KR100398819B1 - gp39길항제를포함하는약제조성물 - Google Patents

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제이. 노엘 랜돌프
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트러스티스 오브 다트마우스 칼리지
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Abstract

본 발명은 흉선-의존성(TD) 항원에 대한 체액성 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 피검자에게 접촉-의존성 헬퍼(helper) 주효체 기능을 매개하는 분자의 길항제와 함께 TD 항원을 투여하는 단계를 포함하고 있다. 바람직한 한 구체예에서, 길항제는 gp39의 길항제이다. 1차 및 2차 체액성 면역 반응은 억제 및 연장될 수 있다.

Description

gp39 길항제를 포함하는 약제 조성물
발명의 배경
면역계는 외래 항원에 대하여 두 가지 타입의 항원-특이적 반응을 일으킬 수 있다. 세포-매개성 면역은 T 림프구에 의해 매개되는 면역계의 이펙터 기능을 설명하는데 사용되는 용어이다. 체액성 면역은 B 림프구에 의한 항원-특이적 항체의 생성을 설명하는데 사용되는 용어이다. 대부분의 항원에 대한 체액성 면역의 발달에는 항체-생성 B 림프구 뿐만 아니라 헬퍼 T(이하 Th로 표기) 림프구의 관여를 필요로 한다는 것은 오랫동안 인식되어 온 사실이다[참조: Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:18-25(1971); Claman and Chaperon, Transplant Rev., 1:92-119(1969); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70:2624-2629(1973); Raff et al., Nature, 226:1257-1260(1970)]. 특정한 신호 또는 "헬프(help)"는 흉선-의존성(이하 TD로 표기) 항원에 의한 자극에 반응하여 Th 세포에 의해 제공된다. 일부 B 림프구 헬프는 Th 세포에 의해 방출된 가용성 분자(예를 들어, IL-4 및 IL-5 같은 림포카인)에 의해 매개되는 한편, B 세포의 활성화는 B 세포와 Th 세포간의 접촉-의존성 상호 작용을 또한 필요로 한다[참조: Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736-3744 1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1754 (1989)]. 이는 B 세포 활성화가 B 세포상의 세포 표면 분자와 Th 세포간에 필수적인 상호작용을 필요로 함을 의미한다. 그러한 상호작용은 활성화된 T 세포에서 분리된 원형질막이 B 세포 활성화에 필요한 헬퍼 기능을 제공할 수 있다는 관찰에 의해 더욱 뒷받침된다[참조: Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146:1118-1124 (1991)].
세포 표면 분자 CD40은 항체에 의해 가교되는 경우 B 세포 증식을 유도하는 미성숙 및 성숙 B 림프구상에서 확인된다[참조: Valle et al., Eur. J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140:1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989)]. CD40은 분자적으로 클로닝되고 특성화되었다[참조: Stamenkovic et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. CD40에 대한 리간드인 gp39(CD40 리간드 또는 CD40L로도 지칭됨)도 분자적으로 클로닝되고 특성화되었다[참조: Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. gp39 단백질은 휴지 상태가 아닌 활성화된 CD4+Th 세포상에서 발현된다[참조: Spriggs et al., J. Exp. Med., 176:1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22:2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immunol., 151:1-14(1993)]. gp39 유전자에 의해 트랜스펙션되어 표면상에서 gp39 단백질을 발현하는 세포는 B 세포 증식을 일으킬 수 있으며, 다른 자극성 신호와 함께 항체 생성을 유도할 수 있다[참조: Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)].
체액성 면역 반응의 유도는 중요한 숙주 방어 메카니즘이지만, 특정 경우에는 특정 항원에 대한 항체 생성을 억제하는 것이 유리할 것이다. 예를 들면, 알레르겐에 대한 체액성 면역이 억제되면 개체내의 알레르기 반응이 저해 또는 감소될 수 있다. 부가하여, 치료 항체가 투여된 경우, 그 항체에 대한 체액성 반응을 억제하면 항체의 치료 효능을 연장시킬 수 있다.
발명의 요약
체액성 면역을 억제하는 한 방법은 B 세포 활성화를 억제하는 것이다. 본 발명은 Th 세포가 B 세포를 자극하는 능력을 저해하여 B 세포 활성화 및 항체 생성을 저해함으로써, 생체내에서 TD 항원에 대한 체액성 면역을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 B 세포의 후속 활성화를 위해서는 Th 세포상의 gp39와 B 세포상의 CD40간의 생체내 상호작용이 필수적이라는 점에 적어도 부분적으로 기초한다. 생체내에서 gp39와 CD40의 상호작용을 효과적으로 억제하는 gp39 길항제는 TD 항원과 함께 피검자에 투여되어 TD 항원에 대한 체액성 면역을 억제한다. 투여되는 gp39 길항제는 gp39에 대한 항체일 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, gp39 길항제는 항-인간 gp39 항체 또는 항-마우스 gp39 항체(예를 들어, MR1) 같은 모노클로날 항체이다. 또한, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 항체 단편이 본 발명의 범위에 포함된다. 대안적으로, gp39 길항제는 gp39의 리간드인 CD40의 가용성 형태일 수 있다. 또한, CD40의 가용성 융합 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 억제되는 체액성 면역 반응은 항원에 대해 처음 노출된 경우에는 1차 체액성 면역 반응일 수 있고, 이미 노출된 항원에 재노출되는경우에는 2차 체액성 면역 반응일 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법은 항원-특이적인 IgM 항체, IgG 항체, IgD 항체 및/또는 IgE 항체의 생성을 억제하는데 이용될 수 있다. 부가하여, 본 발명에 따른 방법은 생체내에서 체액성 면역 반응의 지속적인 억제를 제공한다.
본 발명의 한 가지 측면은 TD 항원에 대한 체액성 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 속하는 항원들에는 특이적 항체 생성에 B 세포 표면상의 리간드(예를 들어, CD40) 및 gp39의 상호작용이 필요한 항원들이 포함된다. 일반적으로, TD 항원에는 단백질성 항원이 포함된다. 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 항원은 치료 항체, 약물, 알레르겐 또는 외래 세포이다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 흉선-비의존성 타입 II(이하 TI-2로 표기함) 항원에 대한 체액성 면역 반응을 유지하면서 TD 항원에 대한 체액성 면역 반응을 효과적으로 억제한다.
본 발명의 또다른 측면은 gp39 길항제를 투여하여 gp39와 B 세포 표면상의 리간드(예를 들어, CD40)의 상호작용을 저해함으로써, 생체내에서 활성화된 Th 세포의 헬퍼 기능을 특이적으로 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, Th 세포를 삭제하거나 아네르기화하지 않고 활성화된 Th 세포의 헬퍼 기능이 생체내에서 억제된다.
더 나아가 본 발명은 gp39 길항제 및 또다른 면역억제제를 병용 투여하여 생체내에서 체액성 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. gp39 길항제와 함께 제공될 수 있는 다른 면역억제제들에는 사이토카인 저해제, CD28/CTLA4 T 세포 공동 자극 경로 저해제 또는 면역억제 약물이 포함된다.
본 발명의 추가의 측면은 항원이 TD 항원 또는 TI-2 항원인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이것은 생체내에서 항원에 대한 체액성 면역 반응이 gp39 길항제에 의해 억제될 수 있는지 여부로 결정될 수 있다.
제 1A도는 생체내에서 항-gp39 처리에 의해 1차 항-SRBC IgM 항체 생성이 억제되는 것을 도시한 막대 그래프이다.
제 1B도는 생체내에서 단기간의 항-gp39 처리후에 1차 항-SRBC IgM 항체 생성이 지속적으로 억제되는 것을 도시한 그래프이다.
제 2A도는 생체내에서 항-gp39 처리에 의해 2차 항-KLH 항체 생성(다양한 이소타입)이 억제되는 것을 도시한 막대 그래프이다. 항체의 역가는 항원을 투여한지 7일후에 측정하였다.
제 3도는 생체내에서 항-gp39 처리에 의해 1차 항-ChiL6 IgM 항체 생성(좌) 및 2차 항-ChiL6 IgG1 항체 생성(우)이 억제되는 것을 도시한 막대그래프이다.
제 4A도는 TNP-SRBC에 의한 면역 및 생체내에서 항-gp39 처리에 의해 1차 항-TNP IgM 항체 생성이 억제되는 것을 도시한 막대 그래프이다.
제 4B도는 TNP-Ficoll에 의한 면역 및 생체내에서 항-gp39 처리에 의해 1차 항-TNP IgM 항체 생성이 억제되지 않는 것을 도시한 막대 그래프이다.
제 5도는 비처리 마우스로 입양 전달(adoptive transfer)시 생체내에서 항-gp39 처리에 이미 노출된 T 세포의 손상되지 않은 헬퍼 활성을 도시한 막대 그래프이며, 항-gp39를 투여해도 기능적으로 Th 세포를 삭제하지 못하는 것을 나타낸다.
제 6A도는 생체내 투여후 7, 14 및 21일에 혈청내에 존재하는 항-gp39를 도시한 웨스턴 블롯이다.
제 6B도는 생체내 투여후 7, 14 및 21일에 혈청내 잔존 항-gp39의 백분율을 도시한 그래프이다.
제 7A, B 및 C도는 6시간 활성화된 인간 말초 혈액 림프구를 CD40Ig(패널A), mAb 4D9-8(패널B) 또는 mAb 4D9-9(패널C)중 하나로 염색한 것을 나타내는 유동 혈구계산 프로필이다.
제 8A, B, 및 C도는 시클로스포린 A의 존재하에 배양된 6시간 활성화된 인간 말초 혈액 림프구를 mAb 4D9-8(패널A), mAb 4D9-9(패널B) 또는 CD40Ig(패널C)중 하나로 염색한 것을 나타내는 유동 혈구계산 프로필이다.
제 9A 및 B도는 6시간 활성화된 인간 말초 혈액 림프구를 표지되지 않은 mAb 4D9-8(패널A) 및 표지되지 않은 mAb 4D9-9(패널B)의 존재하에 CD40Ig로 염색한 것을 나타내는 유동 혈구계산 프로필이다.
제 10도는 세포가 항-인간 gp39 mAb 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 또는 89-79의 존재하에 배양되는 경우에 가용성 gp39 및 IL-4에 의해 유도된 인간 B 세포 증식 억제를 도시한 그래프이다.
제 11도는 세포가 항-인간 gp39 mAb 24-31 또는 89-79의 존재하에 배양되는 경우, 동종-특이적(allo-specific) 혼합 림프구 반응의 억제를 도시한 그래프이다.
흉선-의존성(TD) 항원에 대한 체액성 면역의 발생에는 항원에 대해 특이적인항체를 생성할 수 있는 B 림프구 뿐만 아니라 B 림프구의 활성화에 필요한 Th 세포의 기여도 필요하다. T 헬퍼 세포 작용은 B 림프구에 의해 사용되는 사이토카인의 생성을 포함하지만, B 세포에 외인성 사이토카인을 공급해도 B 세포 활성화에는 Th 세포가 여전히 필요하다. 반대로, B 세포와 Th 세포간의 접촉-의존성, 세포막-매개성 상호작용은 체액성 반응 유도에 필수적이다. 이러한 상호작용에 관련된 수용체-리간드 쌍 CD40 및 gp39가 확인되었다. CD40를 B 세포상에 존재하고, gp39에 결합하는 능력을 가지며, gp39는 활성화시 Th 세포상에서 유도되어 B 세포의 자극 및 궁극적으로는 특이적 항체의 생성을 초래한다. 따라서, 이러한 CD40-gp39 상호작용의 파괴는 특이적 체액성 면역 반응의 발생을 억제하는 수단이 된다.
따라서, 본 발명은 생체내에서 TD 항원에 대한 체액성 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 체액성 면역 반응은 접촉-의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 Th 세포상의 분자와 B 림프구 표면상의 리간드간의 상호작용을 저해함으로써 억제된다. 한 바람직한 구체예에서, 체액성 면역 반응은 생체내에서 gp39 길항제를 피검자에 투여하여 T 세포상의 gp39와 TD항원에 노출된 B 세포상의 CD40간의 상호작용을 저해함으로써 억제된다. 바람직하게는, 이러한 TD 항원은, 예를 들어 치료 항체 또는 약물 같은 치료제이며, 이것이 치료를 위해 환자에게 투여되면 그것에 대한 체액성 면역 반응이 억제되어 약제의 치료 효능이 지속될 수 있다. 또다른 구체예에서, TD 항원은 알레르겐과 같이 피검자에게 환경적으로 노출되는 항원이며, 이러한 경우 체액성 면역 반응은 피검자에게 해로우며, 예를 들어 알레르기 반응을 초래한다. 이러한 경우, 체액성 면역 반응 억제가 피검자에게 치료학적으로 유리할수 있다.
I. qp39 길항제
본 발명의 방법에 따라, gp39 길항제는 피검자에게 투여되어 B 세포 상의 gp39 리간드와 T 세포상의 gp39간의 상호작용을 저해한다. gp39 길항제는, 이러한 상호작용을 저해하는 분자로 정의된다. 상기 gp39 길항제는, gp39에 대한 항체(예를 들어, gp39에 대한 모노클로날 항체), gp39에 대한 항체의 단편 또는 유도체(예를 들어, Fab 또는 F(ab)'2 단편, 키메라 항체 또는 인간화된 항체), gp39 리간드의 가용성 형태(예를 들어, 가용성 CD40), gp39 리간드의 융합 단백질의 가용성 형태(예를 들어, 가용성 CD40Ig) 또는 gp39-CD40 상호작용을 파괴하는 약제일 수 있다.
A. 항체
포유동물(예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 토끼)은 포유동물의 항체 반응을 유도하는 gp39 단백질 또는 단백질 단편(예를 들어 펩티드 단편)의 면역원성 형태로 면역시킬 수 있다. 또한, 표면상에 gp39를 발현시키는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 다른 면역원은 정제된 gp39 단백질 또는 단백질 단편을 포함한다. gp39는 표준 정제 기술로 gp39-발현 세포로부터 정제할 수 있다; gp39 cDNA[참조: Armitage et al., Nature, 357:80-82 1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]는 숙주 세포, 예를 들어 세균 또는 포유동물의 세포주에서 발현되며, gp39 단백질이 정제될 수 있다. gp39 펩티드는 gp39의 아미노산 서열을 기초로 하여 합성될 수있다[참조: Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. 단백질에 면역원성을 부여하는 기술은 담체와의 콘쥬게이션 또는 당업자에게 널리 공지되어 있는 그외의 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 단백질은 아쥬반트의 존재하에 투여될 수 있다. 면역화 진행 과정은 혈장 또는 혈청의 항체 역가를 검출하여 모니터링할 수 있다. 항원으로 면역원을 사용하고, 표준 ELISA 또는 그외의 면역분석법을 이용하여 항체의 수준을 추정할 수 있다.
면역후에, 항혈청을 수득하고, 필요에 따라 폴리클로날 항체를 상기 혈청으로부터 분리할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 항체 생성 세포(림프구)를 면역된 동물로부터 수집하여, 표준 체세포 융합 공정에 의해 골수종 세포와 융합시켜서, 이들 세포를 불멸화시키고, 하이브리도마 세포를 생성시킬 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 하이브리도마 기술은 퀄러 및 밀스테인(Kohler and Milstein)[참조: Nature (1975) 256:495-497]에 의해 최초로 개발되었고, 인간 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4:72], 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole et al. Monocloanl Antibodies in Cancer Therapy (1985), Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96] 및 조합 항체 라이브러리의 스크리닝[참조: Huse et al., Science (1989) 246:1275]과 같은 기타 방법들이 개발되었다. 하이브리도마 세포는, 분리된 모노클로날 항체 및 단백질 또는 펩티드에 특이적으로 반응하는 항체의 생성을 위해, 면역화학적으로 스크리닝될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체(antibody)"는 gp39 단백질 또는 이것의 펩티드 또는 gp39 융합 단백질에 특이적으로 반응하는 단편을 포함하는 의미이다. 항체는 종래 기술을 이용하여 단편화시킬 수 있고, 상기 단편들은 사용을 위해 전체 항체에 대해 전술한 바와 같은 방법으로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2단편은 펩신으로 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2단편은 Fab' 단편을 생성하도록 이황화물 다리(bridge)를 환원하여 처리될 수 있다. 본 발명의 항체는 그외에 항-gp39 부분을 갖는 양쪽특이적 및 키메라 분자를 포함한다.
인간 이외의 피검자에서 생성된 항체가 치료를 목적으로 인간에게 사용되는 경우에, 그것들은 정도에 따라 이물질로서 인식되므로, 환자내에서는 면역 반응이 발생될 수 있다. 일반적인 면역억제 보다 바람직한, 이러한 문제를 제거하거나 또는 최소화하는 한 가지 방법은 키메라 항체 유도체, 즉 인간 이외의 동물의 가변 영역 및 인간의 불변 영역을 조합한 항체 분자를 생성시키는 것이다. 키메라 항체 분자는, 예를 들어 인간의 불변 영역과 함께 마우스, 랫트 또는 그외의 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 다양한 방법이 기술되어 왔고, 이는 gp39를 인식하는 면역글로불린 가변 영역을 함유하는 키메라 항체를 제조하는데 이용될 수 있다[참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851(1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,897; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496; EuropeanPatent Publication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B]. 이러한 키메라 항체는 인간 피검자에서 대응하는 비키메라 항체 보다 덜 면역원성일 것으로 기대된다.
인간을 치료하기 위해서 gp39 단백질 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 모노클로날 또는 키메라 항체는, 가변 영역의 일부, 특히 항원-결합 도메인의 보존 구조 영역은 인간을 기원으로 하고, 단지 초가변 영역만이 인간 이외의 것을 기원으로 한, 인간의 불변 영역 키메라를 생성시킴으로써 추가적으로 인간화될 수 있다. 이러한 변형된 면역글로불린 분자는 당업자에게 공지된 여러 가지 방법[참조: Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982)]에 의해 수득될 수 있고, 바람직하게는 PCT 공보 제 WO92/06193호 또는 EP 제 0239400호의 방법에 따라 제조된다. 인간화된 항체는, 예를 들어 스코토겐 리미티드(Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain)에 의해 상업적으로 제조된다.
gp39 단백질 또는 펩티드에 대해 반응하는 특이적 항체 또는 항체 단편을 제조하는 또다른 방법은, 세균에서 발현되는 면역글로불린 유전자 또는 이것의 일부를 코드화하는 발현 라이브러리를 gp39 단백질 또는 펩티드에 의해 스크리닝하는 방법이다. 예를 들어, 파지 발현 라이브러리를 사용하여, 완전한 Fab 단편, VH영역 및 FV영역을 세균에서 발현시킬 수 있다[참조: Ward et al., Nature, 341:544-546(1989); Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989); 및 McEafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]. 이러한 라이브러리를, 예를 들어 gp39로 스크리닝하여 gp39와 반응하는 면역 글로불린 단편을 확인할 수 있다. 다른 방법으로, 젠팜(Genpharm)에 의해 개발된 SCID-hu 마우스를 사용하여 항체 또는 그것의 단편을 생성할 수 있다.
B. gp39에 대한 가용성 리간드
체액성 면역을 억제하기 위해 투여할 수 있는 다른 gp39 길항제들은 gp39 리간드의 가용성 형태이다. gp39의 1가의 가용성 리간드는 gp39와 결합하여, B 세포상의 CD40와 gp39의 상호작용을 억제할 수 있다. 용어 "가용성(soluble)"은, 상기 리간드가 세포막에 영구적으로 결합되어 있는 것이 아님을 나타낸다. 가용성 gp39 리간드는 화학 합성 또는 바람직하게는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 가용성 gp39 리간드는 가용성 CD40이다. 다른 방법으로, 가용성 gp39 리간드는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 이러한 융합 단백질은, 제 2의 분자에 부착된 gp39 리간드의 일부 또는 전부를 포함한다. 예를 들어, CD40은 면역글로불린과의 융합 단백질(CD40Ig)로서 발현될 수 있다. 한 구체예에서, CD40Ig 융합 단백질을 형성하기 위해 Cγ1의 현지 CH2 및 CH3 영역에 대응하는 서열의 아미노산 잔기에 결합된 CD40의 세포외 도메인 부분의 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질이 생성된다[참조: Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 1783:721-730; Capon et al;. (1989) Nature 337, 525-531; and Capon U.S. 5,116,964]. 상기 융합 단백질은 화학 합성, 또는 바람직하게는 CD40의 cDNA를 기본으로 하는 재조합 DNA 방법[참조:Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)]에 의해 생성될 수 있다.
II. 체액성 면역이 억제되는 항원
본 발명은 Th 세포에 의해 전달되는 접촉-의존성 헬퍼 기능을 필요로 하는 항원에 대한 체액성 면역을 억제하는 것에 관한 것이다. 전형적으로, 흉선-의존성(TD) 항원으로 기술된 항원들이 본 발명의 범위에 포함된다. Th 세포로부터 접촉-의존성 "헬프(help)"가 필요한 것은 T 세포상의 gp39와 B 세포상의 CD40간의 상호작용에 대한 필요성 때문일 수 있다. 본 발명에 의하여 정의된 바와 같이, 용어 "TD 항원"은 항원에 대한 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 T 세포와 B 세포간의 gp39-CD40 상호작용을 필요로 하는 항원이 포함되는 것을 의미한다. 일반적으로 단백질 항원은 TD 항원이다. 본 발명의 범위에 포함되는 TD 항원의 또다른 형태는 단백질에 결합된, 합텐으로 지칭되는 분자이다. 이러한 경우에, 단백질은 T 세포 헬프를 유도하기 위한 담체로 작용하여 합텐에 대한 체액성 면역 반응을 유도하게 된다.
본 발명에 따른 TD 항원은, 예를 들어 가용성 단백질 주사와 같은 가용성 형태로 투여될 수 있거나, TD 항원은, 예를 들어 세포 표면 단백질과 같이 피검자의 세포 표면상에 있을 수 있다. TD 항원은 gp39 길항제와 함께 피검자에 투여될 수 있고, 또는 피검자가 알레르겐 같이 TD 항원에 환경적으로 노출될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, TD 항원은 치료를 목적으로 피검자에게 투여되는 약제이다. 이러한 약제는, 예를 들어 TD 항원인 치료 항체 또는 다른 형태의 치료 약물일 수 있다. 예를 들어, 치료 항체에 대한 체액성 면역 반응을 억제시키면 피검자에서 치료 항체의 제거(clearance)를 저해하여 생체내에서 그것의 효능을 연장시킬 수 있다. 또한, 치료제로서 작용하는 작은 분자들은 이러한 분자들(합텐으로 기능하는)이 B 세포를 활성화시키는 T 세포 헬퍼 기능을 유도하는 단백질 또는 다른 담체들과 함께 투여되는 경우, 체액성 면역이 억제되는 표적 항원이 될 수 있고, 이러한 치료제에 대한 체액성 면역의 억제는 유사하게 이들의 효과를 지속화할 수 있다.
본 발명에 따른 방법들은 흉선-비의존성 타입 II(TI-2) 항원에 대한 반응에 영향을 미치지 않으면서 TD 항원에 대한 체액성 면역 억제를 제공한다. TI-2 항원에는 폴리클로날 방식으로 B 세포를 비특이적으로 활성화할 수 있는 폴리사카라이드 및 지질이 포함된다. 본 발명에 의해 정의된 바와 같이, 용어 "TI-2 항원"은 항원에 대한 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 T 세포와 B 세포간의 gp39-CD40 상호작용을 필요로 하지 않는 모든 항원을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 항원에 대한 체액성 면역 반응이 gp39 길항제에 의해 억제될 수 있는지 여부를 결정함으로써, 항원이 본 발명에 의해 정의된 TD 항원 또는 TI-2 항원인지를 확인하는 방법을 제공한다.
III. 체액성 면역의 억제
본 발명은 TD 항원에 대한 체액성 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 체액성 면역 반응은 TD 항원에 처음 노출된 경우에는 1차 면역 반응일 수 있고, 그 항원에 재노출되는 경우에는 2차 면역 반응일 수 있다. 하나 이상의 항체 이소타입의 생성이 억제될 수 있다. IgM이 주로 생성되는 항체인 1차 체액성 면역 반응의 경우, 주로 IgM 생성이 억제된다. 2차 체액성 면역 반응의 경우, IgM, IgG및 IgE를 포함하는 수 개의 다른 이소타입의 생성이 억제될 수 있다.
본 발명은 TD 항원에 대한 체액성 면역을 지속적으로 억제하는 방법을 제공하는 것이다. 본 명세서에서 사용하는 용어인 "지속적인 억제"는 TD 항원에 대한 항체 생성의 억제가 생체내에서 gp39 길항제의 투여가 종결된 후에도 유지됨을 의미한다.
IV. gp39 길항제의 투여
TD 항원에 대한 체액성 면역 반응은 본 명세서에서 기재한 방법에 따라, TD 항원에 노출된 피검자에게 gp39 길항제를 투여함으로써 억제될 수 있다. 한 구체예에서, gp39 길항제는 TD 항원과 함께 투여된다. gp39 길항제는 TD 항원과 동시에 투여하는 것이 바람직하지만, TD 항원이 B 세포 활성화를 유도하기 전에 gp39 길항제를 투여하기만 하면 TD 항원의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다. 다른 구체예들에서는, 피검자가 항원에 환경적으로 노출된다. 이러한 경우에는, gp39 길항제를 항원에 노출된 후 B 세포 활성화를 억제하는데 충분히 근접한 시간내에 생체내 투여해야 한다.
본 발명의 길항제는, 체액성 면역 반응을 억제하기 위해 생체내 약제 투여에 적합하고 생물학적으로 허용가능한 형태로 피검자에 투여된다. "생체내 투여에 적합하고 생물학적으로 허용가능한 형태(biologically compatible form suitable for administration in vivo)"는 단백질의 치료학적 효과가 독성 효과를 능가하도록 투여되는 길항제의 형태를 의미한다. "피검자(subject)"는 포유류를 포함하여 면역 반응이 유도될 수 있는 살아 있는 유기체를 의미하는 용어이다. 피검자의 예에는인간, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 이들의 유전자이식 종(transgenic species)이 포함된다. 본원에서 기재한 바와 같이 gp39와 CD40의 상호작용을 저해하는 길항제는 임의의 약리학적인 형태 및 약제학적으로 허용되는 담체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료학적 조성물을 치료학적 활성량으로 투여하는 것은 목적하는 결과를 달성하는데 필요한 기간 동안 투여의 유효량으로 정의된다. 예를 들어, gp39와 CD40의 상호작용을 저해하는 길항제의 치료학적 활성량은 개체의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 요소 및 그 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 길항제의 능력에 따라 변화할 수 있다. 투약 계획은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 하루에 수회의 분할 투여량이 투여되거나, 투여량이 치료 상황에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다.
활성 화합물(예를 들어, 길항제)은 주사(피하, 정맥내 등), 경구 투여, 흡입, 경피 투여 또는 직장 투여와 같은 편리한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 효소, 산 및 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하기 위한 재료로 코팅될 수 있다.
비경구적 투여외의 방법으로 gp39와 CD40의 상호작용을 저해하는 길항제를 투여하기 위해서는, 그것의 불활성화를 방지하기 위한 재료로 길항제를 코팅하거나 또는 이와 함께 길항제를 병용 투여할 필요가 있다. 예를 들어, 길항제는 적당한 담체 또는 희석제로 개체에 투여되거나, 효소 저해제와 병용 투여되거나, 리포솜과 같은 적당한 담체로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 식염 및 완충 수용액을 포함한다. 효소 저해제는 췌장 트립신 저해제, 디이소프로필 플로오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤(trasylol)을 포함한다. 리포솜은 수중유중수(W/O/W) 에멀션 및 통상적인 리포솜을 포함한다[참조: Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol 7:27].
또한 활성 화합물은 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이것들의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이러한 제조는, 미생물의 증식을 방지하기 위해 방부제를 함유할 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액을 즉시 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 분산매 또는 용매일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물중에 등장화제, 예를 들어 당류, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 지속적 흡수는, 조성물중에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이룰 수 있다.
멸균 주사용 용액은, 상기 나열된 성분 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 적당한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, gp39와 CD40의 상호작용을 저해하는 길항제)을 혼입시키고, 필요에 따라 멸균 여과 함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은, 염기성 분산매 및 상기 나열된 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 바람직한 추가적 성분 및 활성 성분(예를 들어, 길항제)과 임의의 추가 성분으로 된 분말을, 미리 멸균 여과된 용액으로부터 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 방법이다.
활성 화합물이 상기 기술된 것과 같이 적당하게 보호된 경우, 상기 단백질은, 예를 들어 비활성 희석제 또는 흡수되는 식용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 모든 용매, 분산매, 코팅액, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 약제의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 약제가 활성 화합물과 배합부적인 경우를 제외하고, 치료학적 조성물에 이것의 사용이 고려된다. 또한, 부가적인 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해, 투약 단위 형태로 비경구적 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 것과 같은 투약 단위 형태로는 치료할 포유류 피검자에 대한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적으로 분리된 단위체를 지칭하며; 각 단위체는 필요한 약제학적인 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명에 따른 투약 단위 형태에 대한 규격은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위한 활성 화합물을 조제하는 기술 분야에 내재하는 한계에 의해 규정되고 이들에 직접적으로 의존한다.
V. gp39 길항제 및 다른 면역억제제의 병용 투여
또한, Th 세포상의 공동자극성 분자인 CD28의 자극(triggering)이 가용성 CTLA-4에 의해 저해되면 TD 항체 반응이 억제되고[30], 이종유전자 이식편 거부 반응이 차단되는 것[31]으로 밝혀졌다. 항-gp39 투여와 유사하게, 가용성 CTLA-4는 지속적인 면역억제 상태를 유도하였다. 항-gp39 및 CTLA-4는 체액성 면역 반응의 별개의 단계에서 면역억제 효과를 매개하므로, 이들 두 면역억제제의 병용 투여는 면역에 대해 상가 또는 상승적인 면역억제 효과를 제공할 수 있다.
알레르기 반응은 IgE 항체에 의해 매개된다. IgE 반응의 생성에는 사이토카인 IL-4가 필요하다. TD 항원에 대한 IgE 반응은 gp39 길항제 및 항-IL-4 항체 같은 IL-4 저해제를 병용 투여하면 보다 효율적으로 저해될 수 있다.
본 발명은 비제한적인 하기의 실시예를 통해 추가로 설명된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌 및 특허출원 공보의 내용은 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있다. 또한, 출원인이 랜돌프 제이. 노엘(Randolph J. Noelle) 등이고, 발명의 명칭이 "항원-특이적인 T 세포 내성을 유도하는 방법"인 본 발명과 출원일이 동일한 특허출원의 내용도 본원에 참고로 포함되어 있다.
하기의 방법론을 실시예에 이용하였다.
재료 및 방법
동물.
6-8주령의 Balb/c 마우스 암컷(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)을 본 연구에서 제시된 생체내 실험에 사용하였다. 동물들을 다트마우쓰 메디칼 스쿨(Dartmouth Medical School)의 특정 병원균이 없는 동물 시설에서 보존하였다.
헬퍼 T 세포 클론(Th1)
I-Ad-제한 토끼 Ig-특이적 Th1 클론 D1.6[21]를 데이비드 파커 박사(University of Mass. at Worcester)로부터 얻었다. 본원에서 D1.6을 Th1으로 지칭하겠다.
시약 및 항체
햄스터 항-쥐 gp39 mAb인 MR1[16]을 복수액으로부터 DEAE HPLC에 의해 정제하였다. 대조 항체로 사용한 햄스터 Ig(HIg)는 햄스터 혈청 (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbuty, NY)으로부터 유사하게 정제하였다. 마우스 항-랫트 κ 사슬(햄스터 κ 사슬과 강력하게 교차반응) 항체(RG7)인 RG7/7.6.HL[22]를 HRPO 또는 FITC와 콘쥬게이션시켜 MR1 및 HIg를 검출하기 위한 2차 시약으로 사용하였다. 친화성-정제된 염소 항-마우스 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b및 IgG3(Sourthern Biotechnology, Birmingham AI)을 전체 IgM 및 IgG1 ELISA에서 뿐만 아니라, 항원 특이적인 ELISA에서 검출 항체로서 사용하였다. 모노클로날 항-쥐 IgE인 B1E3(아이오와 대학의 티. 발트슈미트 박사 제공)를 IgE 항-KLH ELISA에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 종양 항원 L6[23]에 특이적인 인간화된 IgG1인 키메라-L6(Chi-L6)은 브리스톨-마이어스 스퀴브 파마슈티컬 리서치 인스티튜트(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA)에 의해 제공되었다. 항-CD4인 GK 1.5[24]를 복수액의 HPLC 정제에 의해 제조하였다. 양 적혈구(SRBC)는 콜로라도 세럼 코포레이션(콜로라도주 덴버 소재)으로부터 구입하였다. 항-SRBC 플라크 어세이에서 사용되는 씨 플라크 아가로오스(sea plaque agarose)는 FMC 코포레이션(메사추세츠주 록랜드 소재)으로부터 얻었다. 새끼 토끼 보체는 세다레인(Cedarlane, Hornby, Ontario Canada)에서 구입하였다. 키호울 림핏 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanine) KLH (Megathura crenulata기원)는 칼바이오켐(켈리포니아주 라졸라 소재)으로부터 구입하였다. 면역을 위한 프로인트 완전 아쥬반트(CFA)는 시그마 케미칼 코포레이션(미저리주 세인트루이스 소재)로부터 얻었다. TNP-SRBC, TNP-KLH 및 TNP-BSA는 전술한 바와 같이 제조한다[25].
생체내에서 1차 및 2차 항체 반응을 일으키기 위한 면역화
1차 면역 반응.SRBC 또는 TNP-SRBC에 대한 1차 항체 반응을 유도하기 위해서 마우스를 200μℓ의 1%SRBC 또는 TNP-SRBC 현탁액으로 면역시켰다(i.v.). IgM, 즉 항-SRBC 반응을 항원을 투여한지 5일후에 여니 플라크 어세이(Jerne plaque assay)[26]의 변법을 이용하여 분석하였다. IgM 항-TNP 반응을 6일째에 ELISA에 의해 측정하였다. 이종 면역글로불린 Chi-L6에 대한 1차 반응을 마우스당 명반상의Chi-L6 100μg을 i.p. 면역에 의해 생성시켰다. 혈청 IgM 항-Chi-L6 항체 반응을 7일후에 측정하였다. TNP-Ficoll에 대한 1차 반응을 25μg TNP-Ficoll의 i.p. 면역에 의해 일으켰다. IgM 항-TNP 반응을 ELISA에 의해 6일째에 측정하였다.
2차 면역 반응.KLH에 대한 2차 면역 반응을 일으키기 위해서 동물들을 CFA중의 KLH(50μg; i.p.)로 면역시켰다. 후속하여, 3개월후에 마우스에 10μg의 가용성 KLH(i.p.)를 투여하였다. 항-KLH 항체 반응을 면역 마우스의 혈청으로부터 이소타입 특이적인 ELISA을 이용하여 7일째에 측정하였다. Chi-L6에 대한 2차 면역 반응은 Chi-L6으로 면역된 마우스에 10μg의 가용성 Chi-L6을 i.p. 투여하여 일으켰다. 혈청 IgG1항-Chi-L6 항체 반응을 7일후에 측정하였다.
항-gp39 처리
HPLC-정제된 멸균 항-gp39(MR1) 또는 HIg(항체 대조)를 각 실험에 대해 지시한 바와 같이 면역 또는 투여후 0, 2, 4일째에 투여하였다(i.p.).
항원 특이적인 ELISA
항원 특이적인 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3및 IgE 항체 역가를 이소타입 특이적 ELISA를 이용하여 측정하였다. 간단하게, 항원(PBS중 KLH, Chi-I-L6, TNP16-BSA 또는 TNP2-BSA 1mg/mℓ)은 4℃에서 밤새 가요성 폴리비닐 마이크로타이터 접시상에 흡수시켰다. 플레이트를 세척하고, PBS-1% FCS-나트륨-아지드로 블로킹하였다. 희석된 혈청 샘플들을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 세척하고, 항원 특이적인 항체의 역가를 알칼리성 포스파타아제 콘쥬게이션된 하기 검출항체중 하나를 이용하여 측정하였다: 염소 항-마우스 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b또는 IgG3(Southern Biotechnology, Birmingham, AI). IgE 특이적인 ELISA는 바이오틴 콘쥬게이션된 B1E3를 사용한 후에 알칼리성 포스파타아제 아비딘(South San Francisco, CA)을 사용하여 검출하였다. 모든 ELISA를 알칼리성 포스파타아제와 포스파타아제 기질(Sigma Chemical, Co., St. Louis, MO)을 반응시켜 발색시켰다. 플레이트를 410nm에서 Dynatech MR700 ELISA 판독기상에서 분석하였다. 유니트는 표준 면역 혈청의 적정 곡선을 기초로 한 무작위 값을 나타낸다. 모든 실험군은 1:100 내지 1:100,000으로 역가가 측정되었고, 역가는 다중점 분석을 기초로 하여 확인되었다. 비투여 대조군에서 항-KLH, 항-Chi-L6 및 항-TNP 항체의 수준은 검출 수준 이하였다.
혈청 항-gp39의 검출
항-gp39-처리 마우스 혈청중 미변화 항-gp39의 정량.750μg의 항-gp39(0, 2, 4일에 250μg)를 투여받은 마우스로부터 혈청을 항-gp39 처리 개시후 7, 14 및 21일째에 얻었다. 혈청을 비환원 조건에서 7.5%의 SDS 겔 상에서 전개시켜 니트로셀룰로오스로 이전시키고, HRPO 콘쥬게이션된 RG7로 블롯팅하였다. 화학발광 검출 후에, 애플 스캐너 앤드 이미지 4.1 소프트웨어 프로그램(Apple Scanner and Image 4.1 Software program)을 이용하여 150-165kDa에 상응하는 블롯팅 영역을 스캐닝 및 디지털화하였다.
처리 마우스 혈청중의 생물학적으로 활성인 항-gp39에 대한 분석: gp39를 발현하는 항-gp39로 활성화된 Th1를, 750μg의 항-gp39(0, 2, 4일에 250μg)를 투여받은 마우스로부터의 혈청 희석액으로 염색하여 혈청중에 잔존하는 생물학적으로 활성인 gp39의 함량을 측정하였다. 항-gp39를 포함하는 혈청 적정액을 활성화된 Th1 세포 클론과 함께 4℃에서 30분간 인큐베이션시킨후 세척하고, 후속하여 FITC-RG7과 함께 4℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 정제된 항-gp39를 이용하여 MFI 대 항-gp39 농도에 대한 표준 곡선을 작성하였다. 샘플을 벡톤 딕킨슨 팩스캔(Becton Dickinson FACScan)상에서 분석하고, 혈청에 잔존하는 항-gp39의 백분율을 항-gp39 표준 곡선을 기초로 유추하였다. 7일째에 혈청에 존재하는 항-gp39의 수준을 100%로 설정하였다.
헬퍼 T 세포의 입양 전달(adoptive transfer)
마우스를 SRBC(1% SRBC 200μℓ, i.v.)로 면역시키고, 항-gp39 또는 HIg(0, 2, 4일에 250μg)를 투여하였다. 7일째에 비면역 마우스 또는 SRBC로 면역된 마우스로부터 비장 세포를 제거하고, 적혈구를 고갈시킨 후, 세척하고 면역 B 세포원으로서 TNP-KLH 프라이밍된(TNP-KLH-CFA, 50μg i.p.) 마우스로부터의 50×106의 비장 세포의 존재 또는 부재하에 방사선 조사(600rads)된 수용자로 전달하였다(마우스당 50×106개, i.v.). 전달시에, 마우스를 TNP-SRBC(1% TN-SRBC 200μg, i.v.)로 면역시켰다. 혈청 IgG1항-TNP 역가를 전달후 6일째에 확인하였다.
실시예 1:항-gp39는 적혈구 항원에 대한 1차 항체 반응의 생성을 억제한다.
시험관내에서 Th-의존성 B 세포 활성화에 대한 항-gp39 및 CD40-Ig의 강력한억제 효과 뿐만 아니라, HIM 환자에서 관찰되는 손상된 TD 면역성은 생체내 체액-매개성 면역에 대한 항-gp39의 잠재적인 면역억제 효과의 연구에 기초를 제공하였다. 1차 TD 체액성 면역 반응에서 gp39-CD40 상호 작용의 역할을 조사하기 위해 양 적혈구(SRBC)에 대한 1차 항체 반응에 대한 항-gp39의 생체내 투여 효과를 측정하였다. 동물을 SRBC로 면역시키고, 4일간에 걸쳐 항-gp39 mAb(또는 대조 HIg)를 투여하였다. 5일째에, 항-gp39 처리 마우스, HIg 처리 마우스 및 대조 마우스에서 1차 항-SRBC 항체 반응을 확인하였다. 총 1.5mg의 항-gp39(0, 2 및 4일에 마우스당 500μg)를 투여받은 마우스의 IgM 항-SRBC 플라크 형성 세포(PFC) 반응은, 대조 마우스 또는 HIg 처리 마우스로부터의 항-SRBC PFC 반응과 비교시 99% 감소되었다(제 1A도). 부가하여, 마우스당 항-gp39 300μg(0, 2 및 4일에 마우스당 100μg) 투여시 항-SRBC 1차 면역 반응은 66% 감소되었다. 이러한 실험 결과들은 항-gp39 처리가 생체내에서 1차 항체 반응을 제거할 수 있음을 설명한다.
후속하여, SRBC에 대한 1차 체액성 면역 반응에 대한 항-gp39의 면역억제 효과의 지속기간을 조사하였다. SRBC로 면역시킨 마우스를 4일간 항-gp39로 처리하고, 여러 후속 시점에서 1차 항-SRBC 반응을 개시하는 능력에 대해 분석하였다. 이러한 실험 세트에서, 모든 동물을 0일째에 SRBC로 면역시키고, 항-gp39 또는 HIg를 0, 2, 4일째에 투여하였다. IgM 항-SRBC PFC 반응을 5일째에 항 군에 대해서 측정하였다. 7일 또는 14일째에는 추가적인 SRBC-면역군에 SRBC를 투여하였다. 각각의 항원 투여 5일 후(각각 12일 및 19일째), IgM 항-SRBC PFC 반응을 측정하였다. 그러한 한 실험의 결과가 제 1B도에 도시되어 있다. 제 1A도에서와 같이, 1차 항-SRBC 반응은 항-gp39의 투여를 시작한 후 5일째에 80-90% 저해되었다. 부가하여, 항-gp39를 처리후 12일 및 19일에 1차 항-SRBC 반응은 90% 이상 저해되었다. 이러한 결과들은 간단한 항-gp39 처리가 1차 항체 반응의 지속적인 억제를 가져옴을 입증한다.
실시예 2:항-gp39는 2차 항-KLH 항체 반응 생성을 억제한다.
1차 항체 반응을 조사하는 실험은 gp39-CD40 상호작용이 1차 체액성 면역의 개시에서 중요한 역할을 함을 시사한다. 그러나, 이러한 실험들은 gp39-의존성 CD40 시그널링이 2차 항체 반응의 생성에 필요한지의 여부는 다루지 않고 있다. 따라서, KLH 가용성 투여에 대한 2차 면역 반응에 대한 항-gp39 투여의 효과를 KLH 면역 마우스에서 측정하였다.
1차 항-SRBC PFC 반응을 감소시킨 항-gp39 투여 스케줄을 이용하여, 2차 항체 반응에 대한 항-gp39의 효과를 평가하기 위한 실험을 계획하였다. 이러한 실험들에서, KLH 면역 마우스(CFA 및 KLH로 3개월전에 면역)에 가용성 KLH(마우스당 10μg, i.v.)를 투여하였다. 항원 투여 당일(0일)에, 마우스에 250μg의 항-gp39 또는 HIg를 투여한 후, 2일 및 4일째에 항-gp39 또는 HIg를 투여하였다. KLH 투여후 7일(제 2도의 패널A) 및 14일(제 2도의 패널B)째에 마우스에서 채혈하여 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3및 IgE 항-KLH 항체의 역가를 측정하였다. 그 결과들은 하기 몇가지 점을 설명한다: 1) 가용성 KLH 투여는 14일 이하의 기간동안 지속되는 지속적인 2차 면역 반응을 유도하였다; 2) 항-gp39의 투여는 동일한 양의 HIg 투여와 비교하여, 측정된 이소타입의 2차 항-KLH 반응을 현저하게 감소시켰다; 및 3) 항-gp39의 면역억제 효과는 항-gp39의 처리 개시후 최소한 14일 동안 지속되는 것으로 나타났다. 이러한 실험들의 결과를 종합하면 1차 체액성 면역 반응과 유사하게, 2차 체액성 면역 반응 생성이 항-gp39에 의해 차단되었음이 설명된다.
실시예 3:항-gp39는 이종 Ig에 대한 항체 반응 생성을 억제한다.
제 1도에 도시된 실험들은 강력한 면역원성 미립자 항원인 SRBC에 대한 1차 반응 동안 항-gp39의 면역억제 활성을 설명한다. 적혈구의 세포 성질은 강력한 면역 반응을 유도하는 능력을 독특하게 만든다. 이종 Ig 분자는 고도로 면역원성인 이러한 특성을 공유하므로, 1차 및 2차 항체 반응 생성에 대한 항-gp39 처리 효과를 조사하기 위한 추가적인 모델 항원 시스템을 제공한다. 동물들을 이종 Ig 분자인 Chi-L6 및 인간화된 마우스 항-종양 세포 mAb로 면역시키고, 항-gp39 또는 대조 HIg로 처리하였다. 7일후에 혈청을 수집하여 IgM 항-Chi-L6의 생성에 대해 분석하였다. 부가하여, 마우스에 최초 면역 및 항-gp39 처리후 14일에 Chi-L6을 투여하고, 21일째에 IgG1항-Chi-L6 항체 생성에 대해 분석하였다. 제 3도는 그러한 한 구체예의 결과를 도시하고 있다. 항-gp39 처리 마우스에서 Chi-L6에 대한 1차 항원 반응은 HIg 처리 마우스와 비교하여 90% 넘게 억제되었다. 더우기, Chi-L6에 대한 2차 IgG1반응이 유사하게 억제되었다. 이러한 결과들은 항-gp39 처리가 적혈구 및 가용성 단백질 항원에 대한 반응을 억제하는 것과 같이 효과적으로 제 2 타입의 TD 항원인 이종 Ig에 대한 1차 및 2차 항체 반응을 제거함을 설명한다.
실시예 4:항-gp39는 T-의존성 타입 II 항원인 TNP-Ficoll에 대한 1차 항체 반응을 억제하지 않는다.
전술한 실험들은 항-gp39가 생체내에서 TD 항원에 대한 1차 및 2차 항체 반응 생성을 효과적으로 차단하는 것을 설명하고 있지만, gp39-CD40 상호작용이 TI 항원에 대한 체액성 반응의 개시에 역할을 하는가의 여부는 불분명하다. 첨부 서류에서 제시된 데이터는 TI-타입 II 항원인 TNP-Ficoll로 면역시키면 생체내에서 Th 세포에 의해 gp39가 발현되는 것을 설명한다. gp39-CD40 상호작용이 이러한 TI 항원에 대한 항체 반응 생성에 필요한가의 여부를 다루기 위해 TNP-Ficoll로 면역된 마우스에 대한 항-gp39의 효과를 분석하였다. TNP-Ficoll 또는 TNP-SRBC로 면역시킨 마우스를 항-gp39 또는 HIg로 처리하고, 6일후에 IgM 항-TNP 항체 반응을 측정하였다. 제 4A도는 TD 항원 TNP-SRBC로 면역시킨 동물에서 현저한 항-TNP 혈청 항체 반응이 유도되었음을 설명한다. 전술한 실험들에서 예측되는 바와 같이, 항-gp39 처리는 이러한 마우스에서 생성되는 1차 항-TNP 반응을 극적으로 억제한다. 대조적으로, TNP-Ficoll로 면역시킨 마우스에서는 더 높은 역가의 항-TNP 항체 반응을 개시하지만(제 4B도), 항-gp39 처리는 TNP-Ficoll에 대한 항체 반응을 억제하지 않는다. 이러한 실험 결과들은 TD 항원에 대한 반응과는 달리, 항-gp39는 TNP-Ficoll에 대한 체액성 반응 생성을 차단하지 않는다는 것을 나타내며, 또한 TI 항원에 대한 반응이 gp-39-비의존성일 수 있음을 시사한다.
실시예 5:항-gp39는 SRBC-특이적인 Th를 기능적으로 삭제하지 않는다.
전술한 실험들로부터, 항-gp39가 TD 체액성 면역의 발달을 저해한다는 것을알 수 있으나, 항-gp39 처리가 체액성 반응을 억제시키는 메카니즘은 불명확하다. 항-gp39에 의한 면역억제는 1) Th 아네르기를 유발하는 gp39-함유 T 세포의 네거티브 시그널링; 2) 항-gp39 함유 CD4+T세포의 mAb-매개 세포독성적 삭제; 및/또는 3) CD40과 gp39 결합의 차단에 의해 매개될 수 있다. 일련의 실험들을 수행하여 이들 메카니즘중 어느 것이 항-gp39 치료와 함께 관찰되는 지속적인 면역억제에 효과적일 수 있는가에 대해 통찰하였다. 항원-특이적인 Th가 항-gp39 치료에 의해 삭제 또는 아네르기화되는 가능성을 조사하기 위해서, gp39 처리 마우스로부터 항원-특이적인 Th 기능을 입양 전달에 의해 측정하였다. 간단하게, 마우스를 SRBC로 면역시키고(SRBC-특이적인 Th를 프라이밍하기 위함), 항-gp39 또는 HIg(0, 2, 4일에 마우스당 250μg)를 투여하였다. 7일후에, 비면역 마우스로부터의 비장 세포, 또는 HIg 또는 항-gp39로 처리한 마우스로부터의 SRBC-면역 비장 세포를, TNP 프라이밍된 B 세포원으로서 TNP-면역 비장 세포를 갖는 수용자 마우스로 입양 전달하였다. 동시에 마우스에 TNP-SRBC를 투여하고, 5일째에 IgG1항-TNP 역가를 확인하였다. 비면역 공여자로부터의 비장 세포를 수용하는 수용자는 SRBC 프라이밍된 동물로부터의 비장 세포를 수용한 마우스에 비해 실질적으로 보다 낮은 IgG1항-TNP를 생성하였다는 사실에 의해 설명되는 바와 같이(도 5), 수용자 마우스에서 2차 항-TNP 반응을 유도하기 위해서는 SRBC 프라이밍된 T 헬퍼 세포가 필요하다. 보다 중요한 것은, 이러한 실험 결과, HIg 처리 마우스 및 항-gp39 처리 마우스의 SRBC 헬퍼 활성이 유사하였음이 밝혀졌고, 이는 항-gp39 처리가 Th 기능을 변화시키거나, Th의 프라이밍을 차단하지 않는다는 것을 나타낸다. 더우기, 항원-반응성 Th는 항-gp39로 처리해도 전달시 헬퍼-이펙터 기능을 제공하였기 때문에, 삭제되거나 아네르기화되지 않았다.
실시예 6:햄스터 항-gp39의 생체내 제거
종래의 연구에서는 항-gp39(MR1)이 gp39와 CD40의 결합을 차단하는 것[15]을 입증하였고, 이는 항-gp39의 생체내 면역억제 효과가 gp39-CD40 상호작용의 차단에 기인한다는 가설을 뒷받침한다. 이러한 가설에 합당하다고 가정하면, 항-gp39 투여에서 관찰되는 장기간의 면역억제는 숙주내에서 항-gp39의 지속성을 필요로 한다. 면역억제가 명백한 기간 동안 항-gp39가 검출될 수 있는가를 결정하기 위해서는, 혈청으로부터의 항-gp39의 생체내 제거 속도를 결정해야 한다. 마우스에 4일간 항체(3×250μg 항-gp39)를 투여하고, 항체 투여 개시후 7일, 14일 및 21일째에 혈청 항-gp39의 수준을 분석하였다. 분해되지 않은 MR1(160kd)에 대한 웨스턴 블롯 분석은 혈청 미변화 항-gp39가 항체 처리 개시후 21일 이상 동안 검출될 수 있음을 나타내었다(제 6A도). 항체 치료 개시후 7일째에 분석한 동물 혈청으로부터 얻은 신호와 비교할 때, 21일째의 동물의 항-gp39의 혈청 농도는 대략 5%이었다(스캐닝 농도계측에 기초).
미변화 항-gp39가 혈청중에 존재하였음을 측정했더라도, 항-gp39가 생물학적으로 활성임을 확인하는 것도 중요하다. 따라서, 4일간 3×250μg의 항-gp39를 투여받은 마우스로부터의 혈청을 사용하여 gp39-함유 Th를 염색하였다(제 6B도). 최종 주사후 3일(항체 처리 개시후 7일)째의 혈청 항-gp39의 수준을 100%로 설정하였다. 항체 치료 개시후 14일에 대략 10-15%의 생물학적으로 활성인 항-gp39 mAb가 혈청에서 검출되었다. 치료 개시후 21일째에는, 2-3%의 항-gp39가 혈청에 잔존하였다. 따라서, 웨스턴 블롯팅에 의한 미변화 gp39 측정 및 생물학적으로 활성인 항-gp39의 측정 결과, 대략 5%의 항-gp39가 항-gp39 치료 개시후 21일에 존재한 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과들은 항-gp39의 반감기가 대략 12일임을 설명하고, 항-gp39에 의한 체액성 면역 반응의 지속적 억제가 Th 기능의 지속적인 차단에 기인한다는 가설과 일치하는 증거를 제공한다.
본 발명은 시험관내에서 gp39-CD40 상호작용을 차단하는 항-gp39 항체를 생체내에 투여하면 TI-타입 II 항원이 아닌 TD 항원에 대한 1차 및 2차 체액성 면역 반응이 현저하게 저해된다는 것을 설명한다. 부가하여, 본 연구는 항-gp39 처리가 항원 프라이밍된 Th 세포의 프라이밍을 차단하지 않는다는 것을 설명한다. 따라서, gp39-CD40 리간드-수용체쌍을 체액성 면역 반응의 치료 조작을 위한 표적으로 사용할 수 있다.
항-gp39가 어떻게 체액성 면역에 대한 면역억제 효과를 나타내는가를 통찰하기 위해, Th 기능에 대한 항-gp39의 직접적인 효과를 다루었다. 그 데이터는 항-gp39로 처리한 마우스로부터의 SRBC로 면역시킨 Th가 입양 전달시 완전하게 헬프를 제공할 수 있다는 것을 나타내고, 이는 항-gp39 처리가 생체내에서 Th 삭제 또는 아네르기를 초래하지 않았음을 시사한다. 이러한 결과들은 항-gp39가 gp39와 CD40의 결합을 차단함으로써 면역억제 효과를 매개하는 것이지, gp39-함유 Th를 불활성화시킴으로써 면역억제 효과를 매개하는 것은 아니라는 것을 설명한다. 이러한 가설을 지지하는, 시험관내의 연구에서 항-gp39가 CD40이 gp39에 결합하는 것을 차단한다는 것이 밝혀졌다[16]. 나아가, 생물학적으로 활성인 항-gp39가 면역억제가 명백한 기간 동안 혈청에서 검출될 수 있었다. 단지 5%의 항-gp39만이 면역 반응이 명백한 시기에 혈청중에 존재하였지만, 2차 림프양 기관의 특정 부위중의 항-gp39의 국소 조직 농도는 더 높을 수 있고, 또한 제거 속도는 혈청 항-gp39에 비해 더 느릴 수 있다. 항-gp39로 마우스를 처리하여 SRBC에 대한 1차 면역 반응이 억제되었고, 장기간 동안 이종 Ig가 90% 넘게 억제되었다. 항-gp39가 gp39 기능을 차단하여 억제를 매개한다고 가정하면, 이러한 데이터는 gp39-CD40 상호작용이 TD 항원에 대한 1차 면역 반응의 발달에 필수적임을 나타낸다. 면역조직화학 분석은 gp39가 TD 항원에 의한 면역화 결과 유도되며, 기능적으로 중요할 수 있음을 입증한다. gp39 발현의 원위치 연구는 1차 체액성 면역 반응 동안 gp39-CD40 상호작용의 초기 부위가 동맥주위의 림프양초의 말초측(PALS)내 및 비장의 말단 소동맥(TA)주변에 있음을 예시한다. 이러한 부위에서 gp39-발현 Th 및 항원-특이적인 B 세포 간의 콘쥬게이트가 병렬되어 존재하며, 이는 외부 PALS이 1차 체액성 면역 반응 동안 T 세포-B 세포 상호작용의 주요 부위임을 시사한다. 따라서, PALS는 항-gp39가 gp39-발현 Th 세포와 상호작용하여 궁극적으로 T-B 상호 작용 및 후속 Ig 생성을 억제하는 부위일 수 있다.
1차 반응과 유사하게, 또한 CFA중 KLH로 프라이밍된 마우스의 2차 체액성 면역 반응은 항-gp39 투여에 의해 억제되는 것으로 나타난다. 또한, 항-gp39에 의한 항-SRBC PFC의 감소와 일치하여, 항원 투여에 대한 혈청 항체 역가의 감소도 관찰되었다. 측정된 모든 항-KLH Ig 이소타입(IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgE)의 혈청 역가는 마우스를 항-gp39 처리함에 의해 감소되었다. 항-gp39 투여 효과는 항원으로 2차 투여후 14일 이상 동안 명백하였고, 이는 항-gp39에 의한 지속적인 면역억제를 입증한다. 항-gp39로 매개되는, KLH에 대한 2차 반응의 면역억제는, 이종 Ig 및 이종 적혈구에 대한 2차 면역 반응도 항-gp39 처리에 의해 억제되므로, KLH에 대해서만 유일한 것은 아니다. gp39-발현 Th의 해부학적인 분포는 1차 면역화시 관찰된 분포와 동일하였지만, 면역 비장내 gp39-발현 Th의 빈도는 1차 면역 반응 동안 관찰된 빈도보다 증가하였다. 면역 비장의 배아 중심 또는 여포내에서는 항-gp39가 전혀 발견되지 않았다. 따라서, B 세포는 PALS와 비장의 TA에서 활성화된 Th 세포에 반응하도록 되어, 그 후에 여포 및 배아 중심으로 이동하는 것으로 보인다.
본 연구의 초점은 TD 체액성 면역의 조절에서 항-gp39의 잠재적 용도를 입증하는 것이다. 항-gp39에 의한 간단한 처리는 이러한 치료 항체의 흥미로운 속성인 지속적 억제를 초래하였다. 특히 주의를 끄는 것은, Chi-L6 같은 다른 이종 치료 항체에 대한 1차 및 2차 체액성 반응을 저해하는 항-gp39의 능력일 수 있다. 이는 환자가 이종 치료 항체의 반복 투여에 노출되는 것을 허용한다.
실시예 7:항-gp39 항체의 생성 및 특성화
실험 1- 인간 gp39에 대한 항체
인간 피검자에서 항원-특이적인 T 세포 내성의 유도를 위해서는, 인간 gp39에 대한 항체를 투여하는 것이 바람직하다. 하기 방법론을 사용하여 마우스 항-인간 gp39 모노클로날 항체를 생성하였다. Balb/c 마우스를 프로인트 완전 아쥬반트(CFA)중의 가용성 gp39 융합 단백질인 gp39-CD8로 면역시켰다. 후속하여 6주후 마우스에 프로인트 불완전 아쥬반트(IFA)중의 가용성 gp-39-CD8을 투여하였다. 가용성 gp39-CD8는 2차 면역후 4주에 가용성 형태로 투여하였다. 후속하여, 2주후에 마우스를 활성화된 인간 말초 혈액 림프구로 부스팅시킨 후에, 추가로 2주후에 가용성 gp39-CD8로 최종 부스팅시켰다. 비장 세포를 표준 프로토콜에 따라서 최종 면역후 4일째에 NS-1 융합 파트너와 함께 융합시켰다.
항-인간 gp39 항체를 생성하는 클론들은 다중 스크리닝 방법을 기초로 선택하였다. gp39-CD8을 사용하는 플레이트 결합 어세이에 의해 클론을 초기 스크리닝하였다. 후속하여, 포지티브 클론을 대조 CD8 융합 단백질인 CD72-CD8에 대하여 스크리닝하였다. CD8-CD72 플레이트 결합 어세이에 대해 포지티브로 기록되는 클론을 제거하였다. 후속하여, 잔여 클론을 유동 혈구계산 분석법을 이용하여 휴지기 및 6시간 활성화된 인간 말초 혈액 림프구(PBL)에 관해 스크리닝하였다. 휴지 상태가 아닌 활성화 상태의 PBL을 염색하는 하이브리도마를 포지티브로 간주하였다. 최종적으로, 플레이트에 결합된 gp38과 CD40Ig의 결합을 차단하는 능력에 대해 잔여 클론을 시험하였다.
대략 300개의 클론을 플레이트 결합 어세이에서 gp39-CD8 및 CD72-CD8에 대해 초기 스크리닝하였다. 그러한 클론중 30개는 CD8이 아닌 플레이트에 결합된 gp39를 검출하는 것으로 밝혀졌다. 후속하여, 이러한 클론을 활성화된 인간 PBL상의 gp39 검출을 위해 스크리닝하였다. 대략 15개의 클론이 휴지 세포가 아닌 활성화된 PBL상의 분자를 검출하였다. 플레이트에 결합된 gp39의 CD40Ig 검출을 차단하는 클론의 능력을 결정하여 특이성을 추가로 확인하였다. 시험한 10개의 클론중 3개는 이러한 어세이에서 CD40Ig의 결합을 차단하였다. 이러한 클론은 3E4, 2H5 및 2H8이었다. 이러한 클론이 본원에 기재된 방법에서 사용하기에 바람직하다. 또한, 휴지 상태가 아닌 활성화 상태의 PBL상에서 포지티브인 것으로 시험된 클론도 활성화된 랫트 T 세포 클론인 POMC8과의 반응성에 대해 스크리닝하였다. 클론 2H8은 이러한 랫트 T 세포주와 교차반응성을 발현하였다.
실험 2 - 인간 gp39에 대한 항체
실험 1에 기재된 면역 과정과 유사한 과정을 이용하여 인간 gp39에 대한 추가 항체를 생성하였다. 한 마리의 Bal/c 마우스를 CFA중의 가용성 gp39-CD8로 면역시키고, 4주후에 6시간 동안 활성화시킨 인간 말초 혈액 림프구를 투여하였다. 후속하여, 그 마우스를 표준 프로토콜에 따라 NS-1 융합 파트너와 비장 세포를 융합하기 4일전에 가용성 gp39-CD8로 부스팅시켰다. 6시간 동안 활성화된 인간 PBL의 유동 혈구계산 염색에 의해 하이브리도마 클론의 스크리닝을 수행하였다. 휴지 상태가 아닌 활성화된 PBL을 염색하는 클론을 선택하였다. 6개의 클론 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 및 89-79을 선택하여 추가로 분석하였다.
선택된 항체의 특이성을 몇 가지 어세이에 의해 확인하였다. 먼저, 유동 혈구계산 분석법은 6개의 모든 mAb가 휴지 상태가 아닌 활성화된 말초 혈액 T 세포를 염색하는 것을 나타낸다(대표적인 예로서 제 7B도 및 제 7C도 참조, 각각 4D9-8 및4D9-9에 의한, 활성화된 T 세포의 염색을 도시). 각 6개의 항체에 의해 인식되는 분자의 발현은 활성화후 4시간내에 검출가능하고, 활성화후 6-8시간에 최대가 되며, 활성화후 24시간이 지나면 검출이 불가능해진다. 모든 6개의 mAb는 주로 CD4+ 표현형인 활성화된 CD3+PBL상에 발현된 분자를 인식하지만, CD8+T 세포의 일부도 그 분자를 발현한다. 6개의 mAb에 의해 인식된 분자의 발현은 gp39의 발현과 동일하게, 배지중의 시클로스포린 A의 존재에 의해 억제된다(대표적인 예로서 제 8A도 및 제 8B도 참조, 각각 4D9-8 및 4D9-9에 의한, 시클로스포린 처리 T 세포의 염색을 도시). 이러한 mAb에 의해 인식된 분자의 발현 속도론 및 분포는 인간 CD40Ig의 융합 단백질에 의해 검출되는 바와 같이 gp39와 동일하다. 부가하여, 모든 6개의 mAb는 CD40Ig에 의한 gp39의 염색을 차단한다(대표적인 예로서 제 9A도 및 제 9B도 참조, 각각 4D9-8 및 4D9-9의 존재 하에 CD40Ig에 의한 gp39의 염색을 차단하는 것을 도시). ELISA 어세이에서, 모든 6개의 mAb는 gp39 분자의 가용성 융합 형태인 gp39-CD8을 인식한다. 더우기, 모든 6개의 mAb는35S-메티오닌으로 표지된 활성화된 인간 PBL로부터 대략 36kd의 분자를 면역침전시킨다. 면역침전된 분자는 인간 CD40I9 융합 단백질에 의해 침전된 분자와 동일하다.
6개의 선택된 mAb(4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 및 89-79)의 기능적인 활성을 하기와 같이 분석하였다. 먼저, IL-4 및 가용성 gp39와 함께 배양한 정제된 인간 B 세포의 증식을 억제하는 mAb 능력을 측정하였다. 정제된 인간 B 세포를 투여량 0 내지 12.5μg/mℓ의 정제된 모노클로날 항체 또는 CD40Ig의 존재 또는 부재하에 gp39 및 IL-4와 함께 배양하였다. B 세포 증식은 3일후에 배지중 티미딘 혼입에 의해 결정하였다. 결과(제 10도에 도시)는 모든 6개의 mAb가 gp39 및 IL-4에 의해 유도된 B 세포 증식을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. mAb 89-76 및 24-31이 유도된 B 세포 증식을 가장 효과적으로 억제한다.
그 다음에, 항-CD3으로 활성화된 T 세포 및 IL-2에 의해 유도된 Ig 생성으로 측정되는 바와 같이, B 세포 분화를 억제하는 mAb의 능력을 조사하였다. 정제된 IgD+인간 B 세포를 FACS로 포지티브 선택에 의해 제조한 후에, 투여량 0 내지 10μg/mℓ의 정제된 항-gp39 모노클로날 항체의 존재 또는 부재하에, 항-CD3로 활성화된 인간 T 세포(미토마이신 C로 처리) 및 IL-2와 함께 6일간 배양하였다. 그 결과(하기 표 1에 나타냄)는 모든 6개의 항체가 IgM, IgG 및 IgA 생성에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 의존성 B 세포의 분화를 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
T 세포 반응에 대한 항-gp39 mAb의 효과를 조사하기 위해서 mAb를 표준 혼합 림프구 반응(MLR)에 포함시켰다. 항-gp39 mAb(10μg/mℓ)의 존재 또는 부재하에 300,000개의 인간 말초 혈액 림프구(감응자=R)를 100,000개의 방사선 조사된 동종 말초 혈액 림프구(자극자=S)와 배양시켰다. 배양물을 4, 5 또는 6일째에 3H-티미딘으로 펄스화하고, 18시간후에 수집하였다. 모든 6개의 항-인간 gp39 mAb는 MLR에 의해 측정된 바와 같이 동종-특이적인 반응을 억제하였다(대표적인 예로서 제 11도 참조, R 및 S를 24-31 또는 89-76의 존재하에 인큐베이션시키는 경우 동종-특이적인 억제를 도시; CTLA4-면역글로불린 융합 단백질 및 항-CD28 mAb를 포지티브 대조로 사용).
6개의 mAb가 인간 gp39 분자상에서 별개의 에피토프를 인식하였는지 여부를 결정하기 위해서 교차차단 실험을 수행하였다. 활성화된 인간 PBL을 6개의 각 mAb(25μg/mℓ의 콘쥬게이션되지 않은 항체)로 먼저 차단시켰다. 세포를 세척한 후에 10μg/mℓ의 바이오틴(biotin) 콘쥬게이션된 항체로 염색시키고, 피토에리트린(phytoerythrin) 콘쥬게이션된 아비딘(PE-Av)과 반응시켰다. PE-Av로 염색된 세포를 FACS를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
모든 항체는 CD40Ig와 활성화된 인간 PBL의 결합을 차단하였다. 그러나, 표 2에 나타난 데이터는 일부 항체들이 다른 항체들과 활성화된 인간 PBL의 결합을 차단하지 못함을 설명하며, 이는 항체가 사람 gp39 분자상의 별개의 에피토프를 인식함을 시사한다.
89-76 및 24-31 항체를 생성하는 89-76 및 24-31 하이브리도마는 부다페스트조약하에 각각 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md.)에 1994년 9월 2일에 기탁되었다. 89-76 하이브리도마는 ATCC 기탁번호는 HB 11713, 24-31 하이브리도마는 ATCC 기탁번호 HB 11712로 기탁되었다.
실험 3- 마우스 gp39에 대한 항체
본 발명에 따른 한 구체예에서, gp39 길항제는 항-마우스 gp39 모노클로날 항체인 MR1이다. 하기 방법은 MR1 모노클로날 항체를 생성하는데 이용되었고, gp39에 대한 다른 항체를 생성하는데 이용될 수 있다.
햄스터를 6주 동안 1주 간격으로 5-106개의 활성화된 Th1 세포로 복강내 면역시켰다. 쥐의 Th1 세포에 대한 혈청 역가가 약 1:10,000 이상인 경우, 세포 융합을 면역 햄스터 비장 세포 및 NS-1을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜로 수행할 수 있다. 성장중의 하이브리도마를 포함하는 웰로부터의 상청액을 휴지 상태 및 활성화된 Th1에 대한 유동 혈구계산법으로 스크리닝 하였다. 활성화된 Th를 선택적으로 인식하는 Mab를 생성하는 한 특정 하이브리도마를 추가로 시험한 후에 서브클로닝하여 MR1를 얻었다. MR1은 복수에서 생성되었고, 이온 교환 HPLC에 의해 정제되었다. 하이브리도마 MR1는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있고, 기탁번호는 HB11048이다.
하기 참고문헌은 실시예 및 본 발명의 상세한 설명에서 번호로 인용된다:
균등물
본 발명의 기술분야에 있는 당업자는 본원에 기재된 본 발명에 따른 특정한 구체예에 대해 많은 균등물이 있다는 것을 단지 통상적인 실험을 이용하여 인식 또는 확인할 수 있을 것이다. 또한, 그러한 균등물은 하기의 특허청구의 범위에 포함된다.

Claims (19)

  1. 흉선 의존성 (TD) 항원, 및 항-gp39 항체, gp39와 특이적으로 결합하는 이것의 단편, 가용성 CD40, 및 가용성 CD40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 gp39 길항제를 포함하며, TD 항원에 대한 체액성 면역반응을 억제하기 위한 면역역제제 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, TD 항원이 알레르겐임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 항-IL-4 항체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  4. 항-gp39 항체, gp39와 특이적으로 결합하는 이것의 단편, 가용성 CD40, 및 가용성 CD40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 gp39 길항제를 포함하며, 흉선 의존성 (TD) 항원과 병용 투여시 TD 항원에 대한 체액성 면역반응을 억제하기 위한 면역억제제 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 체액성 면역 반응이 1차 체액성 면역 반응 또는 2차 체액성 면역반응임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 흉선 비의존성 타입 II(TI-2) 항원에 대한 체액성 면역 반응이 억제되지 않음을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  7. 항-gp39 항체, gp39와 특이적으로 결합하는 이것의 단편, 가용성 CD40, 및 가용성 CD40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 gp39 길항제를 포함하며, 알레르겐에 노출된 환자에서 알레르겐에 대한 체액성 면역반응을 억제하기 위한 면역억제제 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 항-IL-4 항체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  9. 항-gp39 항체, gp39와 특이적으로 결합하는 이것의 단편, 가용성 CD40, 및 가용성 CD40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 gp39 길항제를 포함하며, 항원에 대한 피검자의 체액성 면역반응이 gp39 길항제에 의해 억제될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 약제 조성물.
  10. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, TD 항원이 단백질임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  11. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, TD 항원이 항체임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  12. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, TD 항원이 세포 표면 상에 있음을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  13. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, TD 항원이 단백질 및 항체로부터 선택되는 치료제임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  14. 제 1항, 제 4항 및 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 항-gp39 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 항-gp39 항체가 모노클로날 항체 24-31 (ATCC 기탁번호 HB11712) 또는 89-76 (ATCC 기탁번호 HB11713)임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  16. 제 14항에 있어서, 항-gp39 항체가 키메라성 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  17. 제 1항, 제 4항 및 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 항-gp39 항체가 인간화된모노클로날 항체임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
  18. 항원에 대한 피검자의 체액성 면역반응이 gp39 길항제에 의해 억제될 수 있는지 여부를 결정하는 방법으로서,
    인간 이외의 피검자를 체액성 면역반응을 일으킬 수 있는 항원에 노출시키는 단계;
    인간 이외의 피검자에게 항-gp39 항체, gp39와 특이적으로 결합하는 이것의 단편, 가용성 CD40, 및 가용성 CD40 융합 단백질로 구성된 군으로 부터 선택된 gp39 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및
    항원이 인간 이외의 피검자에서 체액성 면역반응을 일으키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 항-gp39 항체가 인간의 불변 영역 및 모노클로날 항체 24-31 (ATCC 기탁번호 HB11712) 또는 89-76 (ATCC 기탁 번호 HB11713)의 가변 영역을 갖는 인간화된 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 면역억제제 조성물.
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