DE69221484T2

DE69221484T2 - Implantierbare, biokompatible immunisolator-trägersubstanz zum abgeben ausgesuchter, therapeutischer produkte

Info

Publication number: DE69221484T2
Application number: DE69221484T
Authority: DE
Inventors: Patrick Aebischer; Lisa Christenson; Keith Dionne; Dwaine Emerich; Frank Gentile; Orion Hegre; Diane Hoffman; Paul Lacy; Michael Lysaght; Paul Sanberg; David Scharp; Alfred Vasconcellos
Original assignee: Brown University Research Foundation Inc
Current assignee: Brown University Research Foundation Inc
Priority date: 1991-04-25
Filing date: 1992-04-22
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2012-04-23
Also published as: US5800828A; JPH06507412A; FI934545A; JP2007314569A; US20040185083A1; US6322804B1; WO1992019195A1; SG47470A1; ES2107537T3; NO933842L; EP0585368A1; EP0585368B1; AU682796B2; US5798113A; DK0585368T3; DE69221484D1; AU2004192A; EP0585368A4; US5869077A; AU666118B2

Description

Zugehörige Patentanmeldung

Die vorliegende Erfindung ist eine "continuation-in-part"-Anmeldung gemäß 35-USC-120 der am 25. April 1991 eingereichten US-Patentanmeldung 07/692,403.

Stand der Technik

Viele klinische Erkrankungen, Mangelerscheinungen und Krankheitszustände können geheilt oder gelindert werden, indem dem Patienten ein von lebenden Zellen produzierter Faktor oder Faktoren verabreicht wird/werden oder der Patient von schädlichen Faktoren, die durch den Stoffwechsel lebender Zellen entstehen, befreit wird. In vielen Fällen können diese Faktoren beeinträchtigte oder verlorene Organ- oder Gewebe-Funktionen wiederherstellen oder wettmachen. Beispiele für Krankheits- oder Mangelzustände, deren Krankheitsursachen den Verlust eines Sekretions- Organs oder einer Gewebefunktion umfassen, sind (a) Diabetes, wobei die Produktion von Insulin durch die Langerhans-Inseln beeinträchtigt oder vollkommen verloren gegangen ist, (b) Nebenschilddrüsen-Insuffizienz, wobei der Verlust der Produktion von Nebenschilddrüsen-Hormonen eine Senkung des Calcium-Spiegels im Serum bewirkt, was zu schwerer Muskel-Tetanie führt, (c) das Parkinson-Syndrom, wobei die Dopamin-Produktion verringert ist, und (d) Anämie, die durch einen Mangel an Erythropoetin charakterisiert ist, der zum Erlahmen der roten Blutkörperchen-Produktion führt. Die Beeinträchtigung oder der Verlust einer Organ- oder Gewebefunktion kann zum Verlust weiterer Stoffwechsel-Funktionen führen. Beispielsweise verliert bei heftig verlaufendem Leberversagen das Leber-Gewebe die Fähigkeit, Toxine zu eliminieren, die Produkte des Zell-Stoffwechsels auszuscheiden und essentielle Produkte, wie z.B. Albumin und Faktor VIII, zu sezernieren (Bontempo, F. A., et al., Blood 69 (1987), 1721-1724).
In anderen Fällen handelt es sich bei diesen Faktoren um Modulatoren einer biologischen Reaktion, wie z.B. Lymphokine oder Cytokine, die das Immunsystem des Patienten verbessern oder als entzündungshemmende Mittel wirken. Sie können insbesondere bei Personen mit chronischen Parasiten- oder Infektionskrankheiten nützlich sein und eignen sich auch zur Behandlung bestimmter Carcinome. Es kann auch wünschenswert sein, einen Patienten mit trophischen Faktoren zu versorgen, wie z.B. mit dem Nerven- Wachstumsfaktor oder den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren 1 oder 2 (IGF1 oder IGF2).
Bei vielen Krankheits- oder Mangelzuständen ist ein Organ oder Gewebe betroffen, das bei normaler Funktionsweise auf Schwankungen in der Menge spezifischer Metaboliten reagieren kann, wodurch das physiologische Gleichgewicht aufrechterhalten wird. Z.B. reagiert die Nebenschild drüse normalenveise auf Schwankungen der Calcium-Menge im Serum mit einer Veränderung der Produktion des Nebenschilddrüsen-Hormons (PTH). In ähnlicher Weise ändern die β-Zellen der Langerhans-Inseln in der Bauchspeicheldrüse als Reaktion auf Schwankungen der Glucose-Menge im Serum die Insulin-Produktion. Herkömmliche Therapie-Verfahren zur Behandlung dieser Krankheiten können die Reaktionen von normalem Gewebe auf diese Schwankungen nicht ausgleichen. Beispielsweise umfaßt eine anerkannte Diabetes-Behandlung tägliche Insulin-Injektionen. Dieses Therapie-Schema kann die schnellen kurzzeitigen Schwankungen der Serum- Glucose-Mengen nicht ausgleichen, die beispielsweise durch anstrengende körperliche Bewegung verursacht werden. Wenn sich diese Schwankungen nicht ausgleichen lassen, kann das zu Komplikationen des Krankheitszustandes führen. Das trifft besonders auf Diabetes zu (Jarret, R. J. und Keen, J., Lancet (2) (1976), 1009-1012).
Dementsprechend haben viele Forscher den Versuch unternommen, eine Organ- oder Gewebefunktion durch Transplantation von ganzen Organen, Organgeweben oder Zellen wiederherzustellen, die sezernierte Produkte bereitstellen oder Stoffwechsel-Funktionen beeinflussen. Eine Transplantation kann zwar erheblichen Nutzen bringen, ist jedoch in ihrer Anwendbarkeit auf eine relativ kleine Anzahl von Organen beschränkt, die sich zur Transplantation eignen und dafür verfügbar sind. Im allgemeinen müssen die Immunreaktionen des Patienten unterdrückt werden, um eine immunologische Abstoßung des Transplantats zu verhindern, was zu einem Verlust der Transplantat-Funktion und eventuell zu einem Absterben der transplantierten Gewebe oder Zellen führt. In vielen Fällen muß das Transplantat über eine lange Zeitspanne funktionsfähig bleiben, manchmal sogar für den Rest des Lebens des Patienten. Es ist nicht wünschenswert und außerdem teuer, einen Patienten über eine große Zeitspanne im Zustand der Immunsuppression zu halten.
Eine wünschenswerte Alternative zu solchen Transplantations-Verfahren ist die Implantation von Zellen oder Geweben innerhalb einer physikalischen Schutzhülle, die die Diffusion von Nährstoffen, Ausscheidungsstoffen und sezernierten Produkten erlaubt, die zellulären und molekularen Wirkstoffe der immunologischen Abstoßung jedoch blockiert. Es sind verschiedene Vorrichtungen untersucht worden, die Gewebe oder Zellen schützen, die ein erwünschtes Produkt des Immunsystems produzieren. Diese umfassen extravaskuläre Diffusionskammern, intravaskuläre Diffusionskammern, intravaskuläre Ultrafiltrationskammern sowie die Implantation von mikroverkapselten Zellen (Scharp, D. W., et al., World J. Surg. 8 (1984), 221-229).
EP-A-0 127 989 betrifft implantierbare Mikrokapseln, die gebildet werden, indem man einige Zellen in Mginat-Gelkörner oder Kurzzeit-Kapseln einbettet, die Kurzzeit-Kapseln durch Ionen-Bindung eines polykationischen Polymers, z.B. Poly-L-Lysin, an den erstarrten Kern des Alginatgels mit einer Hülle umgibt und den Kern durch Entfernung der multivalenten Kationen aus dem Gel erneut verflüssigt, typischerweise durch Behandlung der Mikrokapseln mit einem Chelatbildner.
US-A-4 670 014 betrifft ein biologisch abbaubares Reservoir, das durch Hydratation einer Collagen-Hülle und Einfüllen einer den Wirkstoff enthaltenden Substanz gebildet wird. Dabei gibt es keinen Matrix-Kern.
WO-A-90/15637 betrifft eine implantierbare Vorrichtung zur neurologischen Therapie, die zur Verankerung im Schädel des Patienten entworfen ist. Es wird jedoch kein Hinweis auf einen Matrix-Kern gegeben.
WO-A-91/02498 betrifft eine Hohlvorrichtung zur künstlichen Perfusion der Bauchspeicheldrüse, die zum Einsetzen in ein Blutgefäß entworfen ist. Diese Vorrichtung besitzt eine Hülle mit einer nicht-durchlässigen Außenfläche, die aus einem starren Metall- oder Plastikmaterial hergestellt ist.
Man geht davon aus, daß Vorrichtungen wie diese einen deutlichen Fortschritt auf dem Gebiet der Transplantation darstellen, da man den Patienten nicht im Zustand der Immunsuppression halten muß und die Möglichkeit gegeben ist, daß viel mehr Patienten Transplantate erhalten, die ihre Geundheit wiederherstellen oder anderweitig nützlich sind, da sie die Verwendung von Donor-Zellen oder Geweben erlauben, die bei üblichen Transplantationstechniken nicht verwendet werden konnten. Keine dieser Verfahrensweisen ist jedoch im Hinblick auf eine langfristige Transplantat-Funktionsfähigkeit zufriedenstellend. Nach wie vor ist kein Verfahren verfügbar, mit dem sich über eine lange Zeitspanne geeignete Mengen benötigter Stoffe, z.B. Enzyme oder Hormone, verabreichen lassen oder das andere erforderliche Stoffwechsel-Funktionen bereitstellt, obwohl ein solches Verfahren für Personen, die eine Langzeit-Behandlung brauchen, große Vorteile bieten würde.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft implantierbare Trägersubstanzen zur Abgabe eines biologisch aktiven Produktes an einen Patienten oder zur Ausübung einer Funktion im Patienten. Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen umfassen (a) einen Kern, der mindestens 10&sup4; eingekapselte lebende Zellen umfaßt, die in einer biologisch verträglichen, ein Hydrogel oder eine extrazelluläre Matrix umfassenden Matrix dispergiert sind, wobei die Zellen ein biologisch aktives Produkt sezernieren oder im Patienten eine biologische Funktion ausüben können, und (b) eine äußere, immunologisch isolierende Hülle, die den Kern umgibt, wobei die Hülle ein biologisch verträgliches thermoplastisches Material oder ein Hydrogel-Material umfaßt, das während der Bildung der Hülle nicht ionisch an ein auf dem Kern befindliches Polymer entgegengesetzter Ladung bindet, wobei die Hülle frei ist von Zellen, die nach außen herausragen und wobei die Hülle einen Molekulargewichts-Ausschlußwert hat, der eine immunologische Abstoßung der Zellen im Kern verhindert und gestattet, daß Substanzen aus dem Kern durch den Mantel hindurch zum Patienten gelangen, wodurch das biologische Produkt oder die biologische Funktion bereitgestellt wird.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Lebewesen" bezieht sich sowohl auf den Menschen als auch auf Tiere.
Wie in der vorliegenden Erfindung definiert, bedeutet der Begriff "Doppelmatrix-Trägersubstanz" solche Trägersubstanzen, die einen zellhaltigen Kern und eine äußere Hülle aufweisen, die frei von Zellen ist. In einer anderen Ausführungsform wird der Matrix-Kern aus einem Hydrogel gebildet, das mit einer Hydrogel-Hülle vernetzt ist. Der Kern weist zweckmäßigerweise eine Stäbchen-Form oder eine andere Form auf. Die Hydrogel-Hülle kann unabhängig als Mantel um die Matrix ohne Vernetzung gebildet werden. Der Hydrogel-Kern ist nicht notwendigerweise durch entgegengesetzte Ionen- Ladungen an die äußere Hülle gebunden. In einer anderen Ausführungsform wird die äußere Hülle aus einem thermoplastischen Material gebildet, das nicht durch chemische Bindung an die Kern-Matrix gebunden ist.
Soweit nicht anders angegeben, bedeutet der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Zellen" Zellen beliebiger Form, zu denen in Geweben und Zellhaufen enthaltene Zellen sowie einzeln isolierte Zellen gehören, ist aber nicht darauf beschränkt.
Der Kern der immunologisch isolierenden Trägersubstanzen ist so aufgebaut, daß er eine geeignete räumliche Umgebung für die speziellen eingekapselten Zellen bietet. In einigen Ausführungsformen umfaßt der Kern ein flüssiges Medium, das zur Erhaltung der Zellen ausreicht. Flüssige Kerne sind zur Erhaltung transformierter Zellen, z.B. PC12-Zellen, besonders geeignet. In anderen Ausführungsformen umfaßt der Kern eine Gelmatrix, die die Zellen immobilisiert und so verteilt, daß die Bildung dichter Zellaggregate verringert wird. Die Gelmatrix kann aus einem Hydrogel oder extrazellulären Matrix- Bestandteilen bestehen.
Aus einer Hydrogel-Matrix hergestellte Kerne sind besonders zur Erhaltung von Zellen oder Geweben geeignet, die zur Bildung von Aggregaten neigen, wie z.B. die Zellen der Langerhans-Inseln oder chromaffine Nebennieren-Zellen. Die Matrix sollte hinreichend viskös sein, um die Zelldispersion innerhalb der Matrix aufrecht zu erhalten. Gegebenenfalls kann der Kern der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen Stoffe enthalten, die die Funktion der eingekapselten Zellen unterstützen oder fördern. Diese Stoffe umfassen natürliche oder synthetische Nährstoff-Quellen, extrazelluläre Matrix- Bestandteile (ECM), Wachstumsfaktoren bzw. das Wachstum regulierende Stoffe, eine Population von Zellen, die Nährstoffe oder Ergänzungsstoffe abgeben, oder O&sub2;-Träger, wie Hämoglobine oder Fluorkohlenwasserstoffe.
Bei früher beschriebenen Vorrichtungen waren der Kern und die Hülle über Ionen-Bindungen zwischen Polymeren mit entgegengesetzter Ladung verbunden, wobei zwei Arten der Bindung möglich waren. (1) Die Vorrichtungen von Rha (US-Patent 4,744,933) waren aus einem geladenen Innenkern-Material und einem Außenhüllen-Material mit entgegengesetzter Ladung aufgebaut. (2) Die Vorrichtungen von Lim und Sun (US-Patente 4,352,833 und 4,409,331) umfaßten eine Zwischenschicht aus Poly-L-Lysin (PLL), die zur Verbindung des negativ geladenen Kern mit dem negativ geladenen Hüllmaterial positiv geladen war. Die Beseitigung der PLL-Schicht ist insofern vorteilhaft, als man davon ausgeht, daß PLL im Wirt fibrinogen wirkt. PLL kann auch bei einigen Zellen unerwünschte Wirkungen auf das Wachstum ausüben. Die Hülle der erfindungsgemäßen Vorrichtungen kann auch hinsichtlich der permselektiven Wirkung besser kontrolliert werden als Hüllen, die aus PLL hergestellt sind.
Die Hülle der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen wird aus einem Material hergestellt, das das gleiche Material sein kann wie das des Kerns oder sich davon unterscheiden kann. In beiden Fällen führt das verwendete Material zu einem randständigen oder peripheren Bereich, der permselektiv und biologisch verträglich ist und immunologisch isoliert.
Die Hülle kann auch ohne chemische Bindung frei um den Kern herum gebildet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Hülle direkt mit der Kern-Matrix vernetzt werden. In beiden Fällen erfordert die Bildung der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen nicht, daß Polymere mit einer gegenüber dem Kern entgegengesetzten Ladung in einer Grenzflächen- Schicht oder in der Hülle vorhanden sein müssen.
Vorzugsweise bilden der Kern und die äußere Hülle eine Grenzfläche, die frei von "Ionen-Bindungen" zwischen Polymeren entgegengesetzter Ladung ist und keine Zwischenschicht des Typs enthält, der bei im Stand der Technik beschriebenen Mikrokapseln verwendet wird. Ionen-Bindung bedeutet eine Ionen-Wechselwirkung zwischen einem (positiv oder negativ) geladenen Kern und der Hülle (oder einer Zwischenschicht) entgegengesetzter Ladung.
Die Hülle erlaubt die Passage von Stoffen bis zu einer bestimmten Größe, verhindert jedoch die Passage größerer Stoffe. Insbesondere wird der randständige oder periphere Bereich in einer solchen Weise erzeugt, daß er Poren oder Öffnungen in einem bestimmten Größenbereich aufweist. Die Folge davon ist, daß die Trägersubstanz permselektiv ist. Der für eine bestimmte Trägersubstanz gewählte Molekulargewichts-Ausschlußwert (MWCO) wird z.T. durch den Typ und Umfang der immonologischen Abstoßung bestimmt, die nach Implantation der Trägersubstanz zu erwarten ist, und z.T. durch die Molekülgröße des größten Stoffes, dessen Passage in die Trägersubstanz und/oder aus der Trägersubstanz heraus erlaubt sein soll. Beispielsweise können zur Bildung permselektiver Membranen oder Hydrogel-Matrices Materialien verwendet werden, die die Passage von Molekülen bis zu einer Größe erlauben, die etwa der von C1q entspricht (etwa 400 kD), einem Komplement-Bestandteil, der ein zum Zusammenbau des cytolytischen Komplement-Abwehrkomplexes benötigtes Protein ist. Bei diesem Beispiel können kleinere Stoffe als C1q ungehindert passieren. Es besteht auch die Möglichkeit, permselektive Matrices oder Membranen zu bilden, die die Passage von Molekülen bis zu einer Größe erlauben, die etwa der von Immunglobulin G (etwa 150 kD) entspricht, wobei größere Moleküle ausgeschlossen werden. Ferner können Membranen oder Hydrogele verwendet werden, die die Passage von Molekülen bis zu einer Größe erlauben, die etwa der von Immunglobulin M (etwa 1000 kD) entspricht. Bei dieser Ausführungsform werden nur sehr große Stoffe ausgeschlossen, wie z.B. Zellen.
Die Hülle ist auch biologisch verträglich. D.h., sie induziert keine nachteilige Reaktion des Wirtes in einem Maße, die zur Abstoßung der implantierten Trägersubstanz führt oder sie funktionsunfähig macht. Die Hülle induziert auch keine ungünstigen Gewebe-Reaktionen wie Fibrose. Außerdem kann die Außenfläche so gewählt oder entworfen werden, daß sie zur Implantation an einer ausgewählten Stelle besonders geeignet ist. Beispielsweise kann die Außenfläche glatt, punktiert oder rauh sein, je nachdem, ob eine Anlagerung von Zellen des umliegenden Gewebes erwünscht ist. Auch die Gestalt oder äußere Form kann so gewählt oder entworfen werden, daß sie für eine bestimmte Implantationsstelle besonders geeignet ist.
Weiterhin isoliert die Hülle der erfindungsgemäßen Trägersubstanz immunolgisch. D.h., sie schützt Zellen im Kern der Trägersubstanz vor dem Immunsystem des Lebewesens, in das die Trägersubstanz implantiert worden ist. Das geschieht, indem (1) Schadstoffe aus dem Körper des Lebewesens am Eindringen in den Kern der Trägersubstanz gehindert werden, (2) der Kontakt zwischen dem Lebewesen und möglicherweise im Kern vorhandenem Material, das Entzündungen hervorruft, antigen wirkt oder in anderer Hinsicht schädlich ist, minimiert wird und (3) eine räumliche Barriere bereitgestellt wird, die ausreicht, um einen immunologischen Kontakt zwischen den eingekapselten Zellen und den für sie schädlichen Teilen des Immunsystems des Lebewesens zu verhindern. Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen unterscheiden sich von den Mikrokapseln von Um und Sun (Lim, F., Sun, A. M., Science 210 [1980], 908-910; Sun, A. M., Methods in Enzymology 137 [1988), 575- 579) durch ihre äußere Hülle, die sicherstellt, daß die Zellen nicht aus dem Kern herausragen können. Die Kapseln von Lim und Sun haben den Nachteil, daß Teile der eingekapselten Zellen möglicherweise aus dem Kern und durch die Poly-L-Lysin-Schicht hindurch herausragen und dadurch mit größerer Wahrscheinlichkeit Entzündungsreaktionen des Wirts-Immunsystems induzieren. Die Techniken zur Herstellung dieser Mikrokapseln beruhen darauf, daß zur Bildung der Mikrokapseln Ionen-Bindungen vorliegen müssen, die möglicherweise biologisch aktiv sind. Da die Mikrokapseln Ionen enthalten, sind sie nach Impantation anfällig für Zersetzung, die auf eine Konkurrenz um die Ionen-Bindungen zurückzuführen ist, die nach Kapsel-Implantation im Körper des Wirtes auftritt. Dieses Problem wird durch die relativ nichtionischen erfindungsgemäßen Makrokapseln verringert. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Makrokapseln besteht in ihrer Kapazität, d.h., eine einzelne Vorrichtung kann mehr Zellen enthalten als das bei der Mikrokapsel- Technologie möglich ist.
Der randständige oder periphere Bereich (Hülle) kann aus einer Hydrogel- Nlatrix oder einem anderen Material hergestellt werden, wie z.B. einer thermoplastischen Membran. Der Bereich kann auch aus einer Matrix- Membran-Kombination so hergestellt werden, daß eine permselektive thermoplastische Membran mit Matrix-gefüllten Poren gebildet wird.
Zweckmäßigerweise kann die äußere Hülle aus einem thermoplastischen Material gebildet werden, von dem bekannt ist, daß es biologisch verträglich ist, wie z.B. aus den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Materialien. In der vorliegenden Erfindung lassen sich außerdem auch andere, bereits für Mikrokapseln verwendete Hüllen einsetzen, wie z.B. Alginat, das zweckmäßigerweise mit einem multivalenten Ion wie Calcium vernetzt wird.
Die immunologisch isolierenden Trägersubstanzen eignen sich (a) zur Abgabe verschiedenster Zellprodukte einschließlich Produkten hohen Molekulargewichts an ein Lebewesen, das diese benötigt, und/oder (b) zur Bereitstellung erforderlicher Stoffwechsel-Funktionen für ein Lebewesen, wie z.B. Entfernung schädlicher Stoffe. Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen enthalten eine große Anzahl von Zellen, so daß die Implantation einiger weniger oder einer einzigen Trägersubstanz(en) ausreicht, um an das Lebewesen eine wirksame Menge des benötigten Stoffes abzugeben oder in dem Lebewesen die erforderliche Funktion auszuüben. Ein weiterer Vorteil, den die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen bieten, besteht darin, daß sie sich in der Praxis leicht zurückgewinnen lassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die besonders bei Langerhans-Inseln nützlich ist, bestehen sowohl der Kern als auch der randständige oder periphere Bereich der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen aus Hydrogelen, die entweder die gleiche Hydrogel- Zusammensetzung haben oder unterschiedliche Hydrogel-Zusammensetzungen sein können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung biologisch verträglicher, immunologisch isolierender Trägersubstanzen. In einer ersten Ausführungsform wird die Trägersubstanz gebildet, indem die Materialien zur Bildung des Kerns und des randständigen oder peripheren Bereichs mit einer mit verschachtelten (koaxialen) Bohrungen versehenen Extrusionsdüse unter Bedingungen coextrudiert werden, die zur Gelierung oder Erhärtung oder zum Gießen des/der Matrix- oder Membran- Präkursors/Präkursoren des randständigen oder peripheren Bereichs (und des Kembereiches) hinreichen. Ein besonderer Vorteil dieser Coextrusions- Ausführungsform besteht darin, daß die Zellen im Kern vom Moment der Trägersubstanz-Bildung an isoliert werden, wodurch sichergestellt wird, daß die Kern-Materialien während der Behandlung bis zur Implantation nicht verunreinigt oder versetzt werden. Ein weiterer Vorteil des Coextrusions- Verfahrens ist, daß es sicherstellt, daß der randstandige oder periphere Bereich frei von Zellen und anderen Kern-Materialien ist. Die Eigenschaften des randständigen oder peripheren Bereiches, wie Permeabilität oder biologische Verträglichkeit, werden von den als Matrix- oder Membran-Präkursoren verwendeten Materialien ebenso bestimmt wie von den Bedingungen, unter denen die Matrix oder Membran gebildet wird.
Bei einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die immunologisch isolierende Trägersubstanz schrittweise gebildet. Wenn beispielsweise die herzustellende immunologisch isolierende Trägersubstanz einen eingekapselte Zellen enthaltenden Hydrogel-Kern umfaßt, kann der Kern zuerst gebildet werden. Die randständige oder periphere Matrix oder Membran kann anschließend zusammengebaut oder aufgebracht werden. Umgekehrt kann die randständige oder periphere Matrix oder Membran vorgefertigt und danach mit dem vorgefertigten Kern-Material, das eingekapselte Zellen enthält, oder mit Materialien beschickt werden, die später den Kern bilden (d.h. Kernpräkursor-Materialien). Die Trägersubstanz wird auf eine solche Weise abgedichtet, daß die Kern-Materialien vollständig eingeschlossen sind. Bei Verwendung eines Kernpräkursor-Materials wird die Trägersubstanz Bedingungen ausgesetzt, die zur Bildung des Kerns führen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Abgabe eines biologischen Produktes an ein Lebewesen, das dieses biologische Produkt benötigt, oder zur Veränderung einer Stoffwechsel- oder immunologischen Funktion bei einem Lebewesen, bei dem eine Stoffwechsel-Funktion verändert werden muß. Eine erfindungsgemäße immunologisch isolierende Trägersubstanz wird unter Verwendung bekannter Techniken oder Verfahren in das Lebewesen (nachstehend als Rezipient bezeichnet) implantiert, die im Hinblick auf eine spezielle immunologisch isolierende Trägersubstanz und eine spezielle Implantations-Stelle ausgewählt wurden. Sobald die Implantation erfolgt ist, produzieren die in der biologisch verträglichen, immunologisch isolierenden Trägersubstanz eingekapselten Zellen das/die gewünschte(n) Produkt(e) oder üben die gewünschte(n) Funktion(en) aus. Wenn die eingekapselten Zellen Produkte freisetzen, wandern diese durch die randständige oder periphere permselektive Membran oder Hydrogel-Matrix in den Körper des Rezipienten. Wenn die eingekapselten Zellen Stoffwechsel- Funktionen bereitstellen, dringen aus dem Körper des Rezipienten Stoffe, die im Stoffwechsel umgesetzt (z.B. abgebaut oder inaktiviert) werden sollen, in die Trägersubstanz ein und werden danach durch den Blutstrom des Rezipienten wieder entfernt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zur Einkapselung von Zellen in einer biologisch verträglichen, immunolog isch isolierenden, implantierbaren Trägersubstanz, wobei die innerhalb der Trägersubstanz enthaltenen Zellen nach Implantation in ein Lebewesen vor dem Immunabwehrsystem geschützt werden. Obwohl einige Mediatoren von Immunreaktionen niedrigen Molekulargewichts (z.B. Cytokine) die Membran durchdringen können, sind in den meisten Fällen die lokal auftretenden oder im Blutkreislauf befindlichen Mengen dieser Stoffe nicht so groß, daß sie schädlich wirken könnten. Die eingekapselten Zellen werden vor Angriffen des Immunsystems des Rezipienten und möglicherweise vor schädlichen Entzündungsreaktionen der Gewebe geschützt, die die implantierte Trägersubstanz umgeben. Im Kern der Trägersubstanz werden die eingekapselten Zellen in einer geeigneten räumlichen Umgebung gehalten. Auf diese Weise kann der Rezipient mit notwendigen Stoffen oder Stoffwechsel- Funktionen selbst über längere Zeitspannen versorgt werden, ohne daß der Rezipient mit gefährlichen Immunsuppressiva behandelt werden muß.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt in graphischer Form die Unterschiede in der Permeabilität von Alginat-Matrizen, die sich unter verschiedenen Testbedingungen für gelöste Stoffe unterschiedlicher Molekülgröße bildeten.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Perfusions-Testes, bei dem die Funktionsfähigkeit von immunologisch isolierten Langerhans- Inseln mit der nicht-geschützter Inseln verglichen wurde, die vier Wochen in vitro gehalten worden waren. Figur 2A stellt die Ergebnisse dar, die mit einer immunologisch isolierenden Trägersubstanz erzielt wurden, die eine Hydrogel- Kernmatrix und eine aus einer permselektiven thermoplastischen Membran hergestellte periphere Hülle aufwies. Figur 2B zeigt die Ergebnisse, die mit einer immunologisch isolierenden Trägersubstanz erzielt wurden, die eine Hydrogel-Kernmatrix und eine periphere Hydrogel-Hülle aufwies.
Figur 3 zeigt in graphischer Form die freigesetzte Insulin-Gesamtmenge und die Insulin-Mengen, die während der ersten und zweiten Reaktionsphase des auch in Figur 2 gezeigten Perfusions-Tests freigesetzt wurden. Figur 3A zeigt die Ergebnisse, die mit einer immunologisch isolierenden Doppelmatrix- Trägersubstanz erzielt wurden. Figur 3B zeigt die Ergebnisse, die mit einer immunologisch isolierenden Trägersubstanz erzielt wurden, die aus einer Kernmatrix und einer permselektive Membran bestand.
Figur 4 zeigt in graphischer Form die Verminderung der Glucose-Spiegel im Plasma, die bei Mäusen, bei denen durch Streptozotocin Diabetes induziert worden war, nach Implantation immunologisch isolierter xenogener Langerhans-Inseln über einen Zeitraum von 60 Tagen festgestellt wurde. Die verwendete immunologisch isolierende Trägersubstanz besaß die in Beispiel 5 beschriebene Konfiguration.
Figur 5 zeigt in graphischer Form die Insulin-Freisetzung bei einem Perfusions-Test, wobei eine Ratten-Langerhans-Inseln enthaltende immunologisch isolierende Trägersubstanz mit der in Beispiel 5 beschriebenen Konfiguration verwendet wurde, die nach einer bestimmten Verweildauer in vivo zurückgewonnen und mit oder ohne Theophyllin-Stimulation mit Glucose behandelt wurde.
Figur 6 zeigt in graphischer Form die Verminderung der Glucose-Spiegel im Plasma, die bei Mäusen, bei denen durch Streptozotocin Diabetes induziert worden war, nach Implantation immunologisch isolierter xenogener Langerhans-Inseln über einen Zeitraum von 100 Tagen festgestellt wurde. Die verwendete immunologisch isolierende Trägersubstanz wies die in Beispiel 4 beschriebene Konfiguration auf.
Figur 7 ist eine graphische Darstellung der Permeabilität einer Alginat-Matrix für verschiedene gelöste Testsubstanzen. Die Permeabilität wurde nach 16- stündiger und 160-stündiger Aufbewahrung in Hank-Lösung getestet. Die Veränderung der Permeabilität ist auf das Herauslösen von Ca&spplus;&spplus;-Ionen aus der Matrix zurückzuführen.
Figur 8 vergleicht in graphischer Form die Reaktionen von Ratten- Langerhans-Inseln auf eine Glucose-Behandlung nach einer bestimmten in vivo-Verweildauer in diskordanten xenogenen Rezipienten (Meerschweinchen), wobei die Ratten-Langerhans-Inseln in immunologisch isolierenden Doppelmatrix-Trägersubstanzen eingekapselt waren, die entweder eine thermoplastische Hülle oder eine Alginat-Hülle aufwiesen.
Figur 9 zeigt in graphischer Form, daß nach Implantation einer immunologisch isolierenden Trägersubstanz, die chromaffine Nebennieren- Zellen in einer Kern-Matrix enthielt und eine randständige Hülle aus permselektivem thermoplastischen Material aufwies, bei Nagetieren mit experimentell induziertern Parkinson-ähnlichen Verhalten die normale Motorik teilweise wiederhergestellt wurde.
Figur 10 ist eine graphische Darstellung der Veränderungen des durchschnittlichen Körpergewichtes, die bei Ratten mit Chinolinsäure- Läsionen festgestellt wurden. Ratten, die chromaffine Rinder-Nebennieren- Zellen enthaltende immunologisch isolierende Kapseln erhalten hatten, konnten ihr Körpergewicht deutlich besser halten als die anderen geschädigten Ratten.
Figur 11 zeigt in graphischer Form die Glukose-Konzentrationen im Plasma normal gefütterter diabetischer Mäuse nach Implantation von Acryl- Gopolymer-Hohlfasern vom Typ 2, die entweder 1000 Ratten-Langerhans- Inseln (A) oder 500 Ratten-Langerhans-Inseln (B) enthielten, wobei die Implantation entweder intraperitoneal (Kreise) oder subcutan (Quadrate) erfolgt war.
Figur 12 zeigt in graphischer Form die Wirkungen von implantierten Ratten- Langerhans-Inseln, die in blattförmige Vorrichtungen eingekapselt waren, auf die Blut-Glucose-Konzentration bei diabetischen Ratten.

Genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch verträgliche, immunologisch isolierende Trägersubstanzen, die zur langfristigen Implantation in Lebewesen geeignet sind. Wegen ihrer biologischen Verträglichkeit eignen sich die Trägersubstanzen zur langfristigen Isolierung biologisch nützlicher Zellen und/oder Stoffe gegen die verschiedenen Schutzsysteme des Körpers. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Schutzsysteme" bezieht sich auf die Typen der immunologischen Abwehr, die durch das Immunsystem des Lebewesens, in das die erfindungsgemäße Trägersubstanz implantiert worden ist, aktiviert werden können, sowie auf andere Abstoßungs-Mechanismen, wie z.B. die Fibrose-Reaktion, die Reaktion auf Fremdkörper und andere Entzündungsreaktions-Typen, die durch die Gegenwart eines Fremdkörpers im Körper des Lebewesens induziert werden können. In der vorliegenden Erfindung beschriebene Trägersubstanz-Implantate und darin enthaltene Stoffe bleiben in vivo länger als drei Monate funktionsfähig, in vielen Fällen sogar länger als ein Jahr. Außerdem können erfindungsgemäße Trägersubstanzen in ausreichender Größe hergestellt werden, so daß eine einzige oder einige wenige (weniger als 10) implantierbare und leicht zurückgewinnbare Trägersubstanz(en) eine ganze therapeutische Dosis eines Stoffes abgeben kann/können.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "biologisch verträglich" bezieht sich sowohl auf die ganze Trägersubstanz als auch auf die darin enthaltenen Stoffe. Insbesondere bedeutet der Begriff, daß die implantierte vollständige Trägersubstanz und darin enthaltene Stoffe keine schädlichen Wirkungen auf die verschiedenen Körper-Schutzsysteme ausüben können und über eine signifikante Zeitspanne funktionsfähig bleiben. Neben der Vermeidung von Schutzreaktionen des Immunsystems oder von Fibrose- Reaktionen auf Fremdkörper bedeutet "biologisch verträglich" auch, daß die Trägersubstanz und darin enthaltene Stoffe keine unerwünschten spezifischen cytotoxischen oder systemischen Wirkungen verursachen, die beispielsweise die gewünschte Funktionsfähigkeit der Trägersubstanz oder der darin enthaltenen Stoffe beeinträchtigt.
Wichtig für die biologische Verträglichkeit und die kontinuierliche Funktionsfähigkeit sind die Morphologie der Trägersubstanzen, ihre hydrophoben Eigenschaften und das Fehlen unerwünschter Stoffe, die sich entweder auf der Oberfläche der Trägersubstanz selbst befinden oder daraus herausgelöst werden können. Daher werden aufgerauhte Oberflächen, Falten, Zwischenschichten oder andere Formen oder Strukturen vermieden, die eine Reaktion auf Fremdkörper hervorrufen. Die Trägersubstanzen bildenden Materialien sind hinreichend rein, so daß keine unerwünschten Stoffe aus den Trägersubstanz-Materialien herausgelöst werden. Außerdem wird es nach der Herstellung der Trägersubstanzen vermieden, die Außenfläche der Trägersubstanzen mit Flüssigkeiten oder Materialien (z.B. Serum) zu behandeln, die an der Trägersubstanz haften oder daran adsorbiert werden können und anschließend die biologische Verträglichkeit der Trägersubstanz beeinträchtigen.
Die vorliegende Erfindung betrifif auch ein Verfahren zur Isolierung oder zum Schutz implantierter Zellen, Gewebe oder anderer Materialien vor der Immunabwehr. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Trägers ubstanzen eignen sich zur Abgabe verschiedenster zellulärer Produkte einschließlich Produkten hohen Molekulargewichts an ein Lebewesen, das diese benötigt, und/oder zur Bereitstellung benötigter Stoffwechsel-Funktionen, wie z.B. Entfernung schädlicher Stoffe, in einem Lebewesen. Produkte, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen abgegeben werden können, umfassen verschiedenste Faktoren, die normalerweise von verschiedenen Organen oder Geweben sezerniert werden. Beispielsweise kann Insulin an einen Diabetes-Patienten abgegeben werden, Dopamin an einen an der Parkinson-Krankheit leidenden Patienten oder Faktor VIII an einen Bluter vom Typ A. Andere Produkte, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen abgegeben werden können, umfassen trophische Faktoren, wie z.B. Erythropoietin, Wachstumshormone, Substanz P und Neurotensin. Eine andere Produktfamilie, die zur Abgabe durch die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen geeignet ist, umfaßt Modulatoren biologischer Reaktionen einschließlich Lymphokine und Cytokine. Auch Antikörper aus Antikörpersezernierenden Zellen eignen sich zur Abgabe. Spezifische Antikörper, die nützlich sein können, umfassen gegen tumorspezifische Antigene gerichtete Antikörper. Durch die Freisetzung von Antikörpern lassen sich auch die Mengen von im Blutkreislauf befindlichen Verbindungen, wie z.B. Hormonen oder Wachstumsfaktoren, vermindern. Diese Produkte eignen sich zur Behandlung von verschiedensten Krankheiten, Entzündungs-Zuständen oder -Störungen und Carcinomen. Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen lassen sich auch zur Wiederherstellung oder Steigerung lebenswichtiger Stoffwechsel-Funktionen verwenden, wie z.B. zur Entfernung von Toxinen oder schädlichen Stoffwechselprodukten (z.B. Cholesterin) aus dem Blutstrom durch Zellen, wie Hepatozyten. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Trägersubstanzen ermöglichen die Implantation von Zellen, ohne daß man während der Behandlungsdauer gleichzeitig Immunreaktionen des Rezipienten künstlich unterdrücken muß. Durch die Verwendung der biologisch verträglichen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen kann das physiologische Gleichgewicht bestimmter Stoffe wiederhergestellt und über längere Zeitspannen aufrechterhalten werden. Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen können eine Vielzahl von Zellen enthalten, so daß die Implantation einer einzigen Trägersubstanz ausreicht, um ein Lebewesen mit einer wirksamen Menge eines benötigten Stoffes oder einer benötigten Funktion zu versorgen.
Die erfindungsgemäßen biologisch verträglichen, immunologisch isolierenden Trägersubstanzen umfassen (a) einen Kern, der eine biologisch aktive Einheit enthält, die entweder in einem Flüssigmedium suspendiert oder in einem Hydrogel oder einer extrazellulären Matrix immobilisiert ist, und (b) einen randständigen oder peripheren Bereich (Hülle), der aus einer permselektiven Matrix oder Membran besteht, keine isolierten Zellen enthält, biologisch verträglich ist und eingekapselte Zellen vor der Immunabwehr zu schützen vermag, falls Zellen im Kern vorhanden sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet eine biologisch aktive Einheit ein Gewebe, eine Zelle oder andere Stoffe, die eine biologisch nützliche Wirkung im Körper des Lebewesens ausüben können, in dem die erfindungsgemäßen eine biologisch aktive Einheit enthaltenden Trägersubstanzen implantiert sind. Der Begriff " biologisch aktive Einheit" umfaßt daher Zellen oder Gewebe, die einen biologisch aktiven Stoff in gelöster Form sezernieren oder freisetzen, Zellen oder Gewebe, die eine Stoffwechsel- Fähigkeit oder Stoffwechsel-Funktion bereitstellen, wie z.B. die Entfernung spezifischer Stoffe in gelöster Form aus dem Blutstrom, oder biologisch aktive Stoffe, wie z.B. Enzyme, trophische Faktoren, Hormone oder Modulatoren einer biologischen Reaktion.
Wenn die innerhalb des Kerns einer biologisch verträglichen, immunologisch isolierenden Trägersubstanz enthaltene biologisch aktive Einheit Zellen umfaßt, wird der Kern so konstruiert, daß er den darin eingekapselten Zellen eine geeignete räumliche Umgebung zur Aufrechterhaltung ihrer Lebens- und Funktions-Fähigkeit bietet. Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen können zur immunologischen Isolierung verschiedenster Zellen oder Gewebe verwendet werden, wobei die gesamte Bandbreite von voll ausdifferenzierten, Anker-abhängigen Zellen oder Primär-Geweben bis zu nicht vollständig ausdifferenzierten fötalen oder neonatalen Geweben und Anker- unabhängigen transformierten Zellen oder Zellinien reicht.
Viele transformierte Zellen oder Zellinien werden am vorteilhaftesten in einer Trägersubstanz eingekapselt, die einen flüssigen Kern aufweist. Beispielsweise lassen sich PC12-Zellen (die Dopamin sezernieren und die sich, wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt, zur Behandlung der Parkinson-Krankheit eignen) in einer Trägersubstanz einkapseln, deren Kern ein Nährstoff-Medium umfaßt, das zur Unterstützung der Lebens- und Funktions-Fähigkeit der Zellen gegebenenfalls eine flüssige Quelle für weitere Faktoren enthält, wie z.B. fötales Rinder- oder Pferde-Serum.
Zweckmäßigerweise kann der Kern aus einer Matrix bestehen, die aus einem Hydrogel gebildet wird, das die Position der Zellen in Zellhaufen stabilisiert. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Hydrogel" bedeutet ein dreidimensionales Netzwerk aus vernetzten hydrophilen Polymeren. Das Netzwerk hat die Form eines Gels, das im wesentlichen aus Wasser, vorzugsweise aus nicht mehr als 90% Wasser besteht, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Man kann vernetzte Hydrogele als Feststoffe betrachten, da sie ohne äußerlich angewandte starke Scherkräfte nicht fließen oder sich verformen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gehören Hydrogele bildende Zusammensetzungen zu zwei Klassen. Die erste Klasse ist insgesamt negativ geladen. Ein typischer Vetreter davon ist Alginat. Die zweite Klasse ist insgesamt positiv geladen. Typische Vertreter davon sind extrazelluläre Matrix- Bestandteile, wie Collagen und Laminin. Beispiele für im Handel erhältliche extrazelluläre Matrix-Bestandteile umfassen Matrigel und Vitrogen .
Zellen, die keinen Anker-Träger brauchen, sind beispielsweise Zellen, die Zusammenballungen oder Aggregate bilden können und daher für einander einen Anker darsteilen. Beispiele für sich zusammenballende Zelltypen sind die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse, beta-Zellinien der Bauchspeicheldrüse, Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) und chromaffine Nebennieren-Zellen. Diese Zellen werden zweckmäßigerweise in einer negativ geladenen Matrix, z.B. Alginat, eingekapselt.
Im allgemeinen überleben Fibroblasten in einer positiv geladenen Matrix gut. Daher werden sie zweckmäßigerweise in Hydrogelen vom extrazellulären Matrix-Typ eingekapselt. Bestimmte Zelltypen neigen zur schnellen Vermehrung und könnten daher den im Kern verfügbaren Raum überwuchern, wenn sie keine Wachstumshemmung zeigen. Wenn die isolierten Zellen keine Wachstumshemmung nach Konfluenz zeigen, kann das Innere der Trägersubstanz Stoffe umfassen, die einen Stillstand der Teilungsaktivität induzieren können. In einigen Fällen kann ein Hydrogel-Kern zur Einschränkung der kontinuierlichen Proliferation ausreichen. Beispielsweise kann eine Hydrogelmatrix-Präkursor-Lösung verwendet werden, die jedoch nicht Polymerisierungsbedingungen ausgesetzt wird. Im Fall eines Natriumalginats bildet sich das Hydrogel nach Implantation nur langsam in dem Maße, in dem aus den umgebenden Geweben Calcium-Ionen herausgelöst werden. In einer anderen Ausführungsform können Wachstum-Hemmfaktoren oder Differenzierungs-Stimulatoren in Mikrokörner eines nur langsam abgebauten Polymers, wie z.B. Polycarbonat, eingebaut werden. Anschließend werden sie mit den Zellen cosuspendiert, die das Produkt sezernieren. Beispielsweise lassen sich NGF oder FGF zur Stimulation der PC12- Zelldifferenzierung und zur Beendigung der Zellteilung verwenden.
Andere Zellen, insbesondere Primär-Zellen oder Primär-Gewebe, neigen dazu, miteinander zu verkleben. Sie bilden dichte Aggregate, die zentrale Nekrose- Bereiche entwickeln, da die in den zusammengeballten Zellmassen enthaltenen Zellen für Nährstoffe und Sauerstoff kaum erreichbar sind. Diese dichten Zellmassen bilden sich aufgrund des Zellwachstums in dichten Kolonien entweder langsam oder nach erneuter Aggregation frisch dispergierter Zellen oder Gewebe, die durch Zelloberflächen-Adhäsionsproteine vermittelt wird, schnell. Im Stoffwechsel sind sehr aktive Zellen oder Gewebe für die Wirkungen eines Sauerstoff- oder Nährstoff-Mangels besonders anfällig und sterben kurz nach ihrer Einbettung in das Zentrum eines Aggregates ab. Viele endocrine Gewebe, die normalerweise von dichten Kapillarbetten versorgt werden, zeigen dieses Verhalten. Langerhans-Inseln und chromaffine Nebennieren-Zellen sind besonders empfindlich. Zellen oder Gewebe, die dieses Verhalten zeigen, weisen meistens eine sehr zufriedenstellende Funktionsfähigkeit in Trägersubstanzen auf, die einen Hydrogel-Matrixkern umfassen, in welchem sich Zellen oder Gewebe immobilisieren lassen und dadurch bleibt die Mehrzahl davon für Nährstoffe und Sauerstoff zugänglich In anderen Fällen kann die zur Immobilisierung verwendete Hydrogel-Matrix eine weitere Funktion erfüllen. Man kann nämlich damit funktionelle Einheiten bestimmter Größe und/oder Form produzieren oder aufrechterhalten, die zur Aufrechterhaltung wünschenswerter Eigenschaften der eingekapselten Zellen geeignet ist. Außerdem ermöglicht die Gegenwart der Kern-Matrix, daß Zellen oder Zellhaufen innerhalb der Trägersubstanz gleichmäßig verteilt bleiben (d.h., die Kern-Matrix verhindert die Sedimentation der enthaltenen Zellen und verringert ihre Beweglichkeit).
Eine besonders vorteilhafte Verwendung der Hydrogel-Kerne betrifft die Einkapselung sich aktiv teilender Zellen. Suspensionen sich aktiv teilender Zellen, die eingekapselt werden sollen, können Alginat oder andere Hydrogele umfassen. Nach Einkapslung und Erzeugung des Gels sind die eingekapselten Zellen im Gel bis zu einem gewissen Maß immobilisiert, wobei während der Zellteilung neu produzierte Zellen in der Nähe der Eltemzellen verbleiben. Auf diese Weise werden innerhalb des Kerns Zellhaufen produziert. Ein solches Züchtungsverfahren ist im Fall von Zellen wie der von beta-Zellen stammenden Zellinie NIT vorteilhaft. Bei Abwesenheit einer Kern-Matrix neigen diese Zellen zum Wachstum entlang der Innenwände der Einkapselungs- Vorrichtung, wobei nur sehr wenige Zellen frei im Hohlraum der Vorrichtung wachsen. Im Gegensatz zu einer frei wachsenden Population, die den Hohlraum der Trägersubstanz ausfüllen kann, führt ein ausschließliches Wachstum an den Wandungen der Kapsel zu einer Größe der Zellpopulation, die durch die Fläche der Kapsel-Innenwand beschränkt ist. Wenn der Kern Alginat umfaßt, ist das Zellwachstum nicht länger auf die Innenfläche der Kapsel beschränkt. Stattdessen werden im Kern distinkte kugelförmige NIT-Zeilhaufen produziert, die zu einer Gesamt-Zellpopulation führen, die signifikant größer ist als eine in Abwesenheit von Alginat auftretende Zellpopulation.
Selbst in Gegenwart einer Kern-Matrix wird die Größe von Gewebefragmenten, die in eine Trägersubstanz mit einem bestimmten Volumen eingefüllt werden können, durch das Auftreten von zentralen Nekrosen innerhalb der einzelnen Fragmente beschränkt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Erhöhung der gewünschten Menge von Gewebefragmenten, die in eine immunologisch isolierende Trägersubstanz eingefüllt werden kann, indem die Zellen so präpariert werden, daß sie verbesserte Diffusionseigenschaften aufweisen. Für peritoneal zu implantierende Trägersubstanzen bedeutet das allgemein, daß Gewebefragmente bis mit zu einem Durchmesser von weniger als 75 µm und optimalerweise bis mit zu einem Durchmesser von etwa 35 µm oder weniger präpariert werden müssen. Für spontan reaggregierende Zellen (z.B. Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse oder chromaffine Nebennieren-Zellen) werden Zell-Aggregate oder Zell-Haufen in verbesserter Diffusions-Form hergestellt, indem Gewebe enzymatisch zu Einzelzellen und kleinen Zellaggregat-Suspensionen dispergiert wird und im Anschluß daran eine gesteuerte Reaggregation erfolgt, bis eine Form mit verbesserten Diffusionseigenschaften entsteht.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Aggregation" betrifft ein Verfahren zur Förderung der Zellhaufen-Bildung. Zeilhaufen bildende Zellen können aus natürlich vorkommenden Aggregaten gewonnen werden, z.B. Bauchspeicheldrüsen-Inseln, die zu Einzelzellen oder kleine Zell- Zusammenballungen enthaltenden Suspensionen dispergiert und anschließend nach den beschriebenen Verfahren erneut aggregiert werden. In einer anderen Ausführungsform werden die Zellen zuerst als Einzelzellen oder kleine Zell-Zusammenballungen gewonnen und danach aggregiert, wobei sich ein Zeilhaufen gewünschter Größe bildet. Solche Zellhaufen enthalten je nach Zellgröße und Aggregations-Eigenschaften im allgemeinen etwa 3 bis 400 Zellen. Typischerweise enthält ein Zellhaufen etwa 10 bis etwa 50 Zellen. Die Verwendung reaggregierter Bauchspeicheldrüsen-Inselzellen ist vorteilhaft, um im Kern geeignete Diffusions-Eigenschaften zu sichern und die Lebensfähigkeit der Inselzellen zu erhalten. Reaggregierte Inselzellen erlauben auch die Verwendung kleinerer Kapseln. Beispielsweise wäre für 500 nicht-reaggregierte Inselzellen im allgemeinen eine Kapsel mit einer Länge von etwa 14 cm erforderlich (bei einer Dichte von 2%). Kapseln, die reaggregierte Inselzellen enthalten, die insgesamt kleiner als eine intakte Langerhans-Insel sind, brauchen wegen der effizienteren Packung dagegen nur 1 cm bis 2 cm lang zu sein. Eine effizientere Packung erlaubt einen niedrigeren Sauerstoffpartialdruck (pO&sub2;) außerhalb der Faser, ohne daß es dadurch zu Nekrosen in den Kernen kommt. Eine eingebaute Toleranz für einen niedrigeren äußeren pO&sub2;-Wert hat zumindest zwei Vorteile. Erstens kann eine kleinere Kapsel zur Aufnahme der gleichen Zellzahl verwendet werden, wobei eine erhöhte Gewebedichte innerhalb des Implantats besser toleriert wird. Zweitens lassen sich Stellen erfolgreich zur Implantation verwenden, von denen bekannt ist, daß sie einen geringeren pO&sub2;-Wert aufweisen, wie Z.B subcutane Stellen. Die Gegenwart der Alginat-Matrix stellt weiterhin sicher, daß die Aggregate sich nicht wieder zu großen Zeilverbänden verbinden, bei denen innenliegenden Zellen Nährstoffe und/oder Sauerstoff entzogen würden.
Bauchspeicheldrüsen-Inselzellen behalten nach enzymatischer Dispersion und Reaggregation ihre Funktionsfähigkeit und sezernieren als Reaktion auf Glucose in fast normaler Weise Insulin. Zellen aus dispergierten Inseln werden vor Beschickung der Trägersubstanz bis zur gewünschten Zellhaufen-Größe reaggregiert. Eine Reaggregation kann mit Hilfe der von Britt, Diabetes 34, 898- 903, beschriebenen Verfahren oder mittels ähnlicher Verfahren erreicht werden. Die optimale Aggregat-Größe für Inselzellen ist der kleinste Zelihaufen, der gerade noch die gewünschten physiologischen Merkmale zeigt. Dann werden die Matrix oder Matrix-bildenden Materialien zu den Zellen gegeben. Diese Kombination kann in biologisch verträgliche, immunologisch isolierende Trägersubstanzen coextrudiert oder eingefüllt werden. Wenn nötig, kann danach die Matrix-Bildung induziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen über Nacht bei 37ºC ohne Rühren reaggregiert. Die Entwicklung der Aggregate wird mittels lichtmikroskopischer Verfahren solange kontrolliert, bis die Aggregate einen Durchmesser von 25 µm bis 75 µm, vorzugsweise von 35 µm erreicht haben. Danach wird den Zellen nicht vernetztes flüssiges Alginat bis zu einer Konzentration von 0,5% bis 2% zugegeben, die Zellen werden in die Trägersubstanzen eingebaut, die Trägersubstanzen werden gegebenenfalls abgedichtet und durch Eintauchen der Trägersubstanzen in einer CaCl&sub2;-Lösung wird Polymerisation induziert.
Erfindungsgemäße Trägersubstanzen mit Primär-Zellen oder Primär-Geweben lassen sich in verschiedenen medizinischen Anwendungsbereichen einsetzen. Manchmal ist es ratsam, als Quelle für Primärkulturen Tiere zu verwenden, deren Erbgut und Entwicklung sorgfältig überwacht wurde, da dadurch eine bessere Kontrolle möglich ist und das gesundheitliche Risiko für Patienten eingeschränkt wird. Durch die Verwendung spezifischer pathogenfreier oder keimfrei aufgezogener Tiere als Ausgangsmaterial lassen sich unerwünschte Viren, Bakterien und andere Pathogene beschränken. Literaturstellen und Verfahren zur Etablierung, Pflege und Verwendung spezifischer pathogenfreier und keimfrei aufgezogener Zuchtstämme sind von Maniatis, O. P. et al., Can. J. Med. 42 (1978), 428, Matthews, P. J., et al., Recent Advances In Germ Free Research (1981), 61-64, Tokal Univ. Press, und in den von National SPF Swine Accrediting Agency, Inc., Conrad, Iowa, veröffentlichten National Accreditation Standards genannt.
Ein Matrix-Kern kann gegebenenfalls auch Materialien enthalten, die die Funktion der isolierten Zellen unterstützen oder fördern. Zur Förderung einer spezifischen Anlagerung oder Adhäsion der isolierten Zellen können beispielsweise extrazelluläre Matrix (ECM)-Bestandteile enthalten sein. Eine Kombination von ECM-Bestandteilen, die zur Wachstumsförderung bestimmter Zelltypen besonders geeignet ist wird von Kleinman et al. (1989) im US-Patent 4,829,000 gelehrt. Die Kern-Matrix kann als Reservoir für lösliche oder freisetzbare Stoffe dienen, wie z.B. Wachstumsfaktoren bzw. das Wachstum regulierende Stoffe oder natürliche oder synthetische Stoffe, die das Nährstoffoder Sauerstoff-Angebot für die isolierten Zellen erhöhen oder verbessern. Das Reservoir kann daher eine ähnliche Funktion ausüben wie die Knochenmark- ECM, die als Reservoir beschrieben worden ist, das spezifische Wachstumsfaktoren für die Knochenmarks-Zell-Ahnenreihe langsam freisetzt, wie z.B. den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (gmcsf) (Gordon, M. Y., et al., Nature 326 (1987), 403-405). Die Kern-Matrix kann als Reservoir für Wachstumsfaktoren (z.B. Prolactin oder den Insulinähnlichen Faktor 2), das Wachstum regulierende Stoffe, wie den transformierenden Wachstumsfaktor 13 (TGF 13) oder das Retinoblastom verursachende Genprodukt, oder solche Stoffe dienen, die den Nährstoff- Transport verbessern (z.B. Perfluorkohlenwasserstoffe, die die Konzentration von im Kern gelöstem Sauerstoff erhöhen können). Einige dieser Stoffe eignen sich zum Einschluß in Flüssigmedien.
In einer Trägersubstanz kann außerdem eine Population von Zellen eingekapselt werden, die Nährstoffe oder Ergänzungsstoffe abgeben. Beispielsweise können Hepatozyten gemeinsam mit Endothel-Zellen eingekapselt werden, die Ergänzungsstoffe abgeben (Cai, Z., et al., Artificial Organs, 12(5) (1988), 388-393), oder mit Insel-Zellen gemischt werden (Ricordi, C., et al., Transplantation 45(6) (1987), 1148-1151). Chromaffine Nebennieren Zellen können gemeinsam mit Zellen eingekapselt werden, die Ergänzungsstoffe produzieren und z.B. den Nerven-Wachstumsfaktor (NGF) bereitstellen, einen von chromaffinen Zellen benötigten Stoff. Im letzteren Fall lassen sich mit einem FGF-Expressionsvektor transfizierte Fibroblasten als Ergänzungsstoffe produzierende Zellen verwenden.
Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen lassen sich auch als Reservoir zur kontrollierten Abgabe benötigter Medikamente oder biologischer Therapeutika verwenden. In diesen Fällen enthält der Kern das gewählte hochkonzentrierte Medikament oder biologische Therapeutikum und keine Zellen oder Gewebe. Außerdem kann man in einen Rezipienten Satelliten-Trägersubstanzen implantieren, die Stoffe enthalten, die eine günstige Umgebung in dem Körperbereich herstellen oder erzeugen, in den eine isolierte Zellen enthaltende, biologisch verträgliche, immunologisch isolierende Trägersubstanz implantiert wird. In solchen Fällen wird eine immunologisch isolierte Zellen enthaltende Trägersubstanz zusammen mit den Satelliten- Trägersubstanzen in den betreffenden Bereich implantiert, wobei die Satelliten-Trägersubstanzen kontrolliert Mengen z.B. eines Stoffes freisetzen, der einer Entzündungsreaktion des Rezipienten entgegenwirkt oder diese hemmt (z.B. gegen Entzündungen gerichtete Steroide), oder eines Stoffes, der das Einwachsen von Kapillarbetten stimuliert (d.h. eines angiogenen Faktors).
Der randständige oder periphere Bereich (Hülle) der erfindungsgemäßen Trägersubstanz ist permselektiv und biologisch verträglich und isoliert immunologisch. Dieser Bereich wird so hergestellt, daß er frei von eingekapselten Zellen ist und den Kern (d.h. die isolierten Zellen) vollständig umschließt, wobei ein Kontakt zwischen den im Kern enthaltenen Zellen und dem Körper des Rezipienten verhindert wird.
Zunächst soll die Permselektivität der Hülle erörtert werden. Die Hülle wird so gebildet, daß ihr Molekulargewichts-Ausschlußwert (MWCO) in einem Bereich liegt, der sowohl dem Typ und dem Ausmaß der nach Trägersubstanz- Implantation zu erwartenden Immunreaktion als auch der Molekülgröße des größten Stoffes entspricht, dessen Passage in die Trägersubstanz oder aus der Trägersubstanz heraus gewünscht wird. Typ und Ausmaß der immunologischen Abwehrreaktionen, die der Rezipient nach Implantation der Trägersubstanz zeigt, hängen teilweise von dem/den Typ(en) der darin eingekapselten Einheit und teilweise von der Art des Rezipienten ab (d.h. wie eng der Rezipient mit der Quelle der biologisch aktiven Einheit genetisch verwandt ist). Wenn das implantierte Gewebe zum Rezipienten allogen ist, verläuft eine immunologische Abstoßung größtenteils über zellvermittelte Abwehrreaktionen der Rezipienten-Immunzellen gegen die implantierten Zellen. Wenn das Gewebe zum Rezipienten xenogen ist, kann eine Abwehrreaktion auf molekularer Ebene vorherrschen, die sowohl über den Zusammenbau des cytolytischen Komplement-Abwehrkomplexes des Rezipienten als auch über eine Antikörper-Wechselwirkung mit dem Komplement erfolgt.
Der MWCO-Wert des randständigen Bereiches muß daher niedrig genug sein, um den Zugang der Stoffe zu verhindern, die diese Abwehrreaktionen gegenüber dem Kern produzieren, jedoch groß genug, um die Abgabe der benötigten Produkte an den Körper des Rezipienten zu erlauben. Es ist daher klar, daß der MWCO-Wert nicht streng auf den Bereich beschränkt sein muß, der Immunglobulin G aus dem Kern ausschließt. Es gibt nämlich viele Fälle, bei denen höhere MWCO-Werte nicht nur möglich, sondern sogar vorteilhaft sind. Höhere MWCO-Werte erlauben sowohl die Abgabe verschiedenster nützlicher Produkte aus immunologisch isolierten Zellen als auch die Verwendung solcher Zellen, die den Stoffwechsel von Stoffen hohen Molekulargewichts kontrollieren.
In geeigneten Fällen kann daher der periphere oder randständige Bereich aus Materialien hergestellt werden, die permselektive Membranen oder Hydrogel- Matrices bilden, welche die Passage von Molekülen bis zu einer Größe erlauben, die in etwa der von C1q entspricht (etwa 400 kD), dem größten Protein, das zum Zusammenbau des Komplement-Abwehrkomplexes erforderlich ist. Daher kann jedes Zellprodukt oder jeder Metabolit, das/der kleiner als C1q ist, die Trägersubstanz frei passieren. In anderen Fällen kann es nach wie vor erwünscht sein, daß Immunglobuline ausgeschlossen werden. In solchen Fällen können Materialien verwendet werden, die Matrices oder Membranen bilden, durch die Moleküle nicht passieren können, die genauso groß wie Immunglobulin G (etwa 150 kD) oder größer sind. Zellprodukte oder Metabolite, die kleiner als 150 kD sind, können die Trägersubstanz noch passieren. In noch anderen Fällen, wenn das Immunsystem des Patienten künstlich unterdrückt wird oder wenn das implantierte Gewebe syngen zum Patienten ist, ist das Auftreten starker Immun-Abwehrreaktionen nicht wahrscheinlich und die Passage eines Moleküls hohen Molekulargewichts kann erwünscht sein. In letzteren Fällen können Materialien verwendet werden, die die Passage aller Moleküle bis zu einer Größe gestatten, die der von Immunglobulin M entspricht (etwa 1000 kD). Diese Materialien verhindern nur die Passage sehr großer Stoffe, wie z.B. Zellen.
Bei einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, daß für die Hülle ein Molekulargewichts-Ausschlußwert verwendet werden kann, der beträchtlich höher ist als der, der vorher in Betracht gezogen wurde, und Lebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit der eingekapselten Zellen trotzdem erhalten bleiben.
Dadurch ist die Verwendung von Makrokapseln bei Anwendungen möglich, bei denen die Zellen einen Stoff hohen Molekulargewichts sezernieren. Für diesen Zweck kann erfindungsgemäß eine Makrokapsel eingesetzt werden, deren Molekulargewichts-Ausschlußwerte beispielsweise 80 kD - 100 kD übersteigen und sogar bis zu 200 kD - 1000 kD oder 2000 kD oder mehr betragen können.
Als nächstes soll die biologische Verträglichkeit des randständigen oder peripheren Bereiches (Hülle) erörtert werden. Diese Eigenschaft wird durch eine Kombination von Faktoren verursacht. Erstens werden die zur Bildung der Trägersubstanzen verwendeten Materialien so gewählt, daß sie mit den Geweben des Rezipienten der implantierten Trägersubstanz kompatibel sind und von diesen angenommen werden. Es werden Stoffe verwendet, die für den Rezipienten oder die eingekapselte biologisch aktive Einheit nicht schädlich sind. Bevorzugte Stoffe umfassen Stoffe, die reversibel oder irreversibel in den Gelzustand übergehen können (z.B. Stoffe, die Hydrogele bilden), und in Wasser unlösliche thermoplastische Polymere. Besonders bevorzugte thermoplastische Polymer-Stoffe sind solche, die nur in geringem Maße hydrophob sind, d.h. die einen in Brandrup, J., et al., Polymer Handbook, 3. Ausgabe (1989), John Wiley & Sons, NY, definierten Löslichkeitsparameter aufweisen, der zwischen 8 und 15 (Joule/m³)1/2, bevorzugterweise zwischen 9 und 14 (Joule/m³)1/2 liegt. Die Polymer-Stoffe werden so gewählt, daß sie einen Löslichkeitsparameter aufweisen, der niedrig genug ist, damit sie sich in organischen Lösungsmitteln lösen, jedoch groß genug ist, damit sie sich trennen und eine geeignete Membran bilden. Solche Polymer-Stoffe sollten frei von instabilen nudeophilen Einheiten und selbst in Abwesenheit von Stabilisierungsmitteln sehr widerstandsfähig gegen Oxidationsmittel und Enzyme sein. Auch die für eine bestimmte immunologisch isolierende Trägersubstanz voraussichtliche Verweildauer in vivo muß berücksichtigt werden: es müssen Stoffe ausgewählt werden, die ausreichend stabil sind, wenn sie bestimmten physiologischen Bedingungen und Streßsituationen ausgesetzt sind. Es gibt viele Hydrogele und thermoplastische Materialien, die selbst über längere Verweilzeiten in vivo ausreichend stabil sind, beispielsweise wenn die Verweilzeit ein oder zwei Jahre übersteigt. Beispiele für stabile Materialien umfassen Alginat (Hydrogel) und PAN/PVC (thermoplastisches Material).
Zweitens sind zur Herstellung biologisch verträglicher, immunologisch isolierender Trägersubstanzen verwendete Stoffe frei von herauslösbaren fiebererzeugenden Substanzen oder Substanzen, die in anderer Weise schädlich sind, Reizungen auslösen oder immunogen wirken. Oder die Stoffe werden zur Entfernung dieser schädlichen Stoffe ausgiebig gereinigt. Nach Aufreinigung sowie während der gesamten Herstellung und Aufbewahrung bis zur Implantation werden die Trägersubstanzen sorgfältig behandelt, um eine Vermischung oder Verunreinigung der Trägersubstanzen mit Stoffen zu verhindern, die ihre biologische Verträglichkeit nachteilig beeinflussen könnten.
Drittens wird die Konfiguration einer Trägersubstanz einschließlich ihrer Textur so gebildet, daß sie nach Implantation eine optimale Grenzschicht zu den Geweben des Rezipienten bietet. Dieser Parameter wird teilweise durch die Implantations-Stelle bestimmt. Wenn sich die Trägersubstanz beispielweise in der Bauchhöhle des Rezipienten befindet, sollte ihre Oberfläche glatt sein. Bei Einbettung in die Weichgewebe des Rezipienten kann ihre Oberfläche jedoch in geringem Maße aufgerauht oder punktiert sein. Ein bestimmender Faktor dabei ist, ob eine Anlagerung von Rezipienten-Zellen an die äußere Hülle der Trägersubstanz erwünscht ist oder ob eine solche Anlagerung vermieden werden muß. Eine offen strukturierte oder schwammartige Oberfläche kann das Einwachsen von Kapillarbetten fördern, während eine glatte Oberfläche ein exzessives Überwuchern mit Fibroblasten verhindern kann. Ein exzessives Überwuchern mit Fibroblasten sollte vermieden werden, außer wenn die Kapillaren unterentwickelt sind, wie es z.B. der Fall ist, wenn sich eine schwach durchlässige Membran als Basisschicht um die Trägersubstanz herum ablagert und die eingekapselten Zellen keinen Kontakt mit dem Körper des Rezipienten haben.
Es hat sich auch herausgestellt, daß bestimmte geometrische Trägersubstanz- Formen die gegen Fremdkörper gerichteten Fibrose-Reaktionen induzieren. Deshalb sollten diese Formen vermieden werden. Trägersubstanzen sollten daher keine strukturierten Trennschichten enthalten, wie z.B. aufgerauhte Oberflächen oder Falten. Im allgemeinen sollten gegenüberliegende Oberflächen oder Ränder derselben oder nebeneinanderliegender Trägersubstanzen mindestens 1 mm, vorzugsweise mehr als 2 mm und am bevorzugtesten mehr als 5 mm voneinander entfernt sein. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen Zylinder, U-förmige Zylinder sowie flache Blätter oder Sandwich-Formen.
Der randständige oder periphere Bereich (Hülle) der biologisch verträglichen, immunologisch isolierenden Trägersubstanz kann gegebenenfalls Stoffe enthalten, die eine lokal auftretende, gegen die implantierte Trägersubstanz gerichtete Entzündungsreaktion abschwächen oder verhindern und/oder lokal eine für die implantierten Zellen oder Gewebe geeignete Umgebung erzeugen oder fördern. Beispielsweise können sie Antikörper enthalten, die gegen einen oder mehrere Mediatoren der Immunreaktion gerichtet sind. Die Matrix- Präkursor-Lösung kann verfügbare potentiell nützliche Antikörper enthalten, beispielsweise Antikörper, die gegen Lymphokine, wie den Tumornekrose- Faktor (TNF) und Interferon (IFN), gerichtet sind. In ähnlicher Weise können gegen Entzündungen gerichtete Steroide enthalten sein (Christenson, L, et al., J. Biomed. Mat. Res. 23 (1989), 705-718; Christenson, L, Promotionsschrift (1989), Brown University, wobei der Inhalt beider Literaturstellen durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist). In einer anderen Ausführungsform kann ein Stoff enthalten sein, der die Bildung von Gefäßen (das Einwachsen von Kapillarbetten) stimuliert. Das kann besonders wünschenswert sein, wenn die eingekapselten Zellen oder Gewebe zu ihrer Funktionsfähigkeit einen engen Kontakt zum Blutstrom des Rezipienten brauchen (z.B. Insulin produzierende Langerhans-Inseln). Die Matrix kann auch Zellen enthalten, die gentechnisch verändert worden sind, damit sie Antikörper sezernieren.
An dieser Stelle soll erläutert werden, was eine immunologische Isolation bedeutet. Der randständige oder periphere Bereich schützt auch die biologisch aktive Einheit vor dem Immunsystem des Lebewesens, in das die Trägersubstanz implantiert worden ist, indem schädliche Stoffe des Körpers des Lebewesens am Eindringen in den Trägersubstanz-Kern gehindert werden und eine physikalische Barriere bereitgestellt wird, die einen nachteiligen immunologischen Kontakt zwischen der eingekapselten Einheit und dem Immunsystem des Lebewesens verhindern kann. Diese physikalische Barriere kann unterschiedlich dick sein, sie muß jedoch immer ausreichend dick sein, damit ein direkter Kontakt zwischen den Zellen und/oder Stoffen auf beiden Seiten der Barriere verhindert wirdc Die Dicke dieses Bereichs liegt im allgemeinen bei 5 µm bis 200 µm, vorzugsweise bei 10 µm bis 100 µm und besonders bevorzugt bei 20 µm bis 50 µm. Immunologische Abwehr-Arten, die durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen verhindert oder minimiert werden können, umfassen die Abwehr durch Makrophagen, Neutrophile, zelluläre Immunreaktionen (z.B. natürliche Killer-Zellen und die Antikörper-abhängige, T-Zell-vermittelte Cytolyse [ADCC]) sowie humorale Reaktionen (z.B. die Antikörper-abhängige, Komplement-vermittelte Cytolyse).
Wie vorstehend diskutiert, werden Typ und Ausmaß einer gegen die implantierte Trägersubstanz gerichteten Immunreaktion des Rezipienten davon beeinflußt) ob der Rezipient und die eingekapselte biologisch aktive Einheit miteinander verwandt sind. Wenn das eingekapselte Material beispielsweise syngene Zellen umfaßt, verursachen diese keine starke Immunreaktion, es sei denn, daß der Rezipient an einer Autoimmunkrankheit hinsichtlich eines in der Trägersubstanz enthaltenen bestimmten Zell- oder Gewebe-Typs leidet. Es gibt mehrere Krankheits- oder Mangel-Zustände, bei denen vor kurzem festgestellt wurde, daß sie auf eine Autoimmunkrankheit zurückzuführen sind. Ein Beispiel dafür ist Insulin-abhängiger Diabetes mellitus vom Typ I, wobei die Insulin sezernierenden β-Zellen der Langerhans- Inseln der Bauchspeicheldrüse durch das Immunsystem des Lebewesens zerstört werden (Fan, M.-Y., et al., Diabetes 39 (1990), 519-522).
Syngene Zellen oder Gewebe sind selten verfügbar. In vielen Fällen sind nur allogene oder xenogene Zellen oder Gewebe verfügbar (d.h. von Spendern, die der gleichen Art wie bzw. einer anderen Art als der zukünftige Rezipient angehören). Die immunologisch isolierenden Trägersubstanzen erlauben die Implantation solcher Zellen oder Gewebe, ohne daß gleichzeitig eine Immunsuppression des Rezipienten erforderlich ist. Deshalb können mittels der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen viel mehr Lebewesen behandelt werden, als das mit herkömmlichen Transplantations-Techniken möglich ist. Beispielsweise leiden weit mehr Patienten an Typ I-Diabetes als Langerhans- Inseln von menschlichen Spendern zur Transplantation zur Verfügung stehen (1990 waren in den USA für alle Organ-Transplantationen weniger als 4000 geeignete menschliche Leichen verfügbar). Das Angebot an Langerhans- Inseln, die vom Schwein oder Rind als Spender stammen, ist weit größer. Wenn xenogene Inseln erfindungsgemäß immunologisch isoliert werden, kann Diabetes bei einer weit größeren Anzahl von Patienten als bisher geheilt werden. Es ist zu erwarten, daß sich Typ und Stärke einer gegen ein xenogenes Transplantat gerichteten Immunreaktion von Immunreaktionen unterscheiden, die bei Implantation eines syngenen oder allogenen Gewebes in einen Rezipienten auftreten. Die Abstoßung kann hauptsächlich über eine zeilvermittelte oder eine Komplement-vermittelte Abwehrreaktion verlaufen, wobei in bestimmten Fällen die bestimmenden Parameter allerdings noch wenig aufgeklärt sein mögen. Wie vorstehend angemerkt, ist jedoch der Ausschluß von IgG vom Kern der Trägersubstanz kein Kriterium für einen immunologischen Schutz, da IgG allein nicht ausreicht, eine Cytolyse von Ziel- Zellen oder Ziel-Geweben zu bewirken. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Makrokapseln, die vorzugsweise allogenes Gewebe enthalten, doch auch xenogenes Gewebe enthalten können, ist die Abgabe von benötigten Produkten hohen Molekulargewichts oder die Bereitstellung von Stoffwechsel-Funktionen, die Stoffen hohen Molekulargewichts eigen sind, möglich, vorausgesetzt, daß aus der immunologisch isolierenden Trägersubstanz die zur Vermittlung der Immunabwehr erforderlichen wichtigen Stoffe ausgeschlossen werden. Diese Stoffe können den C1q- Bestandteil des Komplement-Abwehr-Komplexes oder phagocytische oder cytotoxische Zellen umfassen. Die erfindungsgemäße immunologisch isolierende Trägersubstanz stellt eine Barriere zum Schutz der eingekapselten Zellen vor diesen schädlichen Stoffen bereit. Die erfindungsgemäßen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen können daher so verwendet werden, daß sogar aus allogenen oder xenogenen Zellen oder Geweben eine Abgabe von Produkten unterschiedlichsten Molekulargewichts möglich ist, wie z.B. Insulin, Nebenschilddrüsen-Hormon, Interleukin 3, Erythropoietin, Albumin, Transferrin und Faktor VIII.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung von Krankheiten bereit, die durch Degeneration des Nervensystems verursacht werden. Beispiele für Krankheiten des Menschen, bei denen man annimmt, daß sie mit einer Degeneration des Nervensystems einhergehen, sind die Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington, AIDS- verwandte Demenz und die Parkinson-Krankheit.
Tiermodelle für neurodegenerative Zustände basieren auf der Voraussetzung, daß ein spezifischer Anfall Nervenzellen schädigen oder abtöten kann. In einigen Fällen kann das sogar zu einem kaskadenartig verlaufenden Nervenzell-Tod führen, der die trophisch voneinander abhängigen Nervenzellen entlang der für spezifische Gehirn-Funktionen verantwortlichen Stoffwechselwege beeinflußt.
Eine Strategie zur Behandlung eines neurodegenerativen Zustandes umfaßt die lokale Verabreichung von Wachstumsfaktoren oder trophischen Faktoren, um (1) weitere Schädigungen postsynaptischer Nervenzellen zu hemmen und (2) die Lebensfähigkeit von Zellen zu verbessern, die von dem Anfall betroffen sind. Faktoren, von denen bekannt ist, daß sie die Lebensfähigkeit von Nervenzellen verbessern, umfassen den basischen Fibroblasten- Wachstumsfaktor, den ciliarneurotrophischen Faktor, den aus dem Gehirn stammenden neurotrophischen Faktor, Neurotrophin 3, Neurotensin und Substanz P.
In einem Tiermodell für neurodegenerative Excitotoxizität wird das Glutamat- Analog Chinolinsäure stereotaktisch in den Bereich des Gehirns injiziert, der als Striatum oder Basalganglien bekannt ist, um pathologische Nervenleiden und Symptome zu erzeugen, die denen eines an der Huntington-Krankheit leidenden Patienten analog sind. Sowohl das Modell als auch die eigentliche Huntington-Krankheit sind durch eine Schädigung von Nervenzellen charakterisiert, die für Aspekte der motorischen Kontrolle nötig sind.
Eines der früh auftretenden Symptome der Huntington-Krankheit ist ferner Gewichtsverlust (Sanberg, P. R., et al., Med. J. Aust. 1 (1981), 407-409). Ähnliche Wirkungen sind auch im Modellsystem sichtbar (Sanberg, P. R., et al., Exp. Neurol. 66 (1979), 444-466). Abnorm hohe Mengen an Chinolinsäure werden auch bei AIDS-verwandter Demenz festgestellt.
Erfindungsgemäß erfolgt die Abgabe trophischer Faktoren an den entsprechenden Gehirn-Bereich durch Implantation einer Trägersubstanz, die lebende Zellen enthält, die einen geeigneten Faktor sezernieren. Zweckmäßigerweise handelt es sich bei den Zellen um chromaffine Nebennieren-Zellen, von denen bekannt ist, daß sie mindestens einen Faktor, nämlich den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, sezernieren. Chromaffine Zellen können auch andere, bisher noch nicht identifizierte trophische Faktoren sezernieren. Es sollte erwähnt werden, daß sich diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung von der Verwendung chromaffiner Zellen zur Sekretion des Neurotransmitters Dopamin zur Heilung von Symptomen der Parkinson-Krankheit unterscheidet. Die Verwendung von Zellen, die den Nervenwachstumsfaktor sezernieren, wie z.B. Fibroblasten, die im Hinblick auf eine NGF-Expression gentechnisch verändert worden sind, stellt eine alternative Therapie der durch Chinolinsäure induzierten Nervenzell-Degeneration dar. Aus Myelin präparierte Schwann-Zellen können eingekapselt und in geeignete Bereiche des Gehirns implantiert werden, um die mit der Parkinson-Krankheit einhergehende Degeneration von Nervenzellen zu verhindern.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Tiermodell verwendet, bei dem Läsionen der Fimbria-Fornix herbeigeführt wurden. Insbesondere bei Nervenzellen des Septohippocampus-Systems wurden an den Axonen Einschnitte durchgeführt, was zu Degeneration und Zelltod führte. Man geht davon aus, daß dieses Modell den Lasions-Typen ähnlich ist, die beim Menschen die Alzheimer-Krankheit verursachen. Zweckmäßigerweise wird durch Implantation einer NGF sezernierende Zellen enthaltenden Trägersubstanz ein Wachstumsfaktor bereitgestellt, nämlich der Nervenwachstumsfaktor (NGF). Dazu können Astrozyten verwendet werden, deren Absterben ausgeschlossen wurde (z.B. durch Transformation mit dem großen T-Antigen) oder die im Hinblick auf eine NGF-Expression gentechnisch verändert wurden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zellen u m Fibroblasten, die gentechnisch so verändert wurden, daß sie rekombinantes NGF produzieren können. Die Fibroblasten überleben am besten in einem Kern, der aus einem Matrix-Material besteht, das eine extrazelluläre Matrix nachahmt, wie z.B aus Collagen oder Laminin enthaltenden Hydrogelen. Der Kern ist von einer immunologisch isolierenden Hülle umgeben, die die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen zu den Zellen im Kern und ebenso die Diffusion von sezerniertem NGF durch die Hülle hindurch in den Körper des Patienten erlaubt. Das Trägersubstanz-Implantat hemmt das Absterben cholinergischer Nervenzellen, wie durch Bestimmung der Anzahl von Nervenzellen bestimmt wurde, die Cholinacetyltransferase (CHAT), einen Indikator für lebensfähige cholinergische Nervenzellen, enthalten.
Schädigungen der Fimbria-Fornix verursachen auch bei den im Modell getesteten Tieren Verhaltensstörungen, die bei Aufgaben, die das Lern- und Erinnerungsvermögen betreffen, sehr einfach zu beobachten sind. Es ist berichtet worden, daß eine ständige NGF-Verabreichung an Ratten mit Fimbria-Fornix-Schädigungen die Heilung der Verhältensstörungen beschleunigt (Wills, B., et al., Behav. Brain Res. 17 (1985), 17-24). Die erfindungsgemäße Implantation einer NGF-sezernierende Zellen enthaltenden Trägersubstanz bietet einen praktischen Weg, um NGF kontinuierlich an den entsprechenden Gehirn-Bereich des geschädigten Tieres abzugeben. In Analogie dazu bietet eine erfindungsgemäße Trägersubstanz eine praktische Form einer regenerativen und/oder prophylaktischen Therapie für Alzheimer-Patienten, deren Zustand durch kontinuierliche Versorgung spezifischer Bereiche des Gehirns mit NGF verbessert werden kann.
Die erfindungsgemäßen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen können aus den verschiedensten Kombinationen geeigneter Materialien in unterschiedlichen Formen hergestellt werden. Bei Zellen ist die wichtigste Überlegung in der Auswahl einer Konfiguration für die Trägersubstanz, daß der Zugang für Sauerstoff und Nährstoffe zu den eingekapselten Zellen oder Geweben gewährleistet und die Passage von Stoffwechsel-Abfallprodukten, Toxinen und des sezernierten Produkts aus der Trägersubstanz heraus möglich sein muß. Die immunologisch isolierenden Trägersubstanzen können eine beliebige Konfiguration aufweisen, die geeignet ist, die biologische Aktivität zu erhalten, und die eine Freisetzung des Produktes oder einen Zutritt zur Ausübung der Funktion gestattet. Geeignete Formen umfassen beispielsweise die Zylinder-, Rechtecks-, Scheiben-, Pflaster-, Ei-, Stern- und Kugel-Form. Die Trägersubstanz kann außerdem in eine maschenähnliche oder ineinander verschachtelte Struktur gepackt sein. Wenn die Trägersubstanz nach Implantation zurückgewonnen werden soll, werden keine Konfigurationen verwendet, die zu einer Abwanderung der Trägersubstanz(en) von der Implantations-Stelle neigen, wie z.B. kugelförmige Trägersubstanzen, die so klein sind, daß sie in den Blutgefäßen des Rezipienten frei wandern können. Bestimmte Formen, wie z.B. die Rechtecks-, Pflaster-, Scheiben-, Zylinder- und Blatt-Form, weisen eine bessere strukturelle Integrität auf und sind bevorzugt, wenn eine Rückgewinnung erwünscht ist.
Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen müssen gewährleisten, daß der Abstand zwischen den im Kern eingekapselten Zellen und den umliegenden Geweben des Rezipienten einschließlich des Blutstroms des Rezipienten zumindest in einer Dimension klein genug ist, um die Lebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit der eingekapselten Zellen zu erhalten. Die Beschränkungen der Diffusion durch das zur Bildung der Trägersubstanz verwendete Material bedingen jedoch nicht in allen Fällen allein die Beschränkung ihrer Konfiguration. Man kann bestimmte Zusatzstoffe verwenden, um die Diffusionseigenschaften der Grund-Trägersubstanz oder ihre Nährstoff- oder Sauerstoff-Transport-Eigenschaften zu verändern oder zu verbessern. Beispielsweise kann das im Inneren befindliche Medium mit Sauerstoff-gesättigten Perfluorkohlenwasserstoffen angereichert sein, wobei die Notwendigkeit des sofortigen Kontakts mit dem im Blut vorhandenen Sauerstoff nicht gegeben ist. Dadurch können eingekapselte Zellen oder Gewebe lebensfähig bleiben, während zur gleichen Zeit beispielsweise ein das Einwachsen von Kapillargefäßen stimulierender Angiotensin-Gradient aus der Trägersubstanz in die umliegenden Gewebe freigesetzt wird. Literaturstellen und Verfahren zur Verwendung von Perfluorkohlenwasserstoffen sind in Faithful, N. S., Anaesthesia 42 (1987), 234-242, und in NASA Tech Briefs MSC- 21480, U.S. Govt. Printing Office, Washington, D.C. 20402, angegeben, wobei der Inhalt beider Artikel durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. In einer anderen Ausführungsform können bei donierten Zellinien, wie PC12-Zellen, gentechnisch veränderte Hämoglobin-Sequenzen zur Verbesserung der Sauerstoff-Speicherung in die Zellinien eingeführt werden (NPO-17517 NASA Tech Briefs, Bd. 15 # 1, Seite 54).
Falls die Zellen ohne Sauerstoff-tragende Zusatzmittel vorliegen, ist im allgemeinen bei einer Trägersubstanz die Distanz zur Oberfläche, d.h. die maximale Tiefe, zumindest in einer Dimension nicht größer als 2 mm, wobei einemaximale Tiefe von 800 µm bevorzugt ist. Zur Erzeugung der gewünschten Wirkung im Rezipienten können eine oder mehr Trägersubstanzen erforderlich sein.
Die immunologisch isolierende Trägersubstanz-Hülle sollte ausreichend dick sein, um eine gegen die vorhandenen Trägersubstanzen gerichtete immunologische Abstoßungsreaktion durch den Patienten zu verhindern. Für diesen Zweck sollte die Dicke der zellfreien Trägersubstanz-Hülle vorzugsweise mindestens 1 µm oder mehr betragen.
Außerdem können verstärkende Strukturelemente in die Trägersubstanz eingebaut werden. Diese Strukturelemente können so hergestellt werden, daß sie nicht durchlässig sind und eine geeignete äußere Form aufweisen, die eine feste Verbindung der Trägersubstanz mit den Rezipienten-Geweben oder ein Einnähen darin ermöglicht. Unter bestimmten Umständen können diese Elemente dazu dienen, den randständigen oder peripheren Bereich fest abzudichten (z.B. bei einer zylinderförmigen Trägersubstanz an den Enden oder bei einer scheibenförmigen Trägersubstanz an den Rändern), wobei die Einkapselung der Kern-Materialien vervollkommnet wird (z.B. durch eine thermoplastische Formklammer). Bei vielen äußeren Formen ist es wünschenswert, daß diese Strukturelemente keine große Fläche des randständigen oder peripheren Bereichs blockieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen implantierbaren immunologisch isolierenden Trägersubstanzen eine Größe und Haltbarkeit auf, die eine vollständige Rückgewinnung nach Implantation erlauben. Im Gegensatz zu solchen Mikrokapseln, deren praktisch verwendbares Maximalvolumen typischerweise bei einer Größenordnung von 1 µl liegt, werden die bevorzugten erfindungsgemäßen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen als "Makrokapseln" bezeichnet. Solche Makrokapseln besitzen einen Kern mit einem bevorzugten Mindestvolumen von etwa 1 µl bis 10 µl und können je nach Anwendung leicht mit einem Volumen hergestellt werden, das 100 µl übersteigt.
Hinsichtlich der Möglichkeiten zur Rückgewinnung sind Mikrokapseln im allgemeinen weniger praktisch als Makrokapseln. Damit in Mikrokugeln eingekapseltes Gewebe als therapeutische Dosis, von beispielsweise Insulin, dienen kann, muß die Anzahl der Mikrokugeln in einem solchen Maß erhöht werden, daß eine signifikante Rückgewinnung unmöglich wird. Außerdem erfordert ein erhöhtes Volumen des in einer Mikrokugel befindlichen Gewebes auch eine entsprechend vergrößerte Oberfläche. Da sich in einer Kugel mit Erhöhung der Oberfläche um r² das Volumen um r³ erhöht, wird mit zunehmendem Volumen des eingekapselten Gewebes die Kapselgröße, die erforderlich ist, um eine zur Nährstoff-Diffusion zum eingekapselten Gewebe ausreichende Oberfläche bereitzustellen, schnell impraktikabel.
Makrokapseln in Form von Zylindern oder flachen Bögen weisen diesbezüglich keine Beschränkungen auf, da sich das Volumen vielmehr proportional zur Oberfläche erhöht, so daß bei einer erhöhten Gewebemenge der Diffusions- Transport von Nährstoffen und Produkten durch eine vergrößerte Oberfläche kompensiert werden kann, ohne daß sich die Gesamtgröße der Trägersubstanz so erhöht, daß sie unhandlich wird. Wenn beispielsweise etwa 10 000 Langerhans-Inseln pro kg Körpergewicht erforderlich sind, um bei einem Diabetes-Patienten den normalen Blutzuckerspiegel wiederherzustellen, müssen pro kg Körpergewicht 1000 bis 10 000 Mikrokapseln (z.B. mit 1 - 10 Langerhans-Inseln pro Kapsel) implantiert werden. Diese Anzahl von Mikrokapseln kann nicht ohne weiteres zurückgewonnen werden, falls eine Rückgewinnung nötig ist. Im Gegensatz dazu können die erfindungsgemäßen Makrokapseln ohne weiteres mehr als 1000 Langerhans-Inseln und sogar bis zu 500 000 Langerhans-Inseln oder noch mehr pro Trägersubstanz enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden für einen Patienten weniger als 5 - 10 Trägersubstanzen benötigt, was im Vergleich zu der großen Anzahl von Mikrokapseln eine leichtere Rückgewinnung ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen Makrokapseln unterscheiden sich von Mikrokapseln (Sun, A. M., vorstehend; Rha, C.-K., US-Patent 4,744,933) durch ihr Fassungsvermögen. Makrokapseln enthalten mehr als 10&sup4; Zellen, die sie im lebensfähigen Zustand erhalten können. Das zur Herstellung der Mikrokapseln verwendete Tropfen-Verfahren beschränkt die Anzahl von Zellen pro Kapsel notwendigerweise auf weniger als 10&sup4;, um so die Lebensfähigkeit der Zellen sicherzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung immunologisch isolierender Trägersubstanzen. Wie vorstehend erwähnt, lassen sich die Trägersubstanzen zur Implantation unterschiedlicher Zell- oder Gewebe-Typen verwenden, wozu voll ausdifferenzierte, Anker-abhängige, fötale bzw. neonatale oder transformierte, Anker-unabhängige Zellen oder Gewebe gehören. Die Zellen, die immunologisch isoliert werden sollen, werden entweder aus einem Spender (d.h. Primär-Zellen oder Primär-Gewebe einschließlich reifer, neonataler und fötaler Zellen oder Gewebe) oder aus Zellen präpariert, die sich in vitro vermehren (z.B. nicht absterbende Zellen oder Zellinien einschließlich genetisch veränderter Zellen). In allen Fällen wird im allgemeinen unter sterilen Bedingungen eine ausreichende Menge von Zellen präpariert, die wirksame Mengen des benötigten Produkts produzieren oder eine wirksame Menge der benötigten Stoffwechsel-Funktion bereitstellen sollen. Die isolierten Zellen werden bis zur Einkapselung in geeigneter Weise gehalten (z.B. in einer ausgewogenen Salzlösung, wie Hank- Salzen, oder in einem Nährstoff-Medium, wie Ham-F12-Medium).
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Makrokapseln so gestaltet, daß sie einen geringen Abstand zwischen dem Zentrum der Makrokapsel und dem nächstgelegenen Teil der Hülle aufweisen. Das hat zur Folge, daß Nährstoffe aus dem Körper des Patienten leichten Zugang zu den Zellen haben oder Proteine aus dem Körper des Patienten, auf die die Zellen zur Erzeugung einer Stoffwechselfunktion einwirken sollen, wie z.B. einer Wechselwirkung mit Cholesterin oder dergleichen, leicht in die Zellen eindringen können. In diesem Zusammenhang ist eine nicht-kugelförmige Gestalt bevorzugt, z.B. eine lange Röhrchenform oder eine flache Blattform oder dergleichen. Die optimale Gestalt für diesen Zweck kann mittels bekannter Verfahren, die nachstehend dargelegt sind, berechnet werden.
Vier wichtige Faktoren, die die Anzahl von Zellen oder die Gewebe-Menge beeinflussen, die im Kern einer erfindungsgemäßen biologisch verträglichen, immunologisch isolierenden Trägersubstanz untergebracht werden soll (d.h. die Beschickungsdichte), sind: (1) Größe und geometrische Form einer Trägersubstanz, (2) Mitose-Aktivität innerhalb der Trägersubstanz, (3) die zur Kern-Herstellung und/oder zur Beschickung erforderliche Viskosität und (4) ein vor Implanatation durchgeführter Test auf Eignung.
Was den ersten dieser Faktoren (Größe und geometrische Form der Kapsel) anbetrifft, so sind sowohl die Diffusion wichtiger Nährstoffe und erforderlicher Metaboliten in die Zelle als auch die Diffusion von Abfallprodukten aus der Zelle für eine kontinuierliche Lebensfähigkeit der Zellen wichtig. Da die Trägersubstanz-Oberfläche die Diffusion zu den in der Trägersubstanz enthaltenen Stoffen beschränkt, ist bei Trägersubstanzen mit unterschiedlicher Gestalt und Größe das Verhältnis von Oberfläche zum Volumen entscheidend dafür, wieviel lebensfähiges Gewebe innerhalb der Trägersubstanz erhalten werden kann. Zu den Stoffwechsel-Erfordernissen, die durch Diffusion von Stoffen in die Trägersubstanz erfüllt werden, gehört der Sauerstoff-Bedarf. Der Sauerstoff-Bedarf spezifischer Zellen muß für die Zellen der Wahl ermittelt werden. Verfahren und Literaturstellen zur Bestimmung des Sauerstoff-Stoffwechsels sind bei Wilson, D. F., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 2712-2718, angegeben. Der Sauerstoff-Bedarf von Inselzellen ist auf gekoppelte Diffusions-Reaktions-Modelle angewandt worden, die den Diffusions-Transport aus umliegendem Gewebe durch die Trägersubstanz-Wand hindurch in das Gewebe-Kompartiment (Kern) erklären. Nach dem Verfahren von Dionne, K. E., Promotionsarbeit, Massachusetts Institute of Technology (1989), wurde dann unter Anwendung des Sauerstoff-Bedarfs von Insel-Zellen die erwartete Lebensfähigkeit von Insel-Zellen bei einer Anzahl von Trägersubstanzen unterschiedlicher Größe und äußerer Form berechnet. Bei intakten Bauchspeicheldrüsen-Inseln stimmen diese Berechnungen gut mit den experimentell bestimmten Werten überein. Bei einer in die Bauchfellhöhle (pO&sub2; 45 - 50 mm Hg) implantierten zylinderförmigen Trägersubstanz mit einem Außendurchmesser von 900 µm liegt das optimale Zell-Gesamtvolumen im Bereich von etwa 20% des Trägersubstanz-Volumens, vorzugsweise bei 1% - 15%, am bevorzugtesten bei etwa 5%. (Wenn diese Kapsel 20 cm lang wäre, hätte sie ein Volumen von 100 mm³. Um bei einer einzelnen Kugel die gleiche Oberfläche bereitzustellen, um z.B. vergleichbare Gewebe-Mengen zu versorgen, wäre ein Volumen von 1.047 mm³ erforderlich.) Bei einer zylinderförmigen Trägersubstanz von 400 µm liegt das optimale Zell-Volumen bei 35% bis 65% des Trägersubstanz-Gesamtvolumens, wobei 35% bevorzugt sind. Diese Berechnungen berücksichtigen auch den Sauerstoffpartialdruck an der Implantations-Stelle. An Implantations-Stellen, an denen der Sauerstoffdruck geringer ist als im Bauchfell (z.B. subcutan ist pO&sub2; 20 mm Hg), sind geringere Beschickungsdichten erforderlich Eine Implantation in Arterien (pO&sub2; 95 mm Hg) oder im Gehirn (pO&sub2; > 75 mm Hg) erlaubt die Versorgung eines größeren Gewebe-Volumens pro Trägersubstanz-Einheit. Andere äußere Trägersubstanz-Formen, z.B. eine scheibenförmige oder kugelförmige Gestalt, sind auch möglich. Für diese geometrischen Formen kann das optimale Zell-Volumen ähnlich berechnet werden. Bei konkreten Beschickungsdichten werden nicht nur die Gesichtspunkte bezüglich Diffusion, sondern auch die nachstehend angebenen Gesichtspunkte berücksichtigt.
Was den zweiten Faktor (Zellteilung) anbelangt: wenn davon ausgegangen werden kann, daß sich die ausgewählten Zellen in der Trägersubstanz aktiv teilen, so werden sich die Zellen solange kontinuierlich teilen, bis der verfügbare Raum ausgefüllt ist, oder Phänomene wie Kontakt-Hemmung eine weitere Zellteilung beschränken. Für sich teilende Zellen wird die geometrische Form und Größe der Trägersubstanz so gewählt, daß eine vollständige Füllung des Trägersubstanz-Kerns nicht zu einem Mangel an wichtigen Nährstoffen infolge beschränkter Diffusion führt. Im allgemeinen weisen Trägersubstanzen, die mit Zellen oder Gewebe bis zur Konfluenz gefüllt sind, einen Querschnitt von höchstens 250 µm auf, so daß sie zwischen Zellen in ihrem Inneren bis zur Diffusions-Außenfläche weniger als 15 Zellen beherbergen, vorzugsweise weniger als 10 Zellen und bevorzugter weniger als 5 Zellen.
Für Zellen, von denen nicht zu erwarten ist, daß sie sich innerhalb der Trägersubstanz teilen, wie z.B. chromaffine Zellen, Bauchspeicheldrüsen- Inselzellen und dergleichen, werden geeignete Zelldichten entsprechend den vorstehend aufgelisteten Gesichtspunkten bezüglich Diffusion berechnet.
Was den dritten Faktor (Viskosität der Kemmaterialien) anbelangt, so können Zellen bei Beschickungsdichten lebensfähig bleiben, die höchstens bis zu 70% des Trägersubstanz-Volumens ausfüllen. Jedoch sind Zell-Lösungen in diesem Konzentrations-Bereich in beträchtlichem Maße viskös. Das Einbringen von in einer sehr viskösen Lösung enthaltenen Zellen in die Trägersubstanz kann schwierig, wenn nicht sogar unmöglich sein. Im allgemeinen lassen sich bei den nachstehend diskutierten Strategien zur Herstellung von Trägersubstanzen, d.h. dem zwei Schritte umfassenden Verfahren bzw. dem Coextrusions-Verfahren, nur selten Zell-Beschickungsdichten verwenden, die 30% übersteigen. Im allgemeinen liegen optimale Beschickungsdichten bei 20% oder darunter. Bei Gewebefragmenten ist es zur Erhaltung der im Inneren befindlichen Zellen wichtig, die vorstehend beschriebenen allgemeinen Richtlinien zu beachten. Der Durchmesser von Gewebefragmenten sollte dabei 250 µm nicht überschreiten, wobei sie in ihrem Inneren bis zur nächstgelegenen Diffusionsfläche weniger als 15 Zellen, vorzugsweise weniger als 10 Zellen beherbergen sollten.
Was schließlich den vierten Faktor (Aufbewahrung vor Implantation und Test- Erfordernisse) anbelangt, so ist in vielen Fällen ein bestimmter Zeitraum zwischen Herstellung der Trägersubstanz und Implantation erforderlich. Beispielsweise kann es wichtig sein, die Trägersubstanz hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität zu charakterisieren. Im Fall von mitotisch aktiven Zellen muß man daher bei einer bevorzugten Beschickungsdichte auch die Anzahl von Zellen berücksichtigen, die man zur Durchführung des Eignungstestes braucht.
In den meisten Fällen ist es vor der Implantation in vivo wichtig, zur Bestimmung der Wirksamkeit der in der Trägersubstanz befindlichen biologisch aktiven Einheit in vitro-Tests zu verwenden. Man kann die Trägersubstanzen, die die Einheit von Interesse enthalten) zusammenbauen und unter Verwendung von Modellsystemen analysieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Diffusion von Glucose in die Trägersubstanz verwendet, um in Insel-Zellen der Bauchspeicheldrüse eine Freisetzung von Insulin zu stimulieren. Das Auftreten von Insulin außerhalb der Trägersubstanz wird unter Verwendung eines ausreichend spezifischen Radioimmuntestes kontrolliert. Solche Verfahren erlauben es, die auf eine Zelle oder Volumen-Einheit bezogene Wirksamkeit der Trägersubstanz zu bestimmen.
Wenn man nach den vorstehend erwähnten Richtlinien zur Trägersubstanz- Beschickung und Bestimmung der Trägersubstanz-Wirksamkeit arbeitet, bestimmt man dann mit Hilfe der für eine bestimmte Anwendung erforderlichen Menge der biologischen Aktivität die zur Implantation konkret benötigte Trägersubstanz-Größe. Im Falle von sezernierenden Zellen, die therapeutisch wirksame Stoffe freisetzen, lassen sich die auf dem Fachgebiet bekannten Gesichtspunkte und Kriterien für Standard-Dosierungen zur Bestimmung der erforderlichen Menge eines sezernierten Stoffes verwenden. Faktoren, die dabei berücksichtigt werden müssen, sind die Größe und das Gewicht des Rezipienten, die Leistungsfähigkeit oder der Grad der Funktionsfähigkeit der Zellen und da, wo es angebracht ist, die normale Leistungsfähigkeit oder Stoffwechsel-Aktivität des Organs oder Gewebes, dessen Funktion ersetzt oder verbessert werden soll. Es ist auch wichtig zu bedenken, daß eine Zell-Fraktion die Verfahren der immunologischen Isolierung und Implantation möglicherweise nicht überlebt, und ebenso, ob der Rezipient vorher eine Erkrankung hatte, die die Wirksamkeit des Implantats beeinträchtigen kann. Erfindungsgemäße Trägersubstanzen lassen sich leicht in einer Form herstellen, die mehrere Tausend Zellen enthält. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthielten therapeutisch geeignete immunologisch isolierende Trägersubstanzen etwa 1000 Langerhans-Inseln, wobei diese verwendet wurden, um Ratten mit Insulin-Mangel Insulin bereitzustellen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich auch größere Trägersubstanzen einfach herstellen. Wegen des potentiell großen Fassungsvermögens der immunologisch isolierenden Trägersubstanzen erfordert die Behandlung vieler Erkrankungen nur eine oder höchstens einige wenige (weniger als 10) implantierte Trägersubstanzen zur Bereitstellung einer geeigneten therapeutischen Dosis. Die Verwendung von nur wenigen therapeutisch wirksamen implantierbaren Trägersubstanzen, die eine große Anzahl von Zellen enthalten, bietet eine einfache Möglichkeit zur Rückgewinnung und ist daher bei vielen Anwendungen im Vergleich zu Mikrokugeln oder anderen kleinen Konfigurationen bevorzugt, bei denen eine große Anzahl von Trägersubstanzen erforderlich ist. Eine erfindungsgemäße immunologisch isolierende Makrokapsel kann 10 000 - 100 000 Zellen und sogar bis zu 500 000 oder noch mehr Zellen speichern, die je nach Zell-Typ entweder als Einzelzelle oder in Haufen-Form vorliegen.
Techniken und Verfahren zur Isolierung von Zellen oder Geweben, die ein ausgewähltes Produkt produzieren, sind dem Fachmann bekannt oder können bekannten Verfahren angepaßt werden, wobei nur Routine-Experimente durchgeführt werden müssen. Beispielsweise können Langerhans-Inseln aus der Bauchspeicheldrüse großer Tiere (z.B. Schwein, aber auch Mensch) isoliert werden, wobei das von Scharp, D. W., et al., im US-Patent 4,868,121, (1989) beschriebene kombinierte Verfahren aus mechanischer Dehnung und Collagenase-Spaltung verwendet wird. Aus kleineren Tieren, z.B. der Ratte, können Langerhans-Inseln mit Hilfe des von Scharp, et al., Diabetes 29: Ergänzungsbd. 1 (1980), 19-30, beschriebenen Verfahrens isoliert werden. In ähnlicher Weise können Hepatocyten aus Leber-Gewebe isoliert werden, wobei wie von Sun, A. M., et al., Biomat., Art. Cells, Art. Org. 15(2) (1987), 483-496 beschrieben, eine Collagenase-Spaltung und im Anschluß daran eine Gewebe- Fraktionierung durchgeführt werden. Chromaffine Nebennieren-Zellen können mit Hilfe des Verfahrens von Livett, B. G., Physiology Reviews 64 (1984), 1103-1161, isoliert werden. Viele zelluläre Produkte, die unter Verwendung von Primär-Spendergeweben nur schwer zu gewinnen sind, können unter Verwendung von nicht absterbenden Zellen oder Zellinien bereitgestellt werden. Nicht absterbende Zellen sind Zellen, die sich auf unbestimmte Zeit vermehren können, nach Konfluenz jedoch eine Kontakt- Hemmung ausüben und keine Tumore bilden. Ein Beispiel für eine nicht absterbende Zellinie ist die Ratten-Phäochromocytom-Zellinie PC12. Transformierte Zellen oder Zellinien lassen sich in ähnlicher Weise verwenden. Transformierte Zellen sind insofern anders als nicht absterbende Zellen, als sie nach Konfluenz keine Kontakt-Hemmung zeigen und bei Implantation in einen allogenen Wirt Tumore bilden. Die Verfahren zur Erzeugung nicht absterbender Zellen ermöglichen die Verwendung von Zellen oder Gewebe-Typen, die selten sind oder für ihre Instabilität bekannt sind, zur langfristigen Abgabe eines ausgewählten Produktes oder Ausübung einer Stoffwechsel-Funktion. Geeignete Verfahren zur Erzeugung nicht absterbender Zellen sind in Land, H., et al., Nature 304 (1983), 596-602, sowie in Cepko, C. L, Neuron 1 (1988), 345-353, beschrieben. In Frage kommende Zellinien umfassen gentechnisch veränderte beta-Zellinien, die Insulin sezernieren, wie z.B. NIT-Zellen (Hamaguchi, K., et al., Diabetes 40 (1991), 842), RIN-Zellen (Chick, W. L, et al., PNAS 74 (1977), 628-632), ATT-Zellen (Hughes, S. D., et al., PNAS USA 89 (1992), 688-692), CHO-Zellen (Matsumoto, M., et al., PNAS 87 (1990), 9133-9137) und beta-TC-3-Zellen (Tal, MC, et al., Molec. and Cell Biol. 12 (1992), 422-432). Außerdem können rekombinante Zellen oder Zellinien so verändert werden, daß sie neue Produkte oder Funktionen und Kombinationen davon bereitstellen, wobei verschiedenste Techniken angewandt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Beispielsweise können Fibroblasten mit einem Vektor zur Expression eines ausgewählten Produkts (z. B. Nervenwachstumsfaktor, Erythropoietin, Insulin oder Faktor VIII) transfiziert werden. Verständlicherweise kann jedoch die Expression eines rekombinanten Proteins in einem Zell-Typ, der das Protein normalerweise nicht exprimiert, zu einer nicht-regulierten Expression führen, die bei bestimmten medizinischen Anwendungen unerwünscht sein kann.
B-Zell-Hybridome, die einen ausgewählten monodonalen Antikörper sezernieren, oder T-Zell-Hybridome, die ein ausgewähltes Lymphokin sezernieren, lassen sich auch verwenden. Es kann besonders wünschenswert sein, daß unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ein monodonaler Antikörper oder eine Fraktion davon abgegeben wird, der die biologische Aktivität eines mißregulierten Modulators einer biologischen Reaktion neutralisiert. Gentechnisch veränderte Zellen, die lösliche Fragmente von Rezeptoren dieser Modulatoren einer biologischen Reaktion sezernieren, können in ähnlicher Weise verwendet werden. Die Mißregulation oder Überproduktion bestimmter Modulatoren einer biologischen Reaktion ist an der Entstehung bestimmter Carcinome beteiligt.
Wenn die Zellen, die immunologisch isoliert werden sollen, sich vermehrende Zellen oder an das Wachstum in vitro angepaßte Zellinien sind, ist die Erzeugung einer Zellbank dieser Zellen besonders vorteilhaft. Der besondere Vorteil einer Zellbank besteht darin, daß sie eine Quelle von Zellen darstellt, die aus der gleichen Kultur oder dem gleichen Zellansatz hergestellt wurden. D.h., alle Zellen stammen aus dem gleichen Zellausgangsmaterial und sind den gleichen Bedingungen und Streßsituationen ausgesetzt worden. Deshalb können alle Ampullen, die diese Zellen enthalten, als identische Clone behandelt werden. Im Zusammenhang mit einer Implantation erleichtert dies die Produktion identischer immunologisch isolierender Trägersubstanzen oder solcher, die als Ersatz dienen sollen, ganz wesentlich. Dadurch sind auch vereinfachte Test-Vorgehensweisen möglich, die sicherstellen, daß implantierte Zellen frei von Retroviren oder ähnlichen Viren sind. Auch eine parallele Kontrolle von Trägersubstanzen in vivo und in vitro ist möglich, was die Untersuchung von Wirkungen oder Faktoren gestattet, die ausschließlich in vivo auftreten.
In allen Fällen ist es wichtig, daß die in einer Trägersubstanz enthaltenen Zellen oder Gewebe nicht verunreinigt oder abgewandelt sind. Wenn eine Trägersubstanz mit einer Kern-Matrix gewünscht ist, werden die Zellen unter sterilen Bedingungen mit einer geeigneten Menge eines biologisch verträglichen, gelierbaren Hydrogel-Matrix-Präkursors gemischt. Es gibt zahlreiche natürliche oder synthetische Hydrogele, die sich zur Verwendung bei einer erfindungsgemäßen, biologisch verträglichen, immunologisch isolierenden Trägersubstanz eignen. Geeignete natürlich vorkommende Hydrogele umfassen aus Pflanzen stammende Gummi-Arten, wie Alkalimetallalginate und Agarose, und andere aus Pflanzen stammende Stoffe, wie Cellulose und Derivate davon (z.B. Methylcellulose). Aus tierischem Gewebe stammende Hydrogele, wie Gelatine, lassen sich auch verwenden. In einer anderen Ausführungsform kann die Kern-Matrix aus den von Kleinman et alc im US-Patent 4,829,000 (1989) beschriebenen extrazellulären Matrix (ECM)- Bestandteilen hergestellt werden. Geeignete synthetische Hydrogele umfassen Polyvinylalkohol, das Blockcopolymer von Ethylenvinylalkohol, Natriumpolystyrolsulfonat, Vinylmethyltribenzyl-ammoniumchlorid und Polyphosphazen (Cohen, S., et al., J. Anal. Chem. Soc. 112 (1990), 7832-7833).
Bei der Bildung einer immunologisch isolierenden Doppelmatrix- Trägersubstanz kann der randständige oder periphere Bereich aus einem Hydrogel hergestellt werden, das aus den vorstehend aufgeführten Matrix- Präkursoren ausgewählt wird. Wenn der randständige oder periphere Bereich der Trägersubstanz eine permselektive Membran umfassen soll, können andere Präkursor-Materialien verwendet werden. Der randständige oder periphere Bereich kann beispielsweise aus wasserunlöslichen, biologisch verträglichen, thermoplastischen Polymeren oder Copolymeren hergestellt werden. Mehrere der Polymere oder Copolymere, die von Michaels im US-Patent 3,615,024 (1971) gelehrt werden, wobei der Inhalt davon durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird, erfüllen diese Kriterien. Eine bevorzugte Lösung zum Gießen der Membran umfaßt ein Polyacrylonitril- Polyvinylchlorid (PAN/PVC)-Copolymer, das in dem wassermischbaren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst wird. Diese Gieß-Lösung kann gegebenenfalls hydrophile oder hydrophobe Zusatzmittel enthalten, die die Permeabilitäts-Eigenschaften der fertigen Membran beeinflussen können. Ein bevorzugtes hydrophiles Zusatzmittel für das PAN/PVC-Copolymer ist Polyvinylpyrrolidon (PVP). Andere geeignete Polymere umfassen Polyacrylonitril (PAN), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyvinyldifluorid (PVDF), Polyethylenoxid, Polyolefine (z.B. Polyisobutylen oder Polypropylen), Polysulfone und Cellulose-Derivate (z.B. Celluloseacetat oder Cellulosebutyrat). Verträgliche wassermischbare Lösungsmittel für diese und andere geeignete Polymere und Copolymere sind in der Lehre des US-Patents 3,615,024 zu finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Kern von einer biologisch verträglichen Hydrogel-Matrix umgeben, die frei von Zellen ist, die aus der äußeren Schicht herausragen. Die erfindungsgemäßen Makrokapseln unterscheiden sich von den Mikrokapseln von Rha, Lim und Sun (Rha, C. K., et al., US-Patent 4,744,933; Sun, A. W., vorstehend) durch (1) den vollständigen Ausschluß von Zellen aus der äußeren Schicht der Makrokapseln und (2) die Dicke der äußeren Schicht der Makrokapseln. Diese beiden qualitativen Eigenschaften tragen zur erfindungsgemäßen immunologischen Isolierung der eingekapselten Zellen bei. Die Mikrokapseln von Rha wurden durch Ionen- Wechselwirkung einer ionischen Kern-Lösung mit einem ionischen Polymer mit entgegengesetzter Ladung gebildet. Die Mikrokapseln von Lim und Sun wurden durch Bindung einer äußeren Hydrogel-Hülle an den Kern über eine aus Poly-L-Lysin (PLL) bestehende Zwischenschicht gebildet.
In den Mikrokapseln von Lim und Sun war die PLL-Zwischenschicht nicht dick genug, um zu garantieren, daß Teile der eingekapselten Zellen durch die Schicht hindurch und weiter vordringen können. Zellen, die die PLL-Schicht durchdringen können, sind potentielle Ziele einer Immunreaktion. Alle diese Kapseln einschließlich der von Rha offenbarten Kapseln weisen außerdem folgende Beschränkungen auf: (a) sie sind rund und (b) die Bildung der äußeren Schicht hängt von einer direkten Ionen-Bindung oder Polyamid- Bindung an die Innenschicht oder die Kernsubstanz ab. Die Nachteile einer runden Form und einer ionischen Bindung zwischen Polymeren sind vorstehend beschrieben.
Da in den Kapseln von Rha, Lim und Sun die chemische Art des innen liegenden Stoffes entweder durch die gewählte äußere Schicht oder durch PLL bestimmt wird, ist die Möglichkeit zur Variation der Wachstumsbedingungen an der Innenseite dieser Kapseln stark eingeschränkt. Da es häufig spezifische Wachstumsbedingungen gibt, die zur erfolgreichen Einkapselung spezieller Zelltypen erfüllt werden müssen, können diese Kapseln im allgemeinen nur im beschränkten Maße benutzt werden oder erfordern einen beträchtlichen experimentellen Aufwand, um für einen bestimmten innen liegenden Stoff geeignete äußere Schichten herzustellen. Im Gegensatz dazu schränkt in der vorliegenden Erfindung die Art des Kern-Materials die Art des Materials für die äußere Hülle nicht wesentlich ein und umgekehrt. Dadurch ist es möglich, das Material für das innere Hydrogel nach den für die Zell-Lebensfähigkeit und das Zell-Wachstum wichtigen Kriterien auszuwählen und das Material für die äußere Hülle auf der Basis der immunologisch isolierenden Eigenschaften, der biologischen Verträglichkeit und/oder von die Herstellung betreffenden Gesichtspunkten auszuwählen.
Die Mikrokapseln von Rha, Lim und Sun weisen ein größeres Potential für biologische Unverträglichkeit und Fibrogenese-Entstehung auf und sind stärker anfällig für eine Trägersubstanz-Zersetzung als die erfindungsgemäßen Makrokapseln. Bekanntlich treten verschiedene biologische Systeme mit den Ionenbindungen in Wechselwirkung, die zur Intaktheit der Mikrokapseln erforderlich sind, und brechen diese Ionenbindungen auf. PLL ruft ungünstige Gewebereaktionen gegen die Kapseln hervor. Es ist erwähnenswert, daß es sich dabei um eine Fibrose-Reaktion handelt. Die Mikrokapseln können eine Fibrose-Reaktion auslösen, wenn es einen Riß in der äußeren Schicht gibt, wenn diese nicht ausreichend dick ist, wenn die PLL-Schicht sich zu zersetzen beginnt oder wenn eingekapselte Zellen innerhalb der äußeren Schicht in ausreichender Nähe zu deren Außenfläche eingeschlossen sind. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "fibrogen" wird in bezug auf Kapseln oder Materialien verwendet, die eine Fibrose-Reaktion an der Implantations-Stelle auslösen. Wie in der vorliegenden Erfindung dargelegt, kann die äußere Hülle der erfindungsgemäßen nicht-fibrinogenen, immunologisch isolierenden Makrokapseln auf vielfältige Weise gebildet werden.
In einer Ausführungsform wird der Kern durch Vernetzung einer Hydrogel- Matrix mit einem Vernetzungsmittel, vorzugsweise einem multivalenten Kation wie Calcium, vorgeformt. Andere bekannte Hydrogel-Vernetzungsmittel können jedoch auch eingesetzt werden. Nach Vernetzung wird der Kern in eine Hydrogel-Lösung getaucht, wobei eine zweite Zell-freie Kern-Schicht gebildet wird, die zur gleichen Zeit oder danach zweckmäßigerweise in gleicher Weise vernetzt wird. In der erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Vernetzung des Kern-Materials mit dem Hüll-Material mittels eines Vernetzungsmittels erreicht. Wenn beispielsweise Kern- und Hüll-Materialien jeweils beides negativ geladene Hydrogele sind, werden der Kern und die Hülle durch die beiderseitige Anziehung der positiven Ladungen auf dem Vernetzungsmittel, das vorzugsweise Calcium ist, miteinander vernetzt. Der Kern und die Hülle können aus den gleichen oder aus unterschiedlichen Hydrogel-Typen gebildet werden, vorausgesetzt, daß beide die gleiche Ladung aufweisen. Es ist erwähnenswert, daß die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen nicht, wie im US-Patent 4,744,933 (Rha, C. K., et al., 17. Mai 1988) beschrieben, durch direkte Ionenbindung zwischen anionischen und kationischen Polymeren gebildet werden. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "direkte Ionenbindung" bezieht sich auf den Typ der chemischen Bindung, bei dem sich zwei Polymere mit entgegengesetzter Ladung aufgrund ihrer entgegengesetzten Ladungs-Einheiten gegenseitig anziehen. Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von der Ausführungsform von Rha insofern, als in der erfindungsgemäßen Ausführungsform sowohl das Kern-Material als auch das Hüll-Material die gleiche Ladung aufweisen und ihre Verbindung über ein Vernetzungsmittel mit entgegengesetzter Ladung erfolgt. Die erfindungsgemäße Ausführungsform kann die Form einer Mikrokapsel oder einer Makrokapsel aufweisen, wobei jedoch aus Gründen, die in der vorliegenden Erfindung dargelegt sind, die Makrokapsel-Form bevorzugt ist.
Die erfindungsgemäßen Trägersubstanzen können entweder mittels Coextrusion oder eines schrittweisen Zusammenbaus gebildet werden. Coextrusions-Verfahren, die zur Bildung der erfindungsgemäßen Trägersubstanzen verwendet werden können, werden in der gleichfalls anhängigen US-Patentanmeldung 07/461,999 gelehrt, die am 8. Januar 1990 eingereicht wurde und deren Inhalt durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird. Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Trägersubstanzen wird beispielsweise eine Coextrusions-Vorrichtung verwendet, die der im US-Patent 07/461,999 gelehrten Vorrichtung ähnlich ist. Diese Vorrichtung weist eine Extrusionsdüse auf, die mit verschachtelten Bohrungen versehen ist, wobei der Hohlraum jeder Bohrung (d.h. der inneren und der äußeren Bohrung) zur Abgabe der Materialien für den Kern und den randständigen Bereich in geeigneter Weise mit sterilen Kammern verbunden ist. Die Düse kann eine beliebige Form aufweisen, die geeignet ist, eine immunologisch isolierende Trägersubstanz in einer Gestalt herzustellen, die den Stoffwechsel-Anforderungen der zu immobilisierenden Zellen und der erforderlichen Durchlässigkeit und Stärke der sie umgebenden Matrix entspricht. Beispielsweise kann die Düse rund, elliptisch, sternförmig oder schlitzförmig sein. Gegebenenfalls kann der Satz Bohrungen koaxial angeordnet sein. Die weiteste Öffnung der Düse muß eine für die zu bildende Trägersubstanz geeignete Tiefe aufweisen, die eine maximale Diffusion erlaubt und den Stoffwechsel-Anforderungen der eingekapselten Zellen und Gewebe sowie den Materialien für Kern und periphere Bereiche angemessen ist. Die Materialien für den Kern und die peripheren Bereiche werden aus den Innenund Außenkammern durch die entsprechenden Düsen-Bohrungen unter Bedingungen extrudiert, die das Gelieren, Erhärten oder Gießen des/der Matrix- oder Membran-Präkursors/Präkursoren des randständigen oder peripheren Bereiches (und des Kern-Bereiches) erlauben, wobei kontinuierlich eine längliche Trägersubstanz der gewählten Form gebildet wird. Die Länge der Trägersubstanz und daher auch ihr Volumen oder Fassungsvermögen kann gesteuert werden, wobei Trägersubstanzen in einer Größe produziert werden, die für die in Betracht gezogene spezielle Verwendung zweckmäßig ist. Eine auf diese Weise durch Coextrusion gebildete immunologisch isolierende Trägersubstanz ist besonders bevorzugt, da eine Verwendung dieses Mittels sicherstellt, daß die Zellen von Beginn der Trägersubstanz-Bildung an im Kern isoliert werden. Dadurch wird auch sichergestellt, daß die Kern-Materialien während ihrer Handhabung bis zur Implantation nicht verunreinigt oder vermischt werden. Außerdem ist das Coextrusions-Verfahren derart, daß sichergestellt wird, daß der randständige oder periphere Bereich (Hülle) frei von Kern-Materialien einschließlich Zellen ist, was die immunologische Isolierung der Zellen bei Implantation der Trägersubstanz in ein Lebewesen sichert. Sowohl die ausgewählten Matrix- oder Membran-Präkursormaterialien als auch die Bedingungen, unter denen die Bildung der Matrix oder Membran erfolgt, bestimmen die Merkmale des randständigen oder peripheren Bereichs, d.h. die Permeabilität, den Molekulargewichts-Ausschlußwert und die biologische Verträglichkeit.
Die coextrudierten Trägersubstanzen können mit einem Hydrogel-Matrixkern und einer thermoplastischen oder einer aus Hydrogel bestehenden Hülle gebildet werden. Kern und Hülle solcher Makrokapseln können aus gleichen oder unterschiedlichen Hydrogelen gebildet werden, die miteinander vernetzt sein können oder auch nicht.
Im Hinblick auf die Permselektivität der erfindungsgemäßen Membranen und Gele wird der Ausdruck "Molekulargewichts-Ausschlußwert" (MWCO) verwendet. Selbstverständlich gibt es viele Verfahren zur Bestimmung des Molekulargewichts-Ausschlußwertes einer permselektiven Membran. Je nach verwendetem Verfahren können für die gleiche Membran etwas unterschiedliche MWCO-Werte erhalten werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein MWCO-Wert auf die Ergebnisse der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen empirischen Bestimmungs- Verfahren, wobei die beschriebenen spezifischen Marker unter den spezifischen Bedingungen der Bestimmungs-Verfahren verwendet werden. Andere Verfahren zur Bestimmung von MWC-Werten, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden sollen, müssen entsprechend dem Fachmann bekannten Verfahren anhand der erfindungsgemäßen Vorgehensweise geeicht werden.
Bei der Bildung einer immunologisch isolierenden Doppelmatrix- Trägersubstanz (z.B. einer Alginat-Matrix) kann die Permeabilität der umgebenden Matrix bestimmt werden, indem man die Konzentration des verwendeten Matrix-Präkursors (z.B. Natriumalginat) und/oder die Konzentration des Geliermittels (im Fall von Alginat ein divalentes Kation wie Ca&spplus;&spplus;) in einem Tauchbad verändert, in das die Materialien coextrudiert werden.
Wenn eine immunologisch isolierende Trägersubstanz mit einem aus einer thermoplastischen Membran bestehenden randständigen oder peripheren Bereich gewünscht wird, kann der Größenbereich und die Verteilung der Poren bestimmt werden, indem wie im US-Patent 3,615,024 gelehrt, die festen Bestandteile der Präkursormaterial-Lösung (Gieß-Lösung) und die chemische Zusammensetzung des wassermischbaren Lösungsmittels variiert werden oder gegebenenfalls ein hydrophiles oder hydrophobes Zusatzmittel zur Gieß- Lösung gegeben wird. Die Porengröße kann durch Variation der Hydrophobizität des Koagulationsmittels und/oder des Tauchbades verändert werden. Typischerweise umfaßt die Gieß-Lösung ein polares organisches Lösungsmittel, das ein gelöstes wasserunlösliches Polymer oder Copolymer enthält. Nach Kontakt mit einer Lösungsmittel-mischbaren wäßrigen Phase scheidet sich dieses Polymer oder Copolymer ab, wobei sich an der Stelle der Grenzschicht eine permselektive Membran bildet. Die Größe der Poren in der Membran hängt davon ab, wie schnell die wäßrige Phase in die Lösungsmittel- Phase diffundiert. Hydrophile oder hydrophobe Zusatzmittel beeinflussen die Porengröße durch Veränderung dieser Diffusionsgeschwindigkeit. Da die wäßrige Phase weiter in das Lösungsmittel diffundiert, setzt sich das restliche Polymer oder Copolymer ab, wobei ein bälkchenartiger Träger gebildet wird, der der fertigen Trägersubstanz mechanische Stabilität verleiht. In ähnlicher Weise wird die Außenfläche der Trägersubstanz durch die Bedingungen bestimmt, unter denen sich das gelöste Polymer oder Copolymer absetzt (d.h. das Polymer oder Copolymer wird Luft ausgesetzt, wobei eine offene, bälkchenartige oder schwammartige Außenhaut erzeugt wird, und dann in ein wäßriges Fällbad getaucht, was in einer glatten permselektiven Membran- Doppelschicht resultiert, oder wird wasserdampfgesättigter Luft ausgesetzt, was zu einer Zwischen-Struktur führt). Auch dieses Verfahren zur Bildung immunologisch isolierender Trägersubstanzen stellt sicher, daß die periphere oder randständige Membran frei von den im Kern enthaltenen Zellen ist, von denen gewünscht wird, daß sie gegen das Immunsystem des Lebewesens isoliert werden, in das die Trägersubstanz implantiert wird.
Die Struktur der Trägersubstanz-Oberfläche hängt zum Teil davon ab, ob die Extrusionsdüse über dem Bad angebracht oder darin eingetaucht wird. Bei Anbringen der Düse über der Bad-Oberfläche bildet sich eine aufgerauhte Außenhaut aus PAN/PVC, während sich bei Eintauchen der Düse im Bad eine glatte Außenfläche bildet.
Die immunologisch isolierenden Trägersubstanzen können auch schrittweise gebildet werden. Bei Trägersubstanzen, deren Kern neben den Zellen, deren Isolierung gewünscht wird, eine Hydrogel-Matrix umfaßt, wird zuerst der Kern gebildet und anschließend kann der randständige oder periphere Bereich zusammengebaut oder aufgetragen werden. Der Matrix-Kern kann entweder durch Extrusion oder durch Preßformen gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Flicken- oder Blatt-förmige Trägersubstanz durch schrittweise Extrusion geprägter Blätter gebildet. Bei dieser Ausführungsform wird ein das Material für den peripheren Bereich enthaltendes Blatt mit einem Kern-Material enthaltenden Blatt beschichtet und dann mit einem zweiten Blatt umhüllt, das aus dem Material für den peripheren Bereich besteht. Die Ränder der Trägersubstanz werden dann durch Kräuseln, Zusammenpressen, Erhitzen, Abdichten mit einem biologisch verträglichen Klebstoff oder Einfassen in einer vorgeformten biologisch verträglichen undurchlässigen Klammer oder eine Kombination der vorstehend beschriebenen Verfahren abgedichtet.
Umgekehrt kann auch die randständige oder periphere Matrix oder Membran vorgeformt, dann mit den Kern-bildenden Materialien aufgefüllt (z.B. unter Verwendung einer Spritze) und anschließend so abgedichtet werden, daß die Kern-Materialien vollständig eingeschlossen sind. Danach kann die Trägersubstanz Bedingungen ausgesetzt werden, die die Bildung einer Kern- Matrix hervorrufen, falls im Kern Matrix-Precursor-Material vorhanden ist. In einer anderen Ausführungsform wird eine Flicken- oder Blatt-förmige Kern- Matrix durch Preßformen gebildet, danach zwischen aus permselektiven Membranen bestehende Blätter eingeschoben und auf die vorstehend beschriebene Weise abgedichtet oder zugeklammert, wobei die Einkapselung der Kernmaterialien vervollständigt wird.
- Es ist auch möglich, daß eine einzelne kontinuierliche Hydrogel-Matrix immunologisch isoliert und gleichzeitig als Träger zur Immobilisierung dient. Das kann beispielsweise erreicht werden, indem die isolierten Zellen in der Trägersubstanz in einem konzentrischen Gradienten um den Kern herum so verteilt sind, daß der periphere Bereich der Trägersubstanz frei von immobilisierten Zellen ist. Immunologisch isolierende Trägersubstanzen dieser Art können auf mindestens zwei verschiedene Weisen hergestellt werden. Erstens kann ein Zell-Gemisch, das in einer Lösung eines Hydrogel-Matrix- Präkursors suspendiert ist, die dichter als die isolierten Zellen ist, aus der Düse einer einfachen Extrusion-Vorrichtung extrudiert werden. Auf diese Weise werden die Zellen in den Kernbereich der sich bildenden Trägersubstanz eingepresst. In einer anderen Ausführungsform kann das Gemisch aus Zellen und Matrix-Präkursor aus dem Kern-Lumen einer Düse mit verschachtelten Bohrungen extrudiert werden, während durch die periphere Düse gleichzeitig ein Strom eines Geliermittels abgegeben wird (für Alginat beispielsweise eine Calciumchlorid-Lösung), wobei die Oberfläche und der periphere Bereich der Trägersubstanz zuerst polymerisieren, wodurch die suspendierten Zellen in den Kern eingepresst werden.
Bei einer vorteilhaften Anwendung der vorliegenden Erfindung werden Zellenhaufen hergestellt, indem wie vorstehend beschrieben die erneute Aggregation natürlicher Zellhaufen in einer Form erfolgt, die für eine erhöhte Packungsdichte pro Volumen-Einheit geeignet ist.
Solche erneut aggregierten Zeilhaufen sind vorzugsweise dadurch charakterisiert, daß im Vergleich zu natürlichen Zellhaufen wichtige gelöste Stoffe besser zu den innerhalb der Zelihaufen befindlichen Zellen oder aus diesen Zellen heraus diffundieren können.
Neu gebildete immunologisch isolierende Trägersubstanzen, die mittels eines der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens hergestellt wurden, lassen sich bis zur Implantation unter sterilen Bedingungen in einem nicht-pyrogenen, serumfreien spezifischen Nährstoff-Medium oder einer ausgewogenen Salzlösung bei etwa 37ºC halten. Für bestimmte Zell-Typen und/oder Kulturbedingungen können niedrigere Temperaturen (20ºC - 37ºC) optimal sein. Auch andere Temperaturen und Medien-Zusammensetzungen lassen sich verwenden, sofern die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten bleibt. In einer anderen Ausführungsform können die Trägersubstanzen durch Schockeinfrieren in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, wenn ein Mittel zum Schutz gegen Schockeinfrieren, wie z.B. Glycerin, in die Matrix eingebaut worden ist (Rajotte, R. V., et al., Transplantation Proceedings 21 (1989), 2638- 2640). In einem solchen Fall werden die Trägersubstanzen vor Verwendung aufgetaut und wie vorstehend beschrieben, unter sterilen Bedingungen äquilibriert.
Auch die Implantation der biologisch verträglichen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Im allgemeinen werden die immunologisch isolierenden Trägersubstanzen im Körper des Rezipienten an einer Stelle implantiert, die eine geeignete Abgabe des sezernierten Produktes an den Rezipienten oder Ausübung der Funktion und freien Zugang von Nährstoffen zu den implantierten Zellen oder Geweben erlaubt, ebenso wie freien Zugang zur Trägersubstanz zur Rückgewinnung und/oder zum Austausch. Vorzugsweise werden die in einer Trägersubstanz immobilisierten Zellen sowohl vor als auch nach Implantation daraufhin überprüft, ob sie ordnungsgemäß funktionieren. Für diesen Zweck können Testsysteme und Diagnose-Tests verwendet werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Beispielsweise können ELISA-Tests (enzymgebundener Immunadsorptions-Tests), chromatographische oder enzymatische Tests oder biologische Tests verwendet werden, die für das sezernierte Produkt spezifisch sind. Falls gewünscht, kann die Sekretions-Funktion eines Implantats über den gesamten Zeitraum überwacht werden, indem vom Rezipienten geeignete Proben (z.B. Serum) gesammelt und untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele näher veranschaulicht, die die Erfindung jedoch in keinster Weise beschränken sollen.

Beispiel 1: Herstellung von Zellen zur immunologischen Isolierung

Aus Zellinien und Primärquellen stammende Zellen wurden bis zu ihrer immunologischen Isolierung in vitro aufbewahrt. (In einigen Fällen können die Zellen bei extremer Kälte aufbewahrt und danach aufgetaut und an in vitro- Bedingungen angepaßt werden.) Für spezifische Zelltypen können die Inkubationsbedingungen geändert werden, was der Fachmann leicht ermitteln kann, indem er lediglich Routine-Experimente durchführt. Langerhans-Inseln wurden mit Hilfe des Verfahrens von Scharp et al. (vorstehend) gewonnen und bei 37ºC in einer aus 5% CO&sub2; und 95% Luft bestehenden Atmospäre in einem Medium gehalten) das aus Nährlösung (z.B. Ham-F12-Medium (GIBCO)) bestand, die mit Serum (z.B. 25% (Vol./Vol.) vereinigtes Pferde-Serum) angereichert war. Die Langerhans-Inseln wurden nach dem Verfahren von Lacy, P. E., et al., Science 204 (1979), 312-313, unter Verwendung von Petrischalen bei 24ºC über vorher bestimmte Zeitspannen in Kultur gehalten. Vor ihrer immunologischen Isolierung wurden die Langerhans-Inseln gesammelt, durch Verwirbeln der Petrischale konzentriert und in ausgewogener Salzlösung nach Hank (HBSS) resuspendiert. Die gewaschenen Langerhans-Inseln wurden in einem ausreichenden Volumen HBSS resuspendiert, wobei die Enddichte der Langerhans-Inseln erhalten wurde, die zur Bildung eines die gewünschte Anzahl von Langerhans-Inseln enthaltenden immunologisch isolierenden Trägers erforderlich ist, wobei seine Größe und Form zur Implantation in ein Lebewesen mit Diabetes und anschließender Wiederherstellung des normalen Blutzuckerspiegels geeignet sind. Man geht davon aus, daß durch dieses Herstellungs-Verfahren von Zellen vor ihrer immunologischen Isolierung Antigen-haltige Zellen aus dem Insel-Gewebe entfernt werden, wobei die Immunreaktionen gegen die Außenseite der Trägersubstanz, die deren Funktion und Haltbarkeit beschränken könnten, verringert werden.

Beispiel 2: Bildung von Hydrogel-Matrices mit unterschiedlichen Molekulargewichts-Ausschlußwerten

Eine Alginat-Dünnschicht, die aus einer 1%-igen (Gew./Vol.) Lösung von Natriumalginat in Wasser hergestellt worden war, wurde unter Verwendung von entweder (1) einer 1%-igen (Gew./Vol.) oder (2) einer wäßrigen 2%-igen (Gew./Vol.) CaCl&sub2;-Lösung 6 Minuten vernetzt. Es wurde ein Blatt hergestellt, indem unter Verwendung einer heruntergelassenen Klinge mit einem Schneidspalt von 0,2 mm ein Flüssigkeitsfilm auf eine Glasplatte gegeben wurde und danach in eine wäßrige CaCl&sub2;-Lösung eingetaucht wurde. Aus dem Film wurde unter Verwendung einer 47 mm-Schneidvorrichtung eine Scheibe herausgeschnitten. Die Scheibe wurde in eine Amicon-Rührzelle zur Filtration gegeben und unter einem Druck von 10 psi zur Filtration von Lösungen mehrerer gelöster Marker-Stoffe verwendet. Die Konzentration der Marker- Stoffe wurde im Filterrückstand (Cr = Durchschnitt des Anfangs und Endes der Filterrückstands-Konzentrationen) und in ähnlicher Weise im Filtrat bestimmt, das mengenmäßig den größten Teil darstellte (Cp). Der Ausschluß-Koeffizient jedes Hydrogels wurde wie folgt berechnet:
R= 1 - Cp/Cr
Ein gelöster Stoff, der vollständig zurückgehalten wird, hat daher einen Koeffizienten von 1. Umgekehrt hat ein gelöster Stoff, der das Hydrogel vollständig durchlaufen kann, einen Koeffizienten von 0. Das bei (1) erhaltene Hydrogel hatte eine Durchlässigkeit bis zu einer Größe, die der von Dextran mit einem Molekulargewicht von 2000 kD (Poly Sciences Corp.) entsprach (Ausschluß-Koeffizient = 0,64). Das bei (2) erhaltene Hydrogel war für die gleiche Dextran-Lösung fast undurchlässig. Figur 1 stellt die Permeabilität beider Hydrogele für folgende gelöste Stoffe dar: Rinderserumalbumin (BSA; ICN Biochemicals), Vitamin B12 (ICN Biochemicals), α-Chymotrypsin (ICN Biochemicals), Apoferritin (Sigma). Die ungefähren Molekulargewichte sind in der Figur in Klammern angegeben.

Beispiel 3: Bildung einer immunologisch isolierenden Doppelmatrix- Trägersubstanz

Unter sterilen Bedingungen wurde eine 2%-ige Lösung von Natriumalginat in physiologischer Kochsalz-Lösung (PS; 150 mM NaCl) hergestellt. Eine sterile Lösung von aus der Bauchspeicheldrüse erwachsener Ratten isolierten Langerhans-Inseln in CRML1066-Kulturmedium (GIBCO) wurde 1:1 mit der Alginat-Lösung verdünnt, wobei die Endkonzentration von Alginat in der Suspension der Langerhans-Inseln 1% betrug. Die suspendierten Langerhans- Inseln wurden aus einer Extrusiondüse mit einer einzelnen Kammer in ein 1%- iges CaCl&sub2;-Bad extrudiert. Sobald die Alginat-Polyionen vernetzt waren (etwa 2 min) und sich der Kern gebildet hatte, der die immobilisierten Langerhans- Inseln enthielt, wurde der Kern in eine 2%-ige Alginat-Lösung gegeben. Der Kern wurde dann in einen Schlauch gesaugt, dessen Durchmesser etwa 500 µm größer war als der Kern, und erneut in ein zweites Vernetzungs-Bad aus einer 2%-igen Alginat-Lösung extrudiert, wobei der Kern mit einer Hülle umgeben wurde, die sich aus einer separaten zellfreien Alginatmatrix-Schicht gebildet hatte, die mit dem Kern vernetzt war. Die so gebildete Makrokapsel war zylinderförmig und besaß folgende Abmessungen: Länge 30 mm, Kerndurchmesser 800 mm und Abstand zwischen Kern und Hülle 1 mm. Das Kernvolumen betrug 15 mm. Der Kern enthielt 300 Langerhans-Inseln, die ein Volumen hatten, das 10,6% des Kern-Gesamtvolumens entsprach.

Beispiel 4: Bildung einer immunologisch isolierenden Doppelmatrix- Trägersubstanz durch Coextrusion

Unter sterilen Bedingungen wurde eine 2%-ige Lösung von Natriumalginat in physiologischer Kochsalz-Lösung (PS; 150 mM NaCl) hergestellt. Eine sterile Lösung von aus der Bauchspeicheldrüse erwachsener Ratten isolierten Langerhans-Inseln in CRML1066-Kulturmedium wurde 1:1 mit der Alginat- Lösung verdünnt, wobei die Endkonzentration von Alginat in der Suspension der Langerhans-Inseln 1% betrug.
Die Suspension der Langerhans-Inseln wurde in die Innenkammer einer mit einem Satz von Doppelbohrungen versehenen Coextrusions-Vorrichtung eingefüllt, die die vorstehend beschriebene Form aufwies, wobei die Innenbohrung einen Durchmesser von 500 µm aufwies und die periphere Bohrung einen Durchmesser von 600 µm hatte. Die Außenkammer dieser Vorrichtung wurde mit einer Lösung von 1% sterilem Natriumalginat in PS beschickt.
Die Spitze der Düse wurde in ein Bad eingetaucht, das eine sterile Lösung von 1% CaCl&sub2; in PS enthielt, wobei durch Vernetzung von Alginat-Polyionen das Erhärten oder Gelieren von Alginat induziert wurde. Die Materialien, mit denen die Kammern beschickt worden waren, wurden in das Bad coextrudiert, wobei kontinuierlich ein Alginat-Zylinder erzeugt wurde, der einen Kernbereich aus einer Alginatmatrix und immobilisierten Langerhans-Inseln sowie einen randständigen Bereich aus einer Alginatmatrix enthielt, die frei von Langerhans-Inseln war. Die Hülle war 1,2 mm dick. Der Innendurchmesser des Kerns betrug 1,0 mm - 1,05 mm. Das Gesamtvolumen der Langerhans-Inseln im Kern betrug 0,8 mm³ (200 Langerhans-Inseln). Das Kern-Gesamtvolumen betrug 25,98 mm³. Das Volumen der Langerhans-Inseln betrug 3% des Kern- Gesamtvolumens. Der MWC-Wert für 1%-iges Alginat ist der in Figur 1 gezeigte Wert. Ähnlich wie in Figur 7 gezeigt, erhöhte sich der MWCO-Wert jedoch mit der Zeit infolge der fortgesetzten Ca&spplus;&spplus;-Verdrängung. Das Kern-Alginat wurde mit dem Hüll-Alginat vernetzt.
Die relative Dicke des randständigen Bereiches wurde durch Änderung der Geschwindigkeit modifiziert, mit der Materialien aus der Kernbohrung und der peripheren Bohrung der Düse extrudiert wurden. Im allgemeinen verringerte sich die Wand-Dicke, wenn die Strömung in der Kernbohrung erhöht wurde. Die Wand-Dicke erhöhte sich, wenn die Strömung in der peripheren Bohrung erhöht wurde. Sowohl bei der Kernbohrung als auch bei der peripheren Bohrung lagen die Durchflußgeschwindigkeiten im gleichen Bereich (0,3 ml/min - 1,5 ml/min). Die Enden des Zylinders wurden abgedichtet, indem der Zylinder zuerst in ein steriles 2%-iges Natriumalginat-Bad und danach in ein steriles 1%-iges CaCl&sub2;-Bad getaucht wurde. Der so gebildete immunologisch isolierende Träger wurde bis zur Implantation in einem sterilen Gewebekultur- Medium gehalten.

Beispiel 5: Bildung einer aus einer Kernmatrix und permselektiven Membran bestehenden immunologisch isolierenden Trägersubstanz durch Coextrusion

Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde eine Suspension von Langerhans-Inseln der Ratte in 1% Alginat hergestellt und in die Innenkammer der Coextrusions- Vorrichtung eingefüllt. Die äußere Kammer wurde mit einer Lösung zum Gießen der Membran beschickt, die 12,5% (Gew./Gew.) PAN/PVC in DMSO (d.h. Dimethylsulfoxid) umfaßte. Die Spitze der Düse wurde entweder in einem festgelegten Abstand über einem Bad angebracht oder darin eingetaucht, wobei das Bad eine sterile Lösung von 1% CaCl&sub2; in PS enthielt, das die Aushärtung oder Gelbildung der Alginat-Kernmatrix und gleichzeitig die Aushärtung der Gieß- Lösung induzierte, wobei eine permselektive Membran erhalten wurde. Die Merkmale der Trägersubstanz-Außenfläche wurden durch die Anordnung der Düse über oder unter der Oberfläche des Bades bestimmt. Wenn die Düse über dem Bad angeordnet und Luft mit einer geringen relativen Feuchtigkeit (RH) ausgesetzt wurde, bildete sich eine anisotrope Membran mit einer rauhen coriumartigen (d.h. lederartigen) Außenfläche. Bei Eintauchen der Düse im Bad bildete sich jedoch eine Membran-Doppelschicht mit einer glatten Außenfläche. Im Gegensatz dazu bildete sich ein Zwischenprodukt, wenn die Düse über dem Bad angebracht und die Faser Luft mit hoher relativer Feuchtigkeit ausgesetzt wurde. Die Materialien, mit denen die Kammern beschickt worden waren, wurden in das Bad coextrudiert, wobei kontinuierlich eine zylinderförmige Trägersubstanz erzeugt wurde, die eine Alginatmatrix mit darin immobilisierten Langerhans-Inseln und eine randständige semipermeable Membran mit einem MWCO-Wert von 50 kD umfaßte.
Die relative Dicke der Membran wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durch Veränderung der relativen Extrusionsgeschwindigkeit aus den Bohrungen modifiziert. Die Enden des Zylinders wurden unter Verwendung von Verfahren abgedichtet, die den Verfahren ähnlich sind, die in der am 8. Januar 1990 eingereichten gleichfalls anhängigen US-Patentanmeldung 07/461,999 beschrieben sind, wobei die Lehren davon durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Die so gebildeten immunologisch isolierenden Trägersubstanzen wurden bis zur Implantation in sterilem PS, einer ausgewogenen Salzlösung oder Gewebe-Kulturmedium gehalten.

Beispiel 6: Bildung eines aus einer Kernmatrix und permselektiven Membran bestehenden immunologisch isolierenden Trägers durch "manuelle Einfüllung"

In anderen Fällen wurden die Langerhans-Inseln in einer 1%-igen bis 2%- igen Alginatlösung suspendiert und unter Verwendung einer Spritze manuell in vorgeformte thermoplastische Hohlfasern eingefüllt. Die Enden der Fasern wurden wie im gleichfalls anhängigen US-Patent 07/461,999 beschrieben, mit Hilfe einer Kombination von Hitzeeinwirkung und Polymerklebstoff- Abscheidung abgedichtet. Der MWC-Wert der thermoplastischen Hülle betrug etwa 50 kD. Die Hydrogelmatrix wurde durch 6-minütige Inkubation der aufgefüllten Fasern in einer 1%-igen Calciumchlorid-Lösung gebildet.

Beispiel 7: Beurteilung der Lebens- und Funktionsfähigkeit von immobilisierten immunologisch isolierten Langerhans-Inseln in vitro

Langerhans-Inseln von erwachsenen Ratten wurden mittels der in den Beispielen 3 und 6 beschriebenen Verfahren in Doppelmatrix- Trägersubstanzen immunologisch isoliert. Trägersubstanzen mit einem Kern aus flüssiger Matrix und thermoplastischen Hüllen wurden in vitro mindestens 2 Wochen inkubiert. Der Kern der Trägersubstanzen wies einen Außendurchmesser von 800 µm auf und war mit einer 65 µm dicken Wand überzogen. Trägersubstanzen mit einer Alginat/Alginat-Doppelmatrix wiesen einen Kerndurchmesser von 880 µm und eine 60 µm dicke Wand auf. Die Inkubationsbedingungen waren wie folgt: Eintauchen in Harn F12-Medium, das mit 25%-igem Pferdeserum angereichert war, bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 5% CO&sub2; und 95% Luft. Das Medium wurde alle drei bis vier Tage ausgetauscht. Unter Verwendung von Propidiumjodid wurde festgestellt, daß die immunologisch isolierten Inselzellen nach diesem Inkubationszeitraum in vitro zu 95% lebensfähig waren. Es zeigte sich, daß sie auch funktionsfähig geblieben waren. Bei einem Perfusions-Test mit Glucose (Dionne, vorstehend) zeigte sich, daß die immunologisch isolierten Langerhans-Inseln als Reaktion Insulin sezernierten, wobei Ausmaß und Muster der Reaktion ähnlich waren wie bei nicht-geschützten Langerhans-Inseln, die in vitro über eine ähnlich lange Zeitspanne und unter ähnlichen Bedingungen inkubiert worden waren. Die Freisetzung von Insulin wurde mittels des Verfahrens von Soeldner, J. S., et al., Diabetes 14 (1965), 771, bestimmt. Die Ergebnisse eines typischen Perfusions-Experiments sind in den Figuren 2A und 2B gezeigt. Die Glucose- Konzentration, die zur Stimulierung einer Reaktion verwendet wurde, und die Glucose-Grundkonzentration betrugen 300 mg% bzw. 100 mg%. Bei den immunologisch isolierten Langerhans-Inseln wurde festgestellt, daß der Beginn der ersten Phase der Insulin-Freisetzung nach Glucose-Stimulierung nicht signifikant verzögert war, ebenso wie danach die Insulin-Freisetzung ohne signifikante Verzögerung wieder auf die Grundlinien-Sekretion zurückging. Außerdem wurde das Auftreten einer zweiten Phase festgestellt, die mit der nicht-geschützter Langerhans-Inseln vergleichbar war. Bezogen auf eine einzelne Langerhans-Insel waren die aus immunologisch isolierten Langerhans-Inseln freigesetzten Insulin-Gesamtmengen ungefähr genauso groß wie die aus ungeschützten Langerhans-Inseln freigesetzten Mengen. Die Ergebnisse sind in den Figuren 3A und 3B zusammengefaßt.

Beispiel 8: Vergleich der in vivo-Leistungsmöglichkeiten von implantierten xenogenen Langerhans-Inseln, die in Trägersubstanzen mit oder ohne innere Hydrogel-Matrix isoliert waren

Wie in Beispiel 6 beschrieben, wurden Langerhans-Inseln der Ratte in thermoplastischen Trägersubstanzen immunologisch isoliert, die entweder einen Matrix-Kern oder einen flüssigen Kern aufwiesen. Die Abmessungen der Trägersubstanzen waren wie folgt: Außendurchmesser 800 µm, Wanddicke 55 µm, Faserlänge 2 cm. Die verwendete Beschickungsdichte lag etwas unter 20%. Im Fall der Kapseln mit flüssigem Kern enthielt die Zellsuspension kein Alginat. Im ersten Experiment wurden die Langerhans-Inseln innerhalb einer Matrix immunologisch isoliert Die Trägersubstanzen wurden in Mäuse, bei denen durch Streptozotocin Diabetes induziert worden war, intraperitoneal implantiert, wobei es sich um konkordant-xenogene (d.h. von eng verwandten Arten) Implantate handelte. In die Bauchfellhöhle wurden frei-bewegliche Implantate eingeführt. Acht Mäusen wurden jeweils 500 - 1000 immunologisch isolierte Ratten-Inseln implantiert. Bei einem Tier zeigte sich keine Verbesserung der Hyperglykämie. Bei den anderen stellte sich innerhalb von 5 Tagen nach Implantation der normale Blutzuckerspiegel wieder ein (d.h. die Glucose-Mengen im Plasma dieser Tiere erreichten wieder den Normal- Bereich, der durch 100 mg%- 125 mg% definiert ist), wobei der normale Blutzuckerspiegel bis zur Entfernung der Implantate am 60. Tag erhalten blieb. Danach trat bei den Tieren wieder Hyperglykämie auf. In Figur 4 sind die durchschnittlichen Ergebnisse von 7 Experimenten zusammengefaßt. Es ist erwähnenswert, daß die Glucose-Mengen im Plasma dieser Tiere nicht signifikant schwankten. Die zurückgewonnenen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen wurden daraufhin untersucht, ob Anhaltspunkte für eine Fibroblasten-Vermehrung vorlagen, und es wurde bestimmt, ob sie als Reaktion auf eine Perfusion mit Glucose Insulin freisetzen können. Keine der Trägersubstanzen war vollständig durch Fibroblasten eingekapselt worden, wobei jedoch in einigen Bereichen drei bis fünf Fibroblasten-Schichten um die Trägersubstanz-Außenfläche herum festgestellt wurden. Die zurückgewonnenen immunologisch isolierenden Trägersubstanzen setzten als Reaktion auf eine Perfusion mit Glucose und eine Stimulierung mit Theophyllin Insulin in vitro frei, wobei eine histologische Untersuchung lebensfähige Langerhans-Inseln zeigte, die eine Insulin-Färbung in den β- Zellen zeigten. Die Ergebnisse des Perfusions-Experimentes mit Glucose und einer Theophyllin-Stimulierung sind in Figur 5 gezeigt.
Diese positiven Ergebnisse standen im krassen Gegensatz zu den Ergebnissen, die bei einer immunologischen Isolierung von Langerhans-Inseln der Ratte innerhalb einer PAN/PVC-Membran ohne immobilisierende Matrix erhalten wurden. Diese immunologisch isolierenden Trägersubstanzen zeigten nach Implantation nur 12 ± 3 Tage eine funktionelle Reaktion. Danach stellte sich bei allen fünf getesteten Tiere wieder der Hyperglykämie-Zustand ein. Eine histologische Untersuchung dieser immunologisch isolierenden Trägersubstanzen zeigte eine Aggregation der Langerhans-Inseln. Die Inseln hatten sich zu großen Gewebehaufen verdichtet, die zentral schwere Nekroseerscheinungen aufwiesen und nur am Rand überlebende, lebensfähige und nachweisbare β-Inselzellen enthielten. Die Gegenwart einer Matrix verhindert daher eine Aggregation der Langerhans-Inseln und einen daraus resultierenden Zelltod, wobei die signifikant verbesserte Lebensfähigkeit zu einer langfristigen Wirksamkeit der Implantate führt.

Beispiel 9: Bestimmung der Wiederherstellung eines normalen Blutzuckerstpiegels bei Streptozotocin-induzierten Mäusen mit Diabetes durch Implantation von konkordant-xenogenen Langerhans-Inseln, die in einer für Immunglobulin durchlässigen Trägersubstanz immunologisch isoliert sind

Unter Verwendung des konkordant-xenogenen Ratten-zu-Maus-Modells wurde in vivo die Fähigkeit von immunologischen Doppelmatrix-Trägersubstanzen bestimmt, bei Mäusen, bei denen durch Streptozotocin Diabetes erzeugt worden war, den normalen Blutzuckerspiegel wiederherzustellen. Die Trägersubstanzen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Sie weisen eine signifikante Permeabilität für Dextran mit einem Molekurgewicht von 2000 kD auf (Figur 1). Deshalb sind diese Trägersubstanzen auch ohne weiteres für IgG (150 kD) durchlässig. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Tiere wurden in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 bestand aus sieben Kontroll-Tieren, denen jeweils 300 Langerhans-Inseln, die nicht immunologisch isoliert worden waren, unter der Nierenkapsel implantiert wurden. Nur bei einem dieser Tiere zeigte sich über mehr als 12 Tage eine Besserung der Hyperglykämie. Der normale Blutzuckerspiegel blieb in Gruppe 1 durchschnittlich 14,0 ± 3,1 Tage erhalten.
Gruppe 2 bestand aus 13 Tieren, denen jeweils 300 Ratten-Langerhans-Inseln implantiert wurden, die in einer Alginatmatrix ohne randständigen zelifreien Bereich immobilisiert worden waren. Bei 8 von 13 Tieren der Gruppe 2 ging die Funktion der Implantate innerhalb von 24 Tagen verloren, was darauf hindeutete, daß eine einfache Immobilisierung keine Vorteile gegenüber den Kontrolltieren von Gruppe 1 brachte. Bei den anderen fünf Tieren blieb der normale Blutzuckerspiegel bis zur Implantat-Entfernung erhalten. Der normale Blutzuckerspiegel blieb in Gruppe 2 durchschnittlich 29,3 ± 5,5 Tage erhalten.
Gruppe 3 bestand aus 10 Tieren, denen jeweils 300 Ratten-Langerhans-Inseln implantiert wurden, die in einer immunologisch isolierenden Doppelmatrix Trägersubstanz mit der in Beispiel 3 beschriebenen Form, d.h. mit einer randständigen zellfreien Alginatmatrix-Schicht, immobilisiert worden waren. Nur bei vier Tieren ging die Implantat-Funktion innerhalb von 14 Tagen nach Implantation verloren. Bei sechs Tieren blieb der normale Blutzuckerspiegel über 100 Tage erhalten. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Experiment beendet und die Implantate wurden entfernt, was dazu führte, daß sich wieder Hyperglykämie einstellte (Figur 6). Der normale Blutzuckerspiegel blieb in Gruppe 3 durchschnittlich 65,8 ± 15,1 Tage erhalten (n = 10). Die gegen die zurückgewonnenen Alginat-Trägersubstanzen gerichtete Fibromatose- Reaktion war dabei unbedeutend. Eine histologische Untersuchung der zurückgewonnenen immunologisch isolierten Langerhans-Inseln zeigte lebensfähige Inselzellen mit sichtbar angefärbtem Insulin in den β-Zellen. Auch die in diesem Experiment verwendeten immunologisch isolierenden Trägersubstanzen zeigen die Funktionsfähigkeit und biologische Verträglichkeit von Trägersubstanzen, die für Proteine hohen Molekulargewichts, wie z.B. das Immunglobulin G-Protein, durchlässig sind. Tabelle 1 ÜBERLEBENSDAUER VON IMMUNOLOGISCH ISOLIERTEN XENOGENEN IMPLANTATEN IN DIABETISCHEN MÄUSEN
*Operative Nierenentfernung zur Entfernung der Insel-Implantate
Es wurde eine Trägersubstanz mit der in Beispiel 3 beschriebenen Form hergestellt. Diese enthielt mehrere Hundert Langerhans-Inseln, wobei der MWCO-Wert der Membran unter 50 kD lag.
Die Trägersubstanz wurde in eine diabetische BB-Ratte implantiert. Dieser Ratten-Stamm ist als Nagetier-Modell bekannt, das menschlichen autoimmunen Diabetes vom Typ 1 nachahmt Die Trägersubstanz wurde nach einer Verweilzeit von 21 Tagen in vivo zurückgewonnen. Es stellte sich heraus, daß die immunologisch isolierten Langerhans-Inseln lebens- und funktionsfähig waren, wie durch histologische Untersuchung bestimmt.

Beispiel 10: Bestimmung der Überlebensdauer von immunologisch isolierten Langerhans-Inseln in einem diskordanten xenogenen Rezipienten

Immobilisierte Ratten-Langerhans-Inseln enthaltende immunologisch isolierende Doppelmatrix-Trägersubstanzen wurden mittels des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens hergestellt, bei dem eine Coextrusion mit einer zwei ineinandergeschachtelte Bohrungen aufweisenden Düse erfolgte. Die Bedingungen für das Gelieren der Matrix wurden so gewählt, daß eine Hydrogelmatrix mit einer Durchlässigkeit für Dextranblau mit einem Molekulargewicht von 2000 kD (wie in Figur 7) erhalten wurde, so daß die so gebildete Trägersubstanz auch für Immunglobulin G und C1q durchlässig war.
Aus der kontinuierlichen zylinderförmigen Trägersubstanz wurden etwa 0,5 cm lange Abschnitte hergestellt, indem der Kernmaterial-Durchfluß regelmäßig unterbrochen wurde, wobei gut sichtbare zellfreie Bereiche gebildet wurden. Die Faser wurde in den zellfreien Bereichen durchgeschnitten. Dadurch waren die Zellen vollständig von einer zelifreien Alginatmatrix umhüllt. Die Trägersubstanzen wurden bei Meerschweinchen, d.h. diskordanten (d.h. entfernter verwandten) Wirten, zwischen die Lappen des Dünndarmgekröses implantiert (n = 2). Nach einer 21-tägigen Verweildauer in vivo wurden die Trägersubstanzen entfernt und in vitro hinsichtlich der als Reaktion auf Glucose auftretenden Insulin-Freisetzung getestet Die Ergebnisse sind in Figur 8 zusammengefaßt. Nach einer Grund-Stimulation erfolgte eine Stimulation mit 300 mg/dl Glucose, wobei statistisch signifikant mehr Insulin aus den immunologisch isolierten Langerhans-Inseln freigesetzt wurde. Wenn die Glucose-Konzentration auf 100 mg/dl gesenkt wurde, erreichten auch die Insulin-Mengen wieder das Grundniveau. Mit Alginat-Kernen enthaltenden thermoplastischen Trägersubstanzen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.

Beispiel 11: Verbesserte Gewebe-Lebensfähigkeit durch gesteuerte Reaggregation

Aufgereinigte Langerhans-Inseln vom Hund, die nach dem Verfahren von Scharp und Lacy, US-Patente 07/059,125 und 07/364,976, präpariert worden waren, wurden entsprechend der folgenden Vorgehensweise zu Zell- Aggregaten dispergiert, die 1 bis 50 Zellen enthielten. 1000 Hunde-Inseln wurden dreimal mit 50 ml Ca&spplus;&spplus;-und Mg&spplus;&spplus;-freiem Hank-Medium, das 1mM EDTA enthielt, gewaschen. Nach dem letzten Waschvorgang wurden die Langerhans Inseln 8 min bei 100 x g und 10ºC zentrifugiert, wobei ein Pellet erhalten wurde. Das erhaltene Pellet wurde im gleichen Medium in einer Konzentration von 1000 Inseln pro 5 ml resuspendiert. Dieses breiartige Material wurde unter Verwendung einer Mikropipette, die mit der Hand gehalten wurde, 8 min bei 24ºC gerührt. Nach diesen 8 min wurden Trypsin und DNAse bis zu Endkonzentrationen von 25 µg/ml bzw. 2 µg/ml zugegeben. Das breiartige Material wurde durch wiederholtes Pipettieren etwa 5 min weiter gerührt. Danach erfolgte eine mikroskopische Untersuchung, die zeigte, daß die größten Aggregate aus nicht mehr als etwa 50 Zellen bestanden. Die Spaltung wurde durch Zugabe von kaltem DMEM, das 10% Serum neugeborener Kälber enthielt, in einer Menge von 10 ml pro 1000 Inseln beendet. Durch 6-minütige Zentrifugation bei 250 x g wurden die Aggregate pelletiert. Die Aggregate wurden in 25% Pferdeserum enthaltendem Ham F12-Medium über Nacht kultiviert, wobei während dieser Zeit eine beschränkte Reaggregation erfolgte, die zu einer durchschnittlichen Aggregat-Volumengröße von etwa 35 µm führte.
Im Anschluß an die Übernachtkultur wurden die Aggregate mittels 6- minütiger Zentrifugation bei 250 x g pelletiert. Zu dem Pellet wurde eine 2%-ige Lösung eines nicht-vernetzten Alginats gegeben, wobei eine aus 1% (Gew./Vol.) Alginat und 8% (Gew./Vol.) Gewebe bestehende Lösung hergestellt wurde. Das Endvolumen der Langerhans-Inseln im Kern betrug 0,56 mm³, wobei die Inseln in Form von Aggregaten vorlagen, die in der ganzen viskösen Flüssigkeit gleichmäßig dispergiert waren. Der Gewebe-Brei wurde unter sterilen Bedingungen in einen Pe-90-Schlauch einer bestimmten Länge gesaugt, dessen Ende vorher so verengt worden war, daß es in den Hohlraum von Hohlfaser-Membranen mit einem Innendurchmesser von 670 µm (Außendurchmesser = 800 µm) paßte. In mehrere 2 cm lange PAN/PVC-Fasern wurden jeweils 10 µl des Gewebe-haltigen Breis injiziert. Die Enden jeder Faser wurden wie vorstehend beschrieben abgedichtet. Die Fasern wurden über Nacht in 25% Pferdeserum enthaltendem Ham-F12-Medium aufbewahrt. Vor Implantation wurden die Fasern zur Entfernung von Serum-Resten 1 Stunde in frisches Hank-Medium ohne Serum gegeben.
Nach Übernachtkultur wurde die Hälfte der Trägersubstanzen in die Bauchfellhöhle von Ratten mit normalem Blutzuckerspiegel implantiert (2 Trägersubstanzen pro Tier). Die andere Hälfte der Trägersubstanzen wurde in einer in vitro-Gewebekultur gehalten. Nach 2 Wochen wurden die implantierten Trägersubstanzen aus der Bauchfellhthle entfernt und zusammen mit den in vitro kultivierten Kontroll-Trägersubstanzen in vitro einer Glucose-Behandlung unterworfen. Die der Bauchfellhöhle entnommenen Trägersubstanzen zeigten eine Insulin-Freisetzung, die genauso hoch oder sogar besser war als die vor Implantation festgestellte Insulin-Freisetzung, was zeigte, daß nicht nur die Fähigkeit zur Insulin-Freisetzung, sondern auch die Empfindlichkeit gegenüber Glucose erhalten geblieben war. Nach Glucose- Behandlung wurde der Alginatkern der Trägersubstanzen "ausgeblasen" und das Gewebe wurde zum Nachweis der Lebensfähigkeit mit PI angefärbt. Obwohl sich jedes Aggregat zusammengeballt hatte, wobei sich eine dichte sphäroidische Form mit einem Durchmesser von etwa 35 µm gebildet hatte, blieben die einzelnen Aggregate im ganzen Alginatkern gut verteilt und hatten keine Zellhaufen mit nekrotischen Bereichen gebildet. Da eine Färbung mit dem Färbemittel PI ausblieb, bedeutete das eine 100%-ige Lebensfähigkeit.

Beispiel 12: Teilweise Wiederherstellung der Motorik nach Implantation von immunologisch isolierten chromaffinen Nebennieren-Zellen in einem experimentellen Modell der Parkinson-Krankheit

Nach dem Verfahren von Livett, B. G., Physiol. Rev. 64 (1984), 1103-1161 wurden chromaffine Rinder-Nebennieren-Zellen aus Nebennieren mittels Collagenase- Spaltung gewonnen und 10 Tage in Kultur gehalten, um Verunreinigungen durch Bakterien oder Pilze auszuschließen. Chromaffine Zell-Klumpen wurden mittels Zentrifugation in serumfreiem Medium gewaschen und in einer 1%-ige Alginat-Lösung resuspendiert. Unter Anwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Coextrusions-Verfahrens wurde diese Zell-Suspension zur Bildung einer immunologisch isolierenden Trägersubstanz verwendet, die aus einem Matrix-Kern und einer thermoplastischen Membran bestand. Das wäßrige Präzipitations-Bad umfaßte eine Lösung von 1%-igem CaCl&sub2;, die 1:2 mit Gewebe-Kulturmedium gemischt worden war, so daß die CaCl&sub2;- Endkonzentration im Bad 0,5% betrug. Die Faser wurde 6 Minuten im Bad inkubiert, wodurch das Alginat in den Gelzustand überging, und anschließend in eine Petri-Schale überführt, die nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthielt. Die Faser wurde optisch auf Bereiche mit gut ausgebildeten Wänden und danach stichprobenartig auf vorhandene chromaffine Zellen hin untersucht. Danach wurde die Faser in 4 mm lange Bereiche geteilt, deren Enden mittels einer Kombination aus Hitze-, Lösungsmittel- und Druckeinwirkung abgedichtet wurden.
Acht Sprague-Dawley-Ratten wurde 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)(10 µg/5 µl) in die Substantia nigra injiziert. In wöchentlichen Abständen wurden die Tiere auf Apomorphin-induziertes (0,1 mg/kg) Drehverhalten hin getestet (mit Hilfe des von Ungerstedt, V. U., Acton Physiol. Scand Suppl. 367 (1971), 69-93, und Ungerstedt, V. U., Brain Res. 24 (1970), 485-493, beschriebenen Verfahrens). Apomorphin induziert eine Parkinson-ähnliche motorische Reaktion, wobei ein Abwenden von der Stelle der 6-OHDA-induzierten Funktionsstörung erfolgt. Das Maß eines solchen motorischen Drehverhaltens nach Apomorphin- Induktion kann zur Kontrolle des Umfangs der Störung und des Ausmaßes der Besserung verwendet werden, die durch die immunologisch isolierten chromaffinen Zellen bewirkt wird. Sechs Wochen nach Induktion des Parkinson-Syndroms wurden den Tieren entweder Kontrollen (Trägersubstanzen ohne Zellen) oder chromaffine Nebennieren-Zellen enthaltende Trägersubstanzen intrastriatal implantiert. Danach wurden die Tiere in wöchentlichen Abständen erneut auf Drehverhalten untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 9 zusammengefaßt.
Vor Implantation zeigten alle Tiere nach Apomorphin-Behandlung die gleiche Anzahl von Drehungen. In den ersten 2 Wochen nach Implantation verringerten sich bei den Tieren, die immunologisch isolierte chromaffine Nebennieren-Zellen erhalten hatten, die Drehbewegungen signifikant um 35% - 40% und blieben während des gesamten Tests konstant. Das zeigte, daß die Implantate die Wirkungen der 6-OHDA-induzierten Störungen signifikant aufheben konnten Bei den Tieren, die die Kontroll-Trägersubstanzen erhalten hatten, verringerte sich die Anzahl der Drehungen nicht.

Beispiel 13: Vorbeugung von Nervenschädigungen infolge von Exzitotoxizität

In diesem Beispiel ist ein Verfahren zur Verhütung von Nervenschädigungen infolge einer neuralen Exzitotoxizität bei Versuchstieren dargelegt, wobei eine Trägersubstanz implantiert wird, die einen trophischen Faktor sezernierende Zellen enthält. Man geht davon aus, daß dieses Tier-Modell einer neuralen Exzitotoxizität den Nervenschädigungs-Typen analog ist, an denen Patienten mit Chorea Huntington leiden.

Versuchstiere:

Für die folgenden Experimente wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (N = 23) verwendet, die 90 - 120 Tage alt waren und ungefähr 225 g - 250 g wogen. Die Tiere waren in einem Raum zur Haltung größerer Versuchstiergruppen mit regulierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in Gruppen von 2 - 3 untergebracht und wurden bei einem 12-stündigen Licht-Dunkelheit-Zyklus gehalten, wobei das Licht um 7 Uhr angeschaltet wurde. Während des Tests waren Futter und Wasser frei verfügbar.

Herstellung von chromaffine Nebennieren-Zellen enthaltenden Makrokapseln

Aus Rinder-Nebennieren wurden chromaffine Nebennieren-Zellen isoliert und 10 Tage in Kultur gehalten, um Verunreinigungen mit Bakterien oder Pilzen auszuschließen. Chromaffine Zell-Klumpen wurden mittels Zentrifugation in serumfreiem Medium gewaschen und in einer 1%-igen Alginat-Lösung resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde als Lösung für die Düsen-Bohrungen verwendet und mit einer 15%-igen PAN/PVC-Lösung in DMSO coextrudiert. Die chromaffine Zellen enthaltende coextrudierte Faser wurde in einem Bad aufgefangen, das eine mit Gewebe-Kulturmedium 1:2 gemischte 1%-ige CaCl&sub2;-Lösung enthielt. Die Faser wurde 6 Minuten in dieser Lösung belassen, um die Alginat-Gelbildung zu ermöglichen, und dann in eine Medium enthaltende Petri-Schale überführt. Die Faser wurde visuell auf Bereiche mit gut ausgebildeten Wänden und danach stichprobenartig auf vorhandene chromaffine Zellen hin untersucht. Die Kapseln wurden hergestellt, indem die Enden von 4 mm langen Faserabschnitten mittels einer Kombination aus Hitze-, Lösungsmittel- und Druckeinwirkung abgedichtet wurden. Danach wurden die Kapseln stereotaktisch in die Gehirne von Sprague-Dawley-Ratten implantiert.

Herstellung von Chinolinsäure:

Chinolinsäure (Sigma Chemical Co.) wurde in 2 N Natriumhydroxid gelöst und bei einem pH-Wert von 7,2 mit Phosphatpuffer verdünnt, wobei ein End-pH- Wert von 7,4 und eine Endkonzentration von 225 nMol/µl erhalten wurden.

Operationsverfahren:

Die Ratten wurden mit Natriumpentobarbital (45 mg/kg) narkotisiert und in eine Vorrichtung zur Durchführung stereotaktischer Hirnoperationen gelegt. Die Kopfhaut wurde sagittal eingeschnitten und dann wurde ein Loch in den Schädel zur Einführung der in den Makrokapseln eingekapselten chromaffinen Nebennieren-Zellen gebohrt. Die Kapseln wurden in einen Kapillarschlauch gegeben, der an die Vorrichtung zur Durchführung stereotaktischer Hirnoperationen montiert war und auf die folgenden Koordinaten eingestellt war: 0,3 mm vor dem Bregma, 3,5 mm seitlich der Sutura sagittalis und 7,5 mm ventral zur Hirnoberfläche.
Eine Woche später wurden die Tiere narkotisiert und in die Vorrichtung zur Durchführung stereotaktischer Hirnoperationen gelegt. Danach erfolgte die intrastriatale Verabreichung von Chinolinsäure oder der Phosphatpuffer- Trägersubstanz. Unter Verwendung einer 10 µl-Hamilton-Spritze wurden die Lösungen langsam (0,125 µl/Minute) durch ein Loch infundiert, das 0,8 mm seitlich von der Stelle gebohrt worden war, an der sich die Kapsel befand. Die Injektionsstelle für die Chinolinsäure befand sich 0,3 mm vor dem Bregma, 2,7 mm seitlich der Sutura sagittalis und 5,5 mm ventral zur Hirnoberfläche. Insgesamt wurde ein Volumen von 1,0 µl injziert. Die Injektionsnadel wurde weitere 2 Minuten an dieser Stelle belassen, um die lokale Diffusion des Perfusats zu fördern. Dieses Verfahren führte zur Bildung von 3 experimentellen Gruppen. Eine Gruppe hatte die Nebennierenzellen enthaltende Kapsel und Chinolinsäure erhalten (N = 8), eine Gruppe hatte die Kapsel ohne Zellen plus Chinolinsäure erhalten (N = 8) und eine Gruppe hatte nur Chinolinsäure erhalten (N = 7).
Das Körpergewicht wurde nach Verabreichung von Chinolinsäure täglich über einen Zeitraum von 15 Tagen erfaßt.

Histologie:

30 Tage nach Verabreichung von Chinolinsäure wurde bei den Tieren unter Verwendung einer Peristaltik-Pumpe eine transkardiale Perfusion mit 0,9%- iger physiologischer Kochsalzlösung (50 ml/min) vorgenommen, der sich eine Perfusion mit 1% Paraformaldehyd/1,25% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (800 ml/30 Minuten) anschloß (4ºC). Danach wurden die Gehirne 2 Stunden in der Paraformaldehyd-Lösung nachfixiert, bevor sie 24 Stunden in eine 20%-ige Saccharose-Lösung gegeben wurden. Die Gehirne wurden dann eingefroren und auf einem Schlitten-Mikrotom in 30 µm dicke coronale Serienschnitte zerschnitten. Einige Schnitte wurden dann zum Nachweis von Cytochrom-Oxidase histochemisch behandelt. Benachbarte Schnitte wurden zum Nachweis von Nisslschen Schollen angefärbt.

Ergebnisse:

Es wurde davon ausgegangen, daß das Vorliegen von Cytochrom- Oxidase Stoffwechsel-Aktivität und daher die Lebensfähigkeit von Nervenzellen anzeigt. Die Anfärbung von Nisslschen Schollen wurde verwendet, um die zellulären Prozesse sichtbar zu machen und die allgemeine Struktur des Nervenaufbaus zu beurteilen.
Im Vergleich zu den geschädigten Tieren, die chromaffine Zellen enthaltende Trägersubstanzen erhalten hatten, war das Striatum bei der Gruppe, die Kapseln ohne Zellen erhalten hatte, um 20% - 40% geschrumpft. Bei der Gruppe, die die Kapseln ohne Zellen erhalten hatte, wiesen die Nervenzellen des Striatums keine Stoffwechsel-Aktivität auf, wie aufgrund der fehlenden Anfärbung für Cytochrom-Oxidase gezeigt wurde. Außerdem war bei allen Tieren das Körpergewicht signifikant verringert (Figur 10).
Im Gegensatz dazu wiesen die Nervenzellen der Gruppe, die chromaffine Zellen enthaltende Trägersubstanzen erhalten hatten, eine normale Anfärbung von Cytochrom-Oxidase und Nisslscher Schollen auf. Es wurde kein Verlust des Körpergewichts festgestellt.

Schlußfolgerung:

Die Nervenzellen der Versuchstiere, die chromaffine Zellen enthaltende Implantate erhalten hatten, wurden vor exzitotoxischen Schädigungen geschützt, die durch Chinolinsäure verursacht werden.

Beispiel 14: Behandlung eines neurodegenerativen Leidens

In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Behandlung von Tieren mit einer Fimbria-Fornix-Läsion dargelegt. Dieser Läsions-Typ erzeugt Nervenzell-Tod, die Degeneration postsynaptischer Neuronen und Verhaltens-Symptome, die Gedächtnis- und Lern-Mängel anzeigen. Man nimmt an, daß die in diesem Tiermodell erzeugte Degeneration cholinergischer Neuronen ähnlichen Wirkungen entspricht, die sich bei der Alzheimer-Krankheit des Menschen beobachten lassen.
Operationsverfahren zur Erzeugung einer Fimbria-Fornix-Läsion: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (250 g - 350 g) wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (55 mg/kg) narkotisiert. Einseitige Fimbria-Fornix-Läsionen wurden durch Ansaugen der Fimbrien, des dorsalen Fornix, des Mittelteils des parietalen Cortex, der ventralen hippocampalen Commisura fornicis, des Corpus callosum und des darüberliegenden Cortex- Cingulums erreicht. Eine nachstehend beschriebene Trägersubstanz wurde dann in das ipsilaterale Lateralventrikel jedes Tieres implantiert, wobei sie senkrecht zur Interaural-Ebene orientiert wurde.

Herstellung von PAN/PVC-Fasern.

Mittels des Trockenstrahl-Naßspinn- Verfahrens (Cabasso, 1980) wurden permselektive Hohlfasern hergestellt. Eine 15%-ige Lösung des PAN/PVC-Copolymers in Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde durch eine ringförmige Spinndüse extrudiert, wobei das Lösungsmittel DMSO (für eine poröse Innenfläche) oder Wasser, in dem sich das Copolymer nicht löst (für eine glatthäutige Innenfläche) durch die Bohrung strömte. Die erhaltene Faser wurde in einem Wasserbad aufgefangen, in dem sich das Copolymer nicht löst, mit Glycerin behandelt und getrocknet.

Gentechnisch veränderte Fibroblasten.

Die Ratten-Fibroblasten-Zellinien R208N.8 und R208F wurden von Dr. Xandra Breakefield, Harvard University, erhalten. Die NGF-sezernierende Fibroblasten-Zellinie R208N.8 wurde wie folgt konstruiert (Short, et al., Dev. Neurosci. 12 (1990), 34-45). Aus dem Moloney- Leukämie-Virus der Maus wurde ein retroviraler Vektor konstruiert. Dieser enthielt die letzten 777 Basenpaare des codierenden Bereichs einer Maus-NGF- cDNA unter der Kontrolle der viralen 5'-gelegenen langen terminalen Sequenzwiederholung. Der Vektor umfaßte auch einen dominanten selektierbaren Marker, der das Neomycin-Resistenz bewirkende Protein des Transposons Tn5 codierte und unter der Kontrolle eines internen Promotors des Rous-Sarkom-Virus stand. Übertragbare Retroviren wurden hergestellt, indem die Vektor-DNA in das amphotrope Mittel PA317 produzierende Maus- Fibroblasten-Zellen transfiziert wurde und Kulturmedium dieser Zellen zur Infektion ecotroper Ψ2-Zellen verwendet wurde. Viren aus einem Ψ2-Clon, der die höchsten Virus-Titer produzierte, wurden zur Infektion der etablierten Ratten-Fibroblasten-Zellinie R208F verwendet, wobei durch Transformation der Stamm R208N.8 erhalten wurde. Einzelne Neomycin-resistente Kolonien, die in einem das Neomycin-Analog G418 enthaltendem Medium selektiert worden waren, wurden vermehrt und mit Hilfe eines zweiseitigen Enzym-Immuntests auf Produktion und Sekretion von NGF getestet.

Einkapselung von Fibroblasten.

Zellen der Fibroblasten-Zellinien R208F und R208N.8 wurden mit Trypsin-EDTA aufgespalten und in einer Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/µl in einem Laminin enthaltenden Matrigel suspendiert, in Matrigel oder Vitrogen resuspendiert und mit einer 1 cm³-Spritze in eine vorher sterilisierte PAN/PVC-Hohlfaser gesaugt. Die Fasern wurden auf eine Länge von 4 mm geschnitten. Die Faser-Enden wurden mit einem sterilen Operationskauter abgedichtet.

Immuncytochemische CHAT-Analyse.

Nach zwei Wochen wurden die Tiere getötet. Mittels transkardialer Perfusion mit Heparin enthaltender kalter physiologischer Kochsalzlösung und 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer wurden die Gehirne fixiert. Die Gehirne wurden sofort zerschnitten und über Nacht nachfixiert. Anschließend wurden sie in gepufferte 15%-ige und 25%- ige Saccharose-Lösungen getaucht. Auf einem Kältemikrotom wurden durch Schneiden von vorn nach hinten 25 µm dicke gefrorene Schnitte hergestellt. Alle coronalen Schnitte wurden auf Glasträgern oder in Phosphatpuffer gesammelt. Typische Coronal-Schnitte wurden mit Hilfe des Biotin-Avidin-DAB- Verfahrens unter Verwendung eines gegen Ratten-CHAT gerichteten monodonalen Antikörpers (2,5 µg/ml) für die weitere immuncytochemische Analyse bearbeitet. Die Schnitte wurden in eine Halterung gegeben und die Nervenzellkörper wurden mit Kresylviolett gegengefärbt. Im ipsilateral und contralateral zur Läsion liegenden Bereich des medialen Septums und des vertikal-diagonalen Ligaments zwischen dem Knick des Corpus callosums und der Kreuzung der Commisura anterior wurden alle CHAT-positiven Zellkörper ausgezählt. Bei Ratten, die R208N.8-Fibroblasten enthaltende Kapseln erhalten hatten, wurde festgestellt, daß eine Verminderung von Chat(+)-Zellen signifikant verhindert worden war.

Beispiel 15: Verwendung einer immunologisch isolierenden Trägersubstanz zur Abgabe eines Produktes mit hohem Molekulargewicht an einen Rezipienten

Es wurden immunologisch isolierende Trägersubstanzen hergestellt, indem 350 000 Hybridom-Zellen, die einen für den Tumornekrose-Faktor (TNF) spezifischen Antikörper (Isotyp Immunglobulin G) produzierten, manuell in eine 7 mm lange feinporige Olefin-Hohlfaser von medizinischer Qualität eingefüllt wurden, wobei es sich um die zur Plasmaphorese verwendete Art handelte (Plasmaphan; Enka). Der Innendurchmesser der Faser betrug 300 µm und ihr MWCO-Wert lag bei 1000 kD. Die Enden der Trägersubstanz wurden wie im gleichfalls anhängigen US-Patent 07/461,999, beschrieben, abgedichtet. Die Trägersubstanz wurde unter die Nierenkapsel einer Maus implantiert, wo sie 14 Tage belassen wurde. Danach wurde die Trägersubstanz zurückgewonnen. Es stellt sich heraus, daß sie viele Zellen enthielt, wobei über 50% davon lebensfähig waren, wie durch Ausschluß des Indikatorfarbstoffes (pI) bestimmt wurde. Die Freisetzung des TNF-spezifischen Antikörpers in das Serum der Rezipienten-Maus wurde mittels eines EUSA-Verfahrens kontrolliert. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt: Tabelle 2
Eine in vitro gehaltene immunologisch isolierende Trägersubstanz, die als Kontrolle diente, zeigte eine ähnliche Antikörper-Freisetzung.

Beispiel 16: Subcutane Implantation eingekapselter Langerhans-Inseln

Herstellung von Langerhans-Inseln enthaltenden Kapseln: Es wurden zwei als Typ 1 und Typ 2 bezeichnete Hohlfaser-Typen aus Acryl-Copolymer verwendet. Die Fasern wurden mit einer Spinndüse unter Verwendung des von I. Cabasso, Hollow Fiber Membranes, Bd. 12 von "Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology", 3. Ausgabe (1980), S. 492-517, Wiley, New York, beschriebenen Trocken-Naß-Spinnverfahrens gebildet. Das verwendete Acryl-Copolymer war Poly(acrylonitril-co-vinylchlorid) (Mn = 100 000, Mw = 300 000, wie mittels Größenausschluß-Chromatographie bestimmt; Cytotherapeutics, Inc.), das in Dimethylsulfoxid gelöst wurde (12,5% (Gew./Gew.)). Die Acryl-Copolymer- Lösung wurde durch den Außenschlauch der Spinndüse gepumpt, während durch den Innenschlauch Wasser gepumpt wurde. Die Hohlfasern vom Typ 1 wurden durch einen Luftspalt in Wasser extrudiert, was zu einer perforierten Außenwand führte, die typisch für mittels des Trocken-Naß-Spinnverfahrens hergestellte Fasern ist. Die Fasern vom Typ 2 wurden in ähnlicher Weise hergestellt, wobei allerdings der Luftspalt durch eine befeuchtete Atmosphäre ersetzt wurde, was zu einer glatten Außenfläche führte.
Aus männlichen Wistar-Furth-Ratten wurden wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, Ratten-Langerhans-Inseln isoliert. Die Inseln wurden wie in Lacy, P. E., et al., Science 254 (1991), 1782 beschrieben, in einem Alginat-Gel immobilisiert und in 2 cm langen Fasern vom Typ 1 oder Typ 2 eingekapselt, wobei pro Faser 550 Inseln oder 1000 Inseln eingekapselt wurden.
Implantation: Die eingekapselten Ratten-Langerhans-Inseln wurden subcutan oder intraperitoneal in Mäuse implantiert, bei denen durch Streptozotocin- Injektion Diabetes erzeugt worden war. Dreimal wöchentlich wurde die Glucose-Konzentration im Plasma unter normalen Fütterungsbedingungen bestimmt. Die diabetischen Rezipienten wiesen vor Implantation Glucose- Konzentrationen auf, die über 400 mg/dl lagen. Die Beschickungsdichte der Fasern betrug bei 1000 eingekapselten Inseln 70 Inseln/cm und bei 500 eingekapselten Inseln 35 Inseln/cm. Bei 26 Mäusen wurden die Fasern intraperitoneal implantiert und bei 26 Mäusen subcutan. 14 Mäuse jeder Gruppe erhielten Fasern mit insgesamt 1000 Inseln und 12 Mäuse Fasern mit insgesamt 500 Inseln.
Ergebnisse: Durch intraperitoneal implantierte Fasern vom Typ 1 wurde bei sieben von neun Rezipienten, die 1000 Inseln erhalten hatten, und bei allen Rezipienten, die 500 Inseln erhalten, über einen Zeitraum von mehr als 60 Tagen der normale Blutzuckerspiegel induziert. Bei keinem der Rezipienten, die Implantate vom Typ 1 mit 500 Inseln subcutan erhalten hatten, blieb der normale Blutzuckerspiegel 60 Tage bestehen, während bei drei von acht der Rezipienten, die Implantate vom Typ 1 mit 1000 Inseln subcutan erhalten hatten, der normale Blutzuckerspiegel länger als 60 Tage bestehen blieb. Nach Entfernung der Fasern aus diesen drei Rezipienten stellte sich bei den Mäusen wieder Diabetes ein. Ratten-Inseln enthaltende Faser-Implantate vom Typ 2 erzeugten bei mehr als 80 % der Rezipienten-Mäusen einen normalen Blutzuckerspiegel, wobei es keine Rolle spielte, ob 1000 Inseln oder 500 Inseln intraperitoneal oder subcutan implantiert worden waren. Nach Entfernung der Fasern am 60. Tag erhöhte sich bei den Rezipienten wieder die Blutzuckerkonzentration. Eine histologische Untersuchung der entfernten Fasern vom Typ 1 und Typ 2 zeigte ihre biologische Verträglichkeit.

Beispiel 17: Gesteuerte Reaggregation von Langerhans-Inseln der Ratte

Langerhans-Inseln der Ratte wurden wie in Beispiel 11 beschrieben isoliert, getrennt, erneut aggregiert und eingekapselt, wobei allerdings die abgedichteten Fasern in vitro nicht mit Serum behandelt und nur 1 Stunde bis zur Implantation aufbewahrt wurden. In jede Ratte wurden entweder zwei 2 cm lange Kapseln oder zwei 2 cm lange Kapseln plus eine 1 cm lange Kapsel implantiert.
Längerhans-Inseln wurden getrennt und dann erneut bis zu einer Größe von 35 µm aggregiert. Aus etwa 500 Inseln stammende reaggregierte Zellen wurden allesamt in jeweils eine 4 cm - 6 cm lange Kapsel eingefüllt. Durch die implantierten Kapseln konnte bei Ratten der normale Blutzuckerspiegel über einen Zeitraum von mehr als 60 Tagen aufrechterhalten werden.

Beispiel 18: Herstellung von blattförmigen Trägersubstanzen zur Einkapselung von Langerhans-Inseln

In den folgenden Verfahren wurden nur sterile Materialien und Methoden verwendet. Die Sterilisation erfolgte im Autoklaven oder mittels Ethanol, UV- Licht oder Sterilfiltration durch 0,2 µm-Filter.
Unter Verwendung eines in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel gelösten Monoacryl-Copolymers mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10&sup5; Dalton wurde eine Gieß-Lösung hergestellt. Die Gießlösung enthielt 10,0% (Gew./Gew.) Polymer im organischen Lösungsmittel. Vor seiner Verwendung wurde das Polymer unter sterilen Bedingungen einmal präzipitiert, um restliche Monomere und Oligomere oder vom Hersteller zugebene Zusatzstoffe aus der Polymer-Substanz zu entfernen. Die Polymer- Lösung wurde dann getrocknet und erneut in 100% DMSO gelöst, wobei sich eine 10%-ige (Gew./Gew.) Polymer-Lösung bildete. Dann ließ man diese Lösung über ein steriles 0,2 µm-Nylonfilter laufen, wobei der Durchfluß unter sterilen Bedingungen gesammelt wurde.
Dann wurde die Gießlösung unter Verwendung eines Gießrahmens gleichmäßig auf einem 1/4 Zoll-Glasträger verteilt, wobei die Schichtdicke des aufgetragenen Films 125 µm betrug. Zum Gießen des Films wurde der Träger, der in einer Schräge von 30º gehalten wurde, unter dem stationären Gießrahmen weg- und in das Fällbad hineingezogen. Das Fällbad lag 1/8 Zoll -1/4 Zoll unter dem Gießrahmen. (Als Träger kann ein beliebiges Material verwendet werden, das ein vorzeitiges Abheben der Membran vom Träger vor ihrer vollständigen Aushärtung verhindert.) Zur gleichen Zeit, als die Gießlösung verteilt wurde, war sie in ein Wasserbad mit 24ºC getaucht, was zur Aushärtung des Polymers unter Ausbildung einer anisotropen semipermeablen Membran führte, wobei sich auf der abgeschreckten (dem Träger abgewandten) Seite der Membran eine permselektive Schicht in Form eines dünnen Häutchens zeigte. Der Film wurde vier Minuten im Bad belassen, um sicherzustellen, daß sich die Eigenschaften der Membran vor ihrer Entfernung ausreichend ausgebildet hatten.
Der Film wurde danach einer Reihe von Waschvorgängen unterworfen, um alle Lösungsmittelreste und toxischen Rückstände zu entfernen, die die Verträglichkeit des Endproduktes beeinträchtigen könnten. Die Waschbäder bestanden aus Lösungen, die keine merkliche physikalische oder chemische Modifikation der anfangs erhaltenen Membran bewirkten. Das erste nach Herstellung verwendete Bad bestand aus Wasser, das über ein Milli-Q- Reinigungssystem aufgereinigt worden war. Der Film wurde zum Einweichen mindestens 15 Minuten darin belassen. Das Material wurde dann entfernt und mindestens 60 min in eine aus genau 70% (Vol./Vol.) Ethanol und Wasser bestehende Lösung gegeben, die über ein 0,2 µm-Filter filtriert worden war. Danach wurde der Film entfernt. Schließlich wurde der Film nacheinander in zwei Bädern eingeweicht, die sterile physiologische Kochsalzlösung enthielten, wobei ein Volumen von 2 ml/cm² Faser verwendet wurde und die Einweichdauer jeweils mindestens 60 min betrug.
Ergebnisse: Die Dicke der endgültigen Membran, die so feucht war wie beim Gießen, lag zwischen 30 µm und 75 µm, wobei bei einem Flüssigkeitsdruck von 5,0 psig die Permeabilität 0,475 cm³/min/cm² betrug. Ausschlußkoeffizienten- Werte zeigen, daß die Membran Stoffe ausschließen kann, die größer als etwa 100 000 Dalton sind.
Einkapselung und Implantation: Wie vorstehend beschrieben, wurde eine sterile 10%-ige blattförmige Membran gegossen und in physiologischer Kochsalzlösung eingeweicht. Langerhans-Inseln wurden wie folgt eingekapselt: Ein 6-8-Zoll breites Blatt der feuchten Membran wurde so gefaltet, daß die Häutchen enthaltenden Seiten zueinander lagen, wobei ein etwa 1 Zoll breiter Doppelmembran-Streifen erzeugt wurde. Die gefaltete Membran wurde vorsichtig gepreßt, so daß ein scharfer Knick entstand. Unter Verwendung einer #10-Skalpell-Klinge wurde der 1 Zoll breite Doppelmembran-Streifen vom Rest des Blatts abgeschnitten. Der Doppelmembran-Streifen wurde an einem Ende angehoben und mit einer Schere in 1 Zoll breite Quadrate geschnitten. Die Quadrate wurden so, wie sie abgeschnitten wurden, in physiologischer Kochsalzlösung aufgefangen. Bei jedem Quadrat waren die obere und untere Seite durch den an einer Seite befindlichen Knick verbunden.
Unmittelbar vor Beschickung wurde ein Quadrat herausgehoben und auf den Deckel einer Polystyrol-Petrischale mit einem Durchmesser von 3 Zoll gelegt, auf den vorher 1 - 2 ml einer 1%-igen CaCl&sub2;-Lösung gegeben worden waren. Die Membran wurde aufgeklappt und dann ließ man jede Seite der Membran auf der CaCl&sub2;-Lösung schwimmen, wobei achtgegeben wurde, daß die Lösung nicht auf die Oberseite der Membran gelangte.
Vor diesem Schritt ließ man die Langerhans-Inseln stehen, wobei sie sich ablagerten und ein Pellet bildeten. Danach wurden sie in einer nicht-gelierten 1%-igen Natriumalginat-Lösung (die Lösung wurde hergestellt, indem eine 2%- ige Alginat-Lösung in H&sub2;O hergestellt und 50:50 mit Medium gemischt wurde, in dem die Inseln kultiviert worden waren) resuspendiert. Der aus Inseln und Alginat bestehende Brei wurde durch Rühren und Ansaugen vorsichtig gemischt. Der Brei wurde so hergestellt, daß pro cm² verwendbarer Oberfläche einer einzigen Membran-Seite 500 Inseln in 25 µl Alginat aufgetragen werden konnten. Bei einem quadratförmigen Membranblatt mit einer Seitenlänge von 1 Zoll entsprach das etwa einem Volumen von 125 µl und 2500 Ratten-Inseln.
Der aus Inseln und Alginat bestehende Brei wurde in die Spitze einer 200 µl- Pipette gesaugt und dann gleichmäßig auf der Innenseite einer Membran verteilt, wobei ein 1/8 Zoll breiter Streifen entlang der Ränder des quadratischen Blatts ausgespart wurde. Die Verteilung wurde schnell durchgeführt, da sich aufgrund der Diffusion von Ca&spplus;&spplus; aus der darunterliegenden CaCl&sub2;-Lösung durch die Membran hindurch das Alginat langsam vernetzte.
Sobald das Alginat ausreichend vernetzt war, so daß es nicht verschmieren konnte (etwa 1 - 2 min), wurde die andere Seite der blattförmigen Vorrichtung darübergeklappt, wobei die obere Schicht des Sandwich-artigen Blatts gebildet wurde. Auf die Entfernung der Luftbläschen wurde geachtet.
Die zwei Seiten der Membran wurden unter Verwendung einer Impuls- Heißsiegel-Vorrichtung mit einem auf eine mittlere Temperatur eingestellten 1/8 Zoll-Heizelement verschweißt (die Temperatur erreichte 80ºC - 160ºC).
Jeder Rand einschließlich des geknickten Randes wurde einzeln abgedichtet, indem die Heißsiegel-Vorrichtung eingeschaltet wurde und gleichzeitig auf den 1/8 Zoll breiten Streifen der nicht mit Alginat beschichteten Membran entlang jedes Randes Druck ausgeübt wurde.
Zur weiteren Alginat-Vernetzung wurde die Vorrichtung nach Verschweißen 4 min in einer 1%-igen CaCl&sub2;-Lösung eingeweicht. Bis zur Implantation (innerhalb von 2 Stunden) wurde die Vorrichtung in Hank-Lösung aufbewahrt.
Das flache Blatt wurde in die Bauchfellhöhle einer Wistar-Furth- Rezipientenratte, bei der auf chemischem Weg Diabetes erzeugt worden war, implantiert, indem ein Mittelschnitt durch die Haut in die Bauchfellhöhle des narkotisierten Tieres durchgeführt wurde. Das blattförmige Implanat wurde in die Höhle eingesetzt, indem der verschweißte Rand mit einer glatten Pinzette erfaßt und die Vorrichtung vorsichtig frei beweglich auf den proximal zur Bauchfellwand gelegenen Darmhaufen gegeben wurde. Bauchfellhöhle und Haut wurden durch eine Naht geschlossen.

Claims

1. Implantierbare Trägersubstanz mit einem Kern, der lebende Zellen umfaßt, zur Bereitstellung eines biologisch aktiven Produkts oder einer Funktion für einen Patienten, gekennzeichnet durch:

(a) einen Kern, der mindestens 10&sup4; isolierte lebende Zellen umfaßt, dispergiert in einer biokompatiblen Matrix, umfassend ein Hydrogel oder eine extrazelluläre Matrix, wobei die Zellen ein biologisch aktives Produkt sezernieren können oder eine biologische Funktion gegenüber einem Patienten ausüben können; und

(b) eine äußere, als Immunisolator wirkende Hülle, die den Kern umgibt, wobei die Hülle ein biokompatibles thermoplastisches Material umfaßt, oder ein Hydrogelmaterial, das während der Herstellung der Hülle nicht ionisch an ein Polymer mit entgegengesetzter Ladung im Kern bindet, wobei die Hülle frei ist von Zellen, die nach außen herausragen und wobei die Hülle einen Molekulargewichtsausschlußwert hat, der eine immunologische Abstoßung der Zellen im Kern verhindert und die Passage von Substanzen zwischen Patienten und dem Kern durch die Hülle zur Bereitstellung des biologischen Produkts oder der Funktion erlaubt.

2 Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Trägersubstanz eine Vorrichtung zur Rückgewinnung nach der Implantation aufweist.

3. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Kernmatrix ein Hydrogel umfaßt.

4. Trägersubstanz nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Hülle ein thermoplastisches Material umfaßt.

5. Trägersubstanz nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Hülle ein Hydrogel umfaßt.

6. Trägersubstanz nach Anspruch 3, wobei die Hülle den gleichen Typ von Hydrogel wie der Kern umfaßt.

7 Trägersubstanz nach Anspruch 6, wobei das Hydrogel Alginat umfaßt, das mit einem multivalenten Ion vernetzt ist.

8. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Kernmatrix extrazelluläre Matrixkomponenten umfaßt.

9. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Trägersubstanz ein Kernvolumen von mehr als 1 µl umfaßt.

10. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Matrix außer dem ein Reservoir für Wachstumsfaktoren, Wachstumsregulatorsubstanzen oder Nährstofftransportverstärkern umfaßt

11. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die äußere Hülle eine zylindrische oder nicht-kugelförmige Gestalt aufweist.

12. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Zellen ausgewählt sind aus Insulin-produzierenden Zellen, Nebennieren-Chromaffinzellen, Antikörper sezernierenden Zellen, Fibroblasten, Astrocyten, Schwann-Zellen, Gliazellen, Beta-Zell inien, PCL2-Zellen, NIT-Zellen, RIN-Zellen, ATT-Zellen, β-TC-3-Zellen, Eizellen des Chinesischen Hamsters und gentechnisch veränderten Zellen.

13. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Zellen Nebennieren-Chromaffinzellen sind.

14. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Zellen mit Feeder- oder zusätzlichen Zellen innerhalb der Trägersubstanz coisoliert werden.

15. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei alle Zellen in einem Abstand von nicht mehr als etwa 800 µm von einer Diffusionsoberfläche vorliegen.

16. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Hülle zwischen 5 und 200 Mikron dick ist.

17. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei der Molekulargewichtsausschlußwert über 100 kD beträgt.

18. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Hülle eine einzelne permselektive Schicht umfaßt, die den Kern umgibt.

19. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Hülle zwei permselektive Schichten umfaßt, die den Kern umgeben.

20. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Zellen ein biologisch aktives Produkt sezernieren, ausgewhlt aus Antikörpern, Enzymen, trophischen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Cytokinen, Lymphokinen, Neurotransmittern und Modifikatoren einer biologischen Antwort.

21. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Zellen ein biologisch aktives Produkt sezernieren können, ausgewählt aus einem Wachstumsfaktor, einem trophischen Faktor oder beiden.

22. Trägersubstanz nach Anspruch 21, wobei das biologisch aktive Produkt ausgewählt ist aus Nervenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, ziliarem neurotrophen Faktor, vom Gehirn stammendem neurotrophem Faktor, Neurotrophin 3, Neurotensin, Substanz P und α- Neuroprotectin.

23. Trägersubstanz nach Anspruch 1, wobei die Zellen einen Neurotransmitter sezernieren.

24. Verfahren zur Herstellung einer implantierbaren Trägersubstanz mit einem Kern, der lebende Zellen umfaßt, zur Bereitstellung eines biologisch aktiven Produkts oder einer Funktion für einen Patienten, wobei das Verfahren durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

(a) Erzeugung eines Kerns, der mindestens 10&sup4; isolierte lebende Zellen umfaßt, dispergiert in einer biokompatiblen Kernmatrix, wobei die Zellen ein biologisch aktives Produkt sezernieren oder eine biologische Funktion bereitstellen, und

(b) Erzeugung einer äußeren, als Immunisolator wirkenden Hülle aus einem Hydrogel oder einem thermoplastischen Material um die Kernmatrix, wobei die Hülle dick genug ist, um zu verhindern, daß die Zellen daraus herausragen, und einen Molekulargewichtsausschlußwert aufweist, der die immunologische Abstoßung von Zellen im Kern verhindert, aber die Passage von Substanzen zwischen den Patienten und dem Kern durch die Hülle erlaubt, zur Bereitstellung des biologischen Produkts oder der Funktion

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Trägersubstanz durch Coextrusion erzeugt wird, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Coextrusion einer Suspension der Zellen, die von der inneren Bohrung in einem biokompatiblen Matrixprecursor bereitgestellt werden, ausreichend, um die Zellen darin dispergiert zu halten, aus einer verschachtelten Extrusionsdüse mit Zweifachbohrung mit einer inneren Bohrung und einer äußeren Bohrung;

(b) Bereitstellung einer Lösung eines biokompatiblen hüllenerzeugenden Precursormaterials von der äußeren Bohrung, wobei die Suspension von (a) mit der Lösung von (b) in Kontakt kommt zur Erzeugung einer biokompatiblen, als Immunisolator wirkenden Hülle aus der Lösung von (b); und

(c) Erzeugung einer biokompatiblen Matrix aus dem biokompatiblen Matrixprecursor.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Erzeugung des Matrixkerns aus dem Matrixprecursor erfolgt, wenn die Zellsuspension von (a) und die Lösung von (b) coextrudiert werden.

27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Matrixprecursor von (a) ein Alkalimetallalginat umfaßt, das mit der Lösung von (b) in eine wäßrige Lösung eines mehrwertigen Kations coextrudiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Lösung von (b) ein Hydrogel oder einen Precursor der thermoplastischen Hülle umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Lösung von (b) ein Alkalimetallalginat umfaßt und die Zellsuspension von (a) und die Lösung von (b) in eine wäßrige Calciumchloridlösung coextrudiert werden.

30. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Lösung von (b) ein wasserunlösliches thermoplastisches Polymer oder Copolymer umfaßt, das in einem wassermischbaren Lösungsmittel gelöst ist, und die Suspension von (a) und die Lösung von (b) in eine wäßrige Flüssigkeit coextrudiert werden.

31. Verfahren zur Herstellung einer implantierbaren Trägersubstanz mit einem Kern, der lebende Zellen umfaßt, die ein biologisch aktives Produkt sezernieren können oder eine biologische Funktion bereitstellen können, wobei das Verfahren durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

(a) Erzeugung einer Hülle aus einem biokompatiblen Material, wobei die Hülle einen Molekulargewichtsausschlußwert hat, der die immunologische Abstoßung der Zellen im Kern verhindert, aber die Passage von Substanzen hindurch zur Bereitstellung des biologisch aktiven Produkts oder der biologischen Funktion erlaubt;

(b) Beschicken der Hülle mit einem Kern, der mindestens 10&sup4; Zellen umfaßt, wobei die Zellen in einer biokompatiblen Matrix dispergiert sind, umfassend ein Hydrogel oder extrazelluläre Matrixkomponenten.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Hüllenmaterial aus einem Hydrogel oder einem thermoplastischen Material erzeugt wird.