JP5877862B2

JP5877862B2 - Ｄａｏ１−／−マウスを活用したＤ−アミノ酸関連疾患の評価・スクリーニング方法

Info

Publication number: JP5877862B2
Application number: JP2014058226A
Authority: JP
Inventors: 健司浜瀬; 財津　潔; 潔財津; 真史三田; 豊芦田; 洋介東條
Original assignee: Kyushu University NUC; Shiseido Co Ltd
Current assignee: Kyushu University NUC; Shiseido Co Ltd
Priority date: 2008-08-26
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2016-03-08
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: US20110217707A1; EP2338988A1; EP2338988B1; WO2010024091A1; EP2338988A4; US8592642B2; JP5639890B2; JP2014132903A; CN102124103A; JPWO2010024091A1

Description

本発明は、マウスの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞に対する試験条件による影響の評価方法と、該評価スクリーニング方法を実施するための評価システムと、該評価システムを用いる医薬品及び／又は化粧料候補物質に関する。

グリシン以外の全てのアミノ酸にはＤ型とＬ型という２種類の光学異性体が存在する。Ｌ−アミノ酸は生物のタンパク質合成に用いられており、タンパク質に含まれるアミノ酸はほとんどＬ−アミノ酸である。これに対してＤ−アミノ酸は下等生物の一部の生理活性ペプチドに含まれるが、その多くは翻訳後修飾のプロセスを経て生合成される。そこで、タンパク質又はペプチドを構成するアミノ酸は主にＬ−アミノ酸であり、Ｄ−アミノ酸は例外的な存在である。

Ｄ−アミノ酸は細菌の細胞壁のペプチドグリカンの構成成分である。また、ペプチドを構成しない遊離のＤ−アミノ酸については、水棲動物や昆虫などの下等な動物において存在することは以前から報告されていた。しかし、高等動物に存在するアミノ酸はＬ型であって、Ｄ型は微量しか存在しないと信じられていた時代があった（非特許文献１）。

しかし、ヒトを含む哺乳類におけるＤ−アミノ酸の存在とその役割については、近年の光学分割法をはじめとする分析法の進歩によってようやく明らかになってきた（非特許文献２）。Ｄ−アスパラギン酸は抗Ｄ−アスパラギン酸抗体を用いた二重染色法などにより、ラット下垂体においてプロラクチン産生細胞に局在することが明らかになった。また、ラット下垂体由来の細胞株でプロラクチンを合成、分泌する細胞にＤ−アスパラギン酸を与えることによりプロラクチン分泌が用量依存的に増加した。以上のことからプロラクチン産生細胞においてＤ−アスパラギン酸がプロラクチンの分泌を制御していると考えられている（非特許文献３）。

一方、ラット精巣の静脈では他の静脈血よりも常に高濃度のＤ−アスパラギン酸が検出されていることに加え、ラット精巣から単離、精製したＬｅｙｄｉｇ細胞にＤ−アスパラギン酸を加えることによりテストステロンの合成及び分泌が用量依存的に促進されることが報告されている（非特許文献４）。

Ｄ−セリンは統合失調症に関連すると推察されているＮＭＤＡ受容体のグリシン結合部位を選択的に刺激し、グルタミン酸の本受容体を介する作用を増強することで神経伝達を促進することが報告されている（非特許文献５）。実際にＤ−セリンの投与により統合失調症が改善することや、統合失調症患者では血清中のＤ−セリン濃度が健常者よりも低いことが報告されている。

皮膚科学との関連のある知見として、Ｄ−アスパラギン酸が水晶体のようなタンパク質のターンオーバーが起こりにくい組織に存在するとの報告がある（非特許文献６）。また、Ｄ−アスパラギン酸は皮膚では老齢の被検者の日焼けした皮膚の弾性繊維には含まれるが、日焼けしていない皮膚の弾性繊維には含まれないことから、皮膚の弾性繊維におけるＤ−アスパラギン酸形成にＵＶ曝露が強い関連があることを示唆する報告がある（非特許文献７）。

しかしながらヒトを含む哺乳類におけるＤ−アミノ酸の存在及び役割を探るうえで大きい障害は、Ｄ−アミノ酸が速やかに分解されてしまうことである。Ｄ−アミノ酸の分解では、まず、Ｄ−アミノ酸がＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３、以下では「ＤＡＯ酵素」という。）によって酸化的脱アミノ化されて、対応するα−ケト酸に変換される。その後α−ケト酸はトランスアミナーゼによって対応するＬ−アミノ酸に変換される。ＤＡＯ酵素はＤ−アミノ酸だけを特異的に酸化する酵素で、腎臓その他の臓器で発現する（非特許文献８）。

ＤＡＯ酵素はマウスでは第５染色体上のＤａｏ１遺伝子にコード化されるが、この遺伝子のミスセンス突然変異体はｄｄＹマウスで報告された（非特許文献９）。この突然変異遺伝子（Ｄａｏ^ｃ又はＤａｏ^{Ｇ１８１Ｒ}）では、第１８１番目のＧｌｙ残基がＡｒｇ残基に置換されており、酵素活性を失ったタンパク質が産生される。したがってＤＡＯ酵素活性を失活した表現型は劣性遺伝する。劣性ホモ接合体の個体（以下、「ＤＡＯ酵素欠損マウス」という。）ではＤ−アラニン及びＤ−セリンの血中濃度が５ないし８倍に上昇し、運動失調（ａｔａｘｉａ）及び常套行動（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉｃｂｅｈａｖｉｏｒ）を示す（非特許文献１０）。ＤＡＯ酵素欠損マウスと他の疾患モデルマウスとの交配実験については報告がない。

Corrigan J.J.、Science 164:142-149 (1969) Hamase K, Morikawa A, and Zaitsu K. 、 J Chromatogr B 781: 73-91 (2002) D'Aniello Aら、FASEB J 14: 699-714 (2000) Nagata Yら、FEBS Lett. 444:160-164 (1999) Nishikawa T、Biol. Pharm. Bull. 28: 1561-1565 (2005) Fujii N、Biol. Pharm. Bull. 28: 1585-1589 (2005) Fujii N.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 294, 1047-1051 (2002) Hamase K., Konno R., Morikawa A. and Zaitsu K. 、Biol. Pharm. Bull. 28: 1578-1584 (2005) Konno R. and Yasumura Y.、Genetics 103: 277-285 (1983) Hashimoto A., Yoshikawa M., Niwa A. and Konno R.、Brain Res. 1033:210-215 (2005)

ＤＡＯ酵素欠損マウスと他の疾患モデルマウスとの交配実験で生産される多数の動物からＤａｏ^{Ｇ１８１Ｒ}／Ｄａｏ^{Ｇ１８１Ｒ}のホモ接合体を迅速に選別する必要がある。またＤ−アミノ酸の存在量はＬ−アミノ酸の存在量の約１％以下しかない場合があるため、微量のＤ−アミノ酸を大量のＬ−アミノ酸から分離して検出する必要がある。さらに、多数のマウス個体由来のサンプルや、多数の異なる組織由来のサンプルや、多数の試験条件に曝露されたサンプルに含まれるＤ−アミノ酸を迅速に定量測定する必要がある。

本発明はマウスの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞に対する試験条件による影響の評価方法を提供する。前記評価スクリーニング方法は、（１）Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとを用意するステップと、（２）前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞を前記試験条件に曝露するステップと、（３）前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞を前記試験条件に曝露したことによる影響を分析するステップとを含む。

本発明の評価方法において前記ステップ（１）は、Ｄａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−の遺伝子型の判定方法によって、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとを選別する場合がある。前記判定方法は、Ｄａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−の遺伝子型のマウスを個体識別するステップと、前記個体識別されたマウス個体のそれぞれから染色体ＤＮＡを抽出するステップと、前記抽出された染色体ＤＮＡのうち第７エクソンを含む領域を増幅して増幅ＤＮＡ断片を得るステップと、前記増幅ＤＮＡ断片をＨｐａＩＩ制限酵素で消化するステップと、前記増幅ＤＮＡ断片の制限酵素消化産物を分析するステップとを含む場合がある。

本発明の評価方法において前記増幅ＤＮＡ断片を得るステップは、配列番号１及び２に列挙されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することを含む場合がある。

本発明の評価方法において、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとは、他の遺伝子のうち少なくとも１個について対立遺伝子の組合せが同一である場合がある。

本発明の評価方法において、前記他の遺伝子の対立遺伝子の組合せはＨｒ^−／−を含む場合がある。

前記ステップ（３）は、前記ステップ（２）の前に、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞中のＤ−アミノ酸含有量を測定すること、前記ステップ（２）の後に、前記試験条件に曝露した後で、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞中のＤ−アミノ酸含有量を測定すること、及び、前記ステップ（２）の前に測定されたＤ−アミノ酸含有量と、前記ステップ（２）の後に測定されたＤ−アミノ酸含有量とを比較することを含む場合がある。

本発明の評価方法において、前記Ｄ−アミノ酸含有量は、光学分割カラムを用いるカラムクロマトグラフィーによって測定される場合がある。

本発明の評価方法において、前記Ｄ−アミノ酸含有量は、光学異性体を識別するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によって測定される場合がある。

本発明の評価方法によってマウスの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞に対する試験条件による影響が評価されるＤ−アミノ酸はＤ−プロリンの場合がある。

前記Ｄ−アミノ酸含有量を測定する生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞は、真皮、表皮、腎臓、膵臓、精巣、副腎、小脳、下垂体及び血清からなるグループから選択される１種または２種以上の生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞の場合がある。

本発明の評価方法によってマウスの生体組織又は該生体組織に対する試験条件による影響が評価されるＤ−アミノ酸はＤ−プロリンであり、該Ｄ−プロリンは光学分割カラムを用いるカラムクロマトグラフィーによって測定され、前記生体組織は真皮又は表皮である場合がある。

本発明は、本発明の評価方法を実施するための評価システムを提供する。前記評価システムは、Ｄａｏ１^＋／＋及びＨｒ^−／−の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−及びＨｒ^−／−の遺伝子型を有するマウスと、配列番号１及び２に列挙するヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、プロリンの光学異性体を識別する光学分割カラムとを含む。

本発明は、医薬品及び／又は化粧料の候補物質を本発明の評価システムによって評価することを特徴とする、医薬品及び／又は化粧料の候補物質のスクリーニング方法を提供する。

本明細書においてＤａｏ１と表記される遺伝子は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１というマウスの遺伝子であって、米国ジャクソン研究所のＭｏｕｓｅＧｅｎｏｍｅＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓプロジェクトのホームページ（http://www.informatics.jax.org/javawi2/servlet/WIFetch?page=markerDetail&key=7803）に詳細な説明が公開されている。Ｄａｏ１遺伝子の突然変異としてはＤａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}が知られている（http://www.informatics.jax.org/searches/allele_report.cgi?_Marker_key=7803&int:_Set_key=847160）。本発明におけるＤａｏ１⁻の遺伝子型は、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}を含むが、これに限定されない、いずれかのＤ−アミノ酸デオキシダーゼ１の酵素活性欠失突然変異アレルの遺伝子型を意味する。本発明におけるＤａｏ１^＋の遺伝子型は、Ｄ−アミノ酸デオキシダーゼ１酵素について野生型、すなわち、Ｄａｏ１遺伝子がコード化するタンパク質の第１８１番目のアミノ酸残基がグリシンである酵素と同じか、あるいは、実質的に同じであって、Ｄ−アミノ酸の分解が野生型と同じか、あるいは、実質的に同じ程度に進行するアレルの遺伝子型を意味する。

本発明におけるＤａｏ１^＋及び⁻の遺伝子型を有するマウスは、他のいずれかの遺伝子のアレルを有する場合がある。前記他の遺伝子は、ホモ接合体が特異的な表現型を有する場合もあれば、ヘテロ接合体が特異的な表現型を有する場合もある。したがって、本発明において、前記他の遺伝子のうち少なくとも１個について対立遺伝子の組合せが同一であるような条件下で、Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとでマウスの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞中のＤ−アミノ酸含有量に対する試験条件による影響の評価を行う場合がある。前記試験条件による影響は、前記他の遺伝子のうち少なくとも１個についての対立遺伝子の第１の組合せの表現形質と、該対立遺伝子の第２の組合せの表現形質とに対するＤａｏ１遺伝子型の作用の相違に対する前記試験条件による影響の場合がある。

前記他の遺伝子は、疾患モデルの表現型を示す場合の他、Ｄ−アミノ酸の合成又は分解の代謝経路に関与する遺伝子や、老化、免疫、ストレス反応、栄養、運動、感覚、記憶、行動、血液循環、消化、***、生殖その他のマウスの各臓器又は全身の健康に関係するいかなる遺伝子でも構わない。前記他の遺伝子は、例えば、肥満マウス（Ｌｅｐ^ｏｂ／Ｌｅｐ^ｏｂ）、胸腺依存性免疫不全マウス（Ｆｏｘｎ１^ｎｕ／Ｆｏｘｎ１^ｎｕ）、老化促進マウス（ＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｄＭｏｕｓｅ、ＳＡＭＰ１／ＴａＳｌｃ、ＳＡＭＰ６／ＴａＳｌｃ、ＳＡＭＰ８／ＴａＳｌｃ及び／又はＳＡＭＰ１０／ＴａＳｌｃ）関節炎自然発症マウス（Ｌａｑ１^ＭＲＬ／Ｌａｑ１^ＭＲＬ）及びへアレスマウス（Ｈｒ^ｈｒ／Ｈｒ^ｈｒ）を含むがこれらに限定されない疾患モデルマウスの原因遺伝子の場合がある。Ｈｒ遺伝子の産物は、ジョンス・ホプキンス大学のＯｎｌｉｎｅＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆＭａｎというホームページによれば、体毛形成に関与する転写因子であると考えられている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=602302）。前記ＭｏｕｓｅＧｅｎｏｍｅＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓプロジェクトのホームページによれば、マウスでは、Ｈｒ^ｈｒのようなＭＬＶプロウイルスの挿入による自然発生突然変異体の他、トランスジーンの挿入その他による偶発的に作成された突然変異体やノックアウトマウスなど、いくつかのアレルが報告されている（http://www.informatics.jax.org/imsr/fetch?page=imsrSummary&op:gsymname=%3D&gsymname=Hr&gsymnameBreadth=C）。本発明におけるＨｒ⁻の遺伝子型は、Ｈｒ^ｈｒを含むが、これに限定されない、いずれかのＨｒ遺伝子産物の機能欠損により、Ｈｒ^ｈｒのホモ接合体の成体には体毛がない遺伝子型を意味する。

本発明において、前記他の遺伝子のうち少なくとも１個について対立遺伝子の組合せが同一であるような条件下でＤ−アミノ酸含有量に対する試験条件による影響の評価を行う場合には、本発明の評価方法におけるステップ（１）では、Ｄａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−遺伝子型の判定方法に加えて、前記他の遺伝子のうち少なくとも１個について遺伝子型を判定することを含む場合がある。

本発明の評価方法におけるステップ（１）がＤａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−遺伝子型の判定方法によって選別される場合において、マウスの個体識別は、マウスの飼育ケージ及び／又はマウスの身体を標識することによって行われる。マウスの身体の標識は、耳のパンチング、高周波その他の標識用チップの体内への埋め込みその他当業者に周知のいかなる方法を用いて行っても構わない。

本発明の評価方法のステップ（１）におけるＤａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−遺伝子型の判定は、いかなる手順で行っても構わない。Ｄａｏ１遺伝子型の判定は、少量の生体組織その他の生物学的材料を各マウス個体から回収して、これに含まれるＤａｏ１遺伝子又はその遺伝子産物を解析することによって行われる。好ましいＤａｏ１遺伝子型の判定方法は、Ｄａｏ１遺伝子産物の第１８１番目のアミノ酸残基をコード化するＤａｏ１遺伝子配列を弁別することができる方法である。マウス個体からの染色体ＤＮＡ回収と、Ｄａｏ１遺伝子型の解析とは当業者に周知ないかなる方法を用いても構わない。Ｄａｏ１遺伝子型の解析には、ＰＣＲ法、ＳＭＡＰ法、ＬＡＭＰ法等の遺伝子増幅法を用いる場合がある。Ｄａｏ１遺伝子の異なる遺伝子型の弁別は、染色体ＤＮＡ又は増幅されたＤＮＡに対する特定の制限酵素の切断の有無の他、オリゴヌクレオチドプライマーの違いによる増幅の有無によって行われる場合がある。前記特定の制限酵素の切断の有無及び／又は増幅の有無は、増幅されたＤＮＡを分離したり、制限酵素消化後の染色体ＤＮＡを分離した後、前記特定の制限酵素の切断部位の切断の有無を検出可能なプローブを用いたサザンブロット法により該プローブと反応する電気泳動バンドパターンを得ることによっておこなっても構わない。好ましいＤａｏ１遺伝子の異なる遺伝子型の弁別は、以下に説明する遺伝子増幅法である。

本発明の評価方法における遺伝子増幅法によるＤａｏ１遺伝子の異なる遺伝子型の弁別は、Ｄａｏ１遺伝子の突然変異部位を制限酵素ＨｐａＩＩが認識することを利用する。図１は本発明のＤａｏ１遺伝子型の判定方法に関するヌクレオチド配列のアライメント図である。図１は、Ｄａｏ１遺伝子の染色体ＤＮＡ配列（Dao1_genomic）のうちＤａｏ１遺伝子の転写開始点から１５１１１番目の塩基と１５４６０番目の塩基との間の野生型配列（配列表の配列番号４）と、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}突然変異体における点突然変異（転写開始点から１５２２３番目のグアニンがアデニンに置換される。）を含む第７エクソン部分のｃＤＮＡの野生型配列（配列表の配列番号３の６２５番目ないし７２６番目の塩基）と、本発明の実施例で用いる遺伝子増幅用プライマー（Forward primer（配列番号１）及びReverse primer（配列番号２））と、制限酵素ＨｐａＩＩの認識配列とのアライメント結果を示す。なお、リバース・プライマー配列の逆相補体配列（Reverse primer*）を配列表に配列番号５として列挙した。図２は本発明のＤａｏ１遺伝子型の判定方法に用いるＤＮＡ領域のＨｐａＩＩ制限酵素地図である。野生型染色体ＤＮＡの第７エクソンには３カ所ＨｐａＩＩ切断部位（下向き矢印）が存在する。このうち最も５’末端側のＨｐａＩＩ認識配列（ＣＣＧＧ）は、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}突然変異型マウス染色体ＤＮＡではＣＣＡＧとなり、ＨｐａＩＩによって認識されない（＊）。第７エクソン領域は、第６イントロンに位置するフォワード・プライマー（Forward）と、第７イントロンに位置するリバース・プライマー（Reverse）とによって増幅される。野生型マウスゲノムＤＮＡ由来の増幅産物（Wild type）と、前記突然変異型マウスゲノムＤＮＡ由来の増幅産物（Dao1^G181R)とをＨｐａＩＩで消化すると、それぞれ、３カ所及び２カ所で切断される。

本発明の評価方法におけるＤ−アミノ酸含量の測定は、当業者に周知ないかなる方法を用いて実施しても構わない。例えば、予めｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−システイン（Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ）その他の修飾試薬で立体異性特異的にＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡのような分析カラムを用いて１００ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）とアセトニトリルの混液をグラジエント溶離して分離する方法が、アスパラギン酸、セリン及びアラニンのＤ型及びＬ型の同時測定に用いることができる。また、予め４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）のような蛍光試薬でＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ、ＭｉｇｈｔｙｓｉｌＲＰ−１８ＧＰ等のような分析カラムを用いて立体異性非特異的に各アミノ酸を分離した後、Ｐｉｒｋｌｅ型キラル固定相カラム（例えばＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−２５００Ｓ又はＲ）を用いて光学分割して立体異性特異的に分離する方法が、プロリン、ロイシンその他のアミノ酸の微量測定に用いることができる（浜瀬健司及び財津潔、分析化学、５３巻、６７７−６９０（２００４））。本明細書における光学分割カラム系とは、少なくとも光学分割カラムを用いる分離分析系をいい、光学分割カラム以外の分析カラムによる分離分析を含む場合がある。代替的には、アミノ酸の光学異性体を識別するモノクローナル抗体、例えばＤ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン酸等に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によってＤ−アミノ酸を定量することができる（特願２００８−２７６５０明細書）。

本発明における試験条件とは、被験動物に全身的又は局部的に物理的、化学的及び／又は生物学的な処理条件をいう。前記物理的な処理には、紫外線及び赤外線を含む光線や電磁波、音響、振動及び無重力を含む加速度、温度、温水又は冷水による水浴、乾燥又は湿潤等を含むがこれらに限定されない。化学的な処理には、水素イオン、無機物質及び／又は有機物質の適用を含むがこれらに限定されない。生物学的な処理には、食餌、水等の摂取、明暗周期、ケージ面積、ケージの種類、同一ケージに飼育する動物個体数その他の飼育環境、薬物の投与等を含むがこれらに限定されない。本発明における試験条件は、前記のいずれかの処理又はその組合せの場合があり、それぞれの処理を連続的及び／又は断続的に施す場合がある。

本発明の評価方法におけるＤ−アミノ酸含量の測定において、「前記ステップ（２）の後に、前記試験条件に曝露した後で、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞中のＤ−アミノ酸含有量を測定すること」は、前記試験条件への曝露が終了した後にＤ−アミノ酸含有量を測定する場合と、前記試験条件への曝露の途中でＤ−アミノ酸含有量を測定する場合とを含む。

本発明の評価方法によると、Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとに由来する生体組織又は該生体組織由来の培養組織細胞のさまざまな特性に対する前記試験条件による影響を評価することができる。かかる特性は、Ｄ−アミノ酸含有量の変動と、Ｄ−アミノ酸と代謝経路で関連する他の物質、例えば、Ｌ−アミノ酸、αケト酸等の含有量の変動と、これらの物質の代謝、消化吸収、分解***に関係する消化器、肝臓、腎臓、循環器等の生理的及び／又は病理的特性との他、花粉、ハウスダストその他に対するアレルギー、アトピー、皮膚その他の臓器の移植免疫を含むがこれらに限定されない免疫に関連する特性の変動と、微生物の感染又は微生物との共生に関連する特性の変動と、行動、記憶、感覚その他の神経生物学的な特性の変動と、癌及び／又は細胞増殖の亢進及び／又は抑制に関連する特性の変動と、皮膚その他の臓器における加齢に関する特性、例えば、シワ、脱毛等に関する特性と、保湿性、バリア特性、その他の皮膚の健康及び／又は美容に関連する特性とに対する前記試験条件による影響を評価することができる。

本発明のＤａｏ１遺伝子型の判定方法に関するヌクレオチド配列のアライメント図。本発明のＤａｏ１遺伝子型の判定方法に用いるＤＮＡ領域のＨｐａＩＩ制限酵素地図。Ｄａｏ１酵素活性から確認済みのＤａｏ１^＋／＋ホモ接合体マウス（第１レーン）、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}ホモ接合体マウス（第４レーン）及びＤａｏ１^{＋／Ｇ１８１Ｒ}Ｆ１世代へテロ接合体マウス（第２及び３レーン）の染色体ＤＮＡ由来の増幅産物のＨｐａＩＩ分解断片の電気泳動パターン。へアレスマウス（Ｈｒ^ｈｒ／Ｈｒ^ｈｒ、Ｄａｏ１^＋／＋）と、Ｄａｏ１酵素欠損マウス（Ｈｒ^＋／＋、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}）の交配のＦ２世代でヘアレス表現型を有するＦ２世代のマウス個体１２匹の染色体ＤＮＡ由来の増幅産物のＨｐａＩＩ分解断片の電気泳動パターン。プロリン及び４−ヒドロキシプロリンの光学異性体。プロリン及び４−ヒドロキシプロリンの光学異性体を同時に分析するシステムのカラム流路図。プロリン及び４−ヒドロキシプロリンの光学異性体を同時に分析するシステムの第１及び第２カラムの溶出パターンの波形図（Ｄ１及びＤ２）。Ｄａｏ１遺伝子の野生型ホモ接合体マウス（Ｄａｏ１^＋／＋）血清中のＬ−型及びＤ−型プロリンの光学分割カラムの溶出パターン。Ｄａｏ１酵素活性欠損型ホモ接合体マウス（Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}）血清中のＬ−型及びＤ−型プロリンの光学分割カラムの溶出パターン。遺伝子型がＤａｏ１^＋／＋及びＤａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}と判定された個体のさまざまな臓器でのＤ−プロリン存在量を示す棒グラフ。真皮におけるＤ−プロリン存在量を比較した棒グラフ。Ｄａｏ１酵素欠損マウスにおける腫瘍細胞の増殖を検討した棒グラフ。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によって限定されるものであって、本発明の実施例は例示にすぎない。

Ｄａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−遺伝子型の判定方法の開発
Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}は、配列番号３に列挙するＤａｏ１遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列のうち第６６１番目のグアニンがアデニンに置換される突然変異である。そのため、野生型では制限酵素ＨｐａＩＩの切断配列（Ｃ↓ＣＧＧ）になるのに対し、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}突然変異体ではＣＣＡＧとなり切断されない。ここで突然変異部位を含む第６２５−７２６番目のヌクレオチドは第７エクソンに含まれるから（ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号ＮＭ＿０１００１８．２）、染色体ＤＮＡでもＨｐａＩＩ切断部位の有無によって野生型か突然変異型かを識別することができる。

離乳後のマウスを個体識別したうえ、各マウス個体の尾から市販の哺乳類ゲノムＤＮＡミニプレップキット（シグマ、Ｇ１Ｎ７０−１ＫＴ）を用いて染色体ＤＮＡを抽出・精製した。フォワード・プライマーとして第６イントロンに位置する配列番号１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを用い、リバース・プライマーとして第７イントロンに位置する配列番号２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。市販の反応混合液（プロメガ、Ｍ７１２２）を用いて、（１）９４°Ｃ、４分間、１回、（２）９４°Ｃ、３０秒間、５５°Ｃ、３０秒間、７２°Ｃ３０秒間、４０回、（３）７２°Ｃ、１０分間、１回（４）４°Ｃ、保存という熱サイクル設定でマウス染色体ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応産物は、市販のキット（キアゲン、２８１０４）を用いて精製され、ＨｐａＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ、ＨＰＡ２０１）存在下で３７°Ｃ、３時間インキュベーションして制限酵素処理された。７０°Ｃ、５分間の加熱により制限酵素を不活性化させた後、市販の電気泳動マイクロチップ（アジレント、２１００バイオアナライザ）によりＤＮＡ断片の長さを分析した。

図３−１は、Ｄａｏ１酵素活性から確認済みのＤａｏ１^＋／＋ホモ接合体マウス（第１レーン）、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}ホモ接合体マウス（第４レーン）及びＤａｏ１^{＋／Ｇ１８１Ｒ}Ｆ１世代へテロ接合体マウス（第２及び３レーン）の染色体ＤＮＡ由来の増幅産物のＨｐａＩＩ分解断片の電気泳動パターンである。図３−１からわかるとおり、Ｄａｏ１^＋遺伝子の染色体ＤＮＡからは９５ｂｐのＤＮＡ断片が得られ、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ}遺伝子の染色体ＤＮＡからは１０７ｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、野生型ホモ接合体、突然変異型ホモ接合体及びへテロ接合体は明瞭に判別できた。図３−２は、へアレスマウス（Ｈｒ^ｈｒ／Ｈｒ^ｈｒ、Ｄａｏ１^＋／＋）と、Ｄａｏ１酵素欠損マウス（Ｈｒ^＋／＋、Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}）の交配のＦ２世代でヘアレス表現型を有するＦ２世代のマウス個体１２匹についてＤａｏ１遺伝子判定を行った結果である。表１はヘアレス表現型を有するＦ２世代のマウス個体１３８匹についてのＤａｏ１遺伝子型及び性別を整理した表である。

Ｆはメス、Ｍはオスである。

以上のとおり、本判定方法により、多数のマウス個体のＤａｏ１遺伝子型を速やかに判定することが可能になった。

プロリン及び４−ヒドロキシプロリンの光学異性体の定量分析方法の開発
プロリン及び４−ヒドロキシプロリンは皮膚コラーゲンに多く含まれる。そこでプロリン及び４−ヒドロキシプロリンの両方について同時に全ての光学異性体を分離して定量的に分析することができる方法を開発した。

図４−１は、プロリン及び４−ヒドロキシプロリンの光学異性体を示す。プロリンの光学異性体はＬ−型かＤ−型かの２種類だけだが、４−ヒドロキシプロリンの光学異性体は、Ｌ−型かＤ−型かの違いに加えて、トランス型かシス型かの違いにより合計４種類ある。まず、蛍光試薬ＮＢＤ−Ｆでアミノ酸を誘導体化して蛍光標識した。その後、図４−２に示すように第１カラムで逆相分離クロマトグラフィを行い、トランス−４−ヒドロキシプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン及びプロリンの各ピークを検出した。そして、前記各ピークの分画をカラムスイッチングバルブを用いて分取して第２カラムに導いて光学分割クロマトグラフィを行った。

図５の１Ｄの波形図は流速４０μＬ／分の溶媒を用いたモノリシックＯＤＳカラムの溶出パターンを４７０ｎｍの励起光を照射して５３０ｎｍの蛍光発光で検出したものである。２Ｄの波形図は、１Ｄの溶出パターンのトランス−４−ヒドロキシプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン及びプロリンの各ピークを自動的に検出してバルブ切り替えを行って各ピークの分画だけをＱＮ−２−ＡＸカラムに導いて光学分割クロマトグラフィを行った結果である。

図６−１の波形図は、Ｄａｏ１遺伝子の野生型ホモ接合体マウス（Ｄａｏ１^＋／＋）血清中のＬ−型及びＤ−型プロリンの光学分割カラムの溶出パターンであり、図６−２の波形図は、Ｄａｏ１酵素活性欠損型ホモ接合体マウス（Ｄａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}）血清中のＬ−型及びＤ−型プロリンの光学分割カラムの溶出パターンである。Ｄ−プロリンはＤａｏ１野生型ホモ接合体マウスではほとんど検出できなかったが、Ｄａｏ１酵素活性欠損型ホモ接合体マウスでは明確に検出することができた。

図７−１は実施例１で判別されたヘアレスマウスとＤａｏ１酵素活性欠損マウスの交配のＦ２世代のヘアレスマウスのうち、遺伝子型がＤａｏ１^＋／＋及びＤａｏ１^{Ｇ１８１Ｒ／Ｇ１８１Ｒ}と判定された個体のさまざまな臓器でのＤ−プロリン存在量を比較した結果であり、図７−２は真皮におけるＤ−プロリン存在量を比較した結果である。図７−１のグラフの縦軸の単位は、血清についてはｐｍｏｌ／μＬ、その他の組織ではｐｍｏｌ／ｍｇであった。図７−２のグラフの縦軸の単位はｎｍｏｌ／μｇＤＮＡであった。ともに、それぞれ５匹のマウスの臓器の測定値の平均と標準誤差（ＳＥ）を表す。血清の他、下垂体、副腎、膵臓及び真皮においてもＤａｏ１酵素活性欠損マウスでは野生型マウスより数倍以上多くのＤ−プロリンが存在した。また、Ｄａｏ１酵素活性野生型マウスの小脳、腎臓及び肝臓ではＤ−プロリンはほぼ検出されなかったがＤａｏ１酵素活性欠損マウスではＤ−プロリンが明確に検出された。Ｄａｏ１酵素活性欠損マウスの精巣におけるＤ−プロリン量は野生型マウスに比べて少し多いだけで顕著な差がみられなかった。皮膚においてもＤａｏ１酵素活性欠損マウスではＤ−アミノ酸含量が野生型より多いことは今回初めて明らかになった。今後皮膚におけるＤ−アミノ酸含量への紫外線照射や加齢による影響が明らかにされる。なお、今回の分析では、Ｄ−４−ヒドロキシプロリンの含有量についてはシス−異性体及びトランス−異性体のいずれも全組織において検出限界以下であった。

Ｄａｏ１酵素欠損マウスにおける腫瘍増殖
ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒＳａｒｃｏｍａ１８０株の肉腫細胞は１０％ウシ胎児血清（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット＃３００Ａ８０６０１）添加ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地を用いて５％ＣＯ_２、３７°Ｃの加湿条件下で培養した。１ｘ１０^７個／ｍＬの懸濁液を調製し、Ｄａｏ１酵素欠損マウス又は野生型マウスの右後肢フットパットの０．０５ｍＬずつ皮内注射により移植した。移植後１週間ごとに腫瘍の長径、短径及び厚みをノギスで計測し、以下の式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）ｘ短径（ｍｍ）ｘ（厚み（ｍｍ）−３）
ここで厚みはもともとの足の厚みを３ｍｍとしてその差を腫瘍の厚みとした。

結果は図８に示す。図８は、Ｄａｏ１酵素欠損マウスと対照マウスとについて、移植後１、２及び３週間経過時の腫瘍体積の変化を比較した棒グラフである。対照マウスでは移植後１週間ですでに６０ｍｍ^３の腫瘍体積が３週間で２倍に増加していたのに対し、Ｄａｏ１酵素欠損マウスでは、移植後１週間では腫瘍体積が約２０ｍｍ^３しかなく、２週間では５ｍｍ^３程度まで減少し、３週間では完全に消失した。この結果から、Ｄａｏ１酵素欠損マウスでは移植された腫瘍の増殖を抑制し腫瘍を消失させる活性があることが明らかになった。

今回確立されたヘアレスマウスとＤａｏ１酵素欠損マウスとの交配実験系は、エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、関節リウマチ等の膠原病又は膠原病類縁疾患と、糖尿病と、光線皮膚炎と、接触皮膚炎と、じょく瘡と、しみ、くすみ、しわ、たるみ等のその他の皮膚所見とについてＤ−アミノ酸の果たす役割を解明するために今後大いに利用されることが期待される。

Claims

（１）Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとを用意するステップと、
（２）前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織に腫瘍を移植するステップと、
（３）前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織に腫瘍を移植したことによる影響を分析するステップとを含む、マウスの生体組織に対する腫瘍移植による、病理的特性、癌及び/又は細胞増殖の亢進及び/又は抑制に関連する特性、D-アミノ酸含有量の変動からなる群から選ばれる１以上の影響の評価方法。
前記ステップ（１）は、Ｄａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−の遺伝子型のマウスを個体識別するステップと、前記個体識別されたマウス個体のそれぞれから染色体ＤＮＡを抽出するステップと、前記抽出された染色体ＤＮＡのうちＤａｏ１遺伝子の第７エクソンを含む領域を増幅して増幅ＤＮＡ断片を得るステップと、前記増幅ＤＮＡ断片をＨｐａＩＩ制限酵素で消化するステップと、前記増幅ＤＮＡ断片の制限酵素消化産物を分析するステップとを含む、Ｄａｏ１^＋／＋、^＋／−及び／又は^−／−遺伝子型の判定方法によって、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとを選別することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の評価方法。
前記増幅ＤＮＡ断片を得るステップは、配列番号１及び２に列挙されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することを含むことを特徴とする、請求項２に記載の評価方法。
前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとは、他の遺伝子のうち少なくとも１個について対立遺伝子の組合せが同一であることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の評価方法。
前記他の遺伝子の対立遺伝子の組合せはＨｒ^−／−を含むことを特徴とする、請求項４に記載の評価方法。
前記ステップ（３）は、前記ステップ（２）の前に、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織中のＤ−アミノ酸含有量を測定すること、前記ステップ（２）の後に、前記試験条件に曝露した後で、前記Ｄａｏ１^＋／＋の遺伝子型を有するマウスと、前記Ｄａｏ１^−／−の遺伝子型を有するマウスとの生体組織中のＤ−アミノ酸含有量を測定すること、及び、前記ステップ（２）の前に測定されたＤ−アミノ酸含有量と、前記ステップ（２）の後に測定されたＤ−アミノ酸含有量とを比較することを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の評価方法。
前記Ｄ−アミノ酸含有量は、光学分割カラム系を用いるカラムクロマトグラフィーによって測定されることを特徴とする、請求項６に記載の評価方法。
前記Ｄ−アミノ酸含有量は、光学異性体を識別するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によって測定されることを特徴とする、請求項６に記載の評価方法。
前記Ｄ−アミノ酸はＤ−プロリンであることを特徴とする、請求項６ないし８のいずれかに記載の評価方法。
前記Ｄ−アミノ酸含有量を測定する生体組織は、真皮、表皮、腎臓、膵臓、精巣、副腎、小脳、下垂体及び血清からなるグループから選択される１種または２種以上の生体組織であることを特徴とする、請求項６ないし９のいずれかに記載の評価方法。
前記Ｄ−アミノ酸はＤ−プロリンであり、該Ｄ−プロリンは光学分割カラムを用いるカラムクロマトグラフィーによって測定され、前記生体組織は真皮又は表皮であることを特徴とする、請求項１０に記載の評価方法。
Ｄａｏ１^＋／＋及びＨｒ^−／−の遺伝子型を有するマウスと、Ｄａｏ１^−／−及びＨｒ^−／−の遺伝子型を有するマウスと、配列番号１及び２に列挙するヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、プロリンの光学異性体を識別する光学分割カラム系と、腫瘍細胞とを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の評価方法を実施するための評価システム。
医薬品の候補物質を投与後において、請求項１２に記載の評価システムによって、マウスの生体組織に対する腫瘍移植による病理的特性、癌及び/又は細胞増殖の亢進及び/又は抑制に関連する特性、Ｄ−アミノ酸含有量の変動からなる群から選ばれる１以上の影響を評価することによる、医薬品の候補物質のスクリーニング方法。