JP6258332B2

JP6258332B2 - 固形腫瘍の治療手段及び方法

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Publication number: JP6258332B2
Application number: JP2015533011A
Authority: JP
Inventors: リンダー，スティッグ
Original assignee: ヴィヴォルックスアーベー
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2018-01-10
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: IL237569B; CA2884832C; MX369470B; DK2900667T3; EP2900667B1; KR102190768B1; ZA201501558B; IL237569A0; EP2900667A1; CN104662022A; KR20150058441A; EA026465B1; EP2900667A4; US20150259349A1; WO2014046589A1; HK1206352A1; US9562046B2; JP2015529244A; HUE044767T2; PT2900667T

Description

本発明は、癌に冒された人の固形癌腫瘍、特にはん種性固形癌腫瘍、の治療手段、及び対応する方法に関する。

はん種性固形癌を患う患者のために、新しいそして効果的な抗ガン剤を開発する必要がある。固形腫瘍用薬剤の開発は、生体外系での実験で真似るには困難であり得る３−Ｄ腫瘍組織における複雑な生物物理的及び代謝性状態により、特定の問題を伴う。低酸素症及び栄養の制限された拡散は、従来の抗ガン剤及び放射線療法に対する無活動及び抵抗性に導くことが知られている。更に、抗ガン剤は腫瘍実質性(parenchyme)組織に侵入して毒性濃度で癌細胞に到達できなければならない。固形腫瘍の治療に臨床的により使用されているいくつかの薬剤は３−Ｄ腫瘍塊への低い侵入性を示し、それが該薬剤の限定された効能の理由の一つであり得る。多細胞性回転楕円体（ＭＣＳ）は、２−Ｄ単層培養物よりも良くヒト固形腫瘍にまねるので、固形腫瘍に活性の薬剤のスクリーニングに、単層培養物よりも適する。

細胞死はしばしば、３タイプの細胞死：アポトーシス（タイプI）、自食症細胞死（タイプII）及び壊死（タイプIII）に分類される。アポトーシスはカスパーゼの活性化により媒介される。自食症は、長生きした細胞タンパク質及び損傷された細胞小器官の分解について真価的に保存された機構である。自食胞の形成は自食作用の主な特徴である。自食胞形成はクラスIIIホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの活性化を必要とし、そして２つのユビキチン様共役システム(Atg-Atg12及びAtg8)にも依存性である。自食症は、栄養剥奪の状態中、細胞を保護し、そして自食症が阻止された時、細胞はアポトーシスを蒙る。自食症の形態的特徴もまた、カスパーゼ阻止の条件下での細胞死の間、観察された。

本発明の目的は、固体癌腫瘍の効率的な治療手段を提供することである。

本発明の更なる目的は、上記手段を使用した治療方法を提供することである。

本発明の他の目的は、下記の本発明の概要、図面に例示された多くのその好ましい態様、及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。

本発明によると、固形癌腫瘍の効率的な治療のための手段が開示される。該手段は、一般式Ｉの化合物であり、ここで、ＲはＨ又はメチル又はＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキルで置換されたメチレン；Ｒ^１はＨ、Ｃ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、メトキシ、１〜３個のフッ素で置換されたメトキシ、ハロゲンから成る群から選ばれ；Ｒ^２はＨ又はＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキル；ＸはＣＨ又はＮ；ＹはＣＨ又はＮであり、Ｒは、Ｒ^１がＨ又はＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ^２がＨ又はＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキルであり、ＸがＮであり、そしてＹがＮであれば、Ｈ又はメチルを含ない。

Ｒ^２はＨであるのが好ましい。本発明の化合物の好ましい態様は、R = H, R¹ = 6-CH₃, R²=H, X 及び Y = CH; R = CH₂C(CH₃)₃, R¹ = 6-CH₃, R² = H, X 及び Y = N; R = CH₂CH₃, R¹ = 6-CH₃, R² = H, X及びY = Nを含む。

本発明の好ましい観点によると、上記一般式の化合物は、Ｒ^１で置換されていないモノ−、ジ−又はトリ−アザカルバゾリルの６、７、８、９位の一つにおいてＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキルで更に置換されていてもよい。

本発明の化合物は、あらゆる薬学的許容塩、塩／溶媒複合体、金属複合体（Ｆｅ^２＋，Ｆｅ^３＋，Ｃｏ^２＋のいずれかとの複合体を除く）、溶媒複合体、及びそのプロドラッグを含む。

本発明の化合物は、１−ピリジン−２−イル基をイミノフルオレン−２−イル基と結合するＮ＝Ｃ結合におけるシス／トランス異性体の混合物として存在することができる。生理学的条件における異性化速度はかなりであるので、該異性体は身体に対して類似の又は実質的に同じ薬理学的効果を与えると推測される。

本発明の化合物は、細胞浸透性鉄キレート剤である。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明の化合物の抗ガン効果は、その鉄キレート化性に基づくと信じる。

本発明の化合物は、多くのインビトロ（生体外）及びインビボ（生体内）モデルで細胞毒性効果を奏する。該細胞毒性効果はミトコンドリア呼吸の減少にある。結腸癌組織はグルコースを、正常組織のグルコース濃度の〜１０％の濃度で含むことが知られ、癌組織はクレブス回路を経由した好気的呼吸に依存することが示唆される(Hirayama A et al., Cancer Res 69 (2009) 4918-4925)。インビトロのＨＣＴ１１６結腸癌多細胞回転楕円体モデルにおいて、本発明の化合物は、１０μＭ／Ｌの濃度で、５０％又はそれ未満の生存インデックス（ＳＩ）に相当する細胞死を生じる。本願において、化学物質１０μＭ／Ｌの濃度で細胞生存５０％又はそれ未満の限定は、実質的な細胞毒性効果として考えられ、そのように命名する。上記回転楕円体に対する細胞毒性活性は、本発明の化合物が増殖中及び休眠中の両方の細胞集団に影響を及ぼすことを示す。本発明の化合物は、酸素正常状態で高グルコース培地中の単層ＨＣＴ１１６結腸癌細胞培養物の細胞増殖にも影響を及ぼすが、グルコース窮乏は抗増殖活性を増加させる。

本発明の化合物は、ミトコンドリア機能不全を誘発し、そしてグルコース依存性を増加させる。グルコースの枯渇は癌細胞の本発明の化合物に対する感度を増加させ、その結果、細胞毒性及びアポトーシス（細胞自然死）を増加させる。

本発明によると、本発明の化合物をヒトの固体癌腫瘍の治療へ使用することが開示される。好ましい観点によると、本発明の細胞浸透性鉄キレート剤は、かかる治療には自食症阻害剤と組み合わせて使用するのが好ましい。

本発明の別の好ましい側面によると、本発明の鉄キレート剤及び薬学的担体を含む薬学的組成物が開示される。本発明の薬学的組成物は適当な経路、例えば経口的又は非経口的に、投与することができる。適当な担体には、例えばジメチルスルホキシド及び水性媒体、例えばジメチルスルホキシドと水を含む混合物、が含まれる。好ましい流体担体は、本発明の化合物を溶解できるものである。他の好ましい流体担体、特に水性担体は、本発明の化合物を微分散形、例えば１０μｍ又はそれ未満のサイズの微粒子の形体、で含むものである。

本発明の別の好ましい側面によると、本発明の鉄キレート剤又はその薬学的許容塩、複合体又はプロドラッグの薬理学的有効量をヒトに投与することを含む、ヒトの固形癌を治療する方法が開示される。薬理学的有効量は、本発明の薬学的組成物に含めて投与するのが好ましい。

本発明の更に好ましい側面によると、癌にグルコースを欠乏（枯渇）させ、そしてヒトに薬理学的有効量の本発明の鉄キレート剤又はその薬学的許容塩、複合体若しくはプロドラッグを投与することを含む、ヒトの固体癌を治療する方法が開示される。

本発明の化合物はインビトロ及びインビボで自食症反応を誘発する。従って、本発明の化合物を自食症阻害剤と組み合わせて投与するのが好ましい。好ましい自食症阻害剤はクロロキンである。この観点から、固形腫瘍の治療に、自食症阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせの使用が開示される。”組み合わせ”とは、自食症阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤とを近い時間的関係、例えば同時に又は１日まで及び１週間までの期間内に投与することと理解される。自食症阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤とは、それらを含む薬学的組成物の形態で、又は別個の薬学的組成物の形態で投与することができる。一つの薬学的組成物の形態で投与すると、その組み合わせは薬学的に許容される担体を含む。

自食症阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせにおいて、該自食症阻害剤は好ましくはクロロキンから選ばれる。他の好ましい自食症阻害剤には、ヒドロキシクロロキン、３−メチルアデニン、アデノシン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド、ウォルトマニン(wortmannin)、及びビニブラスチン(viniblastine)が含まれる。

本発明で使用する別の自食症阻害剤は、参照用に本願に含めるＷＯ２０１１／０１１５２２Ａ２に開示された一般式（ＩＩ）のものである：

本発明によると、癌に冒されたヒトの固形腫瘍を治療する方法も開示され、該方法は、ヒトに自食症阻害剤と本発明の細胞浸透性鉄キレート剤との組合せを薬理学的に有効量で、近い時間的関係で、例えば同時に又は１日以内若しくは１週間以内に投与することを含む。投与はいかなる適当な経路でもよく、例えば非経口又は経口で、一方が自食症阻害剤と薬学的に許容される担体、例えばジメチルスルホキシド、とを含む、別個の（複数の）薬学的組合せ物の形態で、或いは同時に投与する場合は薬学的に許容される担体、例えばジメチルスルホキシド、を含む単一の薬学的組合せの形態であってもよい。

本発明の更に別の好ましい側面によると、ヒトの固形癌を治療する方法が開示され、該方法は、該ヒトに自食症阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組合せを薬理学的に有効量で、同時に又は近い時間的関係で、例えば１時間以内又は１日以内又は１週間以内に投与することを含む。投与は前に開示した薬学的組成物の形態であるのが好ましく、そして非経口又は経口又はその他の適当な経路による。

本発明を、多くの図を含む図面に例示された多くの好ましい態様を参照して更に詳しく記述する。

ＨＣＴ１１６結腸癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞モデルにおける本発明の化合物の細胞毒性を示す。

本発明に含まれない類似の構造の化合物が、実質的に細胞毒性がないことを示す。

材料及び方法
本発明の化合物
一般式Ｉの本発明の例示的化合物（表１）を調製した。

表２は、本発明に含まれない一般式ＩＩの多くの新規化合物を示す。それらの細胞毒性は低いか本質的に欠けている。それらは比較のために調製した。

一般的方法
使用した溶媒は全てＨＰＬＣ等級又はそれ以上であった。無水条件は、使用から少なくとも２４時間前に、過剰量の３オングストローム分子篩を溶媒に加えることにより創設した。低解像電子スプレーイオン化質量スペクトルを、アジレント（Agilent)質量分析計を使用して正のイオン化モードで得た。フラッシュクロマトグラフィーをメルク(Merck)シリカゲル６０（２３０−４００メッシュ）上で行った。分析ＬＣ／ＭＳデータを、アジレント質量分析計；Agilent1100システムを用いて得た。(a)ACE C8カラム、(50×3.0mm,5μM);勾配:水/0.1％TFA中10-97%アセトニトリル、3分、1.0ml/分。(b):Xbridge C18カラム、(3.5μm,50×3.0mm);勾配:10mMのNH₄HCO₃(pH10)中10-97%アセトニトリル、3分、1mL/分。化学構造の命名はMarvin Sketch 5.2.6、ChemAxonにより決定した。

実施例１：本発明の化合物１−８の合成に使用する5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル-ヒドラジン中間体の調製の一般的手順
チオセミカルバジド(50 mg, 0.11 mmol)、それぞれのイサチン類(0.12 mmol)及びK₂CO₃ (23.4 mg, 0.17 mmol)を水(1 mL)に溶かし、そして1.5時間還流した。次に温度をRTに調整した。混合物を、HOAcを使用して酸性化し、そして沈殿物を濾取した。母液を濃縮した。粗製の2H,3H,5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-チオン誘導体を精製せずに下記のステップで使用した。

それぞれの2H,3H,5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-チオン誘導体(0.1 mmol)及びヒドラジン水和物(10 mL)の混合物を４時間還流した。冷却すると沈殿物が形成し、そして濾取した。該沈殿物をTHF及びジエチルエーテルで洗い、そしてRTで乾燥した。得られた5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イルヒドラジン中間体を、更に精製することなく使用した。

実施例２：本発明の化合物1-8の調製の一般的手順
それぞれ5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イルヒドラジン中間体(0.1 mmol)を5%酢酸水溶液(1 mL)に懸濁し、そして50℃に加熱した。この温かい懸濁液に2-アセチルピリジン(0.50 mL)を加え、反応を50℃で3時間保持した。反応混合物を濾過した。固体生成物をEtOHで十分洗い、そしてRTで乾燥した。

2-[(1E)-1-(2-{7-クロロ-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]ピリジン(化合物1)。純度98% (主な異性体); LC/MS: rt 1.7760 (主な異性体), 1.945 (少量の異性体), MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 338 [M+H]⁺。

2-[(1E)-1-(2-{6-クロロ-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]ピリジン(化合物 2)。純度96% (主な異性体); LC/MS: rt 1.667 (主な異性体), 1.868 (少量の異性体), MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 338 [M+H]⁺ 。

2-[(1E)-1-(2-{8-メトキシ-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]-ピリジン(化合物3)。純度 99%; LC/MS: rt 1.661(主な異性体); MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 334 [M+H]⁺。

2-[(1E)-1-{2-[8-(トリフルオロメトキシ)-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル]ヒドラジン-1-イリデン}エチル]ピリジン(化合物 4)。純度99%(主な異性体); LC/MS: rt 1.996 (主な異性体), 2.166 (少量の異性体); MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 388 [M+H]⁺。

2-[(1E)-1-(2-{6,8-ジメチル-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]-ピリジン(化合物5)。純度92% (主な異性体); LC/MS: rt 2.016 (主な異性体), 1.878 (少量の異性体); MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 332 [M+H]⁺。

2-[(1E)-1-(2-{9-ブロモ-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]ピリジン(化合物6)。純度 99% (主な異性体); LC/MS: rt 1.744 (主な異性体), 1.927 (少量の異性体); MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 383/385 [M+H]⁺。

2-[(1E)-1-(2-{8-クロロ-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]-ピリジン(化合物7)。純度98%; LC/MS: rt 1.800; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 338/340 [M+H]⁺。

2-[(1E)-1-(2-{9-Mエチル-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]ピリジン(化合物8)。純度92% (主な異性体); LC/MS: rt 1.790 (主な異性体), 1.941 (少量の異性体); MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 318 [M+H]⁺。

実施例3. 本発明の化合物９及び１０の調製の一般的手順
5%酢酸水溶液(0.67 mL)中の3-ヒドラジニル-6-メチル-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール(20 mg, 0.09 mmol)の攪拌懸濁液に、それぞれのケトン(0.47 mmol)を加え、そして反応物を50℃で、以下に特定した時間攪拌した。冷却後、水(1 mL)を加え、沈殿物を濾取し、そして水/アセトニトリル1:1及び2:1で、又はジエチルエーテルで洗った。

2-[(1E)-1-(2-{6-メチル-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-イル}ヒドラジン-1-イリデン)プロピル]-ピリジン(化合物9)。反応混合物を50℃で1時間15分攪拌した。形成した沈殿物をジエチルエーテルで洗って、標題の化合物を99%の純度で得た。方法B, LC/MS: rt 1.851 (主な異性体), 1.982 (少量の異性体); MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 332 [M+H]⁺。

2-(3,3-ジメチル-N-{6-メチル-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-}ブタンヒドラゾノイル)ピリジン(化合物10)。反応物を50℃で2時間攪拌し、次に60℃で一晩攪拌し、最後に80℃で3日間攪拌した。固体を濾取し、そしてジエチルエーテル及びアセトニトリルで洗って、標題の生成物を90%の純度で得た。方法B, LC/MS: rt 2.25, MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 374 [M+H]⁺。

実施例4：2-及び3-[(1Z)-1-(2-{8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール-2-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]ピリジン類の調製手順
2,6-ジクロロ-3-(3-メチル-2-ニトロフェニル)ピリジン。電子レンジ用小瓶に、270 mgの2-ニトロ-3-ブロモ-トルエン(1.25 mmol)及び240 mgの2,6-ジクロロ-ピリジン-3-ホウ酸(240 mg)を4mlの溶媒混合物(1,4-ジオキサン/H₂O, 4:1)中に溶解し、それに炭酸カリウム(345 mg)を加え、次いで28 mgのテトラキスPd(PPh₃)₄ (0.025 mmol)を加え、窒素で5分間、マイクロ波反応器中で100^oCにて15分間脱ガスし、そして蒸発させて溶媒の殆どを除去した。残滓を50 mlの酢酸エチル中に溶解し、3 x10 mlの塩水で洗い、そしてMgSO₄上で乾燥した。溶媒の蒸発後、残滓をフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル,85:15)で精製した。純粋な標題化合物(99 mg, 28 %)を白色粉末として得た。LC-MS: rt 1.803; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 283 [M+H]⁺。

2-(2,6-ジクロロピリジン-3-イル)-6-メチルアニリン。ガラス製フラスコ中で、282 mgの2,6-ジクロロ-3-(3-メチル-2-ニトロフェニル)ピリジン(1 mmol)を20 mlのメタノール中に溶解し、次に325 mgの亜鉛粉(5 mmol)及び570μlの酢酸(10 mmol)を加えた。混合物を室温で30分攪拌し、次に75℃で1時間攪拌した。反応が終わった後、反応混合物を濾過して沈殿物を除去し、該沈殿物を20mlのメタノールで洗い、次に蒸発させて、溶媒の大半を除いた。残滓を酢酸エチル及び塩水に溶解し、そしてクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル, 90:10)で精製した。LC-MS: rt 1.734; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 253 [M+H]⁺。

2-クロロ-8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール。2-(2,6-ジクロロピリジン-3-イル)-6-メチルアニリン(154 mg, 0.61 mmol), 59mgのヨウ素酸銅、70 mgのL-プロリン(0.61mmol)及び398 mgのCs₂CO₃(1.22 mmol)を8 mlのDMFと混合し、90℃に1時間、次に100℃に5時間加熱し、酢酸エチルで希釈し、そして塩水で洗って、DMFと塩基の殆んどを除去した。残滓をフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル90:10)で精製した。収量49 mg。LC-MS: rt 1.730; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 217 [M+H]⁺。

2-ヒドラジニル-8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール。2-クロロ-8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール(33 mg, 0.15 mmol)を、0.8 mlのヒドラジン水素化物中に懸濁し、85℃で週末に亘って攪拌した。出発材料は完全に変換された。混合物を冷却して、沈殿物を形成した。粗製生成物を濾取して、21mgの粗製の標題化合物を得、それを精製せずに次のステップで使用した。LC-MS: rt 1.320; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 213 [M+H]⁺。

3-[(1Z)-1-(2-{8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール-2-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]-ピリジン(化合物19)。2-ヒドラジニル-8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール(10 mg, 0.05 mmol)を、27μlの3-アセチルピリジンを含む5%酢酸0.5ml中に懸濁させ、そしてRTで30分間、次に50℃で更に30分間攪拌した。RTに冷却後、形成した沈殿物を収集し、そして分取HPLC(C18カラム、10mM NH₄HCO₃(pH 10)中の勾配45-85%メタノール, 25 ml/分)で精製した。標題化合物(1 mg)を90 %の純度で得た。LC-MS: A, rt 1.674, B rt 2.314; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 316 [M+H]⁺。

2-[(1Z)-1-(2-{8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール-2-イル}ヒドラジン-1-イリデン)エチル]-ピリジン(化合物11)。2-ヒドラジニル-8-メチル-8H,8aH,9H-ピリド[2,3-b]インドール(10 mg, 0.05 mmol)を、0.5 mlの5%酢酸と28μlの2-アセチルピリジンとの混合物に懸濁し、RTで30分間攪拌した。温度を50℃に上げ、該混合物を更に30分間攪拌し、次にRTに冷却した。沈殿物が形成し、それを分取HPLC, (C18カラム, 10mM NH₄HCO₃ (pH 10)中の勾配45-85%メタノール, 25 ml/分)で精製した。標題化合物(1mg)を95%の純度で得た。LC-MS: A, rt 1.805, B, rt 2.608; MS ESI⁺/MS ESI⁺ ms/z 316 [M+H]⁺。

略語: ACN, アセトニトリル；DCM, ジクロロメタン；DMF, ジメチルホルムアミド；rt, 保持時間；RT, 室温；LC, 液相クロマトグラフィー；SI, 生存インデックス。

実施例５：細胞培養、ＭＣＳの生成及びインビトロにおける細胞毒性の決定
ＨＣＴ１１６結腸癌細胞をマッコイの（ＭｃＣｏｙ’ｓ）５Ａ修飾媒体／１０％ウシ胎児血清中に３７℃で５％ＣＯ_２中に維持した。ＭＣＳを、ＨｅｒｒｍａｎｎＲ外の方法（Screening compounds that induce apoptosis of cancer cells grown as multicellular spheroids.J Biomol Screen 2008;13:108）の変形を用いて調製した。１０，０００個の細胞を含む細胞懸濁液（２００μｌ）をポリ−ＨＥＭＡ被覆９６穴プレートの各穴に加えた。該穴を次ぎに追加の１７０μｌの媒体を加えることによりいっぱいにして、凸表面曲線を得た。塑像用粘土スペーサー（３ｍｍ）を各プレートの隅に置いて、蓋が該媒体に触れるのを防止した。該プレートを次ぎに逆にして該細胞を液体／空気界面に沈殿させ、そして静かに振って培養した。２４時間の培養後、該プレートを正常状態に戻した。第１の過剰媒体を吸引により除去し、次ぎに塑像用粘土スペーサーを除去した。該プレートを薬物処理前に４日間培養した。薬物処理２４時間の後、ＮＰ４０を該培養媒体に加えて０．１％の濃度にして、カスパーゼ分割Ｋ１８をＭＣＳから抽出し、そして死んだ細胞から媒体に放出された物質を含ませた。カスパーゼ分割ケラチン−１８（Ｋ１８−Ａｓｐ３９６）を２５ｍＬの媒体／抽出物を用い、Ｍ３０ＣｙｔｏＤｅａｔｈＥＬＩＳＡアッセー（生体外使用に開発されたＭ３０−Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ(Hagg M et al., A novel high-through-put assay for screening of pro-apoptotic drugs. Invest New Drugs 2002;20:253-9)の変形）（ＰｅｖｉｖａＡＢ，ブロマ、スエーデン）を用いて測定した。生存率測定を、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ外によるA reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. J Biomol Screen 2007;12:92537に記載されたアシッドホスファターゼ（ＡＰＨ）法により行った。背景活性を差し引いた。本発明の化合物の細胞毒性（図１ａ−１ｌ）、及び本発明に含まれない構造的に関連する化合物の細胞毒性（図２ａ−２ｈ）を、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞モデルにおいて測定し、そして該化合物の濃度に依存する細胞の生存インデックスにより表現した。

実施例６：本発明の化合物はインビボにおいて細胞毒性を示す
本発明の化合物（化合物１１）をＮＭＲ１マウスに静脈注射した。16mg/kgの最大許容用量（ＭＴＤ）にて、〜１００μＭの初期血漿濃度が観察され、インビトロにおける腫瘍細胞系及び主要な患者結腸直腸癌細胞のＩＣ５０の＞１０倍である。該化合物は急速に分配されそして最後に４〜５時間の半減期で除かれた。本発明の化合物の全身的毒性は低い。4.5mg/kgまでの用量は動物の血漿パラメータ、例えば肝臓ＡＬＴ、血液グルコース及び全タンパク質、に注目すべき変化を生ぜず、動物が体重増加するのを防止しなかった。

実施例７：本発明の化合物は細胞透過性鉄キレート剤である
本発明の化合物の細胞毒性活性が鉄枯渇に依存性であるか否かを試験するために、本発明の化合物の添加前に塩化鉄をＨＣＴ１１６細胞に添加した。塩化鉄は、ｗｔｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞とｐ５３遺伝子が崩壊したＨＣＴ１１６細胞の両方に対して、本発明の化合物の効果を全く無効にすることが見出された。

実施例８：薬学的組成物
本発明の化合物を有機溶媒、例えば、塩酸を少なくとも２モル当量含むメタノール、に溶解する。第２の溶媒、例えばエタノール、を添加することにより、該化合物の二塩酸塩が該溶液から、そのままで又は沈殿する溶媒との複合体として、例えば化合物２ＨＣｌ・ＥｔＯＨとして、沈殿する。該二塩酸塩／エタノール複合体は、薬学的組成物に使用するためには、本発明の化合物の好ましい態様である。それは寒冷沈殿物の形態で使用されるのが好ましい。所望により、該寒冷沈殿物は、標準的な粉末状薬学的賦形剤、例えばマンニトール、澱粉及びミクロセルロース、と組み合わせて錠剤に混入することができる。該賦形剤は低塩基性でなければならない。水に懸濁した場合、該賦形剤はｐＨを７．０超に上昇させてはならず、５．０−７．０のｐＨを与えなければならない。

室温における安定性研究を、（等張性を与えるために）５％水性マンニトール中の該二塩酸塩／エタノール複合体0.1mg/L〜15mg/Lを用いて行った。より薄い溶液はより一層急速に分解することが見出された。例えば、約2.5%の化合物１１は、１リットル当たり１５ｍｇの該化合物を含む溶液を１００時間貯蔵した後に分解するが、１リットル当たり２ｍｇの該化合物を含む溶液中で約5%の該化合物が分解し、そして１リットル当たり０．１ｍｇの該化合物を含む溶液中で約１／３の該化合物が分解する。ＨＰＬＣは、多くの分解生成物の形成を明らかにする。

Claims

一般式Ｉの細胞毒性化合物：
ここで、ＲはＨ又はメチル又はＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキルで置換されたメチレン；Ｒ^１はＨ、Ｃ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、メトキシ、１〜３個のフッ素で置換されたメトキシ、ハロゲンから成る群から選ばれ；Ｒ^２はＨ又はＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキル；ＸはＣＨ又はＮ；ＹはＣＨ又はＮであり；Ｒ_１がＨ、８−Ｂｒ又はＣ_１−Ｃ_４アルキル、Ｒ^２がＨ又はＣ_１−Ｃ_４の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、ＸがＮ、そしてＹがＮであれば、ＲはＨ又はメチルを含ない。
Ｒ^２がＨである、請求項１の化合物。
Ｒ＝Ｈ，Ｒ^１＝６−ＣＨ３，Ｒ^２＝Ｈ，Ｘ及びＹ＝ＣＨ；Ｒ＝ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３，Ｒ^１＝６−ＣＨ_３，Ｒ_２＝Ｈ，Ｘ及びＹ＝Ｎ；Ｒ＝ＣＨ_２ＣＨ_３；Ｒ^１＝６−ＣＨ_３，Ｒ^２＝Ｈ，Ｘ及びＹ＝Ｎから成る群から選ばれる、請求項２の化合物。
Ｒ＝ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３，Ｒ^１＝６−ＣＨ_３，Ｒ^２＝Ｈ，Ｘ及びＹ＝Ｎである、請求項３の化合物。
Ｒ＝ＣＨ_２ＣＨ_３，Ｒ^１＝６−ＣＨ_３，Ｒ^２＝Ｈ，Ｘ及びＹ＝Ｎである、請求項３の化合物。
請求項１〜５のいずれか１項の化合物のシス−，トランス−異性体の混合物。
請求項１〜６のいずれか１項の化合物の薬学的許容塩、塩／溶媒複合体、金属複合体（Ｆｅ^２＋，Ｆｅ^３＋，Ｃｏ^２＋のいずれかとの金属複合体を除く）、又は溶媒複合体。
塩酸塩及び二塩酸塩から選ばれる、請求項７の薬学的許容塩。
請求項１〜８のいずれか１項の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
薬理学的有効量を投与することを特徴とする、ヒトにおける固形癌腫瘍の治療に使用するための請求項１〜８のいずれか１項の化合物。
ヒトにおける固形癌腫瘍の治療に使用するために、該腫瘍を薬理学的有効量の投与前にグルコース欠乏にする、請求項１〜８のいずれか１項の化合物。