
图2和图3显示，假手组术组小鼠肌纤维横切面和纵切面图都均匀、整齐，基质胶移植后8周的小鼠肌纤维形态比假手术组更加纤细，且肌纤维之间空隙很大，说明单纯基质胶移植对小鼠肌纤维无修复作用；基质胶-生肌细胞组肌纤维形态跟假手组术组很接近，说明生肌细胞移植可以促进肌纤维修复。为了解移植的人生肌细胞否与肌肉组织融合，免疫组织化学SABC法检测标记人细胞的GFP基因，图2、3显示移植细胞8周后仍然有外源人细胞存活，可能与小鼠的腓肠肌细胞发生融合。
Figure BDA0001758654730000131
表1显示，移植基质胶小鼠被钳夹过的左腿和未被钳夹的右腿的腓肠肌重量差别具有显著性差异，直到移植后8周腓肠肌重量恢复不明显。而移植基质胶包裹生肌细胞组6周和8周时小鼠左、腿的腓肠肌重量已无显著性差异，说明生肌细胞可以改善肌肉的重量。
上述结果表明，使用成肌细胞向萎缩的肌肉点注射进行治疗，能够很大程度上改善肌肉的质量。
实施例2
生肌细胞移植后的小鼠肌力检测
采用与实施例1类似的方法进行小鼠生肌细胞移植，利用小动物肌力测试***，检测各组小鼠的肌肉力量。
图4结果显示，移植后8周，基质胶组和假手术组小鼠肌肉力量(A：最大抽搐力；B：最大强直力)比较差异显著，和模型小鼠肌肉力量无显著性差异(实验结果未展示)，说明基质胶移植对小鼠肌肉力量恢复无明显促进作用；基质胶包裹生肌细胞组移植和基质胶移植组小鼠比较，肌肉力量增加明显，具有显著性差异，并且和假手术组小鼠肌肉力量无显著性差异，说明生肌细胞治疗可以改善模型小鼠的肌肉功能。
从图5可以看出，假手术组小鼠坐骨神经横切面和纵切面图神经纤维都均匀、整齐，纤维间隙较小；模型2周组对比假手术2周组，模型组远段神经出现华勒氏变性，大部分髓鞘崩解，轴突坏死，遗留空腔；残留神经纤维增粗，髓鞘形态不规则，神经束膜及神经外膜结构完整,有纤维增生和炎症细胞浸润。基质胶移植8周组和基质胶包裹生肌细胞移植8周组的坐骨神经都有一定程度的修复，和假手术组比较具有显著性差异，基质胶包裹生肌细胞移植8周组的神经纤维形态更接近假手术组。
综合上述结果表明，外周神经损伤后的肌肉萎缩，在没有生肌细胞移植的治疗组即使外周神经有一定程度的修复，肌肉组织的形态和功能都没有显著性改善；生肌细胞治疗组可以在神经修复的基础上明显改善肌肉组织的形态和功能。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种生肌细胞的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于治疗神经源性肌肉萎缩，其中，所述的治疗包括改善肌肉萎缩和神经损伤。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生肌细胞表达选自下组的标志基因：
PAX3+,NCAM+,Myosin Heavy Chain+,Myogenin+,MRF4+或CD56+/CD146+,和CD45-/CD34-/CD144-。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的改善肌肉萎缩包括促进肌纤维修复、增加肌肉的重量、改善肌肉功能、或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的改善神经损伤是指修复神经的形态和功能。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂或组合物包含：(a)生肌细胞；和(b)水凝胶，较佳地，所述的水凝胶为人源水凝胶，更佳地，所述的水凝胶选自下组：胶原蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白、或其组合。
6.一种用于治疗神经源性肌肉萎缩的组合物，其特征在于，所述的组合物包含(a)生肌细胞；和(b)水凝胶，其中，所述的生肌细胞表达选自下组的标志基因：
PAX3+,NCAM+,Myosin Heavy Chain+,Myogenin+,MRF4+或CD56+/CD146+,和CD45-/CD34-/CD144-。
7.一种非治疗性的改善神经源性肌肉萎缩引起的肌肉萎缩和神经损伤的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或肌肉干细胞；
(b)在适合分化的条件下，诱导步骤(a)中的细胞分化，从而获得包含分化的生肌细胞的细胞群体；和
(c)将步骤(b)获得的生肌细胞注射到需要的部位，从而改善肌肉萎缩和神经损伤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，还包括分离所述细胞群体中的生肌细胞的步骤，较佳地，利用流式细胞术分选CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144-的生肌细胞。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，包括用水凝胶包裹所述生肌细胞的步骤。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法是一种构建动物模型的方法。
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