JP4035845B2 - 腫瘍抗原 - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抗原ペプチドとしての作用を有するペプチドに関し、さらに詳しくはＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチド、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドと相互作用を有する化合物、該ペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、これらの１つ以上を含んでなる医薬組成物、該ペプチドと相互作用を有する化合物の同定方法、該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ペプチドおよび該抗体の測定方法、並びに試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞性免疫に係る細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）が重要な役割を果たしている。例えば、癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（非特許文献１）。このような腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子、いわゆる腫瘍抗原は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８個乃至１１個のアミノ酸からなるペプチド、いわゆる腫瘍抗原ペプチドになり、主要組織適合性抗原（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略称する。）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ；以下、ＨＬＡと略称する。）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はこのＨＬＡ分子と腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識し、可溶性因子等、例えばインターフェロン−γ等のサイトカインを放出し、さらには腫瘍細胞を溶解する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す。
【０００３】
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ等に分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃを有している。また、その遺伝子は多型性に富むことが報告されている。例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、Ａ２４、およびＡ２６等の、ＨＬＡ−ＢにはＢ８、Ｂ２７、およびＢ４６等の、ＨＬＡ−ＣにはＣｗ３やＣｗ６等の多型が存在する。そのため、それぞれの個体が有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではない。ＨＬＡ−Ａ亜領域の多型の１つであるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％でみられる（非特許文献２）。また、ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子は日本人の人口の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である。）、白人の約２０％、アフリカ黒人の約１２％で見られる。
【０００４】
細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。また、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られている。ＨＬＡの型により結合するペプチドが異なるため、腫瘍抗原ペプチドを用いて抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化するためには、各型のＨＬＡに結合するペプチドを選択する必要がある。
【０００５】
近年、腫瘍拒絶抗原遺伝子およびＴ細胞抗原受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等の特異免疫に関与する分子が、種々の癌、例えばメラノーマや食道癌等で同定されてきており、進行癌または転移性癌においてペプチドによる特異的免疫療法が検討されている（非特許文献３、４、５、６、７および８）。
【０００６】
現在欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法が開発されつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２を静脈内投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（非特許文献９）。このように腫瘍抗原は、癌ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
【０００７】
しかしながら、癌の多様性を考えると、一種類の腫瘍抗原からなる癌ワクチンを用いて全ての癌を治療することは不可能である。癌細胞の種類や組織の違いにより、発現している腫瘍抗原の種類や発現量が異なる。実際、複数ペプチドを用いた免疫療法（ｍｕｌｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が、癌治療において有効であることが報告されている（非特許文献１０、１１および１２）。
さらに、ＨＬＡ遺伝子の多型により各個体において機能する腫瘍抗原ペプチドの種類が異なることから、それぞれのＨＬＡに応じた腫瘍抗原ペプチドを同定することは、癌治療において高い効果を得るために重要である。
勿論、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化せしめる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。
しかし、癌の治療において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、ＨＬＡ拘束性および癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
【０００８】
以下に、本背景技術の説明に引用した文献を列記する。
【非特許文献１】
「アーカイブス オブ サージェリー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ）」、１９９０年、第１２６巻、ｐ．２００−２０５。
【非特許文献２】
「エイチエルエー １９９１（ＨＬＡ １９９１）」、１９９２年、（英国：オックスフォード）、サイエンティフィック パブリケーションズ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１巻、ｐ．１０６５−１２２０。
【非特許文献３】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９１年，第２５４巻，ｐ．１６４３−１６４７。
【非特許文献４】
「ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９６年、第１８３巻、ｐ．１１８５−１１９２。
【非特許文献５】
ゴミ（Ｇｏｍｉ，Ｓ．）ら、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１６３巻、ｐ．４９９４−５００４。
【非特許文献６】
「プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９５年、第９２巻、ｐ．４３２−４３６。
【非特許文献７】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２６９巻、ｐ．１２８１−１２８４。
【非特許文献８】
「ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９７年、第１８６巻、ｐ．７８５−７９３。
【非特許文献９】
「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９８年、第４巻、ｐ．３２１−３２７。
【非特許文献１０】
「クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第７巻、ｐ．３９５０−３９６２。
【非特許文献１１】
「ジャーナル オブ クリニカル オンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第１９巻、ｐ．３８３６−３８４７。
【非特許文献１２】
「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９８年、第４巻、ｐ．３２８−３３２。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
腫瘍抗原ペプチドとして作用する新規なペプチド、例えば前立腺癌患者の特異的免疫療法に有用な、細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドを見出すことを課題とする。
【課題を解決する手段】
【００１０】
本発明者は、前立腺癌のマーカーとして知られている３つの蛋白質、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、および前立腺幹細胞抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）に着目した。そして、これら蛋白質の部分ペプチドのうち、前立腺癌患者の末梢血単核細胞からＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する腫瘍抗原ペプチドを同定し、これにより本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチド、および／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドである。
さらに本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチド、および／またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドである。
さらにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチド、および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドである。
またさらに本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも１つからなる医薬である。
また本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも１つからなる癌ワクチンである。
さらに本発明の一態様は、前立腺癌の治療に用いる前記癌ワクチンである。
さらにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも１つを含有してなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤である。
またさらに本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも１つを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
また本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である；
ｉ）配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、
および
ｉｉ）配列表の配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、
および
ｉｉｉ）工程ｉ）および工程ｉｉ）で得られた細胞を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。
さらに本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である；
ｉ）配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、
および
ｉｉ）工程ｉ）で得られた細胞を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。
さらにまた本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である；
ｉ）配列表の配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、
および
ｉｉ）工程ｉ）で得られた細胞を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。
またさらに本発明の一態様は、前記ペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
また本発明の一態様は、前記ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２４分子と相互作用して、少なくともＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、前記ペプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも１つを用いることを特徴とする同定方法である。
さらに本発明の一態様は、前記ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子と相互作用して、少なくともＨＬＡ−２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、前記ペプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも１つを用いることを特徴とする同定方法である。
さらにまた本発明の一態様は、前記同定方法により得られた化合物である。
またさらに本発明の一態様は、前記ペプチドの少なくとも１つに対する、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物である。
また本発明の一態様は、前記ペプチドの少なくとも１つに対する、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物である。
さらに本発明の一態様は、前記ペプチド、前記抗体、および前記化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物である。
さらにまた本発明の一態様は、前記ペプチドの、または前記抗体の、定量的あるいは定性的な測定方法である。
またさらに本発明の一態様は、前記ペプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含んでなる試薬キットである。
また本発明の一態様は、前記細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、前記同定方法、または前記測定方法に使用する試薬キットであって、前記ペプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含んでなる試薬キットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００１−３７６４１５号からの優先権を請求するものである。
【００１３】
本発明の理解のために、本明細書において用いる用語についてまず説明する。腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：以下、ＣＴＬと略称することもある。）に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであり、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。
【００１４】
ここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞抗原受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに促進するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された抗原を認識することにより、例えばインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと略称する）を産生すること、あるいは細胞傷害性Ｔ細胞が認識した標的細胞（ターゲットともいう。）に対し細胞傷害活性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
【００１５】
本明細書においては、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えば蛋白質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。
【００１６】
その他、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００１７】
本発明においては、前立腺癌のマーカーとして知られている３つの蛋白質、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：以下、ＰＳＡと略称する。）、前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ：以下、ＰＳＭＡと略称する。）、および前立腺幹細胞抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ：以下、ＰＳＣＡと略称する。）に由来する腫瘍抗原ペプチドを同定した（配列番号１から配列番号７）。すなわち、これら蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフに適合するペプチドを設計して合成し、該ペプチドのうち前立腺癌患者の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：以下、ＰＢＭＣと略称する。）からＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドを同定した。
【００１８】
ＰＳＡは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：Ｘ０５３３２として登録されている遺伝子がコードする蛋白質（アクセッション番号：ＣＡＡ２８９４７）であり、キニン−カリクレインファミリーに属するセリンプロテアーゼの１つである。ＰＳＡは大多数の前立腺癌で発現しており、ＰＳＡ由来の２種類のペプチドＰＳＡ−１（配列番号８）およびＰＳＡ−３（配列番号９）がＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、およびＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが報告されている〔コリール（Ｃｏｒｒｅａｌｅ，Ｐ．）ら、「ジャーナル オブ ザ ナショナル キャンサー インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）」、１９９７年、第８９巻、ｐ．２９３−３００〕。また、ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−３、およびＨＬＡ−Ａ３結合モチーフをもつＰＳＡ−９のアミノ酸配列を含む３０ｍｅｒのオリゴペプチド（配列番号１０）が、ＰＳＡを発現しているＨＬＡ−Ａ２陽性（以下、ＨＬＡ−Ａ２^＋と称する。）腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞を健常人由来のＰＢＭＣから誘導したことが報告されている〔ピアーパオロ（Ｐｉｅｒｐａｏｌｏ，Ｃ．）ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１９９８年、第１６１巻、ｐ．３１８６−３１９４〕。
【００１９】
ＰＳＭＡは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＦ００７５４４として登録されている遺伝子がコードする蛋白質（アクセッション番号：ＡＡＣ８３９７２）であり、Ｎ−アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ α−ｌｉｎｋｅｄ ａｃｉｄｉｃ ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の薬理学的特性を有し、基質の加水分解活性を示すことが報告されている〔ルース（Ｒｕｔｈ，Ｅ．Ｃ．）ら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ」、１９９６年、第９３巻、ｐ．７４９−７５３〕。また、ＰＳＭＡ由来のＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するペプチドＰＳＭ−Ｐ１（配列番号１１）およびＰＳＭ−Ｐ２（配列番号１２）を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することによる免疫療法が前立腺癌の臨床試験で検討されている（パトリシア（Ｐａｔｒｉｃｉａ，Ａ．Ｌ．）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第６０巻、ｐ．８２９−８３３）。
【００２０】
ＰＳＣＡは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＦ０４３４９８として登録されている遺伝子がコードする蛋白質（アクセッション番号：ＡＡＣ３９６０７）であり、Ｔｈｙ−１／Ｌｙ−６細胞表面蛋白質ファミリーに関連する蛋白質である。ＰＳＣＡのｍＲＮＡは前立腺特異的に発現しており、さらに前立腺癌においては過剰発現していることが知られている〔ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ，Ｅ．Ｒ．）ら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ」、１９９８年、第９５巻、ｐ．１７３５−１７４０〕。また、抗ＰＳＣＡ抗体による前立腺癌の治療効果が、ヒト前立腺癌を移植したマウスで確認されている〔ダグラス（Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｃ．Ｓ．）ら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ」、２００１年、第９８巻、ｐ．２６５８−２６６３〕。ＰＳＣＡについては、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチド、あるいはＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドは報告されていない。
【００２１】
このように、前立腺癌におけるＰＳＡ、ＰＳＭＡ、およびＰＳＣＡの発現は公知であり、ＰＳＡおよびＰＳＭＡについてはこれらに由来するＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが知られていた。しかしながら、本発明において同定された７種類のペプチド（配列番号１から配列番号７）のうち、５種類のペプチド（配列番号１から配列番号５）はＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドであり、これらペプチドについての報告は無い。また、残り２種類のペプチド（配列番号６または配列番号７）は、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有し、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドであるが、ＰＳＣＡ由来のこれらペプチドについての報告は無い。
【００２２】
具体的には、配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドで、ＨＬＡ−Ａ２４陽性（以下、ＨＬＡ−Ａ２４^＋と称する。）前立腺癌患者由来またはＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来のＰＢＭＣを刺激したとき、刺激に用いたペプチドと同一のペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する反応における当該ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生がペプチド特異的に促進された。
【００２３】
また、配列表の配列番号１から配列番号３のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌細胞に対する反応における、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来またはＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来のＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。さらに、これらペプチドで刺激したＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌細胞を認識し、当該細胞に対して細胞傷害活性を示した。
【００２４】
これらから、配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来またはＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍細胞を認識し、当該腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導することが判明した。
【００２５】
配列表の配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、これらペプチドのいずれかでＨＬＡ−Ａ２陽性（以下、ＨＬＡ−Ａ２^＋と称する。）前立腺癌患者由来またはＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来のＰＢＭＣを刺激したとき、刺激に用いたペプチドと同一のペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する反応における当該ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生をペプチド特異的に促進した。
【００２６】
また、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌細胞に対するＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進し、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌細胞に対するＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。さらに、配列番号７に記載のペプチドで刺激した前立腺癌患者由来ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示した。
【００２７】
これらから、配列表の配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者由来またはＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を認識し、当該腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導することが判明した。
【００２８】
また、配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスの抗ペプチド抗体が前立腺癌患者血液中に存在することを見出した。このことから、癌患者血液中には腫瘍抗原ペプチドに対する抗体が存在しており、この抗ペプチド抗体の有無と該ペプチドのＣＴＬによる認識および／またはＣＴＬの誘導とは相関性があることが判明した。腫瘍抗原ペプチドに対するＩｇＧ抗体の存在と該ペプチドの癌ワクチン効果とに関連性があることは、本発明において初めて見出された知見である。今までに、糖蛋白質である多型性上皮ムチン（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｕｃｉｎ）（Ｍｕｃ１）に対するＩｇＧクラスの自然抗体が早期乳癌患者血清中に存在しており、その存在と疾病の予後とが関連していることが報告されている〔「ヨーロピアン ジャーナル オブ キャンサー（Ｅｕｒｏｐｉｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９６年、第３２巻ｐ．１３２５−１３３１；「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，２０００年、第１８巻、ｐ．５７４−５８３〕。Ｍｕｃ１は大多数の腺癌で発現しており、血中癌関連抗原として乳癌患者の治療経過の監視と再発の早期発見とに使用されている。また、Ｍｕｃ１は腺癌患者に対する免疫療法のためのワクチンとして検討されてきている。抗ＭＵＣ１抗体が血清中に検出された患者は、検出されなかった患者と比較して、生存率が有意に増加する。すなわち、ＭＵＣ１に対する液性免疫応答が認められる患者において生存率が高いことが示唆されている。これらから、本発明において見出された腫瘍抗原ペプチドに対するＩｇＧ抗体が血液中に存在する患者は、該腫瘍抗原ペプチドに対する免疫応答が高く、検出されない患者と比較してその予後が良好である可能性があると考えられる。
【００２９】
かくして、本発明において、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性にＣＴＬにより認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導することができる７種類のペプチドを得た。これらペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原特異的ＣＴＬに認識されるので、該ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。配列表の配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原特異的ＣＴＬに認識されるので、該ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。
【００３０】
上記ペプチドは、ＣＴＬを誘導するためにおよび／またはＣＴＬを活性化するために、単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。ＣＴＬは種々の抗原を認識する複数種類の細胞集団であることから、好ましくはこれらを２種類以上組み合わせて用いることが推奨される。
【００３１】
また、このように特定されたペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。好ましくは、このような変異を導入したペプチドであって、ＣＴＬにより、例えば少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬまたはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬにより認識されるペプチドである。変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００３２】
本発明に係るペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、１９７５年、および「ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（米国）、インターサイエンス、１９９６年の成書に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。
本発明に係るペプチドの精製・回収は、ゲルクロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィー等を組み合わせるか、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段により精製回収できる。回収しようとするペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体を作製し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法も使用できる。
【００３３】
本発明に係る抗体は、上記本発明に係るペプチドを認識するまたは結合する抗体である。抗体は免疫学的に該ペプチドを認識するまたは結合するものである限り特に限定されない。抗体は、自然抗体であってよく、また抗原を用いて作製された抗体であってもよい。該抗体を作製するとき、抗原は上記ペプチド自体でもまたはその断片でもよい。該断片は、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個乃至１０個のアミノ酸で構成される。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により測定できる。
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、本発明に係るペプチドを、アジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであればいずれも用いることができる。例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等が例示できるが、これらに限定されない。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫に用いる動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適である。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクロ−ナル抗体は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）を用いて自体公知の形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００３４】
かくして得られた、上記ペプチドを認識し結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ペプチドの精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。
【００３５】
上記ペプチドまたはこれら各ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独でまたは複数種類を組み合わせることにより、ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する物質の同定に有効な手段を提供する。同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞を用いてＣＴＬを刺激し、該ＣＴＬによる腫瘍抗原ペプチドの認識および／または該ＣＴＬの活性化を測定する実験系を構築し、被検物質を試験することにより、本発明に係るペプチドのＣＴＬによる認識を増強する物質を選別できる。抗原提示細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２分子および／またはＨＬＡ−Ａ２４分子を保持する細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２分子および／またはＨＬＡ−Ａ２４分子を保持する細胞株、より具体的にはＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２^＋）等が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ２分子またはＨＬＡ−Ａ２４分子を保持しない細胞であっても、ＨＬＡ−Ａ２ ｃＤＮＡまたはＨＬＡ−Ａ２４ ｃＤＮＡを遺伝子導入して細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２分子またはＨＬＡ−Ａ２４分子を発現させた細胞を用いることもできる。抗原提示細胞への腫瘍抗原のパルスは、抗原提示細胞と腫瘍抗原とを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である。
【００３５】
ＣＴＬとしては、例えばＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ株またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ系、例えば、ＯＫ−ＣＴＬ（非特許文献５）等を用いる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ株またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ系、例えば、ＫＥ４−ＣＴＬ（「インターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９９年、第８１巻、ｐ．４５９−４６６）等を用いる。該ＣＴＬによる腫瘍抗原ペプチドの認識および／または該ＣＴＬの活性化は、簡便には該ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を指標にして測定できる。この実験系は同定方法の１つを説明するものであり、本発明に係る同定方法はこれに限定されない。
【００３６】
ＫＥ４−ＣＴＬは食道癌患者の腫瘍浸潤リンパ球から樹立されたＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ培養細胞株である。ＫＥ４細胞は食道癌細胞であるが、この細胞には前立腺癌マーカーであるＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が発現していることが確認されている〔「ジャーナル オブ ウロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第１６６巻、ｐ．１５０８−１５１３〕。このことから、本発明に係るペプチドが由来したＰＳＡ、ＰＳＭＡ、およびＰＳＣＡもＫＥ４細胞で発現しており、そのためＨＬＡ−Ａ２４分子により提示された本発明に係るペプチドをＫＥ４−ＣＴＬが認識できる可能性がある。したがって、当該ペプチドのＣＴＬによる認識を増強する物質の同定にＫＥ４−ＣＴＬを使用できる可能性がある。
【００３７】
本発明は、上記同定方法で得られた化合物も包含する。該化合物は、本発明に係るペプチド、例えば配列表の配列番号１から配列番号５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２４と相互作用してＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物であり得る。または、例えば配列表の配列番号６若しくは配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２と相互作用してＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物であり得る。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。
【００３８】
本発明に係るペプチドは、腫瘍抗原ペプチドとして、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性に抗原特異的ＣＴＬを誘導するおよび／または抗原特異的ＣＴＬを活性化するために使用できる。すなわち、上記ペプチドから選ばれた１つ以上のペプチドからなる医薬、上記ペプチドの１つ以上を含有するＣＴＬの誘導剤並びに上記ペプチドの１つ以上を使用することを特徴とするＣＴＬの誘導方法も、本発明の範囲に包含される。
【００３９】
ＣＴＬの誘導方法は、その一態様として、本発明に係るペプチドを抗原提示細胞にパルスする工程、および該工程で得られた抗原提示細胞を用いてＣＴＬの前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程を含む。抗原提示細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２分子および／またはＨＬＡ−Ａ２４分子を保持する細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２分子および／またはＨＬＡ−Ａ２４分子を保持する細胞株を用いる。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ２分子を保持する細胞株としてＴ２細胞等が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ａ２ ｃＤＮＡまたはＨＬＡ−Ａ２４ ｃＤＮＡを常法により遺伝子導入して細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２分子またはＨＬＡ−Ａ２４分子を発現させた細胞を用いることもできる。抗原提示細胞へのペプチドのパルスは、抗原提示細胞と腫瘍抗原ペプチドとを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である。ＣＴＬの前駆細胞を含む細胞集団は、例えば末梢血細胞、より好ましくは末梢血単核細胞である。当該細胞集団の刺激は、ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４^＋抗原提示細胞およびＨＬＡ−Ａ２^＋抗原提示細胞をそれぞれ単独で用いて実施してもよいし、両方を共に用いて行なってもよい。
【００４０】
また、本発明に係るペプチド、該ペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子と相互作用してＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物、あるいは該ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２４分子と相互作用してＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物を、単独でまたは複数種類組み合わせて利用することにより、これらのうち少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供できる。
【００４１】
上記医薬、上記医薬組成物、上記ＣＴＬの誘導剤、および上記ＣＴＬの誘導方法は、例えば癌の治療、例えば前立腺癌の治療において有用である。ＨＬＡ−Ａ亜領域の多型の１つであるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の人口の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％でみられる（非特許文献２）。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子は日本人の人口の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である。）、白人の約２０％、アフリカ黒人の約１２％で見られる。これらから、本発明に係る医薬、医薬組成物、ＣＴＬの誘導剤、およびＣＴＬの誘導方法は多数の患者においてその効果を期待できる。
【００４１】
具体的には、例えば本発明に係るペプチドからなる医薬、さらに本発明に係るペプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。ここでいう癌ワクチンとは、腫瘍細胞に対する特異的免疫応答の誘導および／または増強により、腫瘍細胞を選択的に傷害する薬物を意味する。その投与量は、ＣＴＬによる当該ペプチドの認識の程度により適宜変更を加えて決定できるが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ乃至１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ乃至１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。投与方法は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行えばよく、好適には皮下投与、静脈内投与または筋肉内投与にて行われる。投与に際しては、免疫応答の誘導および／または増強のために、本発明に係るペプチドは適当なアジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して用いることができる。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。アジュバントは、通常のペプチドワクチン接種に用いられるものであればよく、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）および鉱物油等が例示される。また、剤形は、ペプチドを製剤化する自体公知の手段を応用して適宜選択できる。
または、患者の末梢血より単核細胞画分を採取して、本発明に係るペプチドと共に培養した後に、ＣＴＬの誘導および／またはＣＴＬの活性化が認められた該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。培養するときの単核細胞濃度、本発明に係るペプチドの濃度、培養期間等の培養条件は、簡単な繰り返し実験により決定できる。培養時に、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
【００４３】
癌ワクチンとして本発明に係るペプチドを使用する場合、１種類のペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類のペプチドを組み合わせて使用することもできる。複数ペプチドに基づく免疫療法が有効であると報告されていること（非特許文献９、１０および１１）、および癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、１種類のペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数種類を組み合わせて使用する方が、より高い効果が得られるときがある。特に、ＨＬＡ−Ａ２４とＨＬＡ−Ａ２とを両方有する癌患者においては、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬに認識されるペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬに認識されるペプチドとを組み合わせて癌ワクチンとして使用すると、高い効果が得られるときがある。またこのとき、本発明のペプチドから選ばれるペプチドを組み合わせて使用してもよいが、これらから選ばれる少なくとも１種類のペプチドに、公知の腫瘍抗原ペプチドから選ばれる少なくとも１種類の腫瘍抗原ペプチドを組み合わせて使用してもよい。公知の腫瘍抗原ペプチドとしては、ｌｃｋ遺伝子またはｓｒｃ遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチド（国際公開番号第ＷＯ０１／１１０４４号公報）、ＳＡＲＴ−１遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチド（「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」、１９９９年、第８１巻、ｐ．４５９−４６６）、ＳＡＲＴ−３遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチド（「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、１９９９年、第５９巻、ｐ．４０５６−４０６３）、並びにサイクロフィリンＢ遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチド（非特許文献５）等が例示されるがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明に係るペプチドおよび該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んであってもよい。また本発明は、これらのうちの１つまたはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたは抗体それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。これらの試薬および試薬キットは、上記同定方法、上記ＣＴＬの誘導方法、または本発明に係るペプチドの定量的若しくは定性的測定に使用できる。当該測定をするための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）等がある。
また、患者由来血液試料について、本発明に係るペプチドに対する抗ペプチド抗体の定量的若しくは定性的測定が、上記試薬または試薬キットを使用して実施可能である。測定には患者由来血液試料として血清または血漿を使用できる。上述したように、抗ペプチド抗体の癌患者血液中の存在と該抗体が認識するペプチドの癌ワクチン効果とに関連性があると考えられるため、当該抗ペプチド抗体の測定により、ペプチドの癌ワクチンとしての有効性の判断が可能になると考えられる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
（ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬにより認識されるペプチドの同定）
ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを文献検索により得て、該モチーフに適合する９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを、前立腺癌マーカーとして知られている３つの蛋白質、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、およびＰＳＣＡのアミノ酸配列に基づいて設計し、自体公知の方法で合成した。合成したペプチドの純度はいずれも７０％以上であった。
【００４７】
合成したペプチドについて、前立腺癌患者から調製したＰＢＭＣからの、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ誘導能を検討した。ＰＢＭＣは血液から常法により調製し、細胞数１×１０^５を培養培地〔４５％ＲＰＭＩ−１６４０培地、４５％ＡＩＭ−Ｖ^登録商標培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、０．１ｍＭのＭＥＭノンエッセンシャルアミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１０％ＦＣＳからなる〕２００μｌを加えた９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエル中で、ペプチド各１０μＭと共に、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて培養した。培養４日目および７日目に半量の培地を除き、最初に添加したペプチドと同じペプチドを含む上記組成の培地と交換した。培養１０日目の細胞を回収した後に洗浄してエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。
【００４８】
一方、合成した各ペプチド（１０μＭ）を、Ｃ１Ｒ−Ａ２４０１細胞（ＨＬＡ−Ａ２４^＋）と、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて２時間インキュベーションし、細胞表面上に発現しているＨＬＡ−Ａ２４分子に当該各ペプチドを結合させた。このように各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０１細胞を標的細胞（Ｔ）として用いた。
【００４９】
エフェクター細胞を均等に分割し、種々の標的細胞と混合し、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて１８時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清１００μｌを回収して、産生されたＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにより測定した。このとき、エフェクター細胞を誘導するのに用いたペプチドとＣ１Ｒ−Ａ２４０１細胞にパルスしたペプチドとが同じものになるように、エフェクター細胞と標的細胞とを組み合わせた。また、対照としてヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：以下、ＨＩＶと略称する）由来のペプチドを用い、ＨＩＶペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０１細胞を認識したＣＴＬのＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。算出された各測定値（ＮＥＴ）はスチューデントｔ検定で統計処理し、Ｐ値が０．０５以下であるものを有意差があると見なした。また、ＩＦＮ−γ産生をＮＥＴで５０ｐｇ／ｍｌ以上かつ有意差をもって促進したペプチドを陽性と判定した。
【００５０】
その結果、ＰＳＡ由来のＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）、ＰＳＭＡ由来のＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）、並びにＰＳＣＡ由来のＰＳＣＡ７６−８４（配列番号４）およびＰＳＣＡ８２−９１（配列番号５）が、それぞれ１４例中２例、１３例中４例、１４例中５例、１２例中１例、並びに１２例中２例の前立腺癌患者ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。すなわち、これらのペプチドが、前立腺癌患者ＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導することが分かった。なお、ここで、ペプチド名の数字ＭＭＭ−ＮＮＮは、該ペプチドが由来した蛋白質のアミノ酸配列中で第ＭＭＭ番目から第ＮＮＮ番目のアミノ酸残基からなることを意味する。
【実施例２】
【００５１】
（ペプチドにより誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性）
ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）によりＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を、前立腺癌細胞を用いて^５１Ｃｒ遊離試験で検討した。まず、２例の前立腺癌患者由来ＰＢＭＣを、実施例１と同様に１０日間培養して刺激し、さらに１０日間培養した後にエフェクター細胞として用いた。このエフェクター細胞のＨＬＡ−Ａ２４^＋標的細胞に対する細胞傷害活性を、Ｅ／Ｔ比１０または２０で、標準的な６時間の^５１Ｃｒ遊離試験で測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２４⁻前立腺癌細胞ＰＣ９３にＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を常法により導入して発現させた細胞ＰＣ９３−Ａ２４を用いた。また対照として、当該ＨＬＡ−Ａ２４⁻前立腺癌細胞を用いた。
【００５２】
その結果、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）で刺激した前立腺癌患者由来ＰＢＭＣは、２例ともにＨＬＡ−Ａ２４を発現させた前立腺癌細胞を特異的に溶解した（表１）。このことから、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）は癌患者のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが明らかになった。
【００５３】
【表１】

【実施例３】
【００５４】
（前立腺癌患者血清中の抗ペプチド抗体の測定）
前立腺癌患者血清中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスの抗ペプチド抗体を後述のようにＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、前立腺癌患者由来ＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導したペプチドである、ＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）、ＰＳＣＡ７６−８４（配列番号４）、およびＰＳＣＡ８２−９１（配列番号５）に対する抗体が、患者１０例中、それぞれ５例、１例、４例、および２例で検出された。しかし、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）に対する抗体は検出されなかった。一方、前立腺癌患者由来ＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導しなかったペプチドである、ＰＳＡ由来のＰＳＡ１−１０およびＰＳＡ２−１０、ＰＳＭＡ由来のＰＳＭ２９８−３０６、ＰＳＭ２２７−２３５、ＰＳＭ６０６−６１４、ＰＳＭ１７８−１８６、ＰＳＭ４４８−４５６、ＰＳＭ５２０−５２８、ＰＳＭ７０４−７１２、ＰＳＭ７４−８３、ＰＳＭ５６５−５７４、ＰＳＭ６９９−７０８、ＰＳＭ６２４−６３３、およびＰＳＭ５８４−５９３、並びにＰＳＣＡ２７−３６に対する抗体は検出されなかった。代表的な結果を図１から図６に示す。図１から図３は患者例１についての結果を、図４から図６は患者例２についての結果を示す。患者例１においては、血清中にＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）、およびＰＳＣＡ７６−８４（配列番号４）のそれぞれに対する抗体が検出された（図１および図３）。また、患者例２においては、ＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）およびＰＳＣＡ７６−８４（配列番号４）のそれぞれに対する抗体が認められた（図４および図６）。
このことから、癌患者血液中には腫瘍抗原ペプチドに対する抗体が存在しており、この抗ペプチド抗体の有無と該ペプチドのＣＴＬによる認識および／またはＣＴＬの誘導には相関性があることが判明した。
【００５５】
抗ペプチド抗体（ＩｇＧクラス）はＥＬＩＳＡにより測定した。各ペプチド（２０μｇ／ウエル）を９６ウェル ヌンク コバリンク（Ｎｕｎｃ Ｃｏｖａｌｉｎｋ）平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｂｅｒａｔｅ）（ＰＩＥＲＣＥ社）で製品指示書にしたがって固相化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）した。このとき、バックグランドとしてペプチドを固相化しないウエルをプレート中に設けた。このように処理したプレートをブロックエース（Ｂｌｏｃｋ ａｃｅ；雪印社）でブロックして０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄し、血清または血漿サンプルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ ａｃｅで希釈して、１００μｌ／ウエルの容量をプレートに加えた。３７℃で２時間インキュベーション後、プレートをＴｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄し、１：１０００倍希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（γ鎖特異的抗体；ＤＡＫＯ社）と共にさらに３７℃で２時間インキュベーションした。このプレートを９回洗浄し、１：１００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇ抗体を結合させたホースラディッシュ パーオキシダーゼ−デキストランポリマー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ；ＤＡＫＯ）を１００μｌずつ各ウエルに加えて室温で４０分間インキュベーションした。洗浄後にテトラメチルベンジジン基質溶液（ＫＰＬ社）１００μｌを加え、その後に反応を１Ｍのリン酸を添加して停止し、４５０ｎｍの波長における吸光度（ＯＤ）を測定した。各ペプチドを固相化したウエルの吸光度から、ペプチドを固相化しなかったウエルの吸光度を減算して得られた値を、各抗ペプチド抗体の量として図示した。
【実施例４】
【００５６】
（ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）の細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の検討）
ＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人およびＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者からＰＢＭＣを調製し、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）による前立腺癌に反応するＣＴＬの誘導について検討した。ＰＢＭＣは、実施例１と同様の方法でＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）各１０μｇ／ｍｌと共に１２日間培養したものを用いた。標的細胞は、各ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）をＣ１Ｒ−Ａ２４０１細胞（ＨＬＡ−Ａ２４^＋）に実施例１と同様の方法でパルスしたものを用いた。ＰＢＭＣと標的細胞とを混合し、実施例１と同様にインキュベーションして、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。
【００５７】
その結果、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）と共に培養したＰＢＭＣは、それぞれ前立腺癌患者６例中３例および７例中４例で、ＩＦＮ−γ産生を促進した。実施例１で行なった別症例についての結果と併せると、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）は、２０例中５例および２０例中８例で、ＩＦＮ−γ産生を促進した。また、これらペプチドとともに培養した、健常人５例中１例の、ＰＢＭＣは対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０１細胞を認識し、ＩＦＮ−γを産生した。
【００５８】
次に、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）を用いて、前立腺癌細胞を認識して細胞傷害活性を示すＣＴＬの誘導を、健常人由来ＰＢＭＣについて検討した。健常人由来ＰＢＭＣは、本実施例においてＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）により、ペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生が観察された健常人由来ＰＢＭＣ各１例由来のものを用いた。ＰＢＭＣは、上記同様にＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）各１０μｇ／ｍｌと共に１２日間培養した。標的細胞として実施例２で作成した前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２４を用い、上記培養したＰＢＭＣと共にインキュベーションして、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した（実施例１参照）。さらに、上記培養した細胞を、さらに１４日間培養して、ＰＣ９３−Ａ２４細胞に対する細胞傷害活性を、^５１Ｃｒ遊離試験により測定した（実施例２参照）。
【００５９】
その結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）で刺激された健常人由来ＰＢＭＣは、ＰＣ９３−Ａ２４細胞に対し、それぞれ有意差をもって高いＩＦＮ−γを産生した（図７Ａ）。また、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）で刺激された健常人由来ＰＢＭＣは、ＰＣ９３−Ａ２４細胞に対して細胞傷害活性を示し、当該細胞を溶解した。これらの細胞傷害活性は、ＰＣ９３細胞に対する活性と比較して有意差が認められた（図７Ｂ）。
【００６０】
さらに、４例の前立腺癌患者由来ＰＢＭＣについて同様の検討を行なった。その結果を図８Ａおよび図８Ｂに示した。ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）のいずれかで刺激されたＰＢＭＣは、それぞれ前立腺癌患者４例中２例および４例中３例において、ＰＣ９３−Ａ２４細胞に対し有意差をもって高いＩＦＮ−γを産生した（図８Ａ）。また、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）で刺激した前立腺癌由来ＰＢＭＣは、ＰＣ９３−Ａ２４細胞に対して細胞傷害活性を示し、当該細胞を溶解した。これらの細胞傷害活性は、ＰＣ９３細胞に対する活性と比較して有意差が認められた（図８Ｂ）。
【００６１】
さらに、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体を、前立腺癌患者血清について測定した（実施例３参照）。ＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体は、５例で検出された（図９Ａ）。このうち１例においては、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）に対する抗体も検出された。患者血清中のＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体は、ＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）を固相化したプレートでインキュベーションすることにより吸着されたが（図９Ｂ）、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）を固相化したプレートでは吸着されなかった。このことから、検出された抗体はＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に特異的であることが判明した。
【００６２】
ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体は、健常人血清でも検出された。代表的な８例を図１０に示す。
【００６３】
これらの結果から、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）が、ＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来およびＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌細胞を認識して、当該細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導することが明らかになった。さらに、これらペプチドに対する特異抗体が、前立腺癌患者血清中に存在することが判明した。
【実施例５】
【００６４】
（ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）の細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の検討）
ＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人およびＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者から調製したＰＢＭＣをＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）と共にインキュベーションし、標的細胞の認識によるＩＦＮ−γ産生を検討した。ＰＢＭＣは、実施例１と同様の方法でＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）１０μｇ／ｍｌと共に１２日間または１０日間培養したものを用いた。標的細胞は、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）をＣ１Ｒ−Ａ２４０１細胞（ＨＬＡ−Ａ２４^＋）に実施例１と同様の方法でパルスしたものを用いた。ＰＢＭＣと標的細胞とを混合し、実施例１と同様にインキュベーションして、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。
【００６５】
その結果、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）は、前立腺癌患者２例中１例で、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。実施例１で行なった別症例についての結果と併せると、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）は、１６例中６例で、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。また、このペプチドは、健常人５例中３例で、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進した。
【００６６】
次に、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）を用いて、前立腺癌細胞を認識して細胞傷害活性を示すＣＴＬの誘導を、上記検討に用いた症例とは別の７例の前立腺癌患者由来ＰＢＭＣについて検討した。ＰＢＭＣは、上記同様にＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）１０μｇ／ｍｌと共に１２日間培養した。標的細胞として実施例２で作成した前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２４を用い、上記培養したＰＢＭＣと共にインキュベーションして、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した（実施例１参照）。
【００６７】
その結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）は、７例中５例において、前立腺癌患者由来ＰＢＭＣのＰＣ９３−Ａ２４細胞に対する反応におけるＩＦＮ−γ産生を、有意差をもって促進した（図１１Ａ）。ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）により刺激されたＣＴＬ誘導によるＩＦＮ−γ産生は、抗ＣＤ８抗体によって阻害されたが、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ１４抗体では阻害されなかった（図１１Ｂ）。これらから、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）が、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌細胞を認識するＣＴＬを誘導することが明らかになった。
【００６８】
また、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）に対する抗体を、前立腺癌患者血清について測定した（実施例３参照）。抗体が検出された代表的な３例を図１２Ａに示した。患者血清中の当該抗体は、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）で被覆したセルロースビーズと予めインキュベーションすることにより吸着された（図１２Ｂ）。このことから、患者血清中に検出された抗体はＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）に特異的であることが判明した。さらに、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）を被覆したビーズに結合した抗体を０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．２Ｍ クエン酸緩衝液で溶出したところ、得られた溶出液中にＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）に対する特異抗体が検出された（図１２Ｃ）。
【００６９】
これらの結果から、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）が、ＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来およびＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌細胞を認識して、当該細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導することが明らかになった。さらに、このペプチドに対する特異抗体が、健常人および前立腺癌患者血清中に存在することが判明した。
【実施例６】
【００７０】
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬにより認識されるペプチドの同定）
ＨＬＡ−Ａ２分子に結合するペプチドを得るために、まずＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するペプチドについて、インターネットホームページ＜ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／＞を用いて検索した。そして、該モチーフに適合する９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを、ＰＳＣＡのアミノ酸配列に基づいて設計し、自体公知の方法で合成した。合成したペプチドの純度はいずれも９０％以上であった。
【００７１】
合成したペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ２^＋健常人またはＨＬＡ−２^＋前立腺癌患者から調製したＰＢＭＣからの、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ誘導能を検討した。ＰＢＭＣは血液から常法により調製し、細胞数１×１０^５を、実施例１に記載の培養培地と同一のものを用いて９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエル中で、ペプチド各１０μｇ／ｍｌと共に、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて培養した。培養５日目および１０日目に半量の培地を除き、最初に添加したペプチドと同じペプチドを含む新鮮培地と交換した。培養１５日目の細胞を回収した後に洗浄してエフェクター細胞として用いた。
【００７２】
一方、合成した各ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を、Ｔ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２^＋）と、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて２時間インキュベーションし、細胞表面上に発現しているＨＬＡ−Ａ２分子に当該各ペプチドを結合させた。このように各ペプチドをパルスしたＴ２細胞を標的細胞として用いた。
【００７３】
エフェクター細胞と細胞数１×１０^４の標的細胞とを、様々な混合比で、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて１８時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清１００μｌを回収して、産生されたＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにより測定した。このとき、エフェクター細胞を誘導するのに用いたペプチドとＴ２細胞にパルスしたペプチドとが同じものになるように、エフェクター細胞と標的細胞とを組み合わせた。また、対照としてＨＩＶペプチドを用い、ＨＩＶペプチドをパルスしたＴ２細胞を認識したＣＴＬのＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。算出された各測定値（ＮＥＴ）はスチューデントｔ検定で統計処理し、Ｐ値が０．０５以下であるものを有意差があると見なした。また、ＩＦＮ−γ産生をＮＥＴで８０ｐｇ／ｍｌ以上かつ有意差をもって促進したペプチドを陽性と判定した。
【００７４】
その結果、ＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）が、５例中３例のＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来ＰＢＭＣからＩＦＮ−γ産生を促進した。また、ＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）およびＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）が、それぞれ１２例中５例および６例のＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣからＩＦＮ−γ産生を促進した。すなわち、これらペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来および／またはＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導することが分かった。
【実施例７】
【００７５】
（ペプチドにより誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性）
ＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）およびＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）によりＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来またはＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者由来のＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を、前立腺癌細胞を用いて、ＩＦＮ−γ産生試験および^５１Ｃｒ遊離試験で検討した。
【００７６】
まず、２例の健常人由来または１例の前立腺癌患者由来のＰＢＭＣを、実施例６と同様にペプチドで刺激し、エフェクター細胞として用いた。標的細胞には、ＨＬＡ−Ａ２⁻前立腺癌細胞株ＰＣ９３にＨＬＡ−Ａ２遺伝子を常法により導入して発現させた細胞ＰＣ９３−Ａ２を用いた。また対照として、当該ＨＬＡ−Ａ２⁻前立腺癌細胞を用いた。エフェクター細胞の一部を用いて標的細胞と混合培養した。培養は、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒの条件下で３７℃にて１８時間行なった。インキュベーション後の上清１００μｌを回収して、産生されたＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００７７】
その結果を表２に示す。ＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）とＨＬＡ−Ａ２^＋健常人由来ＰＢＭＣとの培養により、該ＰＢＭＣからの、ＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌細胞に対するＩＦＮ−γ産生が促進された。また、ＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）とＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣとの培養により、該ＰＢＭＣからの、ＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌細胞に対するＩＦＮ−γ産生が促進された。これらの結果は、いずれもスチューデントｔ検定で統計学的に有意差が認められた。
【００７８】
【表２】

【００７９】
次に、前立腺癌患者由来ＰＢＭＣをＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）と共に１５日間培養して刺激し、さらに１０日間培養してエフェクター細胞として用い、前立腺癌細胞に対する細胞傷害活性を試験した。前立腺癌細胞は、ＰＣ９３−Ａ２を用いた。対照としてＰＣ９３を用いた。細胞傷害活性は、標準的な６時間の^５１Ｃｒ遊離試験でＥ／Ｔ比２０または４０で測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した。
【００８０】
その結果、ＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）で刺激した前立腺癌患者由来ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２を発現させた前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２を特異的に溶解した（表３）。
【００８１】
【表３】

【００８２】
これらから、ＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）は、癌患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが明らかになった。また、ＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）により、腫瘍細胞に対する癌患者のＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生が促進されることから、ＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）も同様にＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導すると推定できる。
【実施例８】
【００８３】
ＰＳＣＡ由来のＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するペプチドについて、これらに対するＩｇＧクラスの抗ペプチド抗体の、ＨＬＡ−Ａ２^＋健常人血清およびＨＬＡ−Ａ２^＋前立腺癌患者血清中の存在を、実施例３と同様にＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、前立腺癌患者由来ＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導したペプチドである、ＰＳＣＡ２１−３０（配列番号７）に対する抗体が、健常人５例中５例および前立腺癌患者１２例中９例で検出された。ＰＳＣＡ７−１５（配列番号６）に対する抗体は、健常人５例および前立腺癌患者１２例のいずれにおいても検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明においては、前立腺癌マーカーとして知られているＰＳＡ、ＰＳＭＡ、およびＰＳＣＡのアミノ酸配列に基づいてペプチドを設計して合成し、該ペプチドのうち前立腺癌患者由来のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬを誘導するものを同定した。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の人口の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、およびアフリカ黒人の約２３％でみられる。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子は日本人の人口の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、白人の約２０％、およびアフリカ黒人の約１２％で見られる。したがって、本発明に係るペプチドは比較的多数の癌患者における特異的免疫治療に適用できる。かくして本発明で提供されるペプチドは、癌の、例えば前立腺癌の治療において極めて有用な手段を提供する。また、本発明に係るペプチドは、既に報告されている腫瘍抗原ペプチドと組み合わせて使用することにより、複数種類の腫瘍抗原を認識する細胞集団であるＣＴＬの誘導および／または活性化、並びに癌の多様性に対応できるため、その有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
第１図は、前立腺癌患者例１について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。
第２図は、前立腺癌患者例１について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。
第３図は、前立腺癌患者例１について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。
第４図は、前立腺癌患者例２について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。
第５図は、前立腺癌患者例２について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。
第６図は、前立腺癌患者例２について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。
第７図Ａは、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）がそれぞれ、ＨＬＡ−２４^＋前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２４に対する反応におけるＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。第７図Ｂは、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）と共に培養したＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人由来ＰＢＭＣが、ＰＣ９３−Ａ２４に対して細胞傷害活性を示したことを示す。図中、＊はスチューデントＴ検定で有意差が認められたことを示す。
第８図Ａは、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）およびＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）がそれぞれ、ＨＬＡ−２４^＋前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２４に対する反応におけるＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。第８図Ｂは、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）と共に培養したＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者由来ＰＢＭＣが、ＰＣ９３−Ａ２４に対して細胞傷害活性を示したことを示す。図中、＊はスチューデントＴ検定で有意差が認められたことを示す。
第９図Ａは、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者血清中に、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体が検出されたことを示す。第９図Ｂは、ＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体が検出されたＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者血清を、予めＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）で吸着すると、その抗体価が低減したことを示す。図中、＊はスチューデントＴ検定で有意差が認められたことを示す。
第１０図は、ＨＬＡ−Ａ２４^＋健常人血清中に、ＰＳＡ１５２−１６０（配列番号１）またはＰＳＡ２４８−２５７（配列番号２）に対する抗体が検出されたことを示す。
第１１図Ａは、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）が、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−２４^＋前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２４を認識するＣＴＬを誘導したことを示す。第１１図Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者のＰＢＭＣからＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）により誘導されたＣＴＬのＨＬＡ−２４^＋前立腺癌細胞ＰＣ９３−Ａ２４に対するＩＦＮ−γ産生が、抗ＣＤ８抗体により低減されたことを示す。図中、＊はスチューデントＴ検定で有意差が認められたことを示す。
第１２図Ａは、ＨＬＡ−Ａ２４^＋前立腺癌患者血清中で、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）に対する抗体が検出されたことを示す。第１２図Ｂは、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）に対する抗体が検出されたＨＬＡ−Ａ２４ ^＋ 前立腺癌患者血清を、予めＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）を被覆したビーズを用いて吸着すると、その抗体価が低減したことを示す。第１２図Ｃは、ＨＬＡ−Ａ２４ ^＋ 前立腺癌患者血清を吸着させた、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）を被覆したビーズの溶出液中に、ＰＳＭ６２４−６３２（配列番号３）に対する抗体が検出されたことを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列表の配列番号１：ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号２：ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号３：ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＭＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号４：ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＣＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号５：ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＣＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＣＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＣＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号１０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＡのアミノ酸配列から設計されたオリゴペプチド。
配列表の配列番号１１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＭＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
配列表の配列番号１２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ＰＳＭＡのアミノ酸配列から設計されたペプチド。
【配列表】

Claims (3)

1. ＨＬＡ−Ａ２４陽性癌患者に適用される配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする薬剤。
2. 癌ワクチンである請求項１の薬剤。
3. ＨＬＡ−Ａ２４陽性患者血清中の細胞障害性Ｔ細胞の誘導に使用する請求項１の薬剤。

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