CN102652139B - Pcsk9拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供抗蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9a(“PCSK9”)的抗体拮抗剂和使用这样的抗体的方法。

Description

PCSK9拮抗剂

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2009年12月11日的美国临时专利申请61/285,942的优先权，并将其为了所有的目的以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明涉及抗PCSK9的抗体拮抗剂。

发明背景

低密度脂蛋白受体(LDL-R)通过清除血液中的低密度脂蛋白(LDL)预防动脉粥样硬化和高胆固醇血症。LDL-R在翻译后水平受蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9a(subtilisin/kexin type 9a,“PCSK9”)的调节。最近，报道了小鼠中PCSK9的敲除。这些小鼠表现出血浆胆固醇水平降低了约50%，和表现出对他汀类药物(statins)在降低血浆胆固醇中增强的敏感性(Rashid S,等(2005)Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379)。人类遗传数据也支持PCSK9在LDL体内稳态中的作用。最近，鉴定出了两个突变，其可能是PCSK9“功能丧失性”突变。具有这些突变的个体中的血浆LDL-C水平降低约40%，这转化为约50-90%的冠心病减少。总之，这些研究显示，PCSK9的抑制剂对于血浆LDL-C浓度的降低和其它由PCSK9介导的疾病是有益的，并可以，例如与用于降低胆固醇的第二药，共同用药来增强功效。

发明概述

本发明提供了与蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9(PCSK9)(例如SEQ ID NO:47)结合并拮抗其功能的抗体，和使用这样的抗体的方法，例如以治疗PCSK9介导的疾病状况。

在一个方面，本发明提供了与蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9(PCSK9)结合的抗体和抗原结合分子。在一些实施方案中，所述抗体：

a)不阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)的结合，和

b)抑制PCSK9介导的LDLR降解。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子与人PCSK9的第680-692位残基中的至少一个氨基酸结合。例如，在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子与氨基酸序列RSRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:49)中的PCSK9的表位结合。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子与人PCSK9结合的平衡解离常数(KD)为约500pM或更低。例如，在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子与人PCSK9结合的平衡解离常数(KD)为约400pM、300pM、250pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM或更低。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子的体内半衰期为至少约7天。在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子的体内半衰期为至少约3、4、5、6、7、8、9、10天。在一些实施方案中，抗体或抗原结合分子的体内降胆固醇功效为至少约2周，例如2、3、4周或更长。优选，该体内半衰期是在人受试者中确定的。

在一些实施方案中，抗体包括：

(a)重链可变区，其包括人重链V片段、重链互补决定区3(CDR3)和重链构架区4(FR4)，以及

(b)轻链可变区，其包括人轻链V片段、轻链CDR3和轻链FR4，其中：

i)重链CDR3包含氨基酸序列SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y)(SEQ IDNO:14)；以及

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ IDNO:26)。

在一些实施方案中，抗体包括：

(a)重链可变区，其包括人重链V片段、重链互补决定区3(CDR3)和重链构架区4(FR4)，以及

(b)轻链可变区，其包括人轻链V片段、轻链CDR3和轻链FR4，其中：

i)重链CDR3包含氨基酸序列SYYYYNMDY(SEQ ID NO:12)；以及

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ IDNO:26)。

在一些实施方案中，抗体包括：

(a)重链可变区，其包括人重链V片段、重链互补决定区3(CDR3)和重链构架区4(FR4)，以及

(b)轻链可变区，其包括人轻链V片段、轻链CDR3和轻链FR4，其中：

i)重链CDR3包含氨基酸序列SYYYYAMDY(SEQ ID NO:13)；以及

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ IDNO:26)。

在一些实施方案中，重链CDR3包含选自SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13的氨基酸序列；轻链CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重链V片段与SEQ ID NO:28具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，且其中轻链V片段与SEQ ID NO:31具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一些实施方案中，重链V片段与SEQ ID NO:27具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，且其中轻链V片段与选自SEQ ID NO:29和SEQID NO:30的氨基酸具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一些实施方案中，重链FR4为人种系FR4。在一些实施方案中，重链FR4为SEQ ID NO:35。

在一些实施方案中，轻链FR4为人种系FR4。在一些实施方案中，轻链FR4为SEQ ID NO:39。

在一些实施方案中，重链V片段和轻链V片段各包括互补决定区1(CDR1)和互补决定区2(CDR2)；其中：

i)重链V片段的CDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

ii)重链V片段的CDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

iii)轻链V片段的CDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；以及

iv)轻链V片段的CDR2包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重链V片段和轻链V片段各包括互补决定区1(CDR1)和互补决定区2(CDR2)；其中：

i)重链V片段的CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

ii)重链V片段的CDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

iii)轻链V片段的CDR1包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及

iv)轻链V片段的CDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

在一些实施方案中：

i)重链V片段的CDR1包含SEQ ID NO:7；

ii)重链V片段的CDR2包含SEQ ID NO:10；

iii)重链CDR3包含选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

iv)轻链V片段的CDR1包含SEQ ID NO:21；

v)轻链V片段的CDR2包含SEQ ID NO:24；以及

vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO:26。

在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:40的可变区具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性，轻链可变区与SEQ ID NO:41的可变区具有至少90%的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:40的重链和包含SEQ ID NO:41的轻链。

在一些实施方案中，重链可变区与选自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4的可变区具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性，轻链可变区与选自SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的可变区具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4的氨基酸序列，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:18的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体为IgG。在一些实施方案中，抗体为IgG1。在一些实施方案中，抗体的重链与选自SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:5的氨基酸具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些实施方案中，抗体的轻链与选自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一些实施方案中，抗体为FAb’片段。在一些实施方案中，抗体为单链抗体(scFv)。在一些实施方案中，抗体包含人恒定区。在一些实施方案中，抗体包含人IgG1恒定区。在一些实施方案中，将人IgG1恒定区突变，使其对例如细胞上的Fc受体(FcR)(例如FcγR1)等效应子配体，或补体的C1组分具有降低的结合亲和性。见例如美国专利号5,624,821。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代为Ala234和Ala235。重链恒定区中残基的编号为EU索引(见,Kabat,等,(1983)“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,U.S.Dept.Health and Human Services)中的编号。

在一些实施方案中，将抗体与载体蛋白(例如，白蛋白)连接。

在一些实施方案中，抗体被聚乙二醇化。

在相关方面，本发明提供了与PCSK9结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各包含下列3个互补决定区(CDRs)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：

i)重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

ii)重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

iii)重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；

iv)轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；

v)轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；

vi)轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；

在一些实施方案中：

i)重链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

ii)重链可变区的CDR2包含选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

iii)重链可变区的CDR3包含选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

iv)轻链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列；

v)轻链可变区的CDR2包含选自SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列；

vi)轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

在相关方面，本发明提供了与PCSK9结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各包含下列3个互补决定区(CDRs)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：

i)重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

ii)重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

iii)重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

iv)轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

v)轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；

vi)轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；

在相关方面，本发明提供了与PCSK9结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各包含下列3个互补决定区(CDRs)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：

i)重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

ii)重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

iii)重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；

iv)轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；

v)轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；

vi)轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

在相关方面，本发明提供了与PCSK9结合的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各包含下列3个互补决定区(CDRs)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：

i)重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

ii)重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

iii)重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

iv)轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；

v)轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；

vi)轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含如本文中描述的抗体或抗原结合分子，以及生理相容性赋形剂。

在一些实施方案中，组合物还包含降低个体中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的第二药。

在一些实施方案中，第二药为他汀类药。例如，该他汀类药可以选自阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin)。

在一些实施方案中，第二药选自贝特类药(fibrates)、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸。

在另一方面，本发明提供了在有需要的个体中降低LDL-C、非HDL-C和/或总胆固醇的方法，所述方法包括给个体施用治疗上有效量的如本文中描述的抗体或抗原结合分子。

在一些实施方案中，个体对他汀类药治疗具有低反应性或具有抗性。在一些实施方案中，个体不耐受他汀类药治疗。在一些实施方案中，个体的基线LDL-C水平为至少约100mg/dL，例如，至少约110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或更高。在一些实施方案中，个体患有家族性高胆固醇血症。在一些实施方案中，个体患有甘油三酯血症(triglyceridemia)。在一些实施方案中，个体具有功能获得性（gain-of-function）PCSK9基因突变。在一些实施方案中，个体患有药物诱发性血脂异常。

在一些实施方案中，总胆固醇随LDL-C一起降低。

在一些实施方案中，方法还包括给个体以治疗上有效的量施用在降低LDL-C上有效的第二药。

在一些实施方案中，第二药为他汀类药。例如，该他汀类药可以选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，第二药选自贝特类药(fibrates)、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸。

在一些实施方案中，将抗体或抗原结合分子与第二药作为混合物共施用。

在一些实施方案中，将抗体或抗原结合分子与第二药以分开的方式共施用。

在一些实施方案中，抗体进行静脉内给药。在一些实施方案中，抗体进行皮下给药。

定义

“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白的片段的多肽，其能够非共价地、可逆地和以特异性的方式结合相应的抗原。一个示例性的抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有通过二硫键连接的一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义了免疫球蛋白的类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条链的N端定义约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链的这些区域。如在本申请中使用的，“抗体”包括具有特异于例如PCSK9的特定结合力的、抗体及其片段的所有变型形式。因此，该概念涵盖全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab'以及这些片段的具有相同结合特异性的多聚体形式(例如,F(ab')2)。

“互补决定结构域”或“互补决定区(CDRs)”可互换使用，指VL和VH的超可变区。CDRs是抗体链的靶标蛋白结合位点，包含对该靶标蛋白的特异性。在每一人的VL或VH中都有3个CDRs(CDR1-3,从N端开始顺序编号)，占可变结构域的约15-20%。CDRs在结构上与靶标蛋白的表位互补，因此直接负责结合的特异性。VL或VH中其余的区段，即所谓的构架区，在氨基酸序列上显示出较低的变化性(Kuby,Immunology,第4版,第4章.W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。

可以使用各种本领域公知的定义，确定CDRs和构架区的位置，例如Kabat、Chothia、国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(于万维网imgt.cines.fr/上)和AbM(见,例如,Johnson等,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987);Chothia等,Nature,342:877-883(1989);Chothia等,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992);Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)).抗原结合位点的定义也描述于：Ruiz等,Nucleic Acids Res.,28:219–221(2000);和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);MacCallum等,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996);和Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268–9272(1989);Martin等,Methods Enzymol.,203:121–153(1991);和Rees等,于Sternberg M.J.E.(编辑),蛋白质结构预测(Protein Structure Prediction),牛津大学出版社,Oxford,141–172(1996)中。

术语“结合特异性决定簇”或“BSD”可互换使用，指决定抗体的结合特异性所必需的互补决定区内最少的连续或非连续的氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以位于一个或多个CDR序列中。在一些实施方案中，最小结合特异性决定簇位于抗体重链和轻链的部分或全长CDR3序列中(即仅由其决定)。

如本文中使用的“抗体轻链”或“抗体重链”指分别包含VL或VH的多肽。内源VL由基因片段V(可变)和J(连接)编码，内源VH由V、D(多样性)和J编码。每个VL或VH包括CDRs以及构架区。在本申请中，抗体轻链和/或抗体重链有时可以统称为“抗体链”。这些术语涵盖包含突变的抗体链，所述突变，如本领域技术人员容易明了的，不干扰VL或VH的基本结构。

抗体可以作为完整的免疫球蛋白存在，或作为多种已被充分表征的片段存在，所述片段通过用各种肽酶进行消化而产生。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中于二硫键下方消化抗体，产生F(ab)’2，即Fab’的二聚体，Fab’本身是通过二硫键连接到VH-CH1的轻链。可以在温和条件下还原F(ab)’2，以打开铰链区中的二硫键，由此将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有部分铰链区的Fab。Paul,FundamentalImmunology第3版.(1993)。尽管各种抗体片段是以完整抗体的消化来进行定义的，但本领域技术人员明了，这样的片段可以通过化学方法或使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文中使用的，术语“抗体”也包括通过完整抗体的修饰而产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)、或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(见,例如,McCafferty等,Nature 348:552-554(1990))。

可以使用本领域已知的任何技术制备单克隆或多克隆抗体(见,例如,Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975);Kozbor等,ImmunologyToday 4:72(1983);Cole等,单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy),第77-96页.Alan R.Liss,Inc.1985)。可以对用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)进行适应性调整，以产生抗本发明多肽的抗体。也可以使用转基因小鼠或其它生物体(例如其它哺乳动物)来表达人源化抗体。备选地，可以使用噬菌体展示技术来鉴定与所选择的抗原特异结合的抗体和异聚体Fab片段(见,例如,McCafferty等,同上;Marks等,Biotechnology,10:779-783,(1992))。

用于将非人抗体人源化或灵长类化(primatizing)的方法在本领域公知。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为输入性残基，其一般取自输入性可变结构域。可以基本上按照Winter及其同事的方法(见,例如,Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，通过以啮齿类动物的CDRs或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行人源化。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中实质性小于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列替代。实践中，人源化抗体一般是人抗体，其中一些互补决定区(“CDR”)残基和可能地一些构架区(“FR”)残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基替代。

“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，以致抗原结合位点(可变区)连接到具有不同的或改变了的类别、效应子功能和/或物种的恒定区上，或连接到完全不同的分子上，所述分子赋予嵌合抗体新的特性，这些分子例如酶、毒素、激素、生长因子和药物；或(b)可变区或其部分被改变、替代或交换为具有不同的或改变了的抗原特异性的可变区。

本发明的抗体或抗原结合分子还包括与其它蛋白质化学缀合或表达为融合蛋白的一个或多个免疫球蛋白链。也包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是人工杂种抗体，其具有不同的两对重/轻链和两个不同的结合位点。本发明的其它抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv(diabody)、双特异性scFv抗体(其中该抗体分子识别两个不同的表位)、单结合结构域(dAbs)和微型抗体(minibodies)。

本文中描述的各种抗体或抗原结合片段可以通过对完整抗体的酶促或化学修饰来产生，或使用重组DNA方法从头合成(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库来鉴定(见,例如,McCafferty等,Nature 348:552-554,1990)。例如，可以使用本领域描述的方法，例如Vaughan和Sollazzo,Comb Chem High Throughput Screen.4:417-302001，产生微型抗体。可以通过多种方法产生双特异性抗体，所述方法包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。见，例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990);Kostelny等,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。可以使用噬菌体展示文库、核糖体展示文库、或基因改组文库，鉴定单链抗体。这样的文库可以从合成的、半合成的或天然的具免疫能力的来源构建。

“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，以致抗原结合位点(可变区)连接到具有不同的或改变了的类别、效应子功能和/或物种的恒定区，或连接到完全不同的分子，所述分子赋予嵌合抗体新的特性，这些分子例如酶、毒素、激素、生长因子和药物等；或(b)可变区或其部分被改变、替代或交换为具有不同的或改变了的抗原特异性的可变区。例如，如下文实施例中所示，小鼠抗PCSK9抗体可以通过将用来自人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区，进行修饰。由于用人恒定区进行替代，嵌合抗体能保留其识别人PCSK9的特异性，而与原来的鼠抗体相比较，其在人中的抗原性降低。

术语“抗原结合分子”或“非抗体配体”指使用非免疫球蛋白的蛋白质支架的抗体模拟物，其包括adnectins、avimers、单链多肽结合分子和抗体样结合拟肽。

术语“可变区”或“V区”可互换使用，指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。见图1。内源可变区由免疫球蛋白重链V-D-J基因或轻链V-J基因编码。V区可以是天然存在的、重组的或合成的。

如本文中使用的，术语“可变片段”或“V片段”可互换使用，指包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可变区子序列。见图1。内源V片段由免疫球蛋白V基因编码。V片段可以是天然存在的、重组的或合成的。

如本文中使用的，术语“J片段”指编码的可变区的子序列，其包含CDR3和FR4的C端部分。内源J片段由免疫球蛋白J基因编码。见图1。J片段可以是天然存在的、重组的或合成的。

“人源化”抗体是保留了非人抗体的反应性而在人中具有较低的免疫原性的抗体。这可以例如通过保留非人CDR区和将抗体的其余部分用它们的人对应物进行替代来实现。见,例如,Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988);Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。

术语“相应的人种系序列”指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，该编码的可变区氨基酸序列或子序列，与所有其它已知的由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的确定的氨基酸序列同一性。相应的人种系序列也可以指，该人可变区氨基酸序列或子序列，与所有其它评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性。相应的人种系序列可以是仅构架区，仅互补决定区，构架区和互补决定区，可变片段(如上文定义的)，或是包含可变区的序列或子序列的其它组合。序列同一性可以使用本文中描述的方法来确定，例如使用BLAST、ALIGN或本领域所知的其它比对算法来比对两条序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90%、92%、94%、96%、98%、99%的序列同一性。相应的人种系序列可以通过例如可公开获取的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(在万维网imgt.cines.fr/上)和V-base(在万维网vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上)来确定。

在描述抗原(例如蛋白质)和抗体或源自抗体的结合剂之间的相互作用的上下文中使用时，词组“特异地(或选择地)结合”指，在异质性蛋白质群体或其它生物制品，例如生物样品(例如血液、血清、血浆或组织样品)中，确定抗原存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，具有特定的结合特异性的抗体或结合剂与特定的抗原的结合至少两倍于背景，并且该抗体或结合剂基本上不与样品中存在的其它抗原产生显著量的结合。在这样的条件下与抗体或结合剂的特异性结合，可能需要该抗体或结合剂已经针对其对特定蛋白质的特异性进行过选择。如期望的或适当的，该选择可以通过扣除掉与例如来自其它物种(例如小鼠)的PCSK9分子或其它的PCSK亚型交叉反应的抗体来实现。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白质产生特异免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定被常规用于选择与特定蛋白质产生特异免疫反应的抗体(关于可用来确定特异性免疫反应的免疫测定方式和条件的描述，见例如，Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。典型地，特异性或选择性结合反应产生的信号将至少两倍于背景信号，更典型地至少10至100倍于背景。

术语“平衡解离常数(K_D,M)”指解离速率常数(k_d,时间^-1)除以结合速率常数(k_a,时间^-1,M^-1)。可以使用本领域任何已知的方法来测定平衡解离常数。本发明的抗体的平衡解离常数通常小于约10^-7或10^-8M，例如小于约10^-9M或10^-10M，在一些实施方案中，小于约10^-11M、10^-12M或10^-13M。

如本文中使用的，术语“抗原结合区”指本发明的PCSK9结合分子中负责该分子和PCSK9之间的特异性结合的结构域。抗原结合区包括至少一个抗体重链可变区和至少一个抗体轻链可变区。在本发明的每个PCSK9结合分子中都存在至少一个这样的抗原结合区，每一个抗原结合区可以与其它抗原结合区相同或不同。在一些实施方案中，本发明的PCSK9结合分子的至少一个抗原结合区起PCSK9的拮抗剂的作用。

如本文中使用的，术语“拮抗剂”指能够特异地与靶标分子结合和抑制其活性的试剂。例如，PCSK9的拮抗剂特异地与PCSK9结合，完全或部分地抑制PCSK9介导的LDLR降解。抑制PCSK9介导的LDLR降解可以干扰或可以不干扰PCSK9与LDLR的结合。在某些情况下，可以通过其与PCSK9结合和抑制PCSK9与LDLR结合的能力来鉴定PCSK9拮抗剂。当暴露于本发明的拮抗剂时，如果PCSK9介导的LDLR降解，与存在对照或缺乏拮抗剂时的PCSK9介导的降解相比，低至少约10%，例如低至少约25%、50%、75%或完全被抑制，则发生了抑制。可以使对照不暴露于抗体或抗原结合分子、或暴露于特异结合另一抗原的抗体或抗原结合分子、或已知不起拮抗剂作用的抗PCSK9抗体或抗原结合分子。“抗体拮抗剂”指拮抗剂是抑制性抗体的情况。

术语“PCSK9”或“蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9a”可互换使用，指天然存在的、属于分泌型枯草杆菌酶（subtilase）家族的蛋白酶K亚家族的人蛋白原转化酶(proprotein convertase)。PCSK9作为可溶性酶原合成，其在内质网中经历自催化的分子内加工，被认为作为蛋白原转化酶发挥功能。PCSK9在胆固醇的体内稳态中起作用，并可能在皮层神经元的分化中起作用。PCSK9基因的突变已经与常染色体显性家族性高胆固醇血症相关。见,例如,Burnett和Hooper,Clin Biochem Rev(2008)29(1):11-26。已知PCSK9的核酸和氨基酸序列，其分别以GenBank登录号NM_174936.2和NP_777596.2公布。如本文中使用的，PCSK9多肽功能性地与LDLR结合和促进LDLR降解。在结构上，PCSK9的氨基酸序列与GenBank登录号NP 777596.2的氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在结构上，PCSK9的核酸序列与GenBank登录号NM_174936.2的核酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

词组“PCSK9功能获得性突变”指存在于PCSK9基因中的天然突变，该突变，例如由于增强的LDLR降解和LDLR水平的降低，与家族性高胆固醇血症表型、加速的动脉粥样硬化和早发冠心病(premature coronaryheart disease)相关和/或是其产生的原因。PCSK9功能获得性突变的等位基因频率极低。见,Burnett和Hooper,Clin Biochem Rev.(2008)29(1):11-26。示例性PCSK9功能获得性突变包括D129N、D374H、N425S和R496W。见,Fasano,等,Atherosclerosis(2009)203(1):166-71。在例如Burnett和Hooper,同上;Fasano,等,同上;Abifadel,等,J Med Genet(2008)45(12):780-6;Abifadel,等,Hum Mutat(2009)30(4):520-9;和Li,等,Recent Pat DNA Gene Seq(2009)Nov.1(PMID 19601924)中，对PCSK9功能获得性突变进行了综述。

本发明的多肽的“活性”指多肽在其天然细胞或组织中的结构性、调节性或生化的功能。多肽活性的实例包括直接活性和间接活性。示例性的PCSK9直接活性是与该多肽直接相互作用的结果，包括与LDLR结合和PCSK9介导的LDLR降解。在PCSK9的情况中，观察到的示例性间接活性可以为：细胞、组织、器官或个体中对多肽的直接活性的反应或表型的改变，例如，降低增加了的肝脏LDLR、降低的血浆HDL-C、降低的血浆胆固醇、增强对他汀类药的敏感性。

当用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示核酸或蛋白质基本上没有在天然状态下与其相关的其它细胞组分。其优选处于同质状态。它可以是干燥的或水溶液的形式。通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定纯度和同质性。在存于制剂中的物类中占绝大多数的蛋白质是基本上纯化的。特别地，分离的基因是与位于基因侧翼、编码非目的基因的蛋白质的开放阅读框分开的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中形成基本上一条带。特别地，它意味着核酸或蛋白质的纯度为至少85%，更优选为至少95%，和最优选为至少99%。

术语“核酸”或“多核苷酸”指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物，以单链或双链形式存在。除非特地加以限定，该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守性修饰变体(例如，简并密码子替代)、等位基因、直向同源物、SNPs和互补序列，以及明确指出的序列。特别地，可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第3位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列，实现简并密码子替代(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合体。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合体，以及适用于天然存在的氨基酸聚合体和非天然存在的氨基酸聚合体。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些其后经过修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基、和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留了和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的常规化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。

“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守性修饰变体指那些编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或在核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质可以由很多功能上相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个规定丙氨酸的密码子位置，该密码子可以被改变成任何所述相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，它是保守性修饰变异中的一种。本文中每一个编码多肽的核酸序列也描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。本领域技术人员知道，可以对核酸中的每个密码子(除AUG以外，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)进行修饰，以产生功能上相同的分子。因此，在每一个所描述的编码多肽的核酸序列中，暗含该核酸的每个沉默变异。

关于氨基酸序列，本领域技术人员知道，对于在编码序列中导致单个氨基酸或小百分比氨基酸的改变、添加或缺失的、核酸、肽、多肽或蛋白质序列中的单替代、缺失或添加，当该改变导致氨基酸被其化学上类似的氨基酸替代时，则是“保守性修饰变体”。提供功能类似的氨基酸的保守性替代表在本领域公知。这样的保守性修饰变体是对本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且不排斥它们。

下列8组各包含相互为保守性替代的氨基酸：1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)丝氨酸(S),苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(见,例如,Creighton,Proteins(1984))。

通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中为了两条序列的最佳比对，与不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)。百分比这样来计算：确定在两条序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以获得匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100，以获得序列同一性的百分比。

在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一的”或百分比“同一性”指两条或更多条序列或子序列为相同的序列。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对，按照下列序列比较算法之一或通过手工比对和目测确定，获得最大对应性时，如果两条序列具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域中，或当没有规定时，在参考序列的整个序列中，70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同)，这两条序列是“基本相同的”。本发明提供了分别与本文中示例的多肽或多核苷酸(例如,SEQ ID NOS:1-5、15-19和40-41之任一示例的可变区;SEQ ID NOS:27-31之任一示例的可变片段;SEQ IDNOS:6-14、20-26之任一示例的CDRs;SEQ ID NOs:32-39之任一示例的FRs;和SEQ ID NOS:42-45之任一示例的核酸序列)基本相同的多肽或多核苷酸。可选地，同一性存在于长度为至少约15、25或50个核苷酸的区域，或更优选地于长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸的区域，或于参考序列的全长中。就氨基酸序列而言，同一性或基本同一性可以存在于长度为至少5、10、15或20个氨基酸的区域，任选于长度为至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸的区域，任选于长度为至少约150、200或250个氨基酸的区域，或于参考序列的全长区域中。就较短的氨基酸序列而言，例如20个或更少氨基酸的氨基酸序列，当根据本文中定义的保守性替代，一个或两个氨基酸残基进行了保守性替代时，存在基本同一性。

对于序列比较，一般将一条序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。在使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要的话，指定子序列的坐标，然后指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或可以指定可选参数。然后，序列比较算法基于程序参数，计算测序序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

如本文中使用的，“比较窗口”包括选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150个的连续位置数之任一的区段，在该区段中可以将一个序列与相同连续位置数的参考序列，在两条序列经过最优比对后，进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域公知。可以例如通过Smith和Waterman的局部同源算法(Needleman和Wunsch(1970)Adv.Appl.Math.2:482c)，通过Needleman和Wunsch的同源比对算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444)，通过计算机执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过手工比对和目测(见，例如Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))，进行用于比较的序列最优比对。

适用来确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获取。该算法包括，首先通过鉴别查询序列中长度为W的如下短字来鉴别高分值序列对(HSPs)，其中所述短字在与数据库序列中同样长度的字进行比对时，匹配或满足一定的正值阈值分值T。T被称为邻近字分值阈值(Altschul等,同上)。这些初始的邻近字命中物作为种子启动搜索来寻找包含它们的更长的HSPs。只要累积比对分值可以增加，字命中物就沿着每条序列在两个方向进行延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(给一对匹配残基的奖分；总是大于0)和N(给错配残基的罚分；总是小于0)，计算累积分值。对于氨基酸序列，使用打分矩阵计算累积分值。当累积比对分值从其所达到的最大值降低了数量X，或由于一个或多个负得分残基比对的累积而使累积分值变为0或以下，或到达任何一条序列的末端时，终止字命中物在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M=5、N=-4和双链比较，作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3、期望值(E)为10和BLOSUM62打分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和双链比较，作为默认值。

BLAST算法也执行两条序列之间相似性的统计学分析(见,例如,Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的对相似性的一种度量是最小加和概率(P(N))，该概率指示两条核苷酸或氨基酸序列之间因偶然而发生匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小加和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则该测试核酸被视为与参考序列相似。

两条核酸序列或多肽基本相同的一个指示是，如下文所描述的，由第一个核酸编码的多肽可以与抗第二个核酸编码的多肽所产生的抗体起免疫交叉反应。因此，例如，当两个多肽仅因保守性替代而不同时，通常地，两个多肽是基本相同的。两条核酸序列基本相同的另一个指示是，如下文所描述的，这两个分子或其互补体在严紧条件下互相杂交。两条核酸序列基本相同的另一个指示是，可以使用相同的引物来扩增序列。

当在描述抗原结合区在本发明的PCSK9结合分子中如何连接的上下文中使用时，术语“连接”涵盖用于使这些区域在物理上接合的所有可能的手段。许多抗原结合区常通过化学键例如共价键(例如，肽键或二硫键)或非共价键来接合，所述化学键可以是直接键(即，在两个抗原结合区之间没有接头)或间接键(即，在两个或更多个抗原结合区之间借助于至少一个接头分子)。

术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换使用，指哺乳动物，例如人或非人的灵长类哺乳动物。哺乳动物也可以是实验室哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠。在一些实施方案中，哺乳动物可以是农用哺乳动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼科动物)或驯养哺乳动物(例如，犬，猫)。

术语“治疗可接受量”或“治疗有效剂量”可互换使用，指足够产生预期效果(即，降低血浆非HDL-C、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病)的量。在一些实施方案中，治疗可接受量不诱导或造成不期望的副作用。可以通过先施用低剂量，然后递增地增加该剂量直到获得预期效果，以确定治疗可接受量。本发明的PCSK9拮抗抗体的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止与PCSK9存在相关的疾病症状(例如，高胆固醇血症)的发作或降低其严重性。所述术语也可以分别促进或增加无疾病症状期的频率和持续时间。“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”也可以分别预防或改善因PCSK9活性引起的失调和疾病所导致的伤害或残疾。

术语“共用药/共施用”指两种活性剂在个体的血管中同时存在。可以同时或顺序地给予共用药/共施用的活性剂。

如本文中使用的，词组“基本由…组成”指包括在方法或组合物中的活性药剂的类(genera)或种(species)，以及对方法或组合物的预期目的无活性的任何赋形剂。在一些实施方案中，词组“基本由…组成”明确地排除包括一种或多种非本发明的抗PCSK9抗体拮抗剂的其它活性剂的情况。在一些实施方案中，词组“基本由…组成”明确地排除包括一种或多种非本发明的抗PCSK9抗体拮抗剂的其它活性剂和第二共施用剂的情况。

术语“他汀类药”指作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂的一类药剂。

附图说明

图1示例了亲本小鼠单克隆抗体NVP-LFU720的重链(SEQ ID NO:1)和轻链(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。CDR1、CDR2和CDR3的序列以加下划线和加粗表示。

图2示例了亲本小鼠单克隆抗体NVP-LGT209的重链(SEQ ID NO:2)和轻链(SEQ ID NO:16)氨基酸序列。CDR1、CDR2和CDR3的序列以加下划线和加粗表示

图3示例了亲本小鼠单克隆抗体NVP-LGT210的重链(SEQ ID NO:2)和轻链(SEQ ID NO:18)氨基酸序列。CDR1、CDR2和CDR3的序列以加下划线和加粗表示

图4示例了亲本小鼠单克隆抗体NVP-LGT211的重链(SEQ ID NO:4)和轻链(SEQ ID NO:16)氨基酸序列。CDR1、CDR2和CDR3的序列以加下划线和加粗表示

图5A-C示例了，与NVP-LFU720-NX-4相比，NVP-LGT209(A)、NVP-LGT210(B)和NVP-LGT-211(C)和几种不同的人和小鼠抗原的结合的ELISA试验测定。

图6A-C示例了在ELISA中，NVP-LGT209(A)、NVP-LGT210(B)和NVP-LGT-211(C)与人和cyno的Pcsk9的结合。二抗为山羊抗小鼠抗体，按1:5000稀释。“仅二抗”(“2nd only”)为单独二抗对照。

图7示例了亲本小鼠单克隆抗体NVP-LFU720与PCSK9的C末端第680-692位残基(RSRHLAQASQELQ;SEQ ID NO:49)结合。Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211竞争相同的表位。C端突变体A685X=SEQ ID NO:56。

图8示例了，如在时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)生化试验中测定的，亲本小鼠抗体NVP-LFU720(5P20)对PCSK9和LDL-R间相互作用的破坏很差。相比之下，13C10以50nM的IC₅₀破坏PCSK9-LDL-R FRET相互作用。将以荧光团标记的人PCSK9(hPCSK9-AF)，与NVP-LFU720-AX-1或13C10，在试验缓冲液(20mM HEPES,pH 7.2,150mM NaCl,1mM CaCl2,0.1%v/v吐温20,和0.1%w/v BSA)中，于室温孵育30分钟。接着，加入铕标记的LDL-R(hLDL-R-Eu)，于室温再孵育90分钟，以使最终浓度为8nM的hPcsk9-AF和1nM的hLDL-R-Eu。以平板读取器(EnVision 2100,Perkin Elmer)测量TR-FRET信号(330nm处激发，665nm处发射)，计算存在5P20或13C10时的百分比(%)抑制。通过在Prism(GraphPad)中绘制百分比抑制值的曲线来计算IC50值。每个数据点代表平均值±SD(每个点n=4个重复)。数据为至少两个独立实验的代表。

图9示例了Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211与小鼠抗体LFU720在导致增加的LDL-R水平和HepG2细胞的LDL摄取上是等效的。为了测量LDL-R，将细胞与PCSK-9结合抗体一起孵育，以抗LDL-R抗体进行标记。对于LDL摄取，将细胞与PCSK9结合抗体、PCSK9和DiI-LDL一起孵育。用流式细胞计测量LDL-R抗体和DiI-LDL荧光。对于每个试验，显示重复测量的平均值+SEM。结果为3次独立实验的代表。

对于LDL摄取试验，将PCSK9结合抗体在含10%的胎牛无脂蛋白血清(Intracel)和200nM人PCSK9(Hampton等.PNAS(2007)104:14604-14609)的DMEM中，于室温孵育30分钟，将抗体/PCSK9/培养基溶液加到96孔板的孔中，孵育过夜。第二天，加入1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基-吲哚羰花青高氯酸盐标记的LDL(DiI-LDL,BiomedicalTechnologies)，再孵育2小时。然后吸去培养基，以PBS将细胞洗3次，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA离解细胞。然后将细胞转移到FACS缓冲液(含5%胎牛血清、2mM EDTA和0.2%叠氮化钠的PBS)中，于1000x g离心10分钟，吸去液体，以1%的多聚甲醛固定。使用流式细胞计(Becton Dickinson LSR II)，通过细胞的DiI荧光(488nm处激发，575nm处发射)测量LDL摄取。为了进行表面LDL-R测定，将细胞与含抗体的无血清培养基一起孵育，以PBS洗涤，用Versine(Biowhittaker,17-771E)和FACS缓冲液收获细胞。将细胞转移到新的平板中，于1200rpm离心5分钟，用正常兔IgG(MP biomedicals)进行封闭。于FACS缓冲液中以兔抗hLDL-R-Alexa 647IgG(5μg/ml)标记的抗体标记细胞，离心，洗涤，以1%的多聚甲醛固定。通过流式细胞计(488nm处激发，633nm处发射)测量表面LDL-R。用Prism(GraphPad)计算EC50。

图10提供了用于确定本发明抗体降低胆固醇效果的人PCSK9输注小鼠模型的研究设计示意图。LGT209、LGT210和LGT211为Humaneered^TM抗PCSK9抗体，它们与hPCSK9以高亲和力结合，与鼠PCSK9没有可检测的结合。为了测试LGT209、LGT210或LGT211是否能够抑制hPCSK9介导的非HDL胆固醇升高和阻止PCSK9介导的肝脏LDLR降解，在含有hPCSK9的微型渗透泵植入(用于连续输注)之前3小时，将各个抗体注射到小鼠中。在hPCSK9注射后24小时，采集血浆和肝脏组织。

图11显示以抗体LGT209、LGT210和LGT211治疗导致了输注小鼠模型中人PCSK9(“hPCSK9”)的积累。简言之，通过使用mAb 7D16进行捕获，以ELISA测定总的hPCSK9。mAb 7D16与LGT209、LGT210和LGT211结合PCSK9上的不同表位，能够用于测量总的(游离的和结合的)PCSK9。所观察到的总hPCSK9的增加可能是由于hPCSkK9/Ab复合物的增加。通过使用hPCSK9进行捕获，以ELISA来测定游离的抗体。该测定测量了“游离的”抗体并可以度量1:1的Ab:PCSK9复合物。用仅媒介物、仅PCSK9、PCSK9+20mg/kg LGT210、PCSK9+20mg/kgNVP-LGT211、或小鼠非特异性IgG混合物(阴性对照)，处理C57BL/6小鼠。绘制数据点图，用水平条界定平均值；视p<0.05为显著。

通过Meso Scale Discovery(MSD)试验，定量血浆IgG水平。使用hPCSK9进行捕获,测量了游离抗体。该测定测量了“游离的”抗体并可以度量1:1的Ab:PCSK9复合物。对于IgG MSD测定，使用MSD标准96孔板(L11XA-3)。简言之，以25至28μl的捕获抗原PCSK9-His(1μg/ml，于PBS中)包被平板(25-28ng孔)，于4℃过夜。除去包被溶液，每孔以150μl 5%的MSD Blocker A(R93AA-2)封闭平板，于室温摇动1小时。以300μl的PBS+0.05%吐温20洗涤平板3次，加入25μl的IgG校准物稀释液(以MSD blocker A进行从10,000至0.0003ng/ml的10个系列稀释)、未知的血浆样品稀释液(以MSD blocker A稀释10,000X)、或质量控制样品，于室温下摇动孵育1小时。洗涤后，每孔加入25μl 1μg/ml的检测抗体(MSD羊抗鼠SULFO-TAG标记的检测抗体R32AC-5，以1%BSA/PBS/0.05%吐温20稀释)，于室温摇动孵育1小时。洗涤后，每孔加入150μl 1X读取缓冲液T，立即在MSD SECTOR Imager 6000上读取平板。使用MSD数据分析软件，绘制标准曲线和计算未知样品。

通过Meso Scale Discovery(MSD)试验，定量了血浆IgG和hPCSK9水平。MSD hPCSK9测定与IgG测定类似，但有以下例外。以25-28μl的捕获抗体(7D16.C3:2.95mg/ml)以1μg/ml包被平板。mAb 7D16与LGT209、LGT210和LGT211结合PCSK9上不同的表位，其可用于测量总的(游离的和结合的)PCSK9。封闭平板后，将25μl的hPCSK9校准物稀释液(从10,000至0.0003ng/ml的10个点)和血浆样品稀释液(以MSDblocker A稀释10,000X)于室温下摇动孵育1小时，然后与第一检测抗体(家兔ID#RB11835中，兔抗PCSK9多克隆抗体Ab4)一起孵育。在用MSD SECTOR Imager 6000进行读取之前，添加一个与第二检测抗体(MSD羊抗兔SULFO-TAG标记的检测抗体R32AB-5)的孵育步骤。所观察到的总hPCSK9的增加可能是由于hPCSkK9/Ab复合物的增加引起。使用GraphPad Prism 4.02(GraphPad软件,San Diego,CA)进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)来分析组的差异，当发现了总体差异时，使用Newman-Keuls事后检验(Newman-Keuls post hoc test)确定处理组间的特定差异。

图12说明抗体LGT209、LGT210和LGT211导致输注小鼠模型中肝脏LDL-R免受hPCSK9介导的降解。用仅媒介物、仅PCSK9、PCSK9+20mg/kg LGT210、PCSK9+20mg/kg NVP-LGT211、或小鼠非特异性IgG混合物(阴性对照)，处理C57BL/6小鼠。显示来自各个体动物的肝脏样品。

使用20泳道4-12%Bis-Tris Invitrogen Midi胶(InvitrogenWG1402BX10)和MOPS电泳缓冲液(Invitrogen NP0001)，对血浆膜样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将准备好的样品于70℃加热10分钟，置于冰上，然后使用点阵多通道移液器将每个样品各10μl点样到胶上。与样品一起点加SeeBlue Plus2标记(Invitrogen LC5925)，用于确定大小和胶的方向。在200V恒压下电泳凝胶，直到染料的前缘到达胶的底部。电泳后，使用iBlot装置(Invitrogen IB1001EU)，将胶向硝化纤维素膜(Invitrogen IB3010-01)转移。以20V进行7分钟转移。转移后，以PierceSuperblock T20(Pierce 37536)封闭膜至少30分钟。将膜置入“seal-a-meal”袋中，加入于Superblock中的兔抗LDLR抗体1:500稀释物，然后于4℃摇动孵育过夜。将膜在TBS/0.05%吐温中摇动漂洗5次，每次5分钟，然后向膜上加1:30,000稀释于Superblock中的山羊抗兔HRP第二抗体，孵育1小时。再次将膜在TBS/0.05%吐温中摇动漂洗5次，每次5分钟。使用Pierce SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce 37079)，按照生产商的指导，检测HRP缀合物。简言之，混合等份的过氧化物溶液和Luminol/Enhancer溶液，将其加到膜上(0.2ml/cm²)，5分钟。吸除过量的溶液，以膜对Kodak BioMax MR X-射线胶片(Kodak 870 1302)进行曝光。

图13A-C示例了抗体LGT209、LGT210和LGT211导致hPCSK9输注小鼠模型中血浆非HDL胆固醇的降低。预注射LGT209抗体导致对hPCSK9介导的非HDL胆固醇升高的46%防止。预注射LGT210或LGT211对hPCSK9介导的非HDL胆固醇升高导致等同的或更大的防止作用。13C10是经过确认的鼠抗PCSK9抗体，其与hPCSK9高亲和力地结合，用作该测定试验的阳性对照。以仅媒介物、仅PCSK9、PCSK9+20mg/kg LGT209、PCSK9+20mg/kg LGT210、PCSK9+20mg/kgNVP-LGT211、PCSK9+20mg/kg 13C10或小鼠非特异性IgG混合物(阴性对照)，处理C57BL/6小鼠。显示单个数值，以水平条界定平均值。使用Olympus临床分析仪(Olympus美国公司:Olympus AU400)定量血浆总胆固醇水平。将血浆样品按1:3稀释于ddH2O中，按照生产商的指导，定量40μl稀释的血浆样品中总胆固醇水平。使用Helena Laboratories的Spife 3000获取脂蛋白胆固醇级分，以定量血浆HDL和非HDL。按照操作手册中提供的技术指导，完成所有的步骤，包括准备样品、制备凝胶、施加样品、凝胶电泳、染色、洗涤和干燥。然后，在Quick Scan 2000中采用Slit 5扫描凝胶，使用Helena光密度计，计算脂蛋白胆固醇级分的相对百分比。最后，通过将每个级分的百分比与总胆固醇水平相乘来计算HDL和非HDL的绝对值。

图14显示，与“典型的”IgG1(PK)谱相比较，抗体LGT209、LGT210和LGT211(人IgG1-silent)的大鼠药代动力学(PK)谱。与典型的IgG1的半衰期(约6天)相比，抗体LGT209、LGT210和LGT211的半衰期显著更长(7-13天)(例如，如在人受试者中测定的)。没有靶介导的沉积(TMD)的迹象，表明抗体不与啮齿动物PCSK9交叉反应。对于每个测试抗体，以10mgs/kg注射3只雄性Lewis大鼠。在时间=0、1、6、24小时以及2、4、8和16天，采集250μl血样，稀释经澄清的血浆，在捕获ELISA(山羊抗人IgG)中进行评估，以测量所回收的总的人抗体。也产生每个测试抗体的标准曲线。以所回收的IgG的量对预期的典型人IgG在大鼠中的回收量，进行绘图。

发明详述

1．引言

本发明的抗体和抗原结合分子与蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9a(“PCSK9”)特异结合。本发明的抗PCSK9抗体和抗原结合分子与PCSK9的C端结合，其具有意料不到的特性——干扰PCSK9介导的低密度脂蛋白受体(LDL-R)的降解而不干扰PCSK9与LDL-R的结合。特别地，抗PCSK9抗体和抗原结合分子与PCSK9的第680-692位残基内的表位结合，例如位于PCSK9的C末端的氨基酸序列RSRHLAQASQELQ(SEQID NO:49)内的表位。因为本发明的抗体和抗原结合分子可与结合在细胞上的PCSK9而非只与循环PCSK9结合，故它们在患者中具有相对较长的体内半衰期，例如至少约7天或更长，在一些实施方案中，提供施用后至少2周的降脂效果。本发明的抗PCSK9抗体和抗原结合分子是PCSK9的拮抗剂，因为它们防止、减少和/抑制PCSK9介导的LDL-R的降解，从而促进低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)摄取的增加。抗PCSK9抗体和抗原结合分子可用于治疗患有例如血脂异常、高胆固醇血症、甘油三酯血症和其它PCSK9介导的疾病状况的受试者。

2．改良的抗PCSK9抗体概述

可以使用本领域已知的任何手段来产生抗PCSK9抗体片段，所述手段包括但不限于重组表达、化学合成、抗体四聚体的酶促消化，而全长单克隆抗体可以通过例如杂交瘤或重组生产方式来获得。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。当恒定区存在时，抗PCSK9抗体的恒定区可以是任何合适的型或亚型，可以选择以来自待以本发明方法治疗的受试者的物种，例如人、非人灵长类动物，或其它哺乳动物，例如农用动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼科动物)、驯养哺乳动物(例如，犬，猫)或啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、兔)。在一些实施方案中，抗PCSK9抗体经过人源化或Humaneered^TM。在一些实施方案中，恒定区同种型是IgG，例如IgG1。在一些实施方案中，将人IgG1恒定区突变，使其对效应子配体，例如细胞上的Fc受体(FcR)(例如FcγR1)、或补体的C1组分具有降低的结合亲和性。见例如，美国专利号5,624,821。包含这种突变的抗体介导减少的或不介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，将IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235替换为Ala234和Ala235。重链恒定区中残基的编号为EU索引中的(见,Kabat等,(1983)“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,美国健康和公共事业部)。也见例如，Woodle等,Transplantation(1999)68(5):608-616;Xu等,Cell Immunol(2000)200(1):16-26;和Hezareh等,J Virol 75(24):12161-8。

本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子也包括具有骆驼科动物支架的单结构域抗原结合单元。骆驼科中的动物包括骆驼、美洲驼和羊驼。骆驼科动物产生缺乏轻链的功能性抗体。重链可变区(VH)自发折叠，作为抗原结合单位独立起作用。与经典的抗原结合分子(Fabs)或单链可变片段(scFvs)中的6个CDRs相比，它的结合表面仅涉及3个CDRs。骆驼科动物抗体能够达到与常规抗体相当的结合亲和性。可以使用本领域公知的方法，产生具有本文中示例的抗PCSK9抗体的结合特异性的、基于骆驼科动物支架的抗PCSK9分子，所述方法例如Dumoulin等,Nature Struct.Biol.11:500–515,2002;Ghahroudi等,FEBS Letters 414:521–526,1997;和Bond等,J Mol Biol.332:643-55,2003。

本发明的改良的抗PCSK9抗体是经改造的人抗体，其V区序列与人种系V区序列具有实质性的氨基酸序列同一性，并保留参考抗体的特异性和亲和性。见美国专利公布号2005/0255552和美国专利公布号2006/0134098，由此将两者均以引用的方式并入本文。改良的过程包括从参考抗体的可变区中鉴定出决定抗原结合特异性所需的最小序列信息，和将该信息转移到人部分V区基因序列的文库，以产生人抗体V区的表位聚焦文库(epitope-focused library)。可以使用基于微生物的分泌***将该文库的成员表达为抗体Fab片段，可以例如使用菌落转印(colony-lift)结合试验，筛选文库中的抗原结合性Fabs。见例如，美国专利公布号2007/0020685。可以对阳性克隆进行进一步表征，以鉴定那些具有最高亲和性的阳性克隆。所产生的经改造的人Fabs保留了亲本(参考抗PCSK9抗体)的结合特异性，一般对抗原具有与亲本抗体等同或更高的亲和性，并含有与人种系抗体V区具有高度序列同一性的V区。

产生表位聚焦文库所需的最小结合特异性决定簇(BSD)一般由重链CDR3(“CDRH3”)中的序列和轻链CDR3(“CDRL3”)中的序列表示。BSD可以包含部分或整个长度的CDR3。BSD可以由连续的或非连续的氨基酸残基组成。在某些情况下，从人V片段序列，构建表位聚焦文库，所述人V片段序列与来自参考抗体的包含BSD的独特CDR3-FR4区以及人种系J片段序列连接(见,美国专利公布号2005/0255552)。备选地，可以通过顺序的盒置换，产生人V片段文库，其中开始仅部分的参考抗体V片段用人序列文库替代。然后，将所鉴定的在参考抗体剩余的氨基酸序列中支持结合的人“盒”，在第二个文库筛选中重组，以产生完整的人V片段(见,美国专利公布号2006/0134098)。

在每种情况下，使用来自参考抗体的包含特异性决定簇的、成对重链和轻链CDR3片段、CDR3-FR4片段或J片段，以限制结合特异性，以便从文库中获得的抗原结合物保留参考抗体的表位特异性。可以在文库构建中，向每条链的CDR3区引入另外的成熟改变，以鉴定具有最佳结合动力学的抗体。所获得的经改造的人抗体具有来源于人种系文库的V片段序列，保留来自CDR3区中的短BSD序列，并具有人种系构架区4(FR4)。

因此，在一些实施方案中，抗PCSK9抗体包含来自原初或参考单克隆抗体重链和轻链的CDR3中的最小结合序列决定簇(BSD)。重链和轻链可变区(CDR和FR)的其余序列，例如V片段和J片段，来自相应的人种系和亲和力成熟的氨基酸序列。V片段可以选自人V片段文库。可以通过亲和力成熟进行进一步的序列精炼。

在另一个实施方案中，抗PCSK9抗体的重链和轻链包含来自相应的人种系序列的人V片段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，例如选自人V片段文库的人V片段，和来自原初单克隆抗体的CDR3-FR4序列片段。可以通过用相应的人种系序列替代序列片段和/或通过亲和力成熟，进一步精炼CDR3-FR4序列片段。例如，可以用相应的人种系序列替代BSD周围的FR4和/或CDR3序列，而保留来自原初单克隆抗体的CDR3的BSD。

在一些实施方案中，重链V片段的相应人种系序列是Vh1-02。在一些实施方案中，重链J片段的相应的人种系序列是JH4。在一些实施方案中，重链J片段包含人种系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:50)。来自人种系JH4的全长J片段是YFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO:51)。可变区基因依照免疫球蛋白可变区基因的标准命名***来提及。目前的免疫球蛋白基因信息可以通过万维网获取，例如在ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base和PubMed数据库中。也见Lefranc,Exp Clin Immunogenet.2001;18(2):100-16;Lefranc,Exp ClinImmunogenet.2001;18(3):161-74;Exp Clin Immunogenet.2001;18(4):242-54;和Giudicelli等,Nucleic Acids Res.2005 Jan 1;33(Databaseissue):D256-61。

在一些实施方案中，轻链V片段的相应的人种系序列是VK3L6。在一些实施方案中，轻链J片段的相应的人种系序列是Jk2。在一些实施方案中，轻链J片段包含人种系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ IDNO:52)。来自人种系Jk2的全长J片段是YTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO:53)。

在一些实施方案中，重链V片段与氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFS(D/T)MYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)RVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO:28)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些实施方案中，重链V片段与氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPANEHTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR (SEQ IDNO:27)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

在一些实施方案中，轻链V片段与以下氨基酸序列具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性：(E/Q)IV(L/M)TQSPATLSVSPGERATLSC(R/S)AS(Q/S)SVSYMHWYQQKPGQAPRLLIY(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)GIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ IDNO:31)。在一些实施方案中，重链V片段与以下氨基酸序列具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性QIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：29).，在一些实施方案中，重链V片段与以下氨基酸序列具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：30).

在一些实施方案中：

i)重链CDR3包含氨基酸序列SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y)(SEQ IDNO:14)；以及

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ IDNO:26)。

在一些实施方案中：

i)重链CDR3包含选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及

ii)轻链CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包括包含氨基酸序列(D/T)MYMS(SEQ ID NO:8)的CDR1；包含氨基酸序列RIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)(SEQ ID NO:11)的CDR2；和包含氨基酸序列SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y)(SEQ ID NO:14)的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括包含氨基酸序列(R/S)AS(Q/S)SVSYMH(SEQ ID NO:22)的CDR1；包含氨基酸序列(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)(SEQ ID NO:25)的CDR2；和包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)的CDR3。

在一些实施方案中，重链可变区包括包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的FR2；包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列的FR3；和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的FR4。这些鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个替代的氨基酸(例如，来自亲和力成熟)或一个或两个保守替代氨基酸。

在一些实施方案中，轻链可变区包括包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的FR2；包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的FR3；和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的FR4。这些鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个替代的氨基酸(例如，来自亲和力成熟)或一个或两个保守替代氨基酸。

本发明的抗PCSK9抗体的可变区在其全长上一般与相应的人种系可变区氨基酸序列具有至少约85%、例如至少约89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的总体可变区(例如，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)氨基酸序列同一性。例如，抗PCSK9抗体的重链可以与人种系可变区Vh1-02具有至少约85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。抗PCSK9抗体的轻链可以与人种系可变区VK3L6具有至少约85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，仅对构架区中的氨基酸进行添加、缺失或替代。在一些实施方案中，序列同一性比较不包括CD3。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:40的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:41的轻链可变区(即，共有序列)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:1的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:15的轻链可变区(即，小鼠LFU720)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:2的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:16的轻链可变区(即，LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:2的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:18的轻链可变区(即，LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:4的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:16的轻链可变区(即，LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:3的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链多肽，和包含与SEQ ID NO:17的轻链可变区(即，LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链多肽。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:3的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链多肽，和包含与SEQ ID NO:19的轻链可变区(即，LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链多肽。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体包含与SEQ ID NO:5的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的重链多肽，和包含与SEQ ID NO:17的轻链可变区(即，LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的轻链多肽。

对于鉴定的长度小于20个氨基酸的氨基酸序列，可以耐受一个或两个保守氨基酸残基替代而仍然保留期望的特异性结合和/或拮抗剂活性。

本发明的抗PCSK9抗体与PCSK9结合的平衡解离常数(K_D)一般小于约10^-8M或10^-9M，例如，小于约10^-10M或10^-11M，在一些实施方案中小于约10^-12M或10^-13M。

任选地，可以根据本发明的方法多聚化和使用抗PCSK9抗体。抗PCSK9抗体可以是全长四聚体抗体(即，具有两条轻链和两条重链)、单链抗体(例如,scFv)、或包含抗体片段的分子，所述抗体片段形成一个或多个抗原结合位点并赋予PCSK9结合特异性，例如，包含重链和轻链可变区的分子(例如，Fab'或其它类似的片段)。

本发明还提供编码本文中描述的抗体的多核苷酸，例如，编码如本文中描述的重链或轻链可变区或包含互补决定区的片段的多核苷酸。在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43和SEQ ID NO:54的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:55的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:42的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:45的多核苷酸(即，LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:42的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:44的多核苷酸(即，LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:43的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:45的多核苷酸(即，LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:54的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:55的多核苷酸(即，小鼠LFU720)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。

3．用于鉴定抗PCSK9抗体的测定试验

可以通过产生抗PCSK9抗体，然后测试每个抗体减少或抑制PCSK9介导的事件(例如，与LDLR结合，促进LDLR降解)的能力，以鉴定拮抗剂抗体。可以在体外或体内进行该测定试验。优选与PCSK9结合、不阻止PCSK9与LDLR结合、和减少或抑制PCSK9介导的LDLR降解的抗体。

可以使用本领域已知的方法测定抗体或抗原结合分子与PCSK9的结合，所述方法包括但不限于ELISA、Biacore和Western印迹。

也可以使用本领域已知的任何方法，测定PCSK9介导的LDLR降解。在一些实施方案中，使用输注小鼠模型，测定抗PCSK9抗体或抗原结合分子抑制LDLR降解的能力。将抗PCSK9抗体或抗原结合分子经静脉输注(例如,3μg/小时)到小鼠中，测定肝脏膜制品中LDLR水平，并与来自接受了静脉输注对照抗体(例如，与不相关的抗原结合的抗体)的小鼠的肝脏膜制品中LDLR水平相比较。与接受了对照抗体的小鼠相比较，接受了拮抗剂抗PCSK9抗体的小鼠将具有可检测地更高水平(例如，至少高10%、20%、50%、80%、100%)的LDLR。

也可以测试抗PCSK9拮抗剂抗体在降低血浆LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇水平上的治疗功效。将抗PCSK9抗体或抗原结合分子经静脉输注(例如,3μg/小时)到哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、非人灵长类动物、人)中，测定血浆LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇水平，并与来自治疗前的相同哺乳动物或来自接受了静脉输注对照抗体(例如，与不相关的抗原结合的抗体)的哺乳动物的血浆LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇水平相比较。与治疗前的哺乳动物或接受了对照抗体的哺乳动物相比较，接受了拮抗剂抗PCSK9抗体的哺乳动物将具有可检测地更低(例如，低至少10%、20%、50%、80%、100%)的血浆LCL-C、非HDL-C和/或总胆固醇水平。

4．包含抗PCSK9抗体的组合物

本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子，所述抗体或抗原结合分子与药学上可接受载体配制在一起。组合物可以还包含其它适用于治疗或预防给定失调的治疗剂。药学载体增强或稳定组合物，或便于组合物的配制。药学上可接受载体包括生理可接受的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。

可以用本领域已知的多种方法对本发明的药物组合物进行给药。给药的途径和/或模式根据期望结果而不同。优选通过静脉、肌内、腹膜内、或皮下给药，或给药到目标位置的附近。药学上可接受载体应该适合于静脉、肌内、皮下、肠胃外、鼻内、吸入、脊柱、或表皮给药(例如，通过注射或输注)。根据给药的途径，可以将活性化合物(即，抗体、双特异性和多特异性分子)包在包衣料中，以保护化合物免受可造成化合物失活的酸和其它自然条件的作用。

可以将抗体，单独或与其它合适的组分组合，制成气雾剂(即，它们可以被“雾化”)以通过吸入来给药。可以将气雾剂置于加压的可接受的抛射剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。

在一些实施方案中，组合物是无菌的和流动的。可以例如通过使用例如卵磷脂等包衣剂、在分散剂的情况下通过维持所要求的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)、和氯化钠。可以通过在组合物中包括延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现注射型组合物的长期吸收。

可以依照本领域公知和常规使用的方法，制备本发明的药物组合物。药学上可接受的载体部分地由所给药的特定组合物，以及由用于组合物给药的特定方法来确定。因此，存在很多种合适的本发明药物组合物制剂。用于配制抗体和确定适当剂量及给药方案的适用方法可以在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,University ofthe Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams和Wilkins编辑(2005)中，和在Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press中，和在Martindale,Martindale:TheExtra Pharmacopoeia,第31版,1996,Amer Pharmaceutical Assn和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978中找到，由此将其每一均通过引用的方式并入本文。优选在GMP条件下制备药物组合物。一般在本发明药物组合物中使用抗PCSK9抗体的治疗有效剂量或有用剂量。通过本领域技术人员已知的常规方法，将抗PCSK9抗体配成药学上可接受的剂型。调整给药方案以提供期望的反应(例如，治疗反应)。在确定治疗或预防有效剂量中，可以先低剂量给药，然后逐步增加直到获得期望的反应而具有最小的或没有不需要副作用。例如，可以给予单个的大剂量(bolus)，可以在一段时间内给予几个分剂量，或可以依据治疗情形的紧迫性，按比例减少或增加剂量。特别有利的是，以单位剂量形式配制肠胃外组合物，以易于给药和达成剂量的均一性。如本文中使用的单位剂量形式指合适作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理上分离的单位；每个单位包含预先确定的量的活性化合物，所述量经计算可以在与所需药物载体结合的情况下产生期望的治疗效果。

为了获得对特定的患者、组合物和给药模式可以有效达到期望治疗反应而对患者没有毒性的活性成分的量，本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以是变化的。所选择的剂量水平取决于多种药物动力学因素，所述因素包括所使用的特定本发明组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所使用的特定化合物的***速率，治疗持续时间，与所使用的特定组合物结合使用的其它药物、化合物和/或物质，所治疗的患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康状况和以前的病史等因素。

在一些实施方案中，药物组合物包含抗PCSK9抗体或抗原结合分子和第二药的混合物。例如，组合物可以包含本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子和已知有利于降低胆固醇(包括LDL-C、非HDL-C和总胆固醇)和/或升高HDL-C的试剂。

可与本发明抗PCSK9抗体或抗原结合分子包含于混合物中的示例性第二药包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂(即，他汀类药)、贝特类药(例如，氯贝特(clofibrate)、吉非贝特(gemfibrozil)、非诺贝特(fenofibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate))、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂(例如，消胆胺(cholestyramine)、降胆宁(colestipol)、colesvelam)、回肠胆汁酸转运(IBAT)抑制剂、甲状腺激素模拟物(例如，化合物KB2115)、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和γ双重激动剂、酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂、Niemann Pick C1-样1(NPC1-L1)抑制剂(例如,依折麦布(ezetimibe))、ATP结合盒(ABC)蛋白G5或G8的激动剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸。降脂药在本领域已知，其描述于例如Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版,Brunton,Lazo和Parker编辑,McGraw-Hill(2006);2009Physicians’Desk Reference(PDR),例如,第63版(2008),Thomson PDR中。

可以用于本发明组合物中的另外的降脂药描述和/或综述于例如Chang等,Curr Opin Drug Disco Devel(2002)5(4):562-70;Sudhop等,Drugs(2002)62(16):2333-47;Bays和Stein,Expert Opin Pharmacother(2003)4(11):1901-38;Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003)Mar(134):45-50;Tomoda和Omura,Pharmacol Ther(2007)115(3):375-89;Tenenbaum等,Adv Cardiol(2008)45:127-53;Tomkin,Diabetes Care(2008)31(2):S241-S248;Lee等,J Microbiol Biotechnol(2008)18(11):1785-8;Oh等,Arch Pharm Res(2009)32(1):43-7;Birch等,J Med Chem(2009)52(6):1558-68;以及Baxter和Webb,Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320中。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子作为与他汀类药的混合物来提供。示例性的他汀类药包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子作为与诱发高胆固醇血症或甘油三酯血症的药的混合物来提供。例如，该第二药可以是蛋白酶抑制剂，例如沙奎那韦(Saquinavir)、利托那韦(Ritonavir)、茚地那韦(Indinavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、安普那韦(Amprenavir)、洛匹那韦(Lopinavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、福沙那韦(Fosamprenavir)、替拉那韦(Tipranavir)、达芦那韦(Darunavir)、阿巴卡韦-拉米夫定-齐多夫定(abacavir-lamivudine-zidovudine)(三协唯(Trizivir))。在一些实施方案中，第二药为他克莫司(Tacrolimus)。

5．使用抗PCSK9抗体的方法

a.以抗PCSK9抗体治疗的病况

本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子可用于治疗由PCSK9的活性或过度活性介导的任何疾病状况。

例如，由于多种原因或病因而患有或有危险患有血脂异常或高胆固醇血症的个体可以受益于本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子的施用。例如，个体可以患有家族或遗传传递的纯合性或杂合性高胆固醇血症，其中存在功能性LDL-R。与家族或遗传传递的高胆固醇血症相关的或引起该病的遗传突变概述于例如Burnett和Hooper,Clin Biochem Rev(2008)29(1):11-26中。个体也可以患有其它疾病状况、或从事有助或增加血脂异常或高胆固醇血症患病风险的行为。例如，个体可以是肥胖的、或患有糖尿病或代谢综合症。个体可以是吸烟者、具有久坐不动的生活方式、或高胆固醇饮食。

靶向PCSK9可以用于降低、逆转、抑制或阻止血脂异常、高胆固醇血症和餐后甘油三酯血症。见例如，Le May等,Arterioscler ThrombVasc Biol(2009)29(5):684-90;Seidah,Expert Opin Ther Targets(2009)13(1):19-28;和Poirier等,J Biol Chem(2009)PMID 19635789。因此，本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子的用药可用于在有需要的个体中降低、逆转、抑制或阻止血脂异常、高胆固醇血症和餐后甘油三酯血症。

本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子可用于在有需要的个体中减少或降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。个体可以具有持续升高的LDL-C水平。在一些实施方案中，个体的LDL-C血浆水平持续高于80mg/dL，例如高于90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或更高。本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子也可用于在有需要的个体中减少或降低非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)或总胆固醇。

个体可以已经服用了其它药来降低胆固醇，并抵抗或不耐受该药。例如，个体可以已经在他汀类药物治疗方案下，该方案可能已经被证明在该个体中在将LDL-C、非HDL-C或总胆固醇降低到可接受的水平上是无效的。个体也可以是不耐受他汀类用药的。将本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体和抗原结合分子与可以用于降低LDL-C或非HDL-C和/或升高HDL-C的第二药联合施用，将例如，通过允许施用较低剂量的第二药，而提高第二药的功效和耐受性。

在一些实施方案中，个体在PCSK9基因中含有功能获得性突变，例如导致LDLR的降解异常增加的突变。

在一些实施方案中，个体正在接受诱发血脂异常或高胆固醇血症的药剂，即，个体患有药物诱导性血脂异常或高胆固醇血症。例如，个体可以正在接受蛋白酶抑制剂治疗方案，例如，用于治疗HIV感染。另一种已知导致血浆甘油三酯水平升高的药是他克莫司(Tacrolimus)，它是一种给移植患者施用的免疫抑制性药物。环孢菌素已经被证实显著增加LDL。见例如，Ballantyne等,(1996)78(5):532-5。第二代抗精神病药(例如，阿立哌唑(aripiprazole)、氯氮平(clozapine)、奥氮平(olanzapine)、喹硫平(quetiapine)、利培酮(risperidone)和齐拉西酮(ziprasidone))也已经与血脂异常相关。见例如，Henderson,J Clin Psychiatry(2008)69(2):e04和Brooks等,Curr Psychiatry Rep(2009)11(1):33-40。

b.抗PCSK9抗体的施用

医生或兽医可以以低于达到期望疗效所需水平的剂量水平，开始药物组合物中本发明抗体的剂量，然后逐渐增加剂量直到获得期望效果。通常，本发明的组合物的有效剂量根据许多不同的因素而变化，所述因素包括待治疗的特定疾病或状况、给药的方式、靶点、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其它药物、和治疗是预防性还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。对于抗体用药，剂量范围从约0.0001至100mg/kg、更通常为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。可以每天、每周、每两周、每月或，按需要或期望，更频繁地或频度较低地用药。示例性治疗方案是每周一次、每两周一次、或每月一次或每3至6月一次施用。

在一些实施方案中，施用编码本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子的多核苷酸。在药剂为核酸的实施方案中，典型的剂量可以是约0.1mg/kg体重直到和包括约100mg/kg体重，例如，在约1mg/kg体重至约50mg/kg体重之间。在一些实施方案中，约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg/kg体重。

可以单剂或分剂量施用抗体。通常多次施用抗体。单次剂量之间的时间间隔可以，按需要或期望的，是一周一次、两周一次、一月一次或一年一次。时间间隔也可以是不定的，由测量患者中血液抗PCSK9抗体的水平来指示。在一些方法中，调整剂量以使血浆抗体浓度达到1–1000μg/ml，在一些方法中达到25-300μg/ml。可选地，在需要较低频率给药时，可以将抗体以持久释放制剂的形式施用。剂量和频率随患者中抗体的半衰期而变化。通常，人源化抗体表现比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。给药的剂量和频率可以随治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以在一段长时间内，按相对不频繁的时间间隔，施用相对低的剂量。一些患者在其生命的剩余时间内持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔施用相对高的剂量，直到疾病的发展被减弱或终止，优选直到患者的疾病症状表现出部分或完全改善。此后，患者可以采用预防性方案。在一些实施方案中，当患者中血浆LDL-C水平升高到预先确定的阈值水平以上时，例如至少约80mg/dL，例如至少约90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或更高时，施用抗PCSK9抗体或抗原结合剂。

c.与第二药的共施用

PCSK9抗体拮抗剂可以与已知有利于降低胆固醇(包括LDL-C、非HDL-C和总胆固醇)和/或升高HDL-C的药组合使用。

活性剂可以与抗PCSK9拮抗剂抗体以混合物的形式一起施用，或者每一种活性剂可以分开地施用。抗体活性剂和其它活性剂可以但不必须同时用药。

用于与本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子一起共施用的示例性第二药包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂(即，他汀类药)、贝特类药(例如，氯贝特、吉非贝特、非诺贝特、环丙贝特、苯扎贝特)、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂(例如，消胆胺、降胆宁、colesvelam)、回肠胆汁酸转运(IBAT)抑制剂、甲状腺激素模拟物(例如，化合物KB2115)、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和γ双重激动剂、酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂、Niemann Pick C1-样1(NPC1-L1)抑制剂(例如,依折麦布(ezetimibe))、ATP结合盒(ABC)蛋白G5或G8的激动剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸。

另外有用的降脂药描述和/或综述于例如Chang等,Curr Opin DrugDisco Devel(2002)5(4):562-70;Sudhop等,Drugs(2002)62(16):2333-47;Bays和Stein,Expert Opin Pharmacother(2003)4(11):1901-38;Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003)Mar(134):45-50;Tomoda和Omura,Pharmacol Ther(2007)115(3):375-89;Tenenbaum等,Adv Cardiol(2008)45:127-53;Tomkin,Diabetes Care(2008)31(2):S241-S248;Lee等,JMicrobiol Biotechnol(2008)18(11):1785-8;Oh等,Arch Pharm Res(2009)32(1):43-7;Birch等,J Med Chem(2009)52(6):1558-68;以及Baxter和Webb,Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子与他汀类药一起共施用。示例性的他汀类药包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子与诱发高胆固醇血症或甘油三酯血症的药剂一起共施用。例如，第二药可以是蛋白酶抑制剂，例如沙奎那韦(Saquinavir)、利托那韦(Ritonavir)、茚地那韦(Indinavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、安普那韦(Amprenavir)、洛匹那韦(Lopinavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、福沙那韦(Fosamprenavir)、替拉那韦(Tipranavir)、达芦那韦(Darunavir)、阿巴卡韦-拉米夫定-齐多夫定片(abacavir-lamivudine-zidovudine)(三协唯(Trizivir))。在一些实施方案中，第二药为他克莫司(Tacrolimus)。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子与特异靶向PCSK9或apoB100的抑制性核酸(例如，siRNA、miRNA、反义序列、核酶)一起共施用。

6．药盒

本发明的药物组合物可以以药盒的形式提供。在某些实施方案中，本发明的药盒包含如本文中描述的抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子。抗PCSK9抗体或抗原结合分子可以以均一的或变化的剂量提供。

在一些实施方案中，药盒包含如本文中描述的一种或多种第二药。第二药可以与抗PCSK9抗体或抗原结合分子在相同的制剂中或在分开的制剂中提供。第一和第二药的剂量各自独立地可以是均一的或变化的。

在一些实施方案中，药盒包含PCSK9抗体拮抗剂和一种或多种已知有利于降胆固醇(包括LDL-C、非HDL-C和总胆固醇)和/或升高HDL-C的药。

用于与本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体或抗原结合分子一起包含在药盒中的示例性第二药包括但不限于，HMG-CoA还原酶抑制剂(即，他汀类药)、贝特类药(例如，氯贝特、吉非贝特、非诺贝特、环丙贝特、苯扎贝特)、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂(例如，消胆胺、降胆宁、colesvelam)、回肠胆汁酸转运(IBAT)抑制剂、甲状腺激素模拟物(例如，化合物KB2115)、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和γ双重激动剂、酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂、Niemann Pick C1-样1(NPC1-L1)抑制剂(例如,依折麦布(ezetimibe))、ATP结合盒(ABC)蛋白G5或G8的激动剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸。

可以用于药盒的另外的降脂药描述和/或综述于例如Chang等,CurrOpin Drug Disco Devel(2002)5(4):562-70;Sudhop等,Drugs(2002)62(16):2333-47;Bays和Stein,Expert Opin Pharmacother(2003)4(11):1901-38;Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003)Mar(134):45-50;Tomoda和Omura,Pharmacol Ther(2007)115(3):375-89;Tenenbaum等,Adv Cardiol(2008)45:127-53;Tomkin,Diabetes Care(2008)31(2):S241-S248;Lee等,J Microbiol Biotechnol(2008)18(11):1785-8;Oh等,ArchPharm Res(2009)32(1):43-7;Birch等,J Med Chem(2009)52(6):1558-68;以及Baxter and Webb,Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320中。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子与他汀类药一起在药盒中提供。示例性的他汀类药包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或抗原结合分子与诱发高胆固醇血症或甘油三酯血症的药剂一起在药盒中提供。例如，第二药可以是蛋白酶抑制剂，例如沙奎那韦(Saquinavir)、利托那韦(Ritonavir)、茚地那韦(Indinavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、安普那韦(Amprenavir)、洛匹那韦(Lopinavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、福沙那韦(Fosamprenavir)、替拉那韦(Tipranavir)、达芦那韦(Darunavir)、阿巴卡韦-拉米夫定-齐多夫定片(abacavir-lamivudine-zidovudine)(三协唯(Trizivir))。在一些实施方案中，第二药为他克莫司(Tacrolimus)。

实施例

提供了以下实施例来对本发明进行举例说明而不是加以限制。

实施例1：Pcsk9拮抗剂NVPLFU720的产生和鉴定

概述

进行了产生抗Pcsk9的功能性抗体拮抗剂的研究。鉴定出了多个杂交瘤，这些杂交瘤分泌能够与加His标签的该蛋白质结合的抗体。对来自杂交瘤的抗体进行功能性拮抗剂活性的评估，所述活性由抗体抑制HepG2细胞上Pcsk9介导的LDL受体降解（从而导致这些细胞摄取LDL胆固醇的能力增加）的能力来度量。鉴定出了强效功能性鼠抗人Pcsk9 IgG1-κ单克隆抗体，将其命名为NVP-LFU720(LFU720)。

方法

抗原和其它蛋白质

通过HEK293Freestyle^TM细胞(Invitrogen,Carlsbad,Ca)的转染，产生分泌人Pcsk9蛋白的稳定表达细胞系。简言之，使用Lipofectamine2000^TM转染试剂和具有mellittin信号序列、成熟Pcsk9cDNA(aa 31-692)和在序列C端上的his6(SEQ ID NO:57)标签(由E.Hampton克隆,GNF,NPL 010051)的重组质粒，转染在BioCoat摇瓶(Becton Dickinson)上以贴壁模式在补加了10%胎牛血清的Freestyle^TM培养基(Invitrogen)中培养的细胞。转染后48小时，通过向培养基中加入100μg/mL Zeocin，开始阳性转染子的选择。4周后，形成了4个生产Pcsk9的细胞的稳定细胞池。使生产水平最高的4号池在Freestyle^TM培养基中适应无血清悬浮条件，随后按比例扩大，以使用Wave^TM生物反应器在10-20L生产量的规模上进行大规模生产。

随着时间进行几轮后，获得以12至30mg/L的速率生产的重组蛋白。收获细胞上清液，通过交叉流过滤进行浓缩。将得到的浓缩液以0.5mL/分钟加载到25mL NiNTA His-Bind Superflow柱(以50mM Tris/300mM NaCl/1mM CaCl2/2mM β-巯基乙醇(pH 7.4)进行平衡)。在以50mMTris/300mM NaCl/20mM咪唑(pH 7.4)进行基线洗涤后，以50mMTris/300mM NaCl/250mM咪唑(pH 7.4)洗脱结合的物质。将得到的洗脱物对PBS(pH 7.3)透析，过滤除菌和进行等分。通过分析性大小排阻色谱，分析样品，以确定低聚化。纯化的蛋白质得到的HPLC色谱显示出两个峰，主峰占85%。全长蛋白质的HPLC-ESI MS分析揭示了质量58176.0Da，这与从所有半胱氨酸残基均被氧化的mellitin-hsPcsk9 aa31-692-His预期的质量相符。部分样品还被N糖基化。约13kD质量的污染性蛋白最可能是蛋白质的游离原结构域(pro-domain)。再次使用在Freestyle培养基中无血清悬浮培养的HEK293 Freestyle细胞，以大规模瞬时表达的方法，生产了来自小鼠和食蟹猴的Pcsk9的相应同源物。使用聚乙烯亚胺作为质粒DNA的载体，按1:3(μg/mL:μg/mL DNA:PEI)的比例，将重组质粒——具有天然前导序列和C末端his6(SEQ ID NO:57)标签特征的小鼠Pcsk9 cDNA和具有CD33前导序列和C末端his6(SEQ IDNO:57)标签特征的cyno Pcsk9——转染到Freestyle细胞中。在Wave^TM生物反应器中，以10升的规模进行多轮生产，以类似于上文描述的用于人Pcsk9蛋白的操作程序，进行蛋白质纯化和表征。小鼠Pcsk9蛋白的产率在0.7至2.7mg/L培养基之间，cyno Pcsk9以3.1mg/L获得。

产生杂交瘤

免疫小鼠和产生杂交瘤

在免疫Bcl-2转基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2)22wehi品系)之前，以弗氏完全佐剂按1:1稀释纯化的Pcsk9。采用要求多位点重复免疫(RIMMS)的程序免疫小鼠。简言之，以1-3μg的抗原，在接近外周***(PLN)的8个特定位点，注射小鼠。在12天内重复该程序6次。在第12天，采集测试血液，使用ELISA分析血清抗体滴度。在第15天，从高滴度小鼠移出合并的PLN。为了收获淋巴细胞，以plain DMEM洗涤PLN两次，然后，通过.22微米的滤网(Falcon#352350)来进行离解。在融合前，将得到的淋巴细胞再洗涤2次。按2.5个淋巴细胞对1个NSO细胞的比例，将NSO/Bcl-2骨髓瘤细胞与淋巴细胞混合。将细胞混合物离心，随后，在1分钟内将1mL的PEG 1500逐滴加到细胞沉淀中。30秒后，缓慢加入1mL的DMEM，1分钟后，在5分钟内加入19mL的DMEM。沉淀融合的细胞，以2x 10⁵个细胞/mL的密度重悬浮在HAT培养基(DMEM+20%FBS,Pen/Strep/Glu,1x NEAA,1x HAT,0.5xHFCS)中，于37℃放置1小时。然后将细胞按每孔60μL加到384孔板中。

筛选分泌抗Pcsk9的功能性抗体的杂交瘤

融合后10天，对杂交瘤平板筛选Pcsk9特异性抗体的存在。为了进行ELISA筛选，以50μL的Pcsk9包被Maxisorp 384孔板(Nunc#464718)(于PBS中稀释到15ng/孔)，于4℃孵育过夜。吸除剩余的蛋白质，以于PBS中1%的BSA封闭孔室。在于室温下孵育30分钟后，以PBS+0.05%吐温(PBST)洗涤孔室4次。将15μL杂交瘤上清液转移到ELISA平板中。将15μL在移出PLN时采取的小鼠血清按1:1000稀释在PBS中，作为阳性对照加入。在ELISA平板上的所有孔中加入50μL二抗(山羊抗小鼠IgG–HRP(Jackson Immuno Research#115-035-071),按1:5000稀释在PBS中)。在于室温下孵育1小时后，以PBST洗涤平板8次。加入25μL TMB(KPL#50-76-05)，于室温孵育30分钟后，在605nm处读取平板吸光度。将来自阳性孔的细胞扩大至24孔板的HT培养基(DMEM+20%FBS,Pen/Strep/Glu,1x NEAA,1x HT,0.5x HFCS)中。

抗体纯化

使用蛋白G(Upstate#16-266(Billerica,MA))纯化包含LFU720的上清液。在加载上清液之前，以10倍柱体积的PBS平衡树脂。在样品结合后，以10倍柱体积的PBS洗涤柱，然后以5倍柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.0)洗脱抗体。立即以1/10体积的Tris HCl(pH 9.0)中和柱级分。测量级分的OD280，合并阳性级分，将其对PBS(pH 7.2)透析过夜。

结合动力学和Biacore测定

使用光学生物传感器Biacore S51，通过表面等离子共振测量，测定动力学结合参数。该技术允许无标记测定配体与受体的结合(k_a)和解离(k_d)微观速率常数。因此，它特别适合于表征抗体-抗原相互作用。

通过以事先固定在S系列CM-5Biacore传感器芯片(经认证的)(Biacore#BR-1005-30)上的兔抗小鼠Fcγ抗体(Biacore#BR-1005-14)捕获小鼠抗体LFU720，进行Pcsk9与LFU720(2μg/mL)的结合研究。以‘Amine Coupling试剂盒’(Biacore#BR-1000-50)进行Fcγ捕获抗体的共价结合。以10μl/分钟的流速，将捕获抗体(兔抗小鼠)，以10mM乙酸钠(pH 5)中的50μg/mL抗Fcγ抗体溶液(Biacore#BR-1003-51)，结合到EDC活化的葡聚糖表面。使0.5μM至7.8nM(2倍系列稀释)浓度范围的Pcsk9，在PBS加100mM NaCl,0.005%P20(Biacore#BR-1000-54)中，从捕获的LFU720芯片上流过。使用Biacore S51评估软件，分析得到的传感图。将从所有浓度得到的数据全体地拟合到1:1Langmuir模型上。

TR-FRET测定

在384孔白色浅平板(Perkin Elmer,6008280)中进行TR-FRET测定。在15μL的测定缓冲液(20mM HEPES,pH 7.2,150mM NaCl,1mMCaCl2,0.1%v/v吐温20和0.1%w/v BSA)中，将hPcsk9-AF(10.7nM)与系列稀释的未标记的hPcsk9蛋白、EGF-A肽或NVP-LFU720-AX-1抗体室温孵育30分钟。随后，将5μL于测定缓冲液中的hLDL-R-Eu(4nM)加到hPcsk9和NVP-LFU720-AX-1预孵育的复合物中，于室温孵育90分钟。这些标记的蛋白质的最终浓度为8nM的hPcsk9-AF和1nM的hLDL-R-Eu。以EnVision 2100多标记读取仪(Perkin Elmer)，在330nm激发和665nm发射下，测量TR-FRET信号。使用以下公式将数据转化为经标化的数值：[(665nm值x 10,000)/(615nm值)]。用以下公式计算百分比抑制率：100-[(处理样品的标化后数值/未处理样品的平均标化后数值)x 100]。使用Prism第5版，以公式Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))(GraphPad Prism软件)，绘制百分比抑制剂量反应曲线。

LDL-R周转率测定

以胰蛋白酶处理HepG2细胞，将细胞按每孔6x 10⁴个细胞种到预先以1%v/v胶原蛋白包被的平底96孔板(Corning,3595)中的100μL培养基中，然后，在5%CO2中于37°C孵育24小时。通常，以100μL包含hPcsk9蛋白、EGF-A肽和/或NVP-LFU720-AX-1抗体的无血清培养基处理细胞。处理后，弃去培养基，以100μL的PBS洗涤细胞。为了收获细胞，加入100μL的Versine(Biowhittaker,17-771E)，在5%CO2中于37°C孵育1小时，随后加入100μL FACS缓冲液。将细胞转移到V形底96孔板(Corning,3894)中，于1200rpm离心5分钟，以沉淀细胞。为了封闭细胞上非特异性结合位点，向每个孔中加入50μL 100μg/mL于FACS缓冲液中的正常兔IgG(MP biomedicals,55944)和小鼠IgG(Sigma,I5381)，在冰上孵育30分钟。于1200rpm离心细胞5分钟，通过轻拍平板除去缓冲液。为了标记细胞，向每个孔中加入于FACS缓冲液中的10μL兔抗hLDL-R-Alexa 647IgG(5μg/mL)和10μL小鼠抗铁传递蛋白-R-藻红蛋白(PE)IgG(2μg/mL)(CD71,Becton Dickinson Biosciences,624048)标记的抗体，在冰上孵育60分钟。于1200rpm离心细胞5分钟，通过轻拍平板除去缓冲液。通过以每孔200μL的FACS缓冲液洗涤细胞两次来除去未结合的抗体。在于PBS中的1%多聚甲醛中固定细胞，使用BDLSR II流式细胞仪和FACSDIVA软件(Becton Dickinson)，对活细胞进行设门(gate)(5000)和分析。在488nm激发和575nm发射下测量PE荧光的中值。在488nm激发和633nm发射下测量Alexa 647荧光的中值。通过Covance(Denver,PA,美国)制备了定制的兔抗hLDL-R多克隆IgG 583，用于HepG2细胞上表面hLDL-R的FACS检测。对于在HepG2细胞表面上检测hLDL-R，兔抗hLDL-R IgG 583表现出约7倍于正常兔IgG的窗口。为了确定抗hLDL-R IgG 583对HepG2细胞表面上LDL-R的特异性，用hLDL-R蛋白作为该IgG结合的竞争剂，进行了实验。观察到了随着hLDL-R蛋白浓度的增加，抗hLDL-R IgG 583对HepG2细胞的平均中值荧光的剂量依赖性降低。这证明，如通过FACS所测量的，抗hLDL-R IgG 583特异地识别HepG2细胞表面上LDL-R。后期工作直接将标记的抗hLDL-R-583-Alexa 647IgG用于HepG2细胞表面上LDL-R的FACS定量。

LDL-C摄取

以胰蛋白酶处理HepG2细胞，将细胞按每孔6x 10⁴个细胞种到预先以1%v/v胶原蛋白包被的平底96孔板(Corning,3595)中的100μL培养基中，然后，在5%CO2中于37°C孵育24小时。除非另作说明，以100μL包含hPcsk9蛋白、EGF-A肽和/或NVP-LFU720-AX-1抗体的无血清培养基处理细胞。处理后，向每个孔加入20μL于无血清培养基中的30μg/mL 3,3’-双十八烷基吲哚羰花青标记的低密度脂蛋白(DiI-LDL)(Intracell,RP-077-175)，在5%CO2中于37°C孵育2小时。通过轻拍平板，除去培养基，以100μL磷酸盐缓冲盐水(不含钙或镁的PBS,Invitrogen,14190-144)洗涤细胞。通过轻拍平板，弃去PBS，向每个孔中加入100μL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA，在5% CO2中于37°C孵育5分钟。向每个孔中加入100μL FACS缓冲液(含5%FBS、2mM EDTA和0.2%叠氮化钠的PBS)，通过于1200rpm离心5分钟沉淀细胞。通过轻拍平板，除去培养基，通过向每个孔中加入50μL于PBS中的1%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences,15710)固定细胞。使用BD LSR II流式细胞仪和FACSDIVA软件(Becton Dickinson)，对活细胞进行设门和分析。在488nm激发和575nm发射下测量DiI-LDL荧光的中值，分析了5000个细胞。使用微软Excel 2002(微软公司)绘制条形图。按如下计算活化百分比：%活化=[1-(X÷A)]x 100，其中X=来自样品孔的中值荧光读数，A=来自仅以hPcsk9处理的孔的中值荧光读数。

将活化百分比相对于处理，进行绘图，从使用公式Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)x HillSlope))和GraphPad Prism 5(GraphPad软件)产生的剂量反应曲线，确定EC₅₀。

结果

抗人Pcsk9单克隆抗体的产生

从以Pcsk9蛋白免疫的动物的原代***，收获B细胞。使用标准PEG介导的融合，产生了杂交瘤。通过ELISA测定所得到的融合物，鉴定出与人Pcsk9的阳性结合者，并扩大以产生上清液。随后通过功能测定，将多个鉴定出的ELISA阳性克隆进行分类。被鉴定为先导候选者的克隆是LFU720。除了我们的先导候选者LFU720以外，也鉴定出了多个其它克隆，这些克隆不能阻断Pcsk9和LDLr的相互作用(如通过FRET所度量的)，但当与Pcsk9结合时能够阻断Pcsk9介导LDLr降解的能力(如通过LDLc摄取来度量的)，包括克隆21D6、5A4-C1和13F1。克隆21D6也显示出能够在体内阻断Pcsk9的LDLr降解作用。

针对与Pcsk9的特异性结合，筛选LFU720

通过在ELISA中评估与一系列其它蛋白质的结合，检测了LFU720的特异性。将LFU720与三种其它带HIS标签的蛋白质的结合，和与Pcsk9-HIS的结合进行了比较。这证明了与Pcsk9的结合是特异的，以及抗体不与HIS标签结合。

评估LFU720与食蟹猴Pcsk9的结合

测定了LFU720与Pcsk9的食蟹猴同源物的结合。为了进行该测定，与Ni捕获平板一起使用来自表达食蟹猴HIS标签Pcsk9的细胞的上清液，从而避免纯化该材料的需要。稀释人Pcsk9，也通过其HIS标签进行捕获。LFU720与人和食蟹猴Pcsk9都能够结合。5P20在ELISA中不与人LDL-R或小鼠Pcsk9结合。

LFU720的结合动力学

通过使用光学生物传感器技术(Biacore)，分析了识别人Pcsk9蛋白的小鼠抗体LFU720的结合亲和力。发现LFU720与重组人Pcsk9的结合具有亚纳摩尔亲和力(KD=200pM)的高亲和力。

LFU720阻断Pcsk9/LDL-R相互作用的筛选

使用TR-FRET测定法来确定抗hPcsk9抗体NVP-LFU720是否能够破坏hPcsk9-AF与hLDL-R-Eu标记的蛋白质之间的相互作用。对未标记的hPcsk9蛋白或EGF-A肽进行评估，以证明该测定法能够检测TR-FRET信号（由hLDL-R-Eu与hPcsk9-AF标记的蛋白质的相互作用引起）所遭到的破坏。增加浓度的未标记hPcsk9和hPcsk9-AF竞争与hLDL-R-Eu结合，这导致TR-FRET信号的降低。EGF-A肽破坏了hLDL-R-Eu与hPcsk9-AF之间的相互作用，其具有2.5μM的IC50。相反，NVP-LFU720不能很好地破坏hPcsk9-Eu与hLDL-R-AF之间的TR-FRET信号，其具有大于1000nM的IC50，并在低抗体浓度下表现出U形反应。

LFU720抑制Pcsk9介导的LDL-R降解的筛选

已经显示，Pcsk9与LDL-R的结合导致LDL-R降解，使用HepG2细胞和重组人Pcsk9对此进行了证实。测定了LFU720与Pcsk9结合以及阻断该效应的能力。NVP-LFU720抑制外源hPcsk9处理的HepG2细胞，导致细胞表面LDL-R增加。

LFU720抑制Pcsk9和恢复LDL摄取的筛选

Pcsk9介导的LDL-R降解的抑制应该导致恢复HepG2细胞内化LDL-C的能力。NVP-LFU720阻止了以外源hPcsk9处理的HepG2细胞上Pcsk9介导的LDL-R降解，并导致DiI-LDL摄取的增加，EC50为99nM。

实施例2：产生PCSK9拮抗剂抗体NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211

引言

该实施例描述了通过改造鼠单克隆PCSK9拮抗剂抗体NVP-LFU720以使其与人种系抗体具有更高的序列同源性，从而产生人抗体NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP LGT211。NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP LGT211保留了亲本鼠抗体NVP-LFU720的表位特异性、亲和力、和与食蟹猴PCSK9的交叉反应性。比原始鼠抗体，NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP LGT211与人种系序列具有高得多的同源性，因此应该更好地被人免疫***所耐受。

将小鼠单克隆抗体LFU720进行Humaneered^TM，以使其蛋白质序列更接近人种系序列和降低其免疫原性。Humaneering^TM技术可通过南旧金山的KaloBios(在万维网kalobios.com上)获得。抗体的Humaneering^TM产生改造的人抗体，其具有与人种系序列高度同源的V区序列，而仍然保留了亲本或参考抗体的特异性和亲和力(美国专利公布2005/0255552和2006/0134098)。该程序首先鉴定出参考Fab的重链和轻链可变区中的最小抗原结合特异性决定簇(BSDs)(一般是重链CDR3和轻链CDR3中的序列)。由于这些重链和轻链BSDs在Humaneering^TM过程中构建的所有文库中都被保留下来，因此每个文库都是表位聚焦的，且最终的、充分Humaneered^TM的抗体保留原始鼠抗体的表位特异性。

接着，产生完整链文库(其中以人序列的文库置换整个轻链或重链可变区)和/或盒文库(其中以人序列文库置换小鼠Fab的重链或轻链可变区的一部分)。使用细菌分泌***将文库的成员表达为抗体Fab片段，使用菌落转印结合试验(CLBA)对文库筛选结合抗原的Fabs。对阳性克隆进行进一步的表征，以鉴定那些具有最高亲和力的克隆。然后，将鉴定到的在剩余的鼠序列背景中支持结合的人盒，在最终的文库筛选中组合，以产生完全地人V区。

所得到的Humaneered^TM的Fabs具有来自人文库的V片段序列，保留在CDR3区中鉴定的短BSD序列，并具有人种系构架区4。通过将这些重链和轻链的可变区克隆到IgG表达载体中，将这些Fabs转化为完整的IgGs。在该过程中产生的完全Humaneered^TM的抗体保留了亲本鼠抗体的结合特异性，一般具有与亲本抗体等同的或比其更高的亲和力，并具有在蛋白质水平上与人种系抗体基因有高度序列同一性的V区域。

方法

鼠V区的克隆

使用RT-PCR，从使用标准方法自杂交瘤细胞系中分离的RNA，扩增鼠单克隆NVP-LFU720的V区DNA。成功用于自杂交瘤cDNA PCR扩增重链可变区的引物是V_H14(5’-CTTCCTGATGGCAGTGGTT-3’;SEQ ID NO:58)(Chardes T等,1999,FEBS Letters;452(3):386-94)和HCconstant    (5’-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3’;SEQ ID NO:59)。成功用于自杂交瘤cDNA PCR扩增轻链(κ)可变区的引物是Vκ4/5(5’-TCAGCTTCYTGCTAATCAGTG-3’;SEQID  NO:60)(Chardes T 等,1999,同上)和LCconstant(5’-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’;SEQ ID NO:61)。对所扩增的重链和轻链可变区进行测序。然后，使用PCR扩增V基因和整合用于向KaloBios载体中克隆的限制性酶切位点：Vh在NcoI(5’)和NheI(3’)进入KB1292-His，所述KB1292-His是KB1292的经修饰的版本，其在CH1上编码具有氨基酸序列AAGASHHHHHH(SEQ ID NO:62)的一个C端柔性接头和6-His(SEQ ID NO:57)标签；Vk在NcoI(5’)和BsiWI(3’)进入KB1296。然后，通过以BssHII和ClaI进行限制性消化和连接，将这些分开的重链和轻链载体组合成单个的双顺反子KaloBios Fab表达载体。在大肠杆菌中自该载体表达Fab片段。测试该Fab片段与PCSK9抗原的结合，将其称为参考Fab SR032。

Fab纯化

通过使用KaloBios表达载体从大肠杆菌中分泌表达Fab片段。使细胞在2xYT培养基中生长至OD600为约0.6。通过加入IPTG至100μM和于33℃摇动4小时，诱导表达。通过渗透裂解从周质级分中获得组装的Fab，使用Ni-NTA柱(HisTrap HP柱;GE Healthcare catalog#17-5247-01)，按照标准方法进行亲和色谱纯化。在包含500mM咪唑的缓冲液中洗脱Fabs，并相对于不含钙和镁的PBS(pH 7.4)进行彻底透析。

文库构建

在文库构建中的第一步，通过KaloBios人V片段文库序列的PCR扩增，产生表位聚焦的完整人V区文库。在制备这些完整链文库中，使用重叠PCR，将包含BSD的独特CDR3-FR4区和来自经优化的参考FabSR038的人种系J片段序列连接到人V片段文库上。不直接筛选这些完整V区文库；而是，将它们用作构建Vh和Vk中间文库的模板。根据在CDR区中与原始的鼠Vh和Vk最接近的人种系序列，选择用于完整链文库构建的KaloBios人V片段文库。原始的鼠NVP-LFU720 Vh在其CDRs上与人种系序列Vh1-02最接近，因此，使用包含Vh1亚群成员的两个KaloBios文库的混合物(KB1410和KB1411)制备完整Vh文库。同样，由于NVP-LFU720Vk在其CDRs上与Vk3L6人种系序列最接近，使用包含Vk3亚群成员的两个KaloBios人V片段文库的混合物(KB1423和KB1424)制备完整的Vk文库。然后，以这些全长Vh和Vk文库作为构建盒文库的模板，在盒文库中仅部分亲本鼠V片段被人序列文库替代。通过桥式PCR构建两类盒：以上述Vh1文库的混合物(KB1410和KB1411)或Vk3文库的混合物(KB1423和KB1424)作为模板，扩增了在FR1、CDR1、和FR2的前面部分中包含人序列的前端盒。使用上述完整的人Vh区或Vk区文库作为模板，扩增了在FR2的后面部分、CDR2和FR3中包含人序列的中间盒。Vh盒在FR2中于氨基酸位置45-49(Kabat编号)处具有重叠的共同序列；Vk    FR2中于氨基酸残基35-39(Kabat编号)处具有重叠的共同序列。以这种方式，通过PCR构建了人重链V1和Vκ3同种型的前端和中间人盒文库。将每个Vh盒文库在NcoI(5’)和KpnI(3’)处克隆到载体KB1292-His中，将每个Vk盒文库在NcoI(5’)和HindIII(3’)处克隆到载体KB1296-B(KaloBios载体KB1296的修改版，其在FR4中添加有沉默的HindIII位点)中。然后，通过以BssHII和ClaI进行消化和其后的连接，将所得的Vh或Vk质粒文库与来自经优化的参考Fab SR038的互补链组合(例如，将Vh前端文库与经优化的参考Vk载体组合)，以产生表达完整Fabs的双顺反子载体的文库。

一般ELISA

重组人或食蟹猴PCSK9-His6抗原用于所有的ELISA测定。典型地，通过于4℃孵育过夜，将稀释于PBS(pH 7.4)中的PCSK9-His6抗原，按300ng/孔结合到96孔微量滴定板中。以于PBS中3%的BSA溶液于37℃封闭该平板1小时，然后以PBST清洗一次。向每个孔中加入包含Fab的诱导的细胞培养基、或稀释的纯化的Fab(50μL)。在于37℃孵育1小时后，以PBST清洗平板3次。向每个孔加入按1:5000稀释于PBS中的抗人κ链HRP缀合物(Sigma#A7164)（50μl），将平板于室温孵育45分钟。以PBST洗涤平板3次，然后向每个孔加入100μLSureBlue TMB底物(KPL#52-00-03)，将平板于室温孵育约10分钟。在分光光度计中于650nm处读取平板。

为了对纯化的人和小鼠IgGs进行特异性ELISAs，以一组纯化的人或鼠抗原，按每孔88ng，包被384孔平板，于4℃孵育过夜。按如上描述封闭和洗涤平板，然后向每个孔中加入22μL于PBS中稀释至2μg/mL的纯化的小鼠或人抗PCSK9抗体。将平板于37℃孵育1小时，然后以PBST洗涤。将抗小鼠Fc抗体(Jackson ImmunoResearch Labs#115-035-071)或与HRP缀合的抗人κ抗体(Sigma#A7164)按1:5000稀释于PBS中(25μL)，加到每个孔中。将平板于室温孵育1小时，然后按如上描述进行洗涤和显色。

菌落转印结合试验(CLBA)

使用以6μg/mL的PCSK9-His6包被的硝酸纤维素滤膜，基本按照美国专利公布2005/0255552和2006/0134098中的描述，进行Fab片段的Humaneered^TM文库的筛选。使用按1:5000稀释于PBST中的碱性磷酸酶缀合的抗人κ轻链抗体(Sigma#A3813)，检测与包被有抗原的滤膜结合的Fabs，以针对碱性磷酸酶的DuoLux化学发光底物(Vector Laboratories#SK-6605)对印迹进行显色。

生物素化重组PCSK9的产生和亲和力测定

通过在pRS5a/PCSK9质粒中编码PCSK9和His6(SEQ ID NO:57)标签的基因之间***EcoRI限制性位点，产生具有C末端Avi-(用于定点生物素化)和His6(SEQ ID NO:57)标签的PCSK9(PCSK9-Avi-His6)；表达带C末端His6(SEQ ID NO:57)标签的PCSK9(Uniprot登录号Q8NBP7)的第31-693位氨基酸。以T4多核苷酸激酶(Invitrogen)，将编码Avi标签(氨基酸序列:GGGLNDIFEAQKIEWHE;SEQ ID NO:63)及侧翼有EcoRI突出端的寡核苷酸进行磷酸化，退火，随后利用新***的EcoRI位点连接到pRS5a/PCSK9中。通过测序分析，验证包含Avi标签的克隆。在293Freestyle表达***(Invitrogen)中进行PCSK9-Avi-His6的表达，使用Ni-NTA树脂(QIAGEN)纯化所分泌的重组蛋白。纯化后，将PCSK9-Avi-His6蛋白对10mM Tris pH 8.0,50mM NaCl进行透析。以生物素-蛋白质连接酶(Avidity)，按照生产商的规程，对蛋白质进行体外生物素化。完成后，将反应物对PBS pH 7.2进行透析，通过Western印迹、以HRP缀合的链霉抗生物素蛋白为探针，对生物素化进行验证。

使用溶液平衡滴定(“SET”)测定法，分析IgGs和Fab片段的结合动力学。简言之，将hPCSK9的系列稀释液加到60pM的IgG或Fab中，孵育过夜。以1μg/ml的hPCSK9包被96孔标准结合(Standard Bind)微量滴定板(Meso Scale Discovery)，孵育过夜，以PBS/0.05%(w/v)吐温20洗涤，以PBS/5%(w/v)BSA封闭，再次洗涤。将抗体-抗原制备液加到PCSK9包被的标准结合板中，于室温下孵育30分钟。在进行3次另外的洗涤步骤后，加入Sulfo-Tag标记的羊抗人检测抗体(R32AJ-5,Meso ScaleDiscovery)，于室温孵育1小时。在洗涤平板3次后，加入读数缓冲液(Read Buffer)(Meso Scale Discovery)，以Sector Imager 6000(Meso ScaleDiscovery)测量电化学发光(ECL)信号。用Excel插件XLfit 4.3.2(ID Business Solutions)，使用描述于Piehler等,(1997)J ImmunolMethods 201:189-206中的适合于抗体的拟合模型，处理ECL数据。观察到了在溶液中人PCSK9与抗体LGT209、LGT210和LGT211之间的高亲和力结合，每个抗体的计算KD值为150-190pM。

产生和纯化抗体

通过使用293fectin转染试剂(Invitrogen#51-0031)，按照生产商的规程，将如下载体共转染到293Freestyle细胞中，产生完全Humaneered^TM的NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211抗体(沉默的IgG1κ)。

LGT-209-pJG04(Vh)+pJG10(Vk)

LGT-210-pJG04(Vh)+pJG01(Vk)

LGT-211-pSR74(Vh)+pJG10(Vk)

使用5-mL的HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare#17-0403-03)，从293Freestyle细胞上清液中纯化抗体。使用IgG洗脱缓冲液(Pierce#21004)洗脱抗体，通过透析将缓冲液交换成PBS。在AKTAFPLC液相色谱***(GE Healthcare)上进行蛋白A亲和色谱。

表位竞争测定试验

使用ForteBio Octet QK***和包被有生物素化PCSK9-Avi-His6的链霉抗生物素蛋白高结合生物传感器(Streptavidin High BindingBiosensors)，测定原始小鼠抗体NVP-LFU720和其Humaneered^TM衍生物NVP-LGT209之间对PCSK9上表位结合的竞争。然后，将以下3个不同的抗体结合到分开的PCSK9包被的传感器上至饱和：小鼠LFU720、完全人LGT209或对照小鼠抗体7D16(已知其与LFU720具有分开的表位)。接着，将所有的传感器浸入到包含LFU720小鼠抗体的孔中，以确定第一抗体是否能够阻断LFU720结合。

结果

鼠和参考V区氨基酸序列

将来自表达NVP-LFU720的杂交瘤的RT-PCR产物测序，通过使用ThermoElectron LTQ-Orbitrap质谱仪，该序列在蛋白质水平上大部分(95%或更高)得到了验证。然后，将LFU720的重链和轻链可变区克隆到KaloBios载体中，以产生参考Fab SR032。不得不将NVP-LFU720Vk中第一个氨基酸从谷氨酰胺(Q)改变为谷氨酸(E)，以使其能够克隆到KaloBios载体中来产生参考Fab SR032；因此，SR032Vk在第一个Vk位置上具有谷氨酸。Fab SR032具有来自NVP-LFU720的完整鼠V区，其与人恒定区融合，将其从大肠杆菌中纯化。在PCSK9-His6抗原结合的稀释ELISA测试中，所克隆的SR032参考Fab产生依赖Fab浓度的结合曲线。除了参考Fab(SR032)以外，还构建了优化的参考Fab,SR038。SR032中的几个构架氨基酸残基在SR038中被改变成人种系的。

参考和优化的参考Fab的亲和力分析

在FR1和FR3中整合到优化的参考SR038中的人种系残基是由用于扩增人V片段全库(repertoire)的PCR引物所规定的，因此它们存在于Humaneered^TM V区文库的所有成员中。构建优化的参考Fab来评估是否任何至人种系的变化都改变Fab结合的特性。通过使用纯化的Fabs进行稀释ELISA，确定了SR032和SR038对重组PCSK9抗原的亲和力是相同的，表明SR038中的氨基酸改变是被耐受的。

文库构建和选择完全Humaneered^TM的Fabs

产生了重链和轻链前端和中间盒文库（限制于Vh1或Vk3的亚群），通过CLBA进行筛选。对于Vh，通过菌落转印结合试验，鉴定出了支持与PCSK9抗原结合的前端盒，但没有鉴定出Vh中间盒。对于Vk，前端和中间盒都通过菌落转印而被鉴定出来，此外，也鉴定出了一些完整Vk克隆(由于Vk前端文库被完整链Vk克隆污染而引起)。来自每个文库的许多结合者在以包含Fab的细胞上清液进行的ELISA测定中再次得到确认，自每个文库从周质级分中纯化了几种Fabs，使用Forte分析按亲和力进行了等级排序。

由于没有鉴定到支持PCSK9结合的V重链中间盒，构建了两个诱变文库，它们在重链CDR2或FR3中的所有位置上编码亲本鼠残基或最接近的人种系残基。由此，构建了改造的人中间盒文库，对其进行了筛选，鉴定出了抗原结合克隆。然后，将在各克隆中支持结合的Vh中间盒中向人种系的改变进行组合，以产生一个最终的中间盒，通过Forte分析，确认了在优化的参考Fab背景中包含该盒的Fab具有与优化的参考Fab一样好的结合亲和力。

通过CLBA，对于重链和轻链都从所产生的文库中成功鉴定出了支持与PCSK9结合的前端和中间人盒。通过ELISA，对这些结合物都进行了确认，然后，使用ForteBio Octet***对Fabs进行了纯化和等级排序。通过桥式PCR，将重链和轻链的高等级盒组合成一个最终的文库，通过CLBA从该文库中选择支持与PCSK9结合的完全Humaneered^TM的Fabs。与此平行，将所有排位第一的盒或链(最好的Vh前端、改造的Vh中间、最好的完整轻链)组合在一起，以产生单个Fab SR066，预期其支持高亲和力的结合。

亲本小鼠mAb NVP-LFU720以及Humaneered^TM Abs NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211的重链和轻链可变区序列分别显示于图1-4中。

使用ForteBio Octet分析测试完全Humaneered^TM的Fabs对PCSK9抗原的亲和力

对Humaneered^TM SR066 Fab和从最终组合文库中挑出的3个Fabs(#1-2,#3-2,和#4-2)进行了表达和纯化。然后，使用ForteBio Octet***，将这4个人Fabs的结合动力学与优化的参考Fab SR038的动力学进行了比较(数字数据总结于表1中)。

表1、完全Humaneered^TM Fabs对PCSK9的亲和力

***没有检测到#4-2Fab足以产生可靠动力学数据的结合。

很难对这些Fabs进行蛋白质浓度确定；就此，解离速率(kd)数据比结合速率(ka)和KD数据可靠得多(只有解离速率是浓度不依赖性的)。所有测试的4个Humaneered^TM Fabs都表现出具有比优化的参考Fabs“差”3至4倍(即，更快)的解离速率。该亲和力的降低可能是由于这些克隆中的重链前端引起的，因为从原始的重链前端盒文库中选择的所有Fab结合者都显示出比优化的参考Fab“差”的解离速率(数据未显示)。由于重链前端包含CDR1，在Vh前端盒中对该CDR的改变是导致最终Humaneered^TM的Fabs亲和力降低的潜在原因。在完全Humaneered^TMFabs中，SR066具有最好的解离速率(表1)，在重链CDR1中SR066和参考(小鼠)序列之间存在3处不同。为了测试对CDRH1的改变是导致在所有Humaneered^TM Fabs中都观察到的亲和力降低的原因，我们一次同时将SR066的CDRH1中两个残基变回至匹配原始的鼠残基，表达和纯化这些改变了的Fabs用于Forte动力学分析。

一个在CDRH1中具有两个同时的改变的Fab(SR079)(表2)显著提高了SR066的结合动力学(数字数据总结于表3中)。事实上，SR079Fab表现出具有与优化的参考(小鼠)Fab SR038相等的解离速率。

表2、CDRH1-变体Fab SR079*的CDRH1序列

SR066(humaneered)	TYYMN	SEQ ID NO:64
			SR038(小鼠)	DMYMS	SEQ ID NO:65
SR079(humaneered)	TMYMS	SEQ ID NO:66

*以加粗表示人(SR066-衍生的)或不变残基，以正常字体表示鼠残基。

表3、SR079Fab对PCSK9的亲和力

Humaneered^TM Fabs SR066、#1-2、#3-2和#4-2在CDRH2中包含来自原始小鼠抗体的“Asn-Gly”(“NG”)氨基酸序列。已知该序列潜在经历脱酰胺作用，这是对生产是非期望的特性。因此，在努力提高Humaneered^TM SR066Fab的亲和力的同时，在SR066背景下构建了两个诱变文库，其中“N”或“G”被除原始氨基酸以外的每种可能的氨基酸替代(例如，在“N移去文库”中，“N”被除“N”以外的每种氨基酸替代)。然后，通过ELISA从该文库中筛选含Fab的细胞上清液，以鉴定不再具有“NG”序列而仍然保留SR066结合水平(其比优化的参考Fab SR038的水平低)的克隆。“N移去文库”不产生任何与SR066相同程度结合的Fabs，而“G移去文库”产生具有足够结合水平的Fabs，这些Fabs在“G”位置上具有许多不同替代。从这些Fabs中选择具有“NG”至“NE”、“NA”和“NM”改变的Fabs，进行纯化和Forte动力学分析，发现它们具有与亲本Fab SR066类似的动力学。

改造7472人IgG以提高亲和力

Vk改造

为了产生完全人IgG，通过桥式PCR，扩增SR079(SR066的修改版，其具有提高的亲和力)中直至CDRH2的Vh序列，并缝接到“G移去文库”克隆(在CDRH2中包含“NE”)的从CDRH2到大部分FR4的序列上。将该Vh序列在NruI(5’)和KpnI(3’)处克隆到pRS5a-hIgG1LALA+KpnI(沉默IgG1克隆载体，其已经过修改，在FR4中加入了KpnI位点而不影响Vh的氨基酸序列)中，以产生pSR074。扩增来自SR066的Vk(从FR1直到FR4的一半)，在AgeI和BsiWI处克隆到pRS5a-hkappa中，以产生pSR072。通过测序验证这些载体，将其共转染到293Freestyle细胞中。从包含抗体的细胞培养基中纯化该IgG(将其称为“7472”)。令人惊讶的是，通过Biacore分析，抗体7472具有比亲本小鼠抗体LFU720显著更慢的结合速率(未显示)。通过将每个人链与互补的亲本小鼠链进行互换，确定了该结合速率的缺陷是由于人轻链的问题。对pSR072人轻链进行了改变来回复亲和力(表4)：将轻链的头4个残基转变回鼠序列，将CDR1的第二半部分中的残基转变回鼠的。按以上的描述将该轻链克隆到pRS5a-hkappa中，产生pJG10和pJG01，通过pSR074(Hc载体)和pJG10(Lc载体)或pJG01(Lc载体)的共转染，产生了完整的IgG。总之，当通过Biacore进行测定时，这些改变部分回复了Humaneered^TM抗体的亲和力。

表4、对IgG 7472轻链的改变

表4显示了人抗体7472、亲本小鼠抗体LFU720的轻链和pJG10编码的轻链的部分的比对。该部分与pJG01编码的轻链相同。将这些轻链载体用于表达最终的Humaneered^TM抗体NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT-211。

CDRH3的亲和力成熟

在对轻链进行改变的同时，构建了Fab文库来进行pSR074重链的CDR3的亲和力成熟。在该文库中，CDR3残基被除了原始残基以外的每个其它氨基酸进行了单替代。通过CLBA筛选该文库，以ELISA验证结合者，对得到的Fabs进行纯化和通过生物膜干涉(bio-layerinterferometry)进行测试，以确定它们相对于亲本人Fab来说是否具有改良的结合动力学。

鉴定出了一个显著提高亲和力的CDRH3替代：A至N的改变(表5)。随后，在pSR074重链IgG表达质粒背景中进行了该改变；将该新的构建体称为pJG04。通过pJG04(Hc)和pJG10的共转染及随后的纯化，产生最终的Humaneered^TM抗体NVP-LGT209(LGT209)。通过pJG04(Hc)和pJG01的共转染及随后的纯化，产生最终的Humaneered^TM抗体NVP-LGT210(LGT210)。没有向抗体NVP-LGT211(LGT211)中引入该改变。

表5、对IgG 7472重链CDR3的改变

表5显示了人抗体7472、亲本小鼠抗体LFU720的重链CDR3和pJG04编码的重链(用于表达最终的Humaneered^TM抗体NVP-LGT209和NVP-LGT210的重链载体)的比对。以加下划线表示A至N的替代。

使用溶液平衡滴定(SET)***分析NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211的结合动力学

使用SET测定法，测定了NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211抗体对人PCSK9的结合亲和力为150-190pM，如表6中所示。这说明，在溶液中抗体和PCSK9之间高亲和力的相互作用。

表6

抗体	KD[pM]
		LGT209	190±50
LGT210	150±50
		LGT211	190±50

通过ELISA分析NVP-LGT209的抗原特异性

为了测试在最终的Humaneered^TM IgGs，LGT209、LGT210和LGT211，中是否保留了亲本小鼠抗体LFU720的抗原特异性，在ELISA测定试验中测试了这些抗体与一组人和小鼠抗原(以及人PCSK9)的结合。该测定的结果(图5A-C)显示，LGT209、LGT210和LGT211保留了对PCSK9的高度特异性，类似于鼠抗体LFU720。

在ELISA中抗体与人和食蟹猴Pcsk9蛋白的结合

对LGT209、LGT210和LGT211与人和食蟹猴(cyno)Pcsk9的特异性结合进行了评估。该ELISA测定显示，与亲本小鼠抗体LFU720一样，Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211能够以类似的方式结合人和食蟹猴(cyno)Pcsk9(图6A-C)。

基于生物膜干涉的表位竞争试验

为了测试在最终的Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211中是否保留了亲本鼠抗体LFU720的表位特异性，使用ForteBioOctet***进行了竞争试验。Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211阻断亲本小鼠抗体NVP-LFU720的结合，表明Humaneered^TM抗体保留了原始鼠抗体的表位特异性。当改变抗体的加样顺序时，即先进行NVP-LFU720结合，随后加Humaneered^TM抗体，也得到了类似的结果。

Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211的氨基酸序列和与人种系序列的百分比同一性

最终的Humaneered^TM抗体LGT209、LGT210和LGT211的可变区氨基酸序列分别显示于图2-4中；以加下划线和加粗表示CDRs。在序列列表中包括了核苷酸序列。

通过Vh和Vk氨基酸序列对单个人种系序列(分别为Vh11-02和Vk3A27;表7)的比对，确定了抗体LGT209、LGT210和LGT211对人种系序列的百分比同一性。在每条链的计算中略去了CDRH3和CDRL3中的残基。

表7、抗体LGT209、LGT210和LGT211对人种系序列的百分比同一性

在图8-14的图注中讨论了有关humaneered抗体的功能特性的其他信息。

实施例3：PCSK9拮抗剂抗体NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211的突变分析

评估了PCSK9拮抗剂抗体NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP-LGT211的变体与PCSK9结合的能力。结果总结如下：

关于重链CDR1，TMYMS(SEQ ID NO:66)，只有包含原始小鼠残基(以加粗表示)的克隆保留小鼠Ab的结合动力学(通过生物膜干涉分析所测定的)。因此，重链CDR1中的这些残基在结合中起作用。

关于重链CDR2，RIDPANEHTNYAQKFQG(SEQ ID NO:74)，在从文库中挑出的抗体结合者中以加粗表示的残基没有被改变，所述文库在各位置上分别编码原始(小鼠)残基或最接近的人种系序列中的相应残基(通过ELISA筛选)。因此，以加粗表示的残基在结合中起作用。在加下划线的Glu残基所示的位置上，保守性替代是被耐受的，例如，如通过ELISA所确定的和通过生物膜干涉所验证的，该位置可以是A、E或D。

关于重链CDR3，SYYYY(A/N)MDY (SEQ ID NO:75)，在从亲和力成熟文库中挑出的克隆中以加粗表示的残基没有被改变，所述文库在各位置上编码所有可能的氨基酸(除原始氨基酸以外)。因此，以加粗表示的残基在结合中起作用。在加下划线的Ala或Asn残基所示的位置上，保守性替代是耐受的，例如，如通过Biacore所确定的，该位置可以是A、N或Q。在加下划线的Tyr残基所示的位置上，保守性替代是耐受的，例如，如通过Biacore所确定的，该位置可以是A、F、S、V或Y。

关于轻链FR1，(E/Q)IV(M/L)TQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ IDNO:76)，如通过Biacore所确定的，在加下划线的第1和4位上，保守性替代是耐受的。例如，第1位的氨基酸可以是A、D、E、N或Q。第4位的氨基酸可以是V、I、L或M。如通过Biacore所确定的，第1-4位为QIVL(SEQ IOD NO:69)(如小鼠亲本LFU720、LGT209和LGT211Vk中的)时比第1-4位为EIVM(SEQ ID NO:67)(如LGT210Vk中的)时具有改良的结合。

关于轻链CDR1，RASQSVSYMH(SEQ ID NO:71)，以加粗表示的残基的间距对结合具有影响，因为在Lc CDR1的该位置中具有2个额外氨基酸的人克隆是亲和力受损的。因此，以加粗表示的残基在结合中起作用。

关于轻链CDR3，LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)，如通过ELISA所测定的，在这些位置上改变为人种系是不耐受的。因此，以加粗表示的残基在结合中起作用。

应理解的是，本文中描述的实施例和实施方案仅为了举例说明目的，本领域技术人员明了基于它们的各种修改和改变，这些修改和改变应该包括在本申请的精神和范围以及所附加的权利要求的范围内。本文中引用的所有出版物、专利、专利申请和序列登录条目为了所有目的以引用的方式就其全部内容并入本文中。

Claims (43)

1.与蛋白原转化酶枯草溶菌素/kexin型9(PCSK9)结合的抗体，其中该抗体：

a)不阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)的结合，且

b)抑制PCSK9介导的LDLR降解，

其中所述抗体包含重链V片段和轻链V片段，其中重链V片段和轻链V片段各包括互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)、互补决定区3(CDR3)、和构架区4(FR4)；其中

i)重链V片段的CDR1为SEQ ID NO:7；

ii)重链V片段的CDR2为SEQ ID NO:10；

iii)重链CDR3为选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

iv)轻链V片段的CDR1为SEQ ID NO:21；

v)轻链V片段的CDR2为SEQ ID NO:24；以及

vi)轻链CDR3为SEQ ID NO:26。

2.权利要求1的抗体，其中抗体与人PCSK9的第680-692位残基中的至少一个氨基酸结合。

3.权利要求1的抗体，其中抗体与人PCSK9结合的平衡解离常数(K_D)为500pM或更低.

4.权利要求1的抗体，其中抗体的体内半衰期为至少7天。

5.权利要求1的抗体，其中重链V片段为SEQ ID NO:28所示序列，其中轻链V片段为SEQ ID NO:31所示序列。

6.权利要求1的抗体，其中重链V片段为SEQ ID NO:27所示序列，其中轻链V片段为选自SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的序列。

7.权利要求1的抗体，其中重链FR4为人种系FR4。

8.权利要求7的抗体，其中重链FR4为SEQ ID NO:35。

9.权利要求1的抗体，其中轻链FR4为人种系FR4。

10.权利要求9的抗体，其中轻链FR4为SEQ ID NO:39。

11.权利要求1的抗体，其中重链可变区为SEQ ID NO:40的可变区，轻链可变区为SEQ ID NO:41的可变区。

12.权利要求1的抗体，其中抗体包括SEQ ID NO:3的重链和SEQ IDNO:17或19的轻链，或SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:17的轻链。

13.权利要求1的抗体，其中重链可变区为SEQ ID NO:2的可变区，轻链可变区为SEQ ID NO:16的可变区。

14.权利要求1的抗体，其中重链可变区为SEQ ID NO:2的可变区，轻链可变区为SEQ ID NO:18的可变区。

15.权利要求1的抗体，其中重链可变区为SEQ ID NO:4的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

16.权利要求1的抗体，其中抗体为FAb’片段。

17.权利要求1的抗体，其中抗体为IgG。

18.权利要求1的抗体，其中抗体为单链抗体(scFv)。

19.权利要求1的抗体，其中抗体包含人恒定区。

20.权利要求1的抗体，其中抗体与载体蛋白连接。

21.权利要求1的抗体，其中抗体被聚乙二醇化。

22.包含权利要求1-21之任一项的抗体和生理相容性赋形剂的组合物。

23.权利要求22的组合物，其中组合物还包含降低个体中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的第二药。

24.权利要求23的组合物，其中第二药是他汀类药。

25.权利要求24的组合物，其中他汀类药选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

26.权利要求23的组合物，其中第二药选自贝特类药(fibrates)、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸。

27.权利要求1-21之任一项的抗体在制备在有需要的个体中降低LDL-C的药物中的用途。

28.权利要求27的用途，其中个体对他汀类药治疗反应过低或具有抵抗性。

29.权利要求27的用途，其中个体不耐受他汀类药治疗。

30.权利要求27的用途，其中个体的基线LDL-C水平为至少100mg/dL。

31.权利要求27的用途，其中个体患有家族性高胆固醇血症。

32.权利要求27的用途，其中总胆固醇随LDL-C而降低。

33.权利要求27的用途，其中个体患有甘油三酯血症。

34.权利要求27的用途，其中个体具有功能获得性PCSK9基因突变。

35.权利要求27的用途，其中个体患有药物诱发性血脂异常。

36.权利要求27的用途，其中以治疗上有效的量，给个体施用在降低LDL-C中有效的第二药。

37.权利要求36的用途，其中第二药为他汀类药。

38.权利要求37的用途，其中他汀类药选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

39.权利要求36的用途，其中第二药选自贝特类药(fibrates)、烟酸(niacin)及其类似物、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂、甲状腺激素模拟物、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂、二酰甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoB100的抑制性核酸

40.权利要求36的用途，其中将抗体与第二药作为混合物共施用。

41.权利要求36的用途，其中将抗体与第二药以分开的方式共施用。

42.权利要求27的用途，其中将抗体进行静脉内给药。

43.权利要求27的用途，其中将抗体进行皮下给药。