JP6238265B2 - 細胞凝集塊の作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性幹細胞等の有用な細胞を液体培地中で浮遊培養し細胞凝集塊を作製する方法に関する。

ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性幹細胞の近年の研究により、再生医療の実用化の可能性が高まっている。これらの細胞は、無限に増殖できる能力と、様々な細胞に分化する能力を有していることから、多能性幹細胞を用いた再生医療には、難治性疾患、生活習慣病等に対する治療法を根本的に変革することが期待されている。多能性幹細胞からは、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞などさまざまな種類の細胞に試験管内で分化誘導することが既に可能になっている。

多能性幹細胞を用いて各種臓器を再生する再生医療に関する実用化に向けた課題の一つに、臓器再生に必要な大量の細胞を如何に効率的に生産するかという課題がある。例えば肝臓の再生には約２×１０^１１個の細胞が必要である。平坦な基板上での接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０^６ｃｍ^２以上の基板が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するためスケールアップが困難であり、再生医療に必要な十分な量の細胞を供給することは困難である。

液体培地中で細胞を浮遊させながら培養する浮遊培養はスケールアップが容易であることから、細胞の大量生産に適していると期待される。

非特許文献３には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、強い撹拌力により液体培地を撹拌しながらヒト多能性幹細胞の浮遊培養を行い均一な大きさのスフェロイドを製造する方法が開示されている。

非特許文献４では微小なマイクロウェルが形成された基板を用い、各マイクロウェル中で均一な大きさのスフェロイドを作製する方法が開示されている。

非特許文献５では培地として、粘性や比重の調製された培地を用い、多能性幹細胞の浮遊状態を保持するとともに細胞同士の衝突を抑制しながら培養を行う方法が開示されている。

特許文献１には細胞を液体培地中で旋回培養しながら培養して、細胞の凝集塊を作製する技術が開示されている。

特許文献２には多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約２００〜３００μｍとなるまで浮遊培養する方法が開示されている。

特開２００３−３０４８６６号公報 国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２３号パンフレット

Takayama N, Nishimura S, Nakamura S, Shimizu T, Ohnishi R, Endo H, Yamaguchi T, Otsu M, Nishimura K, Nakanishi M, Sawaguchi A, Nagai R, Takahashi K, Yamanaka S, Nakauchi H, Eto K. Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells. J Exp Med. 2010 Dec 20; 207(13):2817-30. doi: 10.1084/jem.20100844. Epub 2010 Nov 22. PubMed PMID: 21098095; PubMed Central PMCID: PMC3005234. FR Garcia-Gonzalo and JCI Belmonte, Albumin-Associated Lipids Regulate Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal. PLoS ONE, 2008, 3(1), e1384 Olmer R. et al., Tissue Engineering: Part C, Volume 18 (10): 772-784 (2012) Ungrin MD et al., PLoS ONE, 2008, 3(2), e1565 Otsuji GT et al., Stem Cell Reports, Volume 2: 734-745 (2014)

上記のように細胞凝集塊を浮遊培養により調製する技術が各種開発されているが、本発明者らは、以下のような未解決課題があると推察する。

多能性幹細胞等の接着性細胞は浮遊培養により凝集塊を形成する。細胞凝集の機構としては膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着等が挙げられる。ヒトｉＰＳ細胞等の細胞は単細胞では生存できないため生存のために細胞凝集塊を形成する必要があるが、凝集塊が大きすぎる場合、凝集塊の内部の細胞にまで栄養が十分に行き渡らず、増殖阻害や、未分化性維持への影響の問題が生じる。過剰な凝集を防ぐには液体培地を培養中流動させることが考えられるが、過度の流動は細胞への物理的な刺激になり細胞に障害を起こす危険性がある。そこで、適度な大きさの凝集塊を、細胞に障害を与えることなく生産する浮遊培養の技術が求められているが、背景技術欄で挙げた従来の凝集塊作製方法はなお改善の余地があった。

非特許文献３の方法では剪断応力により細胞死が生じやすいという問題がある。

非特許文献４の方法は大規模化が困難であることや、培地の交換が困難である等の問題がある。

非特許文献５の方法では培養時の培地の移動が少ないため酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。

特許文献１では細胞塊の大きさを適度な大きさに制御するための手段は開示されていない。

特許文献２では細胞塊同士の接着を防ぐための手段として培地に水溶性高分子を添加して粘性を高めることが記載されている。このため非特許文献５と同様に、酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。

そこで本発明は、浮遊培養による細胞凝集塊の作製方法であって、細胞凝集塊を培養に適した大きさに調製することが容易な、細胞へ障害を与える可能性の低い方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、脂質（特にリン脂質）を液体培地中に添加して細胞の浮遊培養を行うことにより、適切な寸法の細胞凝集塊の集団を大量に生産することができる、という驚くべき知見を得て、本発明を完成するに至った。本発明では、培地の粘性、撹拌によるせん断応力、又は、マイクロウェルなどの培養器の形状などの培養環境を変化させるという機械学的／物理学的な手段ではなく、生体に存在する物質を利用し、培地組成を変化させるという生化学的／化学的な手段を用いる。具体的には本発明は以下の発明を包含する。
（１）リゾリン脂質を含む液体培地中で浮遊させながら細胞を培養する工程を含む、細胞凝集塊の作製方法。前記工程は、典型的には、リゾリン脂質を含む液体培地中で浮遊させながら細胞を培養することにより、培養中の前記細胞凝集塊の寸法の増大を制御する工程である。
（２）前記液体培地が、前記リゾリン脂質を０．００６４μｇ／ｍＬより大きく、１００μｇ／ｍＬ以下で含有する、（１）に記載の方法。
（３）前記リゾリン脂質を添加して前記液体培地を調製する工程及び前記リゾリン脂質を酵素反応により生成させて前記液体培地を調製する工程のうち少なくとも一方を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記細胞が、接着又は浮遊させながら培養した後に単離された細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸の少なくともいずれかである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記液体培地が、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より少なくとも１つを含有する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記液体培地が、増殖因子を含有する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記増殖因子が、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の少なくともいずれかである、（７）に記載の方法。
（９）前記液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、（９）に記載の方法。
（１１）前記細胞が多能性幹細胞である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法により作製された細胞凝集塊。
（１３）リゾリン脂質を含む、細胞凝集抑制剤。本発明において、「細胞凝集抑制剤」は「細胞凝集制御剤」と表現することもできる。
（１４）前記リゾリン脂質を０．００６４μｇ／ｍＬより大きく、１００μｇ／ｍＬ以下で含有する、（１３）に記載の細胞凝集抑制剤。
（１５）さらに、増殖因子を含有する（１３）又は（１４）に記載の細胞凝集抑制剤。
（１６）前記増殖因子が、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の少なくともいずれかである、（１５）に記載の細胞凝集抑制剤。
（１７）さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する、（１３）〜（１６）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤。
（１８）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、（１７）に記載の細胞凝集抑制剤。
（１９）前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸の少なくともいずれかである（１３）〜（１８）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤。
（２０）リゾリン脂質の、細胞の凝集を抑制するための使用。本発明において、「細胞の凝集を抑制するための使用」は「細胞培養において細胞の凝集を制御するための使用」と表現することもできる。
（２１）前記リゾリン脂質が、０．００６４μｇ／ｍＬより大きく、１００μｇ／ｍＬ以下の濃度で存在する、（２０）に記載の使用。
（２２）前記リゾリン脂質が、増殖因子と組み合わされている、（２０）又は（２１）に記載の使用。
（２３）前記増殖因子が、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の少なくともいずれかである、（２２）に記載の使用。
（２４）前記リゾリン脂質が、ＲＯＣＫ阻害剤と組み合わされている、（２０）〜（２３）のいずれかに記載の使用。
（２５）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、（２４）に記載の使用。
（２６）前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸の少なくともいずれかである（２０）〜（２５）のいずれかに記載の使用。
（２７）アルブミンと結合能を有する脂質を含む液体培地中で浮遊させながら細胞を培養する工程を含む、細胞凝集塊の作製方法。
（２８）前記液体培地が、前記脂質を０．００３２５〜０．０６５ｍｇ／ｍｌで含有する、（２７）に記載の方法。
（２９）前記液体培地が、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はインスリン及び／又はトランスフェリン及び／又はセレン及び／又は炭化水素ナトリウム及び／又は１つ以上の増殖因子を含有する、（２７）又は（２８）に記載の方法。
（３０）前記液体培地に含まれる前記増殖因子が、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である、（２９）に記載の方法。
（３１）前記細胞が多能性幹細胞である、（２７）〜（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）（２７）〜（３１）のいずれかに記載の方法により作製された細胞凝集塊。
（３３）アルブミンと結合能を有する脂質を含む、細胞凝集抑制剤（又は細胞凝集制御剤）。
（３４）アルブミンと結合能を有する脂質の、細胞の凝集を抑制（又は制御）するための使用。
（３５）前記脂質が０．００３２５〜０．０６５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、（３３）に記載の細胞凝集抑制剤、又は、（３４）に記載の使用。
（３６）前記脂質が、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はインスリン及び／又はトランスフェリン及び／又はセレン及び／又は炭化水素ナトリウム及び／又は１つ以上の増殖因子と組み合わされている、（３３）に記載の細胞凝集抑制剤、又は、（３４）に記載の使用。
（３７）前記細胞が多能性幹細胞である、（３３）に記載の細胞凝集抑制剤、又は、（３４）に記載の使用。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−０１５３０６号の開示内容を包含する。

本発明の方法は、浮遊培養に適した細胞凝集塊を大量に生産することが可能であり、且つ細胞自体も大量に生産することが可能である。

図１は、細胞凝集塊の作製手順の概要を模式的に示す。 図２は、各ＫＳＲ添加濃度における、非接着性の容器内で旋回培養（培養２日目）によってヒトｉＰＳ細胞から形成された三次元凝集塊とその大きさを示す。％＝体積（ｖ）／体積（ｖ）。 図３は、各ＫＳＲ添加濃度における、グルコース消費量の経時的な変化を示す。ｎ＝４。 図４は、各ＫＳＲ添加濃度における、培養５日目の細胞数を示す。ｎ＝４。 図５は、非特許文献２に開示されているＫＳＲの構成成分を示す。 図６は、各因子（ＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ、ＢＳＡ、インスリン、トランスフェリン）添加における、凝集塊形成への影響を示す。％＝重量（ｗ）／体積（ｖ）。 図７は、ヒトｉＰＳ細胞の接着培養時および浮遊培養時（凝集塊）におけるＯＣＴ４発現率を示す。 図８は、脂質フリーウシ血清アルブミンと各脂質を添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養したときの顕微鏡観察像を示す。 図９は、脂質フリーウシ血清アルブミンと各濃度のＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）とを添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養したときの顕微鏡観察像を示す。φは細胞凝集塊の寸法の平均値（±標準偏差）を示す。 図１０は、脂質フリーウシ血清アルブミンと各濃度のＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）とを添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養したときの顕微鏡観察像を示す。φは細胞凝集塊の寸法の平均値（±標準偏差）を示す。 図１１は、脂質フリーウシ血清アルブミンのみ、或いは、各濃度のＬＰＡ又はＳ１Ｐを添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養したときの顕微鏡観察像を示す。 図１２は、脂質フリーウシ血清アルブミンのみ、或いは、各濃度のＬＰＡ又はＳ１Ｐを添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養したときの培養系のグルコース消費量の経時変化を示す。ｎ＝３。 図１３は、脂質フリーウシ血清アルブミンのみ、或いは、各濃度ＬＰＡ又はＳ１Ｐを添加したヒトｉＰＳ細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養したときの培養５日目の細胞収量を示す。ｎ＝３。 図１４は、ヒトｉＰＳ細胞の、接着培養時および１．０μｇ／ｍＬのＬＰＡ又はＳ１Ｐを添加した細胞懸濁液中での浮遊培養時における未分化マーカー（ＯＣＴ４及びＳＯＸ２）の陽性率を示す。 図１５は、浮遊培養での各培養スケール（４ｍＬスケール、３００ｍＬスケール、１．６Ｌスケール）における播種１日後（Ｄａｙ１）と播種５日後又は６日後（Ｄａｙ５又はＤａｙ６）における顕微鏡観察像を示す。 図１６は、浮遊培養での各培養スケール（４ｍＬスケール、３００ｍＬスケール、１．６Ｌスケール）における細胞密度の経時的変化を示す。 図１７は、浮遊培養での各培養スケール（４ｍＬスケール、３００ｍＬスケール、１．６Ｌスケール）及び接着培養時における未分化マーカー（ＯＣＴ４及びＳＯＸ２）の陽性率を示す。

以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
＜１．細胞＞
本発明の方法で培養し、細胞凝集塊を形成する細胞は、接着性を有する細胞（接着性細胞）であれば特に限定されず、動物由来細胞等であることができ、好ましくは哺乳類動物由来細胞等であることができ、より好ましくは生体組織由来細胞及び生体組織由来細胞から派生した細胞等であることができ、特に好ましくは上皮組織由来細胞及び上皮組織細胞から派生した細胞等、又は結合組織由来細胞及び結合組織由来細胞から派生した細胞等、又は筋組織由来細胞及び筋組織由来細胞から派生した細胞等、又は神経組織由来細胞及び神経組織由来細胞から派生した細胞等であることができ、さらに好ましくは動物由来幹細胞及び動物由来幹細胞から分化した細胞等であることができ、もっと好ましくは動物由来多能性幹細胞及び動物由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができ、よりさらに好ましくは哺乳類動物由来多能性幹細胞及び哺乳類動物由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができ、もっとも好ましくはヒト由来多能性幹細胞及びヒト由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができる。

本発明において「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。多能性幹細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞であるＥＧ細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． （１９９８） ９５， ｐ．１３７２６−１３７３１）、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞（Ｃｏｎｒａｄ Ｓ．， Ｎａｔｕｒｅ （２００８） ４５６， ｐ．３４４−３４９）、体細胞由来の人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に用いる多能性幹細胞は、特に好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ＥＳ細胞は、胚盤胞と呼ばれる初期胚の内部に存在する内部細胞塊から採取した未分化細胞に由来する培養細胞である。ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化し、多能性を付与した培養細胞である。初期化因子としては、例えばＯＣＴ３／４及びＫＬＦ４及びＳＯＸ２及びｃ−Ｍｙｃを用いることができ（Ｙｕ Ｊ, ｅt ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００７；３１８：１９１７−２０．）、例えばＯＣＴ３／４及びＳＯＸ２及びＬＩＮ２８及びＮａｎｏｇを用いることができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， eｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． ２００７；１３１：８６１-７２．）。これらの因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、ＴｋＤＮ４−Ｍ株、ＴｋＤＡ３−１株、ＴｋＤＡ３−２株、ＴｋＤＡ３−４株、ＴｋＤＡ３−５株、ＴｋＤＡ３−９株、ＴｋＤＡ３−２０株、ｈｉＰＳＣ ３８−２株、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ１株、ＢＪ−ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ−１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。ｉＰＳ細胞を作製する際の細胞の由来は特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞又はリンパ球等を用いることができる。

本発明で用いられる細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、さらにイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物などの哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。

本発明では、接着又は浮遊させながら培養した後に単離された細胞を用いることができる。ここで「単離された細胞」とは、複数の細胞が集団として接着している細胞を剥離、分散した状態の前記細胞である。単離とは、培養容器や培養担体等に接着していた状態の細胞又は細胞同士が接着している状態の細胞集団を剥離、分散して単一の細胞にする工程である。単離する細胞集団は液体培地中に浮遊した状態であってもよい。単離の方法は特に限定されないが、剥離剤（トリプシン又はコラゲナーゼ等の細胞剥離酵素）又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤又は剥離剤とキレート剤の混合物等を好適に使用することができる。剥離剤は特に限定されないが、トリプシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）、コラゲナーゼなどが挙げられる。単離後に凍結保存した前記細胞も本発明で好適に使用することができる。
＜２．細胞凝集塊＞
本発明において細胞凝集塊とは、複数の細胞が三次元的に凝集して形成される塊状体であって、スフェロイドとも呼ばれる。本発明で作製される細胞凝集塊は、典型的には、概ね球状の形状を有する。

本発明において、細胞凝集塊を構成する細胞は１種類以上の前記接着性細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された前記細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している細胞を含む。前記多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ−１−６０、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１等が例示できる。前記細胞凝集塊を構成する細胞が前記多能性幹細胞である場合、前記多能性幹細胞マーカーを発現する細胞の割合は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％以下とすることができる。

本発明の方法により作製される細胞凝集塊の寸法は特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限が好ましくは１０００μｍ、より好ましくは９００μｍ、より好ましくは８００μｍ、より好ましくは７００μｍ、さらに好ましくは６００μｍ、もっと好ましくは５００μｍ、よりさらに好ましくは４００μｍ、もっとも好ましくは３００μｍである。下限は好ましくは５０μｍ、より好ましくは６０μｍ、さらに好ましくは７０μｍ、もっと好ましくは８０μｍ、よりさらに好ましくは９０μｍ、最も好ましくは１００μｍである。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

本発明の方法により作製される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞凝集塊のうち重量基準で１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、もっと好ましくは４０％以上、よりさらに好ましくは５０％以上、よりもっと好ましくは６０％以上、さらにもっと好ましくは７０％以上、よりさらにもっと好ましくは８０％以上、もっとも好ましくは９０％以上が上記の範囲の寸法を有することが好ましい。
＜３．液体培地＞
本発明で用いる液体培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、前記脂質及び必要に応じて他の成分を適宜添加することにより調製することができる。

基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地とを好ましくは６０／４０〜４０／６０の重量比、より好ましくは５５／４５〜４５／５５の重量比、最も好ましくは等量で混合した培地を用いる。

本発明で用いる液体培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。

本発明で用いる液体培地は、より好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含み、より好ましくはこれらの全部を含む。Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムは、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸は、２−リン酸アスコルビン酸マグネシウムなどの誘導体の形態で培地に添加してもよい。セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウムなど）の形態で培地に添加してもよい。インスリン及びトランスフェリンは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。インスリン、トランスフェリン、及びセレンは、試薬ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）の形態で培地に添加してもよい。ＩＴＳは、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムを含む、細胞増殖促進用の添加剤である。

Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含む市販の培地を用いて本発明の液体培地として使用することができる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦ Ｄｒｙ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）等を用いることができる。ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）なども好適に用いることができる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている液体培地も好適に使用することができる。

本発明で用いる液体培地は好ましくは少なくとも１つの増殖因子を含む。増殖因子としては、限定するものではないが、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２）、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＬＩＦ及びＩＧＦＢＰ−７からなる群から選択される１つ以上を含むことが好ましい。特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である。

本発明で用いる液体培地として最も好ましいものは、アルブミン及び／又は後述の脂質以外の成分として、更にＬ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子を含む無血清培地であり、特に好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。このような培地としては、アルブミン及び／又は後述の脂質を添加した、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が好適に使用できる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地は、ライフテクノロジーズジャパン株式会社から市販されている、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＨＡＭ）１：１と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭサプリメント（Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１を含む）とを混合して調製することができる。

本発明で用いる液体培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤、リン酸化酵素阻害剤等の成分を含有してもよい。

抗生剤としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。

リン酸化酵素阻害剤としては、ＲＯＣＫ阻害剤を添加することができる。

ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ(ＲＯＣＫ，Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ)のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、例えば、Ｙ−２７６３２(４−［(１R)−１−アミノエチル]−Ｎ−ピリジン−４−イルシクロヘキサン−１−カルボキサミド)又はその２塩酸塩（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７(１−(５−イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン)又はその２塩酸塩（例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、Ｈ−１１５２((Ｓ)−(＋)−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル)スルホニル]−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１,４−ジアゼピン）又はその2塩酸塩（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Ｗｆ−５３６((＋)−(Ｒ)−４−(１−アミノエチル)−Ｎ−(4-ピリジル)ベンズアミド1塩酸塩)（例えば、Nakajima et al., CancerChemother. Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、少なくとも1種のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。

本発明で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、下記の式Ｉで示される化合物又はその塩（例えば2塩酸塩）であるＹ−２７６３２であり得る。Ｙ−２７６３２として水和物の形態のものを添加してもよい。

液体培地におけるＹ−２７６３２の濃度は特に限定されないが、例えば、８０〜１２０ｎＭ（特に１００ｎＭ）、４００〜６００ｎＭ（特に５００ｎＭ）、６００〜９００ｎＭ（特に７５０ｎＭ）、０．８〜１．２μＭ（特に１μＭ）、１．６〜２．４μＭ（特に２μＭ）、２．４〜３．６μＭ（特に３μＭ）、３．２〜４．８μＭ（特に４μＭ）、４〜６μＭ（特に５μＭ）、４．８〜７．２μＭ（特に６μＭ、μＭ（特に７μＭ）、６．４〜９．６μＭ（特に８μＭ）、７．２〜１０．８μＭ（特に９μＭ）、８〜１２μＭ（特に１０μＭ）、１２〜１８μＭ（特に１５μＭ）、１６〜２４μＭ（特に２０μＭ）、２０〜３０μＭ（特に２５μＭ）、２４〜３６μＭ（特に３０μＭ）、３２〜４８μＭ（特に４０μＭ）、又は、４０〜６０μＭ（特に５０μＭ）、より好ましくは８〜１２μＭ（特に１０μＭ）である。
＜４．脂質＞
本発明に用いる脂質は、本発明の一実施形態においては、アルブミンと結合能を有する脂質であることができる。本欄＜４．脂質＞において「脂質」とは、特に明示しない限り、アルブミンと結合能を有する脂質を指す。具体的な脂質としては、血清アルブミン等のタンパク質と複合体を形成している脂質、血清アルブミンから分離した脂質、微生物、化学合成等で生産した脂質であってアルブミンと結合能を有する脂質等の形態の脂質が挙げられる。なお、「アルブミンとの結合能」とは、化学的及び／又は物理的な結合を介してアルブミンと複合体を形成しうる性質を指す。

脂質の起源動物は特に限定されず、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜又は愛玩動物などの哺乳動物であってよく、好ましくはウシ又はヒトである。培養される細胞と同種の生物に由来する脂質も好適である。また、脂質は人為的に合成されたものであってもよい。

脂質は、それを含む血清として液体培地中に添加されてもよい。また脂質を含む血清アルブミン（脂質含有血清アルブミン）として液体培地中に添加されてもよい。脂質含有血清アルブミンとしては、脂質と血清アルブミンのタンパク質とが複合体を形成したものを使用することができる。脂質含有血清アルブミンのなかでも特に、脂質の含有率を高めた形態のものが好ましい。該脂質含有血清アルブミンとしては、市販されているＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ、具体的にはＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ Ｉ又はＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ ＩＩ（いずれもライフテクノロジーズジャパン株式会社）が挙げられる。

脂質は血清由来の脂質、又は血清アルブミンと結合可能な脂質であれば特に限定されず、起源生物に応じて変動し得るが、遊離脂肪酸、リン脂質（グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、リゾホスファチジルコリンなど）、中性脂肪、コレステロールなどの可能性がある。脂質は例えばリゾホスファチジルコリン、トリアシルグリセリド、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、コレステロール及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される少なくとも一種を含み、より好ましくは前記群の全てを含む。更に好ましくは、本発明に用いる脂質は、脂質の全重量を基準として、２０〜８０重量％（より好ましくは４０〜７０重量％）の遊離脂肪酸、５〜５０重量％（より好ましくは１０〜３０重量％）のリゾホスファチジルコリン、５〜４５重量％（より好ましくは１０〜３０重量％）のトリアシルグリセリド、及び２〜２５重量％（より好ましくは５〜１５重量％）のホスファチジルコリンを少なくとも含み、好ましくは更に、１〜１０重量％（より好ましくは１〜６重量％）のホスファチジン酸、０．１〜３重量％（より好ましくは０．５〜２重量％）のコレステロール及び０．１〜３重量％（より好ましくは０．５〜２重量％）のスフィンゴミエリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。このような組成の脂質を含有する脂質含有血清アルブミンを、本発明の方法に好適に用いることができる。なお、非特許文献２によればＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ ＩＩは、脂質の全重量を基準として、約５４重量％の遊離脂肪酸、約１７重量％のリゾホスファチジルコリン、約１５重量％のトリアシルグリセリド、約８重量％のホスファチジルコリン、約３重量％のホスファチジン酸、約１重量％のコレステロール及び約１重量％のスフィンゴミエリンを含む。

血清アルブミンから分離された前記脂質も好適に本発明に使用することができる。前記血清アルブミンから前記脂質を分離する方法は特に限定されないが、脂質と複合体を形成した血清アルブミンに対してトリプシン処理等のタンパク質分解処理を施したのち脂質を回収する方法が挙げられる。分離された脂質は、血清アルブミンに含まれる脂質の組成を実質的に維持したまま本発明に使用してもよいし、一部の脂質を高濃度化して使用してもよい。

脂質が、血清代替物として市販されている試薬の中に含まれている場合には、該試薬に含まれる一成分として液体培地中に添加し使用することもできる。血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の培養において血清（ＦＢＳ等）の代替品として細胞の未分化状態の維持及び培養のために使用される試薬であり、例えば、ＫＮＯＣＫＯＵＴ^ＴＭ ＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ；和光純薬工業）、Ｎ２サプリメント（和光純薬工業）等が挙げられる。前記ＫＳＲにはＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ、具体的にはＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ Ｉ又はＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ ＩＩが含まれる。

一般的に血清中に含まれるアルブミン濃度はおよそ５０ｍｇ／ｍｌであり、ＫＳＲにも同様の濃度の血清アルブミンが含まれると容易に考えられる。非特許文献２によれば、ＫＳＲに含まれる血清アルブミンはＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭであることから、非特許文献２に記載の通り、１００ｍｇのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭに含有する脂質は０．６５ｍｇであるので、例えば、最終濃度１％（体積／体積）のＫＳＲが含まれる液体培地には、０．５ｍｇ／ｍｌのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭが含まれており、つまり、脂質は０．００３２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれることになる。例えば、最終濃度２ｍｇ／ｍｌのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭが含まれる液体培地には、０．０１３ｍｇ／ｍＬの脂質が含まれる。従って、本発明の浮遊培養に用いる液体培地における脂質の含有量は、特に限定されないが０．００３２５〜０．０６５ｍｇ／ｍｌとすることができ、好ましくは０．００３２５〜０．０３２５ｍｇ／ｍｌとすることができ、より好ましくは０．００３２５〜０．０１６２５ｍｇ／ｍｌとすることができ、さらに好ましくは０．００３２５〜０．０１３ｍｇ／ｍｌとすることができる。脂質の濃度は、適切な分析法（例えば液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等の手段を用いた分析法）により求めた濃度を採用することができる。

脂質はアルブミンと結合していない状態で液体培地中に存在していてもよい。別々に用意された脂質とアルブミンとを液体培地に添加してもよく、添加するアルブミンの由来は特に限定されないが、例えば、ヒト又はウシ由来アルブミンが好ましい。すなわち本発明の方法の一実施形態では、前記脂質をアルブミンと結合していない状態で添加して液体培地を調製する工程を含むことができる。また、脂質フリーの血清アルブミンを使用しても良い。遺伝子組み換え技術により大腸菌や動物細胞で発現、調製したアルブミンを使用しても良い。アルブミンの代替となるタンパク質や添加物、例えば、両親媒性の物質（界面活性剤等）を添加することもできる。
＜５．リゾリン脂質＞
本発明の他の実施形態において用いる脂質はリゾリン脂質である。

リゾリン脂質は、１つの脂肪族基（例えば１つの中鎖又は長鎖脂肪族基）を有するリン脂質の総称である。リゾリン脂質としてはグリセロール骨格を有するものでもよいし、スフィンゴシン骨格を有するものでもよい。前記リゾリン脂質としてはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）、リゾホスファチジルスレオニン（ＬＰＴ）、リゾホスフェチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）等が挙げられ、複数種のリゾリン脂質の混合物であってもよい。これらのリゾリン脂質は塩等の任意の形態であってよい。前記リゾリン脂質としては、ＬＰＣ以外のリゾリン脂質であることが好ましく、ＬＰＡ、Ｓ１Ｐ等の、極性頭部基として無置換のリン酸基を有するリゾリン脂質がより好ましい。前記リゾリン脂質がアシル基を含む場合、アシル基の炭素数や不飽和度は特に限定されず、起源生物に応じた炭素数や不飽和度であることができるが、典型的にはアシル基の炭素数は１６〜２４であり、不飽和度は０〜６の範囲である。より好ましくは、炭素数：不飽和度が１６：０、１６：１、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２０：５、２２：０、２２：１、２２：２、２２：３、２２：４、２２：５、又は、２２：６のアシル基である。また、グリセロール骨格を有するリゾリン脂質は１-アシル型リゾリン脂質および２-アシル型リゾリン脂質のどちらでもよく、好ましくは１-アシル型リゾリン脂質である。

前記リゾリン脂質の起源生物は、＜４．脂質＞において説明した起源生物と同様の範囲から選択できる。また、前記リゾリン脂質は人為的に調製されたものであってもよい。

前記リゾリン脂質は、それを含む組成物として液体培地中に添加されてもよい。前記組成物としてはリゾリン脂質とタンパク質との混合物等が例示できる。

前記リゾリン脂質は、タンパク質と結合していない形態で培養に使用してもよい。特に、液体培地を調製するための原料として、タンパク質との混合物ではない形態の、好ましくは実質的に精製された形態の、前記リゾリン脂質を用いれば、前記リゾリン脂質の添加量を好適な範囲に調節することが容易であるため好適である。このようなリゾリン脂質は、起源生物から分離したものであってもよいし、人為的に調製されたものであってもよい。

前記リゾリン脂質の浮遊培養の開始時の液体培地中での濃度は適宜調整し得るが、例えば０．００１２８μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．００６４μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．００６４μｇ／ｍＬよりも大きく、好ましくは０．０３２μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．０６４μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．１６μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．２μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．３μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．４μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ以上である場合に、細胞の凝集を適度に抑制して略均一な大きさの細胞凝集塊を形成することができ、例えば１０００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは９０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは８０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは７０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは８μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは７μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは６μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．９μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．８μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．７μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．６μｇ／ｍＬ以下である場合に、上述のような適切な寸法の球状の細胞凝集塊を形成することができる。液体培地中にリゾリン脂質として複数種の成分が添加される場合には、各リゾリン脂質の濃度が上記範囲となるように設定することが好ましく、リゾリン脂質の合計濃度が上記範囲となるように設定することがより好ましい。なお、上記のリゾリン脂質の量は、液体培地の調製時に添加されるリゾリン脂質の量（ただし、後述のように液体培地中で酵素反応によりリゾリン脂質が生成される場合は該反応で生じるリゾリン脂質の量も含む）を指し、培養される細胞が産生するリゾリン脂質は量に含まれない。前記リゾリン脂質の濃度は、適切な分析法（例えば液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等の手段を用いた分析法）により求めた濃度を採用することができる。より好ましくは、リゾリン脂質を２Ｓ−ａｍｉｎｏ−１−（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−４Ｅ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ−１，３Ｒ−ｄｉｏｌ（分子量３７９．５）として換算したときの重量の濃度が上記の範囲となるようにする。

前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸である場合、浮遊培養の開始時の液体培地中でのリゾホスファチジン酸の濃度は適宜調整し得るが、例えば０．００１２８μｇ／ｍＬ以上又は０．００２７９μＭ以上、好ましくは０．００６４μｇ／ｍＬ以上又は０．０１４０μＭ以上、好ましくは０．００６４μｇ／ｍＬよりも大きく又は０．０１４０μＭよりも大きく、好ましくは０．０３２μｇ／ｍＬ以上又は０．０６９８μＭ以上、好ましくは０．０６４μｇ／ｍＬ以上又は０．１４０μＭ以上、好ましくは０．１６μｇ／ｍＬ以上又は０．３４９μＭ以上、好ましくは０．２μｇ／ｍＬ以上又は０．４３６μＭ以上、好ましくは０．３μｇ／ｍＬ以上又は０．６５４μＭ以上、好ましくは０．４μｇ／ｍＬ以上又は０．８７２μＭ以上、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ以上又は１．０９μＭ以上である場合に、細胞の凝集を適度に抑制して略均一な大きさの細胞凝集塊を形成することができ、例えば１０００μｇ／ｍＬ以下又は２１８０μＭ以下、好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下又は４３６μＭ以下、好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下又は３２７μＭ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下又は２１８μＭ以下、より好ましくは９０μｇ／ｍＬ以下又は１９６μＭ以下、より好ましくは８０μｇ／ｍＬ以下又は１７４μＭ以下、より好ましくは７０μｇ／ｍＬ以下又は１５３μＭ以下、より好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下又は１３１μＭ以下、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以下又は１０９μＭ以下、より好ましくは４０μｇ／ｍＬ以下又は８７．２μＭ以下、より好ましくは３０μｇ／ｍＬ以下又は６５．４μＭ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下又は４３．６μＭ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下又は２１．８μＭ以下、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以下又は１９．６μＭ以下、より好ましくは８μｇ／ｍＬ以下又は１７．４μＭ以下、より好ましくは７μｇ／ｍＬ以下又は１５．３μＭ以下、より好ましくは６μｇ／ｍＬ以下又は１３．１μＭ以下、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以下又は１０．９μＭ以下、より好ましくは４μｇ／ｍＬ以下又は８．７２μＭ以下、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以下又は６．５４μＭ以下、より好ましくは２μｇ／ｍＬ以下又は４．３６μＭ以下、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下又は２．１８μＭ以下、より好ましくは０．９μｇ／ｍＬ以下又は１．９６μＭ以下、より好ましくは０．８μｇ／ｍＬ以下又は１．７４μＭ以下、より好ましくは０．７μｇ／ｍＬ以下又は１．５３μＭ以下、より好ましくは０．６μｇ／ｍＬ以下又は１．３１μＭ以下である場合に、上述のような適切な寸法の球状の細胞凝集塊を形成することができる。なお、上記のリゾホスファチジン酸の量は、液体培地の調製時に添加されるリゾホスファチジン酸の量（ただし、後述のように液体培地中で酵素反応によりリゾホスファチジン酸が生成される場合は該反応で生じるリゾホスファチジン酸の量も含む）を指し、培養される細胞が産生するリゾホスファチジン酸は量に含めない。上記のリゾホスファチジン酸の重量の濃度は、好ましくは、ナトリウム塩（１−Ｏ−９Ｚ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｙｌ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ， ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ；分子量４５８．５）として換算した重量の濃度を指す。

前記リゾリン脂質がスフィンゴシン−１−リン酸である場合、浮遊培養の開始時の液体培地中でのスフィンゴシン−１−リン酸の濃度は適宜調整し得るが、例えば０．００１２８μｇ／ｍＬ以上又は０．００３３７μＭ以上、好ましくは０．００６４μｇ／ｍＬ以上又は０．０１６９μＭ以上、好ましくは０．００６４μｇ／ｍＬよりも大きく又は０．０１６９μＭよりも大きく、好ましくは０．０３２μｇ／ｍＬ以上又は０．０８４３μＭ以上、好ましくは０．０６４μｇ／ｍＬ以上又は０．１６９μＭ以上、好ましくは０．１６μｇ／ｍＬ以上又は０．４２２μＭ以上、好ましくは０．２μｇ／ｍＬ以上又は０．５２７μＭ以上、好ましくは０．３μｇ／ｍＬ以上又は０．７９１μＭ以上、好ましくは０．４μｇ／ｍＬ以上又は１．０５μＭ以上、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ以上又は１．３２μＭ以上である場合に、細胞の凝集を適度に抑制して略均一な大きさの細胞凝集塊を形成することができ、例えば１０００μｇ／ｍＬ以下又は２６４０μＭ以下、好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下又は５２７μＭ以下、好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下又は３９５μＭ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下又は２６４μＭ以下、より好ましくは９０μｇ／ｍＬ以下又は２３７μＭ以下、より好ましくは８０μｇ／ｍＬ以下又は２１１μＭ以下、より好ましくは７０μｇ／ｍＬ以下又は１８４μＭ以下、より好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下又は１５８μＭ以下、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以下又は１３２μＭ以下、より好ましくは４０μｇ／ｍＬ以下又は１０５μＭ以下、より好ましくは３０μｇ／ｍＬ以下又は７９．１μＭ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下又は５２．７μＭ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下又は２６．４μＭ以下、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以下又は２３．７μＭ以下、より好ましくは８μｇ／ｍＬ以下又は２１．１μＭ以下、より好ましくは７μｇ／ｍＬ以下又は１８．４μＭ以下、より好ましくは６μｇ／ｍＬ以下又は１５．８μＭ以下、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以下又は１３．２μＭ以下、より好ましくは４μｇ／ｍＬ以下又は１０．５μＭ以下、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以下又は７．９１μＭ以下、より好ましくは２μｇ／ｍＬ以下又は５．２７μＭ以下、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下又は２．６４μＭ以下、より好ましくは０．９μｇ／ｍＬ以下又は２．３７μＭ以下、より好ましくは０．８μｇ／ｍＬ以下又は２．１１μＭ以下、より好ましくは０．７μｇ／ｍＬ以下又は１．８４μＭ以下、より好ましくは０．６μｇ／ｍＬ以下又は１．５８μＭ以下である場合に、上述のような適切な寸法の球状の細胞凝集塊を形成することができる。なお、上記のスフィンゴシン−１−リン酸の量は、液体培地の調製時に添加されるスフィンゴシン−１−リン酸の量（ただし、後述のように液体培地中で酵素反応によりスフィンゴシン−１−リン酸が生成される場合は該反応で生じるスフィンゴシン−１−リン酸の量も含む）を指し、培養される細胞が産生するスフィンゴシン−１−リン酸は量に含めない。上記のスフィンゴシン−１−リン酸の重量の濃度は、好ましくは、フリー体（２Ｓ−ａｍｉｎｏ−１−（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−４Ｅ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ−１，３Ｒ−ｄｉｏｌ；分子量３７９．５）として換算した重量の濃度を指す。

複数の前記リゾリン脂質を混合して使用することもできる。混合比率は特に限定されないが、例えばＬＰＡ：Ｓ１Ｐが重量比で１：１〜８００００又は１〜８００００：１であり、具体的には、１：０．５〜１．５（例えば１：１）、１：２．５〜７．５（例えば１：５）、１：１３〜３８（例えば１：２５）、１：６３〜１９０（例えば１：１２５）、１：７８〜２３０（例えば１：１５６．２５）、１：３１０〜９４０（例えば１：６２５）、１：１６００〜４７００（例えば１：３１２５）、１：７８００〜２３０００（例えば１：１５６２５）、１：３９０００〜１２００００（例えば１：７８１２５）、２．５〜７．５：１（例えば５：１）、１３〜３８：１（例えば２５：１）、６３〜１９０：１（例えば１２５：１）、７８〜２３０：１（例えば１５６．２５：１）、７８〜２３０：５（例えば１５６．２５：５）、７８〜２３０：２５（例えば１５６．２５：２５）、７８〜２３０：１２５（例えば１５６．２５：１２５）、３１０〜９４０：１（例えば６２５：１）、３１０〜９４０：１５６．２５（例えば６２５：１５６．２５）、１６００〜４７００：１（例えば３１２５：１）、１６００〜４７００：１５６．２５（例えば３１２５：１５６．２５）、７８００〜２３０００：１（例えば１５６２５：１）、７８００〜２３０００：１５６．２５（例えば１５６２５：１５６．２５）、３９０００〜１２００００：１（例えば７８１２５：１）、３９０００〜１２００００：１５６．２５（例えば７８１２５：１５６．２５）で使用することができる。前記重量比は、好ましくは、ＬＰＡをナトリウム塩（１−Ｏ−９Ｚ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｙｌ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ， ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ；分子量４５８．５）として換算し、Ｓ１Ｐをフリー体（２Ｓ−ａｍｉｎｏ−１−（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−４Ｅ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ−１，３Ｒ−ｄｉｏｌ；分子量３７９．５）として換算した重量比である。

前記リゾリン脂質として、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）とスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）以外に、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）、リゾホスファチジルスレオニン（ＬＰＴ）、リゾホスフェチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）も前記濃度又は前記混合比率で使用することができる。

本発明の方法では更に、脂質から酵素反応により前記リゾリン脂質を生成する工程を含んでもよい。前記酵素反応としては、加水分解酵素反応、リン酸化酵素反応等が例示できる。

前記加水分解酵素反応としては、前記リン脂質を基質とする加水分解酵素による加水分解反応が挙げられる。本発明に用いる前記加水分解酵素は特に限定されないが、好ましくはホスホリパーゼ及びリゾホスホリパーゼである。前記ホスホリパーゼ及び前記リゾホスホリパーゼは特に限定されないが、好ましくはホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、リゾホスファリパーゼＤ（オートタキシン）である。ホルホリパーゼＡ１とはグリセロリン脂質のｓｎ−１位のエステル結合を加水分解する酵素である。ホスホリパーゼＡ２とはグリセロリン脂質のｓｎ−２位のエステル結合を加水分解する酵素である。オートタキシンとは、リン脂質又はリゾリン脂質におけるリン酸基上の置換基とのリン酸エステル結合を加水分解して、極性頭部基として無置換のリン酸基を生成させる加水分解酵素であり、例えばＬＰＣを加水分解してＬＰＡとコリンを生成させることができる。グリセロリン脂質を基質とし、ホスホリパーゼＡ１又はホルホリパーゼＡ２、及びオートタキシンによる反応で得られた加水分解物（ＬＰＡ等）も本発明においてリゾリン脂質として好適に使用することができる。ＬＰＣ、ＬＰＳ、ＬＰＩ、ＬＰＧ、ＬＰＴ、ＬＰＥ等を上記オートタキシン処理により得られた加水分解物（ＬＰＡ等）も本発明において好適に使用することができる。

本発明において、前記スフィンゴ脂質から調製されたＳ１Ｐ等もリゾリン脂質として好適に使用することができる。調製方法は特に限定されないが、例えば、スフィンゴシンをスフィンゴキナーゼ等のリン酸化酵素でリン酸化して得られたリン酸化物（Ｓ１Ｐ等）がリゾリン脂質として好適に使用することができる。

本発明の方法では更に、前記リゾリン脂質を添加して液体培地を調製する工程を含んでもよい。このとき前記リゾリン脂質をタンパク質と結合していない形態で添加することが、前記リゾリン脂質の添加量を調節し易いため好ましい。

本発明において、前記リゾリン脂質（好ましくはＬＰＡ又はＳ１Ｐのいずれかを含む）、又は、前記脂質の加水分解物、又は、前記脂質と前記加水分解酵素との混合物、又は、前記スフィンゴ脂質と前記リン酸化酵素との混合物等、或いはこれらの物質のいずれかを含む液体培地等を含有する細胞凝集抑制キットも好適に使用することができる。
＜６．細胞凝集抑制剤＞
本発明における細胞凝集抑制剤は、前記脂質を含有しており、且つ、浮遊培養系において細胞の凝集を適度に抑制して略均一な大きさの細胞凝集塊を形成するために用いることができる。

本発明における細胞凝集抑制剤の形態は特に限定されず、前記脂質自体であってもよいし、前記脂質と他の成分とを組み合わせた組成物であってもよい。前記組成物の形態は特に限定されない。前記組成物は例えば浮遊培養に用いる液体培地であってもよいし、液体培地の調製時に配合される添加用組成物であってもよい。

本発明における細胞凝集抑制剤の好ましい実施形態は、前記リゾリン脂質を前記濃度又は前記比率で含有する、前記液体培地又はリン酸緩衝液等の緩衝液である。

本発明における細胞凝集抑制剤の別の好ましい実施形態は、前記リゾリン脂質を液状媒体中に含有する液状組成物である。前記液状組成物は、浮遊培養用の液体培地を調製する際に添加される添加物である。前記液状組成物は、調製される液体培地中での前記リゾリン脂質の最終濃度が前記濃度となるように調製されていることが好ましい、前記細胞と混合前の前記液状組成物中での前記リゾリン脂質の濃度は特に限定されないが、好ましくは、前記リゾリン脂質の、浮遊培養時の好ましい濃度として挙げた前記濃度の１倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上、より好ましくは１００００倍以上である。

細胞凝集抑制剤は、添加剤として、酵素（特に加水分解酵素、リン酸化酵素）、抗生剤、リン酸化酵素阻害剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等も含有していても良い。酵素は特に限定されないが、加水分解酵素、リン酸化酵素等を使用することができ、前記加水分解酵素やリン酸化酵素は上述した通りである。抗生剤は特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。リン酸化酵素阻害剤は特に限定されえないが、好ましくはＲＯＣＫ阻害剤である。ＲＯＣＫ阻害剤は特に限定されないが、好ましくは前記Ｙ−２７６３２である。本発明の細胞凝集抑制剤はＲＯＣＫ阻害剤を、液体培地に対して最終濃度として前記濃度となるように、含有することが好ましく、最も好ましくは、液体培地に対して最終濃度として１０μＭとなるように含有する。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙がられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、dl−カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、2−ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、l−メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ−ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢおよびその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥおよびその誘導体、αリポ酸およびその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、およびこれらの混合物などが挙げられる。

細胞凝集抑制剤は、増殖因子を含有してもよく、好ましくはＦＧＦ２又はＴＧＦ−β１の少なくともいずれかを含有していることが好ましい。
＜７．浮遊培養＞
本発明では、前記の液体培地中で細胞を浮遊させながら培養を行うことで、細胞凝集塊を形成する。本発明では、仮に本発明の所定の脂質が液体培地中に存在しない場合には、細胞が、前記好適な寸法を超える大きな細胞凝集塊を形成することとなる条件において浮遊培養を行うことが好ましい。

浮遊細胞の培養に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、Ｎｕｎｃｌｏｎ^ＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用できるが特に限定はされない。

培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。

浮遊培養は静置培養であってもよいし、液体培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは液体培地が流動する条件での培養である。液体培地が流動する条件での培養としては、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。

旋回培養（振盪培養）は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。旋回速度は特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１１５ｒｐｍ、より好ましくは１１０ｒｐｍ、より好ましくは１０５ｒｐｍ、もっと好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９５ｒｐｍ、特に好ましくは９０ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは５０ｒｐｍ、より好ましくは６０ｒｐｍ、より好ましくは７０ｒｐｍ、さらに好ましくは８０ｒｐｍもっと好ましくは９０ｒｐｍとすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ、好ましくは１０ｍｍ、より好ましくは２０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ、好ましくは１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍ、より好ましくは３０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍであり、上限は例えば１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍとすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。

揺動培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う培養である。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２〜５０回、好ましくは４〜２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°〜２０°、より好ましくは２°〜１０°とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。

更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。

スピナーフラスコ状の培養容器を用いた培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができる。回転数は例えば１０ｒｐｍ以上、１００ｒｐｍ以下とすることができるが、特に限定されない。

浮遊培養における細胞の液体培地中での播種密度（浮遊培養の開始時の細胞密度）は適宜調整することができるが、下限として、例えば０．０１×１０^５個細胞／ｍｌ、より好ましくは０．１×１０^５個細胞／ｍｌ、より好ましくは１×１０^５個細胞／ｍｌである。播種密度の上限としては、例えば２０×１０^５個細胞／ｍｌ、より好ましくは１０×１０^５個細胞／ｍｌである。播種密度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。

浮遊培養の際の培養液量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ^２）を使用する場合は０．５ｍｌ／ウェル以上、１．５ｍｌ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍｌ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ^２）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、好ましくは２ｍＬ／ウェル以上、より好ましくは３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、好ましくは５ｍＬ／ウェル以下、より好ましくは４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、好ましくは１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上、好ましくは１０５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１０ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、好ましくは２６０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２７０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２８０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３２０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、より好ましくは５５０ｍＬ／容器以上、より好ましくは６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１３００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１４００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１７００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは２００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは３００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは４００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは６００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは７００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは８００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは９００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１９００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１８００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１７００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１６００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１５００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１４００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１３００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１２００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは６Ｌ／バッグ以上、より好ましくは７Ｌ／バッグ以上、より好ましくは８Ｌ／バッグ以上、より好ましくは９Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１６Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１４Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１３Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１２Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。

使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ^２、好ましくは０．６５ｃｍ^２、より好ましくは０．６５ｃｍ^２、さらに好ましくは１．９ｃｍ^２、もっと好ましくは３．０ｃｍ^２、３．５ｃｍ^２、９．０ｃｍ^２、又は９．６ｃｍ^２の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ^２、好ましくは５００ｃｍ^２、より好ましくは３００ｃｍ^２、より好ましくは１５０ｃｍ^２、より好ましくは７５ｃｍ^２、もっと好ましくは５５ｃｍ^２、さらに好ましくは２５ｃｍ^２、さらにより好ましくは２１ｃｍ^２、さらにもっと好ましくは９．６ｃｍ^２、又は３．５ｃｍ^２の培養容器を用いることができる。

前記脂質の存在下での細胞の浮遊培養の温度、時間、ＣＯ_２濃度等の条件は特に限定されない。培養温度は好ましくは２０℃以上、より好ましくは３５℃以上、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、最も好ましくは３７℃である。培養時間は好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１２時間以上、好ましくは７日間以下、より好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下、最も好ましくは２４時間以下である。培養時のＣＯ_２濃度としては、好ましくは４％以上、より好ましくは４．５％以上、好ましくは１０％以下、より好ましくは５．５％以下、最も好ましくは５％である。浮遊培養は継代を伴ってもよい。培養条件がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。

浮遊培養に用いる細胞は、予め常法により維持培養しておくことができる。維持培養は、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、細胞を培地中で浮遊させながら培養する浮遊培養であってもよい。維持培養しておいた細胞は、既述の剥離剤で培養基材から剥離又は細胞同士を剥離させ、十分に分散させてから浮遊培養に用いる。細胞を分散させるためにストレーナーを通過させて単細胞にまで分散させることができる。

前記脂質存在下での浮遊培養により形成された細胞凝集塊を更に培養することができる。細胞凝集塊の更なる培養方法としては、前記リン酸化酵素阻害剤を含まない液体培地中に細胞凝集塊を懸濁し培養する方法が挙げられる。この更なる培養に用いる液体培地としては、前記リン酸化酵素阻害剤を含まない以外は上記と同様の液体培地を用いることができ、培養の条件としては上記と同様の条件を用いることができる。この更なる培養では、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は細胞種により異なるが、好ましくは５日に一回以上、より好ましくは４日に一回以上、さらに好ましくは３日に一回以上、もっと好ましくは２日に一回以上、最も好ましくは１日に一回以上の頻度で培地交換作業を含むことができる。この頻度の培地交換は、本発明に使用したような多能性幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換の方法は特に限定されないが、好ましくは細胞凝集塊を含む培養液を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、その後、新鮮な液体培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度プレート等の培養容器に細胞凝集塊分散液体培地を戻すことで細胞凝集塊を継続して培養することができる。更なる培養の培養期間は特に限定されないが３日〜７日が好ましい。

本発明における「前記リゾリン脂質を添加して前記液体培地を調製する工程」とは、前記液体培地に前記リゾリン脂質を前記濃度又は前記比率になるように添加することである。前記リゾリン脂質を前記液体培地に添加した後に前記の単離された細胞を混ぜても良いし、前記の単離された細胞を前記液体培地に混合してから前記リゾリン脂質を添加しても良いが、好ましくは前記リゾリン脂質を前記液体培地に添加した後に前記の単離された細胞を混ぜることが好ましい。前記リゾリン脂質を前記液体培地に添加する際、安定化剤を添加することもできる。前記安定化剤は、前記リゾリン脂質の液体培地中での安定化、活性維持、培養容器等への吸着防止等に寄与する物質であれば特に限定されないが、アルブミン等のタンパク質、乳化剤、界面活性剤、両親媒性物質又はヘパリン等の多糖類等を使用することができる。「前記リゾリン脂質を添加して前記液体培地を調製する工程」は前記リゾリン脂質を添加した前記液体培地（前記安定化剤を含んでいても良い）を凍結する工程、及び解凍する工程を含んでいても良い。

以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらは単なる例示であって、本発明を何ら限定するものではない。

下記実施例における細胞凝集塊の作製手順の概要を図１に模式的に示す。ヒトｉＰＳ細胞を接着培養し、回収して単離細胞とした後、液体培地中で浮遊懸濁培養を行い、次いで凝集塊培養を行った。以下の説明では、浮遊懸濁培養を開始した初日を「０日目（Ｄａｙ０）」とし、翌日以降をそれぞれ「１日目（Ｄａｙ１）」、「２日目（Ｄａｙ２）」、「３日目（Ｄａｙ３）」、「４日目（Ｄａｙ４）」、「５日目（Ｄａｙ５）」とした。浮遊懸濁培養は２日目まで行い、続いて、凝集塊培養を３日間（すなわち浮遊懸濁培養開始から５日目まで）行った。
＜実施例１．ヒトｉＰＳ細胞の維持培養＞
ヒトｉＰＳ細胞は、ＴｋＤＮ４−Ｍ株（非特許文献１）を使用した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）又はＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）をコートした細胞培養用ディッシュ上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、培地はｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を使用して維持培養した。継代時の細胞剥離剤としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養した場合は、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ上で培養した場合は０．０２％ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液又はＡｃｃｕｔａｓｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いた。また、細胞播種時のみ、Ｙ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を１０μＭの濃度になるように培地に添加した。培地交換は毎日実施した。実験には継代数５０回までのヒトｉＰＳ細胞を使用した。
＜実施例２．ヒトｉＰＳ細胞の凝集塊形成＞
ヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ又はＥＤＴＡ溶液で３〜５分間処理して剥離し、単細胞まで分散した後、４０ μｍ孔径セルストレーナー（ベクトンディッキンソン社）を通過させた。この細胞を最終濃度１０ μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。１ｍｌあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製したのち、異なる複数の濃度でＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭＳｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を添加した。この細胞懸濁液を低接着１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に１ｍｌ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（オプティマ社）上で９０ ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で２日目まで浮遊懸濁培養を行った。培養を開始して２日目に顕微鏡にて画像を取得した。

続いて、培地を、前記ＫＳＲ（脂質）及びＹ−２７６３２を含まないＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地に交換し、引き続き同じ条件で３日間（前記浮遊懸濁培養開始から５日間）旋回培養を行った。その間、毎日培地交換を行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置させて細胞凝集塊を沈降させた。その後、上清を除去し、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を再懸濁させ、低接着１２ウェルプレートに再播種した。

培養開始から５日目（凝集塊培養３日目）に細胞凝集塊の顕微鏡写真を撮影し、凝集塊の大きさを画像解析ソフト（例えばｉｍａｇｅ Ｊ）により解析し、凝集塊の直径を測定した。培養後、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に凝集塊を懸濁し、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で１０分処理し、マイクロピペットを用いて凝集塊を単細胞に分散させ、トリパンブルー染色により細胞数を調べた。

上記の顕微鏡観察の結果、ＫＳＲ未添加の条件では大きな凝集塊ができてしまうが、ＫＳＲの添加により、およそ７０〜２６０μｍの直径を有する多数の凝集塊が形成されることが確認された（図２）。ＫＳＲの添加濃度が高いほど凝集塊の大きさは小さくなり、ＫＳＲに含まれる成分のいずれかにより、細胞の凝集抑制効果があることが明らかになった。また、形成された凝集塊について、各ＫＳＲ濃度におけるグルコース消費量と５日目の細胞数を調べた結果（図３及び図４、どちらもｎ＝４）、ＫＳＲ濃度が１〜１０％（ｖ／ｖ）（脂質の含有量に換算すると、０．００３２５〜０．０３２５ｍｇ／ｍｌ）の時に、細胞が顕著に増殖していることから、１００μｍ〜２６０μｍの直径を有する細胞凝集塊を形成させることで、効率的な細胞培養が可能であることが確認された。一方、過度に細胞の凝集を抑制すると細胞増殖も抑制されることが明らかとなった。
＜実施例３．ＫＳＲに含まれる凝集抑制作用を持つ成分＞
ＫＳＲの構成成分として図５に示したような成分が報告されている（非特許文献２）。

これらの構成成分のうち、凝集抑制効果を示す可能性があると考えられたタンパク質性の各構成成分（ＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭ、ＢＳＡ、インスリン、トランスフェリン）について、添加によるヒトｉＰＳ細胞の凝集抑制作用があるのか調べた。

具体的には次の操作を行った：異なる複数の濃度の脂質リッチなアルブミンであるＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、一般的なウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ社）、インスリン（Ｓｉｇｍａ社）又はトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社）を、実施例２におけるＫＳＲに替えて添加した点を除いて、実施例２と同じ手順によりヒトｉＰＳ細胞の旋回培養（各因子の存在下での浮遊懸濁培養を２日間、続いて培地交換後に浮遊懸濁培養を３日間）を行った。ＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ添加条件及びＢＳＡ添加条件では培養を開始して２日目に、インスリン添加条件及びトランスフェリン添加条件では培養を開始して１日目に、それぞれ顕微鏡にて画像を取得した。実施例３で添加する各因子の濃度は、液体培地１００ｍｌあたりの重量（単位ｇ）を示す％（ｗ／ｖ）により表す。

その結果、脂質を含まないインスリン及びトランスフェリンでは大きな凝集塊の形成が生じたこと、ＢＳＡを０．２％（ｗ／ｖ）で添加したときよりも、脂質含量の多いＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩを０．２％（ｗ／ｖ）で添加したとき（脂質の含有量に換算すると、０．０１３ｍｇ／ｍｌ）の方が、凝集が顕著に抑制されたことが確認された。このことからＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩに含まれる脂質、つまり、アルブミンと結合能を有する脂質により凝集が抑制されることが明らかになった（図６）。
＜実施例４．凝集塊を形成したヒトｉＰＳ細胞の未分化性＞
実施例３において、ＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩを０．２％（ｗ／ｖ）含有する条件で形成したヒトｉＰＳ細胞由来の凝集塊をＡｃｃｕｔａｓｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）により分散し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。その後、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより−２０℃で一晩透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳによりブロッキングし、蛍光標識済抗ＯＣＴ４抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５３７０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）により４℃で１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ベクトンディッキンソン社）にて解析した。その結果、通常の接着培養時のヒトｉＰＳ細胞と同様に凝集塊のヒトｉＰＳ細胞においても９６％以上の細胞が未分化マーカーであるＯＣＴ４を発現しており、形成された凝集塊ヒトｉＰＳ細胞は未分化性が維持されていることが確認された（図７）。
＜実施例５．リン脂質による細胞凝集抑制効果＞
リン脂質を用いて、細胞凝集塊の形成への影響について解析した。
（手順）
実施例１の手順で培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ又はＥＤＴＡ溶液又はＡｃｃｕｔａｓｅで３〜５分間処理して剥離し、単細胞まで分散した後、４０ μｍ孔径セルストレーナー（ベクトンディッキンソン社）を通過させ、単細胞となるように単分散させた。この細胞を最終濃度１０ μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。１ｍｌあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。この細胞懸濁液に、脂質フリーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ｆｆ；ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅアルブミン、和光純薬）を最終濃度５ｍｇ／ｍＬ及びＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を最終濃度１０μＭとなるように添加し、さらに下記の脂質を添加し、実施例２と同じ条件下で１日間旋回培養して、ヒトｉＰＳ細胞の浮遊懸濁培養を行った。この１日の浮遊懸濁培養後、顕微鏡にて細胞を観察した。

本試験で用いる脂質又は添加剤は以下の通り：
・ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）（１−Ｏ−９Ｚ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｙｌ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ， ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６２２１５、Ｃａｙｍａｎ社、ｓｎ−１にオレイル基を有する）
・Ｓ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）（２Ｓ−ａｍｉｎｏ−１−（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−４Ｅ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ−１，３Ｒ−ｄｉｏｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６２５７０、Ｃａｙｍａｎ社）
ＬＰＡは０．２μｇ／ｍＬ、Ｓ１Ｐは０．２μｇ／ｍＬとなるように上記ヒトｉＰＳ細胞懸濁液に添加した。

コントロール試験として、上記脂質を添加しない以外は上記と同様に調製した細胞懸濁液を用いた条件での試験を行った。
（結果）
上記浮遊懸濁培養後の顕微鏡観察像を図８に示す。観察の結果、コントロール試験では大きな凝集塊（直径が１ｍｍ以上）が形成されたが、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）又はＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）を０．２μｇ／ｍＬ含有する細胞懸濁液ではおよそ１００μｍの径の多数の略均一な大きさの球状の細胞凝集塊が形成されることが確認された。
＜実施例６．ＬＰＡ及びＳ１Ｐの添加濃度と凝集塊の大きさ＞
実施例５において細胞凝集抑制能が認められたＬＰＡ及びＳ１Ｐについて異なる添加濃度で含む細胞懸濁液を用いて浮遊懸濁培養を行った。
（ＬＰＡ濃度）
ヒトｉＰＳ細胞懸濁液は実施例５と同様の手順で作製し、ＬＰＡの添加濃度は、前記ナトリウム塩として、０．００１２８μｇ／ｍＬ、０．００６４μｇ／ｍＬ、０．０３２μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとし、各々に最終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるようにＢＳＡ−ｆｆを、さらに最終濃度１０μＭとなるようにＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を添加した。実施例５と同様の条件において１日懸濁培養し、顕微鏡を用いて観察した。

観察結果を図９に示す。ＬＰＡ濃度に応じて細胞凝集塊の大きさは変化した。０．１６〜１００μｇ／ｍＬのＬＰＡ濃度のときに略均一な大きさの細胞凝集塊が形成された。０．０３２μｇ／ｍＬ以下のＬＰＡ濃度では直径１ｍｍ以上の大きな細胞凝集塊が形成された。

ＬＰＡ濃度が０．１６〜１００μｇ／ｍＬの観察像中の３０個の細胞凝集塊を観察し、顕微鏡写真のスケールと比較して各細胞凝集塊の最も広い部分の幅（「φ」とする）を求め、平均値±標準偏差を算出した。

ＬＰＡ濃度０．１６μｇ／ｍＬのときφ＝１２４．９±２６．５μｍ、０．８μｇ／ｍＬのときφ＝６８．２±９．８μｍ、４μｇ／ｍＬのときφ＝５７．２±８．７μｍ、２０μｇ／ｍＬのときφ＝３９．９±８．０μｍ、１００μｇ／ｍＬのときφ＝４１．６±９．９μｍであった。
（Ｓ１Ｐ濃度）
ヒトｉＰＳ細胞懸濁液は実施例５と同様の手順で作製し、Ｓ１Ｐの添加濃度は、前記フリー体として、０．００１２８μｇ／ｍＬ、０．００６４μｇ／ｍＬ、０．０３２μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとし、各々に最終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるようにＢＳＡ−ｆｆを、さらに最終濃度１０μＭとなるようにＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を添加した。実施例５と同様の条件において１日懸濁培養し、顕微鏡を用いて観察した。

観察結果を図１０に示す。Ｓ１Ｐ濃度に応じて細胞凝集塊の大きさは変化した。０．０３２〜１００μｇ／ｍＬのＳ１Ｐ濃度のときに略均一な大きさの細胞凝集塊が形成された。０．００６４μｇ／ｍＬ以下のＳ１Ｐ濃度では直径１ｍｍ以上の大きな細胞凝集塊が形成された。

Ｓ１Ｐ濃度が０．０３２〜１００μｇ／ｍＬの観察像中の３０個の細胞凝集塊を観察し、顕微鏡写真のスケールと比較して各細胞凝集塊の最も広い部分の幅（「φ」とする）を求め、平均値±標準偏差を算出した。

Ｓ１Ｐ濃度０．１６μｇ／ｍＬのときφ＝１４２．４±１６．４μｍ、０．８μｇ／ｍＬのときφ＝１１８．５±２１．８μｍ、４μｇ／ｍＬのときφ＝１０９．９±２３．１μｍ、２０μｇ／ｍＬのときφ＝９４．０±１９．４μｍ、１００μｇ／ｍＬのときφ＝８９．０±１９．５μｍであった。
＜実施例７．ＬＰＡ又はＳ１Ｐ存在条件での細胞増殖能、未分化能への影響＞
異なる濃度でＬＰＡ又はＳ１Ｐを含む培養存在条件でヒトｉＰＳ細胞の浮遊懸濁培養を行いグルコース消費量、細胞収量、未分化マーカーの陽性率を測定し、これらの添加物が細胞へ与える影響を解析した。
（方法）
ヒトｉＰＳ細胞懸濁液は実施例５と同様の手順で作製し、最終濃度として０．２μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬのＬＰＡ又はＳ１Ｐと、最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆ及び最終濃度１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を添加した。コントロールとして、実施例５と同様の手順で作製し、最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆ及び最終濃度１０μＭのＹ−２７６３２のみを添加した細胞懸濁液も調製した。

上記細胞懸濁液を実施例５と同様の培養条件で２日間浮遊懸濁培養した。培養２日後、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆを添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地で毎日培地交換した。培養２日目、３日目、４日目、５日目における培養上清中のグルコース濃度を測定し、グルコース消費量を計算した。また、培養５日目に細胞凝集塊を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅにより分散し、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆを添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地で懸濁した。この細胞懸濁液の一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。上記細胞懸濁液を３００ｇで５分間遠心分離後、上清を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した。その後、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより−２０℃で一晩透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳによりブロッキングし、蛍光標識済抗ＳＯＸ２抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５６１１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗ＯＣＴ４抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５３７０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）により４℃で１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅにて解析した。

グルコース消費量の測定は次の手順で行った。すなわち、培地交換時に培養上清を採取し，ＹＳＩ社製バイオアナライザー（ＹＳＩ２９５０）で残存グルコース量を測定し、グルコース消費量を計算した。
培養５日目に細胞収量を測定した。細胞収量の測定は次の手順で行った。すなわち、形成した細胞凝集塊をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで５〜１０分処理し，ブルーチップでのピペッティングによって細胞を単分散させ，トリパンブルー染色した後，血球計算盤を用いて細胞数を係数し，細胞収量を測定した。
（結果）
図１１の写真は培養開始後２日目に観察した顕微鏡写真である。ＬＰＡ及びＳ１Ｐを添加した試験では適度な大きさ（直径５００μｍ以下）の細胞凝集塊が形成されたのに対して、ＢＳＡ−ｆｆのみ添加した試験では大きな細胞凝集塊（直径１ｍｍ以上）が形成された。

グルコース消費量の測定結果を図１２に、培養５日目の細胞収量を図１３にそれぞれ示す。ＬＰＡ又はＳ１Ｐを添加した場合は、ＢＳＡ−ｆｆのみ添加した場合と比較して、グルコース消費量及び細胞数が多く、細胞が顕著に増殖していることが明らかになった。

未分化マーカーの陽性率の測定結果を図１４に示す。１μｇ／ｍＬのＬＰＡ又はＳ１Ｐを含む細胞懸濁液中で浮遊懸濁培養した場合、単層接着培養したときと同様に９５％以上の細胞が未分化マーカーであるＯＣＴ４及びＳＯＸ２を発現しており、脂質の添加によって形成されたヒトｉＰＳ細胞の凝集塊は未分化性を維持していることが確認された。
＜実施例８．継代および培養スケールアップ検討＞
ヒトｉＰＳ細胞懸濁液を実施例５と同様の手順で調製し、最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ及び最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆ及び最終濃度１０μＭのＹ−２７６３２を添加し、培地量が１ウェルあたり４ｍＬ、細胞密度が１ｍｌあたり２×１０^５個となるように６ウェルプレート（住友ベークライト社）に播種して、ロータリーシェーカー（オプティマ社）上で９０ｒｐｍの旋回速度、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で２日間培養して凝集塊を形成させた。その後、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ及び最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地で４日間毎日培地交換を行った。細胞を播種して６日後に下記の方法で継代操作を行った。細胞凝集塊を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて３７℃で１０分間処理し、細胞を分散した後、最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ培地を添加した。３００ｇで３分間遠心分離し、上清を除去後、上記と同様にヒトｉＰＳ細胞懸濁液（最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ及び最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆ及び最終濃度１０μＭのＹ−２７６３２を添加）を調製し、培地量が容器あたり３００ｍＬ、細胞密度が１ｍｌあたり２×１０^５個となるように１Ｌ三角フラスコ（コーニング社、製品番号４３１１４７）に播種して、上記６ウェルプレートと同様に培養した。播種して５日後、上記と同様にヒトｉＰＳ細胞懸濁液（最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＡｌｂｕＭＡＸ^ＴＭＩＩ及び最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−ｆｆ及び最終濃度１０μＭのＹ−２７６３２を添加）を調製し、培地量が容器あたり１．６Ｌ、細胞密度が１ｍｌあたり２×１０^５個となるように３Ｌ三角フラスコ（コーニング社、製品番号４３１２５２）に播種し継代して、旋回速度を７０ｒｐｍとして、上記と同様の方法で培養操作を行った。各容量（４ｍＬスケール、３００ｍＬスケール、１．６Ｌスケール）の培養において、播種１日後と５日後又は６日後における細胞凝集塊の顕微鏡写真を撮影し、また、培養最終日には実施例２と同様の方法で細胞数を調べ、実施例７と同様の方法で未分化マーカーの陽性率を解析した。コントロールとして実施例１の方法で接着培養した細胞を用いた。

上記の顕微鏡観察の結果、培養スケールに関係なく、同様に略均一な大きさの細胞凝集塊を形成させることができ、未分化性を維持したまま増殖させることが可能であることが確認された（図１５、１６、１７）。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

1. 精製された形態のリゾリン脂質を含む液体培地中で浮遊させながら多能性幹細胞を培養する工程を含み、前記リゾリン脂質が極性頭部基としてリン酸基を有するリゾリン脂質である、細胞凝集塊の作製方法。
2. 前記液体培地が、前記リゾリン脂質を０．００６４μｇ／ｍＬより大きく、１００μｇ／ｍＬ以下で含有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記リゾリン脂質を添加して前記液体培地を調製する工程及び前記リゾリン脂質を酵素反応により生成させて前記液体培地を調製する工程のうち少なくとも一方を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記多能性幹細胞が、接着又は浮遊させながら培養した後に単離された多能性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸の少なくともいずれかである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記液体培地が、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より少なくとも１つを含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記液体培地が、増殖因子を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記増殖因子が、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の少なくともいずれかである、請求項７に記載の方法。
9. 前記液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、請求項９に記載の方法。
11. リゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸の少なくともいずれかのリゾリン脂質を含む液体培地中で浮遊させながら多能性幹細胞を培養する工程を含む、細胞凝集塊の作製方法。
12. 極性頭部基としてリン酸基を有するリゾリン脂質を含む、多能性幹細胞凝集抑制剤。
13. 前記リゾリン脂質を０．００６４μｇ／ｍＬより大きく、１００μｇ／ｍＬ以下で含有する、請求項１２に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
14. さらに、増殖因子を含有する、請求項１２又は１３に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
15. 前記増殖因子が、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の少なくともいずれかである、請求項１４に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
16. さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
17. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、請求項１６に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。
18. 前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸の少なくともいずれかである請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の多能性幹細胞凝集抑制剤。

Images