JP6214016B2 - 疾患サンプル分析装置、分析システム及び分析方法 - Google Patents
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Description
of Health(NIH))のガイドラインに従って資生堂リサーチセンターの倫理委員会によって承認された後に実施された。
1.材料及び方法
(1)サンプル
健常人及び各種疾患由来の血清サンプルは、米国バイオサーブ社(BioServe Biotechnologies, Ltd、米国、メリーランド州、Beltsville)から入手された。前記サンプルは、現在バイオサーブ社に買収されたGenomicCollaborative Inc.社によって採取された。採血は患者の医師による管理の下で行われ、米国の医療保険の相互運用性及び説明責任に関する法律(HIPAA)に沿った書類による採血者の同意が確認済みである。今回の分析に用いられたサンプルの提供者のうち健常者は、男女各4名全員が50歳の白人で、検討対象疾患の既往歴のない者が選ばれた。腎臓病患者は糖尿病を併発していない者が選ばれた。認知症患者は、アルツハイマー病協会による7段階の重症度のステージ5(日々の生活に他人の補助が必要となり始める段階)と診断された男性4名が選ばれた。大腸がん患者はステージIIと診断された男性4名が選ばれた。乳がん患者は、片側のみで発生しステージIIと診断された女性4名が選ばれた。前立腺がんはステージIIと診断され、ホルモン療法及び化学療法を受けていない男性が選ばれた。肝障害患者は、片側のみで発生しステージIIと診断された女性が選ばれた。骨粗鬆症患者は女性が選ばれた。卵巣がん患者はステージIIの女性が選ばれた。今回の分析に用いられたサンプルの提供者には喫煙者は除外された。
前記サンプルは、財津らが開発したD、L−アミノ酸一斉高感度分析システム(特許第4291628号)によるアミノ酸立体異性体の全分析に供された。各アミノ酸の分析条件の詳細は、Hamase K.ら、J.Chromatogr.A, 1143:105(2007)、HamaseK.、ら、J.Chromatogr.A, 1217:1056(2010)、MiyoshiY.、ら、J.Chromatogr.B, 879:3184(2011)に説明される。簡潔には、サンプルは、その20倍の容積のメタノール中で、4°C、3,500rpm、2分間マイクロホモジナイジングシステム(Micro Smash MS−100R、株式会社トミー精工)でホモジナイズされ、20,400×gで10分間遠心された。遠心上清10μLは、40°Cで減圧乾燥された。残渣に20μLの200mMホウ酸ナトリウムバッファー(pH8.0)と、40mM NBD−F(4−フルオロ−7−ニトロ−2,1,3−ベンゾオキサジアゾール、東京化成工業株式会社)の無水シアン化メチル溶液の5μLとが添加され、60°C、2分間加熱された。反応後、75μLの2%(v/v)トリフルオロ酢酸水溶液が添加された。この混合液の2μLがHPLCシステム(NANOSPACE SI−2、株式会社資生堂、Sasabe,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、109:627(2012)の補足情報を参照せよ。)に供された。簡潔には、逆相分離用分析カラムは、40°Cに保温された自社製のモノリシックODSカラム(内径759mm×0.53mm、石英ガラス毛管に装填)が用いられた。移動相は、シアン化メチル−トリフルオロ酢酸−水(容積比5:0.05:95)が用いられた。流速は毎分35μLであった。逆相分離の後、150μLループが装着されたカラム切り替えバルブを経由して、目的のNBD化アミノ酸分画は自動的にエナンチオ選択性カラムに移された。エナンチオマー分離には、キラルセレクターとして(S)−ナフチルグリシンを用いるスミキラルOA−2500Sカラム(内径250mm×1.5mmI.D.、自家充填、材料は株式会社住化分析センター製)が使用された。蛍光検出は、励起波長470nm、検出波長530nmで実行された。
図1は、健常者及び各種疾患患者のそれぞれ最初のサンプルについてのD−アミノ酸の分析結果をまとめた表である。表の各行はサンプル提供者の疾患名を表し、各列は分析されたD−アミノ酸の種類を表す。表の中でNDは検出限界以下であったことを表す。トリプトファン、システイン及びチロシンの列の粗い右上がりのハッチングはこれらのアミノ酸は今回のサンプルでは定量できなかったことを表す。上向き矢印はこのサンプルでは第1行の健常男性のサンプルよりアミノ酸量が高いことを表し、下向き矢印は第1行の健常男性のサンプルよりこのサンプルのアミノ酸量が低いことを表す。細かい右上がりのハッチング(例えば、腎臓病サンプルのアスパラギン等)は、これらのサンプルのアミノ酸量の前記健常男性のサンプルのアミノ酸量に対する割合が2倍以上(上向き矢印)か、あるいは、1/2以下(下向き矢印)かを表す。粗い左上がりのハッチング(例えば、腎臓病サンプルのグルタミン等)は、これらのサンプルのアミノ酸量の前記健常男性のサンプルのアミノ酸量に対する割合が2倍未満(上向き矢印)か、あるいは、1/2未満(下向き矢印)かを表す。
アミノ酸立体異性体の全分析は、実施例1で説明されたD、L−アミノ酸一斉高感度分析システムと同様のシステムが用いられたが、送液ポンプにダンパーを有さないMSを用いたこと、MPSと低用量デガッサーとの採用により、2次元目の移動相を幅広く選択できるようになったことが異なる。
本実施例で用いられたマウス疾患モデルは、拡張型心筋症モデルマウス、卵巣摘出による更年期モデルマウス、肉腫移植マウス、アルツハイマー病モデルマウス、DAO欠損マウス及びDDO欠損マウスである。以下に詳しくそれぞれのマウスについて説明する。マウスを用いる実験は九州大学大学院薬学研究院にて行われた。
心血管障害のモデルマウスとして、心筋構成タンパク質の1種である、MLP(muscle LIM protein)が欠損した、MLP−KOマウス(Arber, S.ら、Cell、88:393(1997))が用いられた。拡張型心筋症モデルマウス(MLP−KOマウス、以下、「疾病」という。)雄8週齢3匹と、対照正常マウス(以下、「正常」という。)雄8週齢4匹との尿サンプルを得て、その全アミノ酸光学異性体含量が分析された。
更年期モデルマウスとして、HR−1マウス9週齢雌から麻酔下で卵巣が摘出され、皮膚が縫合された。同じ週齢の雌マウスから、卵巣摘出を行わずに、皮膚の切開及び縫合のみを行った対照実験のマウスも用意された。施術前と、施術後1週間目ないし4週間目の体重が測定された。対照マウスと比較して体重が増大することが確認された個体が更年期モデルマウスとして尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
肉腫移植マウスとして、2×10 7 個の肉腫細胞を移植されたICR系雄6週齢マウスが用意された。移植3週間後に外植された腫瘍の成長が確認された個体が尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。肉腫移植マウスの対照実験として、同環境で飼育されたICR系雄9週齢マウス個体が尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
アルツハイマー病モデルマウスとして、アミロイドβ前駆体タンパク質高発現トランスジェニックマウスTg2576(Hsiao、K.ら、Science、274:99(1996))のヘミ接合体雄8週齢マウスが尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。C57BL雄8週齢マウスが対照正常マウスとして尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
D−アミノ酸代謝関連酵素活性変化モデルの1つとして、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス(Konno、 R.ら、Genetics 103:277(1983)、ddY/DAO−、以下、「DAO−/−」という。)雄8週齢の個体が尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス雄8週齢の個体が、対照マウスとして尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
D−アミノ酸代謝関連酵素活性変化モデルの1つとして、D−アスパラギン酸酸化酵素(DDO)欠損マウス(Huang、A.S.ら、J. Neurosci.、2:2814(2006)、以下、「DDO−」という。)雄8週齢の個体が尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。D−アスパラギン酸酸化酵素(DDO)野生型(以下、「DDO+」という。)雄8週齢個体が、対照マウスとして尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
アミノ酸代謝障害モデルマウスの1つとして、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、Shedlovsky、A.ら、Genetics 134:1205(1993))のSPF条件で飼育された25−35週齢の雄5匹が尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。同一遺伝背景の野生型アレルのホモ接合体のSPF条件で飼育された25−35週齢の雄5匹が、対照マウスとして尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
アミノ酸代謝障害モデルマウスの1つとして、(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、Homanics G.E.ら、BMC Med Genet、7:33(2006)のSPF条件で飼育された8−10週齢の雄5匹が尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。同一遺伝背景の野生型アレルのホモ接合体のSPF条件で飼育された8−10週齢の雄5匹が、対照マウスとして尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。一部の実験では、+/Dbt tm1Geh のヘテロ接合体のSPF条件で飼育された8−10週齢の雄5匹が中間型として尿中全アミノ酸光学異性体含量分析に供された。
2.1 拡張型心筋症モデルマウス
図4−1は、拡張型心筋症モデルマウス(MLP−KOマウス、以下、「疾病」という。)3匹と、対照正常マウス(以下、「正常」という。)4匹との尿中のD−セリン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、D−セリン濃度(ナノモル/mL)である。図4−2は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のL−セリン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフを示す。縦軸は、L−セリン濃度(ナノモル/mL)である。図4−3は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中の全セリン濃度(D−セリン濃度及びL−セリン濃度の和)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、全セリン濃度(ナノモル/mL)である。図4−4は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中の全セリン濃度に対するD−セリン濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフを示す。縦軸は、%Dである。正常と疾病との有意差は、Studentのt検定でPが0.02未満であった。図4−5は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のD−アルギニン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、D−アルギニン濃度(ナノモル/mL)である。図4−6は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のL−アルギニン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、L−アルギニン濃度(ナノモル/mL)である。正常と疾病との有意差は、Studentのt検定でPが0.01未満であった。図4−7は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中の全アルギニン濃度(D−アルギニン濃度及びL−アルギニン濃度の和)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、全アルギニン濃度(ナノモル/mL)である。図4−8は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のD−グルタミン酸濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、D−グルタミン酸濃度(ナノモル/mL)である。正常と疾病との有意差は、Studentのt検定でPが0.02未満であった。図4−9は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のL−グルタミン酸濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、L−グルタミン酸濃度(ナノモル/mL)である。図4−10は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中の全グルタミン酸濃度(D−グルタミン酸濃度及びL−グルタミン酸濃度の和)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、全グルタミン酸濃度(ナノモル/mL)である。図4−11は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のD−プロリン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、D−プロリン濃度(ナノモル/mL)である。正常と疾病との有意差は、Studentのt検定でPが0.01未満であった。図4−12は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のL−プロリン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、L−プロリン濃度(ナノモル/mL)である。図4−13は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中の全プロリン濃度(D−プロリン濃度及びL−プロリン濃度の和)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、全プロリン濃度(ナノモル/mL)である。図4−14は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のD−リジン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフを示す。縦軸は、D−リジン濃度(ナノモル/mL)である。正常と疾病との有意差は、Studentのt検定でPが0.01未満であった。図4−15は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中のL−リジン濃度の平均値及び標準誤差の棒グラフを示す。縦軸は、L−リジン濃度(ナノモル/mL)である。図4−16は、拡張型心筋症モデルマウス3匹と、対照正常マウス4匹との尿中の全リジン濃度(D−リジン濃度及びL−リジン濃度の和)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。これらの結果から、D−セリン濃度は疾病群で正常群より低い傾向はあったが、有意差は認められなかった。しかし%Dで評価すると、D−セリンの%Dは、疾病群で正常群より有意に低かった。L−アルギニン濃度は、疾病群で正常群より有意に低かった。D−グルタミン酸濃度は、疾病群で正常群より有意に高かった。D−プロリン濃度は疾病群で正常群より有意に低かった。D−リジン濃度は疾病群で正常群より有意に低かった。
図5−1は、9週齢HR−1マウスから卵巣が摘出された更年期モデルマウス(以下、「OVX」という。)12匹と、同じ週齢の雌マウスから、卵巣摘出を行わずに、皮膚の切開及び縫合のみを行った対照マウス(以下、「sham」という。)6匹との体重の平均値及び標準偏差の変化を示すグラフである。縦軸はマウスの体重(グラム)を示す。黒塗り及び斜線ハッチングの棒グラフは、それぞれ、施術前の9週齢マウスと、施術後1週目(10週齢)、2週目(11週齢)、3週目(12週齢)、4週目(13週齢)の更年期モデルマウス(OVX)及び対照マウス(sham)の体重の平均値及び標準偏差を示す。更年期モデルマウス(OVX)及び対照マウス(sham)との体重の有意差は、Studentのt検定でPが0.05未満(*)又は0.01未満(**)であった。卵巣が摘出された更年期モデルマウスでは術後2週目から体重が対照マウスより有意に増加し、更年期モデルマウス作製に成功したことを示す。
図6−1、6−2及び6−3は、それぞれ、2×10 7 個の肉腫細胞を移植されたICR系雄6週齢マウスで、移植3週間後に外植された腫瘍の成長が確認された個体3匹のうち1匹目(S3)、2匹目(S4)及び3匹目(S5)の尿中全アミノ酸光学異性体含量分析結果を示す表である。グリシンは光学異性体が存在しないので、L体の欄に記載された。アミノ酸はすべてNBD−Fにより蛍光誘導体化され、本発明の全アミノ酸光学異性体含量分析装置を用いて解析された。トリプトファンはNBD誘導体の感度は低いため、今回の解析ではndとされた。システインについては、空気酸化によりシスチンが生成するため、システインとしての含量は極めて低い。そこで今回の解析ではndとされた。図6−4、6−5及び6−6は、それぞれ、肉腫移植マウスの対照実験として同環境で飼育されたICR系雄9週齢マウス個体3匹のうち1匹目(C3)、2匹目(C4)及び3匹目(C5)の尿中全アミノ酸光学異性体含量分析結果を示す表である。図6−7は、肉腫移植マウス3匹(S3、S4及びS5)及び対照マウス(C3、C4及びC5)3匹の尿中のD−アミノ酸含量を比較した表である。図6−8は、肉腫移植マウス3匹(S3、S4及びS5)及び対照マウス(C3、C4及びC5)3匹の尿中のL−アミノ酸含量を比較した表である。図6−9は、肉腫移植マウス3匹(S3、S4及びS5)及び対照マウス(C3、C4及びC5)3匹の尿中の各アミノ酸のD−体濃度及びL−体の濃度の和に対するD−体濃度の百分率(%D)を比較した表である。肉腫移植マウスのセリンの%Dは対照マウスより低く、有意差は、Studentのt検定でPが0.016であった。図6−10は、肉腫移植マウス3匹(S3、S4及びS5)及び対照マウス(C3、C4及びC5)3匹の尿中の全L−アミノ酸の濃度の和に対する各D−アミノ酸濃度の百分率(%D/total L)を比較した表である。図6−11は、肉腫移植マウス3匹(S3、S4及びS5)及び対照マウス(C3、C4及びC5)3匹の尿中の全D−アミノ酸の濃度の和に対する各D−アミノ酸濃度の百分率(%D/total D)を比較した表である。D−アスパラギン及びD−アルギニンは対照マウスよりも肉腫移植マウスが高い傾向があり、D−アルギニンの有意差は、Studentのt検定でPが0.035であった。図6−12は、肉腫移植マウス3匹(S3、S4及びS5)及び対照マウス(C3、C4及びC5)3匹の尿中のD−アスパラギン濃度に対する各D−アミノ酸濃度の百分率(%D/D−Asn)を比較した表である。D−アスパラギンは哺乳類尿中に比較的高濃度に存在すること、及び、全D−アミノ酸濃度に対する比率が最も安定していたことのために、尿中濃度の補正の指標として用いられた。D−アルギニンは対照マウスよりも肉腫移植マウスが高い傾向があり、有意差は、Studentのt検定でPが0.016であった。
図7−1は、アルツハイマー病モデルマウス(アミロイドβ前駆体タンパク質高発現トランスジェニックマウスTg2576ヘミ接合体雄8週齢マウス、以下、「hemi」という。)3匹と、対照正常マウス(C57BL、以下、「Wild」という。)3匹との尿中のD−セリン濃度(D−Ser)、L−セリン濃度(L−Ser)及び両方の合計(Ser)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、濃度(ナノモル/mL)である。図7−2は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中の全セリン濃度に対するD−セリン濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、%Dである。図7−3は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−セリンの相対比(D−Ser/D−allo−Thr)又は尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−セリンの相対比(D−Ser/D−allo−Ile)のグラフである。尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−セリンの相対比も、尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−セリンの相対比も、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照マウスよりも高く、有意差はStudentのt検定でPがともに0.01未満であった。図7−4は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−アラニン濃度(D−Ala)、L−アラニン濃度(L−Ala)及び両方の合計(Ala)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、濃度(ナノモル/mL)である。尿中のD−アラニン濃度は、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照正常マウスより高く、有意差はStudentのt検定でPが0.01未満であった。図7−5は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中の全アラニン濃度に対するD−アラニン濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、%Dである。尿中の全アラニン濃度に対するD−アラニン濃度の百分率(%D)は、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照正常マウスより高く、有意差はStudentのt検定でPが0.01未満であった。図7−6は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−メチオニン濃度(D−Met)、L−メチオニン濃度(L−Met)及び両方の合計(Met)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、濃度(ナノモル/mL)である。尿中のD−Met濃度は、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照正常マウスより高い傾向があった。図7−7は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中の全セリン濃度に対するD−メチオニン濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、%Dである。図7−8は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−メチオニンの相対比(D−Met/D−allo−Thr)又は尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−メチオニンの相対比(D−Met/D−allo−Ile)のグラフである。尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−メチオニンの相対比も、尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−メチオニンの相対比も、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照マウスよりも高く、有意差はStudentのt検定でPがともに0.05未満であった。図7−9は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−ロイシン濃度(D−Leu)、L−ロイシン濃度(L−Leu)及び両方の合計(Leu)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、濃度(ナノモル/mL)である。図7−10は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中の全セリン濃度に対するD−ロイシン濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。図7−11は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−ロイシンの相対比(D−Leu/D−allo−Thr)又は尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−ロイシンの相対比(D−Leu/D−allo−Ile)のグラフである。尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−ロイシンの相対比も、尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−ロイシンの相対比も、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照マウスよりも高く、有意差はStudentのt検定でPが、それぞれ、0.05未満及び0.01未満であった。図7−12は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−アスパラギン酸濃度(D−Asp)、L−アスパラギン酸濃度(L−Asp)及び両方の合計(Asp)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、濃度(ナノモル/mL)である。尿中のD−アスパラギン酸濃度は、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照正常マウスより低く、有意差はStudentのt検定でPが0.05未満であった。図7−13は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中の全アスパラギン酸濃度に対するD−アスパラギン酸濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、%Dである。図7−14は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−フェニルアラニン濃度(D−Phe)、L−フェニルアラニン濃度(L−Phe)及び両方の合計(Phe)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。縦軸は、濃度(ナノモル/mL)である。図7−15は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中の全フェニルアラニン濃度に対するD−フェニルアラニン濃度の百分率(%D)の平均値及び標準誤差の棒グラフである。図7−16は、アルツハイマー病モデルマウス(hemi)3匹と、対照正常マウス(Wild)3匹との尿中のD−アロ−スレオニン濃度に対するD−フェニルアラニンの相対比(D−Phe/D−allo−Thr)又は尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−フェニルアラニンの相対比(D−Phe/D−allo−Ile)のグラフである。尿中のD−アロ−イソロイシン濃度に対するD−フェニルアラニンの相対比は、アルツハイマー病モデルマウスのほうが対照マウスよりも高く、有意差はStudentのt検定でPが0.05未満であった。
図8−1、8−2及び8−3は、それぞれD−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス(ddY/DAO+、以下、「DAO+/+」という。)個体3匹のうち1匹目(DAO+/+ 1)、2匹目(DAO+/+ 2)及び3匹目(DAO+/+ 3)の尿中全アミノ酸光学異性体含量分析結果を示す表である。グリシンは光学異性体が存在しないので、L体の欄に記載された。アミノ酸はすべてNBD−Fにより蛍光誘導体化され、本発明の全アミノ酸光学異性体含量分析装置を用いて解析された。トリプトファンはNBD誘導体の感度は低いため、今回の解析ではndとされた。システインについては、空気酸化によりシスチンが生成するため、システインとしての含量は極めて低い。そこで今回の解析ではndとされた。図8−4、8−5及び8−6は、それぞれ、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス(ddY/DAO−、以下、「DAO−/−」という。)個体3匹のうち1匹目(DAO−/− 1)、2匹目(DAO−/− 2)及び3匹目(DAO−/− 3)の尿中全アミノ酸光学異性体含量分析結果を示す表である。グリシンは光学異性体が存在しないので、L体の欄に記載された。アミノ酸はすべてNBD−Fにより蛍光誘導体化され、本発明の全アミノ酸光学異性体含量分析装置を用いて解析された。トリプトファンはNBD誘導体の感度は低いため、今回の解析ではndとされた。システインについては、空気酸化によりシスチンが生成するため、システインとしての含量は極めて低い。そこで今回の解析ではndとされた。図8−7は、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス3匹(DAO+/+ 1、DAO+/+ 2及びDAO+/+ 3)と、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス3匹(DAO−/− 1、DAO−/− 2及びDAO−/− 3)と尿中のD−アミノ酸含量を比較した表である。D−セリン、D−アロ−スレオニン、D−アラニン、D−プロリン、D−ロイシン及びD−フェニルアラニンはD−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウスよりもDAO酵素欠損マウスが有意に高かった。図8−8は、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス3匹(DAO+/+ 1、DAO+/+ 2及びDAO+/+ 3)と、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス3匹(DAO−/− 1、DAO−/− 2及びDAO−/− 3)と尿中のL−アミノ酸含量を比較した表である。D−セリン、D−アロ−スレオニン、D−アラニン、D−プロリン、D−ロイシン及びD−フェニルアラニンはD−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウスよりもDAO酵素欠損マウスが有意に高かった。図8−9は、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス3匹(DAO+/+ 1、DAO+/+ 2及びDAO+/+ 3)と、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス3匹(DAO−/−
1、DAO−/− 2及びDAO−/− 3)と尿中の各アミノ酸のD−体濃度及びL−体の濃度の和に対するD−体濃度の百分率(%D)を比較した表である。D−セリン、D−アロ−スレオニン、D−アラニン、D−プロリン、D−ロイシン及びD−フェニルアラニンはD−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウスよりもDAO酵素欠損マウスが有意に高かった。図8−10は、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス3匹(DAO+/+ 1、DAO+/+ 2及びDAO+/+ 3)と、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス3匹(DAO−/− 1、DAO−/− 2及びDAO−/− 3)と尿中の全L−アミノ酸の濃度の和に対する各D−アミノ酸濃度の百分率(%D/total L)を比較した表である。D−セリン、D−アロ−スレオニン、D−アラニン、D−ロイシン及びD−フェニルアラニンはD−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウスよりもDAO酵素欠損マウスが有意に高かった。図8−11は、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス3匹(DAO+/+ 1、DAO+/+ 2及びDAO+/+ 3)と、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス3匹(DAO−/− 1、DAO−/− 2及びDAO−/− 3)と尿中の全D−アミノ酸の濃度の和に対する各D−アミノ酸濃度の百分率(%D/total D)を比較した表である。図8−12は、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウス3匹(DAO+/+ 1、DAO+/+ 2及びDAO+/+ 3)と、D−アミノ酸酸化酵素(DAO)欠損マウス3匹(DAO−/− 1、DAO−/− 2及びDAO−/− 3)と尿中のD−アスパラギン濃度に対する各D−アミノ酸濃度の百分率(%D/D−Asn)を比較した表である。D−セリン、D−アロ−スレオニン、D−アラニン、D−プロリン、D−ロイシン及びD−フェニルアラニンはD−アミノ酸酸化酵素(DAO)野生型マウスよりもDAO酵素欠損マウスが有意に高かった。
図9−1、9−2、9−3及び9−4は、それぞれ、D−アスパラギン酸酸化酵素(DDO)野生型マウス(DDO+)個体4匹のうち1匹目、2匹目、3匹目及び4匹目の尿中全アミノ酸光学異性体含量分析結果を示す波形図である。図9−5、9−6、9−7及び9−8は、それぞれ、D−アスパラギン酸酸化酵素(DDO)欠損マウス(DDO−)個体4匹のうち1匹目、2匹目、3匹目及び4匹目の尿中全アミノ酸光学異性体含量分析結果を示す波形図である。DDO欠損マウスの尿中には野生型マウスの尿中よりD−アスパラギン濃度が高く、D−アスパラギン酸及びD−アルギニンの濃度も高いことが示された。DDO酵素の良好な基質であるD−グルタミン酸は、DDO欠損マウスの尿中にはほとんど認められなかった。
図10−1は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−バリン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−2は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−アロ−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−3は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−4は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2/Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−ロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−5は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−フェニルアラニン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。D−フェニルアラニン濃度は対照マウスよりフェニルケトン尿症疾患モデルマウスで高く、有意差は、pが0.01未満であった。図10−6は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−バリン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−7は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−アロ−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−8は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−9は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−ロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図10−10は、フェニルケトン尿症疾患モデルマウス(フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)突然変異マウス、Pah enu2 /Pah enu2 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−フェニルアラニン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。L−フェニルアラニンの濃度は、対照マウスよりフェニルケトン尿症疾患モデルマウスが高く、有意差は、pが0.01未満であった。
図11−1は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−バリン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−2は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−アロ−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−3は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbttm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。血漿中のD−イソロイシン濃度は、メープルシロップ尿症マウスで対照マウスより高く、有意差は、pが0.05未満であった。図11−4は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbttm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−ロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−5は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbttm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−フェニルアラニン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−6は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−バリン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。血漿中のL−バリン濃度は、メープルシロップ尿症マウスのほうが対照マウスより高く、有意差は、pが0.01未満である。図11−7は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbttm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−アロ−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。血漿中のL−アロ−イソロイシン濃度はメープルシロップ尿症マウスのほうが対照マウスより高く、有意差は、pが0.01未満であった。図11−8は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。血漿中のL−イソロイシン濃度は、メープルシロップ尿症マウスのほうが対照マウスより高く、有意差は、pが0.01未満であった。図11−9は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−ロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。血漿中のL−ロイシン濃度は、メープルシロップ尿症マウスのほうが対照マウスより高く、有意差は、pが0.05未満であった。図11−10は、メープルシロップ尿症マウス(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、Dbt tm1Geh /Dbt tm1Geh 、黒塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−フェニルアラニン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−11は、メープルシロップ尿症マウス中間型(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、+/Dbt tm1Geh 、灰色塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のD−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。血漿中のD−イソロイシン濃度は、メープルシロップ尿症マウスのほうが対照マウスより高く、有意差は、pが0.01未満であった。図11−12は、メープルシロップ尿症マウス中間型(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、+/Dbt tm1Geh 、灰色塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−バリン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−13は、メープルシロップ尿症マウス中間型(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、+/Dbt tm1Geh 、灰色塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−アロ−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−14は、メープルシロップ尿症マウス中間型(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、+/Dbt tm1Geh 、灰色塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−イソロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。図11−15は、メープルシロップ尿症マウス中間型(分岐鎖アルファ−ケト酸脱水素酵素(BCKDH)突然変異マウス、+/Dbt tm1Geh 、灰色塗り)及び対照マウス(白塗り)各5匹の血漿中のL−ロイシン濃度(ナノモル/mL)及び標準誤差を表す棒グラフである。
(1)サンプル
実施例1と同様に、各種疾患由来の血清サンプルは、米国バイオサーブ社(BioServe Biotechnologies, Ltd、米国、メリーランド州、Beltsville)から入手された。前記サンプルは、現在バイオサーブ社に買収されたGenomicCollaborative Inc.社によって採取された。採血は患者の医師による管理の下で行われ、米国の医療保険の相互運用性及び説明責任に関する法律(HIPAA)に沿った書類による採血者の同意が確認済みである。関節リウマチサンプルは、多少可動な疾患状態の49才の白人男性由来であった。腎臓がんサンプルは、ステージIの47才のベトナム人男性由来であった。肺がんサンプルは、ステージIの65才のベトナム人男性由来であった。心血管疾患サンプルは、43才の白人男性由来であった。多発性硬化症サンプルは、再発寛解型の33才の白人男性由来であった。急性骨髄性白血病サンプルは、16才男性由来であった。リンパ腫サンプルは、49才ベトナム人女性由来であった。乾癬サンプルは、40才の白人男性由来であった。糖尿病サンプルは、50才白人男性由来であった。全身性エリテマトーテスサンプルは38才白人女性由来であった。
前記サンプルのアミノ酸立体異性体の全分析は実施例1と同様に実施された。
実施例3の疾患サンプルの解析結果のうちD−アミノ酸については図13−1に、L−アミノ酸については図13−2にそれぞれ分析結果をまとめた。実施例1と同様に、表の各行はサンプル提供者の疾患名を表し、各列は分析されたD−アミノ酸の種類を表す。表の中でNDは検出限界以下であったことを表す。上向き矢印はこのサンプルでは健常男性のサンプルよりアミノ酸量が高いことを表し、下向き矢印は健常男性のサンプルよりこのサンプルのアミノ酸量が低いことを表す。細かい右上がりのハッチングは、これらのサンプルのアミノ酸量の前記健常男性のサンプルのアミノ酸量に対する割合が2倍以上(上向き矢印)か、あるいは、1/2以下(下向き矢印)かを表す。粗い左上がりのハッチングは、これらのサンプルのアミノ酸量の前記健常男性のサンプルのアミノ酸量に対する割合が2倍未満(上向き矢印)か、あるいは、1/2未満(下向き矢印)かを表す。関節リウマチでは、L−グルタミン酸は対照の健常男性サンプルより血清濃度が上がったが、L−グルタミン及びL−システインは下がった。腎臓がんでは、D−セリンは健常男性サンプルより血清濃度が上がったが、D−アラニンは血清濃度が下がった。肺がんでは、D−アラニンの血清濃度が健常男性サンプルより下がった。心血管疾患では、L−アルギニンの血清濃度が健常男性サンプルより下がったが、L−グルタミン酸は上がった。多発性硬化症では、D−セリンの血清濃度が健常男性サンプルより上がったが、L−システインの血清濃度は下がった。急性骨髄性白血病では、L−システインの血清濃度は健常男性サンプルより下がった。リンパ腫では、L−システインの血清濃度は健常男性サンプルより下がった。急性リンパ性白血病では、L−グルタミン酸の血清濃度は健常男性サンプルより上がったが、L−システイン濃度は下がった。乾癬では、L−アルギニン及びL−システインの血清濃度は健常男性サンプルより下がった。糖尿病では、D−アラニン及びL−システインの血清濃度は健常男性サンプルより下がったが、L−グルタミン酸の血清濃度は上がった。なお、全身性エリテマトーテスでは、変化が認められなかった。
Claims (6)
- 被検者の血清、血漿、及び血液からなる群から選ばれる試料中のアラニンの立体異性体の量を測定するステップと、
D-アラニンの量の測定値と、健常者及び/又は糖尿病患者における血清、血漿、及び血液からなる群から選ばれる試料中の前記立体異性体の量から予め設定された基準値とを比較するステップ、
とを含むことを特徴とする、糖尿病を決定するためのサンプル分析方法。 - 前記比較ステップにおいて、被検者の立体異性体の量の測定値及び健常者の立体異性体の量の基準値を判別式:
病態指標値=(前記被検者の立体異性体の量の測定値)/(前記健常者の立体異性体の量の基準値)、又は
病態指標値=[(前記被検者の立体異性体の量の測定値)/{(前記被検者の立体異性体の量の測定値)+(前記被検者の立体異性体のエナンチオマーの量の測定値)}]÷[(健常者の立体異性体の量の基準値)/{(前記健常者の立体異性体の量の基準値)+(前記健常者の立体異性体のエナンチオマーの量の基準値)}]
に代入して病態指標値を取得し、
当該病態指標値が、所定の閾値を超えるか否かを判定するステップとを含む、請求項1に記載のサンプル分析方法。 - 前記判定するステップにおいて、所定の閾値が2.0であることを特徴とする、請求項2に記載のサンプル分析方法。
- 被検者の血清、血漿、及び血液からなる群から選ばれる試料中のアラニンの立体異性体を分離・定量する手段と、
D-アラニンの量の測定値と、健常者及び/又は糖尿病患者における血清、血漿、及び血液からなる群から選ばれる試料中の前記アミノ酸の立体異性体の量から予め設定された基準値とに基づいて糖尿病についての病態情報を出力する手段とを含むことを特徴とする、糖尿病を判定するための疾患サンプル分析装置。 - 前記疾患サンプル分析装置が、被検者の立体異性体の量の測定値及び健常者の立体異性体の量の基準値を判別式:
病態指標値=(前記被検者の立体異性体の量の測定値)/(前記健常者の立体異性体の量の基準値)、又は
病態指標値=[(前記被検者の立体異性体の量の測定値)/{(前記被検者の立体異性体の量の測定値)+(前記被検者の立体異性体のエナンチオマーの量の測定値)}]÷[(前記健常者の立体異性体の量の基準値)/{(前記健常者の立体異性体の量の基準値)+(前記健常者の立体異性体のエナンチオマーの量の基準値)}]に代入して病態指標値を取得する手段をさらに含み、
ここで、前記病態情報を出力する手段が、当該病態指標値に基づいて前記被験者の糖尿病についての病態情報を出力する、請求項4に記載の疾患サンプル分析装置。 - 前記病態情報を出力する手段が、前記病態指標値が2.0又はこれ以上のとき、前記被検者は糖尿病に罹患しているとの前記被検者の病態情報を出力する手段であることを特徴とする、請求項5に記載の疾患サンプル分析装置。
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