BR112013007616B1 - Métodos para retirar o cap ("uncapping") de porções de manose-1- fosfo-6-manose e desmanosilar n-glicanos fosforilados em uma glicoproteína, para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero, e para converter uma glicoproteína de uma primeira forma que não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma segunda forma que se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DESOPERCULAR ("UNCAP") PORÇÕES MANOSE-1-FOSFO-6- MANOSE E DESMANOSILAR N-GLICANOS FOSFORILADOS EM UMA GLICOPROTEÍNA E PARA DIRECIONAR E PARA CONVERTER UMA GLICOPROTEÍNA EM UMA CÉLULA DE MAMÍFERO, GLICOPROTEÍNA CAPAZ DE SER TRANSPORTADA, CÉLULA DE MAMÍFERO E CÉLULA FÚNGICA ISOLADA. A invenção refer-se a manosidases capazes de desopercular ("uncap") resíduos manose-1- fosfo-6-manose e desmanosilar N-glicanos fosforilados, métodos de uso dessas manosidases, glicoproteínas produzidas usando os métodos, assim como métodos para facilitar a captação celular por mamíferos de glicoproteínas.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a manosidases que podem (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em fosfo-6- manose e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal desses glicanos contendo fosfato. A invenção também se refere a métodos para facilitar a captação celular por mamíferos de glicoproteínas.

ANTECEDENTES

[0002] Sistemas de expressão de alto desempenho são requeridos para produzir a maioria dos biofarmacêuticos (por exemplo, proteínas recombinantes) atualmente em desenvolvimento. A atividade biológica de muitos desses biofarmacêuticos é dependente de sua modificação pós-tradução (por exemplo, fosforilação ou glicosilação). Um sistema de expressão à base de levedura combina a facilidade da manipulação genética e fermentação de um organismo microbiano com a capacidade de secretar e modificar proteínas. Entretanto, glicoproteínas recombinantes produzidas em células de levedura exibem principalmente estruturas glicano de alta manose e hiper manose heterogêneas, que podem ser prejudiciais para a função da proteína, processamento a jusante e uso terapêutico subsequente, particularmente quando a glicosilação desempenha um papel biologicamente significativo.

SUMÁRIO

[0003] Este documento se baseia, entre outras coisas, na descoberta (i) de uma manosidase que pode hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em fosfo-6-manose (também aqui chamada de "manose-6-fosfato") ("retirar o cap", "uncap") e hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal desses glicanos contendo fosfato ("desmanosilar"); e (ii) de que tanto a retirada do cap (uncapping), quanto a desmanosilação (por enzimas separadas ou por uma única enzima) são requeridas para se conseguir a captação celular por mamíferos de glicoproteínas.

[0004] Em um aspecto, este documento apresenta um método para retirar o cap (uncap) uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose e desmanosilar um N-glicano fosforilado em uma glicoproteína. O método inclui o fornecimento da glicoproteína com um N-glicano fosforilado contendo a ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose; e o contato da glicoproteína com uma manosidase capaz de (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal. A manosidase pode ser uma glicosil hidrolase da família 38. A manosidase pode ser de Canavalia ensiformis ou Yarrowia lipolytica.

[0005] Este documento também apresenta um método para desmanosilar N-glicanos fosforilados. O método inclui o fornecimento de uma glicoproteína compreendendo um N-glicano fosforilado; e o contato da glicoproteína com uma manosidase capaz de (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal. A manosidase pode ser uma glicosil hidrolase da família 38. A manosidase pode ser de Canavalia ensiformis ou Yarrowia lipolytica.

[0006] Os métodos aqui descritos também podem incluir, após as etapas de fornecimento e contato, o contato de uma célula de mamífero com a glicoproteína que inclui o N-glicano fosforilado desmanosilado, em que, após o cotnato, a glicoproteína é transportada para o interior da célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana).

[0007] Os métodos aqui descritos também podem incluir o isolamento da glicoproteína produzida nos métodos. A proteína pode ser uma proteína humana expressada em um organismo fúngico. Por exemplo, o organismo fúngico pode ser Yarrowia lipolytica ou Arxula adeninivorans. O organismo fúngico também pode ser uma levedura metilotrófica (por exemplo, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Oogataea minuta, ou Hansenula polymorpha) ou um fungo filamentoso (por exemplo, Aspergillus caesiellus, Aspergillus candidus, Aspergillus carneus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus penicilloides, Aspergillus restrictus, Aspergillus sojae, Aspergillus sydowi, Aspergillus tamari, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, ou Aspergillus versicolor). A proteína pode ser uma proteína patogênica, uma proteína lisossomal, um fator de crescimento, uma citocina, uma quimiocina, um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, ou uma proteína de fusão. Por exemplo, a proteína lisossomal pode ser uma enzima lisossomal como uma enzima lisossomal associada a um distúrbio de armazenamento lisossomal (LSD). Um LSD pode ser a doença de Fabry, mucopolissacaridose I, doença de Farber, doença de Gaucher, GM1-gangliosidose, doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff, doença do ativador de GM2, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença de Niemann-Pick, doença de Scheie, doença de Hunter, doença de Sanfilippo, doença de Morquio, doença de Maroteaux-Lamy, deficiência de hialuronidase, aspartilglucosaminúria, fucosidose, manosidose, doença de Schindler, sialidose tipo 1, doença de Pompe, picnodisostose, lipofuscinose ceroide, doença do armazenamento do éster de colesterol, doença de Wolman, deficiência de sulfatase múltipla, galactossialidose, mucolipidose, cistinose, distúrbio de armazenamento do ácido siálico, doença da retenção de quilomícron com síndrome de Marinesco- Sjogren, síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome de Chediak- Higashi, doença de Danon ou displasia geleofísica.

[0008] Este documento também apresenta um método para a produção de uma proteína-alvo com uma ligação ou porção manose-6- fosfato ausente de cap (uncapped) e N-glicanos fosforilados desmanosilados em um organismo fúngico. O método inclui o fornecimento de uma célula fúngica geneticamente manipulada para incluir um ácido nucleico que codifique uma manosidase que posas hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em uma porção fosfo-6-manose e hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal desse glicano contendo fosfato; e a introdução na célula de um ácido nucleico que codifique uma proteína-alvo.

[0009] Este documento também apresenta uma célula fúngica isolada geneticamente manipulada para produzir glicoproteínas que incluam uma manose-6-fosfato ausente de cap (uncapped) e um N- glicano fosforilado desmanosilado. A célula fúngica pode ser Yarrowia lipolytica ou Arxula adeninivorans. A célula fúngica também pode ser uma levedura metilotrófica (por exemplo, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Oogataea minuta, ou Hansenula polymorpha) ou um fungo filamentoso (por exemplo, Aspergillus caesiellus, Aspergillus candidus, Aspergillus carneus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus penicilloides, Aspergillus restrictus, Aspergillus sojae, Aspergillus sydowi, Aspergillus tamari, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, ou Aspergillus versicolor). A célula fúngica pode incluir um ácido nucleico que codifique uma manosidase, uma manosidase capaz de (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal. A célula fúngica também pode incluir um ácido nucleico que codifique um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila. A célula fúngica pode ser geneticamente manipulada para ser deficiente em atividade OCH1. A célula fúngica também pode incluir um ácido nucleico que codifique um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila, e em que a célula fúngica é geneticamente manipulada para ser deficiente em atividade OCH1. A manosidase pode incluir um sinal de secreção e/ou um sinal de direcionamento para direcionar uma manosidase para um compartimento intracelular.

[00010] Uma célula fúngica também pode incluir um ácido nucleico que codifique uma proteína-alvo, em que a proteína-alvo é uma glicoproteína. A proteína-alvo pode ser uma proteína humana. A proteína-alvo pode ser uma proteína patogênica, uma proteína lisossomal, um fator de crescimento, uma citocina, uma quimiocina, um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, ou uma proteína de fusão. A proteína lisossomal pode ser uma enzima lisossomal. A proteína-alvo pode ser uma proteína associada a um LSD como doença de Fabry, mucopolissacaridose I, doença de Farber, doença de Gaucher, GM1-gangliosidose, doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff, doença do ativador de GM2, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença de Niemann-Pick, doença de Scheie, doença de Hunter, doença de Sanfilippo, doença de Morquio, doença de Maroteaux-Lamy, deficiência de hialuronidase, aspartilglucosaminúria, fucosidose, manosidose, doença de Schindler, sialidose tipo 1, doença de Pompe, picnodisostose, lipofuscinose ceroide, doença do armazenamento do éster de colesterol, doença de Wolman, deficiência de sulfatase múltipla, galactossialidose, mucolipidose, cistinose, distúrbio de armazenamento do ácido siálico, doença da retenção de quilomícron com síndrome de Marinesco-Sjogren, síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome de Chediak-Higashi, doença de Danon, ou displasia geleofísica.

[00011] Um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila pode ser um polipeptídio MNN4 (por exemplo, um polipeptídio de Yarrowia liplytica, S. cerevisiae, Ogataea minuta, Pichia pastoris, ou C. albicans). O polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila pode ser um polipeptídio PNO1 de P. pastoris.

[00012] Em ainda outro aspecto, este documento apresenta uma cultura substancialmente pura de Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Ogataea minuta, Pichia methanolica, Arxula adeninivorans, ou Aspergillus niger cells, um número substancial dos quais são geneticamente manipulados para produzir glicoproteínas que contenham ligações ou porções manose-6-fosfato ausente de caps (uncapped) e N-glicanos fosforilados desmanosilados. Número substancial indica que mais de cerca de 40% do número total de células viáveis na cultura são geneticamente manipuladas. As células podem incluir um ácido nucleico que codifique uma manosidase, uma manosidase capaz de (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1- fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal. As células também podem incluir um ácido nucleico que codifique um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila. As células podem ser geneticamente manipuladas para serem deficientes em atividade OCH1. As células também podem incluir um ácido nucleico que codifique um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila, e podem ser geneticamente manipuladas para serem deficientes em atividade OCH1. A manosidase pode incluir um sinal de secreção e/ou um sinal de direcionamento para direcionar uma manosidase para um compartimento intracelular.

[00013] Este documento também apresenta um método para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero. O método inclui o fornecimento de uma glicoproteína em que suas ligações manose-6-fosfato tenham sido desmanosiladas, e o contato da célula com a glicoproteína desmanosilada. A glicoproteína pode ser desmanosilada com uma glicosil hidrolase da família 47 ou da família 92. A glicoproteína pode ser desmanosilada com uma manosidase de Aspergillus satoi ou Cellulosimicrobium cellulans. A glicoproteína pode ser desmanosilada com uma glicosil hidrolase da família 38 como uma manosidase de Canavalia ensiformis ou Yarrowia lipolytica.

[00014] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero. O método inclui o fornecimento de uma glicoproteína com um N-glicano fosforilado, em que a glicoproteína não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato na célula; o contato da glicoproteína com uma manosidase capaz de hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose terminal quando a manose subjacente é fosforilada para produzir uma glicoproteína desmanosilada, em que a glicoproteína, após a desmanosilação, se liga substancialmente ao receptor de manose-6-fosfato na célula; e o contato da célula com a glicoproteína desmanosilada. A glicoproteína pode ser desmanosilada com uma glicosil hidrolase da família 47 ou da família 92. A manosidase pode ser de Aspergillus satoi ou Cellulosimicrobium cellulans. A glicoproteína pode ser desmanosilada com uma glicosil hidrolase da família 38 como uma manosidase de Canavalia ensiformis ou Yarrowia lipolytica.

[00015] Em ainda outro aspecto, este documento apresenta um método para converter uma glicoproteína de uma primeira forma que não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero em uma segunda forma que se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero, em que, na primeira forma, a glicoproteína inclui um ou mais N-glicanos contendo um ou mais resíduos manose terminais que estão ligados na posição 1 a um resíduo manose que contém um resíduo fosfato na posição 6. O método inclui o contato da primeira forma da glicoproteína com uma manosidase que desmanosila resíduos manose terminais. A manosidase pode ter atividades de retirada de cap (uncapping) e desmanosilação. Por exemplo, a manosidase pode ser de Canavalia ensiformis ou Yarrowia lipolytica. Em algumas modalidades, a manosidase não tem atividade de retirada de cap (uncapping) (por exemplo, uma manosidase de Aspergillus satoi ou Cellulosimicrobium cellulans).

[00016] Este documento também apresenta um método para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero, a glicoproteína inclui uma ou mais ligações ou porções manose-1-fosfo- 6-manose. O método inclui o contato da célula com a glicoproteína após (a) a retirada do cap (uncapping) das uma ou mais ligações ou porções manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato na glicoproteína, em que, após a retirada do cap (uncapping), a glicoproteína não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato na célula e, após a etapa (a), (b) a desmanosilação dos N-glicanos fosforilados na glicoproteína, em que, após tanto a retirada do cap (uncapping), quanto a desmanosilação, a glicoproteína não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato na célula. As etapas (a) e (b) podem ser catalisadas por duas enzimas diferentes (por exemplo, uma manosidase de Cellulosimicrobium cellulans como CcMan5 e uma manosidase de Canavalia ensiformis) ou por uma única enzima.

[00017] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero. O método inclui o fornecimento de uma glicoproteína com N- glicanos fosforilados ausentes de cap (uncapped) e desmanosilados, e o contato da célula de mamífero com a glicoproteína.

[00018] Nos métodos aqui descritos, a glicoproteína pode ser uma proteína humana.

[00019] Nos métodos aqui descritos, a glicoproteína pode ser uma proteína patogênica, uma proteína lisossomal, um fator de crescimento, uma citocina, uma quimiocina, um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, ou uma proteína de fusão. A proteína lisossomal pode ser uma enzima lisossomal (por exemplo, alfa glucosidase ácida ou alfa galactosidase). A glicoproteína pode estar associada a um LSD (por exemplo, doença de Fabry, mucopolissacaridose I, doença de Farber, doença de Gaucher, GM1-gangliosidose, doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff, doença do ativador de GM2, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença de Niemann-Pick, doença de Scheie, doença de Hunter, doença de Sanfilippo, doença de Morquio, doença de Maroteaux-Lamy, deficiência de hialuronidase, aspartilglucosaminúria, fucosidose, manosidose, doença de Schindler, sialidose tipo 1, doença de Pompe, picnodisostose, lipofuscinose ceroide, doença do armazenamento do éster de colesterol, doença de Wolman, deficiência de sulfatase múltipla, galactossialidose, mucolipidose, cistinose, distúrbio de armazenamento do ácido siálico, doença da retenção de quilomícron com síndrome de Marinesco- Sjogren, síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome de Chediak- Higashi, doença de Danon, ou displasia geleofísica).

[00020] O documento também apresenta uma glicoproteína capaz de ser transportada para o interior de uma célula de mamífero, em que a glicoproteína foi tratada com qualquer um dos métodos aqui descritos, assim como uma célula de mamífero (por exemplo, célula humana) que inclua essa glicoproteína. Em outro aspecto, este documento apresenta um método de tratamento que inclui a administração dessa glicoproteína a um sujeito necessitado.

[00021] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais exemplificativos são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, n° de Acesso do Genbank® e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua inteireza. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo definições, prevalecerá. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

[00022] Outras características e vantagens da invenção ficarão claras com a seguinte descrição detalhada e com as reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00023] A FIG. 1A é uma representação da sequência de nucleotídeos otimizada para códon da alfa glucosidase humana (GAA) com a pré-sequência lip2 em negrito (SEQ ID NO:1). A FIG. 1B é uma representação da sequência de aminoácidos de GAA humana com a pré-sequência lip2 em negrito, em que o * representa o códon de parada (SEQ ID NO:2).

[00024] A FIG. 2 é um esquema de um vetor de expressão em Y. lipolytica usado para a clonagem de huGAA.

[00025] A FIG. 3A é uma representação da sequência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta (ORF) de AMS1 de Yarrowia lipolytica com uma etiqueta His C-terminal (SEQ ID NO:3). A FIG. 3B é uma representação da sequência de nucleotídeos do ORF de AMS1 de Yarrowia lipolytica com uma etiqueta His N-terminal (SEQ ID NO:4). A FIG. 3C é uma representação da sequência de aminoácidos do polipeptídio AMS1 de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO:5).

[00026] A FIG. 4 é um esquema dos produtos de hidrólise final em potencial de açúcares marcados com ácido 8-amino-1,3,6- pirenotrissulfônico (APTS) derivados de uma cepa de Yarrowia lipolytica que superexpressa MNN4, que contém os açúcres Man8GlcNAc2 (M8), ManP-Man8GlcNAc2 monofosforilado (MP-M8) e/ou (ManP)2- Man8GlcNAc2 ((MP) 2-M8) difosforilado (chamados de açúcares MNN4 ou N-glicanos MNN4), considerando que as alfa-manosidases possam remover completamente resíduos manose dos N-glicanos MNN4.

[00027] A FIG. 5 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos de N-glicanos MNN4 tratados com alfa- manosidase de feijão-de-porco (Jb). A análise foi realizada usando-se eletroforese de carboidratos auxiliada por sequenciador de DNA e auxiliada por fluoróforo (DSA-FACE). "M1", "M2", "M3", "M4", "M5", "M6", "M8" e "M9" se referem ao número de resíduos manose conjugados à estrutura N-acetilglucosamina de base. O eixo Y representa as unidades de fluorescência relativa como uma indicação da quantidade de cada estrutura N-glicano. O eixo X representa a mobilidade relativa de cada estrutura N-glicano através de um capilar.

[00028] A FIG. 6 é uma série de eletroferogramas mostrando a atividade de desmanosilação e retirada de cap (uncapping) do fosfato usando AMS1 de Yarrowia lipolytica (YlAms1).

[00029] A FIG. 7 é uma série de eletroferogramas representando os perfis de N-glicano de huGAA antes e depois do tratamento com alfa- 1,2-manosidase de feijão-de-porco.

[00030] A FIG. 8A é uma representação da sequência de nucleotídeos do quadro de leitura aberta (ORF) de manosidase 5 de DsbA-Cellulosimicrobium cellulans (CcMan5) (SEQ ID NO:6). A FIG. 8B é uma representação da sequência de aminoácidos do polipeptídio CcMan5 com a sequência de sinal em negrito (SEQ ID NO: 7). A FIG. 8C é uma representação da sequência de aminoácidos do polipeptídio CcMan5 sem a sequência de sinal (SEQ ID NO:8). O peso molecular previsto do polipeptídio CcMan5 sem a sequência de sinal é de 173 kDa.

[00031] A FIG. 9A é uma representação da sequência de nucleotídeos do ORF de manosidase 4 de DsbA-C. cellulans (CcMan4) (SEQ ID NO: 9). A FIG. 9B é uma representação da sequência de aminoácidos do polipeptídio CcMan4 com a sequência de sinal em negrito (SEQ ID NO: 10). O peso molecular previsto do polipeptídio CcMan4 sem a sequência de sinal é de 184 kDa.

[00032] A FIG. 10 é um esquema dos plasmídios pLSAHCcMan5 e pLSAHCcMan4.

[00033] A FIG. 11 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos da alfa glucosidase humana (GAA) tratada com CcMan4 e/ou CcMan5.

[00034] A FIG. 12 é uma representação esquemática do N-glicanos operculados (capped), em que P se refere a fosfato, um quadrado preenchido se refere a uma porção GlcNac, um círculo aberto se refere a uma manose ligada em beta, e um círculo preenchido se refere a uma manose ligada em alfa.

[00035] A FIG. 13 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos de Myozyme® tratada com CcMan4.

[00036] A FIG. 14 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos da alfa glucosidase humana (GAA) tratada com CcMan4 e/ou CcMan5.

[00037] A FIG. 15 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos de GAA humana tratada com JbMan.

[00038] A FIG. 16 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos de GAA humana tratada com JbMan.

[00039] A FIG. 17 é um gráfico linear da atividade intracelular de GAA (U/mg) de Myozyme® (diamantes) ou GAA humana tratada com CcMan5 (quadrados), CcMan4 (triângulos), CcMan4 e CcMan5 (x), ou JbMan ( ) à concentração indicada de enzima (U/mL). Cada ponto de dado representa a média de duplicatas por dose ± o desvio padrão. Pontos de dados marcados com um asterisco são resultados de uma única condição de estimulação por dose.

[00040] A FIG. 18 é um gráfico linear da atividade intracelular de GAA (U/mg) de Myozyme® (diamantes), Myozyme® mais M6P (quadrados), Myozyme® tratada com CcMan4 (triângulos), Myozyme® tratada com CcMan4, mais M6P (x), GAA humana tratada com CcMan4 e CcMan5 ( ), GAA humana tratada com CcMan4 e CcMan5, plus M6P (circles), GAA humana tratada com JbMan (l), ou GAA humana tratada com JbMan, mais M6P ( ) à concentração indicada de enzima (U/mL). Cada ponto de dado representa a média de duplicatas por dose ± o desvio padrão. Pontos de dados marcados com um asterisco são resultados de uma única condição de estimulação por dose.

[00041] A FIG. 19 é um gráfico de barras da atividade intracelular de GAA (U/mg) em fibroblastos Pompe incubados com Myozyme, JbMan ou a combinação de CcMan4 e CcMan5 durante 14 horas ou 46 horas. Apresenta-se a média de duplicatas ± o desvio padrão.

[00042] A FIG. 20 é uma série de eletroferogramas representando a análise de N-glicanos de GAA humana tratada com CcMan5 e JbMan.

[00043] A FIG. 21 é um gráfico linear da atividade intracelular de huGAA purificada, ausente de cap (uncapped) e desmanosilada versus a atividade intracelular de Myozyme® após estimulação extracelular das células com a huGAA e Myozyme, respectivamente. A quantidade de enzima (expressa como unidades de atividade de enzima) adicionada às células foi convertida em concentração de enzima (expressa como nM) e traçada versus a atividade específica (expressa em U/mg) para os cálculos da Kuptake. Kuptake, e o desvio padrão foi calculado em GraphPrism usando regressão não linear através de 14 pontos de dados (2 pontos de dados por concentração) para huGAA e através de 12 pontos de dados para Myozyme®.

[00044] A FIG. 22 é uma representação da sequência de aminoácidos de uma manosidase de Aspergillus saitoi (SEQ ID NO: 11).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00045] Em geral, este documento apresenta métodos e materiais para hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em fosfo-6-manose (também chamada de "manose-6-fosfato" aqui) ("retirar o cap", "uncapping") e hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal desse glicano contendo fosfato ("desmanosilar"). Também se apresentam métodos para facilitar a captação de uma glicoproteína por uma célula de mamífero, pois tanto retirada de cap (uncapping), quanto desmanosilação (por enzimas separadas ou por uma única enzima) são requeridas para se conseguir a captação celular por mamíferos de glicoproteínas. Os métodos e materiais aqui descritos são particularmente úteis para produzir agentes para tratamento de pacientes com distúrbios de armazenamento lisossomal (LSDs), um grupo diverso de distúrbios metabólicos hereditários caracterizados pelo acúmulo de produtos de armazenamento nos lisossomos devido a uma atividade prejudicada de enzimas catabólicas envolvidas em sua degradação. O acúmulo de produtos de armazenamento leva a disfunção celular e manifestações clínicas progressivas. Deficiências em enzimas catabólicas podem ser corrigidas por terapia de reposição de enzima (ERT), contanto que a enzima administrada possa ser direcionada para os lisossomos das células doentes. Enzimas lisossomais são tipicamente glicoproteínas que são sintetizadas no retículo endoplasmático (ER), transportadas mediante a via secretória para o Golgi e, então, recrutadas pelos lisossomos. Usando os métodos e materiais aqui descritos, um processo de produção de base microbiana pode ser usado para se obterem proteínas terapêuticas com N-glicanos fosforilados desmanosilados. Assim, os métodos e materiais aqui descritos são úteis para preparar glicoproteínas para o tratamento de distúrbios metabólicos como LSDs.

Manosidases

[00046] Este documento apresenta ácidos nucleicos isolados que codificam manosidases que podem (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em fosfo-6-manose e/ou (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal desse glicano contendo fosfato. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são aqui usados de maneira intercambiável e se referem tanto a RNA, quanto a DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, DNA sintético e DNA (ou RNA) contendo análogos de ácidos nucleicos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional. Um ácido nucleico pode ser de fita dupla ou de fita simples (isto é, uma fita de sentido ou uma fita antissentido). Exemplos não limitativos de polinucleotídeos incluem genes, fragmentos de genes, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossomal, siRNA, micro-RNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídios, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e primers, assim como análogos de ácidos nucleicos.

[00047] "Polipeptídio" e "proteína" são aqui usados de maneira intercambiável e significam qualquer cadeia de aminoácidos ligada por peptídios, independentemente do comprimento ou modificação pós- tradução. Tipicamente, um polipeptídio aqui descrito (por exemplo, uma manosidase ou uma proteína-alvo ausente de cap (uncapped) e desmanosilada) é isolado quando constitui pelo menos 60%, em peso, da proteína total em uma preparação, por exemplo, 60% da proteína total em uma amostra. Em algumas modalidades, um polipeptídio aqui descrito consiste em pelo menos 75%, pelo menos 90% ou pelo menos 99%, em peso, da proteína total em uma preparação.

[00048] Um "ácido nucleico isolado" se refere a um ácido nucleico que é separado de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes em um genoma de ocorrência natural, incluindo ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam um ou ambos os lados do ácido nucleico em um genoma de ocorrência natural (por exemplo, um genoma de levedura). O termo "isolado", conforme aqui usado com relação a ácidos nucleicos, também inclui qualquer sequência de ácido nucleico de ocorrência não natural, pois essas sequências de ocorrência não natural não são encontradas na natureza e não têm sequências imediatamente contíguas em um genoma de ocorrência natural.

[00049] Um ácido nucleico isolado pode ser, por exemplo, uma molécula de DNA, contanto que uma das sequências de ácido nucleico normalmente encontradas flanqueando imediatamente essa molécula de DNA em um genoma de ocorrência natural esteja removido ou ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, uma molécula de DNA que exista como uma molécula separada (por exemplo, um ácido nucleico quimicamente sintetizado, ou um cDNA ou fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras sequências, assim como DNA que é incorporado em um vetor, um plasmídio de replicação autônoma, um vírus (por exemplo, qualquer paramixovírus, retrovírus, lentivírus, adenovírus ou vírus da herpes), ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. Além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir um ácido nucleico manipulado, como uma molécula de DNA que seja parte de um ácido nucleico híbrido ou de fusão. Um ácido nucleico que exista entre centenas a milhões de outros ácidos nucleicos dentro, por exemplo, de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas, ou fatias de gel contendo um produto de digestão de DNA genômico, não é considerado um ácido nucleico isolado.

[00050] O termo "exógeno", conforme aqui usado com referência a ácido nucleico e a uma célula hospedeira particular, refere-se a qualquer ácido nucleico que não ocorra em (e não possa ser obtido em) essa célula particular conforme encontrada na natureza. Assim, um ácido nucleico de ocorrência não natural é considerado como sendo exógeno a uma célula hospedeira uma vez introduzido na célula hospedeira. É importante notar que ácidos nucleicos de ocorrência não natural podem conter subsequências de ácido nucleico ou fragmentos de sequências de ácido nucleico que são encontrados na natureza, contanto que o ácido nucleico como um todo não exista na natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA genômico dentro de um vetor de expressão é ácido nucleico de ocorrência não natural e, portanto, é exógena a uma célula hospedeira uma vez introduzida na célula hospedeira, pois essa molécula de ácido nucleico como um todo (DNA genômico mais DNA do vetor) não existe na natureza. Assim, qualquer vetor, plasmídio de replicação autônoma ou vírus (por exemplo, retrovírus, adenovírus ou vírus da herpes) que, como um todo, não exista na natureza é considerado como sendo ácido nucleico de ocorrência não natural. Segue-se que fragmentos de DNA genômico produzidos por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição, assim como cDNAs são considerados como sendo ácido nucleico de ocorrência não natural, pois existem como moléculas separadas não encontradas na natureza. Também se segue que qualquer ácido nucleico contendo uma sequência promotora e uma sequência codificadora de polipeptídio (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) em um arranjo não encontrado na natureza é ácido nucleico de ocorrência não natural. Um ácido nucleico que seja de ocorrência natural pode ser exógeno a uma célula particular. Por exemplo, um cromossomo inteiro isolado de uma célula de levedura x é um ácido nucleico exógeno com relação a uma célula de levedura y, uma vez que esse cromossomo seja introduzido em uma célula de levedura y.

[00051] Um ácido nucleico que codifique uma manosidase pode ter pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:9. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos aqui descritos podem codificar polipeptídios de manosidase que tenham pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100 por cento) de identidade com uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10 ou 11. Por exemplo, um ácido nucleico pode codificar uma manosidase com pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 95 ou 98%) de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, 11 ou uma parte delas. Por exemplo, um ácido nucleico pode codificar uma manosidase com pelo menos 90% de identidade com os resíduos de aminoácidos 1 a 774 da SEQ ID NO:8. A porcentagem de identidade entre uma sequência de aminoácidos particular e a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11 pode ser determinada da seguinte maneira. Em primeiro lugar, as sequências de aminoácidos são alinhadas usando o programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) da versão independente de BLASTZ contendo BLASTP versão 2.0.14. Essa versão independente de BLASTZ pode ser obtida na página da internet da Fish & Richardson’s (por exemplo, www.fr.com/blast/) ou na página da internet do Centro Nacional Para Informações de Biotecnologia do governo norte-americano (www.ncbi.nlm.nih.gov). Instruções explicando como usar o programa Bl2seq podem ser encontradas no arquivo apenas de leitura que acompanha BLASTZ. Bl2seq efetua uma comparação entre duas sequências de aminoácidos usando o algoritmo BLASTP. Para comparar duas sequências de aminoácidos, as opções de Bl2seq são ajustadas da seguinte maneira: -i é estabelecido como um arquivo contendo a primeira sequência de aminoácidos a ser comparada (por exemplo, C:\seq1.txt); -j é estabelecido como um arquivo contendo a segunda sequência de aminoácidos a ser comparada (por exemplo, C:\seq2.txt); -p é estabelecido como blastp; -o é estabelecido como qualquer nome de arquivo desejado (por exemplo, C:\output.txt); e todas as outras opções são deixadas em seu valor padrão. Por exemplo, pode-se usar o seguinte comando para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre duas sequências de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Se as duas sequências comparadas compartilharem homologia, então, o arquivo de saída designado apresentará aquelas regiões de homologia como sequências alinhadas. Se as duas sequências comparadas não compartilharem homologia, então, o arquivo de saída designado não apresentará sequências alinhadas. Procedimentos similares podem ser seguidos para sequências de ácido nucleico, exceto que se usa blastn.

[00052] Uma vez alinhadas, o número de correspondências é determinado por contagem do número de posições em que um resíduo de aminoácido idêntico é apresentado em ambas as sequências. A porcentagem de identidade é determinada dividindo-se o número de correspondências pelo comprimento da sequência de aminoácidos do polipeptídio de manosidase de comprimento total, seguido por multiplicação do valor resultante por 100.

[00053] Deve-se notar que o valor de porcentagem de identidade é arredondado para a decimal mais próxima. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 são arredondados para 78,1, ao passo que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 são arredondados para 78,2. Também se deve notar que o valor do comprimento será sempre um inteiro.

[00054] Percebe-se que inúmeros ácidos nucleicos podem codificar um polipeptídio com uma sequência de aminoácidos particular. A degeneração do código genético é bem conhecida na técnica; isto é, para muitos aminoácidos, há mais de um tripleto de nucleotídeos que serve como o códon para o aminoácido. Por exemplo, códons na sequência codificadora para um dado polipeptídio de manosidase podem ser modificados de modo que se obtenha uma expressão ótima em uma espécie particular (por exemplo, bactéria ou fungo), usando tabelas de viés de códon apropriadas para essa espécie.

[00055] A hibridização também pode ser usada para avaliar a homologia entre duas sequências de ácido nucleico. Uma sequência de ácido nucleico aqui descrita, ou seu fragmento ou variante, pode ser usada como uma sonda de hibridização de acordo com técnicas de hibridização padronizadas. A hibridização de uma sonda de interesse (por exemplo, uma sonda contendo uma parte de uma sequência de nucleotídeos de AMS1 de Yarrowia lipolytica) a DNA ou RNA de uma fonte de teste é uma indicação da presença de DNA ou RNA (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de AMS1) correspondente à sonda na fonte de teste. As condições de hibridização são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Condições moderadas de hibridização são definidas como equivalentes à hibridização em 2X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a 30°C, seguido por uma lavagem em 1 X SSC, 0,1% de SDS a 50°C. Condições altamente rigorosas são definidas como equivalentes à hibridização em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a 45°C, seguido por uma lavagem em 0,2 X SSC, 0,1% de SDS a 65°C.

[00056] Outros candidatos a polipeptídio de manosidase adequados para uso aqui podem ser identificados por anállise de alinhamentos de sequências de nucleotídeos e polipeptídios. Por exemplo, a realização de uma busca em uma base de dados de sequências de nucleotídeos ou polipeptídios pode identificar homólogos e/ou ortólogos de polipeptídios de manosidase. A análise de sequência pode envolver BLAST, BLAST Recíproco ou análise PSI-BLAST de bases de dados não redundantes usando sequências de aminoácidos de manosidase conhecidas. Os polipeptídios na base de dados que tenham mais de 40% de identidade de sequência podem ser identificados como candidatos para avaliação adicional quanto à adequação como um polipeptídio de manosidase. A similaridade de sequência de aminoácidos permite substituições de aminoácidos conservadoras, como a substituição de um resíduo hidrofóbico por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro. Caso desejado, pode-se realizar a inspeção manual desses candidatos para estreitar o número de candidatos a serem adicionalmente avaliados.

[00057] Este documento também apresenta (i) variantes biologicamente ativas e (ii) fragmentos biologicamente ativos ou suas variantes biologicamente ativas, das manosidases aqui descritas. Variantes biologicamente ativas de manosidases podem conter adições, deleções ou substituições com relação às sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10 e 11. Proteínas com substituições em geral não têm mais que 50 (por exemplo, mais mais que uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50) substituições de aminoácidos conservadoras. Uma substituição conservadora é a substituição de um aminoácido por outro com características similares. Substituições conservadoras incluem substituições dentro dos seguintes grupos: valina, alanina e glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina, cisteína e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. Os aminoácidos hidrofóbicos não polares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer substituição de um membro dos grupos polares, básicos ou ácidos acima mencionados por outro membro do mesmo grupo pode ser considerada uma substituição conservadora. Em contraste, uma substituição não conservadora é uma substituição de um aminoácido por outro com características dissimilares.

[00058] Variantes de deleção podem estar desprovidas de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 segmentos de aminoácidos (de dois ou mais aminoácidos) ou aminoácidos únicos não contíguos.

[00059] Adições (variantes de adição) incluem proteínas de fusão contendo: (aum) a manosidase apresentada nas SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 10, 11 ou seu fragmento; e (b) sequências de aminoácidos irrelevantes ou heterólogas internas ou terminais (C ou N). No contexto dessas proteínas de fusão, o termo "sequências de aminoácidos heterólogas" se refere a uma sequência de aminoácidos diferente de (a). Uma sequência heteróloga pode ser, por exemplo, uma sequência usada para purificação da proteína recombinante (por exemplo, FLAG, poliistidina (por exemplo, hexaistidina), hemaglutanina (HA), glutationa- S-transferase (GST) ou proteína de ligação a maltose (MBP)). Sequências heterólogas também podem ser proteínas utilizáveis como marcadores diagnósticos ou detectáveis, por exemplo, luciferase, proteína fluorescente verde (GFP) ou cloranfenicol acetil transferase (CAT). Em algumas modalidades, a proteína de fusão contém uma sequência de sinal de outra proteína. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de levedura), a expressão e/ou secreção da proteína-alvo pode ser aumentada mediante uso de uma sequência de sinal heteróloga. Em algumas modalidades, a proteína de fusão pode conter um veículo (por exemplo, KLH) utilizável, por exemplo, para provocar uma resposta imune para geração de anticorpo, ou sinais de retenção no retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi. Sequências heterólogas podem ser de comprimentos variáveis e, em alguns casos, podem ser sequências mais longas que as proteínas-alvo de comprimento total às quais as sequências heterólogas estão fixadas.

[00060] Fragmentos biologicamente ativos ou variantes biologicamente ativas das manosidases têm pelo menos 40% (por exemplo, pelo menos: 50%; 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99%; 99,5% ou 100% ou mesmo mais) da atividade de manosidase (por exemplo, retirada de cap (uncapping) e/ou desmanosilação) da proteína madura de comprimento total de tipo selvagem. Por exemplo, um fragmento biologicamente ativo de uma manosidase que pode hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo- 6-manose em fosfo-6-manose pode conter os resíduos 1 a 774 da SEQ ID NO:8.

[00061] As manosidases aqui descritas podem ser usadas para produzir moléculas-alvo ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas. Os métodos podem ser realizados in vitro ou in vivo.

Métodos de Desmanosilação ou Retirada de cap (Uncapping) e Desmanosilação de Glicoproteínas

[00062] Conforme aqui descrito, glicoproteínas contendo um N- glicano fosforilado podem ser desmanosiladas, e glicoproteínas contendo um N-glicano fosforilado contendo uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose podem ser ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas por contato da glicoproteína com uma manosidase capaz de (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal. Exemplos não limitativos dessas manosidases incluem uma manosidase de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) e uma manosidase de Yarrowia lipolytica (por exemplo, AMS1). Tanto a manosidase de feijão-de-porco, quanto a AMS1 são glicosídio hidrolases da família 38.

[00063] A manosidase de feijão-de-porco é comercialmente disponível, por exemplo, na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) como uma suspensão em sulfato de amônio (Catálogo n° M7257) e uma preparação de qualidade proteômica (Catálogo n° M5573). Conforme descrito no Exemplo 8, essas preparações comerciais podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia de filtração em gel para remover contaminantes como fosfatases. A manosidase de feijão-de-porco contém um segmento com a seguinte sequência de aminoácidos NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG (SEQ ID NO:12). Veja Howard et al., J. Biol. Chem., 273(4):2067-2072, 1998.

[00064] A manosidase AMS1 de Yarrowia lipolytica pode ser produzida de maneira recombinante. As sequências de ácido nucleico que codificam AMS1 com uma etiqueta poliistidina C- ou N-terminal são apresentadas nas SEQ ID NOs. 3 e 4, respectivamente (veja também as FIGs. 3A e 3B). A sequência de aminoácidos do polipeptídio AMS1 é apresentada na SEQ ID NO:5 (veja também a FIG. 3C). Moléculas de ácido nucleico isolado que codificam polipeptídios de manosidase podem ser produzidas por técnicas padronizadas. Por exemplo, técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) podem ser usadas para se obter um ácido nucleico isolado contendo a sequência de nucleotídeos aqui descrita. PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas a partir de DNA, assim como de RNA, incluindo sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Genericamente, a informação de sequência das extremidades da região de interesse ou além é empregada para projetar primers oligonucleotídicos que sejam de sequência idêntica ou similar a fitas opostas do molde a ser amplificado. Também há várias estratégias de PCR disponíveis pelas quais modificações de sequência de nucleotídeos específicas para sítios podem ser introduzidas em um ácido nucleico de molde. Ácidos nucleicos isolados também podem ser quimicamente sintetizados, como uma única molécula de ácido nucleico (por exemplo, usando síntese automatizada de DNA na direção 3’ para 5’ usando tecnologia de fosforamidita) ou como uma série de oligonucleotídeos. Por exemplo, pode-se sintetizar um ou mais pares de oligonucleotídeos longos (por exemplo, >100 nucleotídeos) que contenham a sequência desejada, com cada par contendo um segmento curto de complementariedade (por exemplo, cerca de 15 nucleotídeos), de modo que se forme um dúplex quando o par de oligonucleotídeos é anelado. Usa-se DNA polimerase para estender os oligonucleotídeos, resultando em uma única molécula de ácido nucleico de fita dupla por par de oligonucleotídeos, que, então, pode ser ligada em um vetor. Ácidos nucleicos isolados também podem ser obtidos por mutagênese de, por exemplo, um DNA de ocorrência natural.

[00065] Para produzir de maneira recombinante um polipeptídio de manosidase, usa-se um vetor que contém um promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídio de manosidase. Conforme aqui usado, um "promotor" se refere a uma sequência de DNA que permite que um gene seja transcrito. O promotor é reconhecido por RNA polimerase, que, então, inicia a transcrição. Assim, um promotor contém uma sequência de DNA que está ligada diretamente à ou está envolvida no recrutamento da RNA polimerase. Uma sequência promotora também pode incuir "regiões intensificadoras", que são uma ou mais regiões de DNA que podem estar ligadas com proteínas (a saber, os fatores de ação trans, muito como um conjunto de fatores de transcrição) para intensificar os níveis de transcrição de genes (daí o nome) em um agrupamento de genes. O intensificador, embora tipicamente na extremidade 5’ de uma região codificadora, também pode estar separado de uma sequência promotora e pode estar, por exemplo, dentro de uma região intrônica de um gene ou em 3’ com relação à região codificadora do gene.

[00066] Conforme aqui usado, "operacionalmente ligado" significa incorporado em um construto genético (por exemplo, vetor), de modo que sequências de controle da expressão controle efetivamente a expressão de uma sequência codificadora de interesse.

[00067] Vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras (por exemplo, por transformação ou transfecção) para expressão do polipeptídio codificado, que, então, pode ser purificado. Sistemas de expressão que podem ser usados para produção em pequena ou grande escala de polipeptídios de manosidase incluem, sem limitação, microorganismos como bactérias (por exemplo, E. coli) transformados com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmídico ou DNA cosmídico contendo as moléculas de ácido nucleico, e fungos (por exemplo, S. cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, ou Aspergillus) transformados com vetores de expressão fúngica recombinantes contendo as moléculas de ácido nucleico. Sistemas de expressão utilizáveis também incluem sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo as moléculas de ácido nucleico, e sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco) ou transformados com vetores de expressão de plasmídio recombinante (por exemplo, plasmídio Ti) contendo as moléculas de ácido nucleico. Polipeptídios de manosidase também podem ser produzidos usando-se sistemas de expressão em mamíferos, que incluem células (por exemplo, linhagens celulares imortalizadas como células COS, células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células 293 embrionárias de rim humanas e células 3T3 L1) portadoras de construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, o promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenovírus e o promotor de citomegalovírus).

[00068] Tipicamente, polipeptídios de manosidase recombinantes são etiquetados com uma sequência de aminoácidos heteróloga como FLAG, poliistidina (por exemplo, hexaistidina), hemaglutinina (HA), glutationa-S-transferase (GST) ou proteína de ligação a maltose (MBP) para auxiliar na purificação da proteína. Outros métodos para a purificação de proteínas incluem técnicas cromatográficas como cromatografia de troca de íons, hidrofóbica e de fase reversa, de exclusão de tamanho, de afinidade, de indução de carga hidrofóbica e outras (veja, por exemplo, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, terceira edição, Springer-Verlag, New York (1993); Burton e Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81 (1998)).

[00069] Em algumas modalidades, as etapas de retirada de cap (uncapping) e desmanolisação são catalisadas por duas enzimas diferentes. Por exemplo, a retirada do cap (uncapping) de uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6 manose pode ser realizada usando-se uma manosidase de Cellulosimicrobium cellulans (por exemplo, CcMan5). A sequência de aminoácidos do polipeptídio CcMan5 contendo a sequência de sinal é apresentada na SEQ ID NO: 7. A sequência de aminoácidos do polipeptídio CcMan5 sem a sequência de sinal é apresentada na SEQ ID NO:8. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um CcMan5 polipeptídio é apresentada na SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, usa-se um fragmento biologicamente ativo do polipeptídio CcMan5. Por exemplo, um fragmento biologicamente ativo pode incluir os resíduos 1-774 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:8. Veja também WO 2011/039634. A manosidase CcMan5 é uma glicosídio hidrolase da família 92.

[00070] A desmanosilação de uma glicoproteína ausente de cap (uncapped) pode ser catalisada usando-se uma manosidase de Aspergillus satoi (As) (também conhecido como Aspergillus phoenicis) ou uma manosidase de Cellulosimicrobium cellulans (por exemplo, CcMan4). A manosidase de Aspergillus satoi é uma glicosídio hidrolase da família 4,7 e a manosidase CcMan4 é uma glicosídio hidrolase da família 92. A sequência de aminoácidos da manosidase de Aspergillus satoi é apresentada na SEQ ID NO:11 (veja a FIG. 22) e no GenBank n° de Acesso BAA08634. A sequência de aminoácidos do polipeptídio CcMan4 é apresentada na SEQ ID NO: 10. A sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:9 codifica o polipeptídio da SEQ ID NO:10.

[00071] A desmanosilação de uma glicoproteína ausente de cap (uncapped) também pode ser catalisada usando-se uma manosidase das glicosídio hidrolases da família 38 como uma manosidase de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) ou uma manosidase de Yarrowia lipolytica (por exemplo, AMS1). Por exemplo, CcMan5 pode ser usada para retirar o cap (uncap) uma porção manose-1-fosfo-6 manose em uma glicoproteína, e a manosidase de feijão-de-porco pode ser usada para desmanosilar a glicoproteína ausente de cap (uncapped).

[00072] Para produzir glicoproteínas desmanosiladas ou glicoproteínas ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas, uma molécula-alvo contendo uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6 manose é contactada sob condições adequadas com uma manosidase(s) adequada(s) e/ou um lisado celular contendo uma manosidase(s) produzida(s) de maneira recombinante adequada(s). Manosidases adequadas são descritas acima. O lisado celular pode ser de qualquer célula geneticamente manipulada, incluindo uma célula fúngica, uma célula vegetal ou célula animal. Exemplos não limitativos de células animais incluem de nematódeos, insetos, plantas, aves, répteis e mamíferos, como de um camundongo, rato, coelho, hamster, gerbo, cão, gato, cabra, porco, vaca, cavalo, baleia, macado ou ser humano.

[00073] Com o contato da molécula-alvo (por exemplo, uma glicoproteína) com as manosidases purificadas e/ou lisado celular, a ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose pode ser hidrolisada em fosfo-6-manose e a ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal desse glicano contendo fosfato pode ser hidrolisada para produzir uma molécula-alvo ausente de cap (uncapped) e desmanosilada. Em algumas modalidades, usa-se uma manosidase que catalisa ambas as etapas de retirada de cap (uncapping) e desmanolisação. Em algumas modalidades, usa-se uma manosidase que catalisa a etapa de retirada de cap (uncapping), e se usa uma manosidase diferente para catalisar a etapa de desmanosilação. Os métodos descritos no Exemplo 5 podem ser usados para determinar se a molécula-alvo foi ausente de cap (uncapped) e desmanosilada. Após o processamento pela manosidase, a molécula-alvo pode ser isolada.

[00074] Métodos adequados para a obtenção de lisados celulares que preservem a atividade ou integridade de uma atividade de manosidase no lisado podem incluir o uso de tampões e/ou inibidores apropriados, incluindo inibidores de nuclease, protease e fosfatase que preservem ou minimizem alterações nas atividades de N-glicosilação no lisado celular. Esses inibidores incluem, por exemplo, quelantes, como ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), ácido etileno glicol bis(éter P- aminoetílico) N,N,N1,N1-tetraacético (EGTA), inibidores de protease, como fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), aprotinina, leupeptina, antipaína e outros, e inibidores de fosfatase, como fosfato, fluoreto de sódio, vanadato e outros. Tampões e condições apropriados para a obtenção de lisados contendo atividades enzimáticas são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3a ed. Burtis e Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999).

[00075] Um lisado celular pode ser adicionalmente processado para eliminar ou minimizar a presença de substâncias interferentes, quando apropriado. Caso desejado, um lisado celular pode ser fracionado por vários métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo fracionamento subcelular, e técnicas cromatográficas como cromatografia de troca de íons, hidrofóbica e de fase reversa, de exclusão de tamanho, de afinidade, de indução de carga hidrofóbica e outras.

[00076] Em algumas modalidades, pode-se preparar um lisado celular em que organelas celulares inteiras permanecem intactas e/ou funcionais. Por exemplo, um lisado pode conter um ou mais de retículo endoplasmático rugoso intacto, retículo endoplasmático liso intacto ou aparelho de Golgi intacto. Métodos adequados para a preparação de lisados contendo organelas celulares intactas e teste da funcionalidade das organelas são descritos, por exemplo, em Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4329-4333; Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328; Rexach et al. (1991) J. Cell Biol. 114(2):219-229; e Paulik et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273.

[00077] Moléculas-alvo, conforme aqui usado, referem-se a (i) qualquer molécula contendo ligação ou porção manose-1-fosfo-6 manose terminal; (ii) qualquer molécula, quando expressada em uma célula de origem fúngica, que contenha uma ligação ou porção manose- 1-fosfo-6 manose; (iii) qualquer molécula contendo uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose, e/ou alfa-1,6 manose terminal de um glicano contendo fosfato; ou (iv) qualquer molécula, quando expressada em uma célula de origem fúngica, que contenha uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose, e/ou alfa-1,6 manose terminal de um glicano contendo fosfato. Em algumas modalidades, a proteína-alvo é uma glicoproteína humana. Proteínas- alvo adequadas podem incluir proteínas patogênicas como toxoide tetânico ou toxoide diftérico; proteínas de superfície viral como glicoproteínas B, H e gCIII do citomegalovírus (CMV), da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), glicoproteínas de invólucro do vírus do sarcoma Rous (RSV), glicoproteínas de invólucro do vírus da herpes simples (HSV), glicoproteínas de invólucro do vírus Epstein Barr (EBV), glicoproteínas de invólucro do vírus da varicela-zoster (VZV), glicoproteínas de invólucro do vírus do papiloma humano (HPV), glicoproteínas do vírus da influenza e antígeno de superfície da família da hepatite; proteínas lisossomais (por exemplo, alfa glucosidase ácida, alfa galatosidase, glucocerebrosidase, cerebrosidase ou galactocerebrosidase); insulina; glucagons; fatores de crescimento; citocinas; quimiocinas e anticorpos ou seus fragmentos. Fatores de crescimento incluem, por exemplo, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento do tipo insulina (IGF), proteína morfogênica óssea (BMP), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator de crescimento neuronal (NGF); uma neurotrofina, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO), miostatina (GDF-8), fator de diferenciação de crescimento-9 (GDF9), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ou FGF2), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Citocinas incluem, por exemplo, interleucinas como IL-1 a IL-33 (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13 ou IL-15). Quimiocinas incluem, por exemplo, I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1y, Eotaxin, MCP- 5, MCP-4, NCC-1, Ckβ10, HCC-1, Leucotactina-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC ou Eotaxina-2. Também estão incluídas glicoproteínas tumorais (por exemplo, antígenos associados a tumores), por exemplo, antígeno carcinoembrionário (CEA), mucinas humanas, HER-2/neu e antígeno específico prostático (PSA) [Henderson e Finn, Advances in Immunology, 62, pp. 217-56 (1996)].

[00078] Em algumas modalidades, a proteína-alvo pode ser uma associada a um distúrbio de armazenamento lisossomal, essas proteínas-alvo incluindo, por exemplo, alfa glucosidase ácida, alfa galactosidase, alfa-L-iduronidase, beta-D-galactosidase, betaglucosidase, beta-hexosaminidase, beta-D-manosidase, alfa-L- fucosidase, arilsulfatase B, arilsulfatase A, alfa-N- acetilgalactosaminidase, aspartilglucosaminidase, iduronato-2- sulfatase, alfa-glucosaminida-N-acetiltransferase, beta-D- glucoronidase, hialuronidase, alfa-L-manosidase, alfa-neuraminidase, fosfotransferase, lipase ácida, ceramidase ácida, esfingomielinase, tioesterase, catepsina K, e lipoproteína lipase.

[00079] Em algumas modalidades, as proteínas-alvo são proteínas de fusão em que a proteína-alvo está fusionada a outra sequência polipeptídica, ou a um polímero, um veículo, um adjuvante, uma imunotoxina ou a uma porção detectável (por exemplo, fluorescente, luminescente ou radioativa). Por exemplo, uma proteína-alvo pode estar unidade a um polímero como polietilenoglicol para aumentar o peso molecular de proteínas pequenas e/ou aumentar o tempo de permanência em circulação.

[00080] Com o contato de uma célula de mamífero com uma molécula-alvo contendo N-glicanos fosforilados ausentes de cap (uncapped) e desmanosilados, a molécula-alvo pode ser transportada para o interior de uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana). Uma glicoproteína com um N-glicano fosforilado ausente de cap (uncapped), mas não desmanosilado, não se liga substancialmente a receptores de manose-6-fosfato em células de mamíferos, e como tal, não é eficientemente transportado para o interior da célula. Conforme aqui usado, "não se liga substancialmente a" significa que menos de 15% (por exemplo, menos de 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0,5%, ou menos, ou 0%) das moléculas de glicoproteína se ligam a receptores de manose-6-fosfato em células de mamíferos. Entretanto, se essa glicoproteína for contactada com uma manosidase capaz de hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose terminal quando a manose subjacente é fosforilada, produz-se uma glicoproteína desmanosilada que se liga substancialmente ao receptor de manose-6- fosfato nas células de mamíferos e é eficientemente transportada para o interior da célula. Conforme aqui usado, "liga-se substancialmente a" significa que 15% ou mais (por exemplo, mais de 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%) das moléculas de glicoproteína se ligam a receptores de manose-6-fosfato em células de mamíferos. Deve-se entender que uma preparação (por exemplo, uma preparação de células hospedeiras recombinantes ou livre de células) contendo uma enzima que retira o cap (uncaps), mas não desmanosila N-glicanos fosforilados poderia ser contaminada com uma enzima que desmanosila N-glicanos fosforilados. Uma amostra de proteína-alvo após contato com essa preparação pode conter moléculas de proteína com alguns N-glicanos fosforilados que estão apenas ausentes de cap (uncapped) e outros que estão ausentes de cap (uncapped) e desmanosilados. Naturalmente, as moléculas de proteína contendo N-glicanos fosforilados ausentes de cap (uncapped) e desmanosilados podem se ligar substancialmente a receptores de manose-6-fosfato. A definição acima de "não se liga substancialmente a" não se aplica a essa amostra de proteína-alvo, pois os N-glicanos fosforilados nas moléculas de proteína não podem ser caracterizados como ausentes de cap (uncapped), mas não desmanosilados.

[00081] Conforme exposto nos Exemplos 9 e 12, moléculas-alvo que sejam ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas são mais eficientemente captadas por células de mamíferos do que moléculas- alvo contendo N-glicanos fosforilados ausentes de cap (uncapped). Por exemplo, uma molécula-alvo ausente de cap (uncapped) e desmanosilada pode ser captadas pelo menos 10 vezes (por exemplo, pelo menos 15, 20, 25 ou 30 vezes) mais eficientemente que uma glicoproteína ausente de cap (uncapped).

[00082] Assim, este documento apresenta métodos de conversão de uma glicoproteína de uma primeira forma que que não se liga a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero em uma segunda forma que se liga a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero. Na primeira forma, a glicoproteína compreende um ou mais N-glicanos contendo um ou mais resíduos manose que estão ligados na posição 1 a um resíduo manose que contém um resíduo fosfato na posição 6. Nesses métodos, a primeira forma da glicoproteína é contactada com uma manosidase que desmanosila os resíduos manose terminais para resultar na manose contendo o fosfato na posição 6 se tornando a manose terminal. Em algumas modalidades, a manosidase tem tanto atividade de retirada de cap (uncapping), quanto de desmanosilação (por exemplo, Canavalia ensiformis (feijão-de- porco) ou manosidase AMS1 de Yarrowia lipolytica). Em algumas modalidades, a manosidase não tem atividade de retirada de cap (uncapping) (por exemplo, uma manosidase de Aspergillus satoi ou uma manosidase de Cellulosimicrobium cellulans (por exemplo, CcMan4)).

[00083] O transporte de uma glicoproteína para o interior da célula pode ser avaliado usando-se um ensaio de captação celular, como o apresentado no Exemplo 9. Por exemplo, células de mamíferos e uma molécula-alvo contendo N-glicanos fosforilados ausentes de cap (uncapped) e desmanosilados podem ser incubadas, então, as células lavadas e lisadas. Lisados celulares podem ser avaliados quanto à presença da molécula-alvo (por exemplo, por Western blotting) ou por atividade da molécula-alvo no lisado celular. Por exemplo, quando a molécula-alvo é uma glucosidase como alfa glucosidase humana, a captação pode ser avaliada em fibroblastos deficientes em atividade alfa glucosidase ácida. A atividade intracelular da alfa glucosidase pode ser avaliada usando-se o ensaio de 4-metilumbeliferil-alfa-D- glucopiranosida (4-MUG). Veja o Exemplo 3. A clivagem do substrato 4- MUG por uma glucosidase leva à geração do produto fluorigênico 4-MU, que pode ser visualizado ou detectado por irradiação com luz UV.

Métodos In Vivo de Retirada de cap (Uncapping) e Desmanosilação de Glicoproteínas

[00084] As células geneticamente manipuladas aqui descritas podem ser usadas para produzir moléculas-alvo ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas. Por exemplo, um método à base de células pode incluir as etapas de introdução em uma célula fúngica geneticamente manipulada para incluir um ácido nucleico que codifique uma manosidase que seja capaz de hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em fosfo-6-manose de um ácido nucleico que codifique uma molécula-alvo, em que a células produz a molécula- alvo contendo N-glicanos fosforilados ausentes de cap (uncapped). Esses N-glicanos fosforilados podem ser desmanosilados conforme acima descrito. Outro método à base de células pode incluir as etapas de introdução em uma célula fúngica geneticamente manipulada para incluir um ácido nucleico que codifique a manosidase que seja capaz de (i) hidrolisar uma ligação ou porção manose-1-fosfo-6-manose em fosfo- 6-manose e (ii) hidrolisar uma ligação ou porção alfa-1,2 manose, alfa- 1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose terminal de um glicano contendo fosfato de um ácido nucleico que codifique uma molécula-alvo, em que a célula produz moléculas-alvo ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam a manosidase e a molécula-alvo contêm uma sequência de secreção em que a manosidase e a molécula-alvo são co-secretadas.

[00085] As células geneticamente manipuladas aqui descritas contêm um ácido nucleico que codifica uma manosidase. Células adequadas para produção in vivo de moléculas-alvo podem ser de origem fúngica, incluindo Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, levedura metilotrófica (como uma levedura metilotrófica do gênero Candida, Hansenula, Oogataea, Pichia ou Torulopsis) ou fungos filamentosos do gênero Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium ou Chrysosporium. Espécies de fungos exemplificativas incluem, sem limitação, Pichia anomala, Pichia bovis, Pichia canadensis, Pichia carsonii, Pichia farinose, Pichia fermentans, Pichia fluxuum, Pichia membranaefaciens, Pichia membranaefaciens, Candida valida, Candida albicans, Candida ascalaphidarum, Candida amphixiae, Candida Antarctica, Candida atlantica, Candida atmosphaerica, Candida blattae, Candida carpophila, Candida cerambycidarum, Candida chauliodes, Candida corydalis, Candida dosseyi, Candida dubliniensis, Candida ergatensis, Candida fructus, Candida glabrata, Candida fermentati, Candida guilliermondii, Candida haemulonii, Candida insectamens, Candida insectorum, Candida intermedia, Candida jeffresii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida lyxosophila, Candida maltosa, Candida membranifaciens, Candida milleri, Candida oleophila, Candida oregonensis, Candida parapsilosis, Candida quercitrusa, Candida shehatea, Candida temnochilae, Candida tenuis, Candida tropicalis, Candida tsuchiyae, Candida sinolaborantium, Candida sojae, Candida viswanathii, Candida utilis, Oogataea minuta, Pichia membranaefaciens, Pichia silvestris, Pichia membranaefaciens, Pichia chodati, Pichia membranaefaciens, Pichia menbranaefaciens, Pichia minuscule, Pichia pastoris, Pichia pseudopolymorpha, Pichia quercuum, Pichia robertsii, Pichia saitoi, Pichia silvestrisi, Pichia strasburgensis, Pichia terricola, Pichia vanriji, Pseudozyma Antarctica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces momdshuricus, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces exiguous, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces mellis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces willianus, Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycopsis capsularis, Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomycopsis fibuligera, Endomyces hordei, Endomycopsis fobuligera. Saturnispora saitoi, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces dairensis, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora fermentati, Saccharomyces fermentati, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora rosei, Saccharomyces rosei,Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces rosei, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces delbrueckii, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces delbrueckii, Zygosaccharomyces mongolicus, Dorulaspora globosa, Debaryomyces globosus, Torulopsis globosa, Trichosporon cutaneum, Trigonopsis variabilis, Williopsis californica, Williopsis saturnus, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces bisporus, Debaryomyces disporua. Saccharomyces bisporas, Zygosaccharomyces bisporus, Saccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces mellis, Zygosaccharomyces priorianus, Zygosaccharomyces rouxiim, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces barkeri, Saccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces major, Saccharomyces rousii, Pichia anomala, Pichia bovis, Pichia Canadensis, Pichia carsonii, Pichia farinose, Pichia fermentans, Pichia fluxuum, Pichia membranaefaciens, Pichia pseudopolymorpha, Pichia quercuum, Pichia robertsii, Pseudozyma Antarctica, Rhodosporidium toruloides, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces fragilis, Saccharomycodes ludwigii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora globosa, Trigonopsis variabilis, Williopsis californica, Williopsis saturnus, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces mellis ou Zygosaccharomyces rouxii. Fungos filamentosos exemplificativos incluem várias espécies de Aspergillus incluindo, mas não limitados a, Aspergillus caesiellus, Aspergillus candidus, Aspergillus carneus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus penicilloides, Aspergillus restrictus, Aspergillus sojae, Aspergillus sydowi, Aspergillus tamari, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus ou Aspergillus versicolor. Essas células, antes da manipulação genética conforme aqui especificada, podem ser obtidas de várias fontes comerciais e instalações de recursos de pesquisas como, por exemplo, a Coleção Americana de Cultura de Tipo (Rockville, MD). Moléculas-alvo incluem proteínas como qualquer uma das proteínas-alvo aqui descritas (veja acima).

[00086] A manipulação genética de uma célula pode incluir, além de um ácido nucleico exógeno que codifica uma manosidase, uma ou mais modificações genéticas como: (i) deleção de um gene endógeno que codifica uma proteína de alongamento de Cadeia Externa (OCH1); (ii) introdução de um ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila (por exemplo, um polipeptídio MNN4 de Yarrowia lipolytica, S. cerevisiae, Ogataea minuta, Pichia pastoris ou C. albicans, ou um polipeptídio PNO1 de P. pastoris) para aumentar a fosforilação de resíduos manose; (iii) introdução ou expressão de uma molécula de RNA que interfere com a expressão funcional de uma proteína OCH1; (iv) introdução de um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína de tipo selvagem (por exemplo, endógena ou exógena) com uma atividade de N-glicosilação (isto é, expressão de uma proteína com uma atividade de N- glicosilação); (v) introdução de um ácido nucleico recombinante que codifica uma molécula-alvo acima descrita; ou (v) alteração dos elementos promotores ou intensificadores de um ou mais genes endógenos que codificam proteínas com atividade de N-glicosilação para, dessa forma, alterar a expressão de suas proteínas codificadas. Moléculas de RNA incluem, por exemplo, RNA interferente pequeno (siRNA), RNA em grampo de cabelo curto (shRNA), RNA antissentido, ou micro RNA (miRNA). A manipualção genética também inclui a alteração de um gene endógeno que codifica a proteína com uma atividade de N-glicosilação para produzir uma proteína com adições (por exemplo, uma sequência heteróloga), deleções ou substituições (por exemplo, mutações como mutações pontuais; mutações conservadoras ou não conservadoras). As mutações podem ser especificamente introduzidas (por exemplo, por mutagênese direcionada a sítio ou recombinação homóloga) ou podem ser aleatoriamente introduzidas (por exemplo, as células podem ser quimicamente mutagenizadas conforme descrito, por exemplo, em Newman e Ferro-Novick (1987) J. Cell Biol. 105(4):1587.

[00087] As modificações genéticas aqui descritas podem resultar em um ou mais de (i) um aumento em uma ou mais atividades na célula geneticamente modificada, (ii) uma diminuição em uma ou mais atividades na célula geneticamente modificada, ou (iii) uma alteração na localização ou distribuição intracelular de uma ou mais atividades na célula geneticamente modificada. Deve-se entender que um aumento na quantidade de uma atividade particular (por exemplo, promoção da fosforilação de manosila) pode ser devido à superexpressão de uma ou mais proteínas capazes de promover a fosforilação de manosila, um aumento no número de cópias de um gene endógeno (por exemplo, duplicação do gene), ou alteração no promotor ou intensificador de um gene endógeno que estimula um aumento na expressão da proteína codificada pelo gene. Uma diminuição em uma ou mais atividades particulares pode ser devida à superexpressão de uma forma mutante (por exemplo, uma forma negativa dominante), introdução ou expressão de uma ou mais moléculas de RNA interferente que reduzam a expressão de uma ou mais proteínas com uma tividade particular, ou deleção de um ou mais genes endógenos que codifiquem uma proteína com a atividade particular.

[00088] Para romper um gene por recombinação homóloga, pode-se construir um vetor "de substituição de gene" de modo a incluir um gene marcador selecionável. O gene marcador selecionável pode estar operacionalmente ligado, tanto na extremidade 5', quanto na 3', a partes do gene de comprimento suficiente para mediar a recombinação homóloga. O marcador selecionável pode ser um de qualquer número de genes que complementem a auxotrofia da célula hospedeira ou confiram resistência a antibiótico, incluindo os genes URA3, LEU2 e HIS3. Outros marcadores selecionáveis adequados incluem o gene CAT, que confere resistência a cloranfenicol a células de levedura, ou o gene lacZ, que resulta em colônias azuis devido à expressão de β- galactosidase. Fragmentos de DNA linearizados do vetor de substituição de gene são, então, introduzidos nas células usando métodos bem conhecidos na técnica (veja abaixo). A integração dos fragmentos lineares no genoma e o rompimento do gene podem ser determinados com base no marcador de seleção e podem ser verificados, por exemplo, por análise de Southern blot. Um marcador selecionável pode ser removido do genoma da célula hospedeira, por exemplo, por sistemas Cre-loxP (veja abaixo).

[00089] Alternativamente, pode-se construir um vetor de substituição de gene para incluir uma parte do gene a ser rompido, essa parte sendo desprovida de qualquer sequência promotora de gene endógeno e codificando um fragmento inativo da sequência codificadora do gene. Um "fragmento inativo" é um fragmento do gene que codifica uma proteína com , por exemplo, menos de cerca de 10% (por exemplo, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2%, menos de cerca de 1%, ou 0%) da atividade da proteína produzida a partir da sequência codificadora de comprimento total do gene. Essa parte do gene é inserida em um vetor de modo que nenhuma sequência promotora conhecida esteja operacionalmente ligada à sequência de gene, mas que um códon de parada e uma sequência de término de transcrição estejam operacionalmente ligados à parte da sequência de gene. Esse vetor pode ser subsequentemente linearizado na parte da da sequência de gene e transformado em uma célula. Por meio de uma recombinação homóloga única, esse vetor linearizado é, então, integrado na contraparte endógena do gene.

[00090] Vetores de expressão podem ser autônomos ou integrativos. Um ácido nucleico recombinante (por exemplo, um que codifique uma manosidase) pode ser introduzido na célula na forma de um vetor de expressão como um plasmídio, fago, transposon, cosmídio ou partícula viral. O ácido nucleico recombinante pode ser mantido extracromossomicamente ou pode ser integrado no DNA cromossômico da célula de levedura. Vetores de expressão podem conter genes marcadores de seleção que codifiquem as proteínas requeridas para a viabilidade celular sob condições selecionadas (por exemplo, URA3, que codifica uma enzima necessária para a biossíntese de uracila, ou TRP1, que codifica uma enzima requerida para a biossíntese de triptofano) para permitir a detecção e/ou seleção das células transformadas com os ácidos nucleicos desejadas (veja, por exemplo, a patente norte-americana n° 4.704.362). Vetores de expressão também podem incluir uma sequência de replicação autônoma (ARS). Por exemplo, a patente norte-americana n° 4.837.148 descreve sequências de replicação autônoma que proporcionam um meio adequado para manter plasmídios em Pichia pastoris.

[00091] Vetores integrativos são apresentados, por exemplo, na patente norte-americana n° 4.882.279. Vetores integrativos em geral incluem uma sequência arranjada em série de pelo menos um primeiro fragmento de DNA inserível, um gene marcador selecionável e um segundo fragmento de DNA inserível. Os primeiro e segundo fragmentos de DNA inseríveis têm, cada um, cerca de 200 (por exemplo, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500 ou cerca de 1000 ou mais) nucleotídeos de comprimento e têm sequências de nucleotídios que são homólogas a partes do DNA genômico da espécie a ser transformada. A sequência de nucleotídeos contendo um gene de interesse (por exemplo, um gene que codifique uma proteína com atividade de N-glicosilação) para expressão é inserida nesse vetor entre o primeiro e o segundo fragmentos de DNA inseríveis, quer antes ou depois do gene marcador. Vetores integrativos podem ser linearizados antes da transformação da levedura para facilitar a integração da sequência de nucleotídeos de interesse no genoma da célula hospedeira.

[00092] Um vetor de expressão pode apresentar um ácido nucleico recombinante sob o controle de um promotor de levedura (por exemplo, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, P. pastoris ou outra espécie de fungo adequada), que o permite ser expressado em células fúngicas. Promotores de levedura adequados incluem, por exemplo, os promotores ADC1, TPI1, ADH2, hp4d, POX e Gal10 (veja, por exemplo, Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(23):7410). Promotores adequados adicionais são descritos, por exemplo, em Zhu e Zhang (1999) Bioinformatics 15(7-8):608-611 e na patente norte- americana n° 6.265.185.

[00093] Um promotor pode ser constitutivo ou induzível (condicional). Um promotor constitutivo é entendido como sendo um promotor cuja expressão seja constante sob as condições de cultura padronizadas. Promotores induzíveis são promotores que são sensíveis a um ou mais sinais de indução. Por exemplo, um promotor induzível pode ser quimicamente regulado (por exemplo, um promotor cuja atividade transcricional seja regulada pela presença ou ausência de um agente indutor químico, como um álcool, tetraciclina, um esteroide, um metal ou outra molécula pequena) ou fisicamente regulado (por exemplo, um promotor cuja atividade transcricional seja regulada pela presença ou ausência de um indutor físico, como luz ou altas ou baixas temperaturas). Um promotor induzível também pode ser indiretamente regulado por um ou mais fatores de transcrição que sejam, por si mesmos, diretametne regulados por sinais químicos ou físicos.

[00094] Deve-se entender que outras modificações geneticamente manipuladas também podem ser condicionais. Por exemplo, um gene pode ser condicionalmente deletado usando, por exemplo, uma DNA recombinase específica para sítio, como o sistema Cre-loxP (veja, por exemplo, Gossen et al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 e publicação de pedido norte-americano n° 20060014264).

[00095] Um ácido nucleico recombinante pode ser introduzido em uma célula aqui descrita usando vários métodos, como a técnica de esferoplastos ou o método de transformação de levedura com cloreto de lítio em célula inteira. Outros métodos utilizáveis para a transformação de plasmídios ou vetores de ácido nucleico lineares em células são descritos, por exemplo, na patente norte-americana n° 4.929.555; Hinnen et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163; patente norte-americana n° 4.879.231; e Sreekrishna et al. (1987) Gene 59:115, cujas exposições são aqui incorporadas por referência em sua inteireza. Procedimentos de transformação de célula inteira por eletroporação e PEG1000 também podem ser usados, conforme descrito por Cregg e Russel, Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Capítulo 3, Humana Press, Totowa, N.J., pp. 27-39 (1998).

[00096] Células fúngicas transformadas podem ser selecionadas usando-se técnicas apropriadas, incluindo, mas não limitadas a, cultivo de células auxotróficas após transformação na ausência do produto bioquímico requerido (devido à auxotrofia da célula), seleção e detecção de um novo fenótipo ou cultivo na presença de um antibiótico que seja tóxico para a levedura na ausência de um gene de resistência contido nos transformantes. Transformantes também podem ser selecionados e/ou verificados por integração do cassete de expressão no genoma, que pode ser avaliado, por exemplo, por análise de Southern blot ou PCR.

[00097] Antes da introdução dos vetores em uma célula-alvo de interesse, os vetores podem ser cultivados (por exemplo, amplificados) em células bacterianas, como Escherichia coli (E. coli), conforme acima descrito. O DNA do vetor pode ser isolado das células bacterianas por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica que resulte na purificação do DNA do vetor do meio bacteriano. O DNA de vetor purificado pode ser amplamente extraído com fenol, clorofórmio e éter, para assegurar que nenhuma proteína de E. coli esteja presente na preparação de DNA plasmídico, pois essas proteínas podem ser tóxicas para células de mamíferos.

[00098] Em algumas modalidades, a célula fúngica geneticamente manipulada é desprovida do gene OCH1 ou de seus produtos de gene (por exemplo, mRNA ou proteína) e é deficiente em atividade OCH1. Em algumas modalidades, a célula geneticamente manipulada expressa um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila (por exemplo, um polipeptídio MNN4 de Yarrowia lipolytica, S. cerevisiae, Ogataea minuta, Pichia pastoris ou C. albicans, ou um polipeptídio PNO1 de P. pastoris). Por exemplo, a célula fúngica pode expressar um polipeptídio MNN4 de Y. lipolytica (Genbank® n° de Acesso: XM_503217, Genolevures Ref: YALI0D24101g). Em algumas modalidades, a célula geneticamente manipulada é deficiente em atividade OCH1 e expresas um polipeptídio capaz de promover a fosforilação de manosila.

[00099] Após a retirada do cap (uncapping) e desmanosilação, a molécula-alvo pode ser isolada. Em algumas modalidades, a molécula- alvo é mantida dentro da célula de levedura e liberada por lise celular. Em algumas modalidades, a molécula-alvo é secretada no meio de cultura mediante um mecanismo proporcionado por uma sequência codificadora (nativa ao ácido nucleico exógeno ou manipulada no vetor de expressão), que dirige a secreção da molécula da célula. A presença da molécula-alvo ausente de cap (uncapped) e desmanosilada no lisado celular ou meio de cultura pode ser verificada por vários protocolos padronizados para a detecção da presença da molécula. Por exemplo, quanto a molécula-alvo alterada é uma proteína, esses protocolos podem incluir, mas não se limitam a, imunotransferência ou radioimunoprecipitação com um anticorpo específico para a proteína- alvo alterada (ou para a própria proteína-alvo), ligação de um ligante específico para a proteína-alvo alterada (ou para a própria proteína- alvo), ou teste de uma atividade de enzima específica da proteína-alvo alterada (ou da própria proteína-alvo).

[000100] Em algumas modalidades, após o isolamento, a molécula- alvo ausente de cap (uncapped) e desmanosilada pode ser fixada a uma porção heteróloga, por exemplo, usando meios enzimáticos ou químicos. Uma "porção heteróloga" se refere a qualquer constituído que seja unido (por exemplo, covalentemente ou não covalentemente) à molécula-alvo alterada, esse constituinte sendo diferente de um constituinte originalmente presente na molécula-alvo alterada. Porções heterólogas incluem, por exemplo, polímeros, veículos, adjuvantes, imunotoxinas ou porções detectáveis (por exemplo, fluorescentes, luminescentes ou radioativas). Em algumas modalidades, um N-glicano adicional pode ser adicionado à molécula-alvo alterada.

[000101] Métodos para detecção da glicosilação de uma molécula- alvo incluem eletroforese de carboidratos auxiliada por sequenciador de DNA (DSA) e auxiliada por fluoróforo (FACE) ou espectrometria de massa de dessoração de lase intensificada por superfície/tempo de voo de ionização (SELDI-TOF MS). Por exemplo, uma análise pode utilizar DSA-FACE em que, por exemplo, glicoproteínas sejam desnaturadas, seguido por imobilização, por exemplo, em uma membrana. As glicoproteínas podem ser, então, reduzidas com um agente redutor adequado, como ditiotreitol (DTT) ou β-mercaptoetanol. Os grupos sulfidrila das proteínas podem ser carboxilados usando-se um ácido, como ácido iodoacético. A seguir, os N-glicanos podem ser liberados da proteína usando-se uma enzima como N-glicosidase F. N-glicanos podem ser opcionalmente reconstituídos e derivatizados por aminação redutora. Os N-glicanos derivatizados podem ser, então, concentrados. Uma instrumentação adequada para análise de N-glicano inclui, por exemplo, o sequenciador de DNA ABI PRISM® 377 (Applied Biosystems). A análise dos dados pode ser realizada usando-se, por exemplo, o software GENESCAN® 3.1 (Applied Biosystems). Manoproteínas isoladas podem ser adicionalmente tratadas com uma ou mais enzimas, como fosfatase de intestino de novilho, para confirmar seu status de N-glicano. Métodos adicionais de análise de N-glicano incluem, por exemplo, espectrometria de massa (por exemplo, MALDI- TOF-MS), cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) em fase normal, fase reversa e cromatografia de troca de íons (por exemplo, com detecção amperométrica pulsada quando os glicanos não estão marcados e com absorbância de UV ou fluorescência se os glicanos estiverem apropriadamente marcados). Veja também Callewaert et al. (2001) Glicobiology 11(4):275-281 e Freire et al. (2006) Bioconjug. Chem. 17(2):559-564.

Culturas de Células Manipuladas

[000102] Este documento também apresenta uma cultura substancialmente pura de qualquer uma das células geneticamente manipuladas aqui descritas. Conforme aqui usado, uma "cultura substancialmente pura" de uma célula geneticamente manipulada é uma cultura dessa célula em que menos de cerca de 40% (isto é, menos de cerca de: 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001%, ou ainda menos) do número total de células viáveis na cultura são células viáveis diferentes da célula geneticamente manipulada, por exemplo, células bacterianas, fúngicas (incluindo de levedura), de micoplasma ou protozoário. O termo "cerca de" nesse contexto significa que a porcentagem relevante pode estar 15% acima ou abaixo da porcentagem especificada. Assim, por exemplo, cerca de 20% pode ser de 17% a 23%. Essa cultura de células geneticamente manipuladas inclui as células e um meio de crescimento, armazenamento ou transporte. O meio pode ser líquido, semissólido (por exemplo, memio gelatinoso) ou congelado. A cultura inclui as células em crescimento no meio líquido ou no/sobre o meio semissólido ou armazenadas ou transportadas em um meio de armazenamento ou transporte, incluindo um meio de armazenamento ou transporte congelado. As culturas estão em um recipiente de cultura ou recipiente ou substrato de armazenamento (por exemplo, um disco, balão ou tubo de cultura ou um frasco ou tubo de armazenamento).

[000103] As células geneticamente manipuladas aqui descritas podem ser armazenadas, por exemplo, como suspensões celulares congeladas, por exemplo, em tampão contendo um crioprotetor, como glicerol ou sacarose, como células liofilizadas. Alternativamente, elas podem ser armazenadas, por exemplo, como preparações de células secas obtidas, por exemplo, por secagem em leito fluidizado ou secagem por pulverização, ou qualquer outro método de secagem adequado.

Distúrbios Metabólicos

[000104] Moléculas ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas podem ser usadas para tratar vários distúrbios metabólicos. Um distúrbio metabólico é um que afete a produção de energia dentro de células humanas (ou animais) individuais. A maioria dos distúrbios metabólicos é genética, embora alguns possam ser "adquiridos" como resultado de dieta, toxinas, infecções e outros. Distúrbios metabólicos genéticos são também conhecidos como erros inatos de metabolismo. Em geral, os distúrbios metabólicos genéticos são causados por defeitos genéticos que resultam em enzimas faltantes ou impropriamente construídas necessárias para alguma etapa no processo metabólico da célula. As maiores classes de distúrbios metabólicos são distúrbios do metabolismo de carboidratos, distúrbios do metabolismo de aminoácidos, distúrbios do metabolismo de ácidos orgânicos (acidúrias orgânicas), distúrbios da oxidação de ácidos graxos e do metabolismo mitocondrial, distúrbios do metabolismo da porfirina, distúrbios do metabolismo de purina e pirimidina, distúrbios do metabolismo de esteroides, distúrbios da função mitocondrial, distúrbios da função peroxissômica e distúrbios de armazenamento lisossomal (LSDs).

[000105] Exemplos de distúrbios metabólicos que podem ser tratados mediante a administração de uma ou mais moléculas ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas (ou suas composições farmacêuticas) podem incluir hemocromatose hereditária, albinismo oculocutâneo, deficiência de proteína C, angioedema hereditário de tipo I, deficiência congênita de sacarase-isomaltase, Crigler-Najjar tipo II, síndrome de Laron, mieloperoxidase hereditária, hipotireoidismo primário, síndrome da QT longa congênita, deficiência de globulina de ilgação a tiroxina, hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia familiar, abeta- lipoproteinemia, baixos níveis plasmáticos de lipoproteína A, enfisema hereditário com lesão hepática, hipotireoidismo congênito, osteogênese imperfeita, hipofibrinogenemia hereditária, deficiência de alfa-1 antiquimiotripsina, diabetes insípido nefrogênico, diabetes insípido neuro-hipofisário, deficiência de adenosina desaminase, doença de Pelizaeus Merzbacher, doença de von Willebrand tipo IIA, deficiência de fatores V e VIII combinados, displasia tardia espôndilo-epifisária, coroidermia, doença celular I, doença de Batten, ataxia telangiectasias, ADPKD-doença renal policística dominante autossômica, doença de inclusão de microvilos, esclerose tuberosa, síndrome oculocerebrorrenal de Lowe, esclerose lateral amiotrófica, síndrome mielodisplásica, síndrome linfocítica de Bare, doença de Tangier, colestase intra-hepática familiar, adreno-leucodistrofia ligada a X, síndrome de Scott, síndrome de Hermansky-Pudlak tipos 1 e 2, síndrome de Zellweger, condrodisplasia puncta rizomélica, hiperoxalúria primária recessiva autossômica, síndrome de Mohr Tranebjaerg, atrofia muscular espinhal e bulbar, discinesia ciliar primária (síndrome de Kartagener), gigantismo e acromegalia, galactorreia, doença de Addison, virilismo adrenal, síndrome de Cushing, cetoacidose, aldosteronismo primário ou secundário, síndrome de Miller Dieker, lisencefalia, doença do neurônio motor, síndrome de Usher, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de Optiz, doença de Huntington, pancreatite hereditária, síndrome anti-fosfolipídios, doença do tecido conectivo superposto, síndrome de Sjogren, síndrome da pessoa rígida, síndrome de Brugada, síndrome nefrítica congênita do tipo finlandês, síndrome de Dubin-Johnson, hipofosfatemia ligada a X, síndrome de Pendred, hipoglicemia hiperinsulinêmica persistente da infância, esferocitose hereditária, aceruloplasminemia, lipofuscinose ceroide neuronal infantil, pseudoacondroplasia e epifisária múltipla, distrofia macular do tipo Stargardt, doença de Charcot-Marie-Tooth ligada a X, retinite pigmentosa dominante autossômica, síndrome de Wolcott- Rallison, doença de Cushing, distrofia muscular de cinturas, mucopolissacaridose de tipo IV, amiloidose familiar hereditária de Finish, doença de Anderson, sarcoma, leucemia mielomonocítica crônica, cardiomiopatia, displasai faciogenital, doença de Torsion, ataxias de Huntington e espinocerebelar, hiperomocisteinemia hereditóaria, polineuropatia, doença do neurônio motor inferior, retinite pigmentada, poliartrite soronegativa, fibrose pulmonar intersticial, fenômeno de Raynaud, granulomatose de Wegner, proteinúria, CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-Id, CDG-Ie, CDG-If, CDG-IIa, CDG-IIb, CDG-IIc, CDG-IId, síndrome de Ehlers-Danlos, exostoses múltiplas, síndrome de Griscelli (tipo 1 ou tipo 2), ou retardo metanl não específico ligado a X. Além disso, os distúrbios metabólicos também podem incluir distúrbios de armazenamento lisossomal como, mas não limitados a, doença de Fabry, mucopolissacaridose I, doença de Farber, doença de Gaucher, GM1-gangliosidose, doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff, doença do ativador de GM2, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença de Niemann-Pick (tipos A, B, e C), doença de Scheie, doença de Hunter, doença de Sanfilippo, doença de Morquio, doença de Maroteaux-Lamy, deficiência de hialuronidase, aspartilglucosaminúria, fucosidose, manosidose, doença de Schindler, sialidose tipo 1, doença de Pompe, picnodisostose, lipofuscinose ceroide, doença do armazenamento do éster de colesterol, doença de Wolman, deficiência de sulfatase múltipla, galactossialidose, mucolipidose (tipos II, III e IV), cistinose, distúrbio de armazenamento do ácido siálico, doença da retenção de quilomícron com síndrome de Marinesco-Sjogren, síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome de Chediak-Higashi, doença de Danon, ou displasia geleofísica.

[000106] Os sintomas de um distúrbio metabólico são numerosos e diversos e podem incluir um ou mais de, por exemplo, anemia, fadiga, facilitade de escoriações, baixa contagem plaquetária, aumento do fígado, aumento do baço, enfraquecimento esquelético, insuficiência pulmonar, infecções (por exemplo, infecções toráxicas ou pneumonias), insuficiência renal, lesão cerebral progressiva, convulsões, mecônio extra espesso, tosse, espirros, produção excessiva de saliva ou muco, fôlego curto, dor abdominal, oclusão intestinal, problemas de fertilidade, pólipos no nariz, unhas e pele dos dedos das mãos/pés em baqueta de tambor, dor nas mãos ou pés, angioceratoma, diminuição da transpiração, opacidades corneanas e lenticulares, cataratas, prolapso e/ou regurgitação da válvula mitral, cardiomegalia, intolerância à temperatura, dificuldades de andar, dificuldades de deglutir, perda progressiva da visão, perda progressiva da audição, hipotonia, macroglossia, arreflexia, dor lombar, apneia do sono, ortopneia, sonolência, lordose ou escoliose. Deve-se entender que devido à natureza diversa das proteínas defeituosas ou ausências e dos fenótipos de doença resultantes (por exemplo, apresentação sintomática de um distúrbio metabólico), um dado distúrbio em geral apresentará apenas sintomas característicos àquele distúrbio particular. Por exemplo, um paciente com doença de Fabry pode apresentar um subconjunto particular dos sintomas acima mencionados, como, mas não limitados a, intolerância à temperatura, distrofia corneana, dor, erupções cutâneas, náusea ou diarreia. Um paciente com síndrome de Gaucher pode apresentar esplenomegalia, cirrose, convulsões, hipertonia, apneia, osteoporose ou descoloração cutânea.

[000107] Além da administração de uma ou mais moléculas ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas aqui descritas, um distúrbio metabólico também pode ser tratado por nutrição apropriada e vitaminas (por exemplo, terapia de co-fatores), terapia física e medicações para dor.

[000108] Dependendo da natureza específica de um dado distúrbio metabólico, um paciente pode apresentar esses sintomas em qualquer idade. Em muitos casos, os sintomas podem se apresentar na infância ou na juventude. Por exemplo, sintomas da doença de Fabry podem se apresentar em uma idade precoce, por exemplo, com 10 ou 11 anos de idade.

[000109] Conforme aqui usado, um sujeito "com risco de desenvolver um distúrbio metabólico" é um sujeito que tenha uma predisposição para desenvolver um distúrbio, isto é, uma predisposição genética para desenvolver um distúrbio metabólico como resultado de uma mutação em uma enzima como glucosidase ácida, alfa galactosidase, alfa-L- iduronidase, beta-D-galactosidase, beta-glucosidase, beta hexosaminidase, beta-D-manosidase, alfa-L-fucosidase, arilsulfatase B, arilsulfatase A, alfa-N-acetilgalactosaminidase, aspartilglucosaminidase, iduronato-2-sulfatase, alfa-glucosaminida-N- acetiltransferase, beta-D-glucoronidase, hialuronidase, alfa-L- manosidase, alfa-neurominidase, fosfotransferase, lipase ácida, ceramidase ácida, esfingomielinase, tioesterase, catepsina K ou lipoproteína lipase. Evidentemente, sujeitos "com risco de desenvolver um distúrbio metabólico" não são todos os sujeitos dentro de uma espécie de interesse.

[000110] Um sujeijto "suspeito de ter um distúrbio" é um com um ou mais sintomas de um distúrbio metabólico, como qualquer um dos aqui descritos.

Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento

[000111] Uma molécula-alvo ausente de cap (uncapped) e desmanosilada pode ser incorporada em uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula e um ou mais adjuvantes, excipientes, veículos e/ou diluentes. Diluentes, veículos e excipientes aceitáveis tipicamente não afetam de maneira adversa a homeostase do receptor (por exemplo, equilíbrio eletrolítico). Veículos aceitáveis incluem sais biocompatíveis, inertes ou bioabsorvíveis, agentes de tamponamento, oligo- ou polissacarídeos, polímeros, agentes de melhora da viscosidade, preservativos e outros. Um veículo exemplificativo é a salina fisiológica (NaCl a 0,15 M, pH 7,0 a 7,4). Outro veículo exemplificativo é fosfato de sódio a 50 mM, cloreto de sódio a 100 mM. Detalhes adicionais quanto a técnicas para formulação e administração de composições farmacêuticas podem ser encontrados, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[000112] A administração de uma composição farmacêutica contendo moléculas ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas pode ser sistêmica ou local. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo que sejam adequadas para administração parenteral e/ou não parenteral. Modalidades de administração específicas incluem administração subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intratecal, oral, retal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, intra-articular, intra-arterial, sub-aracnoide, brônquica, linfática, vaginal e intrauterina.

[000113] A administração pode ser por injeções periódicas de um bolo da composição farmacêutica ou pode ser ininterrupta ou contínua por administração intravenous ou intraperitoneal a partir de um reservatório externo (por exemplo, uma bolsa IV) ou interno (por exemplo, um implante bioerosível, um órgão bioartificial ou uma colônia de células de produção de molécula de N-glicosilação alterada implantada). Veja, por exemplo, as patentes norte-americanas n° 4.407.957, 5.798.113 e 5.800.828. A administração de uma composição farmacêutica pode ser conseguida usando-se meios de distribuição adequados, como: uma bomba (veja, por exemplo, Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984); microencapsulação (veja, por exemplo, as patentes norte-americanas n° 4.352.883, 4.353.888 e 5.084.350); implantes poliméricos de liberação contínua (veja, por exemplo, Sabel, patente norte-americana n° 4.883.666); macroencapsulação (veja, por exemplo, as patentes norte-americanas n° 5.284.761. 5.158.881. 4.976.859 e 4.968.733 e pedidos de patentes PCT publicados WO92/19195, WO 95/05452); injeção, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular ou em outros sítio adequado; ou administração oral, em cápsulas, líquidos, comprimidos, pílulas ou formulações de liberação prolongada.

[000114] Exemplos de sistemas de distribuição parenteral incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vinila, bombas osméticas, sistemas de infusão implantáveis, distribuição por bomba, distribuição por célula encapsulada, distribuição lipossomal, injeção por agulha, injeção sem agulha, nebulizador, aerossolizador, eletroporação e emplastro transdérmico.

[000115] Formulações adequadas para administração parenteral contêm convenientemente uma preparação aquosa estéril da molécula de N-glicosilação alterada, que é, de preferência, isotômica com o sangue do receptor (por exemplo, solução salina fisiológica). As formulações podem ser apresentadas em forma de dose unitária ou de múltiplas doses.

[000116] Formulações adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades distintas, como cápsulas, sachês, comprimidos ou trociscos, cada uma contendo uma quantidade predeterminada da molécula de N-glicosilação alterada; ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso, como um xarope, um elixir, uma emulsão ou uma dose.

[000117] Uma molécula ausente de cap (uncapped) e desmanosilada adequada para administração tópica pode ser administrada a um mamífero (por exemplo, um paciente humano) como, por exemplo, um creme, um spray, uma espuma, um gel, um unguento, um bálsamo ou um pano seco. Um pano seco pode ser reidratado no local de administração. Essas moléculas também podem ser infundidas diretamente em (por exemplo, encharcada e secada) uma bandagem, gaze ou emplastro, que pode ser, então, aplicado topicamente. Essas moléculas também podem ser mantidas em um estado semilíquido, de gel ou completamente líquido em uma bandagem, gaze ou emplastro para administração tópica (veja, por exemplo, a patente norte- americana n° 4.307.717).

[000118] Quantidades terapeuticamente eficazes de uma composição farmacêutica podem ser administradas a um sujeito necessitado em um regime de dosagem determinável por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma composição pode ser administrada ao sujeito, por exemplo, sistemicamente a uma dosagem de 0,01 μg/kg a 10.000 μg/kg de peso corporal do sujeito, por dose. Em outro exemplo, a dosagem é de 1 μg/kg a 100 μg/kg de peso corporal do sujeito, por dose. Em outro exemplo, a dosagem é de 1 μg/kg a 30 μg/kg de peso corporal do sujeito, por dose, por exemplo, de 3 μg/kg a 10 μg/kg de peso corporal do sujeito, por dose.

[000119] Para otimizar a eficácia terapêutica, uma molécula ausente de cap (uncapped) e desmanosilada pode ser primeiro administradas a diferentes regimes de dosagem. A dose unitária e o regime dependem de fatores que incluem, por exemplo, a espécie de mamífero, seu status imune, o peso corporal do mamífero. Tipicamente, os níveis dessa molécula em um tecido podem ser monitorizados usando-se ensaios de triagem apropriados como parte de um procedimento de testes clínicos, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.

[000120] A frequência de dosagem para uma molécula ausente de cap (uncapped) e desmanosilada está dentro das habilidades e julgamento clínico dos profissionais de saúde (por exemplo, médicos ou enfermeiras). Tipicamente, o regime de administração é estabelecido por ensaios clínicos que podem estabelecer parâmetros de administração ótimos. Entretanto, o profissional pode variar esses regimes de administração de acordo com a idade, saúde, peso, sexo e status médico do sujeito. A frequência de dosagem pode ser variada dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico.

[000121] A toxicidade e eficácia terapêutica dessas moléculas ou suas composições farmacêuticas podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos, por exemplo, em culturas celulares ou animais experimentais. Esses procedimentos podem ser usados, por exemplo, para a determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Composições farmacêuticas que exibem altos índices terapêuticos são preferidas. Embora composições farmacêuticas que exibam efeitos colaterais tóxicos possam ser usadas, deve-se tomar cuidado ao projetar um sistema de distribuição que direcione esses compostos para o sítio de tecido afetado para minimizar o dano em potencial para células normais (por exemplo, células não-alvo) e, dessa forma, reduzir os efeitos colaterais.

[000122] Os dados obtidos em ensaios de cultura celular e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em sujeitos apropriados (por exemplo, pacientes humanos). A dosagem dessas composições farmacêuticas em geral se encontra dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para uma composição farmacêutica usada conforme aqui descrito (por exemplo, para tratamento de um distúrbio metabólico em um sujeito), a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura celular. Pode-se formular uma dose em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclua a IC50 (isto é, a concentração da composição farmacêutica que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) conforme determinado na cultura celular. Essa informação pode ser usada para determinar com maior precisão doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma pode ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.

[000123] Conforme aqui definido, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma molécula ausente de cap (uncapped) e desmanosilada é uma quantidade da molécula que seja capaz de produzir um resultado medicamente desejável (por exemplo, melhora de um ou mais sintomas de um distúrbio metabólico) em um sujeito tratado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, uma dosagem eficaz) pode incluir quantidades em miligramas ou microgramas do composto por quilograma de peso do sujeito ou amostra (por exemplo, de cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 500 miligramas por quilograma, de cerca de 100 microgramas por quilograma a cerca de 5 miligramas por quilograma, ou cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 50 microgramas por quilograma).

[000124] O sujeito pode ser qualquer mamífero, por exemplo, um ser humano (por exemplo, um paciente humano) ou um primata não humano (por exemplo, chimpanzé, babuíno ou macaco), um camundongo, um rato, um coelho, uma cobaia, um gerbo, um hamster, um cavalo, um tipo de gado (por exemplo, vaca, porco, ovelha ou cabra), um cão, um gato ou uma baleia.

[000125] Uma molécula ou sua composição farmacêutica aqui descrita pode ser administrada a um sujeito como uma terapia de combinação com outro tratamento, por exemplo, um tratamento para um distúrbio metabólico (por exemplo, um distúrbio de armazenamento lisossomal). Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir a administração ao sujeito (por exemplo, um paciente humano) de um ou mais agentes adicionais que confiram um benefício terapêutico ao sujeito que tenha, ou esteja com risco de desenvolver (ou suspeito de ter) um distúrbio metabólico (por exemplo, um distúrbio de armazenamento lisossomal). Assim, o composto ou composição farmacêutica e os um ou mais agentes adicionais podem ser administrados ao mesmo tempo. Alternativamente, a molécula pode ser administrada primeiro, e os um ou mais agentes adicionais administrados sem segundo lugar ou vice versa.

[000126] Deve-se notar que, em casos emq eu uma terapia anterior seja particularmente tóxica (por exemplo, um tratamento para um distúrbio metabólico com perfis de efeitos colaterais significativos), a administração de uma molécula aqui descrita pode ser usada para compensar e/ou diminuir a quantidade da terapia anterior a um nível suficiente para conferir o mesmo benefício terapêutico ou um melhor, mas sem a toxicidade.

[000127] Qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas pode ser incluída em um recipiente, pacote ou distribuidor juntamente com instruções para administração.

[000128] A seguir, apresentam-se exemplos da prática da invenção. Eles não devem ser tomados como limitativos do âmbito da invenção de forma alguma.

EXEMPLO 1 Geração de uma cepa de expressão de alfa glucosidase humana

[000129] Y. lipolytica cepa OXYY1589 foi construída da seguinte maneira e contém três cópias do gene da alfa glucosidase humana (huGAA, também conhecida como alfa glucosidase ácida ou maltase ácida EC3.2.1.3) e duas cópias do gene de MNN4 de Y. lipolytica. O genótipo da cepa OXYl589 é o seguinte: MatA, leu2-958, ura3-302, xpr2-322, gut2-744, ade2-844 POX2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::zeta POX2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::zeta POX2-Lip2pre-hGM-CSF:GUTEx::zeta YlMNN4-POX2-hp4d-YLMNN4 :ADE2::direcionada para PT

[000130] Todas as transformações foram realizadas de acordo com protocolos bem estabelecidos com modificações para os diferentes marcadores seletivos. A menos que especificado de outra forma, o fragmento de integração de huGAA foi obtido por digestão de restrição com NotI do plasmídio de expressão para remover o gene de resistência à canamicina. Os fragmentos resultantes da digestão de restrição foram separados por eletroforese em gel de agarose seguida por purificação em coluna Qiagen do fragmento de huGAA. Três transformações integrativas estáveis foram realizadas para se obter a cepa de produção de huGAA final OXYY1589.

[000131] Vetor de expressão de huGAA otimizado para códon de Y. lipolytica: A sequência de nucleotídeos que codifica o precursor de huGAA de 110 kDA foi quimicamente sintetizada, e os códons otimizados para expressão em Y. lipolytica. A Tabela 1 mostra o uso de códons para Y. lipolytica. Os dados foram derivados de 2.945.919 códons presentes em 5.967 sequências codificadoras. O conteúdo da Tabela 1 foi obtido em uma Base de Dados de Uso de Códon, que pode ser encontrada na internet em kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=284591. TABELA 1 Tabela de Uso de Códons de Yarrowia lipolytica

[000132] Os campos da tabela são mostrados como [tripleto] [frequência: por mil] ([número]).

[000133] No construto sintético, os peptídios de sinal pré- e pró- huGAA foram eliminados, de modo que a proteína começa no aminoácido 57. O quadro de leitura aberta sintético (ORF) de huGAA (FIG. 1A) foi fusionado na armação na extremidade 5’ com relação à extremidade 3’ da sequência de sinal LIP2 de Y. lipolytica (pré), seguido pela sequência codificadora de dois sítios de clivagem Xxx-Ala, e flanquados por sítios de restrição BamHI e AvrII para clonagem no vetor de expressão. No construto, a sequência codificadora de polipeptídio fusionada estava sob o controle do promotor induzível POX2. A sequência de aminoácidos completa do construto é mostrada na FIG. 1B.

[000134] Um esquema genérico do vetor de expressão em Y. lipolytica é apresentado na FIG. 2. A porção bacteriana é derivada do plasmídio pHSS6 e contém uma origem de replicação bacteriana (ori) e o gene de resistência à canamicina (KanR). O cassete de integração compreende a) o marcador de seleção para transformação em Yarrowia lipolytica (URA3; LEU2; GUT2), b) o cassete de expressão composto por um promotor, c) um sítio de clonagem múltipla (MCS) para inserir a huGAA em quadro com a sequência de sinal e d) o terminador do gene LIP2. O cassete de integração é flanqueado por sequências zeta para integração não homóloga estável no genoma de Y. lipolytica. Dois sítios de restrição NotI permitem o isolamento do cassete de expressão antes da transformação. Os plasmídios pRAN034, pRAN036 e OXYP183 foram usados para gerar os vetores de expressão de huGAA pRAN058, pRAN059 e pRAN060, respectivamente, contendo os marcadores de transformação URA3, LEU2 e GUT2, respectivamente.

[000135] Vetor de expressão de YIMNN4 em tandem OXYP1470B: O gene de MNN4 de Y. lipolytica (YlMNN4) foi clonado sob o controle do promotor induzível pPOX2 e sob o controle do promotor (semi)constitutivo hp4d. Esses dois cassetes de expressão de YlMNN4 foram subclonados em um vetor como um construto em tandem portando regiões de flanco (PT) do gene ADE2 para integração direcionada no locus ADE2 do genoma e o gene ADE2 como um marcador de seleção.

[000136] Cepa Intermediária OXYY1569: A primeira transformação foi uma co-transformação da cepa G014 de Y. lipolytica com os cassetes de expressão purificados dos vetores pRAN058 e pRAN059, usando os marcadores URA3 e LEU2 para produzir a cepa recombinante intermediária OXYY1569. Assim, OXYY1569 é portadora de dois construtos de expressão de huGAA sob o controle do promotor pPOX2 aleatoriamente integrados no genoma da cepa G014.

[000137] OXYY1569 foi selecionada da seguinte maneira. A integração do DNA de huGAA DNA no genoma de Y. lipolytica foi confirmada por triagem por PCR do DNA genômico. Os primers para as reações de PCR foram projetados para amplificar um fragmento de 2552 pb da sequência de nucleotídeos de huGAA. Também se realizou a análise Southern blot do DNA genômico para confirmar a integração de pelo menos 2 cópias do DNA de huGAA. Em particular, DNAs genômicos de clones de OXYY1569 foram digeridos com Hind III e sondados com uma sonda específica marcada com DIG para huGAA.

[000138] Para selecionar um clone que secrete altos níveis de huGAA, vários clones aleatoriamente selecionados com integração confirmada de pelo menos duas cópias do DNA de huGAA foram cultivados em balões com agitação sob condições indutoras de POX2 usando um meio que continha 1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 5% de ácido oleico emulsificado. Em todos os casos, o sobrenadante da cultura foi coletado 72 h após a indução e triados em um Western blot padrão e análise de ensaio de atividade de enzima usando o ensaio 4-MUG descrito no Exemplo 3. A anáise de N-glicanos de OXYY1569 indicou que a estrutura predominante em OXYY1569 era Man8GlcNAc2.

[000139] Cepa Intermediária OXYYl584: A cepa recombinante OXYYl569 foi transformada com o cassete de expressão excisado do plasmídio OXYP1479B para integrar duas cópias do gene MNN4 de Y. lipolytica em seu genoma para produzir OXYYl584. O cassete de expressão foi excisado do plasmídio OXYP1479B com um produto de digestão de restrição com SacII/XmaI. O cassete de expressão foi projetado para integração direcionada no locus ADE2 do genoma de Y. lipolytica. A cepa recombinante foi selecionada após Southern blotting e análise de glicanos para avaliar o comportamento da cepa com relação à fosforilação aumentada. O DNA genômico de vários transformantes arbitrariamente escolhidos foi digerido com SpeI e sondado com uma sonda marcada com DIG específica para MNN4. A integração direcionada correta do cassete de expressão de MNN4 no locus ADE2 do genoma de Y. lipolytica produziu bandas de 4207 pb e 5683 pb após a digestão com SpeI. Clones positivos foram cultivados em um procedimento de balão de agitação padrão. A análise de N-glicanos das proteínas secretadas foi realizada para selecionar o clone intermediário OXYY1584. Em comparação com a cepa progenitora OXXY1569, as estruturas predominantes após a superexpressão de MNN4 eram Man8GlcNAc2(PMan)1 e Man8GlcNAc2 (PMan)2.

[000140] Cepa de produção OXYYl589: Para gerar a cepa de produção prototrófica final OXYY1589, uma terceira cópia de huGAA foi integrada no genoma da cepa recombinante OXYY1584. A transformação foi realizada com um cassete de expressão excisado com Not I de pRAN069. O DNA genômico dos transformantes foi primeiro triado por PCR quanto à presença da cópia adicional de huGAA. Para avaliar a produção de huGAA, clones positivos em PCR arbitrariamente selecionados foram adicionalmente analisados para expressão após cultivo em balão de agitação padrão. O clone que expressava o nível mais alto de huGAA (OXYY1589) foi escolhido após análise Western blot e ensaio de atividade enzimática (ensaio 4-MUG descrito no Exemplo 3). Também foi reconfirmado que os níveis de conversão de M8 em N-glicanos MP2-M8 e MP-M8 não eram influenciados pela presença do cassete de expressão de huGAA adicional.

EXEMPLO 2 Cultivo Por Batelada de Alimentação da Cepa OXYY1589

[000141] Para produzir huGAA a partir da cepa OXYY1589 (Exemplo 1), estabeleceu-se um processo de batelada de alimentação usando um tanque com agitação de 10 L, com um volume operacional de 6 - 8 litros. O processo foi dividido em duas fases: 1) Crescimento por bateladas em glicose para formação de biomassa 2) Formação de produto por indução com o auxílio de uma alimentação limitada de ácido oleico.

[000142] Tipicamente, a fase de batelada era de cerca de 20 horas (h), e a fase de produção de aproximadamente 72 horas. Ao término do processo, o caldo de cultura foi centrifugado, e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi usado como material de partida para a purificação de huGAA (veja o Exemplo 3).

[000143] Os seguintes parâmetros foram controlados durante a fermentação. A aeração foi mantida em um valor constante de 1,5 vvm de ar (volume por volume por minuto). O oxigênio dissolvido (DO) foi inicialmente mantido em 30%. A agitação foi aumentada de 600 para 1200 rpm, dependendo dos níveis de DO. Uma vez atingido o máximo de 1200 rpm, a velocidade foi mantida constante, e o ajuste de DO foi estabelecido em 10%. Para manter 10% de DO, o oxigênio foi injetado no reator com uma porcentagem máxima de 50%. O surgimento de espuma foi controlado por uma sonda de espuma. Se fosse detectada espuma, adicionava-se um antiespumante ao biorreator. O pH foi controlado por adição de amônia a 14% (v/v) (base) ou ácido fosfórico a 10% para manter um valor constante de pH 6,8. A temperatura foi mantida constante em 28°C durante todo o processo.

[000144] A biomassa foi monitorizada por medição da densidade óptica a 600 nm (OD600). As amostras foram diluídas 2 - 1000 vezes em água destilada para se obterem valores na faixa linear do espectrofotômetro. A formação de produto foi detectada por análise Western blot e testes de atividade enzimática específicos.

EXEMPLO 3 Purificação de huGAA recombinante (rhGAA)

[000145] O sobrenadante após o cultivo (veja o Exemplo 2) foi clarificado mediante filtração profunda. O material resultante foi, então, concentrado 20 vezes mediante filtração de fluxo tangencial (TFF) e diafiltrado contra 20 mM de fosfato de sódio pH 6 e 100 mM de NaCl usando uma membrana MWCO de 10kDa (Millipore).

[000146] A purificação de rhGAA foi iniciada por adição de sulfato de amônio até uma concentração de 1 M. Após centrifugação, o sobrenadante foi carregado em uma coluna XK16/40 cheia de Toyopearl-Phenyl 650M (Tosoh Biosciences). Aplicou-se um gradiente linear de 1 a 0 M de sulfato de amônio para eluição. As porções que continham rhGAA foram, então, reunidas e submetidas a uma troca de tampão em 10 mM de BIS-TRIS pH 6. Conseguiu-se uma purificação adicional mediante cromatografia de troca de ânions em uma coluna Tricorn 10/50 ou XK25/20 cheia de 30Q (GE Healthcare) usando um gradiente de sal linear de 0 a 1 M de NaCl. As porções contendo GAA resultantes foram, então, concentradas antes de se carregar em uma coluna de filtração em gel Hiload 16/60 superdex 200 final (GE Healthcare) que foi pré-equilibrada com 50 mM de fosfato de sódio pH 6 e 200 mM de NaCl. As porções foram selecionadas com base na atividade específica e pureza em géis de SDS-PAGE tingidos com Coomassie e foram, então, combinadas e concentradas a uma concentração final de 5 - 10 mg/mL. As proteínas foram concentradas usando dispositivos centrífugos Amicon Ultra de 15 mL (Millipore) com um MWCO de 10 kDa.

[000147] O ensaio de 4-metilumbeliferil-alfa-D-glucopiranosida (4- MUG) foi usado para a triagem de rhGAA. A clivagem do substrato 4- MUG por uma glucosidase leva à geração do produto fluorigênico 4-MU, que pode ser visualizado ou detectado por irradiação com luz UV. As reações para a triagem qualitativa de rhGAA foram iniciadas pela adição do tampão de reação que consiste em 0,35 mM de 4-MUG, 0,1% de BSA e 100 mM de acetato de sódio pH 4 em uma proporção de volume de 10:1 ou 20:1 a 10 ou 5 μL da porção de eluição. Todas as reações foram feitas em placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços. Após um período de incubação de 30 minutos a 1 hora a 37°C, um volume igual de 100 mM de glicina pH 11 foi adicionado para parar a reação, e a liberação do produto de reação fluorogênico 4- metilumbeliferona (4MU) foi observada sob luz UV. As atividades específicas (unidades/mg de proteína) foram determinadas usando um ensaio colorimétrico com o substrato sintético p-nitrofenil-α-D- glucopiranosida (PNPG) que mede a liberação enzimática do produto de reação p-nitrofenolato de cor amarela. As reações foram iniciadas por misturação de 10 μL de solução de enzima e 90 μL de tampão de reação de substrato (2 mM de PNPG em 150 mM de tampão citrato- fosfato pH 4, 1% de BSA) em poços de reação de uma placa de microtitulação e foram subsequentemente incubadas a 37°C. Após incubação durante 1 a 2 horas, um volume igual de tampão de parada, 10% de carbonato de sódio pH 12, foi adicionado para finalizar a reação e levar o p-nitrofenol liberado (PNP) a seu estado ionizado. As absorbâncias corrigidas para o fundo e os padrões de p-nitrofenolato foram medidos a um comprimento de onda de 405 nm, e se calcularam as atividades específicas. As concentrações de proteínas foram determinadas pelo método de ácido bicinconínico (BCA). Uma unidade foi definida como a quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 nmol de PNPG em 1 nmol de PNP e D-glucose por min a 37°C a uma concentração de substrato final de 2 mM em um tampão citrato-fosfato, pH 4,0.

EXEMPLO 4 Clonagem e expressão de YIAMS1

[000148] O gene Ams1 de Yarrowia lipolytica (YlAms1) foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de Yarrowia usando primers específicos para o gene. Uma sequência codificadora com etiqueta HIS6 foi fusionada à extremidade 3’ do ORF de YlAms1, de modo que a proteína YlAMS1 com uma etiqueta His C-terminal pudesse ser produzida, e também foi fusionada à extremidade 5’ do ORF de YlAms1, de modo que a proteína YLAMS1 com uma etiqueta His N-terminal pudesse ser produzida. Ambos os ORFs foram clonados sob o controle do promotor hp4d semiconstitutivo (FIG. 3A e FIG. 3B), e os cassetes de expressão foram transformados em Yarrowia lipolytica. As células foram cultivadas em meio complexo (YPD) e colhidas após 72 h de crescimento. Após romper as células por sonicação, a proteína AMS1 foi purificada usando uma coluna NTA. O material purificado foi analisado quanto à atividade usando PNP-manose como um substrato. As porções ativas foram reunidas e mantidas para análise de glicanos. EXEMPLO 5

Desmanosilação e retirada de cap (uncapping) de fosfato de N-glicanos fosforilados marcados com APTS com GH38 α-manosidases

[000149] α-Manosidase de feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) foi obtida na Sigma-Aldrich. Tanto uma suspensão de sulfato de amônio a 3,0 M (Sigma-M7257), quanto uma α-manosidase de feijão-de-porco de qualidade proteômica (Sigma-M5573) foram usadas nas análises de N- glicanos. Ambas as bateladas deram resultados idênticos e são chamadas de JbMan na descrição a seguir. YlAms1 foi expressada e purificada conforme descrito no Exemplo 4. JbMan e YlAMS1 foram testadas em uma mistura de açúcares marcados com ácido 8-amino- 1,3,6-pirenotrissulfônico (APTS) derivados de uma cepa de Yarrowia lipolytica que superexpressa MNN4, que contém os açúcares Man8GlcNAc2 (M8), o ManP-Man8GlcNAc2 monofosforilado (MP-M8) e/ou o (ManP)2-Man8GlcNAc2 ((MP) 2-M8) difosforilado (chamados de açúcares MNN4 ou N-glicanos MNN4). Na FIG. 4, os produtos de hidrólise final em potencial são esquematicamente representados, considerando que as α-manosidases também podem aparar completamente os N-glicanos MNN4, incluindo a hidróise do braço não fosforilado, a hidrólise da α-1,2-manose terminal se a manose subjacente estiver fosforilada e/ou a retirada do cap (uncapping) do fosfato na ligação manose-1-fosfo-6-manose.

[000150] A menos que declarado de outra forma, todas as reações com JbMan e YlAMS1 nos N-glicanos marcados com APTS foram realizadas durante uma noite a 37°C em um tampão acetato de amônio, 10 mM, pH 5,0 com 2 mM de CaCl2.

[000151] Na FIG. 5, são apresentados eletroferogramas DSA-FACE que representam a hidrólise dos N-glicanos MNN4 com JbMan. Incluiu- se uma amostra com Man8GlcNAc2 como o substrato (Painel B) para se poder identificar picos recém aparecidos. JbMan hidrolisou sequencialmente Man8GlcNAc2 (Painel C) até que apenas Man1GlcNAc2 fosse obtido após incubação de uma noite (Painel D). A hidrólise de uma solução de substrato contendo Man8GlcNAc2 e ManP- Man8GlcNAc2 (Painel E) foi mais complexa. Tanto as atividades de desmanosilação, quanto de retirada de cap (uncapping) de fosfato eram responsáveis pelo aparecimento do pico rápido no lado esquerdo do eletroferograma quando o substrato era incubado com JbMan durante 2 horas (Painel F). A carga extra de um fosfato terminal juntamente com a reação de desmanosilação eram responsáveis pelo aparecimento de picos apresentando mobilidade eletroforética rápida. Todavia, após uma noite de incubação, apenas um pico identificado como Man1GlcNAc2 foi observado (Painel G). A atividade fosfatase presente na preparação comercial de JbMan é responsável por esse resultado.

[000152] A digestão de açúcares MNN4 com JbMan foi repetida com uma solução de substrato contendo ManP-Man8GlcNAc2 e (ManP)2- Man8GlcNAc2 (Painel H). Após incubação durante 2 horas, um pico retirada de cap (uncapped) em potencial apareceu e é indicado com "P- Mx" e "P2Mx" no painel I. Na região de mobilidade eletroforética rápida, a resolução de pico é menor e é possível que estruturas ausente de caps (uncapped) mono- e difosforiladas, por exemplo, P-Man4GlcNAc2 e P2-Man6GlcNac2, corram juntas. O resultado após digestão de uma noite sugere uma desmanosilação adicional. Os picos indicados com P- My e P2-My no painel J poderiam ser P-Man3GlcNAc2 e P2- Man5GlcNAc2, mas Man1GlcNAc2, Man2GlcNAc2 e Man3GlcNAc2 neutros também podem ser observados no painel J. Como nenhum Man8GlcNAc2 estava presente nas soluções de substrato, esses picos são o resultado de uma atividade fosfatase contaminante em potencial e corte adicional de manose.

[000153] Para identificar os picos ausentes de cap (uncapped) no painel J, a mistura de reação foi tratada com fosfatase de intestino de novilho (CIP). O tratamento dos glicanos ausentes de cap (uncapped) (contendo, portanto, um fosfato terminal) resultou em oligossacarídeos neutros que corriam muito mais lentamente e que apareciam mais à direita no eletroferograma. De fato, Man3GlcNAc2 a Man6GlcNac2 aparecem no painel K. Embora a atividade fosse prejudicada pela presença de atividade fosfatase na preparação comercial de JbMan, os dados aparentados revelam que estruturas completamente desmanosiladas e de fosfato ausente de cap (uncapped) (isto é, P- Man3GlcNAc2 e P2-Man5GlcNAc2) podem ser obtidas quando se tratam açúcares MNN4 marcados com APTS com JbMan.

[000154] A atividade de desmanosilação e retirada de cap (uncapping) do fosfato também é observada com YlAMS1, conforme mostrado na FIG. 6. YlAMS1 pode hidrolisar completamente de Man8GlcNAc2 a Man1GlcNAc2 (Painel C). A incubação de YlAMS1 com uma solução de substrato contendo Man8GlcNAc2 e ManP-Man8GlcNAc2 (Painel D) fornece um produto com uma mobilidade eletroforética rápida, provavelmente um glicano de fosfato ausente de cap (uncapped) (Painel E). Uma série de N-glicanos ausentes de cap (uncapped) foram observados quando a reação foi repetida com uma amostra de YlAMS1 diluída usando uma incubação de 2 horas (Painel F). A presença de glicanos de fosfato ausente de cap (uncapped) foi confirmada por tratamento da mistura de reação com CIP, fornecendo uma série de N- glicanos neutros (Painel G). Assim, YlAMS1 pode retirar o cap (uncap) (ManP)2-Man8GlcNAc2 conforme observado no painel I, mas ainda não está claro que produto é formado, P2- Man8GlcNAc2 ou um glicano de manose cortada adicional.

EXEMPLO 6

[000155] Desmanosilação e retirada de cap (uncapping) de fosfato de glicoproteínas expressadas em uma cepa de Yarrowia lypolytica com grau mais elevado de N-glicanos fosforilados com GH38 α-manosidases

[000156] A α-glucosidase lisossomal humana huGAA foi expressada em Y. lipolytica cepa OXYY1589 para fornecer uma glicoproteína com um alto grau de estruturas N-glicano fosforiladas. A huGAA foi purificada conforme descrito no Exemplo 3.

[000157] α-Manosidase de feijão-de-porco (JbMan) foi adicionada a uma solução de huGAA em 100 mM de acetato de amônio, pH 5,0 com 2 mM de CaCl2. A mistura de reação foi incubada durante uma noite à temperatura ambiente. Os N-glicanos foram liberados com PNGaseF, marcados com APTS e subsequentemente analisados em DSA-FACE, essencialmente conforme descrito em Laroy, et al., Nature Protocols, 1:397-405 (2006). Os perfis de N-glicanos antes e depois do tratamento com α-1,2-manosidase são mostrados na FIG. 7. A mistura de N- glicanos liberada de huGAA purificada era composta principalmente por ManP-Man8GlcNAc2 e (ManP) 2-Man8GlcNAc2 (Painel B). Um pico correndo ligeiramente mais rápido que ManP-Man8GlcNAc2 foi atribuído a ManP-Man7GlcNAc2. Apenas quantidades muito pequenas de Man8GlcNAc2 e Man7GlcNAc2 estavam presentes. Como JbMan é uma glicoproteína, uma amostra de controle é apresentada no paienl C para se poder corrigir quanto a N-glicanos específicos de feijão-de-porco. No painel D, apresentam-se os N-glicanos obtidos após a incubação de huGAA com JbMan. Os picos correspondentes a ManP-Man8GlcNAc2 e (ManP)2-Man8GlcNAc2 não estavam mais presentes. Ao invés, inúmeros picos apareceram no lado esquerdo do eletroferograma (potencialmente N-glicanos de fosfato ausente de cap (uncapped)) juntamente com Man1GlcNAc2. Estes resultaram principalmente da atividade fosfatase presente na preparação comercial de JbMan e da desmanosilação adicional dos N-glicanos neutros obtidos.

EXEMPLO 7

[000158] Retirada de cap (uncapping) e desmanosilação de α- glucosidase humana recombinante (huGAA) com CcMan5 e CcMan4

[000159] Ácidos nucleicos que codificam manosidase 4 de Cellulosimicrobium cellulans (CcMan4) e manosidase 5 de Cellulosimicrobium cellulans (CcMan5) foram clonados no vetor pLSAH36, que contém uma sequência de sinal DsbA e resulta na expressão de uma proteína com uma etiqueta HIS N-terminal. As sequências de nucleotídios do quadro de leitura aberta de DsbA- CcMan5 e DsbA-CcMan4 são apresentadas nas FIGs. 8 e 9, respectivamente. As proteínas foram expressadas em células de E.coli B21, e proteínas residindo no periplasma foram isoladas e purificadas usando uma coluna Talon. Uma representação gráfica dos plasmídios pLSAHCcMan5 e pLSAHCcMan4 é dada na FIG. 10.

[000160] Uma série de experimentos de retirada de cap (uncapping) com CcMan5 e desmanosilação com CcMan4 foram realizados com bateladas de 100 μg de huGAA purificada conforme descrito no Exemplo 3. Trinta (30) μL de huGAA (3,7 mg/mL em 25 mM de tampão fosfato, pH 6,0, com 100 mM de manitol) foram adicionados a 46 μL de tampão HEPES a 100 mM, pH 7,0, com 3 mM de CaCl2. Em um experimento (chamado de huGAA_CcMan4), usou-se uma razão de peso:peso (p:p) de 100:1 de huGAA:CcMan4, em que 14 μL de CcMan4 (80 μg/mL formulados em PBS) foram adicionados à solução de huGAA. Em outro experimento (chamado de huGAA_CcMan5), usou-se uma razão p:p de 100:2 de huGAA:CcMan5, emq ue 14 μL de CcMan5 (154 μg/mL formulados em PBS) foram adicionados à solução de huGAA. Em um experimento combinado (chamado de huGAA_CcMan4/5), usou-se uma razão p:p de 100:2:1 de huGAA:CcMan5:CcMan4, em que 14 μL de CcMan5 e 14 μL de CcMan4 foram adicionados a 30 μL de huGAA e 32 μL de tampão HEPES a 100 mM, pH 7,0, com 3 mM de CaCl2. Em um experimento de controle (huGAA_controle), 10 μL de huGAA foram diluídos com 20 μL de tampão HEPES a 100 mM, pH 7,0, com 3 mM de CaCl2. Após incubar todas as amostras durante 16 horas a 30°C, as amostras foram mantidas a 4°C até serem usadas.

[000161] Dois (2) μL de cada amostra foram usados para a análise de N-glicanos conforme descrito no Exemplo 6. Os eletroferogramas DSA- FACE das amostras tratadas com huGAA são apresentados na FIG. 11. O tratamento com CcMan4 resultou na desmanosilação completa de ManP-Man8GlcNAc2 e (ManP)2-Man8GlcNAc2 com a formação dos produtos ManP-Man5GlcNAc2, ManP-Man6GlcNAc2 e (ManP) 2- Man6GlcNAc2 (FIG. 11, terceiro painel). Sob as condições de reação acima, a retirada do cap de fosfato (uncapping) com CcMan5 foi completa para o ManP-Man8GlcNAc2 N-glicano com a formação de P- Man8GlcNAc2. O N-glicano (ManP)2-Man8GlcNAc2 difosforilado foi hidrolisado no P2-Man8GlcNAc2 completamente ausente de cap (uncapped), mas também se observou um pico que corria mais lentamente com uma altura de pico comparável, que correspondia a (ManP)-Man8-(P)GlcNAc2 parcialmente ausente de cap (uncapped) (potencialmente com o fosfato ausente de cap (uncapped) no braço α- 1,6 e um fosfato operculado (capped) no braço α-1,3 do N-glicano) (FIG. 11, quarto painel). huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada foi obtida após tratamento com CcMan5 e CcMan4, e resultou em um perfil de N-glicanos com P2-Man6GlcNAc2, (ManP)-Man6-(P)GlcNAc2 e P-Man5GlcNAc2. Foram observados picos menores correspondendo a Man5 e P-Man6GlcNAc2, P-Man7GlcNAc2, ManP-Man7GlcNAc2 (estes últimos N-glicanos fosforilados potencialmente com o braço α-1,3 fosforilado) (FIG. 11, quinto painel). Uma representação esquemática dos N-glicanos ausentes de cap (uncapped) é mostrada na FIG. 12 (B).

[000162] Outro experimento de retirada de cap (uncapping) e desmanosilação com CcMan5/CcMan4 foi realizado com huGAA da mesma batelada de purificação. O experimento foi realizado essencialmente conforme acima descrito, exceto que o tampão de formulação para huGAA era HEPES a 100 mM, pH 7,0, com 2 mM de CaCl2 e 100 mM de manitol (em vez de 25 mM de tampão fosfato, pH 6,0, com 100 mM de manitol). Usou-se uma razão p:p de 100:3:0,5 para huGAA:CcMan5:CcMan4. A reação foi incubada a 37°C durante 24 horas. Uma amostra de α-glucosidase huaman comercialmente disponível, Myozyme® (alglucosidase alfa, Genzima), foi tratada sob condições idênticas com CcMan4 a uma razão p:p de 100:0,5 para Myozyme:CcMan4. A análise de N-glicanos dessas amostras foi realizada conforme acima discutido. O perfil de N-glicanos para huGAA purificada dessa maneira e tratada com CcMan5 e CcMan4 foi similar à apresentada na FIG. 11. Os eletroferogramas DSA-FACE para Myozyme® tratada com CcMan4 são apresentados na FIG. 13.

[000163] Para seguir o processamento intracelular de huGAA (veja o exemplo 10), realizou-se um experimento de retirada de cap (uncapping) e desmanosilação com CcMan5/CcMan4 com huGAA de uma batelada de purificação diferente. A purificação foi realizada sob condições similares às acima descritas, novamente usando 100 mM de HEPES, pH 7,0, com 2 mM de CaCl2 e 100 mM de manitol como o tampão de formulação de huGAA. A retirada do cap (uncapping) e desmanosilação foram realizadas a uma razão p:p de 100:3:0,5 para huGAA:CcMan5:CcMan4, e a mistura de reação foi incubada durante 24 horas a 30°C. Os perfis de N-glicanos são mostrados na FIG. 14. Neste experimento, os N-glicanos defosforilados P2-Man6GlcNAc2 e (ManP)-Man6-(P)GlcNAc2 foram parcialmente desfosforilados em P- Man6GlcNAc2, (ManP)-Man6GlcNAc2, respectivamente. A atividade fosfatase foi detectada na amostra de huGAA usando o substrato de fosfatase genérico paranitrofenil-fosfato (PNPP) em tampão HEPES a 100 mM, pH 7,5, com 1 mM de MgCl2.

EXEMPLO 8 Retirada de cap (uncapping) e desmanosilação de huGAA recombinante com α-manosidase de feijão-de-porco

[000164] Os experimentos de retirada de cap (uncapping) e desmanosilação do Exemplo 6 foram repetidos após a suspensão em sulfato de amônio de JbMan ter sido adicionalmente purificada por filtração em gel através de uma coluna Superdex 200 para remover atividades fosfatase contaminantes.

[000165] Em um experimento chamado de huGAA_JbMan, usou-se uma razão p:p de 100:15 de huGAAJbMan. Dez (10) μL de JbMan (1,5 mg/mL em PBS) foram adicionados a uma solução contendo trinta (30) μL de huGAA (3,7 mg/mL em 25 mM de tampão fosfato, pH 6,0, com 100 mM de manitol) e 50 μL de tampão acetato de sódio a 100 mM, pH 5,0. A amostra de controle (huGAA_controle) continha huGAA, mas nenhum JbMan. Após 16 horas de incubação a 30°C, as amostras foram mantidas a 4°C até serem posteriiormente usadas. Para a análise de N- glicanos, 2 μL de cada amostra foram usados para liberar e marcar os N-glicanos conforme descrito no Exemplo 6. Os eletroferogramas DSA- FACE dos N-glicanos da huGAA tratada com JbMan são apresentados na FIG. 15. O tratamento com JbMan resultou na retirada do cap (uncapping) e desmanosilação parcial de ManP-Man8GlcNAc2 e (ManP)2-Man8GlcNAc2 na huGAA, com a formação principalmente de P-Man5GlcNAc2 e (ManP)-Man6-(P)GlcNAc2. Este último N-glicano corre juntamente com P-Man5GlcNAc2 no eletroferograma. Uma pequena quantidade de P2-Man6GlcNAc2 completamente ausente de cap (uncapped) também está presente. Um pico corrente mais lentamente do que P-Man5GlcNAc2 pode ser o Man3GlcNAc2 neutro. P2- Man6GlcNAc2 e P-Man4GlcNAc2 não são adicionalmente desmanosilados por JbMan (FIG. 15, terceiro painel).

[000166] Um segundo experimento de retirada de cap (uncapping) e desmanosilação com JbMan foi realizado com huGAA da mesma batelada de purificação. O experimento foi realizado essencialmente conforme descrito acima, 100 mM de acetato de sódio, pH 5,0, com 1 mM de ZnCl2 e 100 mM de manitol como o tampão de formulação de huGAA. Usou-se uma razão p:p de 100:10 para huGAA:JbMan. A reação foi incubada a 37°C durante 24 horas. O perfil de N-glicanos dessas amostras após tratamento com JbMan era similar ao perfil de N- glicanos mostrado na FIG. 15.

[000167] Para seguir o processamento intracelular de huGAA (veja o Exemplo 10), um experimento de retirada de cap (uncapping) e desmanosilação com JbMan foi realizado com huGAA de uma batelada de purificação diferente. Usaram-se condições de reação similares às acima descritas. O tampão de formulação de huGAA usado foi 100 mM de acetato de sódio, pH 5,0, com 1 mM de ZnCl2 e 100 mM de manitol, usou-se uma razão p:p de 100:10 para huGAA:JbMan, e a mistura de reação foi incubada durante 24 horas a 30°C. Os perfis de N-glicanos são mostrados na FIG. 16. O N-glicano difosforilado P2-Man6GlcNAc2 não é observado no eletroferograma. Devido à presença de atividade fosfatase na amostra de huGAA, ocorreu desfosforilação parcial, resultando na presença de quantidades relativamente elevadas de P- Man6GlcNAc2 e ManP-Man6GlcNAc2 monofosforilados, juntamente com os N-glicanos neutros Man3GlcNAc2 em Man6GlcNAc2.

EXEMPLO 9 Captação de huGAA recombinante em fibroblastos Pompe

[000168] As huGAA e Myozyme® ausente de caps (uncapped) e desmanosiladas (não tratada e tratada com CcMan4) dos Exemplos 7 e 8 foram usadas nos experimentos de captação celular. As atividades enzimáticas específicas de huGAA operculada (capped) ou huGAA tratada com CcMan5 (huGAA_CcMan5), Ccman4 (huGAA_CcMan4), uma combinação de CcMan4 e CcMan5 (huGAA_CcMan4/5) ou manosidase de feijão-de-porco (huGAA_JBMan) (veja os Exemplos 7 e 8) foram testadas usando o ensaio 4-MUG. A clivagem do substrato 4- MUG por uma glucosidase leva à geração do produto fluorogênico 4- MU, que pode ser visualizado ou detectado por irradiação com luz UV. Veja o Exemplo 3. A atividade de huGAA foi comparada à de Myozyme®. As enzimas foram diluídas em três concentrações diferentes (125 ng/mL, 62,5 ng/mL e 31,25 ng/mL) em tampão acetato de sódio a 100 mM, pH 4,0, contendo 0,1% de BSA (tampão de reação), e 50 μL de cada diluição foram adicionados a uma placa de 96 poços em triplicata. O substrato 4-MUG (Sigma) foi diluído a 4 mM em tampão de reação, e 50 μL do substrato diluído foram adicionados a cada poço. A reação enzimática foi incubada durante 60 min a 37°C seguido pela adição de 100 μL de sal EDTA-Na2 a 150 mM, pH 11,5, para finalizar a reação. A fluorescência foi medida a uma excitação de 360/40 nm e uma emissão de 460/40 nm. Uma curva padrão com 4-metilumbeliferona (4- MU) foi medida para calcular a atividade específica. A atividade das várias enzimas foi relatada como U/mg, em que 1 unidade é definida como a quantidade de enzima que catalisa a hidrólise de 1 nmol de substrato por hora a 2 mM de concentração de substrato em tampão acetato de sódio a 100 mM, pH 4,0 + 0,1% de BSA. A atividade específica de cada uma das enzimas estava em torno de 200 x 103 U/mg.

[000169] A captação de huGAA tratada com CcMan5 (huGAA_CcMan5), Ccman4 (huGAA_CcMan4), uma combinação de CcMan4 e CcMan5 (huGAA_CcMan4/5) ou manosidase de feijão-de- porco foi avaliada em fibroblastos GM00248, uma linhagem celular de fibroblastos Pompe humanos (Coriell Cell Repository, Camden, NJ). Os fibroblastos GM00248 são deficientes em atividade alfa glucosidase ácida (0,27% do normal) e não têm níveis detectáveis de mRNA ou proteína de GAA. Os fibroblastos GM00248 foram semeados e cultivados até a confluência em Meio Essencial Mínimo (MEM, Invitrogen) contendo sais de Earle e aminoácidos não essenciais suplementados com 15% de FCS e 2 mM de glutamina. Um dias antes da administração das enzimas, as células foram semeadas em placas de 24 poços em meio F10 de Ham suplementado com 5% de FCS termicamente inativada (30 min a 56°C).

[000170] No dia do experimento, huGAA operculada (capped) e huGAA ausente de cap (uncapped) foram diluídas no meio de captação a várias atividades de enzima seguido por filtração através de um filtro de 0,22 μm. A atividade de cada diluição de enzima no meio de captação foi medida novamente usando o ensaio 4-MUG para determinar a atividade de enzima real que foi adicionada às células.

[000171] Os fibroblastos GM00248 for a incubados com as enzimas durante 16 horas, lavados duas vezes com PBS gelado e, então, lisados com 0,5 mL de PBS + 0,5% de Triton X 100 (30 min, 4°C) suplementados com inibidores de protease. Os lisados celulares foram centrifugados a 10,000 x g para remover detritos celulares. A atividade intracelular de huGAA foi medida usando o ensaio de atividade 4-MUG conforme acima descrito. As concentrações de proteínas foram determinadas pelo método de ácido bicinconínico (kit microBCA, Pierce) segundo o protocolo do fabricante. A atividade intracelular de huGAA é expressa como unidades por mg de proteína total (U/mg).

[000172] A FIG. 17 mostra a atividade intracelular de huGAA nos fibroblastos Pompe humanos GM00248. huGAA operculada (capped) que contém uma mistura de ManP-Man8GlcNAc2 e (ManP)2- Man8GlcNAc2 N-glicanos (veja a FIG. 11, segundo painel) não entrou nas células. A atividade intracelular de células tratadas com huGAA operculada (capped) foi similar à de células não tratadas (dados não mostrados). HuGAA_CcMan4, que é completamente desmanosilada (veja a FIG. 11, terceiro painel), também não mostrou nenhuma captação em fibroblastos Pompe. Embora o tratamento com CcMan5 resultasse na formação de P-Man8GlcNAc2 ausente de cap (uncapped) e monofosforilado e P2-Man8GlcNAc2 completamente ausente de cap (uncapped) e difosforilado, nenhuma captação celular foi observada na faixa de doses testadas (FIG. 17). Observou-se uma captação celular dependente da dose para huGAA que era huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada com a combinação de CcMan4 e CcMan5 (huGAA_CcMan4/5) ou com manosidase de feijão-de-porco (huGAA_JBMan). A atividade intracelular de huGAA tratada com CcMan4/5 ou JbMan atingiu um nível de platô em cerca de 500 - 1,000 U/mL, ao passo que a atividade intracelular de Myozyme® não atingiu um platô a 2,500 U/mL. huGAA de fosfato ausente de cap (uncapped) e desmanosilada foi captada aproximadamente 2,5 vezes mais eficientemente do que Myozyme®.

[000173] Realizou-se um segundo conjunto de experimentos para investigar se a captação era devida à ligação ao receptor de manose-6- fosfato (M6P). Para esses experimentos, huGAA da mesma batelada de purificação usada nos experimentos acima foi tratada com CcMan4 e CcMan5 manosidases para retirar o cap (uncapping) os glicanos ligados a manose-1-fosfato-6-manose conforme descrito no Exemplo 7 ou com manosidase de feijão-de-porco conforme descrito no Exemplo 8. Myozyme® foi usada como uma referência. Para investigar o efeito de α-1,2 manoses terminais sobre a eficiência de captação de huGAA, Myozyme® foi tratada com CcMan4 manosidase. A atividade específica das enzimas foi determinada usando o ensaio 4-MUG conforme acima descrito. O ensaio de captação foi realizado conforme acima descrito. As enzimas foi diluídas a atividades de enzima iguais no meio de captação, filtradas, e várias doses foi adicionadas aos fibroblastos GM00248 com ou sem a presença de 5 mM de M6P (Sigma) e incubadas durante 16 horas. Cada experimento de captação celular foi realizado em duplicata. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS gelado, lisadas com 0,5 mL de PBS + 0,5% de Triton X 100 suplementados com inibidores de protease e ensaiadas quanto à atividade de huGAA intracelular usando o ensaio 4-MUG.

[000174] A FIG. 18 mostra a captação de enzimas huGAA em fibroblastos GM00248. O tratamento de Myozyme® com CcMan4 não alterou o perfil de N-glicanos da Myozyme® (veja a FIG. 13, terceiro painel), nem alterou sua eficiência de captação. A captação de Myozyme® foi inibida pela adição de M6P livre. Os resultados na FIG. 18 mostram uma captação dependente da dose de huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada (huGAA_CcMan4/5, huGAA_JBMan), que é inibida pela adição de M6P. Esses resultados indicam que a captação de huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada é mediada pelo receptor de M6P.

EXEMPLO 10 Processamento de huGAA nos lisossomos de fibroblastos Pompe.

[000175] HuGAA é produzida no retículo endoplasmático como um precursor de 110 kDa. Ela sofre processamento de N-glicano no aparelho de Golgi apparatus e é, além disso, proteoliticamente processada nos lisossomos em proteínas ativas de 76 kDa e 70kDa, mediante uma forma molecular intermediária de 95 kDa. As proteínas ativas são responsáveis pela degradação de seu substrato glicogênio natural. Nos experimentos a seguir, investigou-se o processamento intracelular de huGAA recombinante purificada, produzida como uma proteína de 110 kDa em Y. lipolytica. Para esses experimentos, huGAA de uma batelada de purificação diferente da usada no Exemplo 9, e em que o tampão de formulação foi trocado para HEPES a 100 mM, pH 7, com 2 mM de CaCl2 e 100 mM de manitol (veja o Exemplo 7), foi tratada com a combinação CcMan4 e CcMan5 ou com manosidase de feijão- de-porco conforme descrito no Exemplo 7. A atividade específica das enzimas ausente de caps (uncapped) foi determinada usando-se o ensaio 4-MUG. Um dia antes do experimento, fibroblastos GM00248 foram semeados em placas de 6 poços a uma densidade de 5 x 105 células/poço em meio de captação conforme acima descrito. No dia seguinte, os fibroblastos foram incubadas com 1,000 U/mL de huGAA_CcMan4/5 ou huGAA_JBMan em 2 mL de meio de captação durante 14 horas ou durante 46 horas. Como referência, as células foram incubadas com Myozyme®; e as células que não foram incubadas com uma enzima foram usadas como um controle negativo. Cada experimento de captação celular foi realizado em duplicata. Após a incubação, os fibroblastos GM00248 foram lavados com PBS gelado e colhidos por tripsinização (0,05% de tripsina com 0,53 mM de EDTA). As células foram centrifugadas e lisadas em 0,5 mL de PBS + 0,5% de TritonX100, suplementado com inibidores de protease. Os lisados celulares foram centrifugados para remover detritos celulares e ensaiados quanto à atividade intracelular de GAA com o ensaio 4-MUG conforme acima descrito. A concentração de proteína foi determinada com o método BCA.

[000176] A FIG. 19 mostra a atividade intracelular de huGAA. Embora huGAA_Ccman4/5 fosse parcialmente desfosforilada em P- Man6GlcNA2 e (ManP)-Man6GlcNac2 (FIG. 14, terceiro painel), a enzima foi captada 1,8 vezes melhor que Myozyme® em ambos os tempos de incubação testados. HuGAA_JBMan também foi captada melhor que Myozyme®, mas era menos eficiente em comparação com huGAA_CcMan4/5, provavelmente devido à ausência do N-glicano difosforilado P2-Man6GlcNAc2 (FIG. 16, terceiro painel).

[000177] A finalidade desse experimento foi testar se huGAA captada pelos fibroblastos era processada nas formas ativas de 76 kDa e 70kDa. Consequentemente, as amostras de células foram precipitadas pelo método de ácido tricloroacético (TCA)/ desoxicolato (DOC). As amostras (500 μL, contendo 160 μg de proteína) foram misturadas com 50 μL de DOC a 0,5% e incubadas em gelo durante 30 minutos. Após adicionar TCA a 100% (100 μL) para se obter uma concentração final de TCA de 15%, as amostras foram misturadas e precipitadas durante uma noite a -20°C. O precipitado foi centrifugado a 13,000 rpm em uma microcentrífuga durante 30 min, seguido por aspiração de TCA da pelota. A pelota foi lavada com 500 - 700 μL de acetona gelada, misturada e centrifugada a 13,000 rpm. A pelota foi secada durante 10 min a 50°C, seguido por ressolubilização em 1x tampão de amostra NuPAGE® LDS contendo agente redutor de amostra NuPAGE®. Após ebulição da amostra durante 3 min a 100°C, 20 μg de proteína (10 μL) foram carregados em um gel NuPAGE® Bis-Tris a 4 - 12% (Invitrogen) com 1x tampão de operação MOPS SDS contendo 500 μL de antioxidante NuPAGE®. Myozyme® (50 ng) foi carregada no gel como uma referência. As amostras foram transferidas durante uma noite em uma membrana de nitrocelulose, e a huGAA intracelular foi detectada usando-se soro anti-huGAA de coelho policlonal (diluição a 1/2,000) como anticorpo primário e um anticorpo conjugado a peroxidase anti- IgG de coelho de cabra (diluição a 1/5,000, Sigma) como um anticorpo secundário. Após a lavagem da membrana com PBS/Tween, a membrana foi relevada usando-se o reagente de detecção de Western blotting ECL (GeHealthcare). Um período de incubação de 14 h com as enzimas ausente de cap (uncapped) e com Myozyme® resultou na presença principalmente da proteína precursora. Nas células tratadas com huGAA_Ccman4/5, observou-se uma pequena quantidade da proteína de 76 kDa. Após a incubação de 46 h, as enzimas ausente de caps (uncapped) foram processadas no polipeptídio ativo de 76 kDa. Myozyme® também é processada no polipeptídio ativo, mas as bandas foram menos intensas.

EXEMPLO 11 Retirada de cap (uncapping) e desmanosilação de huGAA recombinante com CcMan5 e α-manosidase de feijão-de-porco

[000178] huGAA recombinante foi ausente de cap (uncapped) e desmanosilada com CcMan5 e JBMan a uma razão p:p de 100:5:10 para huGAA:CcMan5:JbMan. A uma solução de 1,08 mL de huGAA (4,8 mg/mL em 10 mM de tampão fosfato de sódio, pH 6,0, com 40 mM de NaCl), adicionaram-se 1,69 mL de CcMan5 (0,154 mg/mL em tampão PBS) e 1,04 mL de JbMan (0,5 mg/mL em tampão PBS). O volume de total foi ajustado em 5,2 mL com 100 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, contendo 2 mM de CaCl2. A mistura de reação foi incubada a 30°C durante 15 horas. A huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada foi purificada usando-se uma coluna de filtração em gel Hiload 16/60 superdex 200 (GE Healthcare) conforme descrito no Exemplo 3.

[000179] Os N-glicanos foram liberados dos 10 μg da huGAA purificada final e marcados conforme descrito no Exemplo 6. O eletroferograma DSA-FACE dos N-glicanos da huGAA tratada tanto com CcMan5, quanto com JbMan é apresentado na FIG. 20. Os principais picos observados após retirada de cap (uncapping) e desmanosilação foram o P2-Man6GlcNAc2 fosforilado duplo e os P- Man4GlcNAc2, P-Man5GlcNAc2 e P-ManGlcNAc2 monofosforilados.

EXEMPLO 12 Captação de huGAA recombinante ausente de cap (uncapped) e desmanosilada com CcMan 5 e JbMan em fibroblastos Pompe

[000180] A captação celular de huGAA ausente de cap (uncapped), desmanosilada e purificada (tratada com JbMan e CcMan5 conforme descrito no Exemplo 11) foi comparada à captação celular de Myozyme® usando a linhagem celular de fibroblasto GM00248 conforme descrito no Exemplo 9.

[000181] A FIG. 21 mostra a atividade intracelular de huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada purificada versus a atividade intracelular de Myozyme®. A quantidade de enzima (expressa como unidades de atividade de enzima) adicionada às células foi convertida em concentração de enzima (expressa como nM) e traçada versus a atividade específica (expressa em U/mg) para os cálculos da Kuptake. Kuptake, e o desvio padrão foi calculado em GraphPrism usando regressão não linear através de 14 pontos de dados (2 pontos de dados por concentração) para huGAA e através de 12 pontos de dados para Myozyme®. Observou-se captação celular dependente da dose para huGAA, atingindo um nível de platô em torno de 25 nM e uma Kuptake de 1,7 ± 0,2 nM, ao passo que a atividade intracelular de Myozyme não atingiu um platô a 200 nM e tem uma Kuptake de 64 ± 5 nM. huGAA ausente de cap (uncapped), desmanosilada produzida em Yarrowia lipolytica foi captada 30 vezes mais eficientemente que Myozyme® em fibroblastos Pompe.

EXEMPLO 13 Processamento de huGAA recombinante ausente de cap (uncapped) e desmanosilada com CcMan 5 e JbMan nos lisossomos de fibroblastos Pompe

[000182] Realizou-se um ensaio de captação celular para determinar se a huGAA produzida em Yarrowia que foi tratada com CcMan5 e JbMan conforme descrito no Exemplo 11 era processada em suas formas maduras nos lisossomos. Um dia antes do experimento, fibroblastos GM00248 foram semeados em uma placa de 6 poços a uma densidade de 3 x 105 células/poço em meio de captação. No dia seguinte, os fibroblastos foram estimulados com 2,000 U/mL de huGAA em 2 mL de meio de captação durante 8 horas ou 24 horas, ou estimulados durante 24 horas (período de "pulso"), então, as células foram lavadas, e 2 mL de meio de crescimento foram adicionados às células para um período de acompanhamento de até 100 horas. Células não tratadas com enzima foram usadas como um controle negativo.

[000183] Após a incubação, as células foram lavadas, e os lisados celulares foram precipitados usando o método DOC/TCA conforme descrito no Exemplo 10 e submetidos a Western blotting. Como uma referência, huGAA purificada (30 ng) foi carregada no gel. As amostras foram transferidas durante uma noite, e a huGAA intracelular foi detectada usando-se soro anti-huGAA de coelho policlonal (diluição a 1/2,000) como um anticorpo primário e um anticorpo conjugado a peroxidase anti-IgG de coelho de cabra (diluição a 1/8,000, Abcam) como um anticorpo secundário. A membrana foi revelada usando-se o reagente de detecção de Western blotting ECL (GeHealthcare).

[000184] Um período de incubação de 8 horas com a enzima ausente de cap (uncapped) e desmanosilada resultou na presença da proteína precursora (110 kDa). Um período de incubação de 24 horas resultou na presença tanto da proteína precursora, quanto da proteína processada (76 kD), ao passo que, após um pulso de 24 horas e um período de acompanhamento de até 100 horas, quase toda a proteína foi processada no polipeptídio ativo de 76 kD. Esses resultados demonstram que a huGAA ausente de cap (uncapped) e desmanosilada foi captada pelos fibroblastos e processada em seus polipeptídios ativos nos lisossomos.

OUTRAS MODALIDADES

[000185] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição precedente pretende ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, que é definido pelo âmbito das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações a seguir.

Claims (12)

1. Método para retirar o cap ("uncapping") de porções de manose-1-fosfo-6-manose e desmanosilar N-glicanos fosforilados em uma glicoproteína, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende: a) o fornecimento da dita glicoproteína com N-glicanos fosforilados contendo a dita porção de manose-1-fosfo-6-manose; e b) o contato da dita glicoproteína com uma manosidase, em que a manosidase como uma única enzima (i) hidrolisa uma porção de manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisa ligações terminais alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose, e em que a manosidase é uma manosidase de feijão-de-porco (Jack bean) (Canavalia ensiformis).

2. Método para desmanosilar N-glicanos fosforilados, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o fornecimento de uma glicoproteína compreendendo N- glicanos fosforilados; e (b) o contato da dita glicoproteína com uma manosidase, em que a manosidase como uma única enzima (i) hidrolisa uma porção de manose-1-fosfo-6-manose em manose-6-fosfato e (ii) hidrolisa ligações terminais alfa-1,2 manose, alfa-1,3 manose e/ou alfa-1,6 manose, e em que a manosidase é uma manosidase de feijão-de-porco (Jack bean) (Canavalia ensiformis).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida manosidase de feijão-de-porco (Jack bean) contém um segmento com a sequência de aminoácidos NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG (SEQ ID NO: 12).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, após as etapas (a) e (b), o contato de uma célula de mamífero, tal como, por exemplo, uma célula humana, com a dita glicoproteína compreendendo os ditos N-glicanos fosforilados desmanosilados, em que, após o dito contato, a dita glicoproteína é transportada para o interior da dita célula de mamífero.

5. Método para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma glicoproteína com um N-glicano fosforilado compreendendo um resíduo de manose terminal ligado por uma ligação alfa 1,2 a um resíduo de manose subjacente, em que a manose subjacente é fosforilada na posição 6, o resíduo fosfato ligado à manose subjacente é ausente de cap ("uncapped"), e a dita glicoproteína não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato na dita célula; (b) desmanosilar a glicoproteína pelo método, como definido na reivindicação 2, para produzir uma glicoproteína desmanosilada, em que a dita glicoproteína, após a dita desmanosilação, se liga substancialmente ao dito receptor de manose-6-fosfato na dita célula; e (c) contatar a dita célula com a dita glicoproteína desmanosilada.

6. Método para converter uma glicoproteína de uma primeira forma que não se liga substancialmente a um receptor de manose-6- fosfato em uma célula de mamífero em uma segunda forma que se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero, em que, na primeira forma, a glicoproteína compreende um ou mais N-glicanos, cada um contendo um ou mais resíduos de manose terminais que estejam ligados na posição 1 a um resíduo de manose subjacente que contenha um resíduo de fosfato na posição 6, e o resíduo fosfato seja ausente de cap ("uncapped"), o método caracterizado pelo fato de que compreende desmanosilar a primeira forma da glicoproteína pelo método, como definido na reivindicação 2.

7. Método para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero, a glicoproteína compreendendo uma porção de manose-1-fosfo-6-manose, em que o resíduo de manose que tem um resíduo de fosfato ligado na posição 6 está ligado a um resíduo de manose terminal na posição 1 do resíduo de manose terminal, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato da célula com a glicoproteína após ter sofrido: (a) retirada do cap ("uncapping") da porção de manose-1- fosfo-6-manose em manose-6-fosfato na glicoproteína; e (b) remoção do resíduo de manose terminal, em que a glicoproteína que sofreu (a) e não (b) ou (b), mas não (a) não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato na célula, em que a glicoproteína que sofreu (a) e (b) se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato na célula, em que as etapas (a) e (b) são catalisadas por uma manosidase de feijão-de-porco (Jack bean) (Canavalia ensiformis).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida manosidase de feijão-de-porco (Jack bean) contém um segmento com a sequência de aminoácidos NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG (SEQ ID NO: 12).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a dita glicoproteína é uma proteína humana.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a dita glicoproteína é uma proteína patogênica, uma proteína lisossomal, um fator de crescimento, uma citocina, uma quimiocina, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, ou uma proteína de fusão.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita proteína lisossomal é uma enzima lisossomal, tal como, por exemplo, uma enzima lisossomal, que é alfa glucosidase ácida ou alfa glucosidase.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a dita glicoproteína está associada a um LSD, tal como, por exemplo, doença de Fabry, mucopolissacaridose I, doença de Farber, doença de Gaucher, GM1- gangliosidose, doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff, doença do ativador de GM2, doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, doença de Niemann-Pick, doença de Scheie, doença de Hunter, doença de Sanfilippo, doença de Morquio, doença de Maroteaux-Lamy, deficiência de hialuronidase, aspartilglucosaminúria, fucosidose, manosidose, doença de Schindler, sialidose tipo 1, doença de Pompe, picnodisostese, lipofuscinose ceroide, doença do armazenamento de éster de colesterol, doença de Wolman, deficiência de sulfatase múltipla, galactossialidose, mucolipidose, cistinose, distúrbio do armazenamento de ácido siálico, doença da retenção de quilomícron com síndrome de Marinesco-Sjogren, síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome de Chediak-Higashi, doença de Danon, ou displasia geleofísica.

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