JP6168485B2 - ヒアルロン酸産生促進剤 - Google Patents
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Description
本発明の組成物は、医薬組成物、化粧品、飲食品、あるいは研究目的(例えば、インビトロやインビボでの実験)に用いられる試薬の形態であり得る。本発明の組成物は、ヒアルロン酸の産生を促進する作用を有するため、例えば、皮膚のヒアルロン酸の産生を促進して、しわや肌荒れを予防若しくは改善するために投与もしくは摂取される医薬組成物や飲食品として、また、塗布などされる化粧品として好適に用いることができる。また、関節のヒアルロン酸の産生を促進して、関節炎、関節痛、変形性関節症、関節リウマチなどの関節障害や関節軟骨損傷を予防、改善、若しくは治療するために投与もしくは摂取される医薬組成物や飲食品として好適に用いることができる。
ヒト線維芽細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を100mmディッシュ(AGCテクノグラス)にて、10%仔ウシ血清(SAFCバイオサイエンス)を含むダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s medium:DMEM)にて培養した。ディッシュ当たりの細胞占有率が90%以上に達した時点で、0.25%トリプシンおよび0.02%EDTAを含むリン酸緩衝液を用いて細胞を剥離し、48ウェルマルチプレートまたは60mmディッシュ(AGCテクノグラス)にそれぞれ1x104細胞/ウェルまたは3x104細胞/ディッシュの細胞数で播種した。ウェルまたはディッシュ当たりの細胞占有率が90%以上に達した時点で、滅菌蒸留水に溶解したタウリン(最終濃度6.25〜50mM)、またはタウリンと5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)(最終濃度20μM)を培養液に添加し、24時間培養した。
ヒトHAS-2(Accession No. NM_005328.2)センスプライマー:5’-GACAGGCATCTCACGAACCG-3’/配列番号:1
ヒトHAS-2(Accession No. NM_005328.2)アンチセンスプライマー:5’-CAACGGGTCTGCTGGTTTAGC-3’/配列番号:2
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ヒトGAPDH(Accession No. NM_002046.3)アンチセンスプライマー:5’-AGCTTCCCGTTCAGCTCAGG-3’/配列番号:6
その結果、ヒト線維芽培養細胞においてタウリンは濃度依存的にヒアルロン酸産生量を増加させ(図1)、同時にヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現も増加させた(図2)。一方、タウリンはヒト線維芽培養細胞のI型コラーゲンα1遺伝子発現には影響を与えなかった(図3)。また、ヒト線維芽培養細胞のヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現は男性ホルモンである5α-ジヒドロテストステロン(5α-DHT)により有意に低下したが、タウリンは濃度依存的にHAS-2遺伝子発現を回復させた(図4)。
ヒト表皮角化細胞(コージンバイオ)を60mmディッシュ(AGCテクノグラス)にて、正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地(コージンバイオ)を用いて培養した。ディッシュ当たりの細胞占有率が80%以上に達した時点で、EDTAトリプシン液(コージンバイオ)、D-PBS(-)(コージンバイオ)およびトリプシンインヒビター液(コージンバイオ)を用いて細胞を剥離し、35mmディッシュ(AGCテクノグラス)に1x105細胞/ディッシュで播種した。ディッシュ当たりの細胞占有率が80%以上に達した時点で、タウリン(最終濃度が6.25〜50mM)を含む無血清基本培地にて24時間培養した。
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ヒトGAPDH(Accession No. NM_002046.3)アンチセンスプライマー:5’-AGCTTCCCGTTCAGCTCAGG-3’/配列番号:10
その結果、ヒト表皮角化細胞において、タウリンはヒアルロン酸産生量を増加させ(図5)、同時にヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現も増加させた(図6)。
ヒト関節滑膜細胞(大日本製薬)を100mmディッシュ(AGCテクノグラス)にて、10%仔ウシ血清(SAFCバイオサイエンス)含有ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s medium:DMEM)にて培養した。ディッシュ当たりの細胞占有率が90%以上に達した時点で、0.25%トリプシンおよび0.02%EDTAを含むリン酸緩衝液を用いて細胞を剥離し、48ウエルマルチプレートまたは60mmディッシュ(AGCテクノグラス)にそれぞれ1x104細胞/ディッシュまたは3x104細胞/ディッシュの細胞数で播種した。ウエルまたはディッシュ当たりの細胞占有率が90%以上に達した時点で、滅菌蒸留水に溶解したタウリンを最終濃度が6.25〜50mMになるように培養液に添加し、24時間培養した。
ヒトHAS-2(Accession No. NM_005328.2)センスプライマー:5’-GACAGGCATCTCACGAACCG-3’/配列番号:11
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ヒトGAPDH(Accession No. NM_002046.3)アンチセンスプライマー:5’-AGCTTCCCGTTCAGCTCAGG-3’/配列番号:14
その結果、ヒト関節滑膜細胞において、タウリンはヒアルロン酸産生量を増加させ(図7)、同時にヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現も増加させた(図8)。
5週齢のHR-1マウス(日本エスエルシー)を順化後、8週齢から24週齢まで、タウリンを3%溶解した飲水を与えた。対照群には精製水のみを与えた。投与終了後、マウスの背部皮膚を摘出し、組織切片を作製した。次いで組織切片とビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質(HABP)(2ng/mlリン酸緩衝液)(生化学バイオビジネス)を反応させた後、リン酸緩衝液にて1000倍希釈したストレプトアビジン-FITC(fluorescein isothiocyanate)(シグマアルドリッチ)を添加し、ヒアルロン酸に結合したHABPを蛍光染色した。組織切片を5から8の計測視野に分け、それぞれの視野における表皮と真皮の単位面積(μm2)当たりの蛍光強度をLumina Vision(三谷商事)により測定した。真皮の蛍光強度に対する表皮の蛍光強度の比を算出して表皮におけるヒアルロン酸量とし、タウリン投与群と非投与群で比較した。
Claims (6)
- タウリンを有効成分とする、ヒアルロン酸の産生を促進することにより関節機能の維持または調節を行うための組成物
- タウリンを有効成分とする、ヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現を促進することにより関節機能の維持または調節を行うための組成物
- タウリンを有効成分とする、男性ホルモンにより低下したヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現を回復させることにより関節機能の維持または調節を行うための組成物
- 皮膚外用剤である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物
- 医薬組成物である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物
- ヒアルロン酸の産生を促進することにより関節機能の維持または調節を行うために用いられる旨の表示、ヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現を促進することにより関節機能の維持または調節を行うために用いられる旨の表示、または男性ホルモンにより低下したヒアルロン酸合成酵素(HAS-2)の遺伝子発現を回復させることにより関節機能の維持または調節を行うために用いられる旨の表示を付した、請求項1から5のいずれかに記載の組成物
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