JP6125036B2 - 魚の孵化液から得られる化粧品組成物 - Google Patents
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Description
a)魚卵を最小体積(例えば卵の体積以下に等しい)の水中に懸濁させるステップ;
b)前記卵の同期した急速な孵化を、好ましくは孵化が80%を超える胚について6時間以内で完了するように誘導するステップ;
c)場合によって、孵化した卵をろ過して、孵化液を得るステップ;および
d)b)またはc)の孵化液をろ過して、組成物を得るステップを含み、ここで、孵化液をろ過するステップは、少なくとも:
(i)少なくとも5μm、好ましくは5〜15μmの孔サイズ、そして特に好ましくは7μmの孔サイズを有するフィルターを使用して孵化液をろ過し、そしてろ液を集めるステップ;
(ii)場合によって、ステップ(i)からの濾液を、0.30〜0.60μmの孔サイズ、好ましくは0.35〜0.55μm、特に好ましくは、0.40〜0.50μm、最も好ましくは、0.45μmの孔サイズを有するフィルターを用いて濾過し、そしてろ液を集めるステップ;
(iii)ステップ(i)または(ii)からの濾液を:
(1)ろ液をDEAE(ジエチルアミノエチル)カラムなどのイオン交換カラム上にロードし;
(2)カラムを好適な緩衝液、例えば20mMのTris−HCl、pH8.5を含むpH7〜9の緩衝洗浄液で洗浄し;
(3)第1溶出緩衝液または溶媒(例えばステップ(4)の第2溶出緩衝液よりも低いイオン強度を有する)、例えば50mMのNaClなど、塩を例えば50〜100mMの濃度でさらに含む緩衝洗浄液を用いてカラム(特にロイコレクチンポリペプチド)からポリペプチドを溶出させ;
(4)残存するポリペプチドをカラムから、第2溶出緩衝液または溶媒(例えばステップ(3)の第1溶出緩衝液よりも高いイオン強度を有する)、例えば1MのNaClなど、例えば500mM〜2Mの濃度で第1溶出緩衝液よりも高い塩濃度を含む緩衝洗浄液を用いて溶出させ;
(5)ステップ(4)からの溶出液を集める
ことを含むイオン交換クロマトグラフィーにかけるステップ
を含む;
e)ステップ(5)からの溶出液中の水を薬剤的に(または美容上)許容される緩衝液と交換するステップ;
f)ステップ(e)から得られた溶液を、0.15〜0.30μmの孔サイズ、好ましくは0.22μmの孔サイズを有するフィルターを用いてろ過し、そしてろ液を集め;そして
g)ステップ(f)からの濾液から前記医薬または化粧品組成物を調製するステップ
を含む。
a)クロモザイムXを切断する;
b)ベンズアミジンにより阻害される;
c)アルギニンとのペプチド結合を切断する;
d)8Mの尿素、塩のモル濃度、蒸留水および有機溶媒、好ましくはジオキサンまたはプロパノールの存在下で活性のままである;そして
e)室温で50日間、溶液中で酵素活性を保持する。好ましくは、セリンプロテアーゼは:
a)魚、例えばサケの卵を最小体積の水中に懸濁させるステップ;
b)同期した急速な孵化の前記卵を誘発するステップ;
c)孵化した卵を濾過して、孵化液を得るステップ;
d)固体尿素を前記孵化液に添加して、卵殻フラグメントを解離させ、前記流体を低速遠心分離に付すステップ;
e)遠心分離上清をゲルろ過に付すことによって前記セリンプロテアーゼをさらに精製するステップ;および
f)ベンズアミジン修飾Superose6B(登録商標)カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって前記セリンプロテアーゼをさらに精製するステップであって、濃縮塩洗浄を実施し、続いて濃縮塩溶液中、ジオキサンで溶出することによって前記アフィニティークロマトグラフィーを実施して、クロマトグラフィーマトリックスまたは巨大分子構造に結合したセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを抽出するステップ
を含む方法によって精製形態で得ることができる。
(i)配列番号1に記載するアミノ酸配列または前記配列と少なくとも70%同一である配列を含むメタロプロテアーゼ;
(ii)上述の方法により得ることができるセリンプロテアーゼ;および
(iii)(a)配列番号2に記載するアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも70%同一である配列を含む卵殻ポリペプチド;
(b)配列番号3に記載するアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも70%同一である配列を含む卵殻ポリペプチド;および
(c)配列番号4に記載するアミノ酸配列もしくは前記配列と少なくとも70%同一である配列を含む卵殻ポリペプチド
のいずれか1以上から選択される卵殻ポリペプチド;または
(iv)(i)〜(iii)で定義されるポリペプチドのいずれかの部分であって、本明細書中で後述するような長さを有する部分;
ならびに1以上の薬剤的に許容される賦形剤および/または希釈剤。(前記少なくとも70%配列同一性は、好ましくは、少なくとも80、90、95、96、97、98または99%の同一性である。)
(i)約0.05〜約0.20%[w/w]のメタロプロテアーゼ、好ましくは約0.100%〜約0.125%、例えば約0.108%〜約0.112%のメタロプロテアーゼ;
(ii)約0.15%〜約0.40%[w/w]のセリンプロテアーゼ、好ましくは約0.255%〜約0.310%、例えば約0.275%〜約0.290%のセリンプロテアーゼ;および
(iii)約99.40%〜約99.80%[w/w]の全卵殻ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの一部、好ましくは約99.575%〜約99.645%、例えば約99.598%〜約99.617%の全卵殻ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの一部。
によって特徴づけられる、水分または皮脂が欠乏した表皮を指す。乾燥肌は、皮膚状態自体(例えば年齢、熱/寒さ/乾燥によるダメージによる)として起こり得るか、または日焼けによる損傷、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬もしくは魚鱗癬(皮膚の顕著な剥離を引き起こす遺伝性疾患)などの皮膚障害もしくは状態の症状であり得る。
または疼痛などの程度もしくは面積を好ましくは正常なレベルまで減少、軽減または除去することを指す。
[図面の簡単な説明]
[図1]図1は、本発明の方法のステップ(f)で調製した孵化液組成物の1%を含むゲル(ゲルB)で4週間、1日2回治療した後、未治療の皮膚と比較して毛穴直径における(A)平均減少および(B)相対的減少を表す棒グラフを示す。
[図2]図2は、本発明の方法のステップ(f)で調製した孵化液組成物の1%を含むゲル(ゲルB)で4週間、1日2回治療した後、未治療の皮膚と比較して、炎症性被布病変における(A)平均減少および(B)相対的減少を表す棒グラフを示す。
[図3]図3は、非炎症性被布病変の数の(A)平均減少および(B)相対的減少を表す棒グラフを示す。
[図4]図4は、本発明の方法のステップ(f)で調製される孵化液組成物の3%およびグリコール酸の3%溶液を含むゲル(活性ゲル)の剥離効果を比較する棒グラフ(A)を示す。低いスコアは鱗状の特性が少ないこと、すなわち角質除去の増加を意味する。(B)は、t0および5分後に活性ゲルで治療した試験部位の写真を示す。
[図5]図5は、本発明の方法のステップ(f)で調製される孵化液組成物の3%を含むゲル(ゲルB)で3週間、1日2回治療した後に、未治療の皮膚と比較して、皮膚水和における(A)平均増加および(B)相対的増加を表す棒グラフを示す。
[図6]図6は、本発明の方法のステップ(f)で調製される孵化組成物の3%を含むゲルで3週間、1日2回治療した後に、未治療の皮膚と比較して、湿疹または挫創の重篤度の(A)平均視覚的評価および(B)相対的視覚評価を表す棒グラフを示す。
[図7]図7は、本発明の方法のステップ(f)で調製される孵化組成物の3%を含むゲルで3週間、1日2回治療した後に、未治療の皮膚と比較して、炎症および非炎症皮膚病変の数における(A)平均減少および(B)相対的減少を表す棒グラフを示す。
組成物をサケ孵化液から調製した。孵化液のタンパク質濃度を改善するために、サケ卵を孵化前に最小体積の水に移した。高度に同期した孵化は、高温(室温)によって、または脱酸素化によって誘導することができ(Oppen−Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417−430)、これによって粗ポリペプチドおよびポリペプチドの部分の少量の高度に濃縮された調製物を得る。孵化は95%を超える胚について2時間以内に完了しなければならない。
孵化液組成物を実施例1で記載するようにして調製した。組成物を1%のゲル[v/v](単位体積のゲルあたりの組成物の合計体積)として調製し、活性構成要素を含まない対照ゲル、すなわち孵化液組成物(図1中のゲルB)と比較した。ゲルは、防腐剤(0.8%)、ジグリセリン(3.00%)およびキサンタンガム(0.8%)を水中に含んでいた。
t0状況は均一であった。t0評価後に活性ゲルで治療される試験部位は、未治療のまま放置される試験部位とは毛穴サイズが有意に異ならなかった(p=0.3811)。t0で、毛穴サイズは平均で、未治療試験部位については0.60(±0.19)mmであり、活性ゲルで治療した試験部位については0.65(±0.22)mmであった。
炎症病変カウント
t0状況は均一でなかった。ベースライン評価後に活性ゲルで治療される試験部位は、未治療のまま放置される試験部位からの炎症病変の数において有意に異なっていた(p=0.0217)。t0で、炎症病変の数は平均で、未治療試験部位について8.4(±7.4)であり、活性ゲルで治療した試験部位について7.0(±6.5)であった。未治療試験部位の炎症病変の数は試験期間内で均一であった(p=0.0815)。
t0状況は均一であった。ベースライン評価後に活性ゲルで処理される試験部位は、未治療のまま放置される試験部位からの非炎症病変の数と有意に異ならなかった(p=0.8753)。t0で、非炎症病変の数は、平均で、未治療試験部位について3.2(±5.3)であり、ゲルB治療試験部位については2.8(±3.2)であった。未治療試験部位の非炎症病変の数は、試験期間内で均一であった(p=0.9057)。
3%のステップ(f)の孵化液組成物を含むゲルを実施例2で記載するようにして調製した。
スコア0:存在しない
スコア1:若干
スコア2:軽度
スコア3:重度
スコア4:極度
不快症状有害反応はなかった。
D−Squames(登録商標)を使用する3人の対象に対する角質除去の評価は、5分、10分または15分の治療レジメン後のグリコール酸と比較して、活性ゲルについて平均で鱗状の特定におけるより高い減少が明らかになった(図4)。
ステップ(f)の孵化液組成物の3%を含むゲルを実施例2で記載するようにして調製した。
ステップ(f)の孵化液組成物を含む活性ゲル(ゲルB)で治療した皮膚は、1日2回製品で3週間治療した後に、非治療状態と比べて4人の対象に関して皮膚水和において約21%の平均増加を示した(図5)。
3%のステップ(f)の孵化液組成物を含むゲルを実施例2で記載するようにして調製した。
スコア0:存在しない
スコア1:若干
スコア2:軽度
スコア3:重度
スコア4:極度
配列番号1:メタロプロテアーゼ−タイセイヨウサケ
MDHRPTLSLL LLLLLLGLSQ ASGNEFHDEP DHVSITSVIL KSNNGTNELL LDGDILAPRT RNAMKCFSSQ YSCLWKKSSD GLVYVPYILS AVYSSLEVET IETAMKYFQG KTCIRFIPRK TQTAYLDIQS SGGCFGTVGT VGDRQTLSLA QFGCVQHGII QHELLHALGF HEHNRSDRE QYIRINWQYI YDYAVGNFQK EDTNNLHTAY DYSSVMHYDR TAYTNDYGKE TITPIPDPSV AIGQRLGMSD IDVLKVNKLY QC
TVTVQCTKDG QFVVVVSRDA TLPNLELDSI SLLGANGAHC TPVGTTSAFA IYQFKVTECG TVVTEEPDTI VYENRMSSSY VVGIGPFGDI TRDSHYDLVF QCRYTGTSVE TLVIEVK
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Claims (30)
- 魚の孵化液から医薬または化粧品組成物を調製する方法であって、
a)魚卵を最小体積の水中に懸濁させるステップと、
b)前記卵の同期した迅速な孵化を誘発するステップと、
c)b)からの前記孵化液を濾過して組成物を得るステップであって、前記孵化液を濾過する前記ステップが、
(i)少なくとも5μmの孔サイズを有するフィルターを用いて前記孵化液をろ過し、かつ前記ろ液を集めるステップと、
(ii)ステップ(i)からの前記ろ液をイオン交換クロマトグラフィーにかけるステップとを少なくとも含み、
前記(ii)ステップが、
(1)前記ろ液をDEAE(ジエチルアミノエチル)イオン交換カラム上にロードし、
(2)前記カラムをpH7〜9の緩衝洗浄液で洗浄し、
(3)ロイコレクチンポリペプチドを前記カラムから、第1溶出緩衝液を用いて溶出させ、前記第1溶出緩衝液は、50〜100mMの濃度の塩をさらに含む前記緩衝洗浄液を含み、
(4)前記残存ポリペプチドを前記カラムから、第2溶出緩衝液を用いて溶出させ、前記第2溶出緩衝液は500mM〜2Mの濃度で塩を含む前記緩衝洗浄液を含み、
(5)ステップ(4)からの前記溶出液を集めることを含み、
d)12kDa未満の排除サイズのフィルターを用いるダイアフィルトレーションにより、ステップ(5)からの前記溶出液中の前記水を薬剤的または美容上許容される緩衝液と交換するステップと、
e)ステップ(d)から得られた前記溶液を、0.15〜0.30μmの孔サイズを有するフィルターを用いてろ過し、かつ前記濾液を集めるステップと、
f)前記医薬または化粧品組成物をステップ(e)からの前記濾液から調製するステップと
を少なくとも含む、方法。 - 孵化が、前記胚の80%超について6時間以内に完了する請求項1に記載の方法。
- 前記孵化した卵を濾過して、孵化液を得るステップをさらに含む請求項1または2に記載の方法。
- 0.30〜0.60μmの孔サイズを有するフィルターを使用してステップ(i)からの前記ろ液を濾過し、前記ろ液を集めるさらなるステップを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- a)ステップ(i)における前記フィルターの前記孔サイズが5〜15μmであり、
b)請求項4に記載の前記フィルターの前記孔サイズが0.35〜0.55μmであり、および/または、
c)ステップ(e)における前記フィルターの前記孔サイズが0.22μmである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - a)ステップ(i)における前記フィルターの前記孔サイズが7μmであり、および/または
b)請求項4に記載の前記フィルターの前記孔サイズが、0.45μmである請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記卵が、Osteoglossomorpha、Elopomorpha、Clupeomorpha、Ostariophysi、Protacanthopterygii、Stenopterygii、Cyclosquamata、Scopelomorpha、Lampridiomorpha、Polymyxiomorpha、ParacanthopterygiiおよびAcanthopterygiiからなるリストから選択される任意の上目の魚から選択される魚由来である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記魚が、Osteoglossiformes、Hiodontiformes、Elopiformes、Albuliformes、Notacanthiformes、Anguilliformes、Saccopharyngiformes、Clupeiformes、Gonorynchiformes、Cypriniformes、Characiformes、Gymnotiformes、Siluriformes、Argentiniformes、Salmoniformes、Esociformes、Osmeriformes、Ateleopodiformes、Stomiiformes、Aulopiformes、Myctophiformes、Lampriformes、Polymixiiformes、Percopsiformes、Batrachoidiformes、Lophiiformes、Gadiformes、Ophidiiformes、Mugiliformes、Atheriniformes、Beloniformes、Cetomimiformes、Cyprinodontiformes、Stephanoberyciformes、Beryciformes、Zeiformes、Gobiesociformes、Gasterosteiformes、Syngnathiformes、Synbranchiformes、Tetraodontiformes、Pleuronectiformes、Scorpaeniformes PerciformesおよびAcipenseriformesからなるリストから選択されるいずれかの目由来のものである、請求項7に記載の方法。
- 前記魚が、Salmonidae、Cyprinidae、Cichlidae、Pangasiidae、Sciaenidae、Serranidae、Carangidae、Sparidae、Lateolabracidae、Moronidae、Mugilidae、Latidae、EleotridaeおよびAcipenseridaeからなるリストから選択される科由来である、請求項8に記載の方法。
- 前記魚が、ソウギョ(Ctenopharyngodon idella)、ハクレン(Hypophthalmichthys molitrix)、キャトラ(Catla catla)、コイ(Cyprinus carpio)、コクレン(Hypophthalmichthys nobilis)、ヨーロッパブナ(Carassius carassius)、ティラピア(Oreochromis niloticus niloticus)、バサ(Pangas catfish)(Pangasius pangasius)、ロフ(Labeo rohita)、タイセイヨウサケ(Salmo salar)、フウセイ(Larimichthys crocea)、ヒトミハタ(Epinephelus tauvina)、マス(Salmo trutta trutta)、ブリ(Seriola quinqueradiata)、ゴウシュウマダイ(Sparus aurata)、スズキ(Lateolabrax japonicus)、ヨーロピアンシーバス(Dicentrarchus labrax)、ヒラダイ(Chrysophrys auratus)、ボラ(Mugil cephalus)、バラマンディ(Lates calcarifer)、マーブルゴビー(Oxyeleotris marmorata)、モザンビークティラピア(Oreochromis mossambicus)、ウミマス(Oncorhynchus mykiss)、ギンサケ(Oncorhynchus kisutch)、マスノスケ(Oncorhynchus tshawytscha)、カラフトマス(Oncorhynchus gorbuscha)、シロサケ(Oncorhynchus keta)、ベニザケ(Oncorhynchus nerka)、シベリアチョウザメ(Acipenser baerii)およびロシアチョウザメ(Acipenser gueldenstaedtii)からなるリストから選択される種である、請求項9に記載の方法。
- 孵化が、前記胚の95%超について2時間以内に完了する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項で定義される方法から得た、または得ることができる、医薬または化粧品組成物。
- 治療法で使用するための請求項12に記載の組成物。
- (i)動物の皮膚の角質除去および/もしくは保湿、ならびに/または
(ii)動物における毛穴のサイズを小さくするための美容的方法であって、
請求項12で定義される組成物を前記動物に投与する、方法。 - (i)動物の皮膚の角質除去および/もしくは保湿ならびに/または
(ii)動物における毛穴サイズを減じるために使用される請求項12で定義される組成物。 - 前記皮膚が異常に乾燥し、前記皮膚の前記角質層が異常に肥厚しているかまたは前記皮膚が色素異常症にかかっている、動物の皮膚の状態または障害を治療または予防するための請求項12で定義される組成物。
- 治療または予防される前記皮膚状態または障害が、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬または挫創である、請求項16に記載の組成物。
- 治療または予防される前記皮膚状態または障害が、炎症性および/または非炎症性皮膚病変を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記炎症性および/または非炎症性皮膚病変は、丘疹、膿疱、ブラックヘッドおよび/またはホワイトヘッドである請求項18に記載の組成物。
- 治療または予防される前記皮膚状態または障害が、たこ、魚の目、いぼまたは肝斑を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記組成物が、製品、材料またはデバイス上にコート、含浸または化学的に結合される、請求項12、13または15〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、製品、材料またはデバイス上にコート、含浸または化学的に結合される、請求項14に記載の方法。
- 請求項12で定義される組成物でコート、含浸または化学的に結合された製品、材料またはデバイス。
- (i)動物の皮膚の角質除去および/もしくは保湿、ならびに/または
(ii)動物における毛穴のサイズを小さくするための薬剤の製造における、請求項12で定義される組成物の使用。 - 前記皮膚が異常に乾燥し、前記皮膚の前記角質層が異常に肥厚しているかまたは前記皮膚が色素異常症にかかっている、動物の皮膚の状態または障害を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項12で定義される組成物の使用。
- 治療または予防される前記皮膚状態または障害が、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬または挫創である、請求項25に記載の使用。
- 治療または予防される前記皮膚状態または障害が、炎症性および/または非炎症性皮膚病変である、請求項25に記載の使用。
- 前記炎症性および/または非炎症性皮膚病変は、丘疹、膿疱、ブラックヘッドおよび/またはホワイトヘッドである請求項27に記載の使用。
- 治療または予防される前記皮膚状態または障害が、たこ、魚の目、いぼまたは肝斑を含む、請求項25に記載の使用。
- 前記組成物が、製品、材料またはデバイス上にコート、含浸または化学的に結合される、請求項24〜29のいずれか一項に記載の使用。
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