JP6297088B2 - Ｐｃｓｋ９アンタゴニスト - Google Patents

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Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、全目的のために参照により組み込んだ２００９年１２月１１日出願の米国特
許仮出願第６１／２８５，９４２号の優先権の利益を主張する。
本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗体アンタゴニストに関する。
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）は、血流中の低密度リポタンパク質（ＬＤ
Ｌ）を排除することによってアテローム性動脈硬化および高コレステロール血症を防御す
る。ＬＤＬ−Ｒは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型（「ＰＣＳＫ
９」）によって翻訳後のレベルが調節される。最近、マウスにおけるＰＣＳＫ９のノック
アウトが報告された。これらのマウスでは血漿コレステロールレベルが約５０％低下して
おり、血漿コレステロール低下においてスタチンに対する高い感受性を示した（Rashid S
, et al (2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379。ヒトの遺伝子データによってもＬ
ＤＬ恒常性維持におけるＰＣＳＫ９の役割が裏付けられる。おそらくＰＣＳＫ９の「機能
損失」変異と考えられる２つの変異が最近同定された。これらの変異を有する個体は、Ｌ
ＤＬ−Ｃの血漿レベルが約４０％低下しており、このことは冠動脈心疾患が約５０〜９０
％減少することを意味している。考え合わせると、これらの研究は、ＰＣＳＫ９の阻害剤
がＬＤＬ−Ｃの血漿濃度およびＰＣＳＫ９によって媒介されるその他の病的状態の軽減に
有益で、効率を高めるために、例えば、コレステロールを低下させるために有用な第２の
薬剤と一緒に同時投与することができることを示唆している。
本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（例え
ば、配列番号４７）と結合し、その機能と拮抗する抗体および、例えば、ＰＣＳＫ９によ
って媒介される病的状態を治療するためにこのような抗体を使用するための方法を提供す
る。
一態様では、本発明はプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ
９）に結合する抗体および抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、この抗体
は、
ａ）ＰＣＳＫ９が低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するのを阻止せず、
ｂ）ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９の媒介による分解を阻害する。
いくつかの実施形態では、この抗体または抗原結合分子はヒトＰＣＳＫ９の６８０〜６
９２位の残基内の少なくとも１個のアミノ酸に結合する。例えば、いくつかの実施形態で
は、抗体または抗原結合分子は、アミノ酸配列ＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ（配列番号４
９）内のＰＣＳＫ９のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子はヒトＰＣＳＫ９に平衡解離定数（
ＫＤ）約５００ｐＭ以下で結合する。例えば、いくつかの実施形態では、抗体または抗原
結合分子はヒトＰＣＳＫ９に平衡解離定数（ＫＤ）約４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐ
Ｍ、２００ｐＭ、１９０ｐＭ、１８０ｐＭ、１７０ｐＭ、１６０ｐＭ、１５０ｐＭ、１４
０ｐＭまたはそれ以下で結合する。
いくつかの実施形態では、抗体抗原結合分子は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における
半減期が少なくとも約７日である。いくつかの実施形態では、抗体抗原結合分子は、イン
ビボにおける半減期が少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０日である。いくつ
かの実施形態では、抗体抗原結合分子は、インビボにおけるコレステロール低下効果が少
なくとも約２週間、例えば、２、３、４週間またはそれ以上である。好ましくは、インビ
ボにおける半減期はヒト対象において測定する。
いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレーム
ワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域と
を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）（
配列番号１４）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含
む。
いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレーム
ワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域と
を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹＮＭＤＹ（配列番号１２）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含
む。
いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレーム
ワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域と
を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１３）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含
む。
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１２および配列番号１３からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
。
いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、配列番号２８と少なくとも８５％、８
８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％の配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントは、配列番号３１と少なくとも８
５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、配列番号２７と少なくとも８５％、８
８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％の配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントは、配列番号２９および配列番号
３０からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同
一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖ＦＲ４がヒト生殖系列ＦＲ４である。いくつかの実施形
態では、重鎖ＦＲ４が配列番号３５である。
いくつかの実施形態では、軽鎖ＦＲ４がヒト生殖系列ＦＲ４である。いくつかの実施形
態では、軽鎖ＦＲ４が配列番号３９である。
いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ、相補
性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ、相補
性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号７を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１０を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択される
アミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２１を含み、
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２４を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２６を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域が配列番号４０の可変領域と少なくとも８５％
、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号４１の可変
領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体が配列番号４０を含む重鎖および配列番号４１を含む軽
鎖を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域が配列番号２および配列番号４からなる群から
選択される可変領域と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有
し、軽鎖可変領域が配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される可変領域
と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域が配列番号２および配列番号４からなる群から
選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１６および配列番号１８からな
る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇ
Ｇ１である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３および配列番号５からなる群
から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する
重鎖を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７および配列番号１９から
なる群から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共
有する軽鎖を有する。
いくつかの実施形態では、抗体はＦａｂ’断片である。いくつかの実施形態では、抗体
は１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト定常領域を含む
。いくつかの実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの実施形態で
は、ヒトＩｇＧ１定常領域は、細胞または補体のＣ１成分上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例
えば、ＦｃガンマＲ１などのエフェクターリガンドに対する結合親和性が低下するように
変異させる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照。いくつかの実施形態では、
ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５をＡｌａ２３４およびＡｌａ２
３５に置換させる。重鎖定常領域中の残基の番号は、ＥＵインデックスの番号である（Ka
bat, et al., (1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. De
pt. Health and Human Servicesを参照のこと）。
いくつかの実施形態では、抗体は担体タンパク質、例えば、アルブミンに連結させる。
いくつかの実施形態では、抗体はペグ化する。
関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および
軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性
決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号６および配列番号７からなる群から選択され
るアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択
されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から
選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選
択されるアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択
されるアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および
軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性
決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。
関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および
軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性
決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。
関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および
軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性
決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。
他の態様では、本発明は本明細書で記載したような抗体または抗原結合分子および生理
学的に適合できる賦形剤を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、個体において低密度リポタンパク質コ
レステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤を含む。
いくつかの実施形態では、この第２の薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、ア
トルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタ
バスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択
することができる。
いくつかの実施形態では、第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類
似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソーム
トリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトラン
スフェラーゼ（ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標
的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択さ
れる。
他の態様では、本発明は、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロール
の低下を必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロ
ールの低下方法であって、個体に本明細書で記載したような抗体または抗原結合分子の治
療有効量を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、個体は、スタチン治療に低応答性または耐性である。いくつ
かの実施形態では、個体はスタチン治療に不耐性である。いくつかの実施形態では、個体
のベースラインＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約１００ｍｇ／ｄＬ、例えば、少なくと
も約１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／
ｄＬであるかまたはそれを上回る。いくつかの実施形態では、個体は家族性高コレステロ
ール血症を有する。いくつかの実施形態では、個体はトリグリセリド血症を有する。いく
つかの実施形態では、個体は機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子変異を有する。いくつかの実施
形態では、薬剤誘導性脂質代謝異常を有する。
いくつかの実施形態では、全コレステロールがＬＤＬ−Ｃと共に低下する。
いくつかの実施形態では、方法がＬＤＬ−Ｃの低下に有効な第２の薬剤の治療有効量を
個体に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第２の薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトル
バスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバス
タチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択する
ことができる。
いくつかの実施形態では、第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類
似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソーム
トリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトラン
スフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１
００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子および第２の薬剤は混合物として同
時投与される。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子および第２の薬剤は別々に同時投与
される。
いくつかの実施形態では、抗体は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、抗体は
皮下投与される。
定義
「抗体」とは、イムノグロブリンファミリーのポリペプチドまたは非共有的、可逆的、
かつ特異的な様式で対応する抗原に結合することができるイムノグロブリンの断片を含む
ポリペプチドを意味する。抗体構造単位の一例には、テトラマーが含まれる。各テトラマ
ーは、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は、ジスルフィド結合によって
連結した１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有
する。確認されたイムノグロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領
域遺伝子ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたは
λのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、次に
、それぞれイムノグロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを決定
する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００個から１１０個以上のアミノ酸
の可変領域を決定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ
、軽鎖および重鎖のこれらの領域を意味する。本出願で使用したように、「抗体」は、特
に、例えばＰＣＳＫ９に対して、特定の結合性を有する抗体およびその断片の変種全てを
包含する。したがって、この概念の範囲内には、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、
１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および同じ結合特異性を有するこれらの断片
の多量体変種（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）が存在する。
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は同義で、ＶＬおよび
ＶＨの超可変領域を意味する。ＣＤＲとは、このような標的タンパク質に特異性を有する
抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。ヒトＶＬまたはＶＨそれぞれには３つのＣＤＲ
（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から順番に番号付け）があり、可変ドメインの約１５〜２０％を
構成する。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補的であり、した
がって、結合特異性に直接関与する。ＶＬまたはＶＨの残りの連続部分、いわゆるフレー
ムワーク領域は、アミノ酸配列の変動が少ないことが示された（Kuby, Immunology, 4th
ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当業界で周知の様々な定義法、例えば、Ｋ
ａｂａｔ，Ｃｈｏｔｈｉａ，ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃ
ｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）お
よびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)；Choth
ia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature, 342:877-
883 (1989)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani et al
., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照のこと）を使用して決定する。抗原結合（ｃ
ｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位の定義はまた、以下に記載されている：Ruiz et al., Nucleic A
cids Res., 28:219-221 (2000)およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209
(2001)；MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)およびMartin et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)；Martin et al., Methods Enzymol.
, 203:121-153 (1991)およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Struct
ure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
「結合特異性決定基」または「ＢＳＤ」という用語は同義で、抗体の結合特異性を決定
するために必要な相補性決定領域内の最小限の連続または非連続アミノ酸配列を意味する
。最小限の結合特異性決定基は、１個または複数のＣＤＲ配列内にあってもよい。いくつ
かの実施形態では、最小限の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列
の一部または完全長内に存在する（すなわち、それによってのみ決定される）。
本明細書で使用した「抗体軽鎖」または「抗体重鎖」はそれぞれ、ＶＬまたはＶＨを含
むポリペプチドを意味する。内在性ＶＬは、遺伝子セグメントＶ（可変）およびＪ（連結
）によってコードされ、内在性ＶＨはＶ、Ｄ（多様性）およびＪによってコードされる。
ＶＬまたはＶＨのそれぞれは、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む。本出願では、抗
体軽鎖および／または抗体重鎖は、時々、集合的に「抗体鎖」を意味することもある。こ
れらの用語には、当業者であれば容易に理解するように、ＶＬまたはＶＨの基本構造を破
壊しない変異を含有する抗体鎖が包含される。
抗体は、完全なイムノグロブリンとして、または様々なペプチダーゼで消化することに
よって生成したいくつかの良く特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば
、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合より下で抗体を消化して、それ自体がＦａｂ
’の二量体、Ｆ（ａｂ）’２を生じ、Ｆａｂ’はＶＨ−ＣＨ１にジスルフィド結合によっ
て連結した軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２は、穏和な条件下で還元され、ヒンジ領域のジス
ルフィド結合が切断し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体はＦａｂ’単量体に変換され
る。Ｆａｂ’単量体はヒンジ領域の一部を含むが、本質的にはＦａｂである。Paul, Fund
amental Immunology 3d ed. (1993)。様々な抗体断片が完全な抗体の消化に関して定義さ
れているが、当業者であれば、このような断片は化学的に、または組換えＤＮＡ法を使用
することによって、新たに合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で
使用したように、「抗体」という用語はまた、抗体全体の改変によって生成した抗体断片
、または組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成された抗体断片（例えば、１本鎖Ｆｖ）ま
たはファージディスプレーライブラリーを使用して同定された抗体断片を含む（例えば、
McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照のこと）。
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製では、当業界で公知の任意の技術
を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)；Ko
zbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)；Cole et al., Monoclonal Antibodies an
d Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985を参照のこと）。１本鎖抗体を
生成するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対
する抗体の生成に適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、またはそ
の他の生物、例えば、その他の哺乳類を、ヒト化抗体の発現のために使用することができ
る。あるいは、ファージディスプレー技術は、選択した抗原に特異的に結合する抗体およ
びヘテロマーＦａｂ断片を同定するために使用することができる（例えば、McCafferty e
t al.、前述; Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)を参照のこと）。
非ヒト抗体のヒト化または霊長類化の方法は、当業界では周知である。一般的に、ヒト
化抗体は、非ヒトである原料からヒト化抗体に導入された１個または複数のアミノ酸残基
を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、移入残基（ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）
と呼ばれることが多く、通常は移入可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯類のＣＤ
Ｒ（複数）配列またはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって、Ｗ
ｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986
)；Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:15
34-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと
）にしたがって本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、
キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、完全なヒト可変ドメインよりも
実質的に少ない部分が非ヒト種の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化
抗体は通常、いくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）残基およびおそらくいくつかのフレー
ムワーク（「ＦＲ」）残基が齧歯類抗体の類似部位の残基によって置換されているヒト抗
体である。
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したク
ラス、エフェクター機能および／または種類の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性
を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子および薬剤に結合す
るように定常領域またはその一部が変化、置換または交換しているか、あるいは（ｂ）可
変領域、またはその一部が、異なるかまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化
しているか、置換または交換している抗体分子である。
本発明の抗体または抗原結合分子はさらに、化学的に結合した、またはその他のタンパ
ク質との融合タンパク質として発現した、１個または複数のイムノグロブリン鎖を含む。
二特異性抗体も含む。二特異性または二機能性抗体は、２個の異なる重鎖／軽鎖対および
２個の異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。本発明のその他の抗原
結合断片または抗体部分には、２価ｓｃＦｖ（二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））、抗
体分子が２個の異なるエピトープを認識する二特異性ｓｃＦｖ抗体、単一の結合ドメイン
（ｄＡｂ）および小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）が含まれる。
本明細書で記載した様々な抗体または抗原結合断片は、完全な抗体の酵素的もしくは化
学的改変によって生成することができるか、または組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成
することができ（例えば、１本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレーライブラリーを使
用して同定することができる（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990
を参照のこと）。例えば、小型抗体は、当業界で記載された方法、例えば、Vaughan and
Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001を使用して作製すること
ができる。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む様々
な方法によって生成することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. I
mmunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)）
を参照のこと。１本鎖抗体は、ファージディスプレーライブラリーまたはリボソームディ
スプレーライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリーを使用して同定することができる
。このようなライブラリーは、合成、半合成または天然および免疫適格性材料から構築す
ることができる。
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したク
ラス、エフェクター機能および／または種類の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性
を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子および薬剤等に結合
するように定常領域またはその一部が変化、置換または交換しているか、あるいは（ｂ）
可変領域、またはその一部が、異なるかまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変
化しているか、置換または交換している抗体分子である。例えば、以下の実施例で示した
ように、マウス抗ＰＣＳＫ９抗体は、その定常領域をヒトイムノグロブリンの定常領域と
置換することによって改変することができる。ヒト定常領域と置換することによって、キ
メラ抗体はヒトＰＣＳＫ９の認識においてその特異性を保持することができる一方、元の
マウス抗体と比較してヒトにおける抗原性が低下する。
「抗体結合分子」または「非抗体リガンド」という用語は、非イムノグロブリンタンパ
ク質骨格を使用する抗体様物質を意味しており、アドネクチン、アビマー、１本鎖ポリペ
プチド結合分子および抗体様結合ペプチド様物質が含まれる。
「可変領域」または「Ｖ領域」という用語は同義で、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤ
Ｒ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を意味する。図１参照のこと。内
在性可変領域は、イムノグロブリン重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子または軽鎖Ｖ−Ｊ遺伝子によっ
てコードされる。Ｖ領域は、天然に生じるか、組換えられているか、または合成されてい
てもよい。
本明細書で使用したように、「可変セグメント」または「Ｖセグメント」という用語は
同義で、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含む可変領域の部分配列である
。図１参照のこと。内在性Ｖセグメントは、イムノグロブリンＶ遺伝子によってコードさ
れる。Ｖセグメントは、天然に生じるか、組換えられているか、または合成されていても
よい。
本明細書で使用したように、「Ｊセグメント」という用語は、ＣＤＲ３およびＦＲ４の
Ｃ末端部分を含む、コードされた可変領域の部分配列を意味する。内在性Ｊセグメントは
、イムノグロブリンＪ遺伝子によってコードされる。図１参照のこと。Ｊセグメントは、
天然に生じるか、組換えられているか、または合成されていてもよい。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持する一方、ヒトにおける免疫原性が少な
い抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残存する部分をヒト
の対応部分と置換することによって実現することができる。例えば、Morrison et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol.,
44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec.
Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照の
こと。
「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン可変領域
配列によってコードされた公知のその他の可変領域アミノ酸配列全てと比較して、参照可
変領域アミノ酸配列または部分配列との決定されたアミノ酸配列同一性が最高であるヒト
可変領域アミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を意味する。対応するヒト生
殖系列配列はまた、その他の評価された可変領域アミノ酸配列全てと比較して、参照可変
領域アミノ酸配列または部分配列とのアミノ酸配列同一性が最高であるヒト可変領域アミ
ノ酸配列または部分配列を意味することができる。対応するヒト生殖系列配列は、フレー
ムワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セ
グメント（上記で定義）または可変領域を含む配列もしくは部分配列のその他の組み合わ
せであってもよい。配列同一性は、本明細書で記載した方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬ
ＩＧＮまたは当業界で公知の別の配列比較アルゴリズムを使用して、２つの配列をアライ
ンメントさせることによって決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸配列また
はアミノ酸配列は、参照可変領域核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９
２％、９４％、９６％、９８％、９９％の配列同一性を有することができる。対応するヒ
ト生殖系列配列は、例えば、公式に利用可能な国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデー
タベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）およびＶ
−ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）
によって決定することができる。
抗原、例えば、タンパク質と抗体または抗体由来の結合物質との間の相互作用を述べる
場合に使用したときの「特異的に（または選択的に）結合する」という表現は、タンパク
質およびその他の生物学的物質の不均一な集団、例えば、生物学的試料、例えば、血液、
血清、血漿または組織試料中における抗原の存在を決定する結合反応を意味する。したが
って、指定した免疫アッセイ条件下では、特定の結合特異性を有する抗体または結合物質
は、背景の少なくとも２倍で特定の抗原と結合し、試料中に存在するその他の抗原とは有
意な量では実質的に結合しない。このような条件下での抗体または結合物質の特異的結合
には、抗体または物質が特定のタンパク質に対する特異性で選択されることが必要であり
得る。所望であれば、または適切であれば、この選択は、例えば、その他の種（例えば、
マウス）のＰＣＳＫ９分子またはその他のＰＣＳＫ亜型と交差反応する抗体を差し引くこ
とによって実現することができる。様々なイムノアッセイ形式を、特定のタンパク質と特
異的に免疫反応する抗体を選択するために使用してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイム
ノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用さ
れる（例えば、イムノアッセイ形式および特異的免疫反応を測定するために使用できる条
件についての説明は、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)
を参照のこと）。典型的は、特異的または選択的結合反応は、背景シグナルの少なくとも
２倍のシグナルを生成し、より典型的には背景の少なくとも１０から１００倍のシグナル
を生成する。
「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」という用語は、結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１
）によって除した解離速度定数（Ｋｄ、時間−１）を意味する。平衡解離定数は、当業界
で公知の任意の方法を使用して測定することができる。本発明の抗体の平衡解離定数は一
般的に、約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未
満、いくつかの実施形態では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満で
ある。
本明細書で使用したように、「抗原結合領域」という用語は、分子とＰＣＳＫ９の特異
的結合に関与する本発明のＰＣＳＫ９結合分子のドメインを意味する。抗原結合領域には
、少なくとも１個の抗体重鎖可変領域および少なくとも１個の抗体軽鎖可変領域が含まれ
る。本発明の各ＰＣＳＫ９結合分子にはこのような抗原結合領域が少なくとも１個存在し
、抗原結合領域はそれぞれその他のものと同一であるかまたは異なっていてもよい。いく
つかの実施形態では、本発明のＰＣＳＫ９結合分子の抗原結合領域の少なくとも１個はＰ
ＣＳＫ９のアンタゴニストとして作用する。
本明細書で使用した「アンタゴニスト」という用語は、標的分子に特異的に結合して標
的分子の活性を阻害することができる薬剤を意味する。例えば、ＰＣＳＫ９のアンタゴニ
ストは、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解を完全に、
または部分的に阻害する。ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解の阻害は、ＰＣＳＫ９の
ＬＤＬＲへの結合を妨害してもよく、または妨害しなくてもよい。いくつかの場合におい
て、ＰＣＳＫ９アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９に結合しＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を
阻害する能力によって同定することができる。ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解が、
本発明のアンタゴニストに曝露したときに生じる阻害は、対照の存在下またはアンタゴニ
ストなしでのＰＣＳＫ９媒介による分解と比較して、少なくとも約１０％低下している、
例えば、少なくとも約２５％、５０％、７５％低下しているか、または完全な阻害である
。対照は、抗体もしくは抗原結合分子に曝露しないか、または別の抗原に特異的に結合す
る抗体もしくは抗原結合分子、またはアンタゴニストとしての機能を果たすことが知られ
ていない抗ＰＣＳＫ９抗体もしくは抗原結合分子であってもよい。「抗体アンタゴニスト
」とは、アンタゴニストが阻害抗体である場合を意味する。
「ＰＣＳＫ９」または「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型」とい
う用語は同義で、分泌型サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属
する天然に生じるヒトプロタンパク質転換酵素を意味する。ＰＣＳＫ９は、小胞体におい
て自己触媒的細胞内プロセシングを受ける可溶性酵素前駆体として合成され、プロタンパ
ク質転換酵素として機能を果たすと考えられている。ＰＣＳＫ９は、コレステロール恒常
性維持において役割を果たし、皮質ニューロンの分化において役割を担う可能性がある。
このＰＣＳＫ９遺伝子における変異は、常染色体優性家族性高コレステロール血症の形態
に関連づけられている。例えば、Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):
11-26を参照のこと。ＰＣＳＫ９の核酸配列およびアミノ酸配列は公知で、それぞれジェ
ンバンク受入番号ＮＭ＿１７４９３６．２およびＮＰ＿７７７５９６．２として発表され
た。本明細書で使用したように、ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、ＬＤＬＲに機能的に結合し
、ＬＤＬＲの分解を促進する。構造的に、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列は、ジェンバンク受入
番号ＮＰ＿７７７５９６．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を
有する。構造的に、ＰＣＳＫ９核酸配列は、ジェンバンク受入番号ＮＭ＿１７４９３６．
２の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
「ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異」という表現は、例えば、ＬＤＬＲ分解の増加および
ＬＤＬＲレベルの低下による家族性高コレステロール血症表現型、加速化アテローム硬化
症および早期冠状動脈心疾患（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）に関連した、かつ／または原因となる、ＰＣＳＫ９遺伝子中に生じる天然
の突然変異を意味する。ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異の対立遺伝子出現頻度は稀である
。Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev. (2008) 29(1):11-26を参照のこと。ＰＣＳＫ
９機能獲得型突然変異の例には、Ｄ１２９Ｎ、Ｄ３７４Ｈ、Ｎ４２５ＳおよびＲ４９６Ｗ
が含まれる。Fasano, et al., Atherosclerosis (2009) 203(1):166-71を参照のこと。Ｐ
ＣＳＫ９機能獲得型突然変異は、例えば、Burnett and Hooper、前述；Fasano, et al、
前述；Abifadel, et al., J Med Genet (2008) 45(12):780-6；Abifadel, et al., Hum M
utat (2009) 30(4):520-9およびLi, et al., Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Nov. 1 (
PMID 19601924)に概説されている。
本発明のポリペプチドの「活性」とは、天然の細胞または組織におけるポリペプチドの
構造的、調節的または生化学的機能を意味する。ポリペプチドの活性の例には、直接的活
性および間接的活性の両方が含まれる。ＰＣＳＫ９の直接的活性の例は、ＬＤＬＲへの結
合およびＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解を含む、ポリペプチドとの直接的相互作用
の結果である。ＰＣＳＫ９の場合の間接的活性の例は、ポリペプチドの直接的活性に対す
る細胞、組織、臓器または対象における表現型の変化または応答、例えば、増加した肝臓
ＬＤＬＲの低下、血漿ＨＤＬ−Ｃの低下、血漿コレステロールの減少、スタチンに対する
感受性の増加として観察される。
核酸またはタンパク質に適用したときの「単離した」という用語は、核酸またはタンパ
ク質が、天然の状態で関連しているその他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する
。好ましくは均一な状態である。乾燥しているか、または水溶液であってもよい。純度お
よび均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー
などの化学分析技術を使用して測定する。調製物中に存在する主な種がタンパク質であれ
ば、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、関心のある
遺伝以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。
「精製した」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本
のバンドを生じることを意味する。特に、核酸またはタンパク質は少なくとも８５％純粋
、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であるこ
とを意味する。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖または２本鎖の形態のデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを意味する。
特に限定はしないが、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に生じるヌク
レオチドと類似の方法で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を
包含する。特に指示がなければ、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそれらの変異体
（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列なら
びに明瞭に指示された配列も非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１個
または複数の選択される（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／また
はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実現することができる
（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem
. 260:2605-2608 (1985)およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）
。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書では同義
で、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が
対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに
天然に生じるアミノ酸ポリマーおよび天然には生じないアミノ酸ポリマーに適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に
生じるアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する
。天然に生じるアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸ならびに後で
改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸および
Ｏ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構
造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化
合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチル
スルホニウムを意味する。このような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン
）または改変されたペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造
を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが
、天然に生じるアミノ酸と類似の方法で機能する化合物を意味する。
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。
特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のア
ミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的
に同一な配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意
の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵ
は全てアミノ酸、アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定さ
れる全ての位置において、コードするポリペプチドを変化させることなく、記載した対応
するコドンのいずれかにコドンを変化させることができる。このような核酸の変動は、「
サイレント変動」であり、保存的に改変された変動の一種である。ポリペプチドをコード
する本明細書の全核酸配列はまた、核酸の可能な全サイレント変動を記載する。当業者で
あれば、核酸の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常は
トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を生じるた
めに改変することができることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードす
る核酸の各サイレント変動は、記載した各配列に事実上含まれる。
アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされた配列の１個のアミノ酸または
ごく少数のアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる核酸、ペプチド、ポ
リペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変化が化学
的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を引き起こす場合、「保存的に改変された変
異体」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的置換の
一覧は、当業界では周知である。このような保存的に改変された変異体はさらに、本発明
の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子を排除しない。
以下の８群はそれぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ
）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（
Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）
、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照
のこと）。
「配列同一性のパーセント」は、比較窓にわたって２種類の最適にアラインメントさせ
た配列を比較することによって決定され、比較窓中のポリヌクレオチド配列の一部は、２
種類の配列の最適なアラインメントのために付加または欠失を含まない参照配列（例えば
、本発明のポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んで
いてもよい。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列内に生じる位置
の数を測定して、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較窓中の位置の全数に
よって除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを出すことによって算出
する。
２種以上の核酸またはポリペプチド配列の場合、「同一な」またはパーセント「同一性
」という用語は、配列が同じ２種以上の配列または部分配列を意味する。以下の配列比較
アルゴリズムの１つを使用して、または手動のアラインメントおよび目視検査によって測
定したときに、比較窓または指定した領域にわたって最大限対応するように比較し、アラ
インメントさせたとき、２種類の配列が特定のパーセントの同じアミノ酸残基またはヌク
レオチドを有する場合（すなわち、特定の領域にわたって、または特定していないときは
、参照配列の全配列にわたって、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する場合）、２種類の配列は「実質的
に同一」である。本発明は、本明細書で例示したポリペプチドまたはポリヌクレオチドそ
れぞれに実質的に同一なポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する（例えば、配列
番号１〜５、１５〜１９および４０〜４１のいずれか１つに例示した可変領域、配列番号
２７〜３１のいずれか１つに例示した可変セグメント、配列番号６〜１４、２０〜２６の
いずれか１つに例示したＣＤＲ、配列番号３２〜３９のいずれか１つに例示したＦＲ、配
列番号４２〜４５のいずれか１つに例示した核酸配列）。所望により、同一性は長さが少
なくとも約１５、２５または５０ヌクレオチドの領域にわたって、より好ましくは、長さ
が１００から５００または１０００以上のヌクレオチドである領域にわたって、あるいは
参照配列の全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性
は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０個のアミノ酸の領域にわたって、所望に
より長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００個のアミノ酸
にわたって、所望により少なくとも約１５０、２００または２５０個のアミノ酸にわたっ
て、あるいは参照配列の全長にわたって存在し得る。より短いアミノ酸配列、例えば、ア
ミノ酸２０個以下のアミノ酸配列に関して、本明細書で定義した保存的置換によって、１
個または２個のアミノ酸残基が保存的に置換されているとき、実質的同一性が存在する。
配列比較のため、通常、１配列は、試験配列を比較する参照配列とする。配列比較アル
ゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、その後の位
置を指定し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設
定のプログラムパラメータを使用することができ、または代わりのパラメータを指定する
こともできる。次に、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメータをベースに
して、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
本明細書で使用した「比較窓」には、２種類の配列を最適にアラインメントさせた後、
１配列を同数の連続した位置の参照配列と比較することができる２０から６００、通常約
５０から約２００、より通常は約１００から約１５０からなる群から選択される連続した
位置の数のいずれか１個のセグメントに対する参照が含まれる。比較のための配列のアラ
インメント方法は、当業界では周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは
、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴ
リズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントア
ルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似
性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる手法（GAP, BESTFIT, FASTA, a
nd TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 5
75 Science Dr., Madison, WI）または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、A
usubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照の
こと）によって実施することができる。
パーセント配列同一性および類似性を決定するために適切なアルゴリズムの２つの例は
、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムで、それぞれAltschul et al. (1977)
Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-
410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテ
クノロジー情報センターから公式に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合
わせ配列内の長さがＷの短いワードであって、データベース配列内の同じ長さのワードと
アライメントしたときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たす
ワードを同定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、
近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、前述）。これら最初の近傍ワード
ヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして
作用する。このワードヒットは、累積アライメントスコアを増加することができる限り、
各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラ
メータＭ（一対の一致残基に対するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に
対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコ
アリングマトリクスを用いて累積スコアを算出する。累積アライメントスコアが最高到達
値から数量Ｘだけ低下した場合；負のスコアを有する残基アライメントが１個または複数
累積したことにより累積スコアが０以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達
した場合には、各方向におけるワードヒットの伸長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム
パラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定する。ＢＬＡ
ＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、既定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待
値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については
、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、規定値として、ワード長３および期待値（Ｅ）１０を用い
、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）
１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２種類の配列の類似性の統計学的分析を実施する（例
えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照
のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされた類似性の１測定値は、最小合計
確率（Ｐ（Ｎ））であり、２種類のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一致が偶然生
じる可能性の指標となる。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が
約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である
ならば、その核酸は、参照配列と類似であると考えられる。
２種類の核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第１の核酸
によってコードされたポリペプチドが、以下に説明したように、第２の核酸によってコー
ドされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。したが
って、ポリペプチドは通常、第２のポリペプチドと実質的に同一で、例えば、２種類のペ
プチドは保存的置換のみが異なる。２種類の核酸配列が実質的に同一である別の指標は、
以下に説明したように、２種類の分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下
で互いにハイブリダイズすることである。２種類の核酸配列が実質的に同一であるさらに
別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅することができることである。
本発明のＰＣＳＫ９結合分子内で抗原結合領域がどのように連結するかを説明する場合
に使用される「結合（ｌｉｎｋ）」という用語は、物理的に領域を結合するために可能な
手段全てを包含する。多数の抗原結合領域は、共有結合（例えば、ペプチド結合またはジ
スルフィド結合）または非共有結合などの化学的結合によって結合することが多く、直接
的結合（すなわち、２種類の抗原結合領域の間にリンカーがない）であってもよく、また
は間接的結合（すなわち、２種類以上の抗原結合領域の間の少なくとも１個のリンカー分
子による）であってもよい。
「対象」、「患者」および「個体」という用語は同義で、哺乳類、例えば、ヒトまたは
非ヒト霊長類哺乳類を意味する。哺乳類はまた、実験動物、例えば、マウス、ラット、ウ
サギ、ハムスターであってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類は農業用哺乳類（例
えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）または家畜哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）で
あってもよい。
「治療上許容される量」または「治療有効用量」は同義で、所望する結果を達成するた
めに（すなわち、血漿非ＨＤＬ−Ｃ、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、冠
動脈心疾患の減少）十分な量を意味する。いくつかの実施形態では、治療上許容される量
は、所望しない副作用を誘導しないか、または引き起こさない。治療上許容される量は、
まず低用量を投与し、次に、所望する効果が実現するまで、その用量を徐々に増加させる
ことによって決定することができる。本発明のＰＣＳＫ９拮抗抗体の「予防的有効用量」
は、ＰＣＳＫ９の存在に関連した疾患症状（例えば、高コレステロール血症）の発症を防
御するができ、「治療有効用量」は疾患症状の重症度の減少を引き起こすことができる。
前記用語はまた、疾患症状のない期間の頻度を高め、持続期間を延長させることができる
。「予防有効用量」および「治療有効用量」はまた、ＰＣＳＫ９の活性から生じた障害お
よび疾患による機能障害または能力障害を予防するかまたは回復させることができる。
「同時投与」という用語は、個体の血液における２種類の活性薬剤の同時存在を意味す
る。同時投与された活性薬剤は、同時に、または順次送達され得る。
本明細書で使用したように、「本質的に構成される」という表現は、方法または組成物
に含まれた活性のある医薬品の部類または種類ならびに方法または組成物の企図した目的
のために不活性な任意の賦形剤を意味する。いくつかの実施形態では、「本質的に構成さ
れる」という表現は、本発明のアンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体以外の１種または複数の
追加的活性薬剤の包含を明白に除外する。いくつかの実施形態では、「本質的に構成され
る」という表現は、本発明のアンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体以外の１種または複数の追
加的活性薬剤および第２の同時投与された薬剤の包含を明白に除外する。
「スタチン」という用語は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（
ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の競合的阻害剤である薬理学的作用物質の種類を意味する。
図１は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０の重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号１５）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。
図２は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９の重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号１６）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。
図３は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０の重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号１８）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。
図４は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の重鎖（配列番号４）および軽鎖（配列番号１６）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。
図５Ａ〜Ｃは、いくつかの異なるヒトおよびマウス抗原に対するＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＮＸ−４と比較したＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を試験するＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図５Ａ〜Ｃは、いくつかの異なるヒトおよびマウス抗原に対するＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＮＸ−４と比較したＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を試験するＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図５Ａ〜Ｃは、いくつかの異なるヒトおよびマウス抗原に対するＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＮＸ−４と比較したＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を試験するＥＬＩＳＡアッセイを示す。
図６Ａ〜Ｃは、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９に対するＥＬＩＳＡにおけるＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を示す。第２抗体はヤギ抗マウス抗体で、１：５０００に希釈する。第２のみ（２ｎｄ ｏｎｌｙ）とは、第２抗体のみの対照である。 図６Ａ〜Ｃは、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９に対するＥＬＩＳＡにおけるＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を示す。第２抗体はヤギ抗マウス抗体で、１：５０００に希釈する。第２のみ（２ｎｄ ｏｎｌｙ）とは、第２抗体のみの対照である。 図６Ａ〜Ｃは、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９に対するＥＬＩＳＡにおけるＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を示す。第２抗体はヤギ抗マウス抗体で、１：５０００に希釈する。第２のみ（２ｎｄ ｏｎｌｙ）とは、第２抗体のみの対照である。
図７は、親マウスモノクローナル抗体、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０がＰＣＳＫ９のＣ末端、残基６８０〜６９２（ＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ；配列番号４９）に結合することを示す。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１は同じエピトープで競合する。Ｃ−末端変異体Ａ６８５Ｘ＝配列番号５６である。
図８は、親マウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０（５ｐ２０）は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）生化学アッセイで測定すると、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒの相互作用を十分に分断しないことを示す。対照的に、１３Ｃ１０は、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ ＦＲＥＴ相互作用をＩＣ５０５０ｎＭで分断する。アッセイ緩衝液中（ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．２、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ）で、蛍光色素（ｈＰＣＳＫ９−ＡＦ）で標識したヒトＰＣＳＫ９をＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１または１３Ｃ１０で室温で３０分間インキュベートした。この後ユーロピウム標識ＬＤＬ−Ｒ（ｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ）を添加し、室温で９０分間さらにインキュベートし、したがって、最終濃度はｈＰｃｓｋ９−ＡＦ ８ｎＭおよびｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ １ｎＭであった。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（３３０ｎｍ励起および６６５ｎｍ放射）をプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定し、５Ｐ２０または１３Ｃ１０存在下での％阻害を計算した。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）でパーセント阻害値をプロットすることによって計算した。各データ点は平均±ＳＤ（点当たりｎ＝４連）を表す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す。
図９は、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が、ＬＤＬ−Ｒレベルの増加およびＨｅｐＧ２細胞によるＬＤＬ取り込みの誘導についてマウス抗体ＬＦＵ７２０と同等であることを示す。ＬＤＬ−Ｒ測定のため、細胞をＰＣＳＫ９結合抗体でインキュベートし、抗ＬＤＬ−Ｒ抗体で標識した。ＬＤＬ取り込みのため、細胞をＰＣＳＫ９結合抗体、ＰＣＳＫ９およびＤｉＩ−ＬＤＬでインキュベートした。ＬＤＬ−Ｒ抗体およびＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光はフローサイトメトリーで測定した。反復測定の平均＋ＳＥＭを各アッセイについて示す。結果は、３回の独立した実験を表す。
ＬＤＬ取り込みアッセイのために、１０％牛胎児リポタンパク質欠乏血清（Ｉｎｔｒａ
ｃｅｌ）およびヒトＰＣＳＫ９（Hampton et al. PNAS (2007) 104:14604-14609）２００
ｎＭを含有するＤＭＥＭ中でＰＳＣＫ９結合抗体を室温で３０分間インキュベートし、抗
体／ＰＣＳＫ９／培地溶液を９６ウェルプレート中の細胞に添加し、一晩インキュベート
した。翌日、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカ
ルボシアニン過塩素酸塩標識ＬＤＬ（ＤｉＩ−ＬＤＬ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）をさらに２時間かけて添加した。次に培地を吸引し、細胞をＰＢＳで
３回洗浄し、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで分離した。その後、細胞をＦＡＣ
Ｓ緩衝液（５％牛胎児血清、ＥＤＴＡ ２ｍＭおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有す
るＰＢＳ）に移し、１０００×ｇで１０分間遠心し、吸引し、１％パラホルムアルデヒド
で固定した。ＬＤＬ取り込みは、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ ＬＳＲ ＩＩ）を使用して、細胞のＤｉＩ蛍光（４８８ｎｍで励起し、５７５ｎｍ
で放射）によって測定した。表面ＬＤＬ−Ｒアッセイのために、抗体を含有する無血清培
地で細胞をインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ベルシン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、
１７−７７１Ｅ）およびＦＡＣＳ緩衝液中に採取した。細胞を新たなプレートに移し、１
２００ｒｐＭで５分間遠心し、正常なウサギＩｇＧ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で
遮断した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中でウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ−Ａｌｅｘａ６４７ＩｇＧ（
５μｇ／ｍｌ）標識抗体で標識し、遠心して、洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定
した。表面ＬＤＬ−Ｒは、フローサイトメトリー（４８８ｎｍで励起し、６３３ｎｍで放
射）によって測定した。ＥＣ５０はＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して計算した
。
図１０は、本発明の抗体のコレステロール低下効果を測定するためのヒトＰＣＳＫ９注入マウスモデルの研究設計の概略を示す。ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１は、マウスＰＣＳＫ９には検出可能な結合は示さないが、ｈＰＣＳＫ９には高い親和性で結合するＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗ＰＣＳＫ９抗体である。ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０またはＬＧＴ２１１がｈＰＣＳＫ９媒介による非ＨＤＬコレステロールの上昇を阻害し、かつＰＣＳＫ９媒介による肝ＬＤＬＲの分解を防御できるかどうかを試験するために、ｈＰＣＳＫ９を含有する浸透圧ミニポンプを埋め込む（持続注入のため）３時間前にこれらの抗体を各マウスに注射した。血漿および肝臓組織採取は、ｈＰＣＳＫ９注射の２４時間後に実施した。
図１１は、注入マウスモデルにおいて、抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１による処理がヒトＰＣＳＫ９（「ｈＰＣＳＫ９」）の蓄積を引き起こしたことを示している。簡単に説明すると、全ｈＰＣＳＫ９は捕捉用にｍＡｂ７Ｄ１６を使用したＥＬＩＳＡによって測定した。ｍＡｂ７Ｄ１６はＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１よりもＰＣＳＫ９上のエピトープに結合し、全（遊離および結合）ＰＣＳＫ９を測定するために使用することができる。全ｈＰＣＳＫ９で認められた増加はおそらく、ｈＰＣＳｋＫ９／Ａｂ複合体の増加によるものであろう。遊離抗体は捕捉用にｈＰＣＳＫ９を使用するＥＬＩＳＡによって測定した。このアッセイでは、「遊離」抗体が測定され、おそらく１：１Ａｂ：ＰＣＳＫ９複合体が測定される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを媒体単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１ ２０ｍｇ／ｋｇ、またはマウス非特異的ＩｇＧ混合物（陰性対照）で処理した。個々のデータ点をプロットし、平均値は水平線で明示し、ｐ＜０．０５は有意とみなした。
血漿ＩｇＧレベルは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイ
によって定量した。遊離抗体は捕捉用のｈＰＣＳＫ９を使用して測定した。このアッセイ
では、「遊離」抗体が測定され、おそらく１：１Ａｂ：ＰＣＳＫ９複合体が測定される。
ＩｇＧ ＭＳＤアッセイでは、ＭＳＤ標準９６プレート（Ｌ１１ＸＡ−３）を使用した。
簡単に説明すると、ＰＢＳに溶かした捕捉抗原ＰＣＳＫ９−ｈｉｓ １μｇ／ｍｌの２５
から２８μｌ（２５〜２８ｎｇ／ウェル）でプレートを４℃で一晩コーティングした。コ
ーティング溶液を除去し、プレートを５％ＭＳＤブロッカーＡ（Ｒ９３ＡＡ−２）１５０
μｌ／ウェルで室温で１時間振盪して遮断した。プレートをＰＢＳ+０．０５％ Ｔｗｅ
ｅｎ−２０の３００μｌで３回洗浄した後、ＩｇＧ標準物質希釈物（ＭＳＤブロッカーＡ
で１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌまでの１０段階に希釈）、未知の血漿試料希
釈物（ＭＳＤブロッカーＡで１０，０００倍）または品質対照試料２５μｌを添加し、室
温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、検出抗体１μｇ／ｍｌ（ＭＳＤヤ
ギ抗マウスＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２ＡＣ−５、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈）２５μｌ／ウェルを添加し、室温で１時間振盪しながら
インキュベートした。洗浄し、１倍読み取り緩衝液Ｔ １５０μｌ／ウェルを添加した後
、プレートをＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ですぐに読み取った。標準
曲線および未知の試料のプロットは、ＭＳＤデータ分析ソフトウェアを使用して計算した
。
血漿ＩｇＧおよびｈＰＣＳＫ９の両レベルは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅ
ｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって定量した。ＭＳＤ ｈＰＣＳＫ９アッセイは、ＩｇＧア
ッセイと類似しているが、以下を除く。プレートを捕捉抗体（７Ｄ１６．Ｃ３：２．９５
ｍｇ／ｍｌ）１μｇ／ｍｌの２５〜２８μｌでコーティングした。ｍＡｂ７Ｄ１６はＬＧ
Ｔ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１よりもＰＣＳＫ９上のエピトープに結合し、
全（遊離および結合）ＰＣＳＫ９を測定するために使用することができる。プレートを遮
断した後、ｈＰＣＳＫ９標準物質希釈物（１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌの１
０箇所）および血漿試料希釈物（ＭＳＤブロッカーＡで１０，０００倍）２５μｌを室温
で１時間振盪しながらインキュベートし、その後１次検出抗体（ウサギ抗ＰＣＳＫ９ポリ
クローナル抗体、Ａｂ４、施設内ウサギ（ｉｎ ｈｏｕｓｅ ｒａｂｂｉｔ）ＩＤ＃ＲＢ１
１８３５）でインキュベートした。ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み
取る前に、２次検出抗体（ＭＳＤヤギ抗ウサギＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２
ＡＢ−５）によるインキュベーション工程を追加した。全ｈＰＣＳＫ９で認められた増加
はおそらく、ｈＰＣＳｋＫ９／Ａｂ複合体の増加によるものであろう。統計学的分析は、
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０２（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して群の差を分析し、
全体の差が見出されたときは、ニューマンクールズのポストホック検定を使用して処理群
の具体的な鎖を決定した。
図１２は、注入マウスモデルにおいて、抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１がｈＰＣＳＫ９媒介による分解から肝ＬＤＬ−Ｒの防御をもたらすことを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを媒体単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１ ２０ｍｇ／ｋｇ、または非特異的ＩｇＧ混合物（陰性対照）で処理した。個々の動物の肝臓試料を示す。
細胞膜試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、２０列の４〜１２％ビス−トリスＩ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｉｄｉゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＷＧ１４０２ＢＸ１０）を
使用してＭＯＰＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００１）を用いて実施した
。調製した試料は、７０℃で１０分間加熱し、氷上に置き、その後Ｍａｔｒｉｘマルチチ
ャンネルピペッターを使用して各試料１０μｌをゲル上に添加した。大きさの決定および
ゲル方向を示すため、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌ
Ｃ５９２５）を試料の横に添加した。色素の先端がゲルの底に到達するまで、ゲルを２０
０Vの定電圧で泳動した。電気泳動後、ｉＢｌｏｔユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉ
Ｂ１００１ＥＵ）を使用してゲルをニトロセルロース膜（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩＢ３０
１０−０１）に移した。移動は２０Ｖで７分間実施した。移動後、膜をＰｉｅｒｃｅ Ｓ
ｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ ３７５３６）で少なくとも３０分間遮断し
た。膜を「食品密封」袋に入れ、次いでＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中にウサギ抗ＬＤＬＲ抗体
の１：５００希釈物を添加し、その後４℃で振盪しながら一晩インキュベートした。膜を
振盪しながらＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ５回濯ぎ、その後Ｓｕｐｅｒ
ｂｌｏｃｋ中でヤギ抗ウサギＨＲＰ ２次抗体の１：３０，０００希釈物を膜に１時間添
加した。膜をＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで振盪しながら５分間ずつ５回再度濯いだ。
ＨＲＰ結合体は、Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学ルミ
ネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ ３７０７９）を使用して、製造者の指示に従って検出した
。簡単に説明すると、ペルオキシド溶液およびルミノール／エンハンサー溶液を同部ずつ
混合し、膜に５分間添加した（０．２ｍｌ／ｃｍ２）。過剰な溶液をブロッティングによ
って除去し、膜を曝露用のＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＲ Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ
８７０ １３０２）に曝露した。
図１３Ａ〜Ｃは、ｈＰＣＳＫ９注入マウスモデルにおいて、抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が血漿中の非ＨＤＬコレステロールの低下を引き起こすことを示している。ＬＧＴ２０９抗体を予め注射すると、非ＨＤＬコレステロールのｈＰＣＳＫ９媒介による上昇から４６％の防御が引き起こされた。ＬＧＴ２１０またはＬＧＴ２１１を予め注射すると、非ＨＤＬコレステロールのｈＰＣＳＫ９媒介による上昇から同等以上の防御が引き起こされた。１３Ｃ１０は、ｈＰＣＳＫ９に高い親和性で結合する有効なマウス抗ＰＣＳＫ９抗体であり、このアッセイで陽性対照として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを媒体単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２０９ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋１３Ｃ１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、またはマウス非特異的ＩｇＧ混合物（陰性対照）で処理した。個々の値は、水平線として明示した平均値で示した。血漿全コレステロールレベルを定量するために、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床用分析器（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．：Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００）を使用した。血漿試料は、ｄｄＨ２Ｏで１：３に希釈し、希釈した血漿試料４０μｌの全コレステロールレベルを製造者の指示に従って定量した。血漿ＨＤＬおよび非ＨＤＬを定量するため、Ｈｅｌｅｎａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＳｐｉｆｅ ３０００を使用してリポタンパク質コレステロール画分を得た。試料調製、ゲル調製、試料添加、ゲル電気泳動、染色、洗浄および乾燥を含む手順は全て、操作者用マニュアルの指示に従った。次に、ゲルをＱｕｉｃｋ Ｓｃａｎ ２０００でスリット５を用いて走査し、リポタンパク質コレステロール画分の相対パーセントをＨｅｌｅｎａ濃度計で計算した。最後に、ＨＤＬおよび非ＨＤＬの絶対値は、各画分のパーセントおよび全コレステロールレベルを乗ずることによって計算した。
図１４は、「典型的」ＩｇＧ１薬物動態（ＰＫ）プロファイルと比較した抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１（ヒトＩｇＧ１−サイレント）のラット（ＰＫ）プロファイルを示す。抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１の半減期は、典型的なＩｇＧ１半減期（約６日）と比較して著しく長い（７〜１３日）（例えば、ヒト対象で測定した通り）。標的媒介による体内動態（ｔａｒｇｅｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＴＭＤ）の証拠はなく、抗体は齧歯類のＰＣＳＫ９と交差反応しないことが示された。各試験抗体１０ｍｇ／ｋｇを３匹のオスＬｅｗｉｓラットに注射した。０、１、６、２４時間後、２、４、８および１６日後に、血液２５０μｌを採取し、血漿を清澄にし、希釈し、回収したヒト全抗体を測定するために捕捉ＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ）で評価した。標準曲線も各試験抗体のために作成した。回収されたＩｇＧの量は、ラットにおける典型的なヒトＩｇＧの予測回収に対してグラフにした。
１．導入
本発明の抗体および抗原結合分子は特異的にプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケ
キシン９ａ型（「ＰＣＳＫ９」）に結合する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合
分子は、ＰＣＳＫ９のＣ末端に結合し、ＰＣＳＫ９の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤ
Ｌ−Ｒ）への結合を妨害することなくＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬ−Ｒの分解を妨害する
という予期せぬ特性を備えている。特に、抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子はＰＣＳ
Ｋ９の残基６８０〜６９２内のエピトープ、例えば、ＰＣＳＫ９のＣ末端に位置するアミ
ノ酸配列ＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ（配列番号４９）内のエピトープに結合する。本発
明の抗体および抗原結合分子は循環しているＰＣＳＫ９だけでなく細胞に結合している間
のＰＣＳＫ９にも結合するので、患者におけるインビボ半減期は比較的長く、例えば、少
なくとも約７日以上で、いくつかの実施形態では、投与後少なくとも２週間脂質低下効果
を実現する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９のアンタゴニ
ストで、ＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９媒介による分解を低下および／または阻害し、それによ
って低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の取り込み増加を促進する。抗
ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、例えば、脂質代謝異常、高コレステロール血症、
トリグリセリド血症およびその他のＰＣＳＫ９媒介による病的状態に罹患した対象の治療
に用途が見出される。
２．改善された抗ＰＣＳＫ９抗体一般論
抗ＰＣＳＫ９抗体断片は、限定はしないが、組換え発現、化学合成および抗体４量体の
酵素的消化を含む当業界で公知の任意の手段によって生成することができる一方、完全長
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生成によって得ることがで
きる。組換え発現は、当業界で公知の適切な任意の宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞、
細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などから行うことができる。存在するならば
、抗ＰＣＳＫ９抗体の定常領域は任意の型または亜型であってもよく、適切ならば、本発
明の方法によって処理した対象の種［例えば、ヒト、非ヒト霊長類またはその他の哺乳類
、例えば、農業用哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、家畜哺乳類（
例えば、イヌ、ネコ）または齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ）］
由来であるように選択することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は
ヒト化またはＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）される。いくつかの実施形態では、定常領域
アイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇ
Ｇ１定常領域は、細胞または補体のＣ１成分上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、Ｆｃガ
ンマＲ１などのエフェクターリガンドに対する結合親和性が低下するように変異させる。
例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照のこと。このような変異を含有する抗体
は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の低下また
は欠如をもたらす。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４
およびＬ２３５は、Ａｌａ２３４およびＡｌａ２３５に置換する。重鎖定常領域中の残基
の番号は、ＥＵインデックスの番号である（Kabat, et al., (1983) “Sequences of Pro
teins of Immunological Interest,” U.S. Dept. Health and Human Servicesを参照の
こと）。例えば、Woodle, et al, Transplantation (1999) 68(5):608-616; Xu, et al.,
Cell Immunol (2000) 200(1):16-26; and Hezareh, et al., J Virol 75(24):12161-8も
参照のこと。
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子には、ラクダ科の骨格を有する単一ドメ
イン抗原結合単位も含まれる。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマおよびアルパカが含ま
れる。ラクダ科は軽鎖の欠如した機能的抗体を生成する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは自
動的に折り畳まれ、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面には、古典的な
抗原結合分子（Ｆａｂ）または１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の６個のＣＤＲと比較して、
３個のみのＣＤＲが含まれる。ラクダ科抗体は、従来の抗体と同程度の結合親和性に達す
ることができる。本明細書で例示した抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特異性を備えたラクダ科骨
格をベースにした抗ＰＣＳＫ９分子は、当業界で周知の方法、例えば、Dumoulin et al.,
Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002；Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-5
26, 1997およびBond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003を使用して生成することが
できる。
本発明の改善された抗ＰＣＳＫ９抗体は、参照抗体の特異性および親和性を保持しなが
ら、ヒト生殖系列Ｖ領域配列と実質的にアミノ酸配列が同一なＶ領域配列を有する遺伝子
操作されたヒト抗体である。いずれも本明細書に参考として組み込んだ米国特許出願公開
第２００５／０２５５５５２号および米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号を
参照のこと。改善のプロセスでは、参照抗体の可変領域から抗原結合特異性を決定するた
めに必要な最小限の配列情報を確認し、その情報をヒトの部分的Ｖ領域遺伝子配列のライ
ブラリーに移してヒト抗体Ｖ領域のエピトープを焦点に当てたライブラリーを作製する。
微生物をベースにした分泌系を使用して、抗体Ｆａｂ断片としてライブラリーのメンバー
を発現し、例えば、コロニーリフト結合アッセイを使用して、このライブラリーの抗原結
合Ｆａｂをスクリーニングする。例えば、米国特許出願公開第２００７／００２０６８５
号参照。陽性クローンはさらに、最高の親和性を有するものとして特徴付けることができ
る。遺伝子操作して得られたヒトＦａｂは、親、参照抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特異性を保
持しており、通常、親抗体と比較して抗原に対して同等またはより高い親和性を有し、ヒ
ト生殖系列Ｖ領域に匹敵した高い程度の配列同一性を有するＶ領域を有する。
エピトープを焦点とするライブラリーを作製するために必要な最小限の結合特異性決定
基（ＢＳＤ）は通常、重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）内の配列、および軽鎖のＣＤＲ３
（「ＣＤＲＬ３」）内の配列によって表される。ＢＳＤは、ＣＤＲ３の一部または完全長
を含んでいてもよい。ＢＳＤは、連続または非連続アミノ酸残基から構成され得る。場合
によっては、エピトープを焦点とするライブラリーは、ＢＳＤおよびヒト生殖系列Ｊセグ
メント配列を含有する参照抗体の特有のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に結合したヒトＶセグメン
ト配列から構成される（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号を参照のこと）
。あるいは、ヒトＶセグメントライブラリーは、参照抗体Ｖセグメントの一部のみがヒト
配列のライブラリーによって最初に置換される連続的カセット置換によって作製され得る
。残存する参照抗体アミノ酸配列の場合に結合を支持する同定されたヒト「カセット」は
、その後、完全なヒトＶセグメントを作製するために第２のライブラリースクリーンに再
結合される（米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号を参照のこと）。
いずれの場合においても、参照抗体の特異性決定基を含有する、対になった重鎖および
軽鎖ＣＤＲ３セグメント、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメント、またはＪセグメントは、ライブ
ラリーから得られた抗原結合部が参照抗体のエピトープ特異性を保持するように、結合特
異性を制限するように使用される。最適な結合速度を備えた抗体を同定するために、ライ
ブラリー構築中に各鎖のＣＤＲ３領域に、成熟した変化をさらに導入することができる。
得られた遺伝子操作されたヒト抗体は、ヒト生殖系列ライブラリーから得られたＶセグメ
ント配列を有し、ＣＤＲ３領域内の短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖系列フレームワー
ク４（ＦＲ４）領域を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、元の、または参照モノク
ローナル抗体から得られた重鎖および軽鎖のＣＤＲ３内の最小限の結合配列決定基（ＢＳ
Ｄ）を含有する。重鎖および軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲ）の残存する配列、例えば
、ＶセグメントおよびＪセグメントは、対応するヒト生殖系列および親和性成熟したアミ
ノ酸配列由来である。Ｖセグメントは、ヒトＶセグメントライブラリーから選択すること
ができる。さらなる配列の改良は、親和性成熟によって達成することができる。
他の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖および軽鎖は、例えば、ヒトＶセグメント
ライブラリーから選択される、対応するヒト生殖系列配列のヒトＶセグメント（ＦＲ１−
ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）および元のモノクローナル抗体のＣＤＲ３−ＦＲ
４配列セグメントを含有する。ＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントはさらに、配列セグメン
トを対応するヒト生殖系列配列で置換することによって、かつ／または親和性成熟によっ
て改良することができる。例えば、ＦＲ４および／またはＢＳＤを取り囲むＣＤＲ３配列
は、対応するヒト生殖系列配列で置換することができ、元のモノクローナル抗体のＣＤＲ
３のＢＳＤは保持される。
いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＶｈ１−０
２である。いくつかの実施形態では、重鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＪ
Ｈ４である。いくつかの実施形態では、重鎖Ｊセグメントは、ヒト生殖系列ＪＨ４の部分
的配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５０）を含む。ヒト生殖系列ＪＨ４の完全長Ｊ
セグメントは、ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５１）である。可変領域遺伝
子は、イムノグロブリン可変領域遺伝子の標準的命名法を基準とする。現在のイムノグロ
ブリン遺伝子情報は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のワールドワ
イドウェブ、Ｖ−ｂａｓｅおよびＰｕｂＭｅｄデータベースから利用可能である。Lefran
c, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16；Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;
18(3):161-74；Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54およびGiudicelli, et al., N
ucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61も参照のこと。
いくつかの実施形態では、軽鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＶＫ３ Ｌ
６である。いくつかの実施形態では、軽鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＪ
ｋ２である。いくつかの実施形態では、軽鎖Ｊセグメントは、ヒト生殖系列Ｊｋ２の部分
的配列ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５２）を含む。ヒト生殖系列Ｊｋ２の完全長Ｊセ
グメントは、ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５３）である。
いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶ
ＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ（Ｄ／Ｔ）ＭＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷ
ＭＧＲＩＤＰＡＮ（Ａ／Ｅ／Ｇ）ＨＴＮＹ（Ａ／Ｄ）（Ｐ／Ｑ）ＫＦＱ（Ａ／Ｇ）ＲＶＴ
ＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２８）と少な
くとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％また
は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミ
ノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＴＭＹＭＳＷ
ＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＡＮＥＨＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩ
ＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２７）と少なくとも８５％、
８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配
列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、軽鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列（Ｅ／Ｑ）ＩＶ（Ｌ／Ｍ
）ＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（Ｒ／Ｓ）ＡＳ（Ｑ／Ｓ）ＳＶＳＹＭＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（Ｇ／Ｌ）（Ｔ／Ｖ）Ｆ（Ｎ／Ｒ）（Ｌ／Ｒ）Ａ（Ｓ／Ｔ）
ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＧＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号３１）
と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは
、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＨ
ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＶＦＲＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ
ＩＧＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号２９）と少なくとも８５％、８９％、９０％、
９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する
。いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬ
ＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＶＦ
ＲＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＧＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番
号３０）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＹＹＹＹ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）
（配列番号１４）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域は、アミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を
含む。
いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列（Ｄ／Ｔ）ＭＹＭＳ（配列番
号８）を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＤＰＡＮ（Ａ／Ｅ／Ｇ）ＨＴＮＹ（Ａ／Ｄ）（
Ｐ／Ｑ）ＫＦＱ（Ａ／Ｇ）（配列番号１１）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＳＹＹＹ
Ｙ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）（配列番号１４）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可
変領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列（Ｒ／Ｓ）ＡＳ（Ｑ／Ｓ）Ｓ
ＶＳＹＭＨ（配列番号２２）を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列（Ｇ／Ｌ）（Ｔ／Ｖ）Ｆ（Ｎ
／Ｒ）（Ｌ／Ｒ）Ａ（Ｓ／Ｔ）（配列番号２５）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＬＱ
ＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＦＲ１、
配列番号３３のアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＦＲ３お
よび配列番号３５のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定したアミノ酸配列は、１個ま
たは複数の置換されたアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１個または２個の保存
的に置換されたアミノ酸を有することができる。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号３６のアミノ酸配列を含むＦＲ１、
配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＦＲ３お
よび配列番号３９のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定したアミノ酸配列は、１個ま
たは複数の置換されたアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１個または２個の保存
的に置換されたアミノ酸を有することができる。
完全長にわたって、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の可変領域は一般的に、可変領域全体（
例えば、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）が対応する
ヒト生殖系列可変領域アミノ酸配列と少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖は、ヒ
ト生殖系列可変領域Ｖｈ１−０２に対して少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の
アミノ酸配列同一性を有する。抗ＰＣＳＫ９抗体の軽鎖は、ヒト生殖系列可変領域ＶＫ３
Ｌ６に対して少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する
。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域内のアミノ酸のみが添加、欠失または置
換されている。いくつかの実施形態では、配列同一性の比較にはＣＤ３を除外する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号４０の重鎖可変領域
に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変
領域を含み、配列番号４１の軽鎖可変領域（すなわち、コンセンサス配列）に対して少な
くとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む
。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号１の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領
域を含み、配列番号１５の軽鎖可変領域（すなわち、マウスＬＦＵ７２０）に対して少な
くとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む
。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領
域を含み、配列番号１６の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２０９）に対して少なくと
も８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領
域を含み、配列番号１８の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１０）に対して少なくと
も８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号４の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領
域を含み、配列番号１６の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１１）に対して少なくと
も８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号３の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペ
プチドを含み、配列番号１７の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２０９）に対して少な
くとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを
含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号３の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペ
プチドを含み、配列番号１９の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１０）に対して少な
くとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを
含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号５の重鎖可変領域に
対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペ
プチドを含み、配列番号１７の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１１）に対して少な
くとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを
含む。
アミノ酸の長さが２０個未満の同定されたアミノ酸配列では、１個または２個の保存的
アミノ酸残基置換が許容得る一方、所望する特異的結合および／またはアンタゴニスト活
性を依然として保持される。
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は一般的にＰＣＳＫ９に結合し、平衡解離定数（ＫＤ）は約
１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ未満、例えば、約１０−１０Ｍまたは１０−１１Ｍ未満、い
くつかの実施形態では、約１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満である。
抗ＰＣＳＫ９抗体は、所望により多量体化し、本発明の方法に従って使用することがで
きる。抗ＰＣＳＫ９抗体は、完全長４量体抗体（すなわち、２本の軽鎖および２本の重鎖
を有する）、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）または１個もしくは複数の抗原結合部位を
形成し、ＰＣＳＫ９結合特異性を付与する抗体断片、例えば、重鎖および軽鎖可変領域（
例えば、Ｆａｂ’またはその他の類似の断片）を含む分子であってもよい。
本発明はさらに、本明細書で記載した抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、重
鎖または軽鎖可変領域または本明細書で記載した相補性決定領域を含むセグメントをコー
ドするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌ
クレオチドは、配列番号４２、配列番号４３および配列番号５４からなる群から選択され
るポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する
。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４４、配列
番号４５および配列番号５５からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８
５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４２のポリ
ヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。い
くつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４５（すなわち
、ＬＧＴ−２０９）のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核
酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４２からな
る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸
配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、
配列番号４４（すなわち、ＬＧＴ−２１０）からなる群から選択されるポリヌクレオチド
と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４３からな
る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸
配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、
配列番号４５（すなわち、ＬＧＴ−２１１）からなる群から選択されるポリヌクレオチド
と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４のポリ
ヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。い
くつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５（すなわち
、マウスＬＦＵ７２０）のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
の核酸配列同一性を有する。
３．抗ＰＣＳＫ９抗体を同定するためのアッセイ
アンタゴニスト抗体は、抗ＰＣＳＫ９抗体を生成し、各抗体のＰＣＳＫ９媒介による現
象、例えば、ＬＤＬＲへの結合、ＬＤＬＲ分解の促進を低下させるかまたは阻害する能力
を試験することによって同定することができる。このアッセイは、インビボまたはインビ
トロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で実施することができる。好ましい抗体はＰＣＳＫ９に結合し
、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを防御せず、ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解
を低下させるかまたは阻害する。
抗体または抗原結合分子のＰＣＳＫ９への結合は、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉ
ａｃｏｒｅおよびウェスタンブロットを含む当業界で公知の任意の方法を使用して測定す
ることができる。
ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解はまた、当業界で公知の任意の方法を使用して測
定することができる。一実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子がＬＤＬＲ
分解を阻害する能力は、注入マウスモデルを使用して測定する。抗ＰＣＳＫ９抗体または
抗原結合分子をマウスに静脈内注入し（例えば、３μｇ／時間）、肝臓膜調製物中のＬＤ
ＬＲのレベルを、対照抗体（例えば、無関連の抗原に結合する）の静脈内注入を受けたマ
ウスの肝臓膜調製物中のＬＤＬＲのレベルと比較して測定した。アンタゴニスト抗ＰＣＳ
Ｋ９抗体を受けたマウスは、対照抗体を受けたマウスと比較して、検出可能な高レベルの
、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、１００％高いＬＤＬＲを有する
だろう。
抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体はまた、ＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全
コレステロールの血漿レベルの低下における治療効果を試験することができる。抗ＰＣＳ
Ｋ９抗体または抗原結合分子を哺乳類（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）
に静脈内注入し（例えば、３μｇ／時間）、ＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全
コレステロールの血漿レベルを、処理前の同じ哺乳類または対照抗体（例えば、無関連の
抗原に結合する）の静脈内注入を受けた哺乳類のＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／また
は全コレステロールの血漿レベルと比較して測定する。アンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体
を受けた哺乳類は、例えば、処理前の哺乳類または対照抗体を受けた哺乳類と比較して、
検出可能に低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、１００％低いＬ
ＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの血漿レベルを有するだろう。
４．抗ＰＣＳＫ９抗体を含む組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化した本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体また
は抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、所与の障害を治療または予
防するために適しているその他の治療薬をさらに含有することができる。薬学的担体は、
組成物を増強するか、または安定化し、あるいは、組成物の調製を容易にする。薬学的に
許容される担体には、生理学的に適合した溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤およ
び抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。
本発明の医薬組成物は、当業界で公知の様々な方法によって投与することができる。投
与の経路および／または様式は、所望する結果に応じて変化する。投与は、静脈内、筋肉
内、腹腔内または皮下に投与するか、あるいは標的部位の近位に投与することが好ましい
。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、鼻腔内、吸入、脊髄内ま
たは腸内投与（例えば、注射または注入による）に適しているべきである。投与経路に応
じて、活性化合物、すなわち、抗体、二特異性および多特異性分子は、酸による作用およ
び化合物を不活性化することができるその他の天然の状態から化合物を防御するための材
料でコーティングしてもよい。
抗体は、単独でまたはその他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与するエア
ロゾル製剤にすることができる（すなわち、「噴霧」することができる）。エアロゾル製
剤は、例えば、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容できる加圧噴射剤に
入れることができる。
いくつかの実施形態では、組成物は滅菌されており、流体である。適切な流動性は、例
えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には必要な粒
径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することがで
きる。多くの場合、組成物には等張化剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトール
などのポリアルコールおよび塩化ナトリウムを含めることが好ましい。吸収を遅延させる
薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることに
よって、注射可能な組成物を長期にわたって吸収させることができる。
本発明の医薬組成物は、当業界で周知であり、日常的に実施されている方法によって調
製することができる。薬学的に許容される担体は、投与する特定の組成物によって、なら
びに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度決定される。した
がって、本発明の医薬組成物の適切な製剤は多種多様である。抗体を製剤化するため、な
らびに適切な用量および計画を決定するために適用できる方法は、例えば、それぞれ本明
細書に参考として組み込んだRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st
Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wil
kins (2005)およびMartindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London
: Pharmaceutical Press.およびMartindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31
st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical AssnおよびSustained and Controlled Releas
e Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
に見出すことができる。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。通常
、抗ＰＣＳＫ９抗体の治療有効量または効果用量を本発明の医薬組成物に使用する。抗Ｐ
ＣＳＫ９抗体は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化す
る。投与計画は、所望する応答（例えば、治療応答）を実現するために調節する。治療ま
たは予防有効用量の決定において、低用量を投与し、その後、所望する応答が、最小限の
副作用で、または副作用なく実現するまで徐々に増加させることができる。例えば、１回
で大量投与してもよく、数回に分けて徐々に投与してもよく、または、治療状況の緊急性
によって必要に応じて用量を減少させるか、または増加させてもよい。投与を簡便にし、
投薬を一定にするためには、非経口組成物を投与単位形態に製剤化すると特に有利である
。本明細書で使用した投与単位形態とは、治療する対象のための単位製剤として適当な物
理的に分離された単位のことで、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望する治療効果を
生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性を有さず、
特定の患者、組成物および投与様式について所望する応答を実現するために有効な活性成
分の量を得るために変化させることができる。選択した用量レベルは、使用した本発明の
特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性を含む様々な薬物動態因子、投
与経路、投与時間、使用した特定の化合物の***速度、治療期間、使用した特定の組成物
と併用したその他の薬剤、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重
、症状、一般的健康状態および既往歴などの要素によって左右される。
いくつかの実施形態では、薬理学的組成物には、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子
および第２の薬理学的作用物質の混合物が含まれる。例えば、組成物には、本発明の抗Ｐ
ＣＳＫ９抗体または抗原結合分子およびＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび全コレステロー
ルを含むコレステロールを低下させるため、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるため
に有益であることが知られている薬剤を含めてもよい。
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子と混合して含めるための
第２の薬剤の例には、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（すなわち、スタ
チン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラ
ート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびその類似体、コレス
テロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセ
ベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン様物質（例えば、化合
物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、二重
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、
アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ア
シルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、ニーマンピ
ックＣ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（
ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク
質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的
とする阻害性核酸が含まれる。脂質低下剤は当業界では公知で、例えば、Goodman and Gi
lman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and P
arker, Eds., McGraw-Hill (2006); 2009 Physicians’ Desk Reference (PDR)、例えば
、63rd (2008) Eds., Thomson PDRに記載されている。
本発明の組成物で使用する他の脂質低下剤は、例えば、Chang, et al., Curr Opin Dru
g Disco Devel (2002) 5(4):562-70；Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47；B
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2009) 52(6):1558-68およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8
:308-320に記載および／または概説されている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はスタチンと
の混合物として形成される。スタチンの例には、限定はしないが、アトルバスタチン、セ
リバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバ
スタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレス
テロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬理学的作用物質との混合物として提
供される。例えば、第２の薬理学的作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビ
ル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザ
ナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダウラナビル、アバカビル−ラミブジン−
ジドブジン（トリジビル）であってもよい。いくつかの実施形態では、この第２の薬理学
的作用物質はタクロリムスである。
５．抗ＰＣＳＫ９抗体の使用方法
ａ．抗ＰＣＳＫ９抗体による治療を受ける状態
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９の活性ま
たは過剰活性によって媒介される任意の病的状態の治療において用途が見出される。
例えば、様々な理由または病因のために脂質代謝異常または高コレステロール血症を発
症する危険性を有するか、またはその危険性に瀕している個体は、本発明の抗ＰＣＳＫ９
アンタゴニスト抗体および抗原結合分子の投与によって利益を得る可能性がある。例えば
、個体は、機能的ＬＤＬ−Ｒが存在する家族的または遺伝的に伝達されたホモ接合的また
はヘテロ接合的高コレステロール血症を有していてもよい。家族的または遺伝的に受け継
がれた高コレステロール血症に関連した、および／または原因となる遺伝子変異は、例え
ば、Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26にまとめて記載されて
いる。個体はまた、脂質代謝異常または高コレステロール血症を発症する危険性に関与す
るか、または危険性を増大させるその他の病的状態を有するか、または行動をとっていて
もよい。例えば、個体は肥満であるか、または糖尿病もしくは代謝異常症候群に罹患して
いてもよい。個体は、喫煙者であってもよく、ほとんど体を動かさない生活を送っていて
いてもよく、またはコレステロールの高い食事をとっていてもよい。
ＰＣＳＫ９の標的化は、脂質代謝異常、高コレステロール血症および食後トリグリセリ
ド血症の軽減、回復、阻害または予防のために有用である。例えば、Le May, et al., Ar
terioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29(5):684-90；Seidah, Expert Opin Ther Target
s (2009) 13(1):19-28およびPoirier, et al., J Biol Chem (2009) PMID 19635789を参
照のこと。したがって、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子の
投与は、脂質代謝異常、高コレステロール血症および食後トリグリセリド血症の軽減、回
復、阻害および予防を必要とする個体における脂質代謝異常、高コレステロール血症およ
び食後トリグリセリド血症の軽減、回復、阻害および予防に用途が見出される。
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、低密度リポタンパク
質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の減少または低下を必要とする個体における低密度リポ
タンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の減少または低下に用途が見出される。個体は
、ＬＤＬ−Ｃのレベルが持続的に上昇していてもよい。いくつかの実施形態では、個体は
、ＬＤＬ−Ｃ血漿レベルが一貫して８０ｍｇ／ｄＬを上回り、例えば、９０、１００、１
１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬを
上回る。本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子はまた、非高密度
リポタンパク質コレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）または全コレステロールの減少または低
下を必要とする個体における非高密度リポタンパク質コレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）ま
たは全コレステロールの減少または低下に用途が見出される。
個体は、コレステロールを低下させるために別の薬理学的作用物質を既に摂取していて
、この薬剤に耐性または不耐性であってもよい。例えば、個体は、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ
−Ｃまたは全コレステロールの許容されるレベルまでの低下においてこの個体では無効で
あることが証明されたスタチンの治療計画下に既にあってもよい。個体はまた、スタチン
の投与に不耐性であってもよい。本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結
合分子とＬＤＬ−Ｃまたは非ＨＤＬ−Ｃの低下および／またはＨＤＬ−Ｃの上昇に有用な
第２の薬剤との併用投与は、例えば、投与する第２の薬剤の用量の低下を可能にすること
によって、第２の薬剤の有効性および耐性を改善する。
いくつかの実施形態では、個体は、例えば、ＬＤＬＲの分解の異常な増加を引き起こす
ＰＣＳＫ９遺伝子の機能獲得型変異を有する。
いくつかの実施形態では、個体は、脂質代謝異常または高コレステロール血症を誘導す
る薬理学的作用物質を投与されており、すなわち、個体は薬剤誘導性の脂質代謝異常また
は高コレステロール血症である。例えば、個体は、例えば、ＨＩＶ感染を治療するために
プロテアーゼ阻害剤の治療計画を受けていてもよい。血漿トリグリセリドレベル上昇の原
因となることが知られている別の薬理学的作用物質は、移植患者に投与される免疫抑制剤
、タクロリムスである。シクロスポリンは、ＬＤＬを著しく増加させることが示されたこ
とがある。例えば、Ballantyne, et al. (1996) 78(5):532-5を参照のこと。第２世代抗
精神病薬（例えば、アリピプラゾール、クロザピン、オランザピン、クエチアピン、リス
ペリドンおよびジプラシドン）はまた、脂質代謝異常に関連している。例えば、Henderso
n, J Clin Psychiatry (2008) 69(2):e04 and Brooks, et al., Curr Psychiatry Rep (2
009) 11(1):33-40を参照のこと。
ｂ．抗ＰＣＳＫ９抗体の投与
医師または獣医師は、医薬組成物中において使用する本発明の抗体の用量を所望する治
療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望する効果が実現す
るまで投薬量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効用量は
、治療する特定の疾患または症状、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者が
ヒトであるかまたは動物であるか、その他の投与された治療薬、および処置が予防的であ
るかまたは治療的であるかを含む多種多様な要素に応じて変化する。治療投薬は、安全性
および効果を最適にするために用量設定する必要がある。抗体の投与については、投薬量
は宿主体重当たり約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１から５ｍｇ
／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重また
は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。投薬は、必要があれば、または所望であ
れば、毎日、毎週、２週間毎、毎月またはそれより多いかもしくは少なくてもよい。治療
計画の例には、週１回、２週間に１回または月１回または３から６ヵ月に１回の投与が含
まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子をコードする
ポリヌクレオチドを投与する。薬剤が核酸である実施形態では、典型的な投薬量は約０．
１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重まで（約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む）の
範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重と約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間であってもよい。いくつ
かの実施形態では、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍ
ｇ／ｋｇ体重である。
抗体は、１回または分割投与で投与することができる。抗体は通常、様々な場合に投与
される。１回の投薬の間隔は、必要または所望により、１週間、２週間、１ヵ月または１
年であってもよい。間隔はまた、患者における抗ＰＣＳＫ９抗体の血液レベルを測定する
ことによって指示して、不規則であってもよい。いくつかの方法では、投薬量は、血漿抗
体濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの場合では２５〜３００μｇ／ｍｌを実現する
ように調節する。あるいは、抗体は、より少ない頻度での投与を必要とする場合では、徐
放製剤として投与することができる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に
応じて変化させる。一般的に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半
減期を示す。投与の投薬量および頻度は、処置が予防であるか、または治療であるかに応
じて変化させることができる。予防適用では、比較的低用量が比較的少ない頻度の間隔で
、長期間にわたって投与される。患者によっては、残りの人生において治療を受け続ける
。治療適用では、疾患の進行が抑えられるか、または停止するまで、好ましくは患者が疾
患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要と
されることが時々ある。その後、患者は予防的投与計画を受けることができる。いくつか
の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合剤は、患者の血漿ＬＤＬ−Ｃレベルが
予め決定した閾値レベルを上回るとき、例えば、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ、例えば、
少なくとも約９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０
、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上のときに投与される。
ｃ．第２の薬剤との同時投与
ＰＣＳＫ９抗体アンタゴニストは、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび全コレステロール
を含むコレステロールを低下させるため、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるために
有益であることが知られている薬剤と組み合わせて使用することができる。
活性薬剤は抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体と混合して一緒に投与することができるか
、または各薬剤は別々に投与することができる。抗体薬剤およびその他の活性剤は同時に
投与することができるが、同時に投与する必要はない。
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子との同時投与で使用する
ための第２の薬剤の例には、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（すなわち
、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフ
ィブラート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびその類似体、
コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、
コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン様物質（例えば
、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤
、二重ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニ
スト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害
剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、ニー
マンピックＣ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセ
ット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タ
ンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００
を標的とする阻害性核酸が含まれる。
使用する他の脂質低下剤は、例えば、Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2
002) 5(4):562-70；Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47；Bays and Stein, E
xpert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38；Kastelein, Int J Clin Pract Suppl
(2003) Mar(134):45-50；Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89；Te
nenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53；Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2
):S241-S248；Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8；Oh, et al
., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7；Birch, et al, J Med Chem (2009) 52(6):1558
-68およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載お
よび／または概説されている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はスタチンと
同時投与される。スタチンの例には、限定はしないが、アトルバスタチン、セリバスタチ
ン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、
ロスバスタチンおよびシンバスタチンが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレス
テロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬理学的作用物質と同時投与される。
例えば、第２の薬理学的作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナ
ビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホ
スアンプレナビル、チプラナビル、ダウラナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン
（トリジビル）であってもよい。いくつかの実施形態では、この第２の薬理学的作用物質
はタクロリムスである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、ＰＣＳＫ
９またはａｐｏＢ１００を特異的に標的とする阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ
ＮＡ、アンチセンス配列、リボザイム）と共に同時投与する。
６．キット
本発明の医薬組成物はキットで提供することができる。ある実施形態では、本発明のキ
ットは、本明細書で記載したように、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗
原結合分子を含む。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は均一に、または様々な投薬量
で提供することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載したように、１種または複数の第
２の薬理学的作用物質を含む。第２の薬理学的作用物質は、同じ製剤中に、または抗ＰＣ
ＳＫ９抗体または抗原結合分子とは別の製剤中に提供することができる。第１および第２
の薬剤の投薬量は、独立して均一であるか、または変化させてもよい。
いくつかの実施形態では、キットは、ＰＣＳＫ９抗体アンタゴニストならびに（ａｎ）
ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび全コレステロールを含むコレステロールを低下させ、か
つ／またはＨＤＬ-Ｃを上昇させるために有益であることが知られている１種または複数
の薬剤を含む。
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子を含むキットに含めるた
めの第２の薬剤の例には、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（すなわち、
スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィ
ブラート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびその類似体、コ
レステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コ
レセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン様物質（例えば、
化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、
二重ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニス
ト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤
、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、ニーマ
ンピックＣ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセッ
ト（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タン
パク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を
標的とする阻害性核酸が含まれる。
キットで使用する他の脂質低下剤は、例えば、Chang, et al., Curr Opin Drug Disco
Devel (2002) 5(4):562-70；Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47；Bays and
Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38；Kastelein, Int J Clin Prac
t Suppl (2003) Mar(134):45-50；Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):37
5-89；Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53；Tomkin, Diabetes Care (20
08) 31(2):S241-S248；Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8；O
h, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7；Birch, et al, J Med Chem (2009) 52
(6):1558-68およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320
に記載および／または概説されている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はスタチンと
共にキットに供給した。スタチンの例には、限定はしないが、アトルバスタチン、セリバ
スタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタ
チン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレス
テロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬理学的作用物質と共にキットに供給
する。例えば、第２の薬理学的作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、
リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビ
ル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダウラナビル、アバカビル−ラミブジン−ジド
ブジン（トリジビル）であってもよい。いくつかの実施形態では、この第２の薬理学的作
用物質はタクロリムスである。
以下の実施例は、限定はしないが請求した本発明を例示するために挙げる。
実施例１：Ｐｃｓｋ９アンタゴニストＮＶＰＬＦＵ７２０の生成および同定
概要
Ｐｃｓｋ９に対する機能的抗体アンタゴニストを作製するために研究を行った。タンパ
ク質のＨｉｓタグ型に結合することができる抗体を分泌する多数のハイブリドーマを同定
した。ハイブリドーマからの抗体は、ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬコレステロール取り込み能
力を増加させるＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬ受容体のＰｃｓｋ９媒介による分解を阻害する
能力で測定した機能的アンタゴニスト活性で評価した。潜在的な機能的マウス抗ヒトＰｃ
ｓｋ９ ＩｇＧ１−カッパモノクローナル抗体を同定し、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０（ＬＦＵ
７２０）と称した。
方法
抗原およびその他のタンパク質
ヒトＰｃｓｋ９タンパク質を分泌する安定した発現細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｆｒｅｅｓ
ｔｙｌｅ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）の形質移入に
よって作製した。簡単に説明すると、ＢｉｏＣｏａｔフラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ）でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％
牛胎児血清中で接着させて培養した細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商
標）形質移入試薬およびメリチンシグナル配列を特徴とする組換えプラスミド、成熟Ｐｃ
ｓｋ９ ｃＤＮＡ（アミノ酸３１〜６９２）および配列のＣ末端のｈｉｓ６（配列番号５
７）タグ（Ｅ．Ｈａｍｐｔｏｎ、ＧＮＦ、ＮＰＬ０１００５１によってクローニングされ
た）を使用して形質移入した。形質移入して４８時間後、ゼオシン１００μｇ／ｍｌを培
養培地に添加することによって陽性形質移入体の選択を開始した。４週間後、Ｐｃｓｋ９
産生細胞の４つの安定した収集物が出現した。最も産生が多いプール４をＦｒｅｅｓｔｙ
ｌｅ（商標）培地中で無血清懸濁条件に適応させ、その後、生成用量の規模が１０〜２０
ＬのＷａｖｅ（商標）バイオリアクターを使用して、大量生成のために規模を拡大した。
時間をかけて数回培養を実施し、組換えタンパク質は１２および３０ｍｇ／Ｌの間の生
成率で生成した。細胞上清を収集し、クロスフロー濾過によって濃縮した。得られた濃縮
物を２５ｍｌ ＮｉＮＴＡ Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｔｒｉｓ
５０ｍＭ／ＮａＣｌ ３００ｍＭ／ＣａＣｌ２ １ｍＭ／β−メルカプトエタノール ２
ｍＭ、ｐＨ７．４で平衡化）に０．５ｍｌ／分で添加した。ベースラインに達した後、Ｔ
ｒｉｓ ５０ｍＭ／ＮａＣｌ ３００ｍＭ／イミダゾール ２０ｍＭ、ｐＨ７．４で洗浄
して、結合した物質はＴｒｉｓ ５０ｍＭ／ＮａＣｌ ３００ｍＭ／イミダゾール ２５
０ｍＭ、ｐＨ７．４で溶出した。得られた溶出液をＰＢＳ、ｐＨ７．３で透析し、滅菌濾
過して分取した。重合化を測定するため、分析用分子ふるいクロマトグラフィーによって
試料を分析した。精製したタンパク質から得られたＨＰＬＣクロマトグラムは、２本のピ
ークを示し、主要なピークが８５％を占める。完全長タンパク質のＨＰＬＣ−ＥＳＩ Ｍ
Ｓ分析によって、質量は５８１７６．０Ｄａで、全システイン残基が酸化したメリチン−
ｈｓＰｃｓｋ９アミノ酸３１〜６９２−Ｈｉｓから予測された質量に一致していることが
明らかである。試料の一部はさらにＮグリコシル化されている。混入する質量約１３ｋＤ
のタンパク質は、おそらくタンパク質の遊離プロドメインに類似している。マウスおよび
カニクイザルの対応するＰｃｓｋ９相同体は、Ｆｒｅｅｓｔｕｌｅ培地中の無血清懸濁液
中で培養したＨＥＫ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を再度使用して、大規模一時発現法
で生成した。組換えプラスミド、天然のリーダー配列およびＣ末端のｈｉｓ６（配列番号
５７）タグを特徴とするマウスＰｃｓｋ９ ｃＤＮＡならびにＣＤ３３リーダー配列およ
びＣ末端ｈｉｓ６（配列番号５７）タグを特徴とするｃｙｎｏ Ｐｃｓｋ９を、プラスミ
ドＤＮＡの担体としてポリエチレンイミンを１：３（μｇ／ｍｌ：μｇ／ｍｌ ＤＮＡ：
ＰＥＩ）の比で使用して、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に形質移入した。生成操作は、Ｗａｖ
ｅ（商標）バイオリアクターにおいて１０リットルの規模で実施し、タンパク質精製およ
び特徴付けは、ヒトＰｃｓｋ９タンパク質で前述したプロトコールと同様に実施した。マ
ウスＰｃｓｋ９タンパク質の収率は０．７と２．７ｍｇ／Ｌ培養物の間であり、ｃｙｎｏ
Ｐｃｓｋ９は３．１ｍｇ／Ｌで得られた。
ハイブリドーマ作製
マウスの免疫およびハイブリドーマの生成
Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇｎ（ｂｃｌ−２）２２ｗ
ｅｈｉ種）を免疫する前に、精製Ｐｃｓｋ９をフロイント完全アジュバントで１：１に希
釈した。マウスは、複数部位での反復免疫（ＲＩＭＭＳ）を必要とする方法を使用して免
疫した。簡単に説明すると、マウスの末梢リンパ節（ＰＬＮ）の近位の特定部位８ヵ所に
抗原１〜３μｇを注射した。この方法を１２日間にわたり６回反復した。１２日目に試験
血を収集し、血清抗体力価をＥＬＩＳＡによって分析した。力価の高いマウスから１５日
目にＰＬＮを取り出し収集した。リンパ球を採取するために、ＰＬＮを基本ＤＭＥＭで２
回洗浄し、次に、２２ミクロンの篩い（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５２３５０）に通すことによ
って分離した。得られたリンパ球を融合前にさらに２回洗浄した。ＮＳＯ／Ｂｃｌ−２骨
髄腫細胞をリンパ球と、リンパ球２．５対ＮＳＯ細胞１の比で混合した。細胞混合物を遠
心し、その後細胞ペレットにＰＥＧ１５００ １ｍＬを１分間かけて滴下した。３０秒後
、ＤＭＥＭ １ｍｌをゆっくり添加し、１分後、ＤＭＥＭ １９ｍｌを５分間かけて添加
した。融合した細胞をペレットにし、ＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ+２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓ
ｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、１×ＨＡＴ、０．５×ＨＦＣＳ）中に２×１０５細胞
／ｍＬの密度で再懸濁し、３７℃で１時間置いた。その後、細胞を３８４−ウェルプレー
トに６０μｌ／ウェルで接種した。
Ｐｃｓｋ９に対する機能的抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング
融合して１０日後、ハイブリドーマプレートのＰｃｓｋ９特異的抗体の存在をスクリー
ニングした。ＥＬＩＳＡスクリーニングのため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート
（Ｎｕｎｃ ＃４６４７１８）をＰｃｓｋ９ ５０μｌでコーティングし（ＰＢＳで１５
ｎｇ／ウェルに希釈）、一晩４℃でインキュベートした。残存するタンパク質を吸引し、
ウェルをＰＢＳに溶かした１％ＢＳＡで遮断した。室温で３０分間インキュベーションし
た後、ウェルをＰＢＳ+０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ハイブリド
ーマ上清１５μｌをＥＬＩＳＡプレートに移した。ＰＬＮを取り出す時に採取したマウス
血清１５μｌをＰＢＳで１：１０００に希釈し、陽性対照として追加した。２次抗体５０
μｌ（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
＃１１５−０３５−０７１）、ＰＢＳで１：５０００に希釈）をＥＬＩＳＡプレートの
全ウェルに添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで８
回洗浄した。ＴＭＢ（ＫＰＬ＃５０−７６−０５）２５μｌを添加し、室温で３０分イン
キュベーションした後、プレートを６０５ｎｍの吸収で読み取った。陽性ウェルの細胞を
２４−ウェルプレートでＨＴ培地（ＤＭＥＭ+２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌ
ｕ、１×ＮＥＡＡ、１×ＨＴ、０．５×ＨＦＣＳ）中で増殖させた。
抗体精製
ＬＦＵ７２０を含有する上清をタンパク質Ｇ（Ｕｐｓｔａｔｅ＃１６−２６６（Ｂｉｌ
ｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））を使用して精製した。上清を添加する前に、樹脂を１０カラム容
量のＰＢＳで平衡化した。試料を結合させた後、カラムを１０カラム容量のＰＢＳで洗浄
し、次いで抗体を５カラム容量のグリシン０．１Ｍ、ｐＨ２．０で溶出した。カラム画分
は１／１０容量のＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ９．０ですぐに中和した。画分のＯＤ２８０を
測定し、陽性画分を収集し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して一晩透析した。
結合反応速度およびＢｉａｃｏｒｅアッセイ
動力学的結合パラメータの測定は、光学的バイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１を使
用して、表面プラズモン共鳴測定によって実施した。この技術によって、標識を用いない
受容体に対するリガンドの結合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）の顕微鏡的速度定数の測定が
可能である。したがって、抗体−抗原相互反応を特徴付けるために特に適している。
Ｐｃｓｋ９のＬＦＵ７２０（２μｇ／ｍｌ）への結合の研究は、予めシリーズＳ ＣＭ
−５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ（認定）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００５−３
０）に固定されたウサギ抗マウスＦｃγ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００５−１４
）でマウス抗体を捕捉することによって実施した。Ｆｃγ捕捉抗体の共有結合は、「アミ
ン結合キット」（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１０００−５０）で実施した。捕捉抗体（ウ
サギ抗マウス）は、酢酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ５に溶かした抗Ｆｃγ抗体溶液（Ｂｉ
ａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００３−５１）５０μｇ／ｍｌを流速１０μｌ／分でＥＤＣ活性
化デキストラン表面に結合させた。Ｐｃｓｋ９を０．５μＭから７．８ｎＭ（２倍希釈系
列）の濃度範囲で、ＰＢＳおよびＮａＣｌ １００ｍＭ、０．００５％Ｐ２０（Ｂｉａｃ
ｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５４）中での捕捉ＬＦＵ７２０チップ上に流した。得られたセ
ンサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ５１評価ソフトウェアを使用して分析した。全濃度
のデータは全体的に１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに適合させた。
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、浅い３８４ウェル白色プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ、６００８２８０）で実施した。ｈＰｃｓｋ９−ＡＦ（１０．７ｎＭ）を標識していな
いｈＰｃｓｋ９タンパク質、ＥＧＦ−ＡペプチドまたはＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１
抗体の希釈系列とアッセイ緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．２、ＮａＣｌ １５
０ｍＭ、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ ｗ／ｖ
ＢＳＡ）１５μｌ中で室温で３０分間インキュベートした。この後、アッセイ緩衝液に
溶かした５μｌのｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ（４ｎＭ）を予めインキュベートしたｈＰｃｓｋ９
およびＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１の複合体に添加し、室温で９０分間インキュベー
トした。これらの標識タンパク質の最終濃度は、ｈＰｃｓｋ９−ＡＦ ８ｎＭおよびｈＬ
ＤＬ−Ｒ−Ｅｕ １ｎＭであった。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１
００マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて励起３３０ｎｍおよび
放射６６５ｎｍで測定した。データは、以下の式：［（６６５ｎｍの値×１０，０００）
／（６１５ｎｍの値）］を使用して正規化した値に変換した。パーセント阻害は、以下の
式：１００−［（処理試料の正規化した値／未処理試料の正規化した値の平均値）×１０
０］で計算した。パーセント阻害用量反応曲線はＰｒｉｓｍ バージョン５を使用して、
式Ｙ＝最小結合度（Ｂｏｔｔｏｍ）＋（最大結合度（Ｔｏｐ）−最小結合度）／（１+１
０^（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊傾き（ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐ
ｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてプロットした。
ＬＤＬ−Ｒ代謝回転アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、予め１％ ｖ／ｖコラーゲンでコーティングした
平底９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９５）で、培養培地１００μｌにウェ
ル当たり６×１０４細胞を接種し、その後３７℃で５％ＣＯ２中で２４時間インキュベー
トした。一般的に、細胞は、ｈＰｃｓｋ９タンパク質、ＥＧＦ−Ａペプチドおよび／また
はＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１抗体のいずれかを含有する無血清培地１００μｌで処
理した。処理後、培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ１００μｌで洗浄した。細胞を採取するた
めに、Ｖｅｒｓｉｎｅ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、１７−７７１Ｅ）１００μｌを添加
し、３７℃で５％ＣＯ２中で１時間インキュベートし、次いでＦＡＣＳ緩衝液１００μｌ
を添加した。細胞をＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３８９４）に移し、１２
００ｒｐＭで５分間遠心して細胞をペレットにした。細胞上の非特異的結合部位を遮断す
るため、ＦＡＣＳ緩衝液に溶かした正常ウサギＩｇＧ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、
５５９４４）およびマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、I５３８１）１００μｇ／ｍｌの５０μ
ｌを各ウェルに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐＭで５
分間遠心して、プレートをはじくことによって緩衝液を除去した。細胞を標識するために
、ＦＡＣＳ緩衝液に溶かしたウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ−Ａｌｅｘａ６４７ＩｇＧ（５μｇ／
ｍｌ）１０μｌおよびマウス抗トランスフェリン−Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）ＩｇＧ
（２μｇ／ｍｌ）（ＣＤ７１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、６２４０４８）標識抗体１０μｌを各ウェルに添加し、氷上で６０分間インキュベ
ートした。細胞を１２００ｒｐＭで５分間遠心して、プレートをはじくことによって緩衝
液を除去した。結合していない抗体は、ＦＡＣＳ緩衝液ウェル当たり２００μｌで細胞を
２回洗浄することによって除去した。細胞は、ＰＢＳに溶かした１％パラホルムアルデヒ
ドで固定し、生細胞をゲーティングし（５０００）、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメー
ターおよびＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用
して分析した。ＰＥ蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および５７５ｎｍの放射で測定し
た。Ａｌｅｘａ６４７蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および６３３ｎｍの放射で測定
した。ＨｅｐＧ２細胞上の表面ｈＬＤＬ−ＲのＦＡＣＳ検出のために、特注のウサギ抗ｈ
ＬＤＬ−ＲポリクローナルＩｇＧ５８３はＣｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ、ＵＳＡ
）によって注文生産された。ウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３は、正常なウサギＩｇ
Ｇと比較して、ＨｅｐＧ２細胞表面上のｈＬＤＬ−Ｒの検出について約７倍のウインドウ
を示した。抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３のＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬ−Ｒに対する
特異性を測定するために、このＩｇＧの結合の競合相手としてｈＬＤＬ−Ｒタンパク質を
使用して実験を実施した。ＨｅｐＧ２細胞に対する抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３の平均
培地蛍光の用量依存減少が、ｈＬＤＬ−Ｒタンパク質の濃度増加につれて認められた。こ
のことは、ＦＡＣＳによって測定されたように、抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３がＨｅｐ
Ｇ細胞表面上のＬＤＬ−Ｒを特異的に認識することを示唆した。その後の研究では、Ｈｅ
ｐＧ２細胞表面上のＬＤＬ−ＲのＦＡＣＳ定量のために、直接標識した抗ｈＬＤＬ−Ｒ−
５８３−Ａｌｅｘａ６４７ＩｇＧを使用した。
ＬＤＬ−Ｃ取り込み
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、平底９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３
５９５、予め１％ ｖ／ｖコラーゲンでコーティング中の培養培地１００μｌにウェル当
たり６×１０４細胞を接種し、その後３７℃で５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートし
た。特に記載しない限り、細胞は、ｈＰｃｓｋ９タンパク質、ＥＧＦ−Ａペプチドおよび
／またはＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１抗体のいずれかを含有する無血清培地１００μ
ｌで処理した。処理後、無血清培地に溶かした３，３’−ジオクタデシルインドカルボシ
アニン標識低密度リポタンパク質（ＤｉＩ−ＬＤＬ）（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ、ＲＰ−０７
７−１７５）３０μｇ／ｍｌ、２０μｌを各ウェルに入れ、３７℃で５％ＣＯ２中で２時
間インキュベートした。プレートをはじくことによって培地を除去し、細胞をリン酸緩衝
生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、
１４１９０−１４４）１００μｌで洗浄した。プレートをはじくことによってＰＢＳを除
去し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で５％Ｃ
Ｏ２中で５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳ、ＥＤＴＡ ２ｍＭお
よび０．２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）１００μｌを各ウェルに添加し、１２
００ｒｐｍで５分間遠心することによって細胞をペレットにした。プレートをはじくこと
によって培地を廃棄し、ＰＢＳに溶かした１％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０）をウェル当たり５０μｌ添加
することによって細胞を固定した。生細胞をゲーティングし、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフロー
サイトメーターおよびＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）を使用して分析した。ＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および５７
５ｎｍの放射で測定し、５０００個の細胞を分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ
２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して棒グラフを作成
した。活性化のパーセントは以下の通りに算出した、％活性化＝［１−（Ｘ÷Ａ）］×１
００、式中、Ｘ＝試料ウェルから読み取った培地蛍光およびＡ＝ｈＰｃｓｋ９処理のみの
ウェルから読み取った培地蛍光。
式Ｙ＝最小結合度＋（最大結合度−最小結合度）／（１+１０^（（ＬｏｇＥＣ’５０−
Ｘ）×傾き））およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ）を使用して作成した用量反応曲線からＥＣ５０を決定するために、活性化のパ
ーセントを処理に対してプロットした。
結果
抗ヒトＰｃｓｋ９モノクローナル抗体の作製
Ｂ細胞は、Ｐｃｓｋ９タンパク質で免疫した動物の一次リンパ節から採取した。ハイブ
リドーマは、標準的ＰＥＧ媒介融合を使用して作製した。得られた融合物は、ＥＬＩＳＡ
によってアッセイし、ヒトＰｃｓｋ９に陽性結合するものを同定し、上清を生成するため
に増殖させた。ＥＬＩＳＡ陽性クローンが多数同定され、その後の機能アッセイによって
選別された。主要な候補として同定されたクローンは、ＬＦＵ７２０であった。我々の主
要な候補、ＬＦＵ７２０に加えて、Ｐｃｓｋ９に結合してＰｃｓｋ９がＬＤＬｒ分解を媒
介する能力を遮断することはできても（ＬＤＬｃ取り込みによって測定した通り）、Ｐｃ
ｓｋ９とＬＤＬｒの相互作用は遮断することはできない（ＦＲＥＴによって測定した通り
）、クローン２１Ｄ６、５Ａ４−Ｃ１および１３Ｆ１を含む多数のその他のクローンが同
定された。クローン２１Ｄ６はまた、インビボにおいてＰｃｓｋ９によるＬＤＬｒの分解
を遮断する能力を示した。
Ｐｃｓｋ９に特異的に結合するＬＦＵ７２０のスクリーニング
ＬＦＵ７２０の特異性は、一連のその他のタンパク質に対する結合をＥＬＩＳＡで評価
することによって調べた。ＨＩＳでタグ付けした３種類のその他のタンパク質に対するＬ
ＦＵ７２０の結合をＰｃｓｋ９−ＨＩＳに対する結合と比較した。これによって、Ｐｃｓ
ｋ９に対する結合が特異的で、この抗体はＨＩＳタグには結合しないことが示された。
ＬＦＵ７２０のカニクイザルＰｃｓｋ９に対する結合の評価
ＬＦＵ７２０のＰｃｓｋ９のカニクイザル相同体に対する結合を測定した。このアッセ
イのために、ＨＩＳでタグ付けしたカニクイザルＰｃｓｋ９を発現する細胞の上清をＮｉ
捕捉プレートと共に利用し、材料を精製する必要性を省いた。ヒトＰｃｓｋ９を希釈し、
そのＨＩＳタグを介してまた捕捉した。ＬＦＵ７２０は、ヒトおよびカニクイザル両方の
Ｐｃｓｋ９に結合することができた。５Ｐ２０はまた、ＥＬＩＳＡではヒトＬＤＬ−Ｒに
もマウスＰｃｓｋ９にも結合しなかった。
ＬＦＵ７２０の結合速度
光学的バイオセンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用することによって、ヒトＰｃｓｋ
９タンパク質を認識するマウス抗体ＬＦＵ７２０の結合親和性を分析した。ＬＦＵ７２０
は、組換えヒトＰｃｓｋ９にナノモル以下の高い親和性（ＫＤ ＝２００ｐＭ）で結合す
ることが見出された。
ＬＦＵ７２０のＰｃｓｋ９／ＬＤＬ−Ｒ相互作用遮断のスクリーニング
抗ｈＰｃｓｋ９抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０がｈＰｃｓｋ９−ＡＦとｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ
標識タンパク質との間の相互作用を中断させることができるかどうかを測定するために、
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用した。ｈＬＤＬ−Ｒ−ＥｕとｈＰｃｓｋ９−ＡＦ標識タン
パク質の相互作用によって生じたＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの中断をアッセイが検出できる
ことを示すために、標識していないｈＰｃｓｋ９タンパク質またはＥＧＦ−Ａペプチドを
評価した。標識していないｈＰｃｓｋ９の濃度を増加させると、ｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕへの
結合をｈＰｃｓｋ９−ＡＦと競合し、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの減少が生じた。ＥＧＦ−
Ａペプチドは、ｈＬＤＬ−Ｒ−ＥｕとｈＰｃｓｋ９−ＡＦの相互作用をＩＣ５０２．５μ
Ｍで中断させた。対照的に、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０はｈＰｃｓｋ９−ＥｕとｈＬＤＬ−Ｒ
−ＡＦの間のＴＲ−ＦＲＥＴシグナルをあまり中断させず、ＩＣ５０は１０００ｎＭを上
回り、低い抗体濃度ではＵ型の応答を示した。
Ｐｃｓｋ９媒介によるＬＤＬ−Ｒ分解のＬＦＵ７２０による阻害のスクリーニング
ＬＤＬ−ＲへのＰｃｓｋ９の結合は、ＬＤＬ−Ｒ分解を引き起こすことが示され、この
ことはＨｅｐＧ２細胞および組換えヒトＰｃｓｋ９を使用して確かめられた。ＬＦＵ７２
０がＰｃｓｋ９に結合し、この効果を遮断する能力を測定した。ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０は
外来性Ｐｃｓｋ９で処理したＨｅｐＧ２細胞を阻害し、細胞表面ＬＤＬ−Ｒの増加を引き
起こした。
ＬＦＵ７２０のＰｃｓｋ９阻害およびＬＤＬ取り込み回復のスクリーニング
ＬＤＬ−ＲのＰｃｓｋ９分解の阻害は、ＨｅｐＧ２細胞がＬＤＬ−Ｃを内部移行させる
能力を回復させる。ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０は、外来性ｈＰｃｓｋ９で処理したＨｅｐＧ２
細胞でのＰｃｓｋ９媒介によるＬＤＬ−Ｒ分解を妨害し、ＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みをＥＣ
５０ ９９ｎＭで増加させた。
実施例２：ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０
およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の生成
導入
この実施例では、マウスＰＣＳＫ９アンタゴニストモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ
７２０のヒト生殖系列抗体に対する配列相同性が高くなるように遺伝子操作することによ
って、ヒト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１
１を作製することを説明する。ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶ
Ｐ−ＬＧＴ２１１は、親マウス抗体、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のエピトープ特異性、親和性
およびカニクイザルマカクＰＣＳＫ９交差反応性を保持している。ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９
、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１は、元のマウス抗体よりもヒト生殖
系列配列により高い相同性を有し、したがってヒト免疫系により耐性であろう。
マウスモノクローナル抗体ＬＦＵ７２０は、そのタンパク質配列がヒト生殖系列配列に
より近く、その免疫原性が減少するように、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）した。Ｈｕｍ
ａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）技術は、南サンフランシスコのＫａｌｏＢｉｏｓ（ワールドワ
イドウェブｋａｌｏｂｉｏｓ．ｃｏｍ）から入手可能である。抗体のＨｕｍａｎｅｅｒｉ
ｎｇ（商標）によって、ヒト生殖系列配列と高い相同性を有する一方、親または参照抗体
の特異性および親和性をなお維持しているＶ領域配列を有する遺伝子操作されたヒト抗体
が作製される（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および第２００６／０１
３４０９８号）。このプロセスではまず、参照Ｆａｂの重鎖および軽鎖可変領域における
最小抗原結合特異性決定基（ＢＳＤ）（通常は重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３内の配列
）を同定する。これらの重鎖および軽鎖ＢＳＤは、Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）プロ
セス中に構築された全ライブラリー中に維持されるので、各ライブラリーはエピトープに
注目し、最終的な完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は元のマウス抗体のエピトー
プ特異性を保持する。
次に、完全長ライブラリー（軽鎖または重鎖可変領域全体がヒト配列のライブラリーで
置換されている）および／またはカセットライブラリー（マウスＦａｂの重鎖または軽鎖
可変領域の一部がヒト配列のライブラリーで置換されている）を作製する。抗体Ｆａｂ断
片としてライブラリーのメンバーを発現させるために細菌分泌系を使用して、コロニーリ
フト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）を使用してこのライブラリーの抗原に結合するＦａｂをス
クリーニングする。陽性クローンはさらに特徴を明らかにして、最高の親和性を有するも
のを同定する。残存するマウス配列において結合を支持することが同定されたヒト「カセ
ット」は次に、完全なヒトＶ領域を作製するための最終的なライブラリースクリーンにお
いて一緒にする。
得られたＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂは、ヒトライブラリーから得られたＶセ
グメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内で同定された短いＢＳＤ配列を保持しており、ヒト
生殖系列フレームワーク４領域を有する。これらのＦａｂは、重鎖および軽鎖の可変領域
をＩｇＧ発現ベクターにクローニングすることによって、完全なＩｇＧに変換する。この
方法で作製された完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は、親、マウス抗体の結合特
異性を保持しており、通常、親抗体よりも抗原に対して同等またはより高い親和性を有し
、タンパク質レベルでヒト生殖系列抗体遺伝子に匹敵する高い程度の配列同一性のＶ領域
を有する。
方法
マウスＶ領域のクローニング
マウスモノクローナルＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のＶ領域ＤＮＡは、標準的方法を使用して
ハイブリドーマ細胞株から単離されたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ハイブ
リドーマｃＤＮＡの重鎖可変領域のＰＣＲ増幅での使用に成功したプライマーは、ＶＨ１
４（５’−ＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴ−３’、配列番号５８）（Chardes
T, et al 1999, FEBS Letters; 452(3):386-94）およびＨＣ定常部（５’−ＧＣＧＴＣＴ
ＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’、配列番
号５９）であった。ハイブリドーマｃＤＮＡの軽（カッパ）鎖可変領域のＰＣＲ増幅での
使用に成功したプライマーは、Ｖκ４／５（５’−ＴＣＡＧＣＴＴＣＹＴＧＣＴＡＡＴＣ
ＡＧＴＧ−３’、配列番号６０）（Chardes T, et al., 1999、前述）およびＬＣ定常部
（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’、配列番
号６１）であった。増幅された重鎖および軽鎖の可変領域の配列を決定した。次に、ＰＣ
Ｒを使用してＶ遺伝子を増幅し、クローニング用の制限酵素部位をＫａｌｏＢｉｏｓベク
ターに組み込んだ。すなわち、ＶｈをＫＢ１２９２−Ｈｉｓ（Ｃ末端可動性リンカーおよ
びＣＨ１上のアミノ酸配列ＡＡＧＡＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）の６−Ｈｉｓ（配列
番号５７）タグをコードするＫＢ１２９２の改変変種）のＮｃｏＩ（５’）およびＮｈｅ
Ｉ（３’）に組み込み、ＶｋをＫＢ１２９６のＮｃｏＩ（５’）およびＢｓｉＷＩ（３’
）に組み込んだ。これらの個々の重鎖および軽鎖ベクターは次に、ＢｓｓＨＩＩおよびＣ
ｌａＩによる制限消化および連結によって単一のジシストロニックＫａｌｏＢｉｏｓ Ｆ
ａｂ発現ベクターに結合させた。Ｆａｂ断片は、このベクターによってイー・コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）で発現させた。このＦａｂのＰＣＳＫ９−抗原結合を試験し、参照Ｆａｂ Ｓ
Ｒ０３２と称した。
Ｆａｂ精製
Ｆａｂ断片は、ＫａｌｏＢｉｏｓ発現ベクターを使用してイー・コリから分泌させるこ
とによって発現させた。細胞は、２×ＹＴ培地で、ＯＤ６００が約０．６になるまで増殖
させた。発現は、ＩＰＴＧを１００μＭまで添加し、３３℃で４時間振盪することによっ
て誘導した。アセンブルされたＦａｂは、浸透圧溶解によって周辺質画分から得られ、Ｎ
ｉ−ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ
番号１７−５２４７−０１）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって標準
的方法に従って精製した。Ｆａｂは、イミダゾール５００ｍＭを含有する緩衝液中に溶出
し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ ｐＨ７．４で徹底的に透析した。
ライブラリー構築
ライブラリー構築の最初の工程では、ＫａｌｏＢｉｏｓヒトＶセグメントライブラリー
配列をＰＣＲ増幅することによって、エピトープを特徴とする完全なヒトＶ領域ライブラ
リーを作製した。これらの完全鎖ライブラリーの作製においては、最適化した参照Ｆａｂ
ＳＲ０３８のＢＳＤおよびヒト生殖系列Ｊセグメント配列を含有する特有のＣＤＲ３−
ＦＲ４領域を、重複ＰＣＲを使用してヒトＶセグメントライブラリーに結合させた。これ
らの完全なＶ領域ライブラリーは、直接スクリーニングせず、むしろＶｈおよびＶｋ中間
ライブラリー構築のための鋳型として使用した。完全鎖ライブラリー構築のために使用し
たＫａｌｏＢｉｏｓヒトＶセグメントライブラリーは、ＣＤＲ領域における元のマウスの
ＶｈおよびＶｋ’に最も近いヒト生殖系列配列をベースにして選択した。元のマウスＮＶ
Ｐ−ＬＦＵ７２０ Ｖｈは、ＣＤＲがヒト生殖系列配列Ｖｈ１−０２に最も近いので、Ｖ
ｈ１亜群のメンバーを含有する２種類のＫａｌｏＢｉｏｓライブラリー（ＫＢ１４１０お
よびＫＢ１４１１）の混合物を、完全なＶｈライブラリーの作製において使用した。同様
に、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０Ｖｋは、そのＣＤＲがＶｋ３ Ｌ６ヒト生殖系列配列に最も近
いので、Ｖｋ３亜群のメンバーを含有する２種類のＫａｌｏＢｉｏｓヒトＶセグメントラ
イブラリー（ＫＢ１４２３およびＫＢ１４２４）の混合物を、完全なＶｋライブラリーの
作製において使用した。次に、これらの完全長ＶｈおよびＶｋライブラリーを、親マウス
Ｖセグメントの一部のみがヒト配列のライブラリーによって置換されているカセットライ
ブラリーの構築のための鋳型として使用した。２種類のカセットは、ブリッジＰＣＲによ
って構築し、ＦＲ１、ＣＤＲ１およびＦＲ２の最初の部分にヒト配列を含有するフロント
エンドカセットは鋳型として前述したＶｈ１ライブラリー（ＫＢ１４１０およびＫＢ１４
１１）の混合物またはＶｋ３ライブラリー（ＫＢ１４２３およびＫＢ１４２４）の混合物
から増幅した。ＦＲ２の最後の部分、ＣＤＲ２およびＦＲ３にヒト配列を含有するミドル
カセットは、鋳型として前述した完全なヒトＶｈまたはＶｋ領域ライブラリーを使用して
増幅した。ＶｈカセットはＦ２におけるアミノ酸４５〜４９位（Ｋａｂａｔによる番号付
け）に重複する共通配列を有し、ＶｋカセットはＦＲ２においてアミノ酸残基３５〜３９
（Ｋａｂａｔによる番号付け）に重複する共通配列を有していた。このように、フロント
エンドおよびミドルヒトカセットライブラリーは、ヒトＶ重鎖１およびＶカッパ３アイソ
タイプについてＰＣＲによって構築した。各Ｖｈカセットライブラリーは、ベクターＫＢ
１２９２−Ｈｉｓ ａｔ ＮｃｏＩ（５’）およびＫｐｎＩ（３’）にクローニングし、
各Ｖｋカセットライブラリーは、ベクターＫＢ１２９６−Ｂ（ＦＲ４にサイレントＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位を添加したＫａｌｏＢｉｏｓベクターＫＢ１２９６の改変変種）のＮｃｏＩ
（５’）およびＨｉｎｄＩＩＩ（３’）にクローニングした。次に、得られたＶｈまた
はＶｋプラスミドライブラリーは、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩで消化し、その後連結し
て完全なＦａｂを発現するジシストロニックベクターのライブラリーを生成することによ
って、最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８の相補鎖と結合させた（例えば、Ｖｈフロント
エンドライブラリーは最適化した参照Ｖｋベクターと結合させた）。
一般的ＥＬＩＳＡ
組換えヒトまたはカニクイザルマカクＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原をＥＬＩＳＡアッセイ
全てに使用した。通常、ＰＢＳｐＨ７．４で希釈したＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原を９６ウ
ェルマイクロタイタープレートに３００ｎｇ／ウェルで一晩４℃でインキュベートするこ
とによって結合させた。プレートをＰＢＳに溶かした３％ＢＳＡ溶液で３７℃で１時間遮
断し、次いでＰＢＳＴで１回濯いだ。その後、Ｆａｂを含有する誘導細胞培地または希釈
した精製Ｆａｂ（５０μｌ）を各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした
後、プレートをＰＢＳＴで３回濯いだ。ＰＢＳで１：５０００に希釈した抗ヒトカッパ鎖
ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ７１６４）（５０μｌ）を各ウェルに添加し、このプレ
ートを室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＳ
ｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ基質（ＫＰＬ ＃５２−００−０３）１００μｌを各ウェルに添
加し、プレートを室温で約１０分間インキュベートした。プレートを分光光度計によって
６５０ｎｍで読み取った。
精製したヒトおよびマウスＩｇＧに対する特異的なＥＬＩＳＡのために、３８４ウェル
プレートを一群の精製したヒトおよびマウス抗原によってウェル当たり８８ｎｇでコーテ
ィングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを前述のように遮断して洗浄し、次
いでＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈した精製したマウスまたはヒト抗ＰＣＳＫ９抗体２２μ
ｌを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴ
で洗浄した。ＨＲＰに結合させた抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ＃１１５−０３５−０７１）または抗ヒトカッパ抗体（Ｓｉｇｍ
ａ ＃Ａ７１６４）をＰＢＳで１：５０００に希釈し（２５μｌ）、各ウェルに添加した
。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後洗浄して、前述のように発色させた
。
コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）
Ｆａｂ断片のＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ライブラリーのスクリーニングは、ＰＣＳ
Ｋ９−Ｈｉｓ６ ６μｇ／ｍｌでコーティングしたニトロセルロースフィルターを使用し
て、本質的に（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および第２００６／０１
３４０９８号）で記載されたように実施した。抗原をコーティングしたフィルターに結合
したＦａｂは、ＰＢＳＴで１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ヒトカ
ッパ軽鎖抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ３８１３）を使用して検出し、ブロットはアルカリホス
ファターゼのＤｕｏＬｕｘ化学ルミネセンス基質で発色させた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ ＃ＳＫ−６６０５）。
ビオチン化組換えＰＣＳＫ９の作製および親和性測定
ｐＲＳ５ａ／ＰＣＳＫ９プラスミドのＰＣＳＫ９およびＨｉｓ６（配列番号５７）タグ
をコードする遺伝子の間にＥｃｏＲＩ制限部位を挿入することによってＣ末端にＡｖｉ（
部位特異的ビオチン化のため）およびＨｉｓ６（配列番号５７）タグ（ＰＣＳＫ９−Ａｖ
ｉ−Ｈｉｓ６）を有するＰＣＳＫ９を作製し、Ｃ末端Ｈｉｓ６（配列番号５７）タグを有
するＰＣＳＫ９ Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｑ８ＮＢＰ７のアミノ酸３１〜
６９２を発現する。Ａｖｉタグ（アミノ酸配列ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配
列番号６３）をコードし、ＥｃｏＲＩオーバーハングが隣接するオリゴヌクレオチドをＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でリン酸化し、アニーリングし、
その後新たに挿入されたＥｃｏＲＩ部位を使用してｐＲＳ５ａ／ＰＣＳＫ９に連結した。
Ａｖｉタグを含有するクローンを配列分析によって確認した。ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉ
ｓ６の発現は、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施し、分
泌した組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。精製
後、ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６タンパク質は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、Ｎ
ａＣｌ ５０ｍＭに対して透析した。タンパク質は、製造者のプロトコールに従ってビオ
チン−タンパク質リガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ）によってインビトロでビオチン化した。完
了後、反応物をＰＢＳ ｐＨ７．２に対して透析し、ビオチン化はウェスタンブロットで
ＨＲＰ結合ストレプトアビジンで探索することによって確認した。
ＩｇＧおよびＦａｂ断片の結合速度は、溶液平衡滴定（「ＳＥＴ」）アッセイを使用し
て分析した。簡単に説明すると、ｈＰＣＳＫ９の希釈系列をＩｇＧ ６０ｐＭまたはＦａ
ｂに添加し、一晩インキュベートした。９６−ウェル標準結合マイクロタイタープレート
（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）にｈＰＣＳＫ９ １μｇ／ｍｌをコーテ
ィングし、一晩インキュベートして、ＰＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で洗
浄し、ＰＢＳ／５％（w／ｖ）ＢＳＡで遮断し、再度洗浄した。抗体−抗原調製物をＰＣ
ＳＫ９コーティング標準結合プレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。さ
らに３回洗浄工程を経た後、スルホ−タグ標識ヤギ抗ヒト検出抗体（Ｒ３２ＡＪ−５、Ｍ
ｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、室温で一時間インキュベートした
。プレートを３回洗浄した後、読み取り緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅ
ｒｙ）を添加し、電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）シグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅ
ｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって測定した。ＥＣＬ
データは、Piehler, et al., (1997) J Immunol Methods 201:189-206に記載された抗体
に適用可能な適当なモデルを使用して、ｅｘｃｅｌアドインＸＬｆｉｔ４．３．２（ＩＤ
Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で処理した。溶液中において、ヒトＰＣＳＫ
９と抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１の間で親和性の高い結合が認め
られ、それぞれについて算出されたＫＤ値は１５０〜１９０ｐＭであった。
抗体産生および精製
完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０お
よびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１抗体（サイレントＩｇＧ１カッパ）は、２９３ｆｅｃｔｉｎ形
質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃５１−００３１）を使用して、製造者のプロトコ
ールに従って、以下の通りにベクターを２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に同時形質移入
することによって生成した。
ＬＧＴ−２０９−ｐＪＧ０４（Ｖｈ）＋ｐＪＧ１０（Ｖｋ）
ＬＧＴ−２１０−ｐＪＧ０４（Ｖｈ）＋ｐＪＧ０１（Ｖｋ）
ＬＧＴ−２１１−ｐＳＲ７４（Ｖｈ）＋ｐＪＧ１０（Ｖｋ）
抗体は、５ｍＬのＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ ＃１７−０４０３−０３）を使用して、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞上清から精製
した。抗体は、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２１００４）を使用して溶出し、透
析によって緩衝液をＰＢＳに交換した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
は、ＡＫＴＡＦＰＬＣ液体クロマトグラフィー系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施
した。
エピトープ競合アッセイ
元のマウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０とそのＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）誘導体化Ｎ
ＶＰ−ＬＧＴ２０９の間のＰＣＳＫ９上のエピトープへの結合の競合は、ＦｏｒｔｅＢｉ
ｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫシステムおよびビオチン化ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６でコーテ
ィングしたストレプトアビジン高結合バイオセンサーを使用してアッセイした。次に、３
種類の異なる抗体、マウスＬＦＵ７２０、完全ヒトＬＧＴ２０９または対照マウス抗体７
Ｄ１６（ＬＦＵ７２０とは別のエピトープを有することが知られている）を別々のＰＣＳ
Ｋ９コーティングセンサーに飽和するまで結合させた。次に、センサーを全て、ＬＦＵ７
２０マウス抗体を含有するウェルに浸漬し、第１抗体がＬＦＵ７２０の結合を遮断できる
かどうかを測定した。
結果
マウスおよび参照Ｖ領域アミノ酸配列
ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０を発現するハイブリドーマ細胞からのＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列
決定し、この配列はＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ 質量ス
ペクトル分析を使用してタンパク質レベルでほとんど（９５％以上）確認された。次に、
参照Ｆａｂ ＳＲ０３２を作製するために、ＬＦＵ７２０の重鎖および軽鎖可変領域をＫ
ａｌｏＢｉｏｓベクターにクローニングした。参照Ｆａｂ ＳＲ０３２作製用のＫａｌｏ
Ｂｉｏｓベクターへのクローニングを可能にするために、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０ Ｖｋの
最初のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）からグルタミン酸（Ｅ）に変化させなければならなか
ったので、ＳＲ ０３２Ｖｋは最初のＶｋ位置にグルタミン酸を有する。Ｆａｂ ＳＲ０
３２には、ヒト定常領域に融合したＮＶＰ−ＬＦＵ７２０由来の完全なマウスＶ領域が有
り、イー・コリから精製された。ＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原結合の希釈ＥＬＩＳＡ試験に
おいて、クローニングされたＳＲ０３２参照Ｆａｂは、Ｆａｂ濃度に応じた結合曲線を生
じた。参照Ｆａｂ（ＳＲ０３２）に加えて、最適化した参照Ｆａｂ、ＳＲ０３８を構築し
た。ＳＲ０３８では、ＳＲ０３２のいくつかのフレームワークアミノ酸残基をヒト生殖系
列に変化させた。
参照および最適化した参照Ｆａｂの親和性分析
ＦＲ１およびＦＲ３中の最適化した参照ＦａｂＳＲ０３８に組み込まれたヒト生殖系列
残基は、ヒトＶセグメントレパートリーを増幅するために使用されたＰＣＲプライマーに
よって特定されたものであり、したがって、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｖ領域ライブ
ラリーの全メンバー中に存在する。最適化した参照Ｆａｂは、ヒト生殖系列への変化のい
ずれかがＦａｂ結合の特性を変化させるかさせないかを評価するために構築する。精製し
たＦａｂを使用した希釈ＥＬＩＳＡによって、組換えＰＣＳＫ９抗原に対するＳＲ０３２
およびＳＲ０３８の親和性は同一であることが測定され、ＳＲ０３８中のアミノ酸変化に
は耐性があることが示唆された。
ライブラリー構築および完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂの選択
Ｖｈ１またはＶｋ３に限定された重鎖および軽鎖フロントエンドおよびミドルカセット
ライブラリー亜群を作製し、ＣＬＢＡによってスクリーニングした。Ｖｈについては、Ｐ
ＣＳＫ９抗原への結合を支持するフロントエンドカセットはコロニーリフト結合アッセイ
によって同定されたが、Ｖｈミドルカセットは同定されなかった。Ｖｋについては、フロ
ントエンドカセットおよびミドルカセットの両方がコロニーリフトによって同定され、さ
らに、いくつかの完全なＶｋクローンが同定された（Ｖｋフロントエンドライブラリーに
完全鎖Ｖｋクローンが混入したため）。各ライブラリーの多くの結合物がＦａｂ含有細胞
上清におけるＥＬＩＳＡアッセイで再確認され、各ライブラリーのいくつかのＦａｂが周
辺質画分から精製され、Ｆｏｒｔｅ分析を使用して親和性によって順位付けされた。
ＰＣＳＫ９結合を支持するＶ−重鎖ミドルカセットは同定されなかったので、重鎖ＣＤ
Ｒ２またはＦＲ３内の全位置で親のマウス残基またはヒト生殖系列に最も近い残基のいず
れかをコードする２種類の突然変異誘発ライブラリーを構築した。こうして、遺伝子操作
されたヒトミドルカセットライブラリーを構築し、スクリーニングし、抗原結合クローン
を同定した。その後、個々のクローンにおいて結合を支持した、Ｖｈミドル内におけるヒ
ト生殖系列への変化を一緒にして最終的に１個のミドルカセットを作り出し、最適化した
参照Ｆａｂにおいてこのカセットを含有するＦａｂの結合の親和性を確認し、最適化した
参照ＦａｂをＦｏｒｔｅ分析した。
作り出したライブラリーから、ＣＬＢＡによって重鎖および軽鎖両方についてＰＣＳＫ
９抗原への結合を支持するフロントエンドおよびミドルヒトカセットを同定することに成
功した。これらの結合物は全てＥＬＩＳＡによって確認し、次いでＦａｂを精製し、Ｆｏ
ｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して順位付けした。重鎖および軽鎖について高
く順位付けされたカセットをブリッジＰＣＲによって最終的な１個のライブラリーに一緒
にし、ＰＣＳＫ９への結合を支持する完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＦａｂをＣＬ
ＢＡによってこのライブラリーから選択した。これと並行して、上位にランク付けされた
カセットまたは鎖全て（最良のＶｈフロントエンド、遺伝子操作されたＶｈミドル、およ
び最良の完全な軽鎖）を一緒にして、親和性の高い結合を支持することが予測される１個
のＦａｂ ＳＲ０６６を作り出した。
親マウスｍＡｂ ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０およびＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ａｂ Ｎ
ＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の重鎖および軽
鎖可変領域の配列をそれぞれ図１〜４に示す。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分析を使用した完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆ
ａｂのＰＣＳＫ９抗原に対する親和性試験
Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＳＲ０６６ Ｆａｂおよび最終的なコンビナトリアルラ
イブラリーから引き出された３個のＦａｂ（＃１−２、＃３−２および＃４−２）を発現
させ、精製した。その後、これら４種類のヒトＦａｂの結合速度は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ
Ｏｃｔｅｔシステムを使用して最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８の速度と比較した（数
値データは表１にまとめて示した）。
これらのＦａｂのタンパク質濃度の決定は困難で、そのため解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔ
ｅ）（ｋｄ）データは結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋａ）およびＫＤデータよりもずっ
と信頼性が高い（解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）のみが濃度依存的である）。試験したＨ
ｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ４種は全て、最適化した参照Ｆａｂよりも３から４倍
「劣る」（すなわち、速い）解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有するように見える。元の
重鎖フロントエンドカセットライブラリーから選択されるＦａｂ結合物の全ては、最適化
した参照Ｆａｂよりも「劣る」解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有するように見えたので
（データは示さず）親和性のこの減少は、これらのクローンにおける重鎖フロントエンド
によるものと考えられる。重鎖フロントエンドは、ＣＤＲ１を含有するので、Ｖｈフロン
トエンドカセット中のこのＣＤＲに生じた変化は、最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標
）Ｆａｂの親和性の減少の原因である可能性があった。完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商
標）Ｆａｂ、ＳＲ０６６は、最高の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有し（表１）、重鎖
ＣＤＲ１中のＳＲ０６６と参照（マウス）配列の間には３つの違いがある。ＣＤＲＨ１に
生じた変化がＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ全てに認められる親和性の減少に関連
することを試験するために、ＳＲ０６６のＣＤＲＨ１に同時に２個の残基を元のマウス残
基に一致するように変化させて戻し、発現させ、Ｆｏｒｔｅ速度分析のためにこれらの変
化したＦａｂを精製した。
ＣＤＲＨ１（ＳＲ０７９）に２つの変化を同時に有する１個のＦａｂは(表２)、ＳＲ０
６６の結合速度が著しく改善された（数値データは表３にまとめて示す）。実際に、ＳＲ
０７９ Ｆａｂは最適化した参照（マウス）Ｆａｂ ＳＲ０３８と同等の解離速度（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）を有するように見えた。
Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ ＳＲ０６６、＃１−２、＃３−２および＃４−
２は、ＣＤＲＨ２中に「Ａｓｎ−Ｇｌｙ」（「ＮＧ」）アミノ酸配列を含有しており、こ
れは元のマウス抗体由来であった。この配列は、生成に望ましくない特性である脱アミド
化を受ける可能性があることが知られている。したがって、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標
）ＳＲ０６６ Ｆａｂの親和性を改善するように努力すると同時に、２種類の突然変異誘
発ライブラリーをＳＲ０６６について構築し、「Ｎ」または「Ｇ」を元のアミノ酸以外の
可能性のあるアミノ酸全てによって置換した（例えば、「Ｎ除去ライブラリー」では、「
Ｎ」は「Ｎ」以外の全アミノ酸で置換した）。次に、「ＮＧ」配列はもう有さないが、Ｓ
Ｒ０６６の結合レベルをまだ保持している（最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８よりは少
ない）クローンを同定するために、このライブラリーからのＦａｂ含有細胞上清をＥＬＩ
ＳＡによってスクリーニングした。「Ｎ除去ライブラリー」は、ＳＲ０６６と同程度に結
合するＦａｂを生じないが、「Ｇ除去ライブラリー」は、「Ｇ」位置にいくつかの異なる
置換を有し、十分な結合レベルを備えたＦａｂを生じた。そのうち、「ＮＧ」から「ＮＥ
」、「ＮＡ」および「ＮＭ」への変化を有するＦａｂを精製およびＦｏｒｔｅ速度分析の
ために選択し、親Ｆａｂ ＳＲ０６６と類似の反応速度を有することを見出した。
親和性を改善するための７４７２個のヒトＩｇＧの遺伝子操作
Ｖｋ操作
完全なヒトＩｇＧを作り出すために、ＳＲ０７９のＶｈ配列（親和性を改善したＳＲ０
６６の改変変種）のＣＤＲＨ２までを増幅し、ブリッジＰＣＲによってＣＤＲＨ２からＦ
Ｒ４のほとんどの「Ｇ除去ライブラリー」クローンの配列（ＣＤＲＨ２中に「ＮＥ」を含
有する）に付着させた（ｓｔｉｔｃｈ）。このＶｈ配列をｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬ
Ａ+ ＫｐｎＩ（Ｖｈのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ＦＲ４にＫｐｎＩ部位を
添加するために改変されたサイレントＩｇＧ１クローニングベクター）のＮｒｕＩ（５’
）およびＫｐｎＩ（３’）にクローニングし、ｐＳＲ０７４を作り出した。ＳＲ０６６か
らのＶｋ（ＦＲ１からＦＲ４を通る経路まで）を増幅して、ｐＲＳ５ａ−ｈカッパのＡｇ
ｅＩおよびＢｓｉＷＩにクローニングし、ｐＳＲ０７２を作り出した。これらのベクター
は配列決定によって確認し、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に同時形質移入した。この
ＩｇＧ（「７４７２」と称する）を抗体含有細胞培地から精製した。驚くべきことに、抗
体７４７２は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析では親マウス抗体ＬＦＵ７２０よりも結合速度（ｏｎ
−ｒａｔｅ）が著しく遅かった（示さず）。各ヒト鎖を相補的なマウス鎖で交換すること
によって、この結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）の不足は、ヒト軽鎖に関する問題によること
が決定された。親和性を回復させるためにｐＳＲ０７２ヒト軽鎖に改変を起こさせ（表４
）、軽鎖の最初の４残基をマウス配列に戻すように変換し、ＣＤＲ１の後半の残基をマウ
スに戻すように変換した。この軽鎖を前述のようにｐＲＳ５ａ−ｈカッパにクローニング
して、ｐＪＧ１０およびｐＪＧ０１を作製し、ｐＳＲ０７４（Ｈｃベクター）およびｐＪ
Ｇ１０（Ｌｃベクター）またはｐＪＧ０１（Ｌｃベクター）を同時形質移入することによ
って完全なＩｇＧを作製した。総合すると、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたように、
これらの変化は部分的にＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の親和性を回復させた。
表４は、ヒト抗体７４７２、親マウス抗体ＬＦＵ７２０の軽鎖の一部およびｐＪＧ１０
によってコードされた軽鎖のアラインメントを示している。この部分はｐＪＧ０１によっ
てコードされた軽鎖と同一である。軽鎖ベクターは、最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商
標）抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１の
発現のために使用した。
ＣＤＲＨ３の親和性成熟
軽鎖の改変と並行して、ｐＳＲ０７４重鎖のＣＤＲ３の親和性成熟のためにＦａｂライ
ブラリーを構築した。このライブラリーでは、ＣＤＲ３残基は、元の残基を除くその他の
全アミノ酸で１つずつ置換した。このライブラリーはＣＬＢＡによってスクリーニングし
、結合物はＥＬＩＳＡによって確認し、得られたＦａｂは精製して、親ヒトＦａｂと比較
して結合速度が改善したかどうかを決定するためにバイオレイヤーインターフェロメトリ
によって試験した。
親和性が著しく改善されたＣＤＲＨ３置換、ＡからＮへの変化を同定した（表５）。こ
の変化はその後、ｐＳＲ０７４重鎖ＩｇＧ発現プラスミドの場合にも行い、この新たなコ
ンストラクトをｐＪＧ０４と呼んだ。最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＮＶＰ
−ＬＧＴ２０９（ＬＧＴ２０９）は、ｐＪＧ０４（Ｈｃ）およびｐＪＧ１０を同時形質移
入し、その後精製することによって作製した。最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗
体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（ＬＧＴ２１０）は、ｐＪＧ０４（Ｈｃ）およびｐＪＧ０１を同
時形質移入し、その後精製することによって作製した。この変化は、抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ
２１１（ＬＧＴ２１１）には導入しなかった。
表５は、ヒト抗体７４７２、親マウス抗体ＬＦＵ７２０の重鎖ＣＤＲ３およびｐＪＧ０
４によってコードされた重鎖（最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＮＶＰ−ＬＧ
Ｔ２０９およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１０の発現のために使用された重鎖ベクター）のアライ
ンメントを示している。ＡからＮの置換には下線を引いてある。
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）システムを使用したＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２
１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の結合速度の分析
ＳＥＴアッセイを使用して、ヒトＰＣＳＫ９に対するＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−
ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１抗体の結合親和性は表６に示したように１５０
〜１９０ｐＭの間であることを測定した。このことは、溶液中における抗体とＰＣＳＫ９
の間の高い親和性相互作用を示唆している。
ＥＬＩＳＡによるＮＶＰ−ＬＧＴ２０９の抗原特異性の分析
親マウス抗体ＬＦＵ７２０の抗原特異性が最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｉｇ
Ｇ、ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１で保持されているかどうかを試験す
るために、一群のヒトおよびマウス抗原（ならびにヒトＰＣＳＫ９）に対する抗体の結合
をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。このアッセイの結果（図５Ａ−Ｃ）は、ＬＧＴ２０９
、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が、マウス抗体ＬＦＵ７２０と同様にＰＣＳＫ９に対
して高い特異性を保持していることを示している。
ＥＬＩＳＡにおいてヒトおよびカニクイザルマカクＰｃｓｋ９タンパク質に結合する抗
体
ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１のヒトおよびカニクイザルマカク（ｃ
ｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９への特異的結合を評価した。このＥＬＩＳＡアッセイは、親マウス抗
体ＬＦＵ７２０のように、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１
０およびＬＧＴ２１１が同様の様式でヒトおよびｃｙｎｏ Ｐｃｓｋ９の両方に結合でき
ることを示している（図６Ａ〜Ｃ）。
バイオレイヤーインターフェロメトリをベースにしたエピトープ競合アッセイ
親マウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のエピトープ特異性が最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅ
ｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１で保持されているかどう
かを試験するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用した競合アッセイを
開発した。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ
２１１は親マウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０の結合を遮断し、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商
標）抗体が元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持していることを示唆している。抗体
の添加の順番を変えると、すなわち、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０を最初に結合させ、次にＨｕ
ｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体を結合させても類似の結果が得られた。
Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１の
アミノ酸配列ならびにヒト生殖系列配列に対するパーセント同一性
最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＩｇＧ ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬ
ＧＴ２１１の可変領域アミノ酸配列をそれぞれ、図２〜４に示す。ＣＤＲは下線を引いた
太字である。ヌクレオチド配列も配列リストに含める。
ヒト生殖系列配列に対する抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１のパー
セント同一性は、単一のヒト生殖系列配列（それぞれ、Ｖｈ１ １−０２およびＶｋ３
Ａ２７、表７）に対してＶｈおよびＶｋアミノ酸配列をアラインメントさせることによっ
て測定した。ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の残基は、各鎖の計算から除外した。
ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ抗体の機能的特徴に関する追加情報は、図８〜１４の説明に記載
されている。
実施例３：ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１
０およびＮＶＰＬＧＴ２１１の突然変異分析
ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮ
ＶＰＬＧＴ２１１の変異体のＰＣＳＫ９に結合する能力について評価した。結果を以下に
まとめて示す。
重鎖ＣＤＲ１、
（配列番号６６）に関して、元のマウス残基（太字）を含有するクローンのみがマウスＡ
ｂの結合速度を保持している（バイオレイヤーインターフェロメトリ分析によって測定さ
れた通り）。したがって、重鎖ＣＤＲ１内のこれらの残基は結合において役割を果たして
いる。
重鎖ＣＤＲ２、
（配列番号７４）に関して、太字の残基は、元の（マウス）残基または各位置において最
も近いヒト生殖系列配列の対応する残基のいずれかをコードするライブラリーから取り出
した抗体結合体中では変化しなかった（ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした）。した
がって、太字の残基は結合において役割を果たしている。保存的置換は、下線を引いたＧ
ｌｕ残基によって示された位置では耐性があり、例えば、この位置は、ＥＬＩＳＡによっ
て測定され、バイオレイヤーインターフェロメトリによって確認されたように、Ａ、Ｅま
たはＤであってもよい。
重鎖ＣＤＲ３、
（配列番号７５）に関して、太字の残基は、各位置において可能性のある全アミノ酸をコ
ードする（元のアミノ酸は除く）親和性成熟ライブラリーから取り出したクローンでは変
化しなかった。したがって、太字の残基は結合において役割を果たしている。保存的置換
は、下線を引いたＡｌａまたはＡｓｎ残基によって示された位置では耐性があり、例えば
、この位置は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたように、Ａ、ＮまたはＱであってもよ
い。保存的置換は、下線を引いたＴｒｙ残基によって示された位置では耐性があり、例え
ば、この位置は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたように、Ａ、Ｆ、Ｓ、ＶまたはＹで
あってもよい。
軽鎖ＦＲ１に関して、
（配列番号７６）、保存的置換は、Ｂｉｏｃｏｒｅによって測定されたように、下線を引
いた位置１および４において耐性がある。例えば、位置１のアミノ酸はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｎま
たはＱであってもよい。位置４のアミノ酸はＶ、Ｉ、ＬまたはＭであってもよい。ＱＩＶ
Ｌとしての位置１〜４（配列番号６９）（マウス親ＬＦＵ７２０、ＬＧＴ２０９およびＬ
ＧＴ２１１Ｖｋにおけるように）は、Ｂｉｏｃｏｒｅによって測定されたように、ＥＩＶ
Ｍとして位置１〜４（配列番号６７）にわたって結合を改善した（ＬＧＴ２１０Ｖｋにお
けるように）。
軽鎖ＣＤＲ１、
（配列番号７１）に関して、太字の残基の空間的配置は、Ｌｃ ＣＤＲ１のこの位置に２
つの他のアミノ酸を有するヒトクローンの親和性が損なわれたように、結合について影響
を及ぼした。したがって、太字の残基は結合において役割を果たしている。
軽鎖ＣＤＲ３、
（配列番号２６）に関して、これらの位置のヒト生殖系列への変化は、ＥＬＩＳＡによっ
て測定されたように、耐性はない。したがって、太字の残基は結合において役割を果たし
ている。
本明細書で記載された実施例および実施形態は、例示した目的のためだけのものであって、それらに関する様々な変更または変化は当業者に示唆されており、本出願の精神および範囲内ならびに特許請求の範囲内に含まれるものである。本明細書で引用した全出版物、特許、特許出願および配列受入記録は、全目的のために全体を参考として本明細書に組み込む。


本発明は、以下の態様を含む。
［１］
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合する抗体であって、
ａ）ＰＣＳＫ９が低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するのを遮断せず、 ｂ）ＰＣＳＫ９が媒介するＬＤＬＲの分解を阻害する、
抗体。
［２］
ヒトＰＣＳＫ９の６８０〜６９２位の残基内の少なくとも１個のアミノ酸に結合する、［１］に記載の抗体。
［３］
平衡解離定数（Ｋ Ｄ ）が約５００ｐＭ以下でヒトＰＣＳＫ９に結合する、［１］に記載の抗体。
［４］
インビボにおける半減期が少なくとも７日である、［１］に記載の抗体。
［５］
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域とを含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）（配列番号１４）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含む、
［１］に記載の抗体。
［６］
重鎖Ｖセグメントが配列番号２８と少なくとも８５％の配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントが配列番号３１と少なくとも８５％の配列同一性を有する、［５］に記載の抗体。
［７］
重鎖Ｖセグメントが配列番号２７と少なくとも８５％の配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントが配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％の配列同一性を有する、［５］に記載の抗体。
［８］
ｉ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、
［５］に記載の抗体。
［９］
重鎖ＦＲ４がヒト生殖系列ＦＲ４である、［５］に記載の抗体。
［１０］
重鎖ＦＲ４が配列番号３５である、［９］に記載の抗体。
［１１］
軽鎖ＦＲ４がヒト生殖系列ＦＲ４である、［５］に記載の抗体。
［１２］
軽鎖ＦＲ４が配列番号３９である、［１１］に記載の抗体。
［１３］
重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、
［５］に記載の抗体。
［１４］
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号７を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１０を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２１を含み、
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２４を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２６を含む、
［１３］に記載の抗体。
［１５］
重鎖可変領域が配列番号４０の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号４１の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、［５］に記載の抗体。
［１６］
重鎖可変領域が配列番号４０の可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号４１の可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、［５］に記載の抗体。
［１７］
配列番号４０を含む重鎖および配列番号４１を含む軽鎖を含む、［５］に記載の抗体。
［１８］
重鎖可変領域が、配列番号２および配列番号４からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、［５］に記載の抗体。
［１９］
重鎖可変領域が、配列番号２および配列番号４からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、［５］に記載の抗体。
［２０］
重鎖可変領域が、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［５］に記載の抗体。
［２１］
ＦＡｂ’断片である、［１］に記載の抗体。
［２２］
ＩｇＧである、［１］に記載の抗体。
［２３］
１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、［１］に記載の抗体。
［２４］
ヒト定常領域を含む、［１］に記載の抗体。
［２５］
担体タンパク質に連結している、［１］に記載の抗体。
［２６］
ＰＥＧ化されている、［１］に記載の抗体。
［２７］
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体。
［２８］
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、
［２７］に記載の抗体。
［２９］
［１］に記載の抗体および生理学的に適合した賦形剤を含む組成物。
［３０］
個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤をさらに含む、［２９］に記載の組成物。
［３１］
第２の薬剤がスタチンである、［３０］に記載の組成物。
［３２］
スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、［３１］に記載の組成物。
［３３］
第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、［３０］に記載の組成物。
［３４］
必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃの低下方法であって、［１］に記載の抗体の治療有効量を個体に投与し、それによって個体のＬＤＬ−Ｃを低下させることを含む方法。
［３５］
個体がスタチン治療に低応答性または耐性である、［３４］に記載の方法。
［３６］
個体がスタチン治療に不耐性である、［３４］に記載の方法。
［３７］
個体のベースラインＬＤＬ−Ｃレベルが少なくとも約１００ｍｇ／ｄＬである、［３４］に記載の方法。
［３８］
個体が家族性高コレステロール血症を有する、［３４］に記載の方法。
［３９］
全コレステロールがＬＤＬ−Ｃと共に低下する、［３４］に記載の方法。
［４０］
個体がトリグリセリド血症を有する、［３４］に記載の方法。
［４１］
個体が機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子変異を有する、［３４］に記載の方法。
［４２］
個体が薬剤誘導性脂質代謝異常を有する、［３４］に記載の方法。
［４３］
ＬＤＬ−Ｃの低下に有効な第２の薬剤の治療有効量を個体に投与することをさらに含む、［３４］に記載の方法。
［４４］
第２の薬剤がスタチンである、［４３］に記載の方法。
［４５］
スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、［４４］に記載の方法。
［４６］
第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、［４３］に記載の方法。
［４７］
抗体および第２の薬剤を混合物として同時投与する、［４３］に記載の方法。
［４８］
抗体および第２の薬剤を別々に同時投与する、［４３］に記載の方法。
［４９］
抗体を静脈内投与する、［３４］に記載の方法。
［５０］
抗体を皮下投与する、［３４］に記載の方法。

Claims (23)

  1. プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含む、抗体。
  2. 請求項１に記載の抗体および生理学的に適合した賦形剤を含む組成物。
  3. 個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 第２の薬剤がスタチンである、請求項３に記載の組成物。
  5. スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
  6. 第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
  7. 必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃを低下させるための、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 個体がスタチン治療に低応答性または耐性である、請求項７に記載の組成物。
  9. 個体がスタチン治療に不耐性である、請求項７に記載の組成物。
  10. 個体のベースラインＬＤＬ−Ｃレベルが少なくとも１００ｍｇ／ｄＬである、請求項７に記載の組成物。
  11. 個体が家族性高コレステロール血症を有する、請求項７に記載の組成物。
  12. 全コレステロールがＬＤＬ−Ｃと共に低下する、請求項７に記載の組成物。
  13. 個体がトリグリセリド血症を有する、請求項７に記載の組成物。
  14. 個体が機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子変異を有する、請求項７に記載の組成物。
  15. 個体が薬剤誘導性脂質代謝異常を有する、請求項７に記載の組成物。
  16. ＬＤＬ−Ｃの低下に有効な第２の薬剤の治療有効量を個体に投与することをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
  17. 第２の薬剤がスタチンである、請求項１６に記載の組成物。
  18. スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
  20. 抗体および第２の薬剤を混合物として同時投与する、請求項１６に記載の組成物。
  21. 抗体および第２の薬剤を別々に同時投与する、請求項１６に記載の組成物。
  22. 抗体を静脈内投与する、請求項７に記載の組成物。
  23. 抗体を皮下投与する、請求項７に記載の組成物。
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