CN113186264A - 一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计的包括位点为L24‑49和/或L24‑2引物对。本申请的引物组的序列如SEQIDNO.1～4所示。本申请的引物组能特异性的识别HLAA24分型患者体内EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR，为追踪监测患者体内TCR‑T细胞药物提供依据。

Description

一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。

背景技术

EBV是可以感染人类的疱疹病毒家族的一员。EBV感染与某些类型的癌症有关。这些因EBV病毒感染所导致的癌症患者有望在TCR-T细胞治疗中获益。

TCR-T细胞治疗是有望治疗实体肿瘤的新一代免疫细胞疗法。在TCR-T细胞治疗的过程中，需要不断监测被输注到病人体内的药用TCR-T细胞的生长和续存的情况。能实现此目的技术手段中，荧光定量PCR(qPCR)是检测灵敏度很高的技术手段。利用qPCR监测TCR-T细胞，需要针对TCR-T细胞的特定TCR基因序列设计qPCR引物。然而现有技术并未发现针对TCR基因序列所设计的qPCR引物组应用于检测TCR-T细胞在病人体内生长和续存状况中。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种特异灵敏的追踪TCR-T细胞药物的引物组，尤其涉及一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种TCR引物组，包括位点为L24-2和/或L24-49的引物对。

作为优选，所述引物组依据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计。

作为优选，位点为L24-2的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.1～2所示；

位点为L24-49的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明还提供了所述的引物组在制备特异性检测HLAA24分型患者体内EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR产品中的应用。

作为优选，所述产品为试剂盒产品。

作为优选，所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。

本发明提供了一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计的。将本申请的引物组制备成荧光定量PCR试剂盒，追踪患者体内TCR-T细胞药物时，能特异的检测到药物的灵敏度为27个拷贝数的基因片段。

附图说明

图1为L24-2位点质粒DNA标准品的扩增曲线(从左到右质粒DNA标准品的稀释度分别为10⁸拷贝、10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10¹拷贝的基因片段)。

图2为L24-2位点质粒DNA标准品扩增产物的电泳图(从左到右质粒DNA标准品的稀释度分别10⁸拷贝、10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10¹拷贝的基因片段)。

图3为L24-2位点质粒DNA标准品的标准曲线图。

图4为L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA的扩增曲线(从左到右，基因组DNA的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。

图5为L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA扩增产物的电泳图(从左到右基因组DNA的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。

具体实施方式

本发明实施例中所述的TCR质粒标准品的构建方法为：

(1)将每个位点对应的TCR基因片段克隆至SEQ ID NO.5所示的质粒载体中，得到含有特定TCR基因片段的质粒载体；

(2)将含有特定TCR基因片段的质粒载体在大肠杆菌内扩增，提纯质粒DNA，得到相应位点的TCR质粒标准品。

在本发明实施例中以L24-2位点为例设计方案，其余位点的检测方法与之相同。

在本发明实施例中所述的TCR-T细胞药的基因组DNA为从相应的TCR-T药物细胞中提取的基因组DNA。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1引物设计

根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的L24-2和L24-49位点设计得到的TCR引物。得到的引物的序列如SEQ ID NO.1～4所示。

实施例2标准曲线建立

以TCR的L24-2位点为例设计方案。

取L24-2位点的质粒DNA标准品的10⁸个拷贝数稀释液、10⁷个拷贝数稀释液、10⁶个拷贝数稀释液、10⁵个拷贝数稀释液、10⁴个拷贝数稀释液、10³个拷贝数稀释液、10²个拷贝数稀释液、10¹个拷贝数稀释液，按照下述的反应体系和反应程序设置实时荧光PCR。

反应体系：PCR预混液10μl；正向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；反向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；ROX Reference Dye(50×)0.2μl；TCR-T细胞药的基因组DNA2μl，浓度50ng/μl，或TCR的质粒标准品DNA2μl；Nuclease-Free Water 7μl；总反应体系共20μl。

PCR反应程序：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，20s)40个循环。设置参比荧光为ROX，选择反应类型为SYBR Green Reagents，选择荧光检测通道SYBR，设置在60℃时采集荧光信号。

经实时荧光PCR扩增得到的L24-2位点质粒DNA标准品的扩增曲线如图1所示。

将每个稀释度的质粒DNA标准品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

以扩增曲线的Ct值为纵坐标，质粒DNA标准品的log以10为底的基因片段拷贝数为横坐标建立标准曲线，标准曲线的结果如图3所示。计算公式为：y＝-3.5555x+41.485(R²＝0.9981)

由于计算公式中的R²≥0.95，则证明本实施例的标准曲线有效。

实施例3灵敏度检测

将针对L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液、10000倍稀释液，根据实施例2实时荧光PCR的反应体系和程序进行扩增。得到针对L24-2位点的TCR-T细胞药的基因组DNA的扩增曲线如图4所示。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。

将得到的每个稀释度的TCR-T细胞药的基因组DNA的Ct值代到实施例2的标准曲线中，可以计算得到每个稀释度的TCR-T细胞药的基因组DNA的拷贝数。

经过计算，针对L24-2位点的TCR-T细胞药基因组DNA原液的拷贝数为46766个拷贝，10倍稀释液的拷贝数为7998个拷贝、100倍稀释液的拷贝数为873个拷贝、1000倍稀释液的拷贝数为125个拷贝、10000倍稀释液的拷贝数为27个拷贝。由此可以得出，本实施例1得到的引物对于检测L24-2位点的TCR-T细胞药的灵敏度能达到27个拷贝。即，在实际应用中，引物在患者外周血样的基因组DNA中最低可以检测到27个拷贝的TCR基因片段。

将L24-49位点的引物按照本实施例3的灵敏度的检测方法检测相对应位点的TCR-T细胞药，所得到的灵敏度均能达到27个拷贝。

由以上实施例可知，本发明提供了一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计的。将本申请的引物组制备成荧光定量PCR试剂盒，追踪患者体内TCR-T细胞药物时，能特异的检测到27个拷贝数的TCR-T细胞药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 重庆天科雅生物科技有限公司

<120> 一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaccacca tgttctggta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtcactgt cagggtgctc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacaggcagc agaacatct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taccagaaca tggtggtggc 20

<210> 5

<211> 7314

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 60

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 120

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 180

aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 240

atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 300

gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 360

acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 420

ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 480

tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 540

ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 600

ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 660

atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 720

taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 780

catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 840

atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 900

acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 960

aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 1020

ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 1080

cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 1140

atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 1200

ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 1260

ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 1320

tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 1380

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 1440

gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 1500

agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 1560

gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 1620

gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 1680

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattagtac tctagcttaa 1740

gtaacgccat tttgcaaggc atggaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa 1800

ggttaggaac agagagacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 1860

ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc 1920

tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 1980

ccgccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 2040

atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 2100

ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggcgcg ccagtcctcc 2160

gatagactgc gtcgcccggg tacccgtatt cccaataaag cctcttgctg tttgcatccg 2220

aatcgtggac tcgctgatcc ttgggagggt ctcctcagat tgattgactg cccacctcgg 2280

gggtctttca tttggaggtt ccaccgagat ttggagaccc ctgcccaggg accaccgacc 2340

cccccgccgg gaggtaagct ggccagcggt cgtttcgtgt ctgtctctgt ctttgtgcgt 2400

gtttgtgccg gcatctaatg tttgcgcctg cgtctgtact agttggctaa ctagatctgt 2460

atctggcggt cccgcggaag aactgacgag ttcgtattcc cggccgcagc ccctgggaga 2520

cgtcccagcg gcctcggggg cccgttttgt ggcccattct gtatcagtta acctacccga 2580

gtcggacttt ttggagctcc gccactgtcc gaggggtacg tggctttgtt gggggacgag 2640

agacagagac acttcccgcc cccgtctgaa tttttgcttt cggttttacg ccgaaaccgc 2700

gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc tctgtctgac tgtgtttctg 2760

tatttgtctg aaaattagct cgacaaagtt aagtaatagt ccctctctcc aagctcactt 2820

acaggcggcc gcgccaccat ggccacaggc agcagaacat ctctgctgct ggccttcgga 2880

ctgctgtgtc tgccttggct gcaagaagcc agcgccagaa aagaggtgga acaggacccc 2940

ggacctttca atgtgcctga aggcgccacc gtggccttca actgcaccta cagcaatagc 3000

gccagccaga gcttcttctg gtacagacag gactgccgga aagaacccaa gctgctgatg 3060

agcgtgtaca gcagcggcaa cgaggacggc agattcacag cccagctgaa cagagccagc 3120

cagtacatca gcctgctgat ccgggatagc aagctgagcg atagcgccac ctacctgtgt 3180

gtcgtgcggg gctacaactt caacaagttc tacttcggca gcggcaccaa gctgaacgtg 3240

aagcctgaca ttcagaatcc cgaacccgcc gtgtaccagc tgaaggaccc taggagccag 3300

gactctaccc tctgcctgtt caccgacttc gacagccaga tcaacgtgcc caagacaatg 3360

gagagcggca ccttcatcac cgacaagacc gtgctggaca tgaaggctat ggacagcaag 3420

agcaacggag ccatcgcttg gagcaaccag accagcttca cttgccagga catcttcaag 3480

gagaccaacg cttgctaccc ctctagcgac gtgccttgcg acgccacact gacagagaag 3540

agcttcgaga ccgacatgaa cctgaacttc cagaacctga gcgtgatggg cctgagaatc 3600

ctgctgctga aggtggccgg attcaacctg ctgatgaccc tgaggctgtg gtcttcccga 3660

gctaaacgag gctcaggcgc gacgaacttt agtttgctga agcaagctgg tgacgttgag 3720

gaaaatccgg gacccatggc cacaggcagc agaacatctc tgctgctggc cttcggactg 3780

ctgtgcctgc cttgtctgca agagggatct gccggtgctg tggtgtctca gcacccttct 3840

tgggtcatct gcaagtccgg caccagcgtg aagatcgagt gcagaagcct ggacttccag 3900

gccaccacca tgttctggta cagacagttc cccaagcaga gcctgatgct gatggccacc 3960

tctaacgagg gcagcaaggc cacatatgag cagggcgtcg agaaggacaa gttcctgatc 4020

aaccacgcca gcctgacact gagcaccctg acagtgacaa gcgcccatcc tgaggacagc 4080

agcttctaca tctgcagcgc cagaggaccc agaatcaccg acagcagcac cgacacacag 4140

tacttcggcc ctggcaccag actgacagtt ctggaggacc tacgtaacgt gacccctccc 4200

aaggtgtccc tgttcgagcc tagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa ggccacactc 4260

gtctgcctgg ctagaggctt cttcccagac cacgtggagc tgtcttggtg ggtgaacggc 4320

aaggaggtgc actcaggagt gtctaccgac cctcaggcct acaaggagag caactacagc 4380

tactgcctgt cctccagact cagggtctgc gccacctttt ggcacaaccc tcggaaccac 4440

ttccgctgtc aggtccagtt ccacggcctg tccgaggaag acaagtggcc agagggctct 4500

cctaagccag tgacacagaa catcagcgcc gaggcttggg gaagagccga ttgcggaatc 4560

accagcgcct cttaccagca gggagtgctg tcagctacca tcctgtacga gatcctgctg 4620

ggcaaggcca cactgtacgc agtgctggtg tccactctgg tcgtgatggc tatggtgaag 4680

cggaagaaca gctaggaatt cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt 4740

tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta 4800

cattttatgg gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag 4860

aaactttccc gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt 4920

gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct 4980

ttaatgcctc tgtatcatgc tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat 5040

aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg 5100

gtgtgctctg tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa 5160

ctcctttctg ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc 5220

tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg 5280

tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccaactg gatcctgcgc 5340

gggacgtcct tctgctacgt cccttcggct ctcaatccag cggacctccc ttcccgaggc 5400

cttctgccgg ttctgcggcc tctcccgcgt cttcgctttc ggcctccgac gagtcggatc 5460

tccctttggg ccgcctcccc gcctgtttcg cctcggcgtc cggtccgtgt tgcttggtcg 5520

tcacctgtgc agaattgcga accatggatt ccaccgtgaa ctttgtctcc tggcatgcaa 5580

atcgtcaact tggcatgcca agaataattc ggatccaagc ttaggcctgc tcgctttctt 5640

gctgtcccat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt ccaactacta aactggggga 5700

tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctagcgc taagcttaac acgagccata 5760

gatagaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaatgaaag accccacctg 5820

taggtttggc aagctagctt aagtaacgcc attttgcaag gcatggaaaa tacataactg 5880

agaatagaga agttcagatc aaggttagga acagagagac agcagaatat gggccaaaca 5940

ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagtt ggaacagcag 6000

aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 6060

cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 6120

cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg 6180

cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc 6240

tcactcggcg cgccagtcct ccgatagact gcgtcgcccg ggtacccgtg ttctcaataa 6300

accctcttgc agttgcatcc gactcgtggt ctcgctgttc cttgggaggg tctcctctga 6360

gtgattgact gcccacctcg ggggtctttc attctcgagc agcttggcgt aatcatggtc 6420

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 6480

aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6540

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 6600

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 6660

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 6720

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 6780

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 6840

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 6900

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 6960

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 7020

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 7080

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 7140

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 7200

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 7260

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagt 7314

Claims (6)

1.一种TCR引物组，其特征在于，包括位点为L24-2和/或L24-49的引物对。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组依据HLAA24分型，EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR设计。

3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，位点为L24-2的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.1～2所示；

位点为L24-49的TCR引物对的序列如SEQ ID NO.3～4所示。

4.权利要求1～3任意一项所述的引物组在制备特异性检测HLAA24分型患者体内EBV病毒抗原肽段IYVLVMLVL的TCR产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒产品。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。

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