KR101534498B1

KR101534498B1 - 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물

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Publication number: KR101534498B1
Application number: KR1020120131908A
Authority: KR
Inventors: 유은숙; 강나진; 현은아; 강희경; 고영상; 현진원; 이남호; 고미희
Original assignee: 제주대학교 산학협력단; 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2015-07-09
Also published as: KR20140064505A

Abstract

본 발명은 항염 활성을 갖는 단빅 추출물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 단박 추출물은 산화질소(nitric oxide: NO) 생성 억제, 염증성 사이토카인 생성 억제, 염증성 케모카인 생성 억제, 프로스타글란딘 E2의 생성억제 및 STAT1의 인산화억제를 모두 가지고 있어 염증을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 독성을 유발시키지 않는 체내 안전한 물질로서, 염증 질환 치료를 위한 의약품 및 건강기능성 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the extract of Ceramium boydenii for preventing and treating inflammatory diseases}

본 발명은 단박(Ceramium boydenii Gepp) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 프로스타글라딘(prostaglandins), 하이드록시에이코사테트라에노익에시드(hydroxyeicosa tetra-enoic acid), 류코트리엔 (leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과정이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증반응은 오히려 점막 손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 일으킨다(Willoughby, D. A., Ann. Rheum. Dis., 34(6) 471, 1975).

또한, 내독소로 잘 알려진 지질다당류(Lipopolysaccharides, LPS)는 그람-음성 박테리아의 세포외막에 존재하며, 대식세포(macrophage) 또는 단핵세포(monocyte)에서 산화질소(nitric oxide), 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines), 프로스타글란딘 E2와 같은 다양한 전구염증성 인자들을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Lee et. al., Bio. Pharm. Bull. 27(5), 617, 2004)

다양한 염증 질환 중에서 대표적인 피부 염증 질환인 아토피성 피부염은 현대의 도시 주거 환경오염으로 인한 환경적 요인이 더 많은 것으로 알려지고 있으며, 흔히 태열이라고 말하는 유아 습진으로 시작하여 만성적, 재발성인 경과를 보이는 만성 피부질환이다. 케모카인은 아토피피부염에서 염증세포 침윤의 가장 중요한 역할을 담당한다. 아토피피부염 환자의 혈청 내에서 다양한 종류의 케모카인들이 증가된다는 여러 보고가 있는데(Y. Shimada et al., J. Dermatol . Sci ., 34, 201-208, 2004; D. Hijnen et al., J. Allergy Clin . Immunol .. 113(2) 334-340, 2004; J. Nakazato et al., Pediatr Allergy Immunol., 1-9, 2008), 이는 시험관내 실험과 아토피피부염 동물 모델(NC/Nga 마우스)을 사용한 연구에서도 특정 케모카인의 증가됨을 보고한 연구결과가 있다(Fujisawa et al., J. Allergy Clin . Immunol .. 110(1), 139-146, 2002; H. Furukawa et al., J. Dermatol . Sci ., 36, 165-172, 2004; Leung et al., Pediatr . Allergy Immunol ., 14, 296-301, 2003; Jahns-Rozyk et. al., Allergy, 60, 685-688, 2005). 이를 바탕으로 혈청이나 병변조직에서 나타나는 특정 케모카인을 찾아 향후 아토피성 피부염 관련연구에서 표적인자로 사용할 수 있는 가에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 이런 케모카인들 중에 특히 MDC(Macrophage-derived chemokine)는 CC 케모카인 수용체 4(CCR4)와 결합하며, 이들 간의 결합은 Th2세포가 염증조직으로 이동해 가는데 중요한 역할을 한다. MDC의 혈청 농도가 아토피성 피부염과 같은 Th2세포 관련 피부질환과 밀접한 상관관계가 있다고 보고되었다. 즉, 아토피성 피부염 환자의 혈청에는 MDC의 농도가 높으며 사이크로스포린 A를 투여한 치료나, 국소용 코르티코스테로이드를 사용한 치료에서 MDC 농도는 현저히 감소하고 질환은 호전됨이 증명되었다(Hijnen et. al., J. Allergy Clin. Immunol.. 113(2) 334-340).

또한, MDC 생성을 유도하는 신호전달경로로서 STAT 경로가 중요하다고 알려진 바 있는데, 세포 신호전달 단백질인 STAT 1(Signal transducer and activator of transcription 1)은 인터페론(IFN-γ) 및 LPS에 반응하는 Jak 단백질(Janus kinases)에 의해 발현하는 세포질 내 전사인자이다(Han et al, Gamma irradiation-reduced IFN-γ expression, STAT1 signals, and cell-mediated immunity, J Biochem Mol Biol, 35(6), 583-589, 2002). Jaks은 사이토카인(cytokine)이나 인터페론(IFNs) 수용체(receptor)의 세포막 가까이에 존재하면서 사이토카인이나 인터페론의 신호전달에 관계하는 단백질 티로신 키나아제(protein tyrosine kinases)로서, 인터페론이 세포막에 있는 인터페론 수용체(IFNs receptor)에 결합을 하면, 수용체의 세포질 영역의 타이로신 영역(tyrosine motifs)과 그와 관련된 단백질들이 인산화(phosphorylate) 되면서 순차적인 신호전달이 시작된다. 세포질 내 영역에서 STAT이 인산화 되면 핵 내로 이동하고, 특정 DNA 부분에 결합하여 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine)과 같은 염증인자의 발현을 조절하게 된다고 알려져 있다(Strobl et al., A completely foreign receptor can mediate an interferon-γ-like response. EMBO, 20(19), 5431-5442, 2001; Ivashkiv and Hu, Signaling by STATs, Arthritis res, 6, 159-168, 2004; Best et al., Inhibition of interferon-stimulated JAK-STAT signaling by a tick-borne flavivirus and identification of NS5 as an interferon antagonist. J virol, 79(20), 12828-12839, 2005)

한편, 단박(Ceramium boydenii)은 홍조 식물문 비단풀과로 우리나라에는 서남 해안과 제주도에 분포하고, 조간대의 모자반류나 다른 해조에 착생하여 서식하며, 채집하여 한천원료로 사용된다(한국동실물도감 제 8권 식물편(해조류) 교육과학기술부). 이러한 단박에 대한 의약학적인 용도로 알려진 바에 의하면 비만과 당뇨를 예방 및 치료할 수 있다는 내용에 대해 알려져 있다.

그러나, 현재까지 단박 추출물이 염증성 질환의 치료 용도로 사용될 수 있다는 연구에 대해서는 보고된 바가 없다.

한국공개특허 제2008-0091651호

이에 본 발명자들은 천연인 단박(Ceramium boydenii) 추출물이 항염 활성이 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단박 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단박 추출물은 70% 에탄올을 이용하여 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단박 추출물은 10~100ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단박 추출물은 산화질소(nitric oxide: NO) 생성 억제, 염증성 사이토카인 생성 억제, 염증성 케모카인 생성 억제, 프로스타글란딘 E2의 생성억제 및 STAT1의 활성 억제를 통해 항염 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 관절염, 류머티즘성 관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 동맥경화증, 염증성 내장 질병, 궤양성 대장염, 골다공증, 크론(Crohn) 병, 뇌척수염, 수막염, 췌장염, 복막염, 골수염, 뇌염, 뇌막염, 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 맥관염, 임파구 맥락수막염, 사구체신염, 포도막염, 회장염, 간 염증, 신장 염증, 천식, 통증, 패혈성 쇼크, 국소 빈혈, 궤양, 다중경화증, 경화증, 출혈성쇼크, 아나필락틱 쇼크, 화상, 감염, 박테리아성 감염, 비루스성 감염, 진균성 감염 및 기생성감염, 건선, 아토피성피부염, 레이슈마니아증, 주혈흡충증, 혈액투석증, 발작, 심폐 혈관이식, 국소 빈혈, 재환류 질환, 혈색소증, 혈색소병증, 당뇨병, 알츠하이머(Alzheimer) 병, 파킨슨(Parkinson) 병, 타가이식거부증 및 자가면역질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단박 추출물은 70% 에탄올을 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단박 추출물은 조성물에 10~100ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 단박 추출물은 산화질소(nitric oxide: NO) 생성 억제, 염증성 사이토카인 생성 억제, 염증성 케모카인 생성 억제, 프로스타글란딘 E2의 생성억제 및 STAT1의 활성 억제를 모두 가지고 있어 염증을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 독성을 유발시키지 않는 체내 안전한 물질로서, 염증 질환 치료를 위한 의약품 및 건강기능성 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 LPS로 자극된 대식세포주 RAW264.7 및 IFN-γ와 TNF-α로 자극된 사람 각질형성세포주 HaCaT 세포에 대한 단박 추출물의 세포 생존능을 확인한 결과이다.
도 2는 LPS로 자극된 대식세포주 RAW264.7 에서의 NO 생성에 대한 단박 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 LPS로 자극된 대식세포주 RAW264.7 에서의 IL-6 생성에 대한 단박 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 LPS로 자극된 대식세포주 RAW264.7 에서의 PGE2 생성에 대한 단박 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 IFN-γ와 TNF-α로 자극된 사람 각질형성세포주 HaCaT 세포에서 MDC생성에 대한 단박 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 IFN-γ와 TNF-α로 자극된 사람 각질형성세포주 HaCaT 세포에서 STAT1 인산화에 대한 단박 추출물의 효과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

홍조류인 단박(Ceramium boydenii)의 추출물이 항염 효과가 매우 우수하여 단박 추출물을 염증 질환 치료제의 소재로 사용할 수 있음을 규명한 점에 그 특징이 있으며, 구체적으로 단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 단박 추출물이 항염 활성이 있다는 본 발명의 일실시예를 통해 확인하였는데, 일실시예에 의하면, 염증 유발 인자인 LPS로 대식세포를 자극시켜 염증 반응을 유발시킨 후, 본 발명의 단박 추출물을 처리하여 염증 반응의 억제 정도를 분석한 결과, 본 발명의 단박 추출물이 산화질소의 생성을 억제하는 것으로 나타났고, 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성도 억제하는 것으로 나타났으며, 나아가 프로스타글란딘 E2의 생성도 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 염증 반응 억제 정도는 단박 추출물의 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 본 발명의 단박 추출물이 항염 활성을 갖는 다는 사실을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 사람 각질형성세포주를 대상으로 항염 활성을 갖는지 확인하였는데, 특히 단박 추출물의 케모카인 생성 억제능을 조사하였다.

이는 케모카인은 아토피피부염에서 염증세포 침윤의 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 인자로서 케모카인의 생성을 억제할 수 있다면 그러한 물질은 아토피피부염의 치료제로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명자들은 본 발명의 단박 추출물이 케모카인(MDC)의 생성을 억제하는지 조사한 결과, INF-r 및 TNF-a로 자극되어 염증 반응이 유발된 사람 각질형성세포주에서 단박 추출물을 처리한 경우가 처리하지 않은 경우에 비해 케모카인의 생성이 유효하게 감소되는 것으로 나타났다.

뿐만 아니라 본 발명자들은 MDC 생성을 유도하는 신호전달경로로서 STAT의 신호 경로에 본 발명의 단박 추출물이 영향을 미치는지 조사하였는데, 특히 세포 신호전달 단백질인 STAT 1(Signal transducer and activator of transcription 1)은 인터페론(IFN-γ) 및 LPS에 반응하는 Jak 단백질(Janus kinases)에 의해 발현하는 세포질 내 전사인자로서, 인산화에 의해 단백질이 활성화가 되면 STAT의 신호 전달로 인해 염증 반응이 증가된다.

한편, 본 발명에 따른 단박 추출물은 인터페론(IFN-γ) 및 TNF-a이 자극된 사람 각질형성세포주에서 단박 추출물을 처리한 군의 경우 처리하지 않은 군에 비해 STAT 1의 인산화가 강하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

그러므로 이상과 같은 실험을 통해 본 발명자들은 본 발명의 단박 추출물이 우수한 항염 활성을 가지고 있으며, STAT 1의 활성 억제를 통한 기작으로 항염활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 염증 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 "염증 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 염증질환의 발달을 저지시킴,

(2) 염증질환의 확산을 예방함,

(3) 염증질환을 경감시킴,

(4) 염증질환의 재발을 예방함 및

(5) 염증질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 단박 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 단박으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 단박의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.

상기 단박으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 단박 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 단박 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 단박 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 일실시예에 따른 단박 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명에서는 음건한 단박을 분쇄하여 분말화한 후, 상기 분말에 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 추출한 다음, 여과 농축시켜 단박 추출물을 수득할 수 있다.

상기의 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 단박 추출물은 조성물에 10 내지 100μg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 단박 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 염증 질환으로는, 관절염, 류머티즘성 관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 동맥경화증, 염증성 내장 질병, 궤양성 대장염, 골다공증, 크론(Crohn) 병, 뇌척수염, 수막염, 췌장염, 복막염, 골수염, 뇌염, 뇌막염, 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 맥관염, 임파구 맥락수막염, 사구체신염, 포도막염, 회장염, 간 염증, 신장 염증, 천식, 통증, 패혈성 쇼크, 국소 빈혈, 궤양, 다중경화증, 경화증, 출혈성쇼크, 아나필락틱 쇼크, 화상, 감염, 박테리아성 감염, 비루스성 감염, 진균성 감염 및 기생성감염, 건선, 아토피성피부염, 레이슈마니아증, 주혈흡충증, 혈액투석증, 발작, 심폐 혈관이식, 국소 빈혈, 재환류 질환, 혈색소증, 혈색소병증, 당뇨병, 알츠하이머(Alzheimer) 병, 파킨슨(Parkinson) 병, 타가이식거부증 및 자가면역질환 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 단박 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 단박 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 단박 추출물은 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 염증 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 염증 질환 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 단박 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 단박 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 단박 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 단박 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 단박 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 산화질소(nitric oxide: NO) 생성 억제, 염증성 사이토카인 생성 억제, 염증성 케모카인 생성 억제, 프로스타글란딘 E2의 생성 억제 및 STAT1의 활성 억제 효과를 가지기 때문에 염증 질환의 개선 및 치료에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 염증 질환 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 단박 추출물을 투여하는 것을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 단박 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 단박 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

단박 ( Ceramium boydenii Gepp ) 추출물의 제조

단박 추출물의 제조를 위해, 단박 시료는 제주도에서 채집하였으며, 증거표본은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute: JBRI)에 기탁하여 JBRI 20349를 부여받았다.

채집된 단박은 음건한 다음 건조된 단박(100g)을 80% 에탄올(2L)로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축하여 단박의 에탄올 가용성 추출물을 수득하였다.

< 실시예 2>

세포배양 및 시약

실시예 1에서 수득한 본 발명의 단박 추출물의 항염증 활성 실험을 위해 다음과 같이 실험을 위한 세포 및 시약들을 준비하였다. 먼저 세포들로는 대식세포주인 RAW264.7 세포를 사용하였는데, 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS)과 100 unit/㎖ penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 세포배양 배지로 이용하였고, 형질 전환된 인간각질형성세포주인 HaCaT 세포는 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS)과 100 unit/㎖ penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI1640을 세포배양 배지로 사용하였으며, 이들 세포는 37℃의 온도 및 5% CO₂가 유지되는 항온기(incubator)에서 배양하였으며, 3일 간격으로 계대배양 하였다.

또한 염증 자극을 위한 자극제로서 사용하는 LPS(Lipopolysaccharide)는 시그마로부터 구입하여 사용하였고, human Interferon-γ (hIFN-γ, recombinant E. coli) 및 human tumor necrosis factor-α (TNF-α, recombinant E. coli)은 Roche로부터 구입하여 사용하였다. 또한 mouse IL-6, mouse TNF-α, mouse PGE2, human MDC/CCL22 ELISA kit는 R&D(Minneapolis,MN) 제품을 구입하여 사용하였다.

< 실험예 1>

단박 추출물의 세포 독성 평가

본 발명에서 제조한 단박 추출물이 세포에 대한 독성을 가지고 있는지 확인하기 위해, RAW264.7 세포 및 HaCaT 세포를 대상으로 하기와 같은 실험을 진행하였다.

RAW264.7 세포에 대한 세포 독성 평가를 위해, 먼저 RAW264.7 세포에 LPS(1μg/mL)를 처리하고, 실시예 1에서 제조한 단박 추출물을 12.5, 25 및 50 ug/mL의 농도로 각각 동시 처리한 후, 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각 웰에 WST 시료를 10 uL씩 첨가한 후, 2시간 동안 배양한 다므, 플레이트 믹서를 사용하여 잘 흔들어 준 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, HaCaT 세포에 대한 세포 독성 평가를 위해, HaCaT 세포에 IFN-γ 및 TNF-α(10 ng/㎖)를 처리하고, 단박 추출물을 3.13, 6.25, 12.5, 25 ug/mL 농도로 각각 동시에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각 웰에 MTT 용액을 10ul씩 넣고, 2시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후 웰로부터 배지를 제거하고, 각 웰당 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma)를 50ul씩 넣고 ELISA 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 자극제를 처리한 대조군과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단박 추출물을 12.5, 25, 50 ug/ml의 농도록 24시간 동안 처리한 경우, 모든 농도에서 생쥐의 대식세포주 RAW264.7 세포(도 1a) 및 HaCaT 세포(도 1b)에 대한 세포 생존능에는 별다른 영향을 미치지 않은 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 단박 추출물이 세포에 대해 특별히 독성을 유발시키지 않는 안전한 물질임을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

단박 추출물의 산화질소 ( Nitric Oxide ) 생성 억제 활성 분석

본 발명의 단박 추출물이 염증 유발인자인 산화질소의 생성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 산화질소 생성 여부를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 즉, RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 X 10⁵ 세포수/mL로 접종하고, 단박 추출물과 LPS (1μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 생성된 산화질소의 양은 Griess 시약을 이용하여 배양 배지에서 생성된 NO² ^-의 형태로 측정하였는데, 세포배양 상등액 100 uL와 Griess 시약 100 uL를 혼합하고, 10분 동안 반응시킨 후, ELISA 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 아질산나트륨(sidium nitrite; NaNO2)을 연속희석 (serial dilution)하여 얻은 그래프를 사용하였다(1-100uM의 아질산나트륨 사용).

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 RAW264.7 세포의 경우 LPS로 자극시키지 않은 세포에 비해 산화질소의 생성량이 급증한 것으로 나타난 반면, 단박 추출물을 처리한 군들의 경우 처리 농도에 비례하여 산화질소의 생성량이 감소되는 것으로 나타났다.

< 실험예 3>

단박 추출물의 염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘 E2 ( PGE2 ) 생성에 미치는 영향 분석

본 발명의 단박 추출물이 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 프로스타글란딘 E2의 생성에 영향을 미칠 수 있는 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 X 10⁵ 세포수/mL로 접종하고, 단박 추출물(12.5, 25. 50ug/ml의 농도로 각각 처리)과 LPS (1μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 상기 세포에 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 이후 TNF-α, IL-6 및 PGE2의 함량 분석은 ELISA kit를 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 단박 추출물을 처리한 군의 경우 단박 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 IL-6의 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, IL-6의 생성 억제 정도는 처리한 추출물의 농도에 비례하는 것으로 나타났다.

또한, PGE2의 생성 역시 단박 추출물을 처리한 군의 경우 처리 농도에 의존적으로 PGE2 생성이 억제되는 것으로 나타났다(도 4 참조).

반면, 본 발명의 단박 추출물은 TNF-α 생성에는 큰 영향을 주지는 않는 것으로 나타났다.

< 실험예 4>

단박 추출물의 염증성 케모카인 ( MDC ) 생성에 미치는 영향

단박 추출물이 염증성 케모카인인 MDC 생성에 어느 정도 영향을 주는지를 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 앞서 배양한 HaCaT세포를 RPMI1640 배지를 이용하여 2.0 X 10⁵세포수/mL로 접종하고, 염증을 유발시키는 인자인 IFN-γ(1ug/ml) 및 TNF-α (1ug/ml)을 함께 처리한 군에 대해 본 발명의 단박 추출물을 농도별로 처리하였을 경우, 염증성 케모카인의 생성 억제 정도를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, IFN-γ와 TNF-α로 자극된 HaCaT 세포에서 단박 추출물을 3.13, 6.25, 12.5, 25 ug/ml을 처리한 결과, 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 염증성 케모카인의 생성이 강하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5>

HaCaT 세포에서 STAT1 인산화 에 미치는 단박 추출물의 영향

단박 추출물이 아토피성 피부염 신호전달 단백질로 알려진 STAT1 인산화에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<5-1> 단백질 분리

HaCaT 세포에 단박 추출물과 IFN-γ (10 ng/㎖) 및 TNF-α (10 ng/㎖)을 처리하고 2 시간 동안 배양 한 후, 세포를 2회 PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후 1 ㎖의 용혈 완충용액을 첨가하고, 30분 동안 용혈(lysis) 시킨 다음 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포막 성분을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준화하여 바이오-레드 단백질 분석 킷트(Bio-Rad Protein Assay Kit. USA)를 사용하여 정량하였다.

<5-2> 웨스턴 블롯( western blot )

상기 <5-1>에서 배양된 세포들을 용해시킨 다음, 30 ㎍의 세포 용해물(lysate)을 8 % 미니 겔(mini gel) SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)를 이용하여 전기영동을 통해 분리시키고, 이를 PVDF 막(membrane)(BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 단백질을 이동시켰다. 이후 막의 차단(blocking)은 1% BSA(bovine serum albumin; Amresco, USA)가 함유된 TTBS(TBS + 0.1 % Tween 20) 용액에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 인산화(phosphorylation)된 STAT1 과 전체(total) STAT1의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 래빗(rabbit) 항(anti)-인산화 STAT1(phospho-STAT1, 1:250) (cell signaling, USA) 마우스(mouse) 항(anti)-STAT1 (1 : 250) (BD, USA)를 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하여 사용하였다. 2차 항체로는 HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 항-래빗(anti-rabbit IgG; Cell signaling, USA) 와 항-마우스(anti-mouse IgG; Amersham Co., U.K.)를 1 : 2500으로 희석하여 상온에서 40분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1분 간 반응 후 X-레이 필름에 감광하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, IFN-γ와 TNF-α로 자극된 HaCaT 세포에 단박 추출물을 3.13, 6.25, 12.5, 25 ug/ml의 농도로 처리한 군의 경우, IFN-γ와 TNF-α로 자극된 세포에 단박 추출물을 처리하지 않은 군과 비교하여 STAT1 인산화가 농도 의존적으로 강하게 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

따라서 상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 단박 추출물이 STAT1의 활성화 억제를 통해 항염 활성을 가진다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단박 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 아토피성피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 단박 추출물은 70% 에탄올을 이용하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 아토피성피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단박 추출물은 3~100ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 아토피성피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단박 추출물은 산화질소(nitric oxide: NO) 생성 억제, 염증성 사이토카인 생성 억제, 염증성 케모카인 생성 억제, 프로스타글란딘 E2의 생성억제 및 STAT1의 인산화 억제를 통해 항염 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
단박(Ceramium boydenii) 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성피부염 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서,
상기 단박 추출물은 70% 에탄올을 이용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 아토피성피부염 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서,
상기 단박 추출물은 조성물에 10~100ug/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 아토피성피부염 개선용 건강기능식품.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아토피성피부염 개선용 건강기능식품.