JP6126804B2 - T細胞受容体のクローニング方法 - Google Patents
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Description
また、T細胞クローンの樹立を含むこれらの方法はTCRレパートリーに偏りを引き起こす可能性があるという懸念が提起されている(非特許文献5および6)。すなわち、T細胞クローンを樹立する工程で、増殖しやすいT細胞クローンが増殖してくるであろうし、PCRを用いた解析については、プライマーにより増幅効率が異なる可能性がある。
[1] 1) 抗原Aに特異的なT細胞を含むT細胞群を、または抗原Aに特異的な1個のT細胞を、T細胞受容体(TCR)遺伝子増幅上有効な条件で刺激する工程;
2)抗原Aに特異的なT細胞を含むT細胞群から、抗原Aに特異的なT細胞を特定して1個ずつ容器へソートする工程;および
3)容器内の1個の活性化された抗原A特異的T細胞をPCRに供して、抗原Aに特異的なTCR遺伝子を増幅する工程
を含む、抗原Aに特異的なTCR遺伝子の製造方法。
[2] さらに、
4)取得したTCRをTCRを発現していないT細胞株に導入し、発現させ、その抗原特異性を検証する工程
を含む、1に記載の製造方法。
[3] すべての工程を10日間以内に行う、[1]または[2]に記載の製造方法。
[4] 工程1)のTCR遺伝子増幅上有効な条件が、少なくともインターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-7(IL-7)、フィトヘマグルチニン(PHA)、ホルボール12-ミリステート13-アセテート( (phorbol 12-myristate 13-acetate、PMA) 、シクロヘキシミド(CHX)、抗CD3抗体、抗CD28抗体、および抗原ペプチドから選択される少なくとも一つの存在下で、細胞群または細胞を8時間〜3日間維持することである、[1]〜[3]のいずれか一に記載の製造方法。
[5] 工程1)のTCR遺伝子増幅上有効な条件が、IL-2またはIL-7およびPHA;抗CD3抗体、抗CD28抗体およびIL-2;抗原ペプチド、抗CD28抗体およびIL-2;PMAおよびCHXの存在下で細胞群または細胞を維持することである、[4]に記載の製造方法。
[6] 工程1)が、T細胞群を刺激するものであり、工程1)、2)および3)が、この順で実施される、[1]〜[5]のいずれか一に記載の製造方法。
[7] 工程2)がフローサイトメトリーまたはチップイムノスポットアッセイ(Immunospot-array assay on a chip、ISAAC)法により実施される、[1]〜[6]のいずれか一に記載の製造方法。
[8] 工程2)が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と抗原A由来抗原ペプチド(p)との複合体を多量体化(典型的には4量体化)したもの(MHC/p四量体)と、抗CD4抗体または抗CD8抗体とを用いてフローサイトメトリーによりソートする工程である、[7]に記載の製造方法。
[9] 工程2)が、抗インターフェロン-γ(IFN-γ)抗体と、抗CD4抗体または抗CD8抗体とを用いてフローサイトメトリーによりソートする工程である、[7]に記載の製造方法。
[10] [1]〜[9]のいずれか一に定義された工程を含み、得られた抗原Aに特異的なTCR遺伝子を別のT細胞に導入して抗原Aに特異的な組換えT細胞を得る工程をさらに含む、組換えT細胞の製造方法。
[11] 抗原AがTCR遺伝子治療により処置可能な疾患または状態に関連する抗原であり、別のT細胞が、当該処置可能な疾患または状態にある対象由来である、[10]に記載の製造方法。
[12] 抗原Aががん関連抗原であり、がん特異的TCR遺伝子、またはがん特異的組換えT細胞が製造される、[1]〜[11]のいずれか一に記載の製造方法。
[13] がんの処置に用いるための、[12]に記載の製造方法。
[14] がんまたは感染症にある対象におけるTCRレパートリーの解析のために行われる、[1]〜[9]のいずれか一に記載の方法。
本発明は培養工程を実質的に含まないように設計することができる。従来の培養工程を含む方法では、培養工程により、細胞集団において増殖が容易なものの割合が拡大され、その結果、偏ったレパートリーの分析がなされる可能性がある。しかしながら、本発明によればそのような問題が低減される。
本発明によれば、出現頻度が比較的低いT細胞クローンのTCR遺伝子であっても、クローニングできる可能性がある。このことは、TCR遺伝子治療に用いる候補TCRを選択する場合等、目的のTCRを選択する場合に有利であろう。
1) 抗原Aに特異的なT細胞を含むT細胞群を、または抗原Aに特異的な1個のT細胞を、T細胞受容体(TCR)遺伝子増幅上有効な条件で刺激する工程;
2) 抗原Aに特異的なT細胞を含むT細胞群から、抗原Aに特異的なT細胞を特定して1個ずつ容器へソートする工程;および
3) 容器内の1個の刺激された抗原A特異的T細胞をPCRに供して、抗原Aに特異的なTCR遺伝子を増幅する工程。
他の条件、例えば、温度、5% CO2雰囲気下等の条件は、T細胞を培養するための通常の条件にしたがえばよい。
健常人であるドナーおよびHLAの分類
ヒトの実験は、富山大学の倫理委員会の承認を得て実施された。すべての対象からインフォームドコンセントを得た。末梢血リンパ球(PBL)を、ヘパリン添加された血液試料からFicoll-Hypaque(Immuno-BioloGical Laboratories)を用いた密度勾配遠心分離により分離した。HLA-A24ハプロタイプ陽性に関するスクリーニングは、PBLを抗HLA-A24抗体(One Lambda)、続いてFITC標識抗マウスIgG抗体(ICN/Cappel)を用いて染色した後、フローサイトメトリーにより解析し、実施した。
HLA-A24拘束AFP357(EYSRRHPQL、配列番号1)およびAFP403(KYIQESQAL、配列番号2)ペプチドワクチンを用いた臨床試験(試験登録:UMIN000003514)を、金沢大学病院で実施した。HCCステージIIIまたはIVの検証された放射線医学的診断を有する患者がこの試験に登録された。その患者にそれぞれ用量あたり3.0mGのAFP由来ペプチドワクチンを与えた。Neo MPS, Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)でGMPグレードとして合成されたペプチドを、不完全フロインドアジュバント(Montanide ISA-51 VG;SEPPIC,フランス、パリ)を含有する乳化溶液として、隔週の皮下免疫処置により投与した。臨床応答を、血清AFP値、ダイナミックCTまたはMRIにより監視し、固形腫瘍における応答評価基準、第1.1版にしたがって評価した。ヘルシンキ宣言にしたがってすべての患者はその試験に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供し、この試験は地域の倫理委員会により承認された(金沢大学医療倫理委員会、第858号)。
RPMI1640およびDMEM培地(Wako Pure Chemical)に10%熱非働化ウシ胎児血清(Biowest)、100μg/mlストレプトマイシン、および100U/mlペニシリンを補い細胞の培養に用いた。ヒトCD8(hCD8)発現TG40細胞(熊本大学のDr.Uenoによりご厚意で提供して頂いた;理研のDr.Saitoから許可を得た)およびT2-A24細胞(愛知県がんセンター研究所のDr.Kuzushimaによりご厚意で提供して頂いた)を、RPMI1640培地中で維持した。PLAT-E(東京大学のDr.Kitamuraによりご厚意で提供して頂いた)およびPhoenix-A(スタンフォード大学のDr.G.Nolanによりご厚意で提供して頂いた)をDMEM培地中で維持した。
IL-2/PHAの場合: 1×106 cells/ mlの細胞懸濁液を、24 wellプレートの各ウェルに1mlずつ播種し(1×106 cells/ well)、刺激した。刺激は、RPMI1640(Wako Pure Chemical)に、10%熱非働化ウシ胎児血清(Biowest)、100μg/mlストレプトマイシン、100U/ml ペニシリン、100 IU/ml Recombinant human IL-2(Peprotech Cat. 200-02)および3 ug/ml PHA(Wako Pure Chemical)を添加した培地で、細胞を37℃、5%CO2の条件下で2日間培養することにより行った。
EBV特異的T細胞を、PE標識HLA-A24/ペプチド四量体で染色した。用いたEBVペプチドの配列は以下の通りである:TYPVLEEMF(BRLF-1 198〜206、配列番号3)、DYNFVKQLF(BMLF-1 320〜328、配列番号4)、IYVLVMLVL(LMP2 222〜230、配列番号5)、RYSIFFCYM(EBNA3A 246〜254、配列番号6)、およびTYSAGIVQI(EBNA3B 217〜225、配列番号7)。AFP特異的T細胞を、PE標識HLA-A24/ペプチド(AFP 357〜365)四量体で染色した(文献13)。すべてのMHC/p四量体はMBLから購入した。FITC標識抗CD8抗体(MBL)、抗CD3ε抗体(eBioscience)、APC標識ストレプトアビジン(eBioscience)、およびPE標識抗CD69抗体(eBioscience)をフローサイトメトリーのために用いた。
IL-2およびPHAにより2日間刺激しておいたPBLをMHC/p四量体にて染色し、MHC/p四量体陽性細胞を、FACSAriaII(Becton Dickinson)を用いて、29.2μgのDynabeads Oligo(dT)(文献25)(Invitrogen)、2.9μlの溶解/結合緩衝液(Invitrogen)および0.29pmolのそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーからなる細胞溶解溶液を含有するMicroAmp(登録商標)反応チューブ(Applied Biosystems)の中にそれぞれ単一細胞ソートした。
alpha-RT(5'-AGCAGTGTTTGGCAGCTCTT-3'、配列番号8)、
beta1-RT(5'-CTGGCAAAAGAAGAATGTGT-3'、配列番号9)、および
beta2-RT(5'-ACACAGATTGGGAGCAGGTA-3'、配列番号10)。
TCRαまたはβ鎖をコードするcDNAをpMXベクター(東京大学のDr.Kitamuraによりご厚意で提供して頂いた)の中に挿入し、次いでレトロウイルスパッケージング細胞株であるPLAT-Eに、FuGENE 6(Roche)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、トランスフェクトされたPLAT-E細胞から組換えレトロウイルスを含む培養上清を集め、polybrene(SiGma-Aldrich)と一緒にhCD8-TG40細胞に添加した。組換えレトロウイルスを感染させたhCD8-TG40細胞にTCRが発現するかは、CD3εの細胞表面への発現およびEBV特異的MHC/p四量体の細胞への結合をフローサイトメトリーにより分析し、観察した。ヒトPBLへの導入に関して、TCRαおよびTCRβ鎖をウイルスのF2A配列(文献16)を介して連結し、pMX-IRES-EGFPベクター(東京大学のDr.Kitamuraによりご厚意で提供して頂いた)の中にクローニングし、Phoenix Aレトロウイルスパッケージング細胞株の中にトランスフェクトした。
クローニングされたTCRα/βペアの抗原特異性を、CD69誘導アッセイおよび/またはMHC/p四量体染色を用いて分析した。簡潔には、TCR発現hCD8-TG40細胞を、HLA-A24+PBLと共に、EBVペプチド(BRLF-1、BMLF-1、LMP2、EBNA3AまたはEBNA3B)のそれぞれの存在下で、5%CO2中で37℃において一夜培養した。培養後、CD69の細胞表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。LMP2に関する抗原特異性の場合は、蛍光標識LMP2特異的HLA-A24四量体を用いて細胞を染色し、その結合をフローサイトメータを用いて分析した。
5×105個のPBLを、製造業者の説明書にしたがってインビトロでCD3CD28 Dynabeads(Invitrogen)および30U/ml組換えhIL-2(Peprotech)で刺激した。2日後、TCRをコードするレトロウイルスの上清を、50μg/ml retronectin(TaKaRa)で一夜コートしておいたプレートに添加した。32℃において1900×g、2時間遠心することにより、その上清中のレトロウイルスをそのプレート上にスピンロードした(spin-loaded)。刺激されたPBLを洗浄し、0.5×106個/mlのこれらの細胞を、レトロウイルスをロードしたプレート中のそれぞれのウェルに添加した。そのプレートを32℃において1000×g、10分間遠心後、5%CO2中で37℃において一夜培養した。次の日(3日目)に、そのPBLを新しく用意したレトロウイルスでコートしたプレートの上に2日目と同様にして移し、5%CO2中で37℃において培養した。10日目に、TCRを導入したPBLをMHC/p四量体染色およびフローサイトメトリーにより適切なTCRの発現に関して評価した。
TCRを導入したPBLの細胞障害性を、カルセインAM(Wako Pure Chemical Industries)放出アッセイを用いて測定した。簡潔には、ペプチドをロードしたT2-A24標的細胞をカルセインAMで37℃、30分間標識した。次いで、その標的細胞および、TCRを導入したPBL(エフェクター細胞)を、示したエフェクター細胞対標的細胞(E/T)比で96ウェルプレートに蒔き、5%CO2を含有する加湿した空気の中で37℃、4時間培養した。培養後、その上清を新しいウェルに移し、FLUOstar OPTIMAマイクロプレートリーダー(BMG LABTECH)を用いて蛍光を測定した。細胞障害性の百分率を、次の式を用いて計算した:%溶解=(F実験-F自然発生)/(F最大-F自然発生)×100。アッセイは3通りで行われた。AFP特異的TCRの場合、TCRを導入したPBLの細胞障害性は51Cr放出アッセイ(文献13)により測定した。
単一抗原特異的ヒトCD8 + T細胞からの抗原特異的TCRの迅速なクローニングおよび機能評価
図1aに、本発明者らが確立した迅速なクローニングおよび機能アッセイシステムの概略を示す。本発明のシステムは、10日以内に単一抗原特異的ヒトT細胞からTCRα/βcDNAペアを得てそれらの抗原特異性を確認することができる。本発明者らはこのシステムをhTEC10システム(10日以内でのヒトTCRの効率的なクローニング(human TCR efficient cloning within 10 days))と名付けた。このシステムでは、ヒト抗原特異的T細胞を抗原特異的MHC/p四量体による染色またはサイトカイン分泌の分析により決定し(図1a左方)、FACSにより単一細胞(single cell)を分離する。TCRのcDNAを単一細胞から増幅し(図1a中程)、発現ベクターの中にクローニングし、TCR陰性T細胞株TG40の中に導入する。次いでそのTCRの抗原特異性を、導入されたTG40を、MHC/p四量体で染色すること(図1a右方)およびCD69の発現を分析することにより評価する。この全プロセスは10日以内に行うことができる。図1bに示してあるように、単一細胞からのTCRの増幅は非常に効率的である。
クローニングされたTCRの抗原特異性を決定するため、本発明者らはまずそのcDNAをTG40細胞に移入し、それらをMHC/p四量体混合物を用いて染色した。TG40上で発現されたTCRの95パーセントが、そのMHC/p四量体混合物に結合した(図2d)。次いで本発明者らは、クローニングしたTCRの抗原ペプチド特異性をCD69誘導アッセイを用いて決定した。本発明者らは、TCRを発現するTG40細胞を、それぞれのEBVペプチドの存在下でHLA-A24+末梢血リンパ球(PBL)と共に培養し、早期リンパ球活性化マーカーであるCD69の発現を調べた。図2eで示したように、TCR E-21に関して、CD69の発現はEBNA3Aペプチドにより有意に増大していたが、他のペプチドでは増大していなかった。TCR F-7の場合、CD69の発現はBRLF-1ペプチドにより有意に増大していたが、他のペプチドでは増大していなかった。これらの結果は、E-21 TCRがEBNA3Aに特異的であり、F-7 TCRはBRLF-1に特異的であることを示している。本発明者らが379種類のTCRの同族抗原をCD69誘導アッセイを用いて分析した際、本発明者らは、EBV特異的TCRの中のBRLF-1、BMLF-1、EBNA3A、EBNA3BおよびLMP-2に特異的なTCRの割合がそれぞれ57.1、21.1、18.8、2.0、および1.1%であることを発見した(表2)。これらのデータは以前の報告(文献10および11)と一致している。
クローニングされたEBウイルス特異的TCRを導入したプライマリーT細胞が同族抗原を提示する標的細胞に対して細胞障害活性を示すかどうかを決定するため、本発明者らは末梢血T細胞を正常なドナーから調製し、BRLF-1特異的Vβ5.1+TCR(Q-22、U-19、F-39)をプライマリーT細胞の中にレトロウイルスにより導入し、BRLF-1ペプチドでパルスしておいたHLA-*2402を遺伝子導入したTAP欠損T2細胞株であるT2-A24細胞(文献12)を殺傷するそれらの能力を比較した。BRLF-1特異的MHC/p四量体は、Q-22、U-19、およびF-39 TCRを導入したT細胞集団においてそれぞれ12.0%、7.6%および1.2%のVβ5.1+細胞に結合した(図2f)。ベクター中のIRES(internal ribosome entry site)を介してTCR遺伝子に連結したEGFPの発現レベルはほとんど同じであった。これは使用したレトロウイルスベクターが類似の導入効率を有していたことを示している(図2fおよび図4a)。次いで本発明者らは、BRLF-1特異的TCRを導入したT細胞の、BRLF-1ペプチドまたはEBNA3AペプチドでパルスしておいたT2-A24細胞に対する細胞障害活性を決定した。図2gにおいて示したように、BRLF-1特異的TCRを導入したT細胞はBRLF-1でパルスしたT2-A24細胞に対して細胞障害性を示したが、EBNA3Aでパルスした細胞には細胞障害性を示さず、これはそれらの細胞障害活性がペプチド特異的であったことを示している。同様に、EBNA3A特異的TCR(E-21)を導入したT細胞はEBNA3AでパルスしたT2-A24細胞に対して細胞障害性を示したが、BRLF-1でパルスした細胞には細胞障害性を示さなかった(図5)。これらの結果は、クローニングされたEBV特異的TCRを導入したプライマリーT細胞は同族抗原を提示する標的細胞に対して細胞障害活性を有することを示しており、これはhTEC10システムがTCR遺伝子療法のためのTCRの候補を同定することができる可能性があることを示している。
hTEC10システムをがん患者に適用するため、本発明者らは腫瘍関連抗原(TAA)特異的TCRを得てそれらの細胞障害性を調べることを望んだ。以前の研究において、肝細胞がん(HCC)を有する患者はα-フェトタンパク質(AFP)特異的CTL応答を有していたことが示されており、いくつかの免疫原性AFP由来CTLエピトープが同定されている(文献13および14)。HCCを有する患者へのAFP由来ペプチドのワクチン接種の有効性を決定するための臨床試験は既に実施されており、何人かの患者が臨床応答を示した。本研究において、本発明者らはまず、AFP由来ペプチドワクチンで処置され、臨床応答を示した2人のHCC患者からPBLを得た。これらの患者の臨床経過を図6aおよびbに示す。B型肝炎ウイルス(HBV)に感染しており門脈に血管侵入した大きなHCC腫瘍を有していた1人目の患者(患者1)に、AFP357およびAFP403ペプチドを隔週で72週間ワクチン接種した。ワクチン接種の後、高い血清AFP値が正常化し、磁気共鳴映像法(MRI)により評価したところ、HCCの大きさが減少し、最終的には消滅した(図6a)。その患者は完全寛解(CR)を示した。HBVに感染しており腹壁および肺にHCCの多数の転移性病巣を有していた2人目の患者(患者2)に、AFP357およびAFP403ペプチドを隔週で88週間の間ワクチン接種した。ワクチン接種の後、高い血清AFP値が減少し、コンピューター断層撮影法(CT)により評価したところ、腹壁のHCCの転移性病巣が消滅した(図6b)。肺転移からの病巣の大きさおよび数は88週間の処置にわたって変化しなかった。この患者は安定疾患(SD)を示した。
本発明者らは、MHC/p四量体を用いる抗原特異的TCRの迅速で直接的なクローニングを示した。しかし、MHC/p四量体の入手可能性は限られている。したがって、本発明者らはインビトロペプチド刺激の後にサイトカイン分泌T細胞からTCRのcDNAをクローニングするための新規のシステムを確立することを試みた。本発明者らは、健常なEBV潜伏性ドナーからPBLを得て、それらをBRLF-1と共に培養してインビトロでBRLF-1特異的CD8+T細胞を拡大した。インビトロ培養の後、PBLをBRLF-1ペプチド有り、または無しで抗CD28抗体の存在下で再刺激した。IFN-γ分泌細胞をIFN-γ分泌アッセイキットを用いて染色した。図7aで示したように、ペプチド刺激により0.61%のCD8+T細胞がIFN-γ陽性であった。次いで本発明者らはT細胞をFACSにより一個ずつ選別し、そのTCRのcDNAを増幅し、それらの配列を分析した。本発明者らは12個のTCRを得て、それらのレパートリーをMHC/p四量体染色法から得られたレパートリーと比較した。その結果、サイトカインの分泌を指標に得られたTCRのレパートリーの83パーセントがMHC/p四量体染色法から得られたレパートリーと同じであり(図7b)、これは本発明のシステムを、MHC/p四量体を用いることなく抗原特異的T細胞を検出するために用いることができることを示唆している。
この研究で、本発明者らは、抗原特異的TCRレパートリーを分析し、がんのTCR遺伝子療法のための見込みのある候補TCRを提供するための、一個の抗原特異的ヒトT細胞に由来するTCRのcDNAの迅速かつ直接的なクローニングおよび機能評価システム(hTEC10システム、図1)を確立した。そのhTEC10システムは以下の理由のため革新的である:
1)一般に用いられるTCRクローニング法が数ヶ月を必要とするのに対し、このシステムは本発明者らが10日以内にTCRを得ることを可能にする。
2)一般に用いられるシステムはその培養条件により結果として偏ったTCRレパートリーをもたらすのに対し、本発明者らはこのシステムを用いて一個のプライマリーT細胞から偏りのないTCRα/βペアを同時に得ることができる。そして、hTEC10システムは主要な、および非常に稀な抗原特異的T細胞クローンの両方からのTCRのcDNAを同定することができる(図2bおよび図5d)。
3)このシステムはTCRの抗原特異性および機能を効率的に分析することを可能にする。
(1) ヒトPBLを、集団のまま刺激剤(IL-2およびPHA、またはIL-7およびPHA)存在下で2日間培養した。次いで、セルソーターによりCD3陽性のT細胞を1個ずつチューブにソートし、RT-PCRを適用した。そして、各チューブからのサンプル10μlを、1%アガロースゲルを用いて電気泳動し、EtBrで染色した。結果を図8に示した。刺激剤存在下での2日間の培養による抗原特異的TCRα/βcDNAペア増幅率は、Il-2およびPHAで刺激した場合が30/30(100%)、IL-7/PHAの場合が30/30(100%)であった。一方、培地のみ(刺激なし)で2日間培養した場合の増幅率は17/30(56.7%)であった。
文献9. Kuzushima, K. et al. Tetramer-assisted identification and characterization of epitopes recognized by HLA A*2402-restricted Epstein-Barr virus-specific CD8+ T cells. Blood 101, 1460-1468 (2003).
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配列番号2:ペプチドワクチンAFP403
配列番号3:EBVペプチドBRLF-1 198〜206
配列番号4:EBVペプチドBMLF-1 320〜328
配列番号5:EBVペプチドLMP2 222〜230
配列番号6:EBVペプチドEBNA3A 246〜254
配列番号7:EBVペプチドEBNA3B 217〜225
配列番号8:PCRプライマーalpha-RT
配列番号9:PCRプライマーbeta1-RT
配列番号10:PCRプライマーbeta2-RT
配列番号11:PCRプライマーAP-1
配列番号12:PCRプライマーalpha-1st
配列番号13:PCRプライマーbeta1-1st
配列番号14:PCRプライマーbeta2-1st
配列番号15:nested PCRプライマーAP-2
配列番号16:nested PCRプライマーalpha-Nest
配列番号17:nested PCRプライマーbeta-Nest
Claims (11)
2) 抗原Aに特異的なT細胞を含むT細胞群から、抗原Aに特異的なT細胞を特定して1個ずつ容器へソートする工程;および
3) 容器内の1個の活性化された抗原A特異的T細胞をPCRに供して、抗原Aに特異的なTCR遺伝子を増幅する工程
を含む、抗原Aに特異的なTCR遺伝子の製造方法であって、
TCR遺伝子増幅上有効な条件が、IL-2またはIL-7およびPHA;抗CD3抗体、抗CD28抗体およびIL-2;抗原ペプチド、抗CD28抗体およびIL-2;またはPMAおよびCHXの存在下で細胞群を維持することあり、
工程1)、2)および3)が、この順で実施される、製造方法。
4) 取得したTCRをTCRを発現していないT細胞株に導入し、発現させ、その抗原特異性を検証する工程
を含む、請求項1に記載の製造方法。
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