JP6214567B2

JP6214567B2 - シクロプロピルジエステルの分解方法

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Publication number: JP6214567B2
Application number: JP2014558781A
Authority: JP
Inventors: アニメシュ・ゴスワミ; ジウェイ・グオ; チウ・ユーピン
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2017-10-18
Anticipated expiration: 2033-02-19
Also published as: CN104114711A; EP2817412A1; ES2714312T3; JP2015507941A; US8828691B2; CN104114711B; WO2013126337A1; EP2817412B1; US20130224812A1

Description

関連出願

（関連出願の相互参照）
本出願は、2012年2月24日に出願された米国仮特許出願第61/602,811号の利益を主張する。

本発明は、ラセミの1,1-ジアルキルオキシカルボニルシクロプロパンの立体特異的加水分解のための方法を提供する。

trans-(1R,2S)-1-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1-カルボキシ-2-ビニルシクロプロパン(1)は、ある特定のC型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤の合成における重要なキラル中間体である。

種々の合成法が報告されている。Flicheらは、ラセミのジメチルエステル(2)を酵素的に分割し、対応する一酸のcis-(1S,2S)-(6a)を製造した後で(6a)を目的のキラル中間体(1)に化学変換する、化学酵素的経路(スキーム1)を報告している。

スキーム1

この方法では、評価された全ての酵素は中程度のエナンチオ選択性のみを示し、最良の酵素でさえも、eeを医薬品中間体のエナンチオ選択的合成の実用化に必要なレベルにまで向上させるためには酵素的分割を2回行わなければならなかった。カルボキシルナプロキセンエステラーゼ(CENP)によるラセミのメチルエステル(2)の酵素加水分解によって、一酸のcis-(1S,2S)-(6a)（ee たった70%）、およびジメチルエステル(2R)-(2b)がリッチな未反応の出発物質（ee 95%）が得られた。該一酸のcis-(1S,2S)-(6a)（ee 70%）をジエステルに再エステル化し、CENPによる2回目の酵素加水分解によって、該一酸のcis-(1S,2S)-(6a)のeeを90%にまで向上させた。エステラーゼ30000によるリッチなジメチルエステル(2R)-(2b)（ee 95%）の2回目の酵素加水分解により、一酸のcis-(1R,2R)-(6a)（ee 95%）が得られた。

また、ジエチルエステル(±)-(3)のブタの肝臓エステラーゼ(PLE)触媒加水分解によって、低いジアステレオ選択性(de 60%)である一酸の(7a)が得られることも報告された。該ジエチルエステル(±)-(3)の非酵素加水分解は部分的ジアステレオ選択性（partial diastereo-preference）を示し、主要な生成物としてラセミのcis-(±)-(7)が得られた。

スキーム2

このような例は、医薬品中間体（例えばビニルシクロプロパン(1)）の実用的なエナンチオ選択的合成のための、高いジアステレオ選択性および高いエナンチオ選択性を有する酵素を見いだす必要性を強調している。

第1の態様において、本発明は、式(II):

（式中、
R¹はアルキルであり;そして、
R²はアルケニルまたはアルキルから選択される）
で示される化合物の製造方法であって、
式(I):

で示される化合物を酵素と反応させることを含む、該方法を提供する。

第1の態様の第1の実施態様において、該酵素は加水分解酵素である。第1の態様の第2の実施態様において、該加水分解酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、またはアミダーゼから選択される。第1の態様の第3の実施態様において、該酵素は、枯草菌由来のエステラーゼ、ペニシリンVアミドヒドロラーゼ、またはコウジカビ由来のプロテアーゼから選択される。第1の態様の第4の実施態様において、該酵素はペニシリンVアミドヒドロラーゼである。第1の態様の第5の実施態様において、該ペニシリンVアミドヒドロラーゼはフサリウム・オキシスポラム由来である。第1の態様の第6の実施態様において、該ペニシリンVアミドヒドロラーゼ酵素は、フサリウム・オキシスポラムのペニシリンVアミドヒドロラーゼ遺伝子を有する組み換え生物から得られる。

第1の態様の第7の実施態様において、R¹はアルキルであり、ここで、該アルキルはメチル、エチル、プロピル、またはブチルから選択される。第1の態様の第8の実施態様において、R²はC₂アルケニルである。

第1の態様の第9の実施態様において、該式(II)で示される化合物は、90%以上のジアステレオマー過剰率で得られる。第1の態様の第10の実施態様において、該式(II)の化合物は、95%以上のジアステレオマー過剰率で得られる。第1の態様の第11の実施態様において、該式(II)で示される化合物は、70%以上のエナンチオマー過剰率で得られる。第1の態様の第12の実施態様において、該式(II)で示される化合物は、90%以上のエナンチオマー過剰率で得られる。第1の態様の第13の実施態様において、該式(II)で示される化合物は、95%以上のエナンチオマー過剰率で得られる。

本発明の他の態様は、本明細書に記載の2つ以上の実施態様および/または態様の適切な組み合わせを含んでよい。

さらに他の本発明の実施態様および態様が、以下の記載から明らかであろう。

該酵素は、そのままかまたは固定化酵素として用いられ得る。加えて、そのままかまたは固定化形態の該酵素は再利用され得る。

本明細書で用いられる通り、以下の用語は以下に示す意味を有する。

本明細書で用いる用語「アルケニル」は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有する2〜6個の炭素原子の直鎖または分枝鎖の基を言う。

本明細書で用いる用語「アルキル」は、1から6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素由来の基を言う。

本発明の全てのプロセスは、連続的プロセスで実施され得る。本明細書で用いる用語「連続的プロセス」は、中間体の単離を行わずに実施される工程を意味する。

関連する化合物の構造をスキーム3-5に示す。

本出願で用いられる略語（とりわけ、以下の例示スキームおよび実施例中のものを含む）は、当業者に周知である。用いる略語のいくつかは以下の通りである: TFAはトリフルオロ酢酸; minは分; hは時間; DMSOはジメチルスルホキシド; MTBEはメチル tert-ブチルエーテル; Etはエチル; n-Prはn-プロピル, n-Buはn-ブチル, t-Buはtert-ブチル;および、Meはメチル。

スキーム3

スキーム4

スキーム5

化学物質はVWRおよび/またはAldrichから購入した。NMRスペクトルを、BRUKER-300および/またはJEOL-400 NMR分光光度計において、CDCl₃(指示される場合を除く)中で記録した。プロトンの帰属は、¹H-¹H COSY実験に基づいた。LCMSデータを、島津LCMSシステムにおいて、陽イオンエレクトロスプレー(ES+)または陰イオンエレクトロスプレー(ES-)法を用いて、記録した。旋光度データを、Perkin-Elmer 241 旋光計で記録した。

逆相HPLC アキラルメソッド1、およびキラルメソッド2および3は、周囲温度での溶媒A(0.05% TFA／水:メタノール 80:20)および溶媒B(0.05% TFA／アセトニトリル:メタノール 80:20)の様々なグラジエント、ならびに210 nmでのUV検出を用いて、実施された（他に指示される場合を除く）。順相HPLCメソッド4はキラル分析用であった。より良好な分離またはより迅速な分析についての研究において、これらHPLCメソッドのいくつかの改変も用いられた。

メソッド-1は、全ての化合物のアキラル分析において用いられ、YMC-Pack Pro C18 column(3 μm, 150 × 4.6 mm)（流速 1 mL/分、ならびに14分かけて30%〜100% 溶媒Bのグラジエントおよび100% Bでさらに2分間ホールド）において、実施された。保持時間は、各々、ジエステル2、3、4および5については6.1、8.7、11.4および13.5分;cis-一酸の6、7、8および9については4.2、5.3、6.7および8.1分;trans-一酸の10、11、12および13については4.0、5.1、6.5および7.9分;二酸の14については3.0分;trans-化合物17およびそのcis-異性体18については8.7および12.5分;trans-化合物1については5.9分であった。

メソッド-2は、trans-化合物17のキラル分析において用いられ、Chiralcel OD-RH column(150 × 4.6 mm)（流速 0.5 mL/分、ならびに25分間35% 溶媒Bのイソクラティック組成）において実施された。保持時間は、(1R,2S)-17aについては19.1分、および(1S,2R)-17bについては20.6分であった。

メソッド-3は、trans-化合物1のキラル分析において用いられ、Chiralpak AS-RH column(150 × 4.6 mm)（流速 0.5 mL/分、ならびに20分間22% 溶媒Bのイソクラティック組成）において実施された。保持時間は、(1R,2S)-1については9.1分、およびそのエナンチオマー(1S,2R)-1bについては11.6分であった。

メソッド-4は、cis-一酸の6〜9のキラル分析において用いられ、Chiralpak AD-H column (250 × 4.6 mm)（流速 1 mL/分、ならびに15分間5% イソプロパノール／ヘプタンのイソクラティック組成）において、実施された。保持時間は、各々、6bおよび6aについては8.0および8.7分;7bおよび7aについては7.4および8.2分;8bおよび8aについては6.9および7.6分;9bおよび9aについては6.6および7.0分であった。

ラセミのジメチルエステル(2)の合成
250 mL フラスコに、(E)-1,4-ジブロモ-2-ブテン(92.6316 mmol, 20.014 g)、炭酸カリウム(無水, 231.802 mmol, 32.036 g)、メタノール(無水, 100 mL)、およびマロン酸ジメチル(101.8786 mmol, 13.4598 g)を加えた。該反応液は初めのうちは発熱性であった。該混合液を周囲温度で20時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣を200 mLの酢酸エチルおよび200 mLの水で処理した。有機層をさらに、水(2 x 100 mL)で洗浄し、MgSO₄で乾燥させ、濾過した。溶媒を濾過して除き、ジメチルエステル(2)(14.7833 g, 86.6%収率)を得た。純粋な分析試料を蒸留(89℃/5 mmHg)により得た。 ¹H NMR (CDCl₃) δ 5.43〜5.36 (m, 1H), 5.26 (見かけ上のd, J = 16.7 Hz, 1H), 5.10 (見かけ上のd, J = 10.4 Hz, 1H), 3.703 (s, 3H), 3.700 (s, 3H), 2.55 (見かけ上のq, J = 8.5 Hz, 1H), 1.68 (dd, J = 7.63, 4.88 Hz, 1H), 1.55 (dd, J = 9.16, 4.89 Hz, 1H) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃) δ 170.01, 167.78, 133.05, 118.65, 52.68, 52.53, 35.81, 31.43, 20.58 ppm.

ラセミのジエチルエステル(3)の合成
250 mL フラスコに、(E)-1,4-ジブロモ-2-ブテン(92.63 mmol, 20.01 g)、炭酸カリウム(無水, 231.44 mmol, 31.99 g)、エタノール(100 mL)、およびマロン酸ジエチル(102.00 mmol, 16.34 g)を加えた。該混合液を周囲温度で46時間撹拌した。ジメチルエステルの製造に用いたものと同じワークアップ手順によって、ジエチルエステル(3)(20.473 g, 104%収率)を得た。純粋な分析試料を、蒸留(97℃/5 mmHg)により得た。 ¹H NMR (CDCl₃) δ 5.47〜5.40 (m, 1H), 5.29 (見かけ上のd, J = 17.09 Hz, 1H), 5.13 (見かけ上のd, J = 10.1 Hz, 1H), 4.26〜4.12 (m, 4H), 2.56 (見かけ上のq, J = 8.24 Hz, 1H), 1.68 (dd, J = 7.33, 4.89, 1H), 1.54 (dd, J = 9.16, 4.89 Hz, 1H), 1.28〜1.23 (m, 6H) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃) δ 169.69, 167.44, 133.27, 118.39, 61.62, 61.44, 36.04, 31.08, 20.35, 14.23, 14.11 ppm.

ラセミのジプロピルエステル(4)の合成
250 mL フラスコに、(E)-1,4-ジブロモ-2-ブテン(92.598 mmol, 20.007 g)、炭酸カリウム(無水, 231.668 mmol, 32.018 g)、1-プロパノール(100 mL)、およびマロン酸ジプロピル(101.916 mmol, 19.183 g)を加えた。該混合液を60℃で24時間撹拌した。ジメチルエステルの製造に用いたものと同じワークアップ手順によって、ジプロピルエステル(4)(23.069 g, 103.7%収率)を得た。 ¹H NMR (CDCl₃) δ 5.47〜5.40 (m, 1H), 5.28 (見かけ上のd, J = 17.09 Hz, 1H), 5.12 (見かけ上のd, J = 10.38 Hz, 1H), 4.15〜4.03 (m, 4H), 2.57 (見かけ上のq, J = 8.24 Hz, 1H), 1.70〜1.62 (m, 5H), 1.54 (dd, J = 8.85, 4.88, 1H), 0.95〜0.92 (見かけ上のt, J = 7.33 Hz, 6H) ppm. ¹³C NMR (CDCl₃) δ 169.82, 167.57, 133.35, 118.40, 67.26, 67.20, 36.16, 31.13, 22.04, 21.97, 20.47, 10.42, 10.35 ppm.

ラセミのジブチルエステル(5)の合成
250 mL フラスコに、(E)-1,4-ジブロモ-2-ブテン(92.784 mmol, 20.047 g)、炭酸カリウム(無水, 231.430 mmol, 31.985 g)、1-ブタノール(100 mL)、およびマロン酸ジブチル(101.869 mmol, 22.032 g)を加えた。ジメチルエステルの製造に用いた方法によって、ジブチルエステル(5)(23.933 g, 96.1%収率)を得た。 ¹H NMR (CDCl₃) δ 5.42 (m, 1H), 5.27 (見かけ上のd, J = 16.78 Hz, 1H), 5.10 (見かけ上のd, J = 10.37 Hz, 1H), 4.17〜4.05 (m, 4H), 2.54 (見かけ上のq, J = 8.54 Hz, 1H), 1.66 (dd, J = 7.63, 4.88 Hz, 1H), 1.62〜1.56 (m, 4H), 1.52 (dd, J = 8.85, 4.89 Hz, 1H), 1.40〜1.32 (m, 4H), 0.93〜0.89 (m, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃) δ 169.80, 167.55, 133.33, 118.34, 65.51, 65.37, 36.12, 34.96, 31.09, 30.69, 30.63, 20.44, 19.10, 13.65, 13.63 ppm.

酵素スクリーニング
酵素を含むマルチウェルプレートを、低温室から取り出した。各ウェルは、約10 mgの凍結乾燥または固定化された酵素を含んでいた。リン酸バッファー, 100 mM, pH 7(1 mL)を各ウェルに加えた。該プレートを、Thermomixer Rにおいて、28℃にて5分間、600 rpmで振盪させた。20 μL DMSO中の1 μL(1.097 mg)のラセミのジメチルエステル(±)-(2)の溶液を、各ウェルに加えた。加水分解を、同じ振盪機において、28℃にて24時間、600 rpmで振盪させることにより、行った。24時間後、アセトニトリル(1 mL)を各ウェルに加えた。該混合液を、振盪機に、300 rpmにて室温で10分間入れて混合させた後、0.2 μフィルターによって濾過し、逆相HPLC(メソッド1)により分析して、加水分解の程度を判定した。10%以上の変換を示す酵素の加水分解からの反応混合液を、キラルHPLCにより分析して、エナンチオマーの組成を決定した。酵素加水分解からの該反応混合液に、0.1 mLの1 N HClを加えて該混合液を酸性(pH 〜2.5)にして、2 mLの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を分離し、窒素の気流でエバポレートした。残渣をヘプタン-イソプロパノール(95:5, 1 mL)に溶解させ、キラルHPLC(メソッド4)により分析した。

^*HPLCピークの帰属は、(6a)の公知化合物(1)への変換により確認された。
^**フサリウム・オキシスポラム由来のPen V アミダーゼは固定化リコンビナントペニシリンVアミドヒドロラーゼであり、もともとペニシリンVの6-アミノペニシラン酸への酵素加水分解に用いられていたものであって、Bristol-Myers Squibbにより社内製造されたものである(米国特許第5,516,679号、およびLowe, D. et al. Biotechnol. Lett. 1986, 8, 151-156参照)。

Pen V アミダーゼを用いたジエチルエステル(±)-3の酵素加水分解によるcis-(1S,2S)-(7a)の製造
該反応を、ジャケット付き2 L フラスコ中でpHスタットにて実施して、温度を30℃に維持し、1 M NaOH水溶液の自動添加によりpH 8.0を維持した。該フラスコに、60 gのPen V アミダーゼおよび1.5 Lの0.1 M リン酸バッファー（pH 8.0）を充填した。撹拌下において、該ジエチルエステル(±)-(3)(30.5 g)を加えた。48時間後、NaOH消費率によって加水分解の完了が示された。該反応を、該混合液を濾過して酵素を取り除くことによって、終わらせた。該固形物を0.1 M リン酸バッファー, pH 8.0(200 mL)および酢酸エチル(3 × 200 mL)で洗浄した。濾液およ洗液を合わせて、2相を分離させた。水相をさらに酢酸エチル(2 × 600 mL)で抽出した。有機相を合わせて、300 mLの5% NaHCO₃、300 mLの水で洗浄した。室温で溶媒を除去して、16.7 gの残留ジエチルエステル(2R)-(3b)を得た。単離収率55%, AP 97, [α]_D = + 23.98 (c=2.16, CHCl₃). NMR (CDCl₃) ¹H δ 5.46 (m, 1H), 5.30 (dd, 1H), 5.14 (dd, 1H), 4.19 (m, 4H), 2.58 (q, 1H), 1.69 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.27 (2つの三重線, 6H) ppm.

水相を4 M HClで酸性化し、酢酸エチル(3 × 600 mL)で抽出した。有機抽出物を合わせて、水で洗浄した。溶媒をロータリーエバポレーターにおいて20-25℃にて除去して、10.3 gの生成物cis-(1S,2S)-(7a)を得た。単離収率39%, AP 98, de 99% および ee 90%, [α]_D = + 5.52 (c=2.82, CHCl₃). NMR (CDCl₃) ¹H δ 11.35 (ブロード, 1H), 5.68 (m, 1H), 5.43 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.30 (m, 2H), 2.75 (q, J = 8.6 Hz, 1H), 1.95 (m, 2H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm.

cis-(1S,2S)-(7a)をtrans-(1R,2S)-(17a)に変換する改変クルチウス反応
cis-(1S,2S)-(7a)(3.684 g, de 99%, ee 90%)／アセトン(50 mL, モレキュラーシーブで乾燥させた)溶液に、-5〜0℃にて、トリエチルアミン(3.35 mL)を加え、次いで10 mLの乾燥アセトン中のクロロギ酸エチル(2.49 mL)の溶液を滴下した。-5〜0℃にて30分後、該混合液を室温で18時間撹拌した。生じた白色の沈殿物を濾過により除去した。該濾過物を-5℃まで冷却し、10 mLの水中のアジ化ナトリウム(1.95 g)の溶液を滴下した。該混合液を-5〜0℃で1時間撹拌した。該混合液に100 mLの冷たい(5℃)水を加えた。該混合液をMTBE(3 × 80 mL)で抽出した。MTBE相をMgSO₄で乾燥させ、濾過した。溶媒をロータリーエバポレーターにおいて20-25℃で除去して、4.118 gの薄黄色のアジド(16a)（全収率 98%）を得た。

50 mLの無水t-ブタノール中のアジド(16a)の混合液を18時間還流した(100℃の油浴)。該混合液を減圧下において乾固するまで濃縮して、4.259 gの薄黄色の生成物 trans-(1R,2S)-(17a)を得た。 AP 78, de ＞ 99%, ee 90%, (7a)からの全収率 83%.

Trans-(1R,2S)-(17a)からTrans-(1R,2S)-(1)への加水分解
前項で得られた粗製物(17a)の混合物、10 mLのTHFおよび40 mLの2 M LiOH水溶液を室温で5日間撹拌した。該混合液を100 mLのMTBEで抽出した。MTBE相を20 mLの水で逆抽出した。水相を合わせて、KHSO₄(10.9 g)および水(30 mL)の混合液で酸性化し、酢酸エチル(2 × 100 mL)で抽出した。酢酸エチル抽出物を合わせて、食塩水(2 × 50 mL)、水(2 × 50 mL)で洗浄し、MgSO₄で乾燥させ、濾過した。溶媒を室温で除去して、3.192 gの粗生成物を得た（AP 77）。該粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(80 g シリカゲル)で処理し、ヘプタン-酢酸エチル-酢酸(50:50:1)で溶出して、2.448 g(54% (7a)からの全収率)の白色の固形物 trans-(1R,2S)-(1)を得た。 AP 95, ee 90%, [α]_D +22.34 (c 1.41, MeOH). LCMS m/z ES-メソッドにより226 (M-H)およびES+メソッドにより250 (M+Na). ¹H, ¹H-¹H COSY, (1)の¹³CおよびDEPT NMRスペクトルを、DMSO-d₆で記録した。¹H-¹H COSYに基づいてプロトンの帰属を行い、DEPT実験に基づいて炭素の帰属を行った。 ¹H δ 12.41 (ブロード, 1H, CO₂H), 7.52 (ブロード, 0.74H, 主要な回転異性体のNH), 7.18 (ブロード, 0.26H, 少量の回転異性体のNH), 5.67 (m, 1H, 4-CH), 5.21 (d, J = 15.8 Hz, 1H, 5-CH₂-A), 5.02 (d, J = 10.3 Hz, 1H, 5-CH₂-B), 2.02 (m, 1H, 2-CH), 1.49 (m, 1H, 3-CH₂-A), 1.35 (s, 9H, Boc), 1.22 (m, 1H, 3-CH₂-B) ppm. 主要な回転異性体の¹³C δ 172.41 (C-6), 155.51 (C-7), 134.95 (C-4 DEPTで上向き), 116.78 (C-5 DEPTで下向き), 77.95 (C-8), 39.92 (C-1 DEPTで示されず), 32.45 (C-2 DEPTで上向き), 28.18 (C-9, 10および11 DEPTで上向き), 22.52 (C-3 DEPTで下向き) ppm.

少量バイアルにおける酵素加水分解の一般的方法
各バイアル(4 mL)に、Pen V アミダーゼ(10 mgまたは指定の量)および1 mLのバッファーを充填した。該バイアルをマルチウェルプレートのウェルに設置し、Thermomixer 振盪機において振盪させた。10分後、基質ジエステル(2、3、4または5) 10 μLまたは指定の量を加え、振盪を続けた。24時間または指定された時間の後、20 μLの4 M HClおよび3 mLのアセトニトリルを加えた。該混合液を0.2 μmフィルターにより濾過した。1 mLの濾液をアキラル分析のためのHPLCメソッド-1で処理した。該変換は、相対HPLC面積により推定された。残りの濾液を窒素の気流である程度濃縮し、酢酸エチルで抽出した。該抽出物を乾燥させ、残渣をイソプロパノール-ヘプタン(1:1)に溶解させ、0.2 μmフィルターにより濾過し、キラル分析のためのHPLCメソッド-4で処理した。

(±)-(2)のPen V アミダーゼ触媒加水分解について共溶媒(5-10%体積)の効果を評価した。直鎖アルカン（例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、およびテトラデカン）はエナンチオ選択性を向上させた（酵素活性においてわずかな効果を有する）。代表的なデータを表2に示す:

複数の実験を、様々なpHおよび温度にて様々なヘプタン濃度を用いて実施し、ジメチルエステル(±)-(2)のPen V アミダーゼ触媒加水分解の効果を評価した。酵素活性およびエナンチオ選択性の両方を考慮すると、最良の条件は、28-32℃にて、水性バッファー, pH 6.5〜7（約20%体積のヘプタンを含む）であることが決定された。

cis-(1S,2S)-(6a)を製造するためのジメチルエステル(±)-(2)の酵素加水分解
該反応を、ジャケット付き500 mL フラスコ中においてpH STATで実施して、32℃の温度および1 M NaOH水溶液の自動添加によるpH 7.0を維持した。該フラスコに、30 gのPen V アミダーゼ、240 mLの0.1 M リン酸バッファー, pH 7.0および60 mLのヘプタンを充填した。撹拌下において、該ジメチルエステル(±)-(2)(6.47 g)を加えた。22時間後、試料の分析により48%の変換が示された。NaOH消費によっても、反応の完了が示された。反応混合液全体を1 M NaOHでpH 8.0に調整し、酢酸エチル(3 × 200 mL)で抽出した。有機相を合わせて、0.1 M リン酸バッファー, pH 8.0(200 mL)および水(200 mL)で洗浄した。溶媒を除去して、3.1 gの残留ジメチルエステル(2R)-(2b)を得た。単離収率48%, AP 98, [α]_D + 34.15 (c 1.95, CHCl₃). NMR (CDCl₃) ¹H δ 5.38-5.49 (m, 1H), 5.30 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.15 (dd, J = 10.0, 1.8 Hz, 1H), 3.75 (s, 6H), 2.60 (m, 1H), 1.73 (dd, J = 7.5, 4.9 Hz, 1H), 1.59 (dd, J = 9.0, 4.9 Hz, 1H) ppm. 13C δ 169.59, 167.37, 132.74, 118.29, 52.33 (2C), 35.42, 31.04, 20.20 ppm.

残った未反応のジエステルを抽出した直後に、水相(pH 8.0)を6 N HClでpH 2まで酸性化した。酸性化された水相を酢酸エチル(3 × 200 mL)で抽出し、溶媒を除去して目的の一酸のcis-(1S,2S)-(6a)（2.5 g）を得た。単離収率42%, AP 97, de 99% および ee 95%, [α]_D - 8.28 (c 1.63, CHCl₃). NMR (CDCl₃) ¹H δ 10.5 (ブロード, 1H), 5.6 (m, 1H), 5.39 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 2.73 (m, 1H), 2.0 (m, 2H) ppm. ¹³C δ 171.99, 170.29, 131.99, 119.56, 52.49, 35.53, 33.86, 21.86 ppm.

(2R)-(2b)のeeを決定するための非酵素加水分解
上記の酵素加水分解実験から得た(2R)-(2b)(840 mg, 4.6 mmol)の5 mLのMeOH中の溶液を氷浴において冷却した。撹拌後、330 mgのKOH(5.9 mmol)を、3分割して10分で加えた。5時間後、該反応混合液を濃縮し、10 mLの水と混合し、酢酸エチル(3 × 10 mL)で抽出した。水相を1 M HClでpH 4.5まで酸性化し、酢酸エチル(2 × 10 mL)で抽出した。該酸性の有機抽出物溶媒を除去して、272 mgの一酸の混合物を得た。アキラルHPLCメソッド-1により、全AP 98およびde 85%が決定された。キラルHPLCメソッド-4により、得られたcis-(1R,2R)-(6b)のeeは82%であると決定された。

Claims

式(II):

（式中、
R¹はアルキルであり;そして、
R²はアルケニルまたはアルキルから選択される）
で示される化合物の製造方法であって、
式(I):

で示される化合物をフサリウム・オキシスポラム由来のペニシリンVアミドヒドロラーゼと反応させることを含む、該方法。
該ペニシリンVアミドヒドロラーゼが、フサリウム・オキシスポラムのペニシリンVアミドヒドロラーゼ遺伝子を有する組み換え生物から得られる、請求項１に記載の方法。
R¹がメチル、エチル、プロピル、またはブチルから選択されるアルキルである、請求項１または２に記載の方法。
R²がC₂アルケニルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
該式(II)で示される化合物が90%以上のジアステレオマー過剰率で得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
該式(II)で示される化合物が95%以上のジアステレオマー過剰率で得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
該式(II)で示される化合物が70%以上のエナンチオマー過剰率で得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
該式(II)で示される化合物が90%以上のエナンチオマー過剰率で得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
該式(II)で示される化合物が95%以上のエナンチオマー過剰率で得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。