CN101563449A

CN101563449A - 干细胞培养基及干细胞培养方法

Info

Publication number: CN101563449A
Application number: CNA2007800351699A
Authority: CN
Inventors: 笹井芳树; 渡边毅一
Original assignee: Rike Corp
Current assignee: Rike Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-24
Publication date: 2009-10-21
Also published as: ZA200901914B

Abstract

本发明公开了一种干细胞培养基及培养方法，将干细胞如胚胎干细胞(ES细胞)包括人ES细胞培养在含ROCK抑制剂的培养基中，并且还公开了一种包括ROCK抑制剂的干细胞培养基，该培养基可以含或者不含血清。

Description

干细胞培养基及干细胞培养方法

技术领域

本发明提供了一种培养干细胞如胚胎干细胞(ES细胞)的方法、培养所述干细胞用的培养基及其应用。

背景技术

ES细胞为细胞移植治疗中枢神经疾病如帕金森病和糖尿病提供了高效的候选细胞源。

在ES细胞研究中，目前常用的是小鼠ES细胞，但考虑到临床应用，有必要进行人类ES细胞的研究与发展。然而，人类ES细胞在细胞培养中比小鼠ES细胞更容易死亡。

比如，在人ES细胞继代(subculture)培养的维持培养中，用酶处理法或用移液管抽吸小细胞团进行的机械分离法将细胞团从饲养细胞或培养基中分离后立刻悬浮培养，然后接种到新的培养基中。然而与一般细胞株和小鼠ES细胞相比，人ES细胞在分离、解离时表现拙劣，许多细胞没能存活。由于人ES细胞***缓慢、容易分化，培养并保持其未分化特征就需要许多时间和人力，获得可重复的结果就需要专门技术训练。并且，人ES细胞的研究与发展的一个障碍是由继代培养中细胞死亡造成的细胞采集率低。并且，基因工程需要克隆人ES细胞，而当人ES细胞均匀的解离为单细胞时，细胞易死亡、停止生长，导致人ES细胞克隆效率低至1％或更低。

此外，为了实现人ES细胞的分化，我们将其与饲养细胞(feeder cells)分离，将其解离为小细胞团或单细胞，然后将其铺展在培养基或特定的饲养细胞上，在诱导分化的培养基中培养。此过程效率很低。进一步的，在一种胚胎培养法中，首先需要将细胞解离成单细胞以形成细胞团，但造成人ES细胞大量死亡，此法为此发明人(WO 2005/123902和Watanabe等人，Nature Neuroscience8，288-296(2005))发明的SFEB法(SFEB：Serum-free Floating culture ofEmbryoid Bodies-like aggregates(不含血清的胚状体漂浮培养))。而且，哪怕人ES细胞不用完全解离(dissociate)成单细胞(比如从小的细胞团培养)，依然存在的问题是它们仍会大量死亡(Frisch等人，Curr.Opin.Cell Biol.13，555-562(2001))。因此需要发展更好的人ES细胞培养方法。

Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil kinase)(ROCK：基因库登陆号：NM_005406)是Rho GTP酶的主要效应分子之一，已知它控制某些生理现象如血管收缩和神经轴突延伸(Riento等人，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.4，446-456(2003))。已知有几个化合物可作为ROCK抑制剂(如Ishizaki等人，Mol.Pharmacol.57，976-983(2000)和Narumiya等人，Methods Enzymol.325，273-284(2000))。虽然有些报道称ROCK抑制可以控制细胞死亡(Minambres，J.Cell Sci.119，271-282(2006)和Kobayashi等人，J.Neurosci.24，3480-3488(2004))，但也有报道称ROCK抑制加速细胞凋亡(Rattan等人，J.Neurosci Res.83，243-255(2006)和Svoboda等人，Dev Dyn.229，579-590(2004))，Rho/ROCK在控制细胞凋亡中作用仍不清楚(Riento等人，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.4，446-456(2003))。

据称CoCl₂可以诱导间质(mesenchymal)干细胞分化为神经细胞(PacaryE.等人，J.Cell Science 119(13)pp 2667-2678)，ROCK抑制可以提高此效果。然而没有关于用含ROCK抑制剂的培养基培养干细胞如ES细胞的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种培养干细胞如ES细胞的新方法及其有效的新培养基。

本发明人进行了广泛的研究，结果发现，用含ROCK抑制剂的培养基培养干细胞如多功能干细胞(pluripotent stem cell)，尤其是ES细胞，可以提高它们的存活率、增殖能力和/或分化效率。

因此本发明提供了：

(1).一种培养干细胞的方法，其包括在培养基中用ROCK抑制剂处理干细胞的步骤。

(2).如(1)中所述的方法，其中所述的干细胞是胚胎干细胞。

(3).如(1)或(2)中所述的方法，其中所述的干细胞是灵长目动物干细胞。

(4).如(3)中所述的方法，其中所述的干细胞是人干细胞。

(5).如(1)至(4)中任一款所述的方法，其中所述的干细胞是被解离过的。

(6).如(5)中所述的方法，其中所述的解离过的干细胞是单个细胞或聚集的干细胞(即聚成细胞团的细胞)。

(7).如(1)至(6)中任一款所述的方法，其包括解离干细胞的步骤和用ROCK抑制剂处理干细胞的步骤。

(8).如(7)中所述的方法，其中在干细胞解离之前用ROCK抑制剂处理干细胞。

(9).如(7)或(8)中所述的方法，其中在干细胞解离之后用ROCK抑制剂处理干细胞。

(10).如(1)至(9)中任一款所述的方法，其中所述的ROCK抑制剂是Y-27632，法舒地尔(Fasudil)或H-1152。

(11).如(1)至(10)中所述的方法，其中所述的细胞是贴壁(adherent)培养或悬浮(suspension)培养。

(12).如(1)至(11)任一款所述的方法，其中所述的培养是传代(passage)培养或诱导(inducing)分化的培养。

(13).如(1)至(12)任一款所述的方法，用于(a)纯化或克隆干细胞、(b)转基因干细胞系的生产或者(c)用悬浮培养法生产神经细胞。

(14).如(13)中所述的方法，其中所述的神经细胞是前脑神经细胞(forebrainneural cell)。

(15).一种从提高了存活率和/或增殖能力或提高了分化效率的干细胞中生产分化细胞的方法，所述的方法包括在ROCK抑制剂条件下培养干细胞。

(16).一种用ROCK抑制剂处理干细胞的方法。

(17).一种包含干细胞和ROCK抑制剂的细胞配制品。

(18).如(17)中所述的细胞配制品备，其中所述的干细胞是解离过的。

(19).一种细胞培养基，所述的培养基包含ROCK抑制剂。

(20).一种不含血清的培养基，所述的培养基包含ROCK抑制剂；和

(21).一种培养***，所述的***包含培养基中的干细胞和ROCK抑制剂。

由此，上述的实施例包含了一种培养干细胞的方法，所述的方法包括将干细胞维持在含有ROCK抑制剂的培养基中的步骤，以及一种含有ROCK抑制剂的干细胞培养基。

另一方面，本发明提供了一种为提高克隆效率或传代效率的干细胞培养方法，包括将干细胞培养在含有ROCK抑制剂的培养基中；一种在干细胞培养中促进克隆形成的方法，包括在ROCK抑制剂条件下培养干细胞；以及一种在干细胞培养中提高克隆效率或传代效率的方法，包括在ROCK抑制剂条件下培养干细胞。

在本发明的优选实施例中，干细胞在不含饲养细胞、饲养细胞提取物和/或血清的条件下培养。干细胞在亚克隆或传代之前可在ROCK抑制剂条件下培养，如在亚克隆或传代前至少培养一个小时。作为可选方案或方案的补充，干细胞在亚克隆或传代之后维持在ROCK抑制剂中。在优选实施例中，干细胞维持在ROCK抑制剂中至少约12小时，更优选最少约2、4或6天。在其他实施例中，干细胞维持在ROCK抑制剂中至少1至5代。

在本发明某些实施例中，ROCK抑制剂随后从培养基中收回，例如约12小时或者约2、4或6天后。其他实施例中ROCK抑制剂在1至5代之后收回。

另一方面，本发明提供了一种在培养基中提高干细胞存活力的方法，所述的方法包括将干细胞接触或暴露在ROCK抑制剂之中的步骤。此方法尤其适于提高那些悬浮培养的解离干细胞或干细胞团的细胞存活力。此方法特别在细胞密度较低时有效，包括所述的可效仿(exemplary)细胞密度，或干细胞处于克隆密度。优选地，干细胞维持在ROCK抑制剂中至少约12小时，更优选地最少约2、4或6天，或者1至5代。可选地，ROCK抑制剂随后从培养基中收回，例如约12小时后，约2、4或6天后，或者至少1至5代后。本发明还提供了一种转移干细胞的方法，所述的方法包括用包含ROCK抑制剂的培养基转移干细胞的步骤。

根据本发明，干细胞优选为多功能细胞(pluripotent stem cell)，例如胚胎干细胞，包括此处描述的任一种干细胞。干细胞可以是成体多功能干细胞，可以是鼠科干细胞、啮齿目动物干细胞或灵长目动物干细胞，包括人干细胞。

最好可以用此处描述的任一种适宜的ROCK抑制剂实施本发明提供的方法。优选的ROCK抑制剂为Y-27632、法舒地尔(Fasudil)和H-1152。

另一方面，本发明提供了一种培养ES细胞的方法，所述的方法包括如下步骤：

-维持培养中的ES细胞于多功能状态，可选的于饲养细胞条件下；

-传代ES细胞至少一次；

-从培养基中收回血清或血清提取物(如果用的话)，收回饲养细胞(如果用的话)以使培养基不含饲养细胞、血清和血清提取物；和

-而后在ROCK抑制剂条件下维持ES细胞于多功能状态。

优选地，在收回血清、血清提取物和/或饲养细胞之前在ROCK抑制剂条件下培养ES细胞。

本发明的方法可在任何条件下方便地使用，只要其中的干细胞已被分离或低密度培养。应用本发明，干细胞可维持在未分化状态、死亡率下降。因此，这些方法可用来提高从组织中获取干细胞的效率。本发明的方法还可以配合合适的技术从胚泡中获取多功能细胞(如ES细胞包括小鼠和人ES细胞)。例如，取一个胚泡，任选地将其在ROCK抑制剂条件下培养，而后可以解离内细胞团，从内细胞团中分离到一个或多个细胞并在ROCK抑制剂条件下培养。

本发明的方法还可以在干细胞基因修饰中发挥作用，尤其在分离基因修饰干细胞的克隆群体方面。由此，本发明提供了一种获得ES细胞转染群的方法，所述的方法包括如下步骤：

-用编码筛选标记的构建体转染ES细胞；

-将转染的细胞铺板；

-在ROCK抑制剂的条件下培养ES细胞；和

-筛选出表达筛选标记的细胞。

可在筛选出表达筛选标记的细胞之前和/或之后添加ROCK抑制剂于培养基中。优选在筛选过程中加入ROCK抑制剂，尤其是筛选标记对培养基中某一特别的筛选剂表现出拮抗作用(如抗生素抗性)以抵消干细胞低密度作用。任选地，本方法进一步包括在ROCK抑制剂条件下亚克隆表达筛选标记的ES细胞，进而促进干细胞生长和/或克隆形成和/或提高干细胞存活力。

本发明还提供了在生产干细胞培养基中ROCK抑制剂的应用。例如培养基可以是所述的任一种培养基，或者可以包含所述的一个或多个培养基组分组合。培养基可以根据适合培养此处所述任一种干细胞类型(包括人和小鼠干细胞如ES细胞)的需要构成。

在相关方面，本发明提供了不含血清和血清提取物的细胞培养基，包括：基础培养基；ROCK抑制剂；并任意一种或多种胰岛素、胰岛素生长因子和铁转运酶(iron transporter)。适宜的基础培养基和铁转运酶(如铁传递蛋白)对技术人员来说容易获得，包括此处所述的可仿效培养基和铁转运酶。

本发明还涉及利用ROCK抑制剂使干细胞产生所述的作用。特别是，本发明提供了用ROCK抑制剂促进和/或提高干细胞培养的克隆效率或传代效率方面的应用；用ROCK抑制剂促进和/或提高干细胞培养中的克隆形成的应用；用ROCK抑制剂促进和/或提高培养中干细胞存活力的应用。

最好所述本发明方法的优点同样适用于本发明所述ROCK抑制剂的应用、培养基及其他化合物。

本发明所述的培养方法可以提高干细胞的存活率、增殖能力或分化效率，尤其是ES细胞如人ES细胞。特别是，本发明的培养方法在，例如，任何一种包含干细胞解离、解离干细胞或类似细胞的贴壁或悬浮培养的培养方法中都有优势。由于本发明的方法有这些优点，它可以优选地用于干细胞的传代培养、干细胞的诱导分化(例如，分化为神经细胞或神经元(neural or nerve cell))、干细胞增殖或克隆、干细胞基因修饰等方面。

本发明相关的细胞配制品、培养试剂、组合物(例如化合物及试剂盒)、不含血清的培养基、培养***等均可被优选地用于本发明的培养方法。

本发明提供了一种包括用ROCK抑制剂处理干细胞步骤的干细胞培养方法、提供了由此法得到的干细胞和从中得到的分化细胞。进一步的，本发明提供了一种用ROCK抑制剂处理干细胞的方法。

术语干细胞包括多功能细胞(pluripotent)、未分化细胞、胚胎干细胞(ES细胞)和成体干细胞。所述的ES细胞包括培养着床前早期胚胎得到的ES细胞、培养用体细胞核进行核移植获得的早期胚胎得到的ES细胞、用基因技术进行基因修饰的ES细胞。这些干细胞可由已知的任何一种方法获得(参考Wilmut等人，Nature，385，810(1997)；Cibelli等人，Science，280，1256(1998)；Baguisi等人，Nature Biotechnology，17，456(1999)；Wakayama等人，Nature，394，369(1998)；Wakayama等人，Nature Genetics，22，127(1999)；Wakayama等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，14984(1999)；Rideout等人，Nature Genetics，24，109(2000)；Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993)；公开号为01/088100的国际申请)。并且，胚胎干细胞可从特定的器官中得到或者从商业途径得到。例如，人ES细胞如KhES-1，KhES-2和KhES-3可从日本京都大学前沿医学科学院(Institutefor Frontier Medical Sciences，Kyoto University)获得。术语成体干细胞包括任何一种能分化成稍后所述的分化细胞的干细胞。神经干细胞、造血干细胞、间质干细胞是成体干细胞的优选实例。

干细胞可从恒温动物如哺乳动物(比如灵长类，啮齿类)中获得。具体来说，哺乳动物包括人类、猴子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、马和山羊。优选从灵长类如人类中获取干细胞。

根据本发明用ROCK抑制剂处理的干细胞可以是解离的细胞或没有解离的细胞。解离的细胞指被处理以促进细胞离散的细胞(如稍后所述的解离)。解离的细胞包括单个细胞和由几个细胞(一般约2到50个、2到20个或2到10个)聚集成的小细胞团(聚集块(aggregate))。解离的细胞可以是悬浮(漂浮)或贴壁的细胞。例如，已知ES细胞如人ES细胞对特别的条件敏感，如解离(和/或解离后悬浮培养)。本发明的方法在干细胞处于那些迄今仍发生细胞死亡的条件下时有特殊的应用。

为实施本发明，ROCK抑制剂一般没有限制，只要这种抑制剂能抑制Rho激活酶(ROCK)的作用，合适的抑制剂包括Y-27632(例如，参考Ishizaki等人，Mol.Pharmacol.57，976-983(2000)；Narumiya等人，Methods Enzymol.325，273-284(2000))、法舒地尔(也称为HA1077)(例如，参考Uenata等人，Nature389：990-994(1997))、H-1152(例如，参考Sasaki等人，Pharmacol.Ther.93：225-232(2002))、Wf-536(例如，参考Nakajima等人，Cancer ChemotherPharmacol.52(4)：319-324(2003))、Y-30141(如美国专利5478838所述)及其衍生物，ROCK的反义核酸(antisense nucleic acid)、RNA干扰剂包括核酸(例如siRNA)、竞争性肽、拮抗性肽、抑制性抗体、抗体-单链可变区片段(antibody-ScFV fragments)、显性负性变体(dominant negative variants)及其表达载体。并且，已知其他小分子化合物可作为ROCK抑制剂，这些化合物或他们的衍生物也可以在本发明中应用(例如，参考美国专利申请20050209261、20050192304、20040014755、20040002508、20040002507、20030125344和20030087919，以及公开号为2003/062227、2003/059913、2003/062225、2002/076976和2004/039796的国际申请)。本发明中也可用一种或多种ROCK抑制剂的组合。

根据本发明，干细胞可在培养基中用ROCK抑制剂处理。因而，本发明方法所用的培养基可已经含有ROCK抑制剂或作为选择，本发明的方法可以包括在培养基中加入ROCK抑制剂的步骤。培养基中ROCK抑制剂的浓度没有特别的限制，只要能达到预期效果如提高干细胞存活率。例如，当用Y-27632作为ROCK抑制剂时，其浓度优选约0.01～1000μM，更优选约0.1～100μM，进一步优选约1.0～30μM，最优选约2.0～20μM。当用法舒地尔/HA1077用作ROCK抑制剂时，其浓度大约为前述Y-27632浓度的两倍。用H-1152做抑制剂时，其浓度约为前述Y-27632浓度的1/50。

用ROCK抑制剂处理细胞的时间没有特别限制，只要在这个时间段内能达到预期效果如提高了干细胞存活率。例如，如果干细胞为人胚胎干细胞，解离前处理时间优选约30分钟至几个小时(如约1小时)。解离后人胚胎干细胞可用ROCK抑制剂处理，例如，约12小时或更久以达到预期效果。

用ROCK抑制剂处理时，干细胞的密度没有特别限制，只要在此密度之下可以达到预期的效果如提高了干细胞的存活率。优选每毫升约1.0×10¹至1.0×10⁷个细胞，更优选每毫升约1.0×10²至1.0×10⁷个细胞，进一步优选每毫升约1.0×10³至1.0×10⁷个细胞，最优选约每毫升3.0×10⁴至1.0×10⁶个细胞。

本发明的方法可进一步包括解离干细胞的步骤。干细胞解离可以用任何已知的方法实施。这些方法包括用螯合试剂处理(如EDTA)，酶处理(胰蛋白酶(trypsin)，胶原酶(collagenase))及其类似物，以及用手术法如机械解离(比如用移液管)。干细胞可以在解离之前和/或之后用ROCK抑制剂处理。例如，干细胞可仅在解离后处理。用ROCK抑制剂处理干细胞的步骤如上所述。

本发明的培养条件可随培养基和所用的干细胞而恰当地确定。本发明还提供了所述方法用的培养基。

本发明的培养基可用适用于培养动物细胞的基础培养基制备。做为基础培养基，BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、改良MEM Zinc Option、IMDM、Medium 199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI 1640及费希尔培养基(Fischer’s media)中任一种以及它们的任意组合都可以使用，但所用的培养基并不局限于此，只要它可以用来培养动物细胞。

本发明的培养基可以是含血清或不含血清的培养基。不含血清的培养基指培养基中没有未处理过或未纯化的血清，因此其中可以包括纯化的源自血液的成分或源自动物组织的成分(如生长因子)。为防止异源的取自动物成分的污染，血清可以从获取干细胞的同一动物上获得。

本发明的培养基可以含有或不含血清替代品。血清代用品可包括含有白蛋白(albumin)(如富含油脂的白蛋白，白蛋白替代品如重组白蛋白，植物淀粉，右旋糖酐和水解蛋白)、转铁蛋白(或其他铁转运酶)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前提、微量元素、2-巯基乙醇、3-巯基甘油(3’thiolglycerol)及其等价物。血清替代品比如可以用国际出版号98/30679公开的方法制备。或者各种商业途径可得的材料也可方便的使用。商业途径可得的材料包括血清替代品(KSR)，成分确定的脂类浓缩物(lipid concentrated)(Gibco公司)和Glutamax(Gibco公司)。

本发明的培养基还可以包含脂肪酸或脂类、氨基酸(如非必须氨基酸)、维生素(一种或多种)、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲液和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以是，例如，约0.05～1.0mM，优选约0.1～0.5mM，但其浓度不限于此，只要它适于培养干细胞。

培养干细胞用的培养容器包括但不限于烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿、陪替氏培养皿、组织培养用培养皿、多层培养皿、微板、微孔培养板、多层培养板、多孔培养板、载物片、室玻片(chamber slide)、培养钵(schale)、试管、淋盘(tray)、培养袋和转瓶(roller bottle)，只要能在其中培养干细胞。

培养容器可以是细胞粘附性或非细胞粘附性，可根据目的选择。细胞粘附性培养容器可以涂有细胞粘附用的基底如细胞外基质(ECM)以提高容器表面对细胞的粘附力。细胞粘附用的基质可以是用以吸附干细胞或饲养细胞(如果用的话)的任何材料，包括胶原蛋白、凝胶、多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine)、多聚右旋赖氨酸、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及其混合物，比如基质胶和溶解细胞膜的制备(Klimanskaya I等人2005.Lancet 365：p1636-1641)。

其他培养条件可以适宜地确定。例如，培养温度可以在约30～40℃，优选37℃，但不限于此。CO₂浓度可约为1％至10％，优选2％至5％。氧分压为1％至10％。

本发明的方法可以用于如干细胞的贴壁(adhesion)培养。在此情况下，细胞可以在饲养细胞条件下培养。当本发明的方法使用饲养细胞时，基质细胞如胚状成纤维细胞可当做饲养细胞(例如，参见Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford UniversityPress(1993)；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，7634(1981)；Evans等人，Nature，292，154(1981)；Jainchill等人，J.Virol.，4，549(1969)；Nakano等人，Science，272，722(1996)；Kodama等人，J.Cell.Physiol.，112，89(1982)；以及公开号为01/088100与2005/080554的国际申请)。

本发明的方法还可以用于干细胞的悬浮培养，包括于载体上悬浮培养(Fernandes AM等人J Biotechnology 2007)或明胶/生物聚合物包裹培养(美国专利20070116680)。术语干细胞的悬浮培养指的是干细胞的培养条件如培养容器或饲养细胞(如果用的话)是非粘附性的。干细胞的悬浮培养包括干细胞的解离培养和干细胞团(aggregate)悬浮培养。术语干细胞的解离培养指的是培养悬浮的干细胞，干细胞的解离培养包括单个干细胞或由许多干细胞(例如约2至20个细胞)构成的小细胞团的培养。前面所述的解离培养继续进行，解离培养的细胞会形成一个大的干细胞团，而后细胞团悬浮培养就可以进行了。细胞团悬浮培养包括胚状体培养法(embryoid culture method)(参见Keller等人，Curr.Opin.Cell Biol.7，862-869(1995))，和SFEB法(Watanabe等人，Nature Neuroscience 8，288-296(2005)；公开号为2005/123902的国际申请)。本发明的方法可以明显提高悬浮培养干细胞的存活率和/或分化效率。

本发明的方法可以作为干细胞亚克隆方法。因此，本发明的方法可以包括干细胞的收集/铺板步骤。依照本发明的方法可以提高其存活率、增强增殖能力。例如，传统做法中解离的人ES细胞存活率较低且不能充分生长，而采用本发明的方法可以获得人解离ES细胞更高的存活率和提高的增殖能力。因此，本发明的方法不仅能方便一直以来难以实现的大批量人ES细胞培养，而且可以使单细胞(或小细胞团)在培养基中充分解离；并且，本发明方法可以促进利用干细胞的药物开发与安全性测试(例如高通量筛选)。此外，本发明方法为基因修饰的干细胞(嵌入细胞和/或同源重组(homologously-recombined)细胞)提供了简便的筛选/亚克隆方法，为药学应用的干细胞系提供了更安全和更均一性的筛选方法。本发明方法还有如下优势：用本方法处理后保持了干细胞的未分化特征，不损害它们的分化能力。

本发明方法可在诱导干细胞分化时使用。由此，本发明方法可涉及诱导干细胞分化的步骤。可采用任何已知的方法诱导干细胞分化。可通过干细胞分化产生的细胞实例包括内胚层细胞(Sox17或AFP标记阳性细胞等)，中胚层细胞(Brachyury，Flk1，Mox标记阳性细胞等)和外胚层细胞。外胚层细胞的实例包括神经细胞(NCAM、TuJ1、络氨酸羟化酶(TH)、血清素(serotonin)、巢蛋白、MAP2、MAP2ab、NeuN、GABA、谷氨酸脂、ChAT或Sox1标记阳性细胞等)、表皮细胞(细胞角蛋白标记阳性细胞等)、感觉细胞(RPE或视紫质标记阳性细胞等)、色素细胞(TRP-1标记阳性细胞等)和源自神经嵴(neuralcrest)的***(SMA标记阳性细胞等)。SFEB法(参见Nature Neuroscience8，288-296，2005；公开号为2005/123902的国际申请)可用以优选地由干细胞诱导神经***细胞，例如神经细胞(比如大脑神经细胞)及其前体。此时可用的因子有：Nodal抑制剂(Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、可溶性Nodal受体、Nodal抗体；Nodal受体抑制剂等)；Wnt抑制剂(Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受体蛋白、可溶性Wnt受体、Wnt抗原、酪蛋白激酶抑制剂、显性负Wnt蛋白等)；和BMP抑制剂(抗BMP抗体、可溶性BMP受体、BMP受体抑制剂等)。依照本发明的方法，干细胞(如人ES细胞)可以高效的分化为特异细胞。本发明的方法还有的优势是，可以优选地在其他方法中使用(如SDIA法、AMED法、用PA6的方法)，使得干细胞分化为神经细胞(前脑神经细胞(forebrain neural cells)和/或后脑细胞(cerebral dorsal cells)(皮层区域)和脑腹侧(基底神经节区域)细胞)。

本发明提供了一种细胞配制品(cell preparation)，可用本发明的方法和/或上述解离处理方法实现。本发明的细胞配制品优选地包括干细胞和ROCK抑制剂。本发明的细胞配制品可以包含解离细胞的步骤，例如由许多单细胞组成的小细胞团。传统的，经过解离处理的人ES细胞存活率极低，但此细胞配制品可以提高细胞存活率或分化效率，所述细胞为干细胞如ES细胞，优选人干细胞或神经干细胞，更优选人干细胞。本发明的细胞配制品可用于，例如保存(如冷冻保存)和/或转运干细胞或亚克隆干细胞。用于干细胞的冷冻保存时，本发明的细胞配制品还可以进一步包括上文所述的血清及其替代品，或一种有机溶剂(例如二甲基亚砜)。此时，其中的血清或其替代品的浓度可以是，但不局限于，约1～50％(v/v)，优选约5～20％(v/v)；有机溶剂的浓度可以是，但不局限于，约0～50％(v/v)，优选约5～20％(v/v)。这些实施例中的组分可以包括血清或不包括血清，可以分别包含饲养细胞。

本发明提供了一种包含ROCK抑制剂的干细胞培养剂。一般情况下，培养剂是干细胞的培养基质。本发明的培养剂可优选在本发明的培养方法中使用。

本发明还提供了一种包括ROCK抑制剂和其他组分的组合物。例如，本发明的组合物可用于培养干细胞(如传代培养、诱导分化培养)。

例如，本发明的组合物可以是一种复合物。本发明的复合物可以是ROCK抑制剂和其他组分的混合物。可被本发明复合物包含的其他组分包括，比如干细胞分化调节剂如干细胞分化抑制剂(例如血清、GFG、LIF、BMP、Wnt、细胞外基质、TGF-β、饲养细胞)干细胞分化诱导剂(例如BMP抑制剂、Wnt抑制剂、Nodal抑制剂、视黄酸、血清、细胞外基质、如***的饲养细胞)以及培养添加剂(例如KSR、2-巯基乙醇、氨基酸、脂肪酸和上文所述因子)。

本发明的组合物也可以是一个试剂盒(kit)。本发明的试剂盒可以包括ROCK抑制剂及单独加入的其他组分(如以非混合式加入)。例如本发明的试剂盒可以以每个容器中单独含有一种组分的形式出现。可被本发明的试剂盒包含的其他组分包括，例如：可被本发明的复合物包含的上文所述的其他组分；一种用于干细胞或分化细胞鉴别或测量(识别或量化)材料(例如细胞标记的抗体)；一种细胞培养基；用细胞外基质处理过的培养容器；基因重组用的质粒及其筛选剂。

本发明还提供了一种培养***，其培养基中含有干细胞和ROCK抑制剂。本发明的培养***可以在本发明培养基中包含干细胞。本发明的培养***还可以在培养基中含有细胞培养因子，而不是上文详述的与本发明的方法相关的组分，如饲养细胞、支持基质和ROCK抑制剂。

所有出版物的内容，包括本说明书参考的专利说明书和专利申请说明书，依各种需要作为本说明书的一个部分以说明各种问题。

附图说明

本发明的详细实例如下文所述，但本发明并不限于下述实例。实施例的附图说明如下：

图1(图1.a至图1.n)、ROCK抑制剂Y-27632明显提高了人ES细胞(KhEs-1)的克隆效率而没有影响其多功能性。(a-c)解离人ES细胞于小鼠胚胎成纤维细胞中，在有(b)或没有(a)10μM Y-27632条件下低密度培养7天。几乎所有的克隆为ALP阳性，比例尺为500μm。(c)ALP阳性克隆与最初接种的人ES细胞比值(**，P＜0.01与对照组，n＝3)。(d-f)对Y-27632处理过人ES细胞用(d)抗上皮钙粘蛋白抗体(anti-E-cadherin)、(e)抗Oct3/4抗体、(f)抗SSEA-4抗体免疫染色。底板为DAPI核染色，100μm。Y-27632处理没有大幅改变人ES细胞肌动蛋白束的形成(未显示)。(g)分化中人ES细胞的早期中胚层标记Brachyury和Meox1的RT-PCR分析，其中RT(-)、G3PDH的PCR扩增没有经过逆转录。(h)分化中ES细胞的早期内胚层标记Sox17的RT-PCR分析。(i-k)于涂有胶原蛋白I和IV的8孔室玻片上进行的分化中人ES细胞中胚层和内胚层标记的免疫染色。(i)几个分化中细胞的中胚层标记Brachyury的表达(红色)。用DAPI比例尺为10μm进行核染色(蓝色)。(j)平滑肌肌动蛋白的免疫染色(SMA，红色)，此肌动蛋白是由源自Y-27632处理过的人ES细胞的细胞在OP9细胞上培养12天后获得的。核染色剂为DAPI(蓝色)。比例尺为5μm。(k)源自人ES细胞的上皮细胞层在第六天的Hnf3β和上皮钙粘蛋白(E-cadherin)免疫染色，比例尺为5μm。(l-n)人ES细胞形成的畸胎瘤(100％，n＝20)，在Y-27632条件下低密度保存(30代)，比例尺为1cm。将细胞注入患重症联合免疫缺陷病(SCID)的小鼠睾丸内(l)。9周后，畸胎瘤包含完全分化的组织混合物，包括肉眼可见的软骨组织(白色箭头所指，m，n)色素上皮(黑色箭头所指，n)。

图2(图2.a至图2.n)、Y-27632直接提高了人ES细胞的克隆效率(KhES-1)。(a，b)人ES细胞在涂有基质胶的培养盘上于小鼠胚胎成纤维细胞条件下进行不含饲养细胞的培养。比例尺500μm。源于解离的人ES细胞克隆形成明显被Y-27632增强(b；插图，典型克隆的放大视图；比例尺，100μm)，而无Y-27632处理时仅有少量克隆形成(a；有或没有Y-27632时形成率分别为10.2±1.2％和＜0.2％；P＜0.001，n＝3)。(c，d)单个人ES细胞在如下条件下培养：在小鼠胚胎成纤维细胞上，于96孔培养板的单孔中，用10μM Y-27632处理7天。(c)ALP阳性克隆出现率，(d)单孔中状况(**，P＜0.01和对照组，n＝3)，对照组为未处理细胞，比例尺100μm。(e，f)以Y-27632处理过的人ES细胞转染12天后在小鼠胚胎成纤维细胞上低密度解离培养获得的抗潮霉素(hygromycin-resistant)克隆，比例尺100μm。(e)相差视图(Phase-contrast)。(f)Venus-GFP表达。(g)用小鼠胚胎成纤维细胞培养的人ES细胞以Y-27632处理不同时间的生长曲线。第一组(蓝色)，只在最初12小时内用Y-27632处理(预处理1小时)；第二组(红色)在整个培养阶段持续用Y-27632处理；无Y-27632组，完全没有用Y-27632处理(紫色)。在每组中，把5x104解离细胞/孔(6孔培养板)铺展于小鼠成纤维细胞上。**，P＜0.01，第二组与第一组(n＝3)。(h)在第一组(蓝色)和第二组(红色)第3和第5天人ES细胞Nanog阳性中Ki67阳性(有丝***)细胞出现比例。(i-n)细胞周期中特定时期种群数(phase-specific populations)流式细胞分析。(i，j，l，m)流式细胞分析模式。X轴，7-AAD结合所示DNA含量；Y轴，暴露1小时后Brdu摄取量。(k，n)第一组(蓝色)和第二组(红色)中人ES细胞特定时期种群数相对百分比。(i-k)第3天。(l-n)第5天.*，P＜0.05；**，P＜0.01，第二组和第一组(n＝3)。结果细胞生长的增长程度不大，不能解释克隆效率的强劲增长(1％和27％)。

图3(图3.a至图3.n)、ROCK抑制剂对解离悬浮培养的人ES细胞(KhES-1)的预防细胞凋亡、提高生存能力作用。(a-c)TUNEL分析。解离人ES细胞在有(b)或没有(a)10μM Y-27632条件下悬浮培养2天。用FACS法分析TUNEL阳性细胞。(c)Y-27632、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂(Z-VAD-fmk)、神经营养因子混合物(neurotrophin cocktail)(BDNF+NT-3和-4)对细胞凋亡率的影响(**，P＜0.01；***，P＜0.001，每组间；n＝3)。(d-f)Y-27432对悬浮培养的人ES细胞存活/生长的支持作用。(d)2x105个解离人ES细胞在35-mm培养板上培养2、4、6天后的细胞数目(n＝3)。第6天，在Y-27632处理过的ES细胞观察到高效率的细胞团形成，但在对照组没有发现，比例尺300μm。以SFEB(不含血清的胚状体漂浮培养)法培养的人ES细胞Pax6(绿色)、Oct3/4(红色)和上皮钙粘蛋白(蓝色)表达的时间段分析。(h)培养方案的图解。(i)用SFEB培养基诱导的源于人ES细胞的神经细胞的免疫染色。Bf1(红色)，TuJ1(绿色)，DAPI(蓝色)，比例尺50μm。注意到一些Bf1阳性细胞对神经细胞标记TuJ1呈阳性。(j-n)SFEB诱导的神经细胞的免疫染色分析，比例尺25μm。(j)对Pax6和Nkx2.1呈阳性的Bf1阳性端脑(telencephalic)细胞比例(**，P＜0.01和对照组；n＝3)。SFEB诱导的神经细胞在有(m，n)或没有(k，l)Shh(30nM)条件下培养的免疫细胞化学分析。Bf1(绿色；k-n)，Pax6(红色；k，m)和Nkx2.1(红色；l，n)。

图4(图4.a至图4.1)、在Y-27632条件下低密度培养的人ES细胞分析。(a-c)用Y-27632处理、低密度培养的扩展传代(extended passaging)后(30次)的人ES细胞(KhES-1)，被Y-27632处理后用上皮粘钙蛋白(a)Oct3/4(b)SSEA-4(c)免疫染色。图中靠下的图版显示用DAPI染色(蓝色)。(d-g)畸胎瘤组织的组织学分析(苏木精-曙红(eosin)染色，5μM石蜡切片)，畸胎瘤由下列方法得到：人ES细胞(KhES-1)在Y-27632条件下扩展传代后，囊下注射入患严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的睾丸内。(d)软骨结构，(e)神经上皮，(f)色素上皮，和(g)有柱形上皮细胞的肠状粘膜。(h，i)扩展传代后用Y-27632处理、低密度培养的解离人ES细胞依然可以在Y-27632条件下高效地形成克隆(32.5±1.7％；KhES-1)，(i)而没有Y-27632的极少看到克隆形成(h)。(j)两个选择性ROCK抑制剂(Y-27632，法舒地尔；在有或没有10μM法舒地尔时克隆效率为25.1±1.6％和1.3±0.8％；P＜0.001，n＝3)和两个非相关的激酶抑制剂(cAMP-Rp，LY294002)对克隆形成的量-效关系(KhES-1)。Y轴表示其对克隆形成的促进作用与10μM Y-27632的作用的比值。(k)Y-27632对人ES细胞在不同的铺板密度克隆形成的促进作用，***，P＜0.001和对照组(未处理组)，n＝5。(l)人ES细胞(KhES-3)G显带法(G-banding)分析(300-500带)，用Y-27632处理维持性扩展传代三个月后细胞仍显示正常的染色体组型(100％，n＝5)。

图5(图5.a至图5.c)、人ES细胞(KhES-1)在悬浮培养中朝神经方向的分化，包含在Y-27632条件下解离/重聚集(reaggregation)的步骤。(a)Nodal抑制剂(5μg/ml Lefty，方法2)，Wnt抑制剂(500ng/ml Dkk1，方法3)和BMP抑制剂(1.5μg/ml BMPR1A-Fc，方法4)在人ES细胞分化成Pax6阳性神经细胞前体过程中的作用。方法5，三个因子的混合剂(*，P＜0.05；**，P＜0.01和对照组；n＝3)。(b，c)在Y-27632(0-6天)和三种抑制剂(0-24天；SFEB)条件下培养的SFEB人ES细胞团(第24天)的免疫染色。(b)染色剂为Pax6(绿色)和上皮钙粘蛋白(红色)。(c)染色剂为Nestin(绿色)和Oct3/4(红色)。

具体实施方式

实施例一、用ROCK抑制剂Y-27632提高人胚胎干细胞克隆效率

试验方法

此处所述实验用人胚胎干细胞指的是从人胚泡中得到的胚胎干细胞(KhES-1、KhES-2和KhES-3)，由位于日本京都大学前沿医学科学院(Institutefor Frontier Medical Sciences，Kyoto University)的Norio Nakatsuji实验室制备，其分配及使用(主要是KhES-1)符合日本政府的人胚胎干细胞准则。依照Nakatsuji实验室的方法(Suemori等人，Biochem Biophys Res Commun.345，926-32(2006))，于塑料培养皿中、在小鼠胚胎成纤维细胞(用丝裂霉素抑制的)组成的饲养细胞层的条件下培养未分化的人胚胎干细胞。更具体的，所用的培养基含有KSR(Invitrogen/Gibco-BRL公司)且最终浓度为20％，1X NEAA(非必须氨基酸，Invitrogen/Gibco BRL公司)，2mM L-谷氨酸和0.1mM D-MEMF12(σ-D6421)溶解的2-巯基乙醇，培养条件为37℃，5％CO₂。每三或四天进行传代，用解离液(含胚胎干细胞0.25％胰蛋白酶，1mg/ml胶原酶IV溶液，1mM磷酸盐缓冲液溶解的CaCl₂；均购自Invitrogen/Gibco-BRL公司)将胚胎干细胞从饲养层中分离出来，而后用吸液管解离为小的细胞团(由约50-100细胞组成)，接种到前一天用饲养小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层上。

在解离成单细胞后人胚胎干细胞的培养过程中，我们对ROCK抑制剂对其抑制细胞死亡的作用、对克隆效率的影响作了如下考察。依上文所述方法培养的人胚胎干细胞以小细胞团的状态从饲养层分离出来。采用的方法是将其放入维持培养基中37℃温育一小时，这样胚胎干细胞团不会与培养板紧密粘附而污染饲养细胞会粘附较紧，进一步的，将污染饲养细胞(contaminating feedercells)粘附于粘附性细胞培养板(涂有0.1％明胶)以方便移除。胚胎干细胞团用胰蛋白酶消化反应(trypsin digestion)(0.25％胰蛋白酶-EDTA，37℃、5分钟)解离成单细胞，接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，在96孔培养板上保持低密度(0.15ml培养基500细胞/0.32cm²)。在维持培养基中培养6天后数清形成克隆的数目。在把细胞从饲养层分离前一小时加入10μM的ROCK抑制剂Y-27632，分离后在培养基中也加入相同剂量。

同样的，为了测试人胚胎干细胞的自分泌因子是否会促进克隆，类似的人胚胎干细胞实验可在96孔培养板上以克隆密度进行，以测定克隆效率。

实现结果

培养6天后，有或没有ROCK抑制剂的克隆效率(形成克隆的数目与最初接种的人胚胎干细胞数目的比值)分别为27％和1％。用ROCK抑制剂处理过的克隆细胞表达未分化细胞胚胎干细胞的标记碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)和Oct3/4。ROCK抑制剂对克隆效率良好的效果不仅在KhES-1也在KhES-2和KhES-3胚胎干细胞中得到了确认。

并且，人胚胎干细胞在克隆密度下用96孔培养板培养，加或不加ROCK抑制剂时克隆效率分别低于25％和1％。因此，可以认为ROCK抑制剂对克隆效率的良好效果不是由于人胚胎干细胞的自分泌因子。

由此，确认ROCK抑制剂Y-27632可明显提高人胚胎干细胞存活率。

实施例二、解离的人胚胎干细胞中Rho的激活

试验方法

人胚胎干细胞的维持培养用的是实施例一所述的小细胞团的传代细胞。

如实施例一所述，人胚胎干细胞用胰蛋白酶消化反应解离为单细胞，悬浮于培养基中维持培养，在37℃下温养。分别在温育0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟用离心处理法获取细胞，随后按使用说明用GTP酶激活试剂盒(Cytoskeleton公司，科罗拉多州丹佛)处理，用下拉法(Pull down method)分析。Rho的激活是用蛋白质印迹(Western blotting)法，根据激活的Rho(GTP相关的Rho)与总Rho的比值的升高而判断。细胞样本是以10cm培养板(约1x10⁶个细胞)为一批制备的。

试验结果

人胚胎干细胞解离/温育15-30分钟后就可以看到明显的Rho激活；Rho激活30分钟后开始缓慢下降。

由此，结果显示Y-27632对人胚胎干细胞的良好效果是由于ROCK抑制剂Y-27632对Rho活化的抑制作用。

实施例三、维持培养中的人胚胎干细胞在不同的激酶抑制剂下的克隆形成效率试验方法

通过实施例一所述的方法评价其它ROCK抑制剂对维持培养中人胚胎干细胞的作用。所用的ROCK抑制剂有法舒地尔/HA1077(10μM)和H-1152(200nM)。也用其它激酶的抑制剂做为参考。使用的其它激酶的抑制剂是：cAMP-Rp(1-100μM)和KT5720(5-500nM)，二者为蛋白激酶A抑制剂；双吲哚马来酰亚胺(bisindolylmaleimide)(0.01-5μM)和星孢菌素(staurosporine)(1-50nM)，二者为蛋白激酶C抑制剂；PD98059(0.5-50μM)，是一种MAPK抑制剂；LY294002(1-50μM)，是一种PI3K抑制剂；和ML-7(0.3-30μM)，是一种MLCK抑制剂。

试验结果

与没有使用抑制剂的相比，使用ROCK抑制剂(法舒地尔/HA1077和H-1152)时克隆效率明显增强，但使用其它激酶抑制剂的没有观察到提高。

由此，发现ROCK抑制剂可以特异性地提高人胚胎干细胞存活率。

实施例四、ROCK抑制剂对悬浮培养的解离/重聚集人ES细胞的抑制细胞凋亡作用

试验方法

维持培养的人ES细胞以小细胞团的形式从饲养细胞中用实施例一所述的方法分离出来，移除残留饲养细胞后，将其用胰蛋白酶消化反应解离为单细胞。离心处理后，在无血清培养基中解离得到2×10⁵个细胞，用以而后诱导分化(Watanabe等人，Nature Neuroscience 8，288-296，2005；添加G-MEM，KSR和2-巯基乙醇后，以20％的浓度加入KSR)。单细胞解离(singly-dissociated)的人ES细胞(1.0×10⁵cells/ml)在无细胞粘附剂的35mm培养板上悬浮培养以形成细胞团，并在其中培养2-6天(SFEB法；参见上文Watanabe等人的参考资料。)培养2天后，采用TUNEL法(MEBSTAIN Apoptosis kit Direct，MBL)计算凋亡细胞的百分比。在细胞分离前一个小时以实施例一所述的方法用ROCK抑制剂(Y-27632)处理，解离后也在维持培养基中添加此抑制剂。作为对比，实验中使用了半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂(ZVAD；10μM)和BDNF/NT-3/NT-4(每种50ng/ml的混合物)，它们抑制细胞凋亡的作用已有报道。且在第6天清点各组的存活细胞数目。

试验结果

在没有补充剂的对照组中，培养2天后，采用TUNEL法观察到80％细胞出现凋亡。而用ROCK抑制剂处理的细胞仅出现9％的TUNEL阳性。另一方面，添加的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(ZVAD；10μM)和BDNF/NT-3/NT-4(每种50ng/ml)分别导致72％和69％的TUNEL阳性。这些结果表示了ROCK抑制剂对细胞死亡强烈的抑制作用。因此，从第6天存活细胞数上讲，无补充剂组在解离培养初有8％存活，而用ROCK抑制剂处理组有70％存活，后者存活细胞较多。用半胱氨酸蛋白酶抑制剂或BDNF/NT-3/NT-4处理后，铺展细胞中存活的小于10％。

如上所述，实验表明ROCK抑制剂明显提高了人ES细胞的存活率。

实施例五、用SFEB法诱导单细胞解离的人ES细胞分化为神经元(neuronal)前体细胞和脑前体细胞

试验方法

维持培养的人ES细胞以小细胞团的形式从饲养细胞中用实施例四所述的方法分离出来，移除残留饲养细胞后，将其用胰蛋白酶消化反应解离为单细胞。离心处理后，在培养基中解离得到2×10⁵个细胞/mL用以诱导分化，将其在无细胞粘附剂的培养板上悬浮培养以实行悬浮细胞团的无血清培养(SFEB法)。并且，诱导分化培养开始后的前10天添加Nodal抑制剂LeftyA(1μg/ml，R&D)，Wnt抑制剂Dkk1(500ng/ml，R&D)和BMP抑制剂BMPR1A-Fc(1.5μg/ml，R&D)。无血清悬浮培养16-35天后，固定细胞团，用荧光抗体法进行免疫染色。在用实施例一所述方法分离细胞前1个小时用ROCK抑制剂(Y-27632)处理，解离后也在前6天添加此抑制剂于维持培养基中。

至于向脑前体细胞的分化，在SFEB培养的第25天，将漂浮细胞团转移至涂有聚-D赖氨酸/层粘连蛋白(laminin)/纤维连接蛋白(fibronectin)的培养片上，在粘附状态下培养10天。在贴壁培养中，使用的培养基是添加了B27(不含维生素A)和2mM L-谷氨酸盐(均由Gibco-BRL公司提供)的神经基质(Neurobasal)培养基。

试验结果

分化培养开始后第20天，在几乎所有用ROCK抑制剂处理过的细胞团上均有对神经前体标记(巢蛋白和Pax6)呈阳性的细胞。分化培养第24天，这些阳性细胞数目增加，约80％的细胞转为Pax6阳性细胞。另一方面Oct3/4(未分化的ES细胞标记)阳性细胞的比例少于10％。分化培养第35天，约60％细胞团中出现大量Bf1(脑细胞前体标记)阳性细胞。这表示人ES细胞产生了大脑神经组织。未用ROCK抑制剂处理组，在分化培养第7天几乎没有细胞存活。

没有用ROCK抑制剂处理的，极少有细胞存活7天或更久，也没有观察到明显的漂浮细胞团的形成。

据此，实验发现ROCK抑制剂没有损害人ES细胞的分化能力，用ROCK抑制剂处理的人细胞可以有效分化。

实施例六、添加ROCK抑制剂的无饲养细胞培养法培养单细胞解离的人ES细胞

试验方法

为了验证ROCK抑制剂处理是否支持在无饲养细胞培养即不含饲养细胞如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的条件下人ES细胞的单细胞解离培养，我们将人ES细胞培养在根据已知方法(Xu C-H等人，Nature Biotechnol.，19，971-974(2001))用MEF制备的细胞外基质中。特别是，根据上述文献，为细胞融合而培养的MEF细胞在培养皿上用脱氧法溶解留下细胞外基质。将解离为单细胞的人ES细胞(96孔培养板，500个细胞/孔)用Y-2763处理(10μM或0μM)，接种于细胞外基质上，所用的方法和在MEF细胞上常规培养(上文所述的实施例)中的一样。所用的培养基为人ES细胞维持培养基和MEF预先在其中培养一天的条件培养基。5天后清点人ES细胞克隆形成数目。

试验结果

在Y-27632处理组发现源自接种的人ES细胞克隆效率较高(10.2％)。而未用Y-27632处理组克隆效率低于0.2％。Y-27632处理组的克隆对碱性磷酸酶(未分化状态标记)呈明显的阳性。这些发现表明ROCK抑制剂直接促进克隆形成的是人ES细胞，而不是饲养细胞。此外，即使不用饲养细胞联合培养，实验证实在充分制备的细胞外基质和液态因子(如在条件培养基中的因子)条件下培养时，ROCK抑制剂可以支持人ES细胞的单细胞解离培养。

实施例七、ROCK抑制剂短时间处理的单细胞解离的人ES细胞的维持培养试验方法

在单细胞解离的人ES细胞的维持培养方面，为了测试Y-27632是否在解离培养初期改善细胞存活力，我们把Y-27632处理时间分为以下三组，以比较各维持培养中细胞存活力的改善效果。

第一组：在人ES细胞的解离培养过程中，Y-27632处理时限包括预处理1小时和解离后的前12小时。

第二组：在人ES细胞的解离培养过程中，Y-27632处理时限包括预处理1小时和解离后的整个培养过程。

第三组：不用Y-27632处理。

第3天在MEF饲养层的维持培养***中清点源自接种细胞(6孔培养板，每孔5×10⁴个细胞)的存活细胞数目。

试验结果

在未用Y-27632处理的第三组，第3天仅有1％的细胞存活。在解离后用Y-27632处理12小时的第一组，存活细胞为接种细胞的270％；在不断用Y-27632处理的第二组，存活细胞为接种细胞的290％。这些结果表明对于在贴壁培养环境中维持培养的人ES细胞，Y-27632处理在解离培养开始后的前半天发挥高效的促进作用。

实施例八、ROCK抑制剂处理对维持培养中的人ES细胞的生长促进作用试验方法

在与上述实施例七相同的实验中，用延长培养时间到6天的方法测定第一组、第二组中Y-27632在解离培养开始后6天内对细胞生长的作用。

试验结果

第6天，在第一组、第二组中细胞数量分别增加到最初接种细胞的670％和860％。种群数量增加一倍的时间(基于解离培养后2至6天的细胞数目)第一组为49.0小时，第二组为41.5小时；第二组时间缩短了一半。在第一、二两组中，细胞凋亡的比例(半胱氨酸蛋白酶3阳性细胞比例)在第3天和第5天少于总细胞数的1％。这些结果表明，Y-27632除了在解离培养刚开始后的细胞存活力促进作用，之后对存活细胞也有促进生长的作用。

由此，干细胞可以在ROCK抑制剂条件下培养，本发明为其提供了培养方法和培养基。

Claims

1、一种培养干细胞的方法，特征在于其包括用ROCK抑制剂(Rho-激酶)来处理干细胞的步骤。

2、根据权利要求1所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的干细胞是胚胎干细胞。

3、根据权利要求2所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的干细胞为灵长目动物的干细胞。

4、根据权利要求3所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的干细胞是人干细胞。

5、根据权利要求1至4中任一项所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的干细胞是解离的。

6、根据权利要求5所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的解离的干细胞是单个干细胞或聚集的干细胞。

7、根据权利要求1所述的培养干细胞的方法，其特征在于其包括解离干细胞和用ROCK抑制剂处理干细胞的步骤。

8、根据权利要求7所述的培养干细胞的方法，其特征在于在解离干细胞之前用ROCK抑制剂处理干细胞。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于解离干细胞之后再用ROCK抑制剂处理干细胞。

10、根据权利要求1至9中任一项所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的ROCK抑制剂为Y-27632、法舒地尔或H-1152。

11、根据权利要求1至9中任一项所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的干细胞采用贴壁培养或悬浮培养。

12、根据权利要求1至9中任一项所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的培养是传代培养或诱导分化培养。

13、根据权利要求1至9中任一项所述的培养干细胞的方法，特征在于其应用于：(a)纯化或克隆干细胞、(b)基因修饰干细胞系的生产、或(c)用悬浮培养生产神经细胞方面。

14、根据权利要求13所述的培养干细胞的方法，其特征在于所述的神经细胞是前脑神经细胞。

15、一种从干细胞生产分化细胞的方法，所述的干细胞具有提高了的存活率和/或增殖能力或者分化能力，特征在于该方法包括在ROCK抑制剂中培养干细胞的步骤。

16.一种加工干细胞的方法，特征在于其包括用ROCK抑制剂处理干细胞的步骤。

17、一种细胞配制品，特征在于其包含有干细胞和ROCK抑制剂。

18、根据权利要求17所述的细胞配制品，其特征在于所述的干细胞是解离的。

19、一种干细胞培养基，特征在于其包含ROCK抑制剂。

20、根据权利要求19所述的干细胞培养基，其特征在于包括基本培养基和ROCK抑制剂。

21、根据权利要求19或20所述的干细胞培养基，其特征在于该培养基不含血清。

22、一种提高克隆效率或传代效率的培养干细胞的方法，特征在于该方法包括在含有ROCK抑制剂的培养基中培养干细胞的步骤。

23、一种在干细胞培养中促进细胞形成的方法，特征在于该方法包括在ROCK抑制剂存在的条件下培养干细胞的步骤。

24、一种在干细胞培养中提高克隆效率或传代效率的方法，特征在于该方法包括在ROCK抑制剂条件下培养干细胞的步骤。

25、根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其特征在于干细胞的培养是在无饲养细胞、饲养细胞提取物和/或血清的条件下进行的。

26、根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其特征在于干细胞在亚克隆或传代之前在ROCK抑制剂条件下培养。

27、根据权利要求26所述的方法，其特征在于干细胞在亚克隆或传代之前在ROCK抑制剂中培养至少1小时。

28、根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其特征在于干细胞在亚克隆或传代之后维持在ROCK抑制剂中。

29、根据权利要求28所述的方法，其特征在于干细胞维持在ROCK抑制剂中至少12小时。

30、根据权利要求29所述的方法，其特征在于干细胞维持在ROCK抑制剂中至少约2天、4天或6天。

31、根据权利要求28所述的方法，其特征在于干细胞维持在ROCK抑制剂中至少1至5代。

32、根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂随后从培养基中收回。

33、根据权利要求32所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂在约12小时后收回。

34、根据权利要求32所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂在约2、4或6天后收回。

35、根据权利要求32所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂在至少1至5代后收回。

36.一种提高培养中干细胞存活力的方法，特征在于包括有使干细胞接触ROCK抑制剂的步骤。

37、根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述培养过程包括解离干细胞或干细胞团的悬浮培养。

38、根据权利要求36或37所述的方法，其特征在于所述的培养包括干细胞处于低密度状态。

39、根据权利要求36或37所述的方法，其特征在于所述的培养包括干细胞处于克隆密度状态。

40、根据权利要求36或37所述的方法，其特征在于干细胞维持在ROCK抑制剂中至少约12小时。

41、根据权利要求40所述的方法，其特征在于干细胞维持在ROCK抑制剂中至少约2、4或6天。

42、根据权利要求40所述的方法，其特征在于干细胞维持在ROCK抑制剂中至少1至5代。

43、根据权利要求36或37所述的方法，其特征在于培养干细胞后将ROCK抑制剂从培养基中收回。

44、根据权利要求43所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂约在12小时后收回。

45、根据权利要求43所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂约在2、4或6天后收回。

46、根据权利要求43所述的方法，其特征在于ROCK抑制剂在至少1至5代后收回。

47、根据权利要求22-46任一项所述的方法，其特征在于所述的干细胞是多功能干细胞。

48、根据权利要求47所述的方法，其特征在于所述的干细胞是胚胎干细胞。

49、根据权利要求22-46任一项所述的方法，其特征在于所述的干细胞是啮齿目动物或灵长目动物的干细胞。

50、根据权利要求49所述的方法，其特征在于所述的干细胞是人干细胞。

51、根据权利要求22-50任一项所述的方法，其特征在于所述的ROCK抑制剂是Y-27632、法舒地尔或H-1152。

52、一种培养ES细胞的方法，所述的方法包括如下步骤：

-维持培养中ES细胞于多功能状态，可选的于饲养细胞条件下；

-传代ES细胞至少一次；

-从培养基中收回血清或血清提取物，收回饲养细胞，以使得培养基不含饲养细胞、血清和血清提取物；以及

-而后在ROCK抑制剂条件下维持ES细胞于多功能状态。

53、根据权利要求52所述的方法，其特征在于在收回血清、血清提取物和/或饲养细胞前在ROCK抑制剂条件下培养ES细胞。

54.一种获得ES细胞转染群体的方法，特征在于该方法包括如下步骤：

-用编码筛选标记的构建体转染ES细胞；

-将ES细胞铺板；

-在ROCK抑制剂条件下培养ES细胞；以及

-筛选表达筛选标记的细胞。

55、根据权利要求54所述的获得ES细胞转染群体的方法，其特征在于所述的方法还包括在ROCK抑制剂条件下亚克隆表达筛选标记的细胞的步骤。

56、ROCK抑制剂的应用，特征在于其应用于生产干细胞培养基。

57、ROCK抑制剂的应用，特征在于其应用于在干细胞培养中促进和/或提高克隆效率或传代效率。

58、ROCK抑制剂的应用，特征在于其应用于在干细胞培养中促进和/或提高克隆形成。

59、ROCK抑制剂的应用，特征在于其应用于在培养中促进和/或提高干细胞存活力方面。

60、一种不含血清和血清提取物的细胞培养基，特征在于所述培养基包括：

-基础培养基；

-ROCK抑制剂；以及

-铁转运酶。