CN110305837A - 磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用 - Google Patents
磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种磷酸二酯酶5活性抑制剂的一种新用途——即作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂，属于水产技术领域。磷酸二酯酶5活性的抑制剂，包括Sildenafil Citrate、Tadalafil和Avanafil。实验表明，Sildenafil Citrate、Tadalafil和Avanafil在促进***成熟中均表现出计量依赖性、时间依赖性和时期依赖性，而且在斑马鱼中诱导***成熟的效率较高。另外，磷酸二酯酶5活性的抑制剂不仅可用于斑马鱼***成熟的诱导，也可能应用于其他鱼类的***成熟诱导，因此具备良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷酸二酯酶5活性抑制剂的一种新用途——即作为诱导斑马鱼***成熟剂，属于水产技术领域。
背景技术
磷酸二酯酶（PDEs）具有水解细胞内第二信使（cAMP,环磷酸腺苷或cGMP,环磷酸鸟苷）的功能，降解细胞内cAMP或cGMP，从而终结这些第二信使所传导的生化作用。其中磷酸二酯酶5是一种特异性水解cGMP的磷酸二酯酶，其抑制剂有Sildenafil、Vardenafil、Tadalafil和Avanafil，主要用于治疗治疗性功能障碍。近些年，在哺乳动物中发现PDE5参与哺乳动物***成熟的调控，但在鱼类中没有发现类似的报道。本专利主要揭示磷酸二酯酶5活性抑制剂作为一种催熟剂在诱导斑马鱼***成熟中的应用。
在水产实践中，鱼类***的正常成熟至关重要，是获得优质卵子进行育种繁殖的前提。因此***成熟的机制一直以来都是鱼类生殖生理学研究的热点，开发出新型鱼类***催熟剂对鱼类养殖有着重要的意义。）***的成熟是由多种因子调控的复杂过程，也是调控是生殖的关键环节之一。与其他脊椎动物相似，鱼类的卵子从初级***开始发生减数***，到完全生长期停滞在第一次减数***的前期，直到受到由垂体分泌的LH（促***）的刺激之后，减数***恢复，核膜破裂，第一极体排出，并停滞在第二次减数***的中期，这个过程被称为***的成熟，在这个过程中卵黄蛋白结构发生重构，卵子的颜色由不透明变成透明，故此变化也是判断斑马鱼卵子是否发生成熟的标志。
近年，在哺乳动物中已经证明，cGMP参与***的成熟。在***内，cGMP抑制磷酸二酯酶3即PDE3A，维持***中cAMP的高水平，而cAMP对细胞周期蛋白起作用，阻止减数***的进展。LH关闭滤泡细胞与***之间的通道连接关闭，进一步导致***内cGMP显著下降，这将导致cGMP抑制PDE3A活性的功能下降，降低了***内cAMP的含量，使减数***得以恢复。越来越多的环核苷酸磷酸二酯酶被发现参与哺乳动物***的成熟调控，包括环核苷酸磷酸二酯酶3、特异性水解cAMP的环核苷酸磷酸二酯酶4、7、8和特异性水解cGMP的环核苷酸磷酸二酯酶1、5。
***的成熟是一个复杂的动态过程，通过对***成熟机制的深入了解和掌握，才能更好地利用***成熟的规律为现代胚胎生物工程的发展服务。虽然，已经有实验室在体外成熟-体外受精-体外培养方面取得了成功，但体外成熟的***存在受精率较低，细胞质量较差等问题，所以通过对***成熟机理的进一步研究，体外成熟体系将会更加完善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸二酯酶5活性抑制剂的一种新用途——即作为诱导斑马鱼***催熟剂。
下面通过具体实验来说明磷酸二酯酶5抑制剂在诱导斑马鱼***成熟中的应用效果。
1、材料和药品
Leibovitz's L-15 培养基购自 Gibco公司（美国），磷酸二酯酶5抑制剂采用Sildenafil Citrate、Tadalafil、Avanafil，均购自selleck公司（美国）。
2、卵巢卵泡分离和培养
斑马鱼麻醉致死后，解剖10~15条雌性斑马鱼，取出卵巢放在含有用无菌水稀释的、质量百分含量为60%的Leibovitz's L-15培养基的培养皿中，人工分离完全生长期卵子（FG期；直径约为0.65毫米）。分离过程通常在室温下持续3~5h，28℃下孵育和药物处理。
图1是Sildenafil Citrate对***成熟的影响，其中（A） SildenafilCitrate处理16小时对***成熟率的浓度依赖性关系；（B）为 Sildenafil Citrate（10uM）对***成熟率的时间依赖性关系；（C）Sildenafil Citrate（10uM处理14h）对不同直径大小的***的成熟率的影响。
图2是Tadalafil对***成熟的影响，其中（A）Tadalafil处理16小时对***成熟率的浓度依赖性关系；（B）Tadalafil（10uM）对***成熟率的时间依赖性关系；（C）Tadalafil（10uM处理14h）对不同直径大小的***成熟率的影响。
图3是Avanafil对***成熟的影响，其中（A）Avanafil处理16小时对***成熟率的浓度依赖性关系；（B）Avanafil（1000uM）对***成熟率的时间依赖性关系；（C）Avanafil （1000uM处理14h）对不同直径大小的***成熟率的影响。
在上述测试不同剂量的实验中，Sildenafil Citrate、Tadalafil和Avanafil在促进***成熟中均表现出剂量依赖性，且Sildenafil Citrate和Tadalafil 在10uM的浓度时效果最好，Avanafil在1mM时效果最佳。（图1A，图2 A，图3 A）。
在上述测试不同时间的实验中，Sildenafil Citrate、Tadalafil和Avanafil在促进***成熟中均表现出时间依赖性，在14小时可达到最好的效果（图1B，图2 B，图3B）。
在上述测试不同时期的实验中，Sildenafil Citrate、Tadalafil和Avanafil在促进***成熟中均表现出时期依赖性，可诱导完全生长期的卵子发生成熟（图1 C，图2C，图3 C）。
综上所述，磷酸二酯酶5的抑制剂可诱导完全生长期的卵子发生成熟，并具有明确的剂量、时间和时期依赖性。
本发明通过研究，首次发现磷酸二酯酶5活性的抑制剂可诱导斑马鱼***成熟，表明磷酸二酯酶5活性的抑制剂可作为一种新型的诱导鱼类***成熟的试剂应用于鱼类***催熟中。此外磷酸二酯酶5活性的抑制剂在斑马鱼中诱导***成熟的效率较高，不仅可用于斑马鱼***成熟的诱导，也可能应用于其他鱼类的***成熟诱导，因此具备良好的应用前景。
附图说明
图1是Sildenafil Citrate在***成熟过程中的作用。
图2是Tadalafil在***成熟过程中的作用。
图3是Avanafil在***成熟过程中的作用。
具体实施方式
通过具体实验来说明磷酸二酯酶5抑制剂在诱导斑马鱼***成熟中的应用效果。
实施例1、Sildenafil Citrate在诱导斑马鱼***成熟中的应用
斑马鱼麻醉致死后，解剖10~15条雌性斑马鱼，取出卵巢放在含有用无菌水稀释的，质量百分含量为60%的Leibovitz L-15培养基的培养皿中，人工分离完全生长期卵子（FG期；直径约为0.65毫米）。分离过程通常在室温下持续3~5h，28℃下孵育，并用药物处理。药物Sildenafil Citrate的浓度为10uM，处理时间14小时。与对照组相比，诱导***成熟率升高越1.83倍。对照组的成熟率约为40%，Sildenafil Citrate处理组的***成熟率约为73%。
实施例2、Tadalafil在诱导斑马鱼***成熟中的应用
药物Tadalafil的浓度为10uM，处理时间14小时。其他与实施例1同。（与对照组相比，诱导***成熟率升高越2.3倍。对照组的成熟率约为33%，Sildenafil Citrate处理组的***成熟率约为75%。
实施例3、Avanafil在诱导斑马鱼***成熟中的应用
药物Avanafil的浓度为1mM，处理时间14小时。其他与实施例1同。（与对照组相比，诱导***成熟率升高越1.5倍。对照组的成熟率约为52%，Sildenafil Citrate处理组的***成熟率约为78.5%。
Claims (5)
1.磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用。
2.如权利要求1所述磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用，其特征在于：磷酸二酯酶5活性抑制剂为Sildenafil Citrate、Tadalafil、Avanafil。
3.如权利要求2所述磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用，其特征在于：Tadalafil的浓度为0.1~10uM。
4.如权利要求2所述磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用，其特征在于：Sildenafil Citrate的浓度为1~10uM。
5.如权利要求2所述磷酸二酯酶5活性抑制剂作为诱导斑马鱼***成熟的催熟剂的应用，其特征在于：Avanafil的浓度为10uM~1000uM。
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