JP6209062B2 - 抗菌性ペプチドの分泌促進剤 - Google Patents
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Description
近年高齢者の間で、免疫の低下に伴う常在菌による感染症が問題となっている。常在菌は所謂多剤耐性株が多く、いったん老人介護施設などで多剤耐性菌の感染患者が発生すると効果的な治療手段がなく、施設内で多数の患者が連鎖的に発生し、状況によっては施設の閉鎖や患者の隔離などが必要になってくる。このため、多剤耐性菌に対する対策は大きな社会問題となっている。
このため、インターフェロン類やインターロイキン類の分泌を誘導する多糖や糖タンパク質などを投与して、生体の免疫システムを増強する治療や予防方法が提案されているが、あまり効果はあがっていない。
ところで動物、植物、昆虫、酵母、乳酸菌などのさまざまな生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備わっている。このような外来からの進入を防御するために、アミノ酸が10数個〜50数個程度からなる抗菌性ペプチドを生物自らが産生していることが明らかになっている。これらの抗菌性ペプチドは、細菌、真菌などに対して幅広い範囲の抗菌スペクトルを有しているとともに、生物自らが産生していることから生体に対しては副作用も生体機能の阻害作用も有していない。
現在も日常で簡便に使用できる抗菌性ペプチドの誘導剤の探索が行われている。
しかしε−ヴィニフェリンが生体内でディフェンシンのような抗菌性ペプチドを分泌促進することは知られていない。
(1)ε−ヴィニフェリンを有効成分とするα−ディフェンシン分泌促進剤。
(2)ε−ヴィニフェリンを有効成分とする腸管内細胞の産生するα−ディフェンシン分泌促進剤。
(3)経口剤である(1)又は(2)に記載のα−ディフェンシン分泌促進剤。
ε−ヴィニフェリンは、ブドウの葉、新芽、果皮等に存在するポリフェノールの一種で、スチルベン系化合物である。
ε−ヴィニフェリンは、有機化学的または微生物を用いて合成した高純度品の他、上述のブドウなどの植物体から抽出することもでき、その場合、抽出物を用いてもよく、またはその抽出物から単離したε−ヴィニフェリンを含有する複合物を用いても良い。天然物としては、ε−ヴィニフェリンの含有量があきらかになっているものであればよく、例えば、公知のブドウ、落花生、およびイタドリやツルドクダミ等のタデ科植物等からの抽出物を利用しても良い。
また、ワイン、ワインの濃縮物または濃縮乾固した固形物中にも含まれているので、それらを用いることもできる。また、ワイン製造時に発生するブドウの残渣をそのまま用いるか、それから上記抽出方法と同様にして抽出することもできる。有機溶剤としてはエタノール等のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。
摂取(投与)量は、摂取(投与)方法と、対象者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、成人では通常1日に体重1kg当たり有効成分として0.1〜600mgが適当である。
<ディフェンシン分泌試験>
1.試験方法
1)試験試料
精製レスベラトロール、発芽玄米由来ステロール配糖体、ε−ヴィニフェリンの3物質についてα−ディフェンシン分泌促進試験を実施した。
試験試料であるレスベラトロールは、合成t-Resveratrol(和光純薬工業株式会社)を、ε−ヴィニフェリンは、精製ε-Viniferin(和光純薬工業株式会社)をそれぞれ用い、ステロール配糖体は、発芽玄米より抽出したものを用いた。
7週齢のICRマウス12匹を、1週間の予備飼育を行った後、体重を勘案して、(1)通常食群、(2)高脂肪食群(HF)、(3)高脂肪食+レスベラトロール摂取群(HF+レスベラトロール)、(4)高脂肪食+ヴィニフェリン摂取群(HF+ヴィニフェリン)の4群に群分けを行った。試験品は飼料に添加した。
マウスは一群3匹として、それぞれ個別飼育(1匹/ケージ)とした。なお合成レスベラトロールはインビトロ試験で腸管由来のパネト細胞からα−ディフェンシンを分泌促進することが確認されている。
それぞれの被験物質を混込した飼料を自由摂取させた。なお飼育を開始する前日24時間(10:00〜翌10:00)の採糞を行った(Preサンプル)。その後、各試験飼料を摂取させた。
(1)通常食群はAIN93G飼料(オリエンタル酵母社製 脂質含有量:7%)、(2)高脂肪食群はAIN93G飼料(脂質含有量:30%)、(3)HF+レスベラトロール群は高脂肪AIN93G飼料+レスベラトロール0.1%(脂質含有量:30%)、(4)HF+ヴィニフェリン群は、高脂肪AIN93G飼料+ヴィニフェリン0.1%(脂質含有量:30%)として、自由摂取で、1週間飼育した。
群分け時及び試験終了時に、体重測定を行い、また摂餌量の測定は、毎日実施した。1週間の飼育期間終了後に、再度、24時間(10:00〜翌10:00)の採糞を行った(Postサンプル)。得られた糞については、ELISAによる測定まで、-20℃にて保存した。
採取した糞(10mg)は、乾燥後、ステンレスビーズとともに破砕(10分)し、粉末化の後、PBS(100ml)を加え、1時間4℃にて振盪撹拌し、20,000g、20分間遠心分離後の上清を測定用サンプルとした。
クリプチジン(Cryptdin)−1およびクリプチジン(Cryptdin)−4をα−ディフェンシンの代表として選択し、ELISA法により測定した。
測定用の特異的サンドイッチELISA法は「Analytical Biochemistry 443 (2013) 124-131」に開示されている方法に従って、概略以下のごとく測定した。
下記の、クリプチジン−1及びクリプチジン−4の特異的アミノ酸配列を選択し、これらの合成ペプチドを用いて、SDラットを免疫し、10日後にこのラット由来のリンパ球とマウス・ミエローマとをハイブリダイズすることにより抗体産生ハイブリドーマを得た。このハイブリドーマを常法によりSDラットの腹腔内で培養し、腹水液を採集して、補足用と検出用の異なる特異的抗クリプチジンモノクロナール抗体を得た。
得られた抗体の中から選択したクリプチジン捕捉用抗体(30mg/ml)を100μlを用いて、4℃で1晩かけてマイクロタイター・プレートに固相化した。次いで、PBS−Tで洗浄し、さらに25%のブロックエース(DSバイオケミカル製)200μlでブロッキング処理を行った。
前記の測定用サンプル100μlを各ウエルに添加し、25℃で1時間インキュベーションした。その後PBS−Tで洗浄し、0.5μg/mlの検出用抗体100μl添加し25℃で1時間インキュベートした。5000倍希釈したストレプトアビジン−HRP複合体(GEヘルスケアサイエンス製)を100μl添加し25℃で30分インキュベートし、0.6N硫酸水溶液を100μl添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。
クリプチジン−1、クリプチジン−4を0.02〜5ng/mlの濃度系列になるように希釈した溶液を同様に測定して検量線を作製した。
クリプチジン−1:Leu Arg Asp Leu Val Cys Tyr Cys Arg Ser Arg Gly Cys Lys Gly Arg Glu Arg Met Asn Gly Thr Cys Arg Lys Gly His Lue Leu Tyr Thr Leu Cys Cys Arg(配列表配列番号1)
クリプチジン−4:Gly Leu Leu Cys Tyr Cis Arg Lys Gly His Cys Lys Arg Gly Glu Arg Val Arg Gly Thr Cys Gly Ile Arg Phe Leu Tyr Cys Cys Pro Arg Arg(配列表配列番号2)
マウスのα−ディフェンシンはクリプチジンとも呼ばれる。クリプチジンは、基本骨格が共通するが、N末端、C末端の構造の変化によるなどの複数のアイソマーが存在する(クリプチジン−1〜クリプチジン−6)。本実施例では24時間中の糞中に排出されるCryptdin(クリプチジン)−1とCryptdin−4を代表的なクリプチジンとして測定し、3匹の測定結果の平均の濃度から、試験品投与前(Preサンプル)に対する投与後(Postサンプル)の%を求め、図1(Cryptdin−4)、図2(Cryptdin−1)に示した。なおクリプチジン−4は、ディフェンシンファミリーの中で、非共生細菌に対しもっとも強力な抗菌作用を有しているといわれている。
糞中のα−ディフェンシンとしてクリプチジン−4及びクリプチジン−1を測定したところ、ヴィニフェリン投与群(HF+ヴィニフェリン)は投与前の量に比較してクリプチジン−4は1000%以上、クリプチジン−1は450%以上増加した。
またインビトロ試験ではα−ディフェンシンをパネト細胞に分泌させることが確認できていたレスベラトロールはほとんど投与前後の差が認められなかった。
以上の試験結果からε−ビニフェリンは経口投与によって、腸管内への抗菌ペプチド分泌促進剤として有用であることが判明した。また腸内感染などの予防に使用可能である。
処方例1
[カプセル剤]
組成
ブドウ抽出精製ε−ヴィニフェリン …100mg
ミツロウ … 10mg
ぶどう種子オイル …110mg
上記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。
[錠剤]
組成
ブドウ抽出精製ε−ヴィニフェリン…150mg
セルロース … 80mg
デンプン … 20mg
ショ糖脂肪酸エステル … 2mg
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。
Claims (3)
- ε−ヴィニフェリンを有効成分とするα−ディフェンシン分泌促進剤。
- ε−ヴィニフェリンを有効成分とする腸管内細胞の産生するα−ディフェンシン分泌促進剤。
- 経口剤である請求項1又は2に記載のα−ディフェンシン分泌促進剤。
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