JP6508873B2 - 抗原特異的ｔ細胞受容体の取得方法 - Google Patents
抗原特異的ｔ細胞受容体の取得方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の検出およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の取得方法に関する。本発明は、Ｔ細胞の解析、ペプチドワクチン等の医薬品の有効性の解析、病気の診断・治療等の分野で有用である。
主として特定のがんへの適用が検討されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子治療においては、がん患者のリンパ球に、がん抗原特異的なＴＣＲの遺伝子が導入される。遺伝子導入されたリンパ球は大量に培養された後、そのがん患者に戻されるが、腫瘍抗原ペプチドを認識するＴＣＲがリンパ球上に発現しているので、これが腫瘍抗原を提示するがん細胞を認識して特異的に攻撃し、最終的にがん細胞を消滅させることが期待できる。
遺伝子治療に用いるための抗原特異的なＴＣＲの遺伝子を得るには、患者から回収した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のＴ細胞の中からがん抗原を認識できるＴ細胞を特定し、ＴＣＲ遺伝子をクローニングする必要がある。
非特許文献１には、ヒトＴ細胞を抗原およびサイトカインで刺激し、Ｔ細胞株およびＴ細胞クローンを得る方法が記載されている。しかし、該方法では、Ｔ細胞クローンを得るまでに約３ヶ月を要する。また、非特許文献２には、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ断片をキャプチャーして塩基配列を解読し、得られた大量のデータを解析することにより、抗原特異的ＴＣＲのα鎖、β鎖のペアを予測し、それをＴ細胞株に発現させ、抗原特異性の確認を行う旨が記載されている。
一方、本発明者らは、偏りのないＴＣＲレパートリーを分析するだけでなく、抗原特異的ＴＣＲα／βｃＤＮＡペアを回収でき、それらの機能を評価することも可能にする、ＴＣＲクローニングシステムを確立することを試みた。すなわち、抗原特異的なＴ細胞をセルソーターで分離し、１個ずつチューブに入れ、ＲＴ−ＰＣＲにより単一Ｔ細胞からＴＣＲｃＤＮＡを増幅することを試みたが、この方法では増幅の効率が非常に低く、クローニングは困難であることが判明した。次いで、先の方法と同様に抗原特異的なＴ細胞を１個ずつチューブに入れ、Ｔ細胞を刺激剤で刺激した後にＲＴ−ＰＣＲを適用したが、効率の低さは改善されなかった。そこで、Ｔ細胞を集団のまま刺激剤で刺激し、その後セルソーターにより抗原特異的Ｔ細胞を１個ずつチューブにソートした後、ＲＴ−ＰＣＲを適用したところ、驚くべきことに、７〜８割の細胞からＴＣＲｃＤＮＡを回収することができることを見出し、先に特許出願を行った（特許文献１）。
Generation and Maintenance of Cloned HumanT Cell Lines. Current Protocols in Immunology (2002) 7.19.1-7.19.12 Edited by JE Coligan et al
High-throughput identification ofantigen-specific TCRs by TCR gene capture - Nature Medicine 19:1534-1541, 2013
特許文献１には、既知の抗原ペプチドに特異的なＴ細胞を、末梢血リンパ球の中から特定し、フローサイトメータにより単一ソートし、そのＴ細胞より抗原特異的ＴＣＲを取得する方法が開示されている。しかし、その後、該方法では、抗原が未知のＴ細胞、例えば、がん患者のがん組織に浸潤しているＴ細胞のように、抗原が未知のＴ細胞の中からがん細胞に特異的なＴ細胞を同定することは難しいことが判明した。
Ｔ細胞を、ペプチドなどを用いず、がん細胞などの抗原提示細胞自体で直接刺激し、インターフェロンγ等のサイトカイン、あるいは活性化マーカーの発現を指標に、がん細胞などの抗原提示細胞を認識し反応するＴ細胞を同定することで、上記課題が解決することができる。
以下、本発明について詳細に説明する
以下、本発明について詳細に説明する
本発明は、以下を提供する：
［１］１）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群を、抗原提示細胞で刺激する工程；
２）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群から、抗原ａに特異的なＴ細胞を特定して１個ずつ容器へソートする工程；および
３）容器内の１個の活性化された抗原ａ特異的Ｔ細胞をＰＣＲに供して、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を増幅する工程
を含む、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子の製造方法。
［２］さらに、
４）取得したＴＣＲ遺伝子をＴ細胞株に発現させ、その抗原特異性を解析する工程
を含む、１に記載の製造方法。
［３］すべての工程を１０日間以内に行う、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］工程１）の抗原提示細胞が、がん細胞；ウイルス感染細胞；がん抗原タンパク、ウイルスタンパクまたはそれらの断片を人工的に発現させた細胞である［１］〜［３］のいずれか一に記載の製造方法。
［５］抗原提示細胞での刺激が、Ｔ細胞群と抗原提示細胞との共培養である請求項４に記載の製造方法。
［６］工程２）がフローサイトメトリーまたはチップイムノスポットアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ−ａｒｒａｙ ａｓｓａｙ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、ＩＳＡＡＣ）法により実施される、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［７］工程２）が、ＣＤ１３７を用いてフローサイトメトリーによりソートする工程である、［６］に記載の製造方法。
［８］［１］〜［７］のいずれか一に定義された工程を含み、得られた抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を別のＴ細胞に導入して抗原ａに特異的な組換えＴ細胞を得る工程をさらに含む、組換えＴ細胞の製造方法。
［１］１）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群を、抗原提示細胞で刺激する工程；
２）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群から、抗原ａに特異的なＴ細胞を特定して１個ずつ容器へソートする工程；および
３）容器内の１個の活性化された抗原ａ特異的Ｔ細胞をＰＣＲに供して、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を増幅する工程
を含む、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子の製造方法。
［２］さらに、
４）取得したＴＣＲ遺伝子をＴ細胞株に発現させ、その抗原特異性を解析する工程
を含む、１に記載の製造方法。
［３］すべての工程を１０日間以内に行う、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］工程１）の抗原提示細胞が、がん細胞；ウイルス感染細胞；がん抗原タンパク、ウイルスタンパクまたはそれらの断片を人工的に発現させた細胞である［１］〜［３］のいずれか一に記載の製造方法。
［５］抗原提示細胞での刺激が、Ｔ細胞群と抗原提示細胞との共培養である請求項４に記載の製造方法。
［６］工程２）がフローサイトメトリーまたはチップイムノスポットアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ−ａｒｒａｙ ａｓｓａｙ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、ＩＳＡＡＣ）法により実施される、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［７］工程２）が、ＣＤ１３７を用いてフローサイトメトリーによりソートする工程である、［６］に記載の製造方法。
［８］［１］〜［７］のいずれか一に定義された工程を含み、得られた抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を別のＴ細胞に導入して抗原ａに特異的な組換えＴ細胞を得る工程をさらに含む、組換えＴ細胞の製造方法。
本発明により、短期間で、例えば約１０日以内に、抗原が未知のがん組織に浸潤しているようなＴ細胞の中からがん細胞に特異的なＴ細胞を同定し、そのＴＣＲを取得することが容易にできるようになった。
本発明および明細書において「 〜 」で数値範囲を表す場合は、特に記載した場合を除き、その範囲は両端の数値を含む。
また、本発明で細胞の状態に関し、「単独」、「1個」というときは、特に記載した場合を除き、その細胞以外の細胞を含まない環境にあることをいう。
また「集団」、「群」というときは、複数の細胞が存在する環境にあることをいう。
また、本発明で細胞の状態に関し、「単独」、「1個」というときは、特に記載した場合を除き、その細胞以外の細胞を含まない環境にあることをいう。
また「集団」、「群」というときは、複数の細胞が存在する環境にあることをいう。
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の検出およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の取得方法を提供する。より具体的には、下記の工程を含む、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子の製造方法を提供する：
１）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群を抗原提示細胞で刺激する工程；
２）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群から、抗原ａに特異的なＴ細胞を特定して１個ずつ容器へソートする工程；および
３）容器内の１個の活性化された抗原ａ特異的Ｔ細胞をＰＣＲに供して、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を増幅する工程
１）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群を抗原提示細胞で刺激する工程；
２）抗原ａに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群から、抗原ａに特異的なＴ細胞を特定して１個ずつ容器へソートする工程；および
３）容器内の１個の活性化された抗原ａ特異的Ｔ細胞をＰＣＲに供して、抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を増幅する工程
工程１）は、抗原提示細胞で、Ｔ細胞群を刺激する工程である。具体的には、抗原提示細胞として、例えば、がん細胞；ウイルス感染細胞；がん抗原タンパク、ウイルスタンパクまたはそれらの断片を人工的に発現させた細胞から選択される細胞とＴ細胞群とを共培養することである。
共培養は公知の方法に準じて行えばよいが、本発明の一態様においては、Ｔ細胞群と抗原提示細胞を同数の細胞密度、具体的には、例えば１×１０５〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは５×１０５〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで両細胞を懸濁し、適切な培養器を用い、Ｔ細胞を培養するための通常の温度等の条件下で培養すればよい。培養時間は、３時間〜２４時間、好ましく６〜１２時間であればよい。
工程２）は、目的のＴ細胞を特定し、１個ずつＰＣＲのための容器へソートする工程である。この工程は、種々の既存の手段、例えばフローサイトメトリーまたはチップを用いたイムノスポットアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ−ａｒｒａｙ ａｓｓａｙ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、ＩＳＡＡＣ）法により、実施することができる。
本発明の一態様においては、工程２）は、活性化マーカーのＣＤ１３７を指標にしてフローサイトメトリーによりソートすることにより実施される。
工程２）は、ＩＳＡＡＣ法によっても実施することができる。この方法は、基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルが１つのＴ細胞のみが入る大きさであるマイクロウェルアレイを用いて行うものである。マイクロウェルアレイを用いる該方法に関しては、特許４１４８３６７等を参照すればよい。
工程３）は、容器内の１個の活性化された（刺激されたと同義である。）抗原ａ特異的Ｔ細胞をＰＣＲに供して、抗原Ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を増幅する工程である。特定された細胞は、増殖させてからＰＣＲに供してもよいが、１個または数個の細胞を対象としてｃＤＮＡの増幅が行えるＰＣＲの手法が種々知られており、本発明においても、そのような公知の手法を適用することができる。典型的には、まず細胞溶解を行い、続いてｄＴアダプタープライマー（ＲＴ ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒ ２）を用いた逆転写反応によりｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行う。得られたｃＤＮＡは増幅してもよく、またはそのまま、鋳型として使用して、また適切に設計されたプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）を行う。
本発明の一態様においては、工程１）、２）および３）が、この順で実施される。
本発明の方法は、さらに、工程４）として、取得したＴＣＲをＴＣＲを発現していないＴ細胞株に導入し、発現させ、その抗原特異性を検証する工程、を含んでもよい。
本発明の方法により、抗原が未知のＴ細胞群の中からがん細胞などに特異的なＴ細胞を同定することができる。また、本発明方法により得られた抗原ａに特異的なＴＣＲ遺伝子を別のＴ細胞に導入して抗原ａに特異的な組換えＴ細胞を得る工程をさらに含む、組換えＴ細胞の製造方法の実施において、実施時間の短縮を図ることができる。
以下、本発明を実施例により説明する。
以下、本発明を実施例により説明する。
〔方法〕
健常人であるドナーおよびＨＬＡの分類
ヒトの実験は、富山大学の倫理委員会の承認を得て実施された。すべての対象からインフォームドコンセントを得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ヘパリン添加された血液試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｉｍｍｕｎｏ−ＢｉｏｌｏＧｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた密度勾配遠心分離により分離した。ＨＬＡ−Ａ２４ハプロタイプ陽性に関するスクリーニングは、ＰＢＬを抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）、続いてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ）を用いて染色した後、フローサイトメトリーにより解析し、実施した。
健常人であるドナーおよびＨＬＡの分類
ヒトの実験は、富山大学の倫理委員会の承認を得て実施された。すべての対象からインフォームドコンセントを得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ヘパリン添加された血液試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｉｍｍｕｎｏ−ＢｉｏｌｏＧｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた密度勾配遠心分離により分離した。ＨＬＡ−Ａ２４ハプロタイプ陽性に関するスクリーニングは、ＰＢＬを抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）、続いてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ）を用いて染色した後、フローサイトメトリーにより解析し、実施した。
細胞株
ＲＰＭＩ１６４０およびＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に１０％熱非働化ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンを補い細胞の培養に用いた。Ｋ５６２細胞（金沢大学のＤｒ．Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉよりご厚意で提供して頂いた）を、ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａ細胞（スタンフォード大学のＤｒ．Ｇ．Ｎｏｌａｎによりご厚意で提供して頂いた）をＤＭＥＭ培地中で維持した。
ＲＰＭＩ１６４０およびＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に１０％熱非働化ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンを補い細胞の培養に用いた。Ｋ５６２細胞（金沢大学のＤｒ．Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉよりご厚意で提供して頂いた）を、ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａ細胞（スタンフォード大学のＤｒ．Ｇ．Ｎｏｌａｎによりご厚意で提供して頂いた）をＤＭＥＭ培地中で維持した。
人工抗原提示細胞の作製
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子（愛知県がんセンター研究所のＤｒ． Ｋｕｚｕｓｈｉｍａよりご厚意で提供して頂いた）、ヒトＣＤ８０遺伝子（Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入）、ヒトＣＤ１３７Ｌ遺伝子（Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入）をコードするｃＤＮＡをｐＭＸベクター（東京大学のＤｒ． Ｋｉｔａｍｕｒａによいご厚意で提供して頂いた）の中に挿入し、次いでレトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｏｅｎｉｘ−Ａに、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、それぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘ−Ａから組換えレトロウイルスを含む培養上清を集めた。集めたレトロウイルスの上清を、５０μｇ／ｍｌ ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａＫａＲａ）で一夜コートしておいたプレートに一緒に添加した。３２℃において１９００×ｇ、２時間遠心することにより、その上清中のレトロウイルスをそのプレート上にスピンロードした（ｓｐｉｎ−ｌｏａｄｅｄ）。０．２×１０６個／ｍＬのＫ５６２細胞を、レトロウイルスをロードしたプレート中のウェルに添加した。そのプレートを３２℃において１０００×ｇ、１０分間遠心後、５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。培養５日目に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌを発現する細胞をフローサイトメトリーにソーティングし、これを人工抗原提示細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ； ａＡＰＣ）とした。
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子（愛知県がんセンター研究所のＤｒ． Ｋｕｚｕｓｈｉｍａよりご厚意で提供して頂いた）、ヒトＣＤ８０遺伝子（Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入）、ヒトＣＤ１３７Ｌ遺伝子（Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入）をコードするｃＤＮＡをｐＭＸベクター（東京大学のＤｒ． Ｋｉｔａｍｕｒａによいご厚意で提供して頂いた）の中に挿入し、次いでレトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｏｅｎｉｘ−Ａに、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、それぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘ−Ａから組換えレトロウイルスを含む培養上清を集めた。集めたレトロウイルスの上清を、５０μｇ／ｍｌ ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａＫａＲａ）で一夜コートしておいたプレートに一緒に添加した。３２℃において１９００×ｇ、２時間遠心することにより、その上清中のレトロウイルスをそのプレート上にスピンロードした（ｓｐｉｎ−ｌｏａｄｅｄ）。０．２×１０６個／ｍＬのＫ５６２細胞を、レトロウイルスをロードしたプレート中のウェルに添加した。そのプレートを３２℃において１０００×ｇ、１０分間遠心後、５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。培養５日目に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌを発現する細胞をフローサイトメトリーにソーティングし、これを人工抗原提示細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ； ａＡＰＣ）とした。
細胞内に発現する抗原を提示する人工抗原提示細胞の作製
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ （ＥＢ）ウイルス関連抗原であるＢＲＬＦ１をコードするＤＮＡおよび陽性コントロールとしてＢＲＬＦ１ペプチド（ＴＹＰＶＬＥＥＭＥ）をコードするＤＮＡをｐＭＸベクター（東京大学のＤｒ．Ｋｉｔａｍｕｒａによりご厚意で提供して頂いた）の中に挿入し（陰性コントロールとして何も導入いていないｐＭＸベクター）、次いでレトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｏｅｎｉｘ−Ａに、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、それぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘ−Ａから組換えレトロウイルスを含む培養上清を集めた。集めたレトロウイルスの上清を、５０μｇ／ｍＬのｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａＫａＲａ）で一夜コートしておいたプレートに一緒に添加した。３２℃において１９００×ｇ、２時間遠心することにより、その上清中のレトロウイルスをそのプレート上にスピンロードした（ｓｐｉｎ−ｌｏａｄｅｄ）。０．２×１０６個／ｍＬのａＡＰＣを、レトロウイルスをロードしたプレート中のウェルに添加した。そのプレートを３２℃において１０００×ｇ、１０分間遠心後、５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。培養５日目に、ＧＦＰが導入された細胞をそれぞれフローサイトメトリーにソーティングし、これを細胞内に発現する抗原を提示するａＡＰＣとした（図３および図４）。
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ （ＥＢ）ウイルス関連抗原であるＢＲＬＦ１をコードするＤＮＡおよび陽性コントロールとしてＢＲＬＦ１ペプチド（ＴＹＰＶＬＥＥＭＥ）をコードするＤＮＡをｐＭＸベクター（東京大学のＤｒ．Ｋｉｔａｍｕｒａによりご厚意で提供して頂いた）の中に挿入し（陰性コントロールとして何も導入いていないｐＭＸベクター）、次いでレトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｏｅｎｉｘ−Ａに、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、それぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘ−Ａから組換えレトロウイルスを含む培養上清を集めた。集めたレトロウイルスの上清を、５０μｇ／ｍＬのｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａＫａＲａ）で一夜コートしておいたプレートに一緒に添加した。３２℃において１９００×ｇ、２時間遠心することにより、その上清中のレトロウイルスをそのプレート上にスピンロードした（ｓｐｉｎ−ｌｏａｄｅｄ）。０．２×１０６個／ｍＬのａＡＰＣを、レトロウイルスをロードしたプレート中のウェルに添加した。そのプレートを３２℃において１０００×ｇ、１０分間遠心後、５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。培養５日目に、ＧＦＰが導入された細胞をそれぞれフローサイトメトリーにソーティングし、これを細胞内に発現する抗原を提示するａＡＰＣとした（図３および図４）。
細胞内に発現する抗原を提示する人工抗原提示細胞に反応するＴ細胞の検出
ドナーＢ（Ｄｏｎｏｒ Ｂ）の末梢血リンパ球は、１種類のＢＲＬＦ１特異的Ｔ細胞を持つ事が明らかになっている（図３：特許文献１）。従って本システムを評価するために、ドナーＢの末梢血リンパ球から細胞内にＢＲＬＦ１を発現するａＡＰＣ（ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡ）に反応するＴＣＲ遺伝子のクローニングを行い、これが既知のドナーＢ由来のＴＣＲと一致するかを検証した。すなわち、１×１０５ｃｅｌｌｓのドナーＢ由来末梢血リンパ球を１×１０５ｃｅｌｌｓ ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡと９６ウェルプレートで３７℃、８時間共培養した。その後、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１３７陽性細胞を検出した。
ドナーＢ（Ｄｏｎｏｒ Ｂ）の末梢血リンパ球は、１種類のＢＲＬＦ１特異的Ｔ細胞を持つ事が明らかになっている（図３：特許文献１）。従って本システムを評価するために、ドナーＢの末梢血リンパ球から細胞内にＢＲＬＦ１を発現するａＡＰＣ（ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡ）に反応するＴＣＲ遺伝子のクローニングを行い、これが既知のドナーＢ由来のＴＣＲと一致するかを検証した。すなわち、１×１０５ｃｅｌｌｓのドナーＢ由来末梢血リンパ球を１×１０５ｃｅｌｌｓ ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡと９６ウェルプレートで３７℃、８時間共培養した。その後、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１３７陽性細胞を検出した。
Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＴ−ＰＣＲ
ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡとの共培養により活性化された、ＣＤ１３７陽性細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、２９．２μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．９μＬの溶解／結合緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．２９ｐｍｏｌのそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーからなる細胞溶解溶液を含有するＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）反応チューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の中にそれぞれ単一細胞ソートした。
ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡとの共培養により活性化された、ＣＤ１３７陽性細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、２９．２μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．９μＬの溶解／結合緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．２９ｐｍｏｌのそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーからなる細胞溶解溶液を含有するＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）反応チューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の中にそれぞれ単一細胞ソートした。
プライマーの配列は以下の通りであった：
ａｌｐｈａ−ＲＴ（５’−ＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴ−３’、配列番号１）、
ｂｅｔａ１−ＲＴ（５’−ＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴ−３’、配列番号２）、および
ｂｅｔａ２−ＲＴ（５’−ＡＣＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡ−３’、配列番号３）。
ａｌｐｈａ−ＲＴ（５’−ＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴ−３’、配列番号１）、
ｂｅｔａ１−ＲＴ（５’−ＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴ−３’、配列番号２）、および
ｂｅｔａ２−ＲＴ（５’−ＡＣＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡ−３’、配列番号３）。
細胞はチューブの中で溶解した。そして、ｐｏｌｙ−Ａ ＲＮＡをＤｙｎａｂｅａｄ上のＯｌｉｇｏ（ｄＴ）に結合させた。次いでそのＤｙｎａｂｅａｄｓを、４．０Ｕ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．３Ｕ マウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液の中に移した。逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で４０分間行った。ＲＴ反応の後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを８Ｕ 末端デオキシヌクレオチド転移酵素（Ｒｏｃｈｅ）、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４Ｕ マウスＲＮａｓｅ阻害剤、４ｍＭ ＭＧＣｌ２、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、５％ Ｐ−Ｋ緩衝液［１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４および１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．０］を含有する別の溶液の中に移し、３７℃で４０分間保温してｃＤＮＡの３’末端にポリｄＧを付加した。次いでそのＤｙｎａｂｅａｄｓを第１ＰＣＲ反応混合物を含有する新しいＰＣＲチューブの中に移した。第１ＰＣＲを、製造業者の説明書にしたがって、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、および、ＡＰ−１、ａｌｐｈａ−１ｓｔ、ｂｅｔａ１−１ｓｔおよびｂｅｔａ２−１ｓｔプライマーを用いて実施した。
ＡＰ−１（５’−ＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤＮ−３’、配列番号４）、ａｌｐｈａ−１ｓｔ（５’−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＴ−３’、配列番号５）、ｂｅｔａ１−１ｓｔ（５’−ＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＴＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’、配列番号６）、およびｂｅｔａ２−１ｓｔ（５’−ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＴ−３’、配列番号７）を用いたＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で５分間、続いて３０サイクルの９５℃で１５秒間、６０℃で５秒間、および７２℃で１分３０秒間。
結果として得られたＰＣＲ産物を水で１００倍希釈し、その希釈したＰＣＲ産物２μＬを鋳型ＤＮＡとして２３μＬのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応液に添加した。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、アダプタープライマーＡＰ−２（５’−ＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡ−３’、配列番号８）およびＴＣＲαの定常領域に特異的なプライマー（ａｌｐｈａ−Ｎｅｓｔ；５’−ＧＧＴＧＡＡＴＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＴＴ−３’、配列番号９）またはＴＣＲβの定常領域に特異的なプライマー（ｂｅｔａ−Ｎｅｓｔ；５’−ＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＴＧＴ−３’、配列番号１０）を用いたこと以外は、第１ＰＣＲと同様の反応液を用いて実施された。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９８℃で１分間、続いて３５サイクルの９８℃で１５秒間、６０℃で５秒間、および７２℃で４５秒間。
次いでそのＰＣＲ産物を、ａｌｐｈａ−ｎｅｓｔまたはｂｅｔａ−ｎｅｓｔプライマーを用いて、直接塩基配列を決定するか、あるいは、ＰＣＲ産物を発現ベクター中へのサブクローニングした後に塩基配列を決定するか、した。そのＴＣＲレパートリーはＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）（文献１）を用いて分析した。
文献1：Giudicelli,
V., Chaume, D. & Lefranc, M.P. IMGT/V-QUEST, an integrated software program
for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic
Acids Res 32, W435-440 (2004).
文献1：Giudicelli,
V., Chaume, D. & Lefranc, M.P. IMGT/V-QUEST, an integrated software program
for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic
Acids Res 32, W435-440 (2004).
＜結果＞
１×１０５ｃｅｌｌｓのドナーＢ由来末梢血リンパ球を１×１０５ｃｅｌｌｓ ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡと９６ウェルプレートで３７℃、８時間共培養した。その後、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１３７陽性細胞を検出した。検出の結果、ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＣＤ１３７陽性細胞の頻度は０．５％だった。また陰性コントロールでは０．１％、陽性コントロールでは０．８％だった。
１×１０５ｃｅｌｌｓのドナーＢ由来末梢血リンパ球を１×１０５ｃｅｌｌｓ ａＡＰＣ−ＢＲＬＦ１−ＤＮＡと９６ウェルプレートで３７℃、８時間共培養した。その後、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１３７陽性細胞を検出した。検出の結果、ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＣＤ１３７陽性細胞の頻度は０．５％だった。また陰性コントロールでは０．１％、陽性コントロールでは０．８％だった。
次いで、ＦＡＣＳを用いて、１５個のＣＤ１３７陽性細胞を単一細胞分離した。さらに、分離された単一細胞から５’ ＲＡＣＥ法を用いて４ペアのＴＣＲαおよびβのｃＤＮＡを増幅した（図６）。
ＲＴ−ＰＣＲの増幅効率は、α：１７／９０（１８．９％）、β：２６／９０（２８．９％）、ペア率：１７／９０（１８．９％）であった。
ＲＴ−ＰＣＲの増幅効率は、α：１７／９０（１８．９％）、β：２６／９０（２８．９％）、ペア率：１７／９０（１８．９％）であった。
次いで、それぞれのＴＣＲ遺伝子が既知のＴＣＲ遺伝子と一致するかを検証した。その結果、得られた４ペア中２ペアが既知のＴＣＲ遺伝子と一致した（表１）。
Claims (2)
- １）がん細胞に特異的なＴ細胞を含むＴ細胞群と前記がん細胞にヒトＣＤ８０遺伝子とヒトＣＤ１３７Ｌ遺伝子をコードする遺伝子を導入した抗原提示細胞とを共培養することにより、前記Ｔ細胞群を刺激する工程と、
２）前記刺激されたＴ細胞を含むＴ細胞群から活性化マーカーＣＤ１３７を指標にしてＣＤ１３７陽性細胞をフローサイトメトリーによりソートする工程と、
３）前記ソートされたＣＤ１３７陽性細胞の単一細胞をＰＣＲに供して前記がん細胞に特異的なＴＣＲ遺伝子を増幅する工程と、を含むがん細胞に特異的なＴＣＲ遺伝子の製造方法。 - 請求項１に記載の方法で得られたがん細胞に特異的なＴＣＲ遺伝子を別のＴ細胞に導入して組換えＴ細胞を得る、組換えＴ細胞の製造方法。
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