KR102027015B1 - 류코렉틴을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연어과 부화액(Salmonidae hatching fluid)으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 화장료 조성물, 상기 조성물의 제조방법 및 피부에 대한 다양한 화장료 적용에서 이의 용도, 특히 포유동물의 피부의 미용 외모를 개선시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

류코렉틴을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이의 용도{Methods for the production of a cosmetic composition comprising leukolectin and uses thereof}

본 발명은 피부에 대한 다양한 적용에서, 연어과 부화액(Salmonidae hatching fluid)으로부터 유래될 수 있는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 피부의 미용 외모를 고치고, 바람직하게는 개선시키는데 유용하다.

피부는 신체 중 더욱 상처받기 쉬운 기관 중 하나이다. 피부는 직접적으로 또는 간접적으로 외부 자극과 일정한 상호작용을 하며, 종종 환경 물질에 노출되고 이에 의해 영향을 받는다. 사실, 피부는 외부 세계와 접촉하는 최초 시점으로 볼 수 있다. 이러한 일정한 노출은 피부, 특히 피부의 미용 외모에 불쾌한 및/또는 원하지않는 신체적 및 시각적 변화를 야기할 수 있다. 이러한 변화가 개인의 건강을 위협하지 않을 수 있으나, 이러한 변화는 신체적으로 불편하거나 또는 시각적으로 불쾌할 수 있다. 실제로, 피부는 그렇게 보이기 때문에, 피부의 외모에 대한 변화는 정신적 스트레스를 야기할 수 있다. 따라서, 피부의 상태를 유지, 회복 또는 개선시키는데, 특히 피부의 젊어보이는 외모(youthful appearance)를 회복시키는데 효과적인 처리에 대한 계속적인 요구 및 수요가 있다.

피부는 인간의 체중의 약 12-16%를 차지하는 신체의 가장 큰 기관을 형성한다. 이것은 외부 세계와 우리의 신체 내의 조절된 환경 사이의 장벽 및 규제 영향 둘 다로서 많은 중요한 역할을 수행한다.

피부는 3층, 즉 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하 조직(subcutis)으로 이루어진다. 표피는 피부의 맨 위의 상피층이다. 이것은 신체로부터 수분 손실을 막고, 신체로 물질과 유기체의 유입을 막는, 신체적 장벽으로 작용한다. 이의 두께는 신체 부위에 따라 변한다.

표피는 중층편평상피(stratified squamous epithelium)로 이루어진다, 즉, 편평한 세포층으로 이루어진다. 피부, 모발 및 손톱은 각질화되며, 이는 이들이 케라틴으로 불리는 단백질로 구성된 죽고, 경화된 소수성 표면을 가지는 것을 의미한다. 표피는 각질형성세포(keratinocytes)와 관련된 세포외 지질의 함량으로 인해, 특히 표피의 중간층 (투명층(stratum lucidum))에서 불투과성이 된다. 점막 (예를 들어 식도(oesophagus), 구강 인두강(oral pharyngeal cavity), 생식기관 (reproductive organs) 등)은 주로 비-각질화되고 촉촉하다. 표피는 3개의 주요 유형의 세포, 즉 각질형성세포 (피부 세포), 멜라닌형성세포(melanocytes) (색소-생성 세포) 및 랑게르한스 세포 (면역 세포)를 가진다. 머켈 세포(Merkel cell)는 4번째의 덜 보급된 표피 세포이다.

각질형성세포는 이들이 바깥 쪽으로 움직임으로써 케라틴의 축적과 함께 충분히 발달하고 분화한다. 이들은 결국 떨어지거나 또는 문질러서 떨어진다. 이들은 가장 표면으로부터 가장 깊숙한 곳으로 (i) 핵이 없는 죽고, 메마르고 굳은 세포가 있는 각질층(Stratum corneum) (horny layer), (ii) 호염기성 과립(basophilic granules)을 함유하고 투명층에 의해 각질층으로부터 바깥쪽으로 분리된 세포가 있는 과립층(Stratum granulosum) (granular layer), (iii) 세포가 위쪽으로 움직임으로써 점점 더 편평해지는 유극층(Stratum spinulosum) (가시가 있는(spinous), 가시 모양의(spiny) 또는 유극 세포층(prickle cell layer)), 및 (iv) 원주 (columnar)(높은) 재생 세포가 있는 기저층(Stratum basale) (basal layer)인, 4개 또는 5개의 뚜렷한 층을 형성한다.

표피의 바로 아래는 표피와 진피 사이에 놓인 특수화된 구조인 기저막이다.

진피는 피부의 섬유성 결합조직(fibrous connective tissue) 또는 지지층이다. 주요 섬유는 콜라겐 섬유 및 섞어짠 엘라스틴이다.

피하 조직(subcutis)은 진피와 표피 바로 아래 지방층이다. 이것은 피하조직 (subcutaneous tissue), 하피(hypodermis) 또는 피하 지방층(panniculus)으로도 불린다. 피하 조직은 주로 지방 세포(adipocytes), 신경 및 혈관으로 이루어진다.

새로운 상피 피부 세포는 피부의 낮은 층인 과립층에서 생성된다. 시간이 흐르면서, 세포는 피부의 표면으로 이동하고 더 산성으로 된다. 이들의 30일 여행 동안, 이들은 죽고 케라틴으로 포화된다. 케라틴 및 관련 지질은 이들이 외부 요소로부터 피부를 보호하기 때문에 중요하다.

질병, 부상, 환경적 요인, 나이, 호르몬 수준, 약물 치료, 외부에서 적용된 또는 섭취된 물질, 유전적 상태 또는 이들의 조합을 포함하는 많은 요인 및 기타 요인은 피부의 미용 외모에서 노후화에 기여할 수 있다. 피부의 미용 외모에서 나이 관련 노후화는 일반적인 요인, 특히 광노화, 즉 광노출(Dermatoheliosis) 이다. 노후화는 피부에서 불규칙 또는 비정상을 볼 수 있으며, 건조 피부, 주름, 잔주름 (fine lines), 증가된 느슨함(laxity) (늘어짐(sagging)) 또는 변경된 색소로 나타날 수 있다.

광노화는 만성적 UVA 및 UVB 노출에 의해 유발된 특징적인 변화에 사용된 용어이다. 생물학적 기능의 저하 및 대사 스트레스(metabolic stress)를 다루는 능력은 노화 과정의 중요한 결과 중 하나이다. 노화는 피부의 기능적 및 심미적 변화를 야기하는 복잡하고 점진적인 과정이다.

광노화는 자연 또는 합성 광으로부터 일 수 있는 대략 245-290 nm의 자외선 (UV)에 피부의 연속적이고 장기간 노출에 기인한 피부의 노화 과정이다. 따라서, 광노화는 UVA 및 UVB 선에 의해 야기된 피부, 특히 얼굴, 귀, 목 및 손의 노화로서 알려져 있다.

건조 및/또는 스케일링 피부는 노화 피부의 가장 일반적인 징후 중 하나이다. 비록 특정 개인은 건조 및/또는 스케일링 피부에 더 민감할지라도, 건조 및/또는 스케일링 피부의 외모는 나이, 성별, 또는 피부 유형에 상관없이 모든 사람에게 영향을 미칠 수 있다.

건조 피부는 피부의 외부층(outer layer) (투명층이 있는 각질층)이 경피수분손실(trans-epidermal water loss, TEWL)을 통해 수분이 고갈될 때 발생한다. 이 층이 충분히 촉촉해질 때, 피부를 통해 수분 손실이 최소화되고 자극제, 알레르겐, 및 병원균이 못 들어오게 도와준다. 그러나, 각질층이 건조될 때, 이의 보호 기능은 감소된다. 이는 큰 피부 손실을 가능하게 하여, 환경적 요인에 상처받기 쉬운 피부를 남겨둔다.

이상적으로, 각질층은 10% 내지 30%의 수분 함량을 가진다. 이 수분은 피부에 부드럽고, 매끄러우며 유연한 질감, 즉 피부의 젊어보이는 외모와 관련된 특성을 부여한다. 수분은 대기, 피부의 하부층(underlying layer), 및 땀에서 나온다. 피부샘에 의해 생성된 오일 및 피부 세포에 의해 생성된 지방 물질은 각질층의 수분을 봉쇄하는 중성 보습제로 작용한다.

신체는 증발에 의해 피부의 표면으로부터 수분을 끈임없이 잃는다 (TEWL). 정상 상태 하에서, 손실 속도는 느리고, 수분은 적당히 대체된다. 건조 피부의 특징적인 징후 및 증상은 수분 손실이 수분 대체를 초과할 때 발생하고, 각질층의 수분 함량은 10% 이하로 떨어진다.

건조 및/또는 스케일링 피부를 개선시키거나 또는 근절시키는 보습제는, 피부의 미용 외모를 개선시킴으로써 매우 바람직하다. 많은 보습제가 기술분야에서 알려져 있으나, 여전히 효과적으로 부드러운 천연 제품이 필요하다.

원하지 않는 또는 과도한 착색, 즉 과착색, 예를 들어 기미를 나타내는 표피 세포는 노화 피부의 다른 일반적인 징후이다. 전통적으로 박피(exfoliation)를 사용하여 피부의 미용 외모에 해로운 표피 세포를 제거할 수 있다.

박피는 표피의 외부층을 제거하여 아래에 새로운 피부 세포를 나타낸다. 박피는 물리적 수단 (즉, 피부의 마모)에 의해 또는 화학적 수단에 의해 이루어질 수 있다. 화학적 각질제거제는 살리실산, 글리콜산, 과일 효소, 시트르산 또는 말산 (malic acid)을 함유하는 스크럽을 포함하며, 피부과 의사에 의해 고농도로 또는 의사 처방 없이 살 수 있는 제품(over-the-counter products)의 저농도로 적용될 수 있다. 화학적 박피는 간단한 방법으로 알파 히드록시산(alpha hydroxy acids, AHAs) 또는 베타 히드록시산(beta hydroxy acids, BHAs)을 함유하는 제품, 또는 세포 접합에서 함께 세포를 보유하는 접착제-유사 물질을 느슨하게 하는 효소의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 박피는 여드름을 치료하는 사람에게 추천한다.

박피의 가장 큰 단점은 이를 이루기 위해 사용된 몇몇의 제품 및 방법이 고가이다. 박피는 피부에 약간의 초기 발적(redness)을 야기할 것이다. 화학적 박피의 끝날 때쯤, 피부 표면에서 밝은 백색으로부터 회색으로 변하는 색과 함께 피부를 급속 냉동할 것이다.

따라서, 박피보다 피부를 더 부드럽게 하는 피부의 과착색 (hyperpigmentation)을 감소시키는 효과적인 방법이 바람직하다.

노화 외에, 신체적 손상은 피부의 미용/심미적 외모를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 가벼운 찰과상(minor scrapes), 할퀸 상처(scratches) 등에 의해 피부의 최상(표면) 층, 즉 표피 및/또는 진피에 표면 손상은 피부에 원하지 않는 잡티 (blemishes)를 야기할 수 있다. 상처(wounds), 베인 상처(cuts), 감염, 여드름 등에 의해 야기된 피부에 신체적 손상은 흉터가 될 수 있다.

상처는 그 중에서도 특히, 구조적 조직의 완전한 상태의 물리적 파괴를 야기하는 화학적, 열적 또는 병원균 수단에 의해 야기된 외부 또는 내부 부상이다.

흉터는 부상 후 정상 피부로 대체되는 섬유성 조직 (섬유증(fibrosis))의 면적이다. 흉터는 피부 및 신체의 다른 조직에서 상처 회복의 생물학적 과정으로부터 생긴다. 따라서, 흉터는 치유 과정의 자연적 부분이다. 매우 작은 병변을 제외하고, 모든 상처 (예를 들어, 사고, 질병, 또는 수술)는 어느 정도의 흉터를 야기한다.

흉터 조직은 부상당하지 않은 정상 피부보다 기능적으로 그리고 미용적으로 열등하다. 이러한 열등은 새로운 조직 형성 동안 생성된 진피 내에 콜라겐 묶음의 배열의 결과일 것으로 생각된다. 정상 피부 내의 콜라겐 묶음은 복잡한 3-차원으로 짠 배열 (종종 "바구니-짜기(basket-weave)" 배열이라 함)이고, 피부에 높은 수준의 탄력성, 및 손상 회복력(resilience to damage)을 제공한다. 흉터 조직 내의 콜라겐 묶음은 피부 표면과 평행 지향적인 묶음과 함께 더 평면 방식으로 배열된다. 3-차원 짜기의 손실 및 콜라겐 묶음의 평행 배열과 함께 이의 대체는 조직 흉터 부위에서 미용술(cosmesis)의 손실의 원인이 될 것으로 생각된다.

또한, 흉터는 개개의 피부층의 파괴에 기인할 수 있다. 예를 들어, 임신선 (stretch marks) (선(striae)로도 알려짐)은 진피의 파괴에 의해 야기된다. 임신선은 종종 빠른 성장 (보통 사춘기에서) 또는 체중 증가 (예를 들어, 임신, 근육 형성(muscle building), 또는 지방의 빠른 증가)와 관련된 피부의 빠른 스트레칭의 결과이고, 또는 어떤 경우에는, 진피의 탄력성을 극복하는 피부에 심각한 당기는 힘(pulling force)의 결과이다. 또한, 임신성은 사춘기, 임신, 근육 형성, 성전환을 위한 호르몬 대체 요법 등과 관련된 호르몬 변화에 의해 영향을 미칠 수 있다. 이러한 종류의 흔적은 위축선(striae atrophicae), striae vergetures, 튼살 (striae distensae), 피부 열선(striae cutis distensae), 임신선(striae gravidarum) (임신에 의해 야기되는 경우), lineae atrophicae, linea albicante, 또는 간단한 선(simply striae)으로 알려져 있다.

따라서, 피부의 심미적 외모를 촉진시키기 위한 적당한 처리의 필요성이 남아있다. 즉, 피부의 미용 외모를 개선시키는 방법이 바람직하다. 특히, 노화된 피부에 대해 젊어보이는 외모의 회복 및/또는 노화 피부의 징후의 방지를 위한 방법이 요구되고 있다. 또한, 표면적으로 손상된 피부의 외모, 예를 들어 표피 및/또는 진피에 가벼운 손상에서 기인한 흉터가 있는 피부 또는 잡티의 개선, 회복 또는 방지를 위한 방법이 필요하다.

연어과 부화액(Salmonidae hatching fluid)에서 확인된 특정 분자, 즉 류코렉틴으로 알려진 폴리펩티드는 놀랍게도 피부의 미용 외모의 개선, 특히 노화 피부와 관련된 신체적 징후의 감소 및 표면적으로 손상된 피부의 외모의 회복에 현저히 효과적인 것으로 지금 확인되었다.

처음에, 단백질은 어류에서 동정 및 정제되었으며, 전체 참조로 본 명세서에 포함된 WO 2010/049688에 기재되었다. 연어 단백질은 255 아미노산 (서열번호: 1)을 가진다. 이는 폴리펩티드의 프로펩티드 형태이고, 19 아미노산 N-말단 펩티드를 함유하며, 나중에 (즉, 난황주위간극(perivitelline space)으로) 분비를 위해 리소좀에 표적된다는 것을 암시한다.

폴리펩티드의 아미노산 서열은 분석된 조직에 따라 에피토프-특이적 항체의 발달을 가능하게 하고, 교대로 단백질의 많은(2-8) 외견상 아형의 확인을 가능하게 하였다. 적어도 2개의 mRNAs가 폴리펩티드 수준에서 단지 7 변화를 야기하는 소수의 서열 차이를 함유하는 연어로부터 분리되었다. 또한, 끝을 자른 형태의 단백질은 연어 백혈구로부터 동정되었다 (서열번호: 2 참조).

단백질은 임의의 알려진 단백질과 거의 닮지 않았고, 임의의 알려진 단백질과 50% 미만의 전체 유사성을 나타낸다. 일부 유사성이 타킬로렉틴 (tachylolectins)에 대한 작은 도메인에서 관찰되었다.

이러한 단백질은 놀랍게도 피부의 미용 외모에 대해 현저한 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 이론에 국한되지 않고, 실시예는 류코렉틴이 피부 섬유아세포로부터, 아연 의존적 엔도펩티다제인 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinases, MMPs)의 방출을 저해할 수 있다는 것을 설명한다. 이러한 효소는 피부의 세포외 기질, 예를 들어 콜라겐에 존재하는 많은 다른 유형의 단백질을 분해할 수 있고, 이러한 효소의 방출의 저해는 적어도 부분적으로 이러한 단백질이 피부의 미용/심미적 외모에 대해 미치는 영향의 원인이 된다고 생각된다.

따라서, 가장 넓게, 본 발명은 피부의 심미적 외모를 촉진시키는데 사용하기 위한, 또는 방법에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 제공하는 것으로 볼 수 있다. 즉, 본 발명은 피부의 미용 외모를 개선시키는데 사용하기 위한, 또는 방법에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 제공하는 것으로 볼 수 있다. 특히 바람직한 측면에서, 본 발명은 노화된 피부에 대해 젊어보이는 외모의 회복 및/또는 노화 피부의 징후의 방지에 사용하기 위한, 또는 방법에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 제공하는 것으로 볼 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 측면은 표면적으로 손상된 피부의 외모, 예를 들어 표피 및/또는 진피에 가벼운 손상으로부터 기인하는 흉터가 있는 피부 또는 잡티의 개선, 회복 또는 방지에 사용하기 위한, 또는 방법에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 제공하는 것으로 볼 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 화장료 조성물로 제공될 수 있으며, 조성물은 하나 이상의 생리적으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함한다는 것이 하기 명세서로부터 명백해질 것이다.

따라서, 하나의 측면에서 본 발명은 포유동물의 피부의 미용 외모를 개선시키는데 사용하기 위한,

(i) 서열번호 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 서열에 적어도 90% 동일한 서열, 또는 상기 서열 중 어느 일부를 포함하는 폴리펩티드; 또는

(ii) (i) 및 하나 이상의 생리적으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포유동물의 피부의 미용 외모를 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물은 상기 동물에 투여된다.

본 발명의 추가 측면은 포유동물의 피부의 미용 외모를 개선시키기 위한 약제의 제조에서 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물의 용도이다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이, "폴리펩티드"는 바람직하게는 50, 100, 150, 200 또는 250 이상의 잔기 및/또는 500, 400, 300, 200 또는 100 미만의 잔기 또는 이로부터 선택된 범위를 가진 분자이다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, "일부 (portion)"는 바람직하게는 유도된 것으로부터 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 그 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 일부는 서열의 중심 또는 N-말단 또는 C-말단 부분으로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 일부는 먼저 폴리펩티드의 50, 100 또는 150 잔기로부터 N-말단 끝으로부터 얻어진다. 대안적으로, 폴리펩티드의 50, 100 또는 150 잔기로부터 C-말단 끝으로부터 얻어진 일부가 바람직하다. 특히 바람직한 측면은 신호 펩티드 또는 자연적으로 발생하는 변종에 없는 일부를 제거하기 위해 상기 폴리펩티드의 절두(truncation)를 포함한다. 바람직한 절두는 N-말단 끝에서 발생하고, 1 내지 50, 예를 들어 1 내지 10, 20, 30 또는 40, 또는 5 내지 40, 예를 들어 10 내지 35 잔기의 길이이다.

바람직하게는, 상기 서열은 비교되는 서열에 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다.

서열 동일성은 가변적인 팜인자(pamfactor), 및 12.0에서 갭 창조 페널티 (gap creation penalty) 세트, 4.0에서 갭 확장 페널티 세트, 및 2 아미노산의 창 (window)을 가진 FASTA pep-cmp를 이용하여 SWISS-PROT 단백질 서열 데이터뱅크를 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 비교는 전장의 서열을 통해 이루어지나, 비교의 작은 창, 예를 들어 200, 100 또는 50 미만의 연속적인 아미노산을 통해 이루어질 수 있다.

바람직하게는, 이러한 서열 동일성 관련된 폴리펩티드는 열거된 서열번호의 폴리펩티드에 기능적으로 동등하다. 이러한 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 하기에 설명한 바와 같은 유도체의 형태를 얻을 수 있다. 유사하게, 서열번호의 서열을 가진 폴리펩티드는 하기 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않고 변형될 수 있다.

또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 "일부"는 기능적 동등일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 일부는 본 명세서에 언급된 동일성 (비교 일부에 비해) 조건을 만족시킨다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이, "기능적 동등"을 이루기 위해 폴리펩티드는 부모 분자 (즉, 아미노산 치환에 의해 유도된 것으로부터의 분자)에 비해 화장료 기능을 수행하는데 약간의 감소된 효능을 나타낼 수 있으나, 바람직하게는 효율적이거나 또는 더 효율적이다. 따라서, 기능적 동등은 이하 기재된 바와 같이 피부의 미용 외모를 개선하는데 효과적인 폴리펩티드에 관한 것이다. 이것은 실시예에 나타낸 in vivo 분석을 수행함으로써 정성 또는 정량 방법으로 유도된 것으로부터의 폴리펩티드에 비해 유도체 폴리펩티드의 효과의 비교에 의해 시험될 수 있다. 정량 결과가 가능한 경우, 유도체는 30, 50, 70 또는 90%로 부모 폴리펩티드 만큼 효과적이다. 대안적으로, in vitro 시험은 in vitro 세포 배양에서 MMPs의 방출의 저해 분석에 의해 수행될 수 있다.

자연적으로-발생하는 단백질과 관련된 또는 이로부터 유도된 기능적으로-동등한 단백질은, 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 본래의 아미노산 서열을 변형시키나 (이들이 상기한 서열 동일성 필요조건을 충족시키는 것을 제공), 분자의 기능을 파괴시키지 않고 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 본래의 서열은 20 미만의 치환, 첨가 또는 결실, 예를 들어 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 이러한 변형을 가진다. 이러한 단백질은 하나 이상의 염기의 적당한 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 생성된 "기능적으로-동등한 핵산 분자"에 의해 인코딩된다.

바람직한 기능적 동등은 부모 폴리펩티드에 융합된 추가 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 아미노 및/또는 카복시 말단 융합 단백질 또는 폴리펩티드가 생성되는 "첨가" 변종이다.

특히 바람직한 기능적으로-동등한 변종은 천연 생물학적 변형, 특히 대립유전자 변종(allelic variants) 또는 종 또는 대안적으로 연어과(Salmonidae), 특히 아과(sub-families) 송어속(Salmo) 및 연어속(Oncorhynchus)으로부터의 다른 속 (genus) 내의 지리학적 변형(geographical variations) 및 알려진 기술을 이용하여 제조된 유도체이다. 특히 바람직한 연어과의 종은 대서양 연어(Atlantic Salmon) (Salmo salar) 및 태평양 연어(Pacific Salmon) (Oncorhynchus masou)를 포함한다.

상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 탈당화(deglycosylation) 또는 당화 (glycosylation)를 포함하는 화학적 변형에 의해 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않고 변형된 것을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 특정 잔기의 기능성, 예를 들어 특정 당화, 메틸화 등에 영향을 미치지 않고 폴리펩티드의 분리후(post-isolation) 변형에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 용도를 위한 또는 조성물에서 폴리펩티드는 폴리펩티드의 기능적 특징을 보유하나 다르게 존재하는, 예를 들어 비-펩디드 구조인 유도체로 간주될 수 있는 펩티도모방체(peptidomimetics)의 형태로도 얻을 수 있다. 이러한 펩티도모방체는 성공적으로 개발되고 다른 적용, 특히 의료에 사용되었다.

펩티도모방체, 특히 비-펩티드성 분자(non-peptidic molecules)는 형태-기반 (conformational-based) 약물 설계, 스크리닝, 집중적인 라이브러리 설계(focused library design) 및 고전적 의약 화학을 포함하는 다양한 공정을 통해 생성될 수 있다. 비천연 아미노산의 올리고머 또는 기타 유기 빌딩블록이 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 탄수화물, 헤테로고리 또는 거대고리 화합물 또는 펩티드의 3-차원 형태의 동일한 특성을 모방하는 분자 정전기 표면(molecular electrostatic surface)을 제공하는 구조적 요소 및 형태를 포함하는 임의의 유기분자도 기술분야에서 알려진 방법에 의해 사용될 수 있다.

따라서, 펩티도모방체는 펩티드 백본에 거의 또는 닮지 않은 것을 가질 수 있다. 펩티도모방체는 완전히 합성 비-펩티드 형태 (예를 들어, 적당한 치환기를 가진 탄수화물 백본을 기반으로 함)를 포함할 수 있고, 또는 하나 이상의 아미노산을 유도체화 또는 하나 이상의 아미노산을 대안적인 비-펩티드 성분으로 대체하는 것을 기반으로 한 하나 이상의 펩티드 요소를 보유할 수 있다. 펩티드-유사 주형은 슈도펩티드 및 고리형 펩티드를 포함한다. 펩티드의 기능에 매우 풍부한 것으로 간주된 구조적 요소는 단지 발판(scaffold) 기능을 보유하기 위해 최소화될 수 있거나 또는 적당한 곳에서 제거될 수 있다.

펩티도모방체가 하나 이상의 펩티드 요소, 즉 하나 이상의 아미노산을 보유하는 경우, 이러한 아미노산은 비-표준 또는 이의 구조적 유사체로 대체될 수 있다. 또한, 서열에 보유된 아미노산은 본 발명의 폴리펩티드의 기능적 특성이 보유되는 한, 유도체화되거나 또는 변형 (즉, 표지된 당화된 또는 메틸화된) 될 수 있다. 펩티도모방체는 특정 폴리펩티드 서열 "로부터 유도될 수 있는(derivable from)" 것으로 나타낸다. 이에 의해, 이것은 펩티도모방체가 이의 기능에 필수적인 펩티드의 구조적 특징을 보유하도록, 정의된 폴리펩티드 서열에 관하여 설계된 것을 의미한다. 이것은 폴리펩티드의 특정 곁사슬, 또는 구조의 잠재적인 수소결합일 수 있다. 이러한 특징은 비-펩티드 성분 또는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 제공될 수 있고, 또는 폴리펩티드의 상기 아미노산 잔기를 연결하는 결합은 이의 기능에 필수적인 폴리펩티드의 구조적 특징을 보유하는 동안, 안정성 또는 프로테아제 내성과 같은 폴리펩티드의 특정 기능을 개선시키기 위해 변형될 수 있다.

사용될 수 있는 비-표준 또는 이의 구조적 유사체의 예는 D 아미노산, 아미드 동배체(amide isosteres) (예를 들어, N-메틸 아미드, 레트로-역(retro-inverse) 아미드, 티오아미드, 티오에스터, 포스포네이트, 케토메틸렌, 히드록시메틸렌, 플루오로비닐, (E)-비닐, 메틸렌아미노, 메틸렌티오 또는 알칸), L-N 메틸아미노산, D-α 메틸아미노산, D-N-메틸아미노산 이다. 비-통상적인 아미노산의 예는 표 1에 열거하였다.

[표 1]

사용될 수 있는 비-표준 아미노산은 Tic (F로 대체), Aib (A로 대체) 또는 피페콜산(pipecolic acid) (Pro로 대체)과 같은 형태적으로 제한된 유사체를 포함한다.

또한, 상기 논의된 폴리펩티드는 친유성, 보조 세포의 수송, 용해도 및/또는 안정성을 개선하기 위해 표적 또는 작용기의 첨가에 의해 (본 명세서에 논의된) 화장료 적용에서 이들의 사용을 촉진시키기 위해 변형된 유도체를 포함한다. 따라서, 올리고당류, 지방산, 지방 알콜, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기한 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 결합될 수 있다.

또한, 폴리펩티드는 가해진 성분이 투여되자마자 절단에 의해, 예를 들어 에스터라제의 작용에 의해 제거될 수 있는 에스터화를 통해 가해진 치환기의 절단에 의해 제거될 수 있도록, "전구-약물(pro-drugs)" 또는 "전구-펩티드(pro-peptides)"의 형태의 유도체를 포함한다. 이러한 전구-약물은 관심있는 폴리펩티드를 생성하기 위해 단백질 가수분해(proteolysis)에 의해 절단된 자연적으로 발생하는 단백질의 본래의 전구체를 포함한다. 이러한 전구체는 전구체 형태로는 불활성일 수 있으나 단백질 가수분해 절단에 의해 활성화될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 변형된 폴리펩티드는 만일 이들이 동일하거나 유사한 의료 효과를 가진다면 측정에 의해 변형되지 않은 분자에 비해 기능적 활성을 보유하고 있음을 확인하기 위해 시험될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물에 사용된 폴리펩티드 및 용도는 자연적으로 발생하는 공급원으로부터 얻어지거나 유도될 수 있다.

편리하게, 폴리펩티드는 실시예에 기재된 프로토콜에 따라 분리된다. 이러한 방법 및 이러한 방법의 생성물은 발명의 추가적 측면을 형성한다.

따라서, 추가적 측면에서 본 발명은 (i) 폴리펩티드를 분리하는 단계 또는 (ii) 적어도 a) 최소량의 물에 연어과 알류(Salmonidae eggs)를 현탁하는 단계 (예를 들어, 알류의 용량과 동등하거나 이하);

b) 상기 알류의 동시에 일어나고 빠른 부화를 유도하는 단계(바람직하게는, 부화가 95% 이상의 배아에 대해 2시간 미만 내에 완료되도록);

c) 임의로 부화된 알류를 여과하여 부화액을 얻는 단계; 및

d) 부화액을 여과하여 폴리펩티드 및/또는 조성물을 얻는 단계를 포함하는, 연어과 부화액 (예를 들어, 연어 부화액)으로부터 본 명세서에 기재된 바와 같은 화장료 조성물을 제조하는 단계의 방법을 제공한다.

임의로, 상기 방법으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 생성물은 본 발명의 방법 및 용도에서 사용하기 전에 적당한 농도로 희석시키거나 또는 농축시킬 수 있다.

첫 번째 실시예에서, 부화액을 여과하는 단계는

(i) 적어도 5 ㎛의 공극 크기, 바람직하게는 5-15 ㎛, 및 특히 바람직하게는 7 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 부화액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계;

(ii) 0.30-0.60 ㎛의 공극 크기, 바람직하게는 0.35-0.55㎛의 공극 크기, 특히 바람직하게는 0.40-0.50㎛, 가장 바람직하게는 0.45㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (i)의 여과액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계;

(iii) 단계 (ii)의 여과액 내 물을 약학적으로 허용가능한 완충액으로 교환하는 단계;

(iv) 적어도 80kDa의 배제 크기, 바람직하게는 80-120kDa, 가장 바람직하게는 100kDa의 배제 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iii)으로부터 얻어진 용액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계; 및

(v) 0.15-0.30 ㎛의 공극 크기, 바람직하게는 0.22㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iv)의 여과액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계를 포함하는 다수의 단계를 포함할 수 있고, 상기 여과액은 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 방법에 의해 얻어진 생성물은 본 발명의 추가 측면을 형성한다.

대안적으로, 두 번째 실시예에서, 부화액을 여과하는 단계는

(i) 적어도 5 ㎛의 공극 크기, 바람직하게는 5-15 ㎛, 및 특히 바람직하게는 7 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 부화액을 여과하는 단계;

(ii) 단계 (i)의 여과액을 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 모으는 단계;

(iii) 단계 (ii)의 용출액 내 물을 약학적으로 허용가능한 완충액으로 교환하는 단계; 및

(iv) 0.15-0.30 ㎛의 공극 크기, 바람직하게는 0.22㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iii)으로부터 얻어진 용액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계를 포함하는 다수의 단계를 포함할 수 있고, 상기 여과액은 상기 폴리펩티드 또는 이의 일부를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 방법에 의해 얻어진 생성물은 본 발명의 추가 측면을 형성한다.

어떤 실시예에서, 단계 (i)의 여과액을 첫 번째 여과 단계보다 작은 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 여과 단계를 더 수행하는 것이 유익할 수 있다. 이것은 부화액으로부터의 물질이 이온 교환 컬럼을 막는(clogging) 것을 하지 못하도록하는데 도울 수 있다.

따라서, 부화액을 여과하는 단계는

(i') 0.30-0.60 ㎛의 공극 크기, 바람직하게는 0.35-0.55㎛의 공극 크기, 특히 바람직하게는 0.40-0.50㎛, 가장 바람직하게는 0.45㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (i)의 여과액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계;의 임의의 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 임의의 여과 단계는 단계 (i)의 여과액을 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계 전에 발생한다. 따라서, 이온 교환 크로마토그래피가 수행된 여과액은 단계 (i) 또는 단계 (i')로부터일 수 있다.

예시적인 실시예에서, 단계 (ii)는

(a) DEAE (디에틸아미노에틸) 컬럼과 같은 이온 교환 컬럼에 (단계 (i) 또는 단계 (i')의) 여과액을 로딩하는 단계;

(b) 적당한 완충액, 예를 들어 20mM Tris-HCl, pH 8.5를 포함하는 세척 용액으로 컬럼을 세척하는 단계;

(c) 염, 예를 들어 50mM NaCl을 더 포함하는 세척 용액과 같은 용출 완충액 또는 용매를 이용하여 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용출하는 단계; 및

(d) 단계 (c)의 용출액을 모으는 단계를 포함한다.

따라서, 일반적인 부화액의 여과 방법은 상기 방법으로부터 단계 (i); 0.30-0.60 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용한 상기 첫 번째 방법으로부터 단계 (ii) 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 상기 두 번째 방법으로부터 단계 (ii); 상기 방법으로부터 단계 (iii); 임의로 적어도 80kDa의 배제 크기를 가진 여과기를 이용한 상기 첫 번째 방법으로부터 단계 (iv) 및 0.15-0.30 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용한 상기 첫 번째 방법의 단계 (v) (상기 두 번째 방법의 단계 (iv)와 동등)를 포함할 수 있다.

여과액이 자체로 화장료 조성물을 형성할 수 있는 반면, 임의로 상기 방법으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 생성물 (첫 번째 실시예의 단계 (v) 또는 두 번째 실시예의 단계 (iv)의 여과액)은 본 발명의 방법 및 용도에서 사용하기 전에 적당한 농도로 희석 (또는 농축)시킬 수 있다. 따라서, 방법은 조성물을 희석 (또는 농축)시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 여과액은 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 5000 또는 10000의 인자에 의해 희석 (또는 농축)될 수 있다.

임의로, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제는 상기 방법으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 생성물에 가해질 수 있다. 따라서, 방법은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 조성물에 가하는 단계, 또는 조성물과 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 조합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대안적 또는 추가 제조 방법 단계는 용매를 변화 또는 변형하는 단계, 예를 들어 pH, 이온 농도 등을 포함한다.

기타 약학적으로 허용가능한 성분 또는 구성 요소는 상기 방법으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 생성물에 가해질 수 있다. 하나 이상의 다른 성분은 활성 성분, 즉 피부에 영향을 미치는, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 화장품 표시 (cosmetic indication)에서, 피부의 심미적 외모를 촉진시키거나 또는 피부의 미용 외모를 개선시키는데 작용하는 성분일 수 있다. 따라서, 대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 활성 성분을 조성물에 가하는 단계, 또는 조성물과 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 활성 성분을 조합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 활성 성분은 무기질, 비타민, 효소, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 항산화제, 다당류, 자외선 차단제 여과기로서 적합한 물질, 화학적 각질제거제, 추출물 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 분리된 폴리펩티드 및/또는 상기 방법으로부터 얻어진 또는 얻어질 수 있는 화장료 조성물은 본 발명의 방법에서 사용에 적합하다. 특히, 화장료 조성물은 포유동물의 피부의 미용 외모를 개선시키는데 사용한다.

여과액을 이온 교환 크로마토그래피로 수행하는 단계는 본 발명의 폴리펩티드 (상기 정의된 바와 같이 이의 일부 포함)가 정제 전 (이온 교환 크로마토그래피 전)에 부화액 추출물에 존재하는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드에 비해 풍부하게 있는 여과액을 야기하는 임의의 적당한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피는 본 발명의 폴리펩티드가 정제 단계 전에 부화액 추출물에 존재하는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드, 바람직하게는 다른 폴리펩티드 모두에 비해 적어도 5%까지 풍부하게 있는 여과액을 야기할 수 있다. 다른 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드 (즉, 류코렉틴)의 구조적 및/또는 기능적 정의 내로 떨어지지 않는 폴리펩티드로서 정의될 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 이 단계에 의해 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50% 까지 풍부하다. 특히 바람직하게는, 폴리펩티드는 정제 전에 부화액 추출물에 존재하는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드에 비해 50% 또는 60% 이상, 예를 들어 >70%, 80% 또는 90%의 순도 정도, 바람직하게는 95% 또는 99% 이상의 순도 정도로 정제된다. 따라서, 용출액은 이온 교환 크로마토그래피 전에 부화액 추출물에 존재하는 단지 미량의 다른 폴리펩티드, 예를 들어 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% 또는 0.00001% w/w 미만의 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 적당한 이온 교환 컬럼은 시판된다. 예시적인 실시예에서, 이온 교환 컬럼은 DEAE (디에틸아미노에틸) 컬럼, 즉 DEAE에 결합된 셀룰로오스, 실리카, 세파로오스 등과 같은 불활성 기질(inert matrix)의 컬럼이다. 그러나, 다른 이온 교환 컬럼은 상기 기재된 방법에서 사용에 적합할 수 있다.

여과된 부화액을 이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계는 본 발명의 폴리펩티드를 결합할 수 있도록 제조되거나 또는 활성화된 이온 교환 컬럼에 부화액을 적용하는 단계를 포함한다. 이온 교환 컬럼을 제조 또는 활성화하는 단계는 일반적으로 완충액, 예를 들어 하기 정의된 바와 같은 세척 완충액으로 컬럼을 세척하는 단계를 포함한다. 이 미리-세척 단계는 폴리펩티드를 컬럼에 결합할 수 있게 하기 위해 최적의 조건 하, 예를 들어 pH에서 이온 교환 컬럼에서 끝난다. 따라서, 로딩 단계는 이온 교환 컬럼에 본 발명의 폴리펩티드를 결합하는 단계로 볼 수 있다.

여과된 부화액을 이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계 후, 표준 프로토콜에 따라, 컬럼을 적당한 완충액으로 세척하여 부화액에 존재하는 컬럼에 결합되지 않은 원하지 않는 성분을 제거할 수 있다. 세척 단계는 컬럼에 다량의 세척 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 일반적으로 컬럼에 적용된 세척 완충액의 부피는 이온 교환 컬럼의 용량에 적어도 동일하고, 그리고 그 이상, 예를 들어 적어도 1.5, 2, 3, 4 또는 5 배의 용량의 컬럼일 수 있다. 어떤 실시예에서, 세척 단계는 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 배로 반복될 수 있다. 임의의 적당한 세척 완충액은 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 적당한 세척 완충액은 관심있는 폴리펩티드와 이온 교환 컬럼 사이의 상호작용이 상당히 방해되지 않는 것이고, 예를 들어 10% 미만, 예를 들어 5, 4, 3, 2 또는 1% 미만의 본 발명의 폴리펩티드는 각 세척 단계에 의해 이온 교환 컬럼으로부터 제거된다. 바람직한 실시예에서, 세척 완충액은 6-10, 바람직하게는 7-9, 예를 들어 8.5 범위의 pH와 함께 10-100mM, 바람직하게는 10-50mM, 예를 들어 20-30mM 범위의 Tris-HCl 용액이다. 세척 단계가 더 필요한지 (예를 들어, 정제 전에 부화액에 존재하는 원하지 않는 성분을 나타내는 폴리펩티드, 다당류, 염 등의 존재를 시험) 및/또는 포기할지를 결정하기 위해, 세척 단계로부터 통과액을 모을 수 있다.

이온 교환 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용출하는 단계는 임의의 적당한 수단에 의해 수행될 수 있고, 일반적으로 관심있는 폴리펩티드와 이온 교환 컬럼 사이의 상호작용을 방해하기 위해 컬럼에 용매 또는 용액의 적용을 포함한다. 일반적으로 컬럼에 적용된 용출 완충액의 부피는 이온 교환 컬럼의 용량에 적어도 동일하고, 그리고 그 이상, 예를 들어 적어도 1.5, 2, 3, 4 또는 5 배의 용량의 컬럼일 수 있다. 어떤 실시예에서, 용출 단계는 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 배로 반복될 수 있다. 용출액 (용출 단계로부터의 통과액)은 각 용출 단계로부터 모을 수 있고, 하나 이상의 용출액은 용출액 내 물을 교환하는 단계 전에 조합될 수 있다. 적당한 세척 완충액은 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 적당한 용출 완충액 또는 용매는 본 발명의 폴리펩티드와 이온 교환 컬럼 사이의 상호작용을 방해하는 것이고, 예를 들어 컬럼에 결합된 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 본 발명의 폴리펩티드는 각 용출 단계에 의해 컬럼으로부터 용출된다.

바람직한 실시예에서, 용출 완충액은 폴리펩티드와 이온 교환 컬럼 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 물질, 예를 들어 염을 포함하는 세척 완충액과 동일하다. 따라서, 어떤 실시예에서, 용출 완충액은 염, 예를 들어 10-500mM, 바람직하게는 20-400mM, 30-300mM, 40-200mM 또는 50-100mM 범위의 NaCl, KCl 등, 예를 들어 50mM NaCl을 포함하는, 6-10, 바람직하게는 7-9, 예를 들어 8.5 범위의 pH와 함께 10-100mM, 바람직하게는 10-50mM, 예를 들어 20-30mM 범위의 Tris-HCl 용액이다.

여과액 또는 용출액 내 물을 교환하는 단계는 기술분야에서 알려진 임의의 적당한 방법, 예를 들어 희석여과(dia-filtration) 또는 투석(dialysis)을 이용하여 수행될 수 있다. 특히 바람직한 실시예에서, 이 단계는 15kDa 미만, 바람직하게는 10kDa 이하, 예를 들어 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3kDa 또는 그 이하의 배제 크기를 가진 여과기를 이용한 희석여과를 이용하여 수행된다.

희석여과는 용액으로부터 염 또는 기타 원하지않거나 또는 바라지 않는 미세용질을 제거하기 위해 또는 용액의 용매, 예를 들어 완충액을 교환하는 방법으로서 한외여과막을 사용한다. 잔류액(retentate) 내 큰 분자(여과기를 통과하지 못한 물질)가 함유되는 반면, 소분자는 용액으로부터 분리된다. 미세용질 및 용매, 예를 들어 물은 일반적으로 막을 통해 쉽게 세척된다. 일반적으로, 약 3 부피의 희석여과 용매는 95%의 미세용질을 제거할 것이다. 따라서, 상기 첫 번째 방법의 단계 (ii)의 여과액 또는 두 번째 방법의 단계 (ii)의 용출액은 처음에 희석여과에 의해 진행되고, 이것은 (부화액의 가용성 불순물/원하지 않은 분획을 함유하는) 용액의 일부가 막을 통과함으로써 잔류액의 농도가 된다. 그 다음, 잔류액은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예를 들어 0.5mM 인산염 나트륨 및 1mM 염화나트륨, 인산염 완충 식염수 등으로 희석된다. 희석된 잔류액은 필요하면 희석여과를 반복 수행할 수 있다.

동시에 일어난 부화는 기술분야에서 알려진 임의의 적당한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 알류(eggs)는 광-조작(photo-manipulation)을 이용하여, 예를 들어 빛(부화를 저해하는)으로부터 빛이 없는 조건으로 알류를 이동시켜 동시에 일어날 수 있다. 또한, 탈산소화(deoxygenation)에 의한 용액의 온도의 조작 (Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), 및 전기를 이용한 자극을 사용하여 동시에 일어난 부화를 야기할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 최소량의 물은 알류의 용량과 동등하거나 적을 수 있으며, 예를 들어 매 1ml의 알류에 대해 ≤1, 0.75, 0.5, 0.25 ml, 예를 들어 0.5 내지 1ml의 현탁액이 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 및/또는 조성물의 용도로 더 확장된다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드가 백혈구로부터 얻어진 경우, 이것은 변형되지 않은 형태로 얻어진다. 연어과 부화액, 예를 들어 연어로부터 얻어진 폴리펩티드는 (당화 및/또는 인산화에 의해) 변형되나, 양쪽 형태는 본 명세서에 기재된 방법에서 동등하게 효과적이다.

본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 분리 과정 또는 이의 제조에서 사용된 원료 물질 또는 물질들로부터 유도된 임의의 오염 성분이 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는, 화합물은 w/w (건조 중량)으로 평가된 바와 같이 50% 또는 60% 이상, 예를 들어 >70%, 80% 또는 90%의 순도 정도, 바람직하게는 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 이러한 순도 수준은 관심있는 특정 분자에 일치하나, 이의 분해 생성물을 포함한다. 적당한 경우, 낮은 순도를 가지는, 예를 들어 w/w (건조 중량)으로 평가된 바와 같이 1, 2, 5 또는 10% 이상의 관심있는 분자, 예를 들어 20, 30 또는 40% 이상을 함유하는 풍부한 제제가 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 "분리하는" 방법은 상기 기재된 바와 같이 순도로 분리되는 것을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC, 크기-배제, 이온-교환, 친화도, 소수성 상호작용, 역-상) 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)에 의해 정제될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물은 in vitro, 예를 들어 세포 또는 기관 배양에서 사용되어 상기 세포의 특성에 영향을 미칠 수 있고, 예를 들어 세포외 기질의 단백질의 구조 및/또는 조성을 변경하기 위해 MMPs의 방출을 저해할 수 있다.

그러나, 폴리펩티드 및 조성물은 본 명세서에 논의된 바와 같이 in vivo 사용이 바람직하다.

"약학적으로 허용가능한" 또는 "생리적으로 허용가능한"은 성분이 화장료 적용 및 조성물에 적합해야 한다는 것을 의미한다. 또한 성분은 수여자에게 생리적으로 허용가능할 뿐만 아니라 조성물에서 다른 성분과 호환되어야 한다.

투여를 위한 활성 성분은 화장료 조성물에서 사용을 위해 적당하게 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용된 화합물은 상기 기재된 바와 같은 유도체의 사용에 의해 분해에 대해 안정화될 수 있다.

또한, 활성 성분은 염 또는 비-전해질, 아세테이트, SDS, EDTA, 시트레이트 또는 아세테이트 완충액, 만니톨, 글리신, HSA 또는 폴리소르베이트와 같은 적당한 첨가제의 사용에 의해 조성물에서 안정화될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물은 단독의 활성 성분으로서 상기 조성물에 존재할 수 있고, 또는 다른 성분, 특히 다른 활성 성분과 조합하여 (상기 기재된 바와 같은) 미용 효과를 증대시키고 또는 소비자에게 더 흥미를 끄는 조성물을 만들 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물은 피부의 미용 외모, 특히 노화된 피부, 예를 들어 광-노화된 피부, 또는 흉터가 있는 피부, 예를 들어 피부의 적어도 하나의 층의 손상, 예를 들어, 표피 및/또는 진피에 가벼운 손상에 기인한 상처, 또는 잡티 또는 마모를 개선시키는데 유용한 특성을 나타낸다.

또한, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 천연 공급원으로부터 상기 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드의 제조 후, 불순물을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 상기 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에서, 각각의 상기 폴리펩티드는 상기 기재된 방법에 따라 제조된 화장료 조성물의 0.0001 내지 50% w/w 범위 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 추가 희석 후, 상기 방법에 따라 제조된 또는 이하 기재된 바와 같은 화장료 조성물의 0.01 - 40% w/w의 범위로 존재한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 화장료 조성물의 0.0001 내지 5%, 0.0001 내지 3%, 0.0001 내지 2%, 0.0001 내지 1%, 0.0001 내지 0.5%, 0.0001 내지 0.1% w/w의 범위로 존재한다.

화장료 조성물에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부의 비율은 조성물에서 용매, 예를 들어 물을 제외한 다른 용질 (예를 들어, 염)에 대하여 정의될 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부는 조성물의 건조 질량의 10-100% w/w의 범위로 존재할 수 있다. 어떤 실시예에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부는 조합하여 조성물의 건조 질량의 10-90% w/w, 예를 들어 조성물의 건조 질량의 10-80%, 15-70%, 20-60%, 30-50% w/w의 범위로 존재할 수 있다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부는 조합하여 조성물의 건조 질량의 10-40%, 20-39%, 25-38%, 30-37% w/w 등의 범위로 존재할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 사용을 위해 희석될 수 있다.

본 발명은 피부의 미용 외모를 개선시키는 방법에 관한 것이나, 이것은 장애, 비정상 또는 상태의 처리를 포함할 수 있고, 모든 경우에 처리는 사실상 화장료이다.

본 명세서에 나타난 바와 같이, "화장료"는 질병 또는 장애를 치유, 치료 또는 예방하지 않는 처리를 나타내는 것으로 생각되나, 대신 스킨케어 제품으로서 작용하고, 또는 피부의 외모, 예를 들어, 피부의 색, 질감 또는 수분 함량을 변형 또는 개선시키는 것으로 생각된다.

본 명세서에 기재된 처리의 기준은 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드의 피부 항-노화, 흉터-감소 및 항-잡티/항-마모 효과이다. 이러한 효과는 본 명세서에 제공된 실시예에 나타내었다.

따라서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 항-노화, 항-잡티/항-마모 및 흉터-감소 특성을 기준으로 한 처리가 고려되고 있다.

따라서, 본 발명은 포유동물의 피부의 미용 외모를 개선시키는 화장료 방법을 제공하며, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물은 상기 동물에 투여된다.

특히 바람직한 실시예에서, 피부는 노화된, 잡티 또는 흉터가 있는 피부이다.

"노화된 피부"는 하나 이상의 노화의 징후 또는 증상, 예를 들어 주름, 잔주름, 과착색, 느슨함 (늘어짐), 건조 피부, 스케일링 또는 경피수분손실 (TEWL)을 보이는 피부를 나타낸다. 특히, "노화된 피부"는 정상의 최적 피부, 즉 건강한, 수화된(hydrated), 정상 색소 및 비-노화된 피부에 대해 상대적으로 결정된다. 이런 점에서, 노화된 피부는 피험자의 나이와 관련이 필요 없고 햇빛에 만성적 노출(광-손상)에 의해 이르게 노화될 수 있다. 따라서, "정상의 최적 피부"에 대한 상대적 매개변수는 당해의 피험자, 예를 들어 햇빛에 만성적 노출을 받지 않은 피험자와 동일 또는 유사한 나이의 많은 피험자로부터 노화의 상기 징후의 평균 측정으로 결정될 수 있다. 대안적으로, "정상의 최적 피부"에 대한 상대적 매개변수는 당해의 피험자보다 젊은 피험자로부터의 측정으로 얻어질 수 있다. 즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 용도 및 조성물은 젊었을 때 피험자의 피부에 비해, 피부의 젊어보이는 외모를 회복시키는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 포유동물에서 광노출의 처리를 위한 화장료 방법을 제공하고, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물은 상기 동물에 투여되고, 바람직하게는 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 국소 투여된다.

대안적으로, 본 발명은 포유동물에서 광노출의 처리에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물을 제공하고, 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 상기 동물의 피부에 투여된다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 국소 투여용이다.

특히 바람직한 실시예에서, 피부 (예를 들어, 노화된 또는 광-손상된 피부)의 미용 외모의 개선은 미용 외모에서 주름, 잔주름, 과착색, 느슨함, 건조 피부, 스케일링 및/또는 경피수분손실의 보급의 감소 또는 예방을 포함한다. 하나 이상의 이러한 매개변수는 개선될 수 있다. 바람직하게는, 잔주름 및/또는 주름이 감소된다.

미용 외모에서 노화된 피부 또는 광노출의 징후 또는 증상의 보급의 감소 또는 예방은 징후 또는 증상의 수 및/또는 중증도의 감소가 있음을 의미할 수 있다. 예를 들어, 잔주름 및 주름의 수는 감소될 수 있고 및/또는 주름 또는 잔주름의 크기, 예를 들어 깊이는 감소되거나 또는 축소될 수 있다. 또한, 감소 또는 예방은 새로운 징후 또는 증상의 외모의 속도의 중지 또는 감소를 포함할 수 있다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이, "건조 피부"는 종종 잔주름, 스케일링, 및 가려움(itching) 및/또는 화상 느낌(burning feeling)의 패턴으로 특징지워진 수분 또는 피지(sebum)가 부족한 표피를 나타낸다. 건조 피부는 피부 상태 자체로서 (예를 들어, 나이에 기인한) 발생할 수 있고 또는 햇빛-손상과 같은 피부 장애 또는 상태의 증상일 수 있다.

이런 점에서, 건조 피부, 스케일링, 잔주름 또는 경피수분손실의 감소는 상기 기재된 폴리펩티드 및 조성물의 보습 효과에 의해 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명은 포유동물의 피부를 촉촉하게 하는 화장료 또는 비-화장료 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있고, 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물은 상기 동물에 투여된다.

대안적으로, 본 발명은 포유동물의 피부를 촉촉하게 하는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물을 제공한다 (대안적으로, 화합물 또는 조성물은 그런 목적을 위해 화장료 약제를 제조하는데 사용될 수 있다.).

본 명세서에 나타낸 바와 같이, "보습"은 (결함이 있는 표피탈락(defective desquamation)을 개선시키는) 스킨 및 연화제(emollients)에 적용될 때 수분을 끌어당기고 보유하는 보습제(습윤제(humectants)) 뿐만 아니라 피부로부터 수분 손실 (예를 들어, TEWL)을 막는 보습제를 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 이러한 보습 특성은 피부의 미용 외모를 개선시키는데 유리하다. 특히 바람직한 실시예에서, 피부는 얼굴, 귀, 목, 손 또는 두피 (scalp)의 피부이다.

"주름"은 피부의 접힘, 융선(ridges) 또는 구김살(creases)이다. 피부 주름은 일반적으로 노화 과정의 결과로서 나타난다. 이런 점에서, 진피는 콜라겐을 포함하고 피부에 내구력(strength)을 주는 피부의 많은 구조적 요소, 피부에 긴장감 (turgor)을 주는 글리코사미노글리칸, 및 피부에 탄력성 또는 반동을 주는 엘라스틴 섬유를 포함한다.

피부 나이에 따라, 피부층은 점점 얇아지고, 또한 피부는 콜라겐을 덜 생성한다. 또한, 탄력성을 제공하는 엘라스틴 섬유는 닳아 없어진다. 피부의 발판 (scaffolding)의 이러한 변화는 피부에 주름 및 늘어짐을 야기시킨다. 진피-표피 접합의 망융선(rete-ridges)이 평평해지고, 피부가 더 부서지기 쉬워지며, 피부의 변형이 용이해진다. 또한, 이러한 과정은 진피와 접촉하여 표면적을 감소시키고, 피부의 정상 복구 과정을 방해하여 표피에 이용할 수 있는 영양분의 양을 감소시킨다.

피하층(subcutaneous layer)에서, 지방 세포는 나이와 함께 더 적어진다. 이것은 더 눈에 띄는 주름 및 늘어짐(느슨함)을 야기시키고, 지방 세포는 다른 층으로부터 손상을 채울 수 없다.

UVA 및 UVB 선에 노출, 즉 햇빛은 콜라겐을 연대순 노화(chronologic ageing)보다 높은 속도로 파괴를 일으킨다. 햇빛은 콜라겐 섬유를 손상시키고, 비정상적인 엘라스틴의 축적을 야기한다. 이 햇빛-유도된 엘라스틴이 축적되는 경우, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 다량으로 생성된다. 일반적으로, 메탈로프로테이나제는 콜라겐을 제조하고 개질시켜 햇빛-손상된 피부를 리모델링한다. 그러나, 이 과정은 항상 잘 작동되지 않고, 일부의 메탈로프로테이나제는 실제로 콜라겐을 파괴한다. 이것은 햇빛 흉터로서 알려진 무질서한 콜라겐 섬유의 형성을 야기한다. 이 불완전한 재건(rebuilding)/재생(regeneration)의 반복은 성장하는 주름 및 피부 느슨함을 야기한다.

그러나, 상기 언급한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 MMPs의 방출을 저해하는 것으로 나타남으로써, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 주름 및 피부 느슨함의 형성의 감소 또는 예방에 유리하다.

더 바람직한 측면에서, 미용적으로 치료 또는 예방될 피부 상태는 착색 상태, 장애 또는 비정상이다.

피부의 착색 장애 또는 비정상, 즉 과착색은 나이의 결과로서 발생할 수 있고, 또는 햇빛 손상으로 인한 조로(premature ageing)에 기인할 수 있다. 변경된 착색은 국소 과도의 멜라닌형성세포 또는 멜라닌형성세포의 증가, 또는 둘 다에 기인한다. 착색 장애는 간, 햇빛 또는 검버섯(일광성흑점(solar lentigo)) 및 주근깨와 같은 기타 잡티를 포함한다.

"흉터가 있는 피부"는 정상의 손상되지 않은 피부보다 기능적으로 그리고 미용적으로 열등하다. 상기 언급된 바와 같이, 흉터는 치유 피부에서 형성하는 콜라겐 묶음의 다른 배열로부터의 결과로 생각된다.

따라서, 본 발명의 하나의 측면은 포유동물에서 흉터 조직의 감소 또는 축소 또는 흉터의 미용 외모를 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물은 상기 동물에 투여되고, 바람직하게는 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 흉터 조직에 국소 투여된다.

대안적으로, 본 발명은 포유동물에서 흉터 조직의 감소 또는 축소 또는 흉터의 미용 외모의 개선에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 화장료 조성물을 제공하며, 바람직하게는 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 상기 동물의 흉터 조직에 투여된다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 국소 투여용이다. 또한, 화장료 조성물은 표면적으로 손상된 피부를 처리하기 위해 사용될 수 있다.

피부, 예를 들어 흉터 또는 흉터 조직을 야기하는 상처 치유에 다양한 단계가 있다 (WO 2007/059584에 기재되고, 전체 참조로 본 명세서에 포함됨). 피부에 표면적 손상, 즉 할퀸 상처 또는 찰과상에 의해 야기된 표피 및/또는 진피에 가벼운 손상의 경우, 피부 치유의 후자 단계가 가장 중요하다.

첫 번째 단계는 "염증성" 단계 (0-6일)이고, 즉시 피부 상처(cutaneous wound)와 같은 상처를 입힌다. 이것은 피브린 및 혈소판에 의해 매개된 혈관수축 (vasoconstriction) 및 응고에 의한 지혈이 출혈을 조절하기 시작하는 것으로 나타낸다. 응고는 섬유아세포 및 염증성 세포를 상처에 도입하기 위한 임시 기질 (provisional matrix)로서 및 사이토카인 및 성장인자의 저장소로서 더 작용한다.

지혈 후에, 염증성 세포는 상처에 들어가고 염증성 과정 (홍반, 열, 팽창 및 통증에 의해 나타냄)을 행한다. 이들 중 첫 번째는 혈소판 유래 성장 인자 (platelet derived growth factor, PDGF) 및 IL-8과 같은 성장인자 및 사이토카인에 의해 유인된 다형핵 세포(polymorphonuclear cells, PMNs)이다. IL-8은 PMNs에 대한 주요한 화학유인물질(chemo-attractant)이고, 이의 빠르고 일시적인 발현은 염증성 과정에 대해 중요하다. PMNs은 세포 잔해, 외부 입자 및 세균을 제거하여 상처를 소독하기 시작하고, 상대적으로 짧은 기간(1-2일) 동안 상처에 거주한다. 상처 후 약 3일경, PMNs은 상처 소독제로서 작용하는 대식세포로 변형하는 단핵세포(monocytes)로 대체된다. 섬유세포(Fibrocytes)는 염증성 과정에서 중요한 역할을 하고, 명확하게 콜라겐 및 사이토카인 생성에 관련된다.

두 번째 단계는 (피부 손상 후 3일 - 몇 주일 발생하는) "증식" 단계이다. 이동하는 섬유아세포는 영구적인 콜라겐-기반 세포외 기질(ECM)을 생성하고, 대식세포는 다양한 성장인자 및 사이토카인을 생성하고, 교대로 성장인자의 생성을 자극한다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 세린 프로테이나제는 세포 이동의 조절에서 중요한 역할을 하고, 상처 후 ECM 리모델링은 감소된 ECM 재구성 (reorganization)이 감소된 섬유아세포 MMP 생성 및 활성화와 관련된다고 설명하였다.

재-상피화(Re-epithelialization)는 피부 치유 과정에서 다음의 중요한 결과이고, 주로 각질형성세포를 이동시켜 시작한다. 재-상피화는 각질형성세포의 증식을 자극하는 성장인자 및 사이토카인을 통해 이루어지고, 육아조직(granulation tissue)을 통해 이동한다. 이러한 세포는 분화성 세포의 표현형과 관련 있는 발현 단백질이 이동하는 동안 많은 표현형 변화를 겪는 것으로 나타난다. 이동이 진행함에 따라, 각질형성세포는 세린 프로테이나제 및 MMPs를 생성하는 단백질 가수분해 표현형을 얻는다. 유사분열로 활성적인 각질형성세포가 표현형 변화를 더 겪은 경우, 완료될 때까지 각질형성세포는 상처 공간으로 이동을 계속하고, 상피의 분화 및 층화(stratification) 및 기저막의 재-형성이 발생하여 재-상피화가 완료된다.

세포의 ECM 결합, 프로테이나제에 의한 ECM 분해, 및 사이토카인 및 성장인자에 의한 이러한 과정의 전체 조절은, 세포의 인테그린-ECM 상호작용을 통한 세포 이동 및 상처 수축과 같은 세포의 기능을 조직화하는 피부 리모델링 및 치유의 다른 중요한 특징이다. 이러한 상호작용은 세포골격(cytoskeleton) 재구성 및 새로운 인테그린-ECM 상호작용을 조절하는 반면, 프로테이나제는 현재의 인테그린 상호작용을 제거하여 후면 탈-부착(rear de-adhesion) 및 세포 이동을 허용한다. 후면 탈-부착의 부재 하에 세포의 수축은 콜라겐 격자 재구성/수축에 의해 실험적으로 정량함으로써, 피부 재구성을 야기한다.

피부 치유 (및 흉터 형성)의 마지막 단계는 "성숙" 이다 (손상이 발생한 후 4일 - 몇 주 또는 몇 개월 사이에 발생함). 성숙 (또는 리모델링)은 특히 표면 피부 손상에 대해 몇일 또는 몇주의 빠른 시일이 걸리 수 있으나, 완전한 과정은 수년까지 지속할 수 있다. 이러한 상 수축 동안, 피부의 감소된 발적, 감소된 두께, 감소된 경화 및 증가된 내구력이 관찰된다. 피부 또는 흉터 조직은 근섬유아세포의 영향 하에 수축하고, 육아조직에서 콜라겐의 생성은 감소하며, 혈관은 감소한다. 그 다음, 피부 치유는 추가 재-상피화에 의해 완료된다.

따라서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 조성물은 피부 치유 과정 동안, 특히 증식 또는 성숙 단계에서 적용될 때 흉터 조직의 감소 또는 축소 또는 흉터의 미용 외모의 개선에 영향을 미칠 수 있다는 것이 상기로부터 명백해질 것이다. 따라서, 상기 기재된 생성물은 표면 피부 손상 또는 흉터의 면적에 적용될 수 있고, 흉터는 부분적으로 또는 완전히 치유된 피부로 생각될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 조성물은 성숙 단계에서 적용된다.

특히 바람직한 실시예에서, 흉터 조직은 여드름의 결과이다.

다른 바람직한 실시예에서, 흉터 조직은 임신선(stretch marks) 또는 선 (striae)이다. 바람직하게는 선은 위축선(striae atrophicae), striae vergetures, 튼살(striae distensae), 피부 열선(striae cutis distensae), 임신선(striae gravidarum), lineae atrophicae 또는 linea albicante 중 어느 하나로부터 선택된다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이, 피부의 미용 외모의 "개선(improving)"은 정상의 최적 피부, 즉 건강한, 수화된, 정상 색소 및 비-노화된 피부에 대해 상대적으로 결정된다. 따라서, 노화된 피부에 대하여, 노화의 하나 이상의 징후 또는 증상은 실시예에 기재된 바와 같이 측정될 수 있고, 바람직하게는 개선이 노화의 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소인 경우, 연대순으로 또는 생리적으로 젊은 피부의 동일한 징후와 비교될 수 있다.

흉터가 있는 또는 잡티 피부에 대하여, 흉터 조직의 감소 또는 축소 또는 흉터 또는 잡티의 미용 외모의 개선은 흉터 또는 잡티의 면적이 흉터, 발적, 피부 표시(skin marking), 또는 착색 (과(hyper)- 또는 저(hypo) 착색)의 수준 또는 정도의 감소를 나타낼 수 있고, 그렇지 않으면 피부 치유 과정과 관련될 수 있으며, 이러한 특성은 정상의 흉터 없는 피부와 비교된다는 것을 의미한다. 또한, 치유된 피부 또는 흉터의 위치 및 주변에서 피부의 인장강도는 측정될 수 있으며, 인장강도의 증가와 함께 피부의 미용 외모의 개선 또는 흉터 조직의 감소를 나타낸다.

바람직한 측면에서, 화장료 용도는 피부에 국소 투여에 의해 이루어진다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료(treating)"는 피부가 상기 상태 또는 장애를 겪지 않고 상기 처리를 받지 않은 상기 개인, 또는 상기 처리를 받지 않은 상응하는 정상 개인의 신체의 다른 부분에 존재하는 증상 또는 효과에 비해, 상기 미용 상태 또는 장애의 하나 이상의 미용 증상 또는 효과, 예를 들어 건조 피부의 존재 또는 정도, 착색의 정도 또는 면적, 또는 흉터 등을 바람직하게 정상 수준으로 감소, 경감 또는 제거하는 것을 나타낸다.

"예방(Preventing)" 또는 "감소(reducing)"는 증상 또는 효과의 개시의 정도 또는 시기(예를 들어, 지연)의 절대적인 예방, 감소 또는 경감을 나타낸다. 예를 들어, 건조, 비정상적으로 착색된, 주름진 또는 흉터 있는 피부에 의해 예시된 상태는 이러한 상태가 나타나기 전에 본 명세서에 기재된 조성물의 규칙적인 적용에 의하여 예방될 수 있다.

바람직하게는, 상기 치료는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 이용하여 이루어진다. 상기 폴리펩티드를 포함하는 화장료 조성물이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 치료 또는 예방의 화장료 방법은 보습을 이루기 위해 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 효과적인 하나 이상의 활성 성분의 투여와 바람직하게 조합될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 화장료 조성물은 하나 이상의 이러한 활성 성분을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 우리는 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 또는 포유동물 치료에서 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 본 명세서에 정의된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 및 임의로 하나 이상의 추가적 활성 성분을 함유하는 제품을 제공한다.

본 발명의 조성물은 즉시 이용할 수 있는 성분을 이용하여 기술분야에서 잘 알려진 기술에 따라, 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다.

따라서, 활성 성분은 임의로 다른 활성 물질과 함께 조합 제제로서, 하나 이상의 통상적인 담체, 희석제 및/또는 부형제와 혼합하여, 분말, 향낭(sachets), 카시에(cachets), 엘릭서(elixirs), 현탁액(주입액으로서), 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서 또는 액체 매질 내), 연고, 멸균 포장 분말 등과 같은 통상적인 생약 제제를 생성할 수 있다. 조성물은 동결-건조, 과냉각 또는 Permazyme을 이용하여 안정화될 수 있다.

적당한 부형제, 담체 또는 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 락토오스, 옥수수 전분, 알지네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물 시럽, 물, 물/에탄올, 물/글리콜, 물/폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광유 또는 경지(hard fat)와 같은 지방 물질 또는 이의 적당한 혼합물이다. 카복시폴리메틸렌, 카복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 또는 폴리비닐아세테이트와 같은 서방형 제형을 얻기 위한 물질 또한 사용될 수 있다.

조성물은 추가적으로 윤활제, 습윤제, 유화제, 점도 증가제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 삼투 활성제, 현탁제, 방부제, 감미제, 향미제, 흡착 증진제 (예를 들어, 표면 침투제, 예를 들어, 담즙염, 레시틴, 계면활성제, 지방산, 킬레이터), 갈변제, 유기 용매, 항산화제, 안정화제, 연화제(emollients), 실리콘, 알파-히드록시산, 완화제(demulcent), 소포제, 보습제, 비타민, 향수, 이온성 또는 비이온성 점증제, 충전제, 격리제, 고분자, 추진제, 알칼리화제 또는 산성화제, 유백체 (opacifier), 착색제 및 지방 화합물 등을 포함한다. 이들 성분들 중 일부는 하기에 더 상세히 기재된다.

화장료 조성물에서 다른 활성 성분 또는 구성 요소는 무기질, 비타민, 효소, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 다당류, 자외선 차단제 여과기로서 적합한 물질, 화학적 각질제거제, 추출물, 피부-컨디셔닝제, 항산화제 및 이의 혼합물 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 단백질의 예는 콜라겐 및/또는 이의 유도체 (예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 이의 일부), 세포 성장을 촉지시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드, 당단백질 1, 당단백질 2 및 라미닌을 포함한다.

본 발명의 조성물은 과일 효소(예를 들어, 브로멜라인(bromelain)), 슈퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase), 퍼옥시다제, 히알루로니다제 및 무코폴리사카리다제(mucopolysaccharidase) 중 어느 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 효소와 조합될 수 있다.

펩티드는 D,L-카르노신(carnosine), D-카르노신, L-카르노신, 안세린 (anserine) 및 마트릭실(Matrixyl) (펜타펩티드 유도체) 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

아미노산은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-시스틴, 글리신, L-글루타민, L-글루탐산, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 L-발린 및 표 1에 정의된 바와 같은 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 포함하는 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 항산화제로서 특히 바람직한 아미노산은 글리신, 리신, 아르기닌, 시스테인, 시스틴, 히스티딘, 티로신 및 트립토판 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.

화장료 조성물은 지방, 오일, 왁스 등을 포함하는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 적당한 극성 오일은 레시틴 및 지방산 트리글리세리드의 군으로부터의 것, 즉 8 내지 24, 특히 12 내지 18의 탄소 원자의 사슬 길이를 가지는 포화 및/또는 불포화, 분기 및/또는 비분기 알칸카복실산의 트리글리세롤 에스터이다. 지방산 트리글리세리드는 합성, 반합성 및 천연 오일, 예를 들어 올리브유, 해바라기유, 두유, 낙화생유(peanut oil), 유채씨유(rapeseed oil), 아몬드유, 팜유, 야자유, 피마자유, 밀 배아유(wheat germ oil), 포도씨유, 엉겅퀴유(thistle oil), 월견초유(evening primrose oil), 마카다미아 견과유(macadamia nut oil) 등의 군으로부터 유리하게 선택될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 오일은 휘발성 오일, 비-휘발성 오일 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 비-휘발성 오일은 하기의 정의 중 적어도 하나를 충족시키는 오일을 포함한다: (a) 오일은 25℃ 및 1 기압에서 0.2mm Hg 이내의 증기압을 나타낸다; (b) 오일은 적어도 300℃의 1 기압에서 끓는점을 가진다. 휘발성 오일은 상기 정의된 바와 같은 "비-휘발성"이 아닌 물질을 포함한다.

비-휘발성 오일은 비-휘발성 실리콘 오일, 비-휘발성 탄화수소 오일 및 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 적당한 비-휘발성 실리콘 오일은 선형 폴리메틸실록산을 포함하고, 바람직하게는, 비-휘발성 실리콘 오일은 고분자량 디메치콘 (dimethicones)이다. 시판되는 선형 폴리메틸실록산의 예는 DC 200 Fluid 20Cst, DC 200 Fluid 100Cst, DC 200 Fluid 350Cst (Dow Corning Corporation)를 포함한다.

적당한 비-휘발성 탄화수소 오일은 디글리세린 또는 트리글리세린의 분기 에스터 또는 에스터 또는 1,2,3,4-부탄 트리올 또는 에리트리톨, 디에리트리톨 또는 트리에리트리톨을 포함한다. 바람직하게는, 비-휘발성 탄화수소 오일은 에리트리틸 트리에틸헥산오에이트(Salacos E-38 (Nisshin Oilio)) 및 폴리글리세릴-2-트리이소스테아레이트(triisostearate) (Cosmol 43V (Nisshin Oilio)), 디에틸 헥실 카보네이트 (Tegosoft DEC (Degussa)), 디카프릴 에테르 (Cetiol OE (Cognis AG)), 디카프릴 카보네이트 (Cetiol CC (Cognis AG)), 이소노닐 이소노나노에이트(isononyl isononanoate) (Lanol 99 (Seppic)), 트리데실 네오펜타노에이트(tridecyl Neopentanoate) (Ceraphyl 55 (International Speciality Products)), 또는 이의 혼합물을 포함한다.

휘발성 오일은 기능화된 및 비-기능화된 둘 다의, 휘발성 실리콘 오일, 휘발성 탄화수소 오일 및 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서 유용한 휘발성 오일은 포화 또는 불포화일 수 있으며, 직쇄 또는 분기쇄 또는 고리형 구조를 가지거나 또는 상기 특징들 중 어느 하나 이상의 조합을 가진다.

휘발성 탄화수소 오일의 예는 이소도데칸 및 이소데칸과 같은 폴리데칸 (예를 들어, Permethyl-99A (Presperse Inc.)) 및 C7-C15 이소파라핀 (예를 들어, Isopar Series (Exxon Chemicals))을 포함한다.

휘발성 실리콘 오일은 시클로펜타실록산, 시클로헥사실록산 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 시판되는 휘발성 고리형 실리콘 오일의 예는 DC 244, DC 245, DC 344, 및 DC 345 (Dow Corning Corp.); SF-1204 및 SF-1202 Silicone Fluids (Momentive Performance Materials); GE 7207 및 7158 (General Electric Co.); 및, SWS-03314 (SWS Silicones Corp.)를 포함한다.

선형 휘발성 실리콘 오일은 선형 폴리메틸실록산일 수 있다. 시판되는 선형 폴리메틸실록산의 예는 DC 200 Fluid, 5Cst (Dow Corning Corp.)를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 음이온성 다당류 (예를 들어, 알긴산, 펙틴, 잔탄 검, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 아라비아 검, 카라야 검, 트라가칸트 검, 카복시메틸-키틴, 셀룰로오스 검, 글리코사미노글리칸), 양이온성 다당류 (예를 들어, 키토산, 아세틸화된 키토산, 양이온성 구아 검, 양이온성 히드록시에틸셀룰로오스 (HEC)), 비이온성 다당류 (예를 들어, 전분, 덱스트린, 구아 검, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 에테르), 양쪽성(amphoteric) 다당류 (예를 들어, 카복시메틸키토산, N-히드록시-디카복시에틸-키토산, 변형된 감자 전분) 및 소수성 다당류 (예를 들어, 세틸 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리쿼터늄24(polyquaternium24)) 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다당류를 더 포함할 수 있다.

화장료 조성물은 유기 자외선 차단제, 예를 들어 신나믹 유도체(cinnamic derivative)와 같은 자외선 차단제 여과기로서 적합한 물질을 더 포함할 수 있다. 활성적인 유기 자외선 차단제는 친수성 유기 자외선 차단제, 소수성 유기 자외선 차단제, 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 자외선 차단제의 적당한 예는 CTFA 국제화장품원료집(International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook), 7th edition volume 2, pp.1672, edited by Wenning and Mc Ewen (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. 1997)에서 확인될 수 있다.

유기 자외선 차단제는 알킬 β,β-디페닐아크릴레이트 유도체, α-시아노-β,β-디페닐아크릴레이트 유도체, 안트라닐레이트 유도체, 벤조페논 유도체, 캠포 유도체, 디벤조일메탄 유도체, p-아미노벤조익 유도체, 살리실릭 유도체, 트리아진 유도체, 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 소수성 유기 자외선 차단제는 4-(1,1-디메틸에틸)-4'-메톡시디벤조일메탄; 4-이소프로필디벤조일메탄; 2-에틸헥실-2-시아노-3,3-디페닐아크릴레이트, 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

부틸 메톡시디벤조일메탄 또는 아보벤존(Avobenzone)으로도 알려진, 시판되는 4-(1,1-디메틸에틸)-4'-메톡시디벤조일메탄의 예는 Parsol TM 1789 (Givaudan Roure S. A.) 및 Eusolex TM 9020 (Merck & Co., Inc.)을 포함한다. 이소프로필디벤조일메탄으로도 알려진, 시판되는 4-이소프로필디벤조일메탄의 예는 Eusolex TM 8020 (Merck & Co., Inc.)을 포함한다. 옥토크릴렌(Octocrylene)으로도 알려진, 시판되는 2-에틸헥실-2-시아노-3,3-디페닐아크릴레이트의 예는 Uvinul N539 SG (BASF); 및 Eusolex OCR (Rona/Merck)을 포함한다.

어떤 실시예에서, 친수성 유기 자외선 차단제는 2-페닐벤즈이미다졸-5-설폰산일 수 있다. PBSA로도 알려진, 시판되는 2-페닐벤즈이미다졸-5-설폰산의 예는 Eusolex 232 (Rona/Merck)를 포함한다.

신나믹 유도체 자외선 차단제의 적당한 예는 CTFA 국제화장품원료집, 7th edition volume 2, pp.1672, edited by Wenning and Mc Ewen (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. 1997)에서 확인될 수 있다. 신나믹 유도체는 2-에틸헥실-p-메톡시신나메이트, 디에탄올아민 메톡시신나메이트, 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트, 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 신나믹 유도체는 2-에틸헥실-p-메톡시신나메이트일 수 있다.

화장료 조성물은 살리실산, 글리콜산, 시트르산 및 말산과 같은 알파 히드록시산 (AHAs), 베타 히드록시산 (BHAs) 또는 폴리-히드록시산 중 어느 하나 이상으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는 화학적 각질제거제와 조합될 수 있다.

화장료 조성물에 포함될 수 있는 추출물은 식물 추출물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 플라보노이드 (예를 들어, 글리코실 루틴(glycosyl rutin), 페룰린산 (ferulic acid), 카페인산(caffeic acid)), 푸르푸릴인덴 글루시톨 (furfurylidene glucitol), 부틸레이티드 히드록시톨루엔, 부틸레이티드 히드록시아니솔, 노르디히드로구아이아레틱 수지 산(nordihydroguaiaretic resin acid), 노르디-히드로구아이아레틱산(nordi-hydroguaiaretic acid), 트리히드록시부티로페논 (trihydroxybutyrophenone) 및 이의 유도체와 같은 페놀성 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 특정 식물 추출물은 알로에 베라 추출물, 인삼 추출물 및 쇠뜨기 추출물(horsetail extract)을 포함한다.

인삼 추출물은 파낙스 진생(Panax ginseng)의 뿌리를 친수성 용매 (특히, 물, 에탄올, 글리콜, 또는 이의 임의의 혼합물)로 추출하여 얻어질 수 있다. 추출물은 사포닌, 스테롤, 탄수화물, 펙틴, 비타민, 무기질 및 지질을 함유한다.

쇠뜨기 추출물은 쇠뜨기(Equisetum arvense)의 전체 허브를 친수성 용매 (특히, 물, 에탄올, 글리콜, 또는 이의 임의의 혼합물)로 추출하여 얻어질 수 있다. 추출물은 실리케이트, 플라비노이드, 사포노시드, 카페인산 및 페룰린산을 함유한다.

화장료 조성물은 피부-컨디셔닝제를 더 포함할 수 있다. 피부-컨디셔닝제는 습윤제, 각질제거제, 연화제 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 습윤제는 다가 알콜(polyhydric alcohols), 예를 들어 글리세린, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨, 히드록시프로필 소르비톨, 헥실렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 1,2,6-헥산트리올, 에톡시레이티드 글리세린, 프로폭시레이티드 글리세린 또는 이의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 항산화제의 예는 아미노산, 비타민, 무기질, 카로테노이드, 펩티드, 티올, 설폭시민 화합물(sulfoximine compounds), 킬레이터, 불포화 지방산, 페놀성 화합물, 식물 추출물, 스틸벤, 요산, 만노오스, 클로로겐산(chlorogenic acid), 이미다졸 (예를 들어, 우로카닌산(urocanic acid)), 푸르푸릴인덴소르비톨(furfurylidenesorbitol), 유비퀴논, 유비퀴놀, 플라스토퀴논 (plastoquinone), 피토스테롤(phytosterols) 및 이의 유도체 (예를 들어, 염, 에스터, 에테르, 당류(sugars), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 펩티드 및/또는 지질 유도체)를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 중 일부는 상기에 기재되어 있다.

비타민은 비타민 A 및 이의 유도체 (예를 들어, 레티노이드 또는 레티놀 또는 레티닐 팔미테이트 또는 레티닐 프로피오네이트와 같은 이의 유도체), 비오틴, 엽산, 칼슘 판토테네이트, 니코틴아미드, 피리독신 HCl, 피리독살 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 티미딘, 비타민 B12, 비타민 B3 (예를 들어, 니아신아미드), 비타민 B5 (예를 들어, 판테놀), 비타민 C 및 이의 유도체 (예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, Mg 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 아세테이트), 토코페롤 및 이의 유도체 (예를 들어, 비타민 E 아세테이트) 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

무기질은 몰리브데네이트 (예를 들어, (NH₄)OMo₇O₂₄), 알루미늄 (예를 들어, AlCl₃), 칼슘 (예를 들어, CaCl₂), 코발트 (예를 들어, CoCl₂), 크롬 (예를 들어, CrK(SO₄)), 구리 (예를 들어, CuSO₄), 철 (예를 들어, Fe(NO₃)₃, FeSO₄), 칼륨 (예를 들어, KCl), 마그네슘 (예를 들어, MgCl₂), 망간 (예를 들어, MnCl₂, MnSO₄), 포스페이트 (예를 들어, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄), 카보네이트 (예를 들어, NaHCO₃), 실리케이트 (예를 들어, Na₂SiO₃), 나트륨 (예를 들어, NaCl), 바나데이트 (예를 들어, NH₄VO₃), 니켈 (예를 들어, NiCl₂), 주석 (예를 들어, SnCl₂), 아연 (예를 들어, ZnO, ZnSO₄), 셀레늄 (예를 들어, 셀레노메티오닌, 엡셀렌(ebselen), H₂SeO₃, Na₂SeO₃), 설페이트(sulphate) 및 니트레이트 중 어느 하나 이상의 염으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

카로테노이드는 카로텐, 예를 들어 α-카로텐, β-카로텐, ψ-리코펜, 피토엔(phytoene) 등 및 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

티올은 아우로티오글루코오스(aurothioglucose), 프로필티오우라실, 티오레독신, 리포산(lipoic acid), 글루타티온, 시스테인, 시스틴, 시스타민 및 이의 글리코실, N-아세틸, 메틸, 에틸, 프로필, 아밀, 부틸 및 라우릴, 팔미토일, 올레일, γ-리놀레일, 콜레스테릴 및 글리세릴 에스터 및 이의 염, 디라우릴 티오디프로피오네이트, 디스테아릴 티오디프로피오네이트, 티오디프로피온산 및 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

설폭시민 화합물은 호모시스테인 설폭시민, 부티오닌 설폰, 펜타-, 헥사-, 헵타티오닌 설폭시민 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 이들이 매우 낮은 용량 (예를 들어, pmol 내지 μmol/kg)으로 제공되도록 조성물에 함유될 수 있다.

킬레이터는 아포페리틴, 데스페랄(desferral), 락토페린, α-히드록시 지방산, 팔미트산, 피트산(phytic acid), α-히드록시산 (예를 들어, 시트르산, 락트산, 말산), 휴믹산(humic acid), 담즙산, 담즙 추출물, 빌리루빈, 빌리베르딘 (biliverdin), EDTA, EGTA 및 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

불포화 지방산은 γ-리놀렌산(linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid) 및 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

스틸벤 및 이의 유도체는 스틸벤 옥사이드 및 트랜스-스틸벤 옥사이드를 포함한다.

다양한 추가적 임의의 활성 성분은 본 발명의 화장료 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 추가 성분의 비-제한적인 예는 파네솔(farnesol), 비스아볼롤 (bisabolol), 피탄트리올(phytantriol), 요소(urea), 구아니딘 (예를 들어, 아미노 구아니딘)과 같은 추가 스킨 케어 활성제; 헥사미니딘 화합물, 이의 염 또는 유도체; 당 아민(sugar amines); 셀프-태닝제 (예를 들어, 데히드록시아세톤); 구성제 (structuring agents); 친수성 겔화제; 항-여드름 약제 (레조시놀, 살리실산 등); 알란토인(allantoin) 등과 같은 피부 진정 및 치유제(skin soothing and healing agents); 및 정유(essential oils), 향수, 스킨 센세이트(skin sensates), 유백체 (opacifiers), 방향족 화합물 (예를 들어, 정향유(clove oil), 멘톨, 캠포, 유칼립투스유(eucalyptus oil), 및 유게놀)와 같은 심미적 목적에 적합한 물질을 포함한다.

본 명세서에 기재된 조성물은 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 신체에 투여한 후 활성 성분의 빠른, 지속 또는 지연 방출을 제공하기 위해 제형화될 수 있다.

조성물은 활성 성분이 흡수, 흡착, 혼입 또는 결합될 수 있게, 에멀젼으로 또는 리포좀, 니오좀, 미립구(microspheres), 나노입자 등으로, 특정 세포 또는 조직에 전달 또는 표적을 허용하는 임의의 적당한 제형일 수 있다. 이것은 생성물을 불용성 형태로 효과적으로 전환시킬 수 있다. 이러한 미립자 형태는 안정성 (예를 들어, 분해) 및 전달 문제 모두를 극복할 수 있다.

용액, 현탁액, 젤 및 에멀젼의 사용이 바람직하고, 예를 들어 활성 성분이 물, 기체, 물-기반 액체, 오일, 젤, 에멀젼, 수중유(oil-in water) 또는 유중수 (water-in-oil) 에멀젼, 분산액 또는 이의 혼합물로 전달될 수 있다.

유화제는 비이온성 유화제, 음이온성 유화제, 양이온성 유화제, 쯔비터이온성 유화제, 양쪽성 유화제 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 유화제는 기술분야에 알려져 있다. 참조, Allured Publishing Corporation에 의해 발행된 McCutcheon's, Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1986).

미용적으로 허용가능한 담체가 실리콘중수(water-in-silicone) 에멀젼인 경우, 유화제는 폴리옥시알킬렌 공중합체, 폴리글리세릴 공중합체 또는 이의 혼합물로부터 선택되는 것이 바람직하다. 실리콘 폴리에테르로도 알려진, 폴리옥시알킬렌 공중합체는 US 4,268,499에 상세히 기재된다. 시판되는 폴리옥시알킬렌 공중합체의 예는 DC5225C 또는 DC2-5185C (시클로펜타실록산과 함께 혼합물로서 이용가능한 PEG/PPG-18/18 디메치콘) (Dow Corning Corp.); 및 KF6017 또는 KF6028 (PEG-9 디메치콘) (Shin-Etsu Inc.)을 포함한다. 시판되는 폴리글리세릴 유화제의 예는 KF6100 및 KF6104 (Shin-Etsu Inc.)를 포함한다.

조성물은 바람직하게는 국소(즉, 피부에) 투여 용이다.

국소 조성물은 젤, 크림, 연고, 스프레이, 로션, 고약(salves), 스틱 (sticks), 비누, 분말, 필름, 에어로졸, 드롭스(drops), 발포체(foams), 용액, 에멀젼, 현탁액, 분산액 예를 들어 비-이온성 소포 분산액(vesicle dispersions), 우유 및 기술분야에서 임의의 기타 통상적인 화장료 형태를 포함한다.

연고, 겔 및 크림은 적당한 점증제 및/또는 겔화제를 첨가하여 수성 또는 오일 기제와 함께 제형화될 수 있다. 로션은 수성 또는 오일 기제와 함께 제형화될 수 있으며, 일반적으로 하나 이상의 유화제, 분산제, 현탁제, 점증제 또는 착색제를 함유할 것이다. 분말은 임의의 적당한 분말 기제의 도움으로 형성될 수 있다. 드롭스 및 용액은 수성 또는 비-수성 기제와 함께 제형화될 수 있으며, 하나 이상의 분산제, 가용화제 또는 현탁제를 포함한다. 에어로졸 스프레이는 적당한 추진제를 사용하여 가압된 팩으로부터 알맞게 전달된다.

어떤 실시예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 및 화장료 조성물은 폴리펩티드 또는 조성물이 적용, 주입 또는 화학 결합된 제품, 장치 또는 물질을 통해 피부에 국소 투여될 수 있다. 이를 위하여, 붕대, 반창고(plasters) (예를 들어, 접착성 패치), 거즈, 수술용 테이프(surgical tape), 면봉 또는 기타 흡수 물질, 예를 들어 퍼프(puff), 양털(fleece), 또는 스펀지, 또는 지지 기질(supportive matrices)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물과 함께 코팅, 주입 또는 화학 결합될 수 있다. 예를 들어, 많은 조성물은 기술분야, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 US 2008/0038300, US 2009/0043236, WO 2005/067499 및 WO 2009/085302에 잘 기재된 피부 패치를 이용하여 피부에 적용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물을 포함하는 물질은 처리될 피험자에 의해 착용될 수 있는 장치의 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물은 기저귀, 장갑, 양말 등의 전부 또는 일부를 형성하는 물질 또는 지지 기질에 적용, 주입 또는 화학 결합될 수 있다.

화장료 조성물은 투여를 위해 사용설명서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가 측면은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물과 함께 코팅, 주입 또는 화학 결합된 제품, 물질 또는 장치의 제공을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용을 위해 이러한 제품, 물질 또는 장치로 확장한다. 바람직하게는, 상기 제품은 붕대, 반창고 (예를 들어, 접착성 패치), 거즈, 수술용 테이프 또는 면봉이고, 또는 상기 장치는 기저귀, 장갑 또는 양말이다.

본 발명의 조성물에서 활성 성분의 농도는 조성물의 공급원 (즉, 상기 기재된 방법의 출발물질), 투여 방식, 처리 과정, 환자의 나이 및 체중, 화장품 표시, 처리될 신체 또는 신체 면적에 의존할 수 있고, 선택에 따라 변하거나 또는 조정될 수 있다. 그러나, 일반적으로 본 명세서에 기재된 화합물의 농도 범위는 0.0001, 0.0005, 0.001 또는 0.01 내지 50%, 예를 들어 0.0005-40%, 예를 들어 0.01 내지 25%, 예를 들어 0.1 또는 0.5 내지 5%, 예를 들어 1-5% (투여, 특히 국소 투여용 최종 제제의 w/w 또는 v/v), 예를 들어 본 발명의 방법에 따라 제조된 상기한 조성물의 1% 용액이다.

하나 이상의 화합물이 존재하는 경우, 각 화합물, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 보습제는 상기 기재된 양으로 존재할 수 있다. 상기 농도는 화합물 자체의 양에 관련하여 측정됨으로써, 적당한 허용량은 조성물의 순도를 고려하여 제조되어야 한다. 처리되는 포유동물에 따라 단회 용량으로 취하여 국소 적용되는 경우, 폴리펩티드에 대한 효과적인 단회 용량은 0.001-100 mg/cm²/day, 예를 들어 0.1-100mg/cm²/day, 바람직하게는 0.001-10 mg/cm²/day, 예를 들어 0.1-10 mg/cm²/day 범위 내일 수 있다.

바람직하게는, 액체 용액, 크림 또는 현탁액은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 조성물의 국소 투여를 위해 사용될 것이다.

조성물이 적용되거나 또는 투여될 수 있는 동물은 포유동물에 한정된다. 바람직하게는, 포유동물은 영장류, 애완동물, 가축 및 실험동물이다. 따라서, 바람직한 포유동물은 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 고양이, 개, 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양 및 말을 포함한다. 특히 바람직하게는, 조성물은 인간에 적용, 또는 투여된다.

하기 실시예는 단지 예증으로서 제공되고, 언급된 도면은 하기와 같다:
도 1은 처리 전 (기준), 처리의 2주 후 및 12주 후에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 처리된 피험자의 사진을 나타낸다. 노화된 피부의 다양한 징후의 감소는 2 및 12주 후 모두 명백하다. 제공된 값은 35명의 참가자에 대한 평균 변화를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 처리하고 2 및 12주 후에 보인 잔주름 및 주름의 감소를 강조하기 위해 도 1의 피험자의 근접 촬영 사진을 나타낸다.
도 3은 처리 전 (기준) 및 처리의 12주 후에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 처리된 피험자의 근접 촬영 사진을 나타낸다. 원형 지역은 처리의 12주 후에 명백한 주름의 감소를 나타낸다.
도 4는 얼굴의 양쪽 면에 촉각/시각 임상 증상의 등급(tactile/visual clinical grading)을 기준으로 노화의 다양한 징후가 개선된 것으로 간주된 피험자의 %를 묘사하는 막대 도표를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 하루에 2번 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 상태와 비교하여 4명의 피험자를 기준으로 약 23%의 피부 수분량(skin hydration)의 평균 증가를 묘사하는 막대 도표를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 하루에 2번 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 상태와 비교하여 4명의 피험자를 기준으로 약 14.5%의 경피수분손실(개선된 피부 장벽 기능)의 평균 감소를 묘사하는 막대 도표를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 하루에 2번 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 상태와 비교하여 4명의 피험자를 기준으로 약 23%의 눈 주름 용량의 평균 감소를 묘사하는 막대 도표를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 하루에 2번 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 상태와 비교하여 4명의 피험자를 기준으로 약 10%의 멜라닌 함량의 평균 감소를 묘사하는 막대 도표를 나타낸다.

실시예 1: 류코렉틴의 분리 및 류코렉틴을 포함하는 제제

류코렉틴 단백질 (하기에 설명) 및 이의 제공 방법은 WO 2010/049688에 상세히 기재되었고, 이는 전체 참조로 본 명세서에 포함된다. 그러나, 완성도를 위해, 류코렉틴을 포함하는 조성물의 바람직한 제조방법을 하기에 기재하고, 상기 기재된 방법을 예시한다.

본 발명의 폴리펩티드를 분리하기 위해 출발물질로서 사용될 수 있는 부분적으로 정제된 조나제(zonase)는, 참조로 본 명세서에 포함된 WO99/29836에서 제공된다 (특히 실시예 1의 기재된 방법, 그러나 임의로 요소 단계가 없음).

류코렉틴은 연어 부화액으로부터 정제되었다. 부화액의 단백질 농도를 개선하기 위해, 연어 알류를 부화 전에 최소량의 물에 옮겼다. 크게 동시에 일어나는 부화는 증가된 온도(실온)에 의해 또는 탈산소화에 의해 유발될 수 있고 (Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), 조 류코렉틴 및 관련 단백질의 매우 농축된 제제의 소량을 생성한다. 부화는 95% 이상의 배아에 대해 2시간 이내에 완료되어야 한다.

부화액을 7 ㎛ 공극 크기를 가진 표준 여과기를 이용하여 여과하여, 이후 여과 단계에서 여과기를 막을 것 같은 물질을 제거하였다. 공정처리된 부화액인 이 여과액은, 추가 단백질 정제를 위해 해동 및 사용하기 전에 상당한 분해 없이 수년간 냉동될 수 있다. 이러한 사실은 연어 류코렉틴을 정제하기 위한 출발물질의 제조를 매우 간단하게 한다.

공정처리된 부화액은 0.45 ㎛ 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 여과하고, 여과액을 모았다. 그 다음 여과액을 8kDa의 배제 크기 여과기로 희석여과하여 부화액의 물을 완충액으로 교환하였다. 이 경우, 비록 다른 완충액이 동등하게 적합할지라도, 완충액은 0.5mM 인산염 및 1mM NaCl을 함유하였다. 예를 들어, 5 mM NaCl을 함유하는 중성 또는 약간 알칼리성 (pH 7.5 - 8.5) 근처의 pH에서 밀리몰 (millimolar) Tris (예를 들어, 10 mM)를 함유하는 인산염 완충 식염수 또는 완충액이 적합하다.

희석여과액은 100 kDa의 크기 배제를 가진 한외 여과기를 이용하여 한외여과하고, 류코렉틴을 포함하는 여과액을 모았다. 마지막으로, 여과액을 0.22 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 통해 여과하고, 최종 여과액을 모았다. 이 여과액은 류코렉틴이 풍부한 제제이다.

실시예 2: 섬유아세포에 대한 류코렉틴의 In vitro 활성

물질 및 방법

실시예 1의 방법에 따라 제조된 조성물을 노화 세포 (인간 피부 섬유아세포, 헤이플릭(Hayflick) 노화 모델의 복제, Hayflick, L., and Moorhead, P. S. (1961). "The serial cultivation of human diploid cell strains." Exp Cell Res 25:585-621)에 적용하였다. 이런 점에서, 노화 섬유아세포는 젊은 섬유아세포와 비교하여 MMPs의 증가된 양을 방출하고, 상기 논의된 바와 같이, MMP 활성은 노화 및 흉터의 징후 및 증상 모두와 관련 있다. 특히, 간질 콜라게나제(interstitial collagenase) 또는 섬유아세포 콜라게나제로 알려진 MMP-1은, 이것이 간질 콜라겐 유형 I, II 및 III를 절단하기 때문에 세포외 기질의 파괴와 관련 있다.

류코렉틴 조성물의 세 개의 다른 농도 (0.015%, 0.050% 및 0.150% [v/v])를 노화 섬유아세포에 적용하였다. 조성물은 류코렉틴이 풍부한 제제이고, v/v는 단위 용량 당 풍부한 제제의 총량(비-류코렉틴 성분 포함)을 나타낸다. MMP-1의 농도는 ELISA에 의해 측정되었다. 두 개의 대조 실험을 동시에 수행하였다. 첫 번째 대조는 청소년의 포피(juvenile foreskin) 또는 얼굴과 유사한 다른 위치의 어른 피부의 진피로부터 분리된 정상 인간 피부 섬유아세포(Normal Human Dermal Fibroblasts, NHDF)의 사용을 포함하였고, 따라서 MMP-1 (P7-NHDF)의 정상 "비-노화" 수준을 설명한다. 두 번째 대조는 류코렉틴 대신 TGF-β (10ng/ml)와 접촉시킨 노화 세포를 포함한다. TGF-β(Transforming growth factor β)는 세포 증식 및 분화, 조직 리모델링 및 복구를 조절하는 다기능성 사이토카인이다. 이것은 MMP-1의 방출을 저해하는 것으로 알려져 있다. 결과는 표 2에 나타내었으며, 이로부터 0.050% 및 0.150%의 농도에서 류코렉틴 조성물이 노화 섬유아세포로부터 MMP-1의 방출을 거의 완전히 저해하여, 수준이 청소년의 섬유아세포의 수준보다 아래임을 볼 수 있다. 이러한 결과는 류코렉틴이 피부, 특히 MMPs의 증가된 수준 및/또는 비정상적 MMP 활성을 나타내는 노화된 및 흉터가 있는 피부의 미용 외모를 개선시키는데 유용할 것으로 기대할 수 있다는 것을 나타낸다. 사실, 류코렉틴을 포함하는 조성물의 효과를 나타내는 하기의 결과는 노화된 피부에서 이러한 조성물의 효과를 확인하였다.

표의 핵심은 하기와 같다:

⁽¹⁾ : 통계적 유의성에 대한 기준점

ns: > 0.05, 유의하지 않음

* : 0.01 내지 0.05, 유의함

** : 0.001 내지 0.01, 매우 유의함

*** : < 0.001, 극히 유의함

< or > : 검출 한계보다 열등 또는 우수

[표 2]

실시예 3: 노화된 피부에 대한 류코렉틴의 In vivo 효과

류코렉틴을 포함하는 조성물은 실시예 1에 기재된 대로 제조되었으나, 100 kDa 배제 크기를 가진 여과기를 통한 한외 여과 단계의 끝에서 두 번째 단계를 생략하였다. 조성물은 1% 및 3% 스킨 로션 [v/v] (로션의 단위 용량 당 조성물의 총 용량)으로 제조되었으며, 시험에서 2개의 활성 스킨 로션은 활성 성분, 즉 부화액 조성물을 포함하지 않은 대조 스킨 로션과 비교하였다. 스킨 로션은 수중유 (O/W) 에멀젼이었다. 오일 상은 총 조성물의 9%를 나타내었고, 수소화된(hydrogenated) 레시틴으로 유화시켰다.

이중 맹검, 위약 대조 임상 시험을 수행하여 경중(mild to moderate) 광손상된, 즉 노화된 얼굴 피부를 가진 여성의 국소 피부 처리의 유효성 및 내성을 평가하였다. 이 시험의 기간은 기준, 2주, 6주 및 12주에 방문과 함께 12주 이었다. 시각 등급, 기기의 사용, 디지털 VISIA CR 사진 및 피험자 자체-평가 설문지를 이용하여 효능을 평가하였다.

피험자의 수

101명의 여성 피험자가 연구에 참가 완료하였다 (세 개의 처리, 즉 하나의 위약 및 활성 성분, 즉 다른 농도의 류코렉틴을 포함하는 두 개의 조성물에 대해 N>30).

피험자 집단 및 확인

피험자는 40 내지 65세의 건강한 여성이었고, 임상 연구 숫자와 함께 사용되는 경우, 연구에서 모든 피험자를 독특하게 식별하는 3자리 숫자를 할당하였다. 이 숫자는 연구하는 동안 피험자와 함께 있어 익명의 실험을 유지하였다.

적법성 기준( Eligibility Criteria )

포함 기준( Inclusion Criteria )

1. 건강 및 적법성 설문지에 의해 결정된 바와 같이 일반적으로 건강이 양호한 40 내지 65세의 여성.

2. 연구 기간 동안 연구 요구사항에 따라 협력하고 동참하며 임의의 반대 증상을 즉시 보고하려는 의지.

3. 3-7점의 변형된 그리피스의 채점 등급(Griffith's grading scale)에 상응하는 얼굴에서 임상적으로 측정된 경중 광손상 (잔주름, 주름, 과착색, 느슨함 및 거칠기).

4. 연구에 참가한 피험자에게 시험 부위의 평가를 손상시키거나 또는 건강 위험을 증가시킬 수 있는 임의의 질병 상태 또는 신체적 얼굴 피부 상태 (예를 들어, 아토피성 피부염, 습진, 건선, 지루성 피부염)가 없음.

5. 연구 기간 동안 장기간의 햇빛 노출 및 태닝 베드(tanning beds)의 모든 사용을 피하려는 의지. 선글라스를 포함하여 보호 의복을 입고, 10 AM에서 4 PM까지 햇빛 노출을 피하기 위해 특별한 관리를 해야한다.

6. 연구 기간 동안 모든 일반 브랜드의 색조 화장품, 클렌저, 토너 (해당되는 경우) 및 화장 지우개(makeup remover)의 사용을 지속하려는 의지. 개인은 할당된 시험 물질 이외의 임의의 항-노화 제품 또는 피부 미백용 제품의 이용을 삼가해야 한다.

7. 각 예정된 병원 방문 전 적어도 20분에 모든 화장을 지우려는 의지. 연구 방문이 완료될 때까지 얼굴 또는 눈 주위에 다른 국소 제품을 적용하지 않았다. 만일 피험자가 모든 화장을 지우지 않은 채로 도착하였으면, 그녀는 병원에서 잔여 화장을 지우는 것이 필요하고 과정 전 적어도 20분을 기다려야 한다.

8. 호르몬 대체 요법 또는 피임을 위한 호르몬을 받은 개인은 연구 시작 전에 적어도 한달 동안 안정적인 처방 계획을 해야 하고, 이들은 연구 기간 동안 이 약물 처리를 계속하고 변하지 않아야 한다. 연구 시작 시 HRT 또는 호르몬을 받지 않은 개인은 연구 과정 동안 흔쾌히 사용을 시작하지 않아야 한다.

9. 연구 요구사항에 따라 협력하고 동참하며 임의의 반대 증상을 즉시 보고하려는 의지.

배제 기준( Exclusion Criteria )

1. 임의의 개인관리용품(personal care product)에 대해 내성 또는 알러지의 병력을 가진 개인.

2. 연구 참가 전 30일 미만에 임의의 처방 또는 OTC 피부 미백 제품을 사용한 개인.

3. 참가 동안 시험 조사자가 부적절하다고 생각하는 피부의 상태 및/또는 질병을 가진 개인.

4. 연구 동안 수유(nursing), 임신, 또는 임신하려는 계획이 있는 개인.

5. 연구 참가 전 30일 미만에, 임의의 항-노화, 항-주름, 국소 항산화제를 일상적으로 사용한 개인.

6. 연구 시작 6개월 이내에 효소적 얼굴 피부 처리를 이용한 개인.

7. 연구 시작 3개월 이내에 Retin-A®, Retin-A Micro®, Renova®, Avita®, Tazorac®, Avage® 또는 Differin® 또는 기타 국소 레티노이드의 사용, 또는 과거 6개월 이내에 어큐테인(Accutane) 또는 구강 레티노이드를 받음.

8. 연구 시작 30일 이내에 얼굴에 알파-, 베타- 또는 폴리-히드록시산 (살리실산 및 락히드린(Lachydrin) 포함), 레티놀 또는 레티놀의 유도체를 함유하는 제품 또는 기타 '항-노화' 제품의 일상적인 사용.

9. 처리의 3개월 이내 또는 연구 동안 얼굴 피부찰상법(facial dermabrasion) 또는 화학적 박피(chemical peel) 처리를 받은 개인.

10. 처리의 6개월 이내 또는 연구 동안 처리된 면적 이내의 처리된 부분에서 가벼운 RF, 또는 기타 장치와 함께 처리 받은 개인.

11. 처리의 9개월 이내 또는 연구 동안 처리된 면적에 보톡스, 콜라겐, 지방 주사 또는 주사되거나 주입된 물질과 함께 기타 증대 방법을 받은 개인.

12. 이 시험의 시작 전 12개월 이내에 표면치환술(resurfacing) 과정, 주름 제거 수술(face lift) 또는 눈 또는 눈꺼플 수술(eye or eyelid surgery)을 받은 개인.

13. 조사자의 관점에서 연구의 결과를 방해하는 얼굴에 이미 존재하는 및/또는 휴면기의 피부 상태 (예를 들어, 백반(vitiligo), 아토피성 피부염, 건선, 적면증(rosacea), 습진, 지루성 피부염, 심각한 찰과상(severe excoriations) 등) 또는 의학적 질환/질병을 가진 개인.

14. 면역 억제/면역 결핍 장애 ((HIV 감염 또는 AIDS 포함)의 병력을 가진 또는 현재 면역억제약물을 이용한 개인.

15. 임의의 다른 임상 이용 연구 (패치 연구가 허용가능함)에 참가한 개인.

16. 당뇨병, 고혈압, 갑상선 기능 항진증(hyperthyroidism) 또는 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism)과 같은 조절되지 않는 질병을 가진 개인. 다양한 건강 상태를 가진 일부 개인은 비록 상태가 식이요법, 약물요법 등에 의해 조절될지라도 참가로부터 배제되었다.

17. 연구에 포함되기 전 28일 이내에 임의의 임상 시험에 참가한 개인.

개인들은 병력 및 연구-전 면접 및 시험의 결과를 기준으로 조사자 또는 그의 임명자의 재량으로 연구에 허가받았다.

연구설계(Study Design)

이중 맹검, 위약 대조 임상 시험을 수행하여 경중 광손상된, 즉 노화된 얼굴 피부를 가진 여성의 국소 피부 처리의 유효성을 평가하였다. 이 시험의 기간은 기준, 2주, 6주 및 12주에 예정된 방문과 함께 12주 이었다. 시각 등급, 기기의 사용, 디지털 VISIA CR 사진 및 피험자 자체-평가 설문지를 이용하여 효능을 평가하였다.

군 당 N>30의 3개 군이 연구를 완료하였다. 피험자는 활성적인 피부 처리, 즉 상기 기재된 류코렉틴 조성물, 또는 비히클 대조(물)를 12주 동안 얼굴에 적용받았다. 3개 군으로 피험자의 무작위화(randomization)는 미리-결정된 무작위화에 따라 수행되었다.

효능 및 내성 평가

숙련된 임상 평점자는 하기에 나타낸 매개변수에 대해 얼굴의 오른쪽 및 왼쪽 면을 평가하였다. 변형된 그리피스의 채점 등급을 사용하였다 (0=없음, 1-3=가벼운, 4-6=중간 및 7-9=심각한). 피부 상태를 더 잘 기재할 필요가 있는 경우, 반점(Half points)을 사용하였다.

- 잔주름

- 주름

- 과착색

- 느슨함

- 윤기 없는(Dull)/무광택(Matte) (투명성(Clarity))

- 촉각 거칠기

숙련된 임상 평점자는 하기에 나타낸 매개변수에 대해 얼굴의 오른쪽 및 왼쪽 면을 평가하였다. 4점 채점 등급을 사용하였다 (0=없음, 2=가벼운, 3=중간 및 4=심각한). 피부 상태를 더 잘 기재할 필요가 있는 경우, 반점을 사용하였다.

- 홍반

- 건조/스케일링

- 화상/쏘는(stinging) 느낌

- 가려움

- 당김/건조 느낌

디지털 VISIA CR 사진( Digital VISIA CR Photography )

얼굴의 오른쪽 및 왼쪽 면의 VISIA-CR 영상을 얻었다. 피험자는 이들의 모발을 끌어올리고, 보석을 제거하고, 눈을 감고, 틀 내에 중심에 서서 중립적 얼굴 표정을 짓고 영상화하였다.

경피수분손실( Transepidermal Water Loss , TEWL )

기기의 사용 측정 전에, 피험자는 적어도 20분 동안 병원의 주위 환경과 평형을 유지하였다. 주위 환경은 연구 방문 동안 한 시간마다 기록하였다. 이 시간 동안 피험자는 등급을 매기고, 설문지를 완성하고 및/또는 VISIA CR 영상을 수행하였다.

피부수분측정기(Tewameter)를 사용하여 모든 방문 시 경피수분손실(TEWL)을 측정하였다. 눈의 모퉁이(corner)로부터 아래로 그리고 코의 바닥을 가로질러 수평으로 확장하는 선의 교차지점에서 오른쪽 및 왼쪽 뺨에서 측정하였다.

피부수분측정기는 개방 챔버 시스템을 이용하여 TEWL을 측정한다. 표면의 상기 두 지점에서 상대 습도로 표본된 피부 표면에 손을 놓고 탐침을 유지하여, 측정된 습도 구배(humidity gradient)로부터 수분 손실율을 계산하였다.

피부탄력측정기( Cutometer ) MPA 580

모든 피험자는 모든 방문 시 피부탄력측정기로 측정하였다. 피부탄력측정기를 사용하여 피부의 점탄성 특성 (즉, 팽창성(extensibility) 및 탄력성)을 평가하였다. 기기를 피부의 조그만 면적에 진공 적용하고, 광학 기술에 의해 피부의 탄성 반응 (구멍의 안과 밖으로 피부의 이동)을 측정한다.

이 연구를 위해, 2mm 탐침을 사용하였고, 300 mbar의 진공을 적용하였으며, 흡입(suction) 및 방출의 2 주기를 수행하였다. 주기 시간은 5초 켜고 10초 껐다.

눈의 모퉁이로부터 아래로 그리고 코의 바닥을 가로질러 수평으로 확장하는 선의 교차지점 또는 턱 근처의 교대 위치에서 오른쪽 및 왼쪽 뺨에서 측정하였다.

피부 평가 및 자체-평가 설문지( Skin Assessment and Self - Assessment Questionnaires )

피험자는 피험자가 이들의 얼굴 피부 외모 및 얼굴의 오른쪽 및 왼쪽 면에서의 상태를 어떻게 인지하는지를 기재하는 문제를 함유하는 피부 자체 평가 설문지를 완성하였다.

결과

잔주름

2주에, 하나의 활성 성분을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 잔주름의 감소를 나타내었다 (예를 들어, 위약 (4.58%)과 비교하여 5.59% (1% 용액) 및 5.65% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 잔주름의 감소는 6주 (예를 들어, 14.34% (1% 용액), 14.86% (3% 용액) 및 8.98% (위약)) 및 12주 (예를 들어, 23.43% (1% 용액), 25.99% (3% 용액) 및 14.68% (위약))에 계속되었다. 도 1 및 2는 잔주름의 28% 감소를 가진 피험자를 나타낸다.

주름

2주에, 하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 주름의 감소를 나타내었다 (예를 들어, 위약 (0.70%)과 비교하여 2.15% (1% 용액) 및 1.75% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 주름의 감소는 6주 (예를 들어, 6.13% (1% 용액), 7.32% (3% 용액) 및 3.70% (위약)) 및 12주 (예를 들어, 14.72% (1% 용액), 15.15% (3% 용액) 및 9.57% (위약))에 계속되었다. 도 1은 주름의 12.5% 감소를 가진 피험자를 나타낸다. 도 3은 주름의 26.32% 감소를 가진 피험자를 나타낸다.

과착색

2주에, 하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 과착색의 감소를 나타내었다 (예를 들어, 위약 (0.40%)과 비교하여 2.11% (1% 용액) 및 2.68% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 과착색의 감소는 6주 (예를 들어, 5.61% (1% 용액), 7.91% (3% 용액) 및 3.16% (위약)) 및 12주 (예를 들어, 10.53% (1% 용액), 15.35% (3% 용액) 및 5.73% (위약))에 계속되었다. 도 1은 12주 후 검버섯의 착색의 15% 감소를 가진 피험자를 나타낸다.

느슨함

2주에, 하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 느슨함의 감소를 나타내었다 (예를 들어, 위약 (0.87%)과 비교하여 2.64% (1% 용액) 및 1.62% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 느슨함의 감소는 6주 (예를 들어, 6.33% (1% 용액), 6.61% (3% 용액) 및 2.51% (위약)) 및 12주 (예를 들어, 10.55% (1% 용액), 11.33% (3% 용액) 및 5.18% (위약))에 계속되었다. 도 1은 12주 후 느슨함(늘어짐)의 7.69% 감소를 가진 피험자를 나타낸다.

윤기 없는/ 무광택 (투명성)

2주에, 하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 피부 투명성의 개선을 나타내었다 (예를 들어, 위약 (10.67%)과 비교하여 12.95% (1% 용액) 및 16.00% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 개선은 6주 (예를 들어, 29.26% (1% 용액), 28.50% (3% 용액) 및 19.07% (위약)) 및 12주 (예를 들어, 37.17% (1% 용액), 39.18% (3% 용액) 및 26.72% (위약))에 계속되었다. 도 1은 윤기 없음의 33.33% 감소를 가진 피험자를 나타낸다.

촉각 거칠기

2주에, 하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 피부의 촉각 거칠기의 감소를 나타내었다 (예를 들어, 위약 (13.38%)과 비교하여 16.51% (1% 용액) 및 20.24% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 개선은 6주에 계속되었으나 (예를 들어, 24.77% (1% 용액), 26.65% (3% 용액) 및 16.79% (위약)), 12주에 추가 감소는 없었다 (예를 들어, 26.61% (1% 용액), 29.19% (3% 용액) 및 15.79% (위약)). 도 1은 촉각 거칠기의 12.5% 감소를 가진 피험자를 나타낸다.

건조/스케일링

2주에, 하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 피부의 건조/스케일링의 감소를 나타내었다 (예를 들어, 위약 (64.71%)과 비교하여 72.09% (1% 용액) 및 100.00% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 그러나, 위약과 비교하였을 때, 6주 (예를 들어, 86.05% (1% 용액), 84.62% (3% 용액) 및 100.00% (위약)), 및 12주 (예를 들어, 90.70% (1% 용액), 100.00% (3% 용액) 및 89.47% (위약))에 추가 감소는 없었다.

TEWL

하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 2주에 TEWL의 감소를 나타내었으나, 이것은 위약과 명백하게 차이가 나지 않았다 (예를 들어, 위약 (17.26%)과 비교하여 15.35% (1% 용액) 및 14.53% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 그러나, 6주 (예를 들어, 29.46% (1% 용액), 26.66% (3% 용액) 및 22.96% (위약)), 및 12주 (예를 들어, 37.46% (1% 용액), 40.04% (3% 용액) 및 34.21% (위약))에 위약의 것보다 더 큰 감소가 있었다.

팽창성

하나의 활성 조성물을 포함하는 스킨 로션으로 처리된 피험자는 2주에 피부의 팽창성의 개선을 나타내었으나, 이것은 위약과 단지 약간의 차이가 있었다 (예를 들어, 위약 (10.82%)과 비교하여 16.18% (1% 용액) 및 17.21% (3% 용액)의 퍼센트 변화). 6주에 3개의 처리 사이에 명백한 차이는 없었으나 (예를 들어, 18.04% (1% 용액), 17.18% (3% 용액) 및 19.90% (위약)), 12주에 활성 성분을 포함하는 조성물로 처리한 피부에 대해 추가 개선이 있었고, 이는 위약의 것보다 더 컸다 (예를 들어, 31.84% (1% 용액), 33.57% (3% 용액) 및 16.48% (위약)).

연구의 시작 (기준) 및 처리의 12주 후에 수행된 얼굴의 양쪽 면에 촉각/시각 임상 증상의 등급(tactile/visual clinical grading)의 비교는, 모든 피험자가 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 처리한 후 이들의 피부의 윤기 없음 및 거칠기의 개선을 나타내었고, 대부분의 피험자는 잔주름 (피험자의 97%), 주름 (피험자의 91%), 과착색 (피험자의 87%) 및 늘어짐 (피험자의 80%)의 개선을 나타내었음을 보여준다 (도 4).

설문지는 6주 사용으로부터 위약 및 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물 사이에서 전체 외모, 전체 느낌, 매끄러움, 부드러움, 투명성 및 탄력성에 관한 보고서의 평균 점수에 대해 통계적으로 유의한 차이를 확인하였음을 나타낸다.

따라서, 상기 결과로부터 류코렉틴을 포함하는 조성물이 위약과 비교하여 노화된 피부의 각 측면에 대한 효과를 입증하였음이 명백하다.

실시예 4: 류코렉틴 함유 조성물의 대안적 제조방법

류코렉틴 함유 조성물의 대안적 제조방법의 초기 단계는 실시예 1에 기재된 단계와 동일하다. 그러나, 대안적 제조방법은 부화액을 7 ㎛ 공극 크기를 가진 표준 여과기를 이용하여 여과하여, 이후 여과 단계에서 여과기를 막을 것 같은 물질을 제거한 후 실시예 1의 방법으로부터 나뉜다. 대안적인 방법에서, 공정처리된 부화액인 이 여과액을 제조자의 사용설명서에 따라 디에틸아미노에틸(DEAE) 이온 교환 컬럼에 로딩하고, 20mM Tris HCl (pH 8.50)의 용액으로 세척하였다. 통과액은 버렸다. 류코렉틴 단백질을 50mM NaCl을 함유하는 세척 용액으로 컬럼으로부터 용출하였다. 용출액을 모은 다음 8kDa의 배제 크기 여과기로 희석여과하여 부화액의 물을 완충액으로 교환하였다. 이 경우, 비록 다른 완충액이 동등하게 적합할지라도, 완충액은 인산염 완충 식염수였다. 예를 들어, 0.5mM 인산염 및 1mM NaCl을 함유하는 완충액 또는 5 mM NaCl을 함유하는 중성 또는 약간 알칼리성 (pH 7.5 - 8.5) 근처의 pH에서 밀리몰(millimolar) Tris (e.g. 10 mM)를 함유하는 완충액이 적합하다. 희석 여과 단계로부터 잔류액을 모으고 완충액을 첨가하여 희석하였다.

마지막으로, 여과액을 0.22 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 통해 여과하고, 최종 여과액을 모았다. 이 여과액은 부화액으로부터 펩티드가 없거나 또는 단지 미량만 포함하는 류코렉틴이 매우 풍부한 제제이다.

실시예 5: 노화된 피부에 대한 류코렉틴 조성물의 in vivo 효과

연구의 목적

이러한 이중 맹검 스킨 케어 연구의 목적은 처리되지 않은 상태와 비교하여 실시예 4의 3%의 류코렉틴 제제를 함유하는 젤과 함께 3주 처리 처방 계획 후 팔뚝 (forearms)에서 피부 수분량 및 경피수분손실(TEWL)에 관한 변화를 평가하기 위한 것이었다. 또한, 손 위에 검버섯의 착색(멜라닌 함량) 및 선택된 눈 주름의 용량에 대한 류코렉틴의 영향은 처리되지 않은 상태와 비교하여 분석하였다.

물질 및 방법

측정 시점에서 변형과 함께 2003년 1월 29일로부터의 SOP "Hautpflege-Prufung Standard" 버전 4에 따라 연구를 수행하였다.

4명의 여성 피험자에 대해 이중 맹검으로 연구를 수행하였다. 피험자는 팔뚝에 건조 피부 (기준 보습력측정결과(corneometry) 값 <20), 측면 안각(lateral canthus)에서 눈 주름 및 양쪽 손 위에 검버섯을 가짐으로써 연구에 참가자격이 있다. 4명의 피험자 모두 올바르고 완전하게 연구를 마쳤다. 4명의 피험자 모두의 결과는 자료 분석에 포함되었다. 4명의 피험자는 56.3 및 70.9세 사이의 연령이었다 (평균 64.3 ± 6.3세).

피부 수분량 및 경피수분손실(TEWL)을 분석하기 위한 시험 부위는 양쪽 팔뚝이었다. 팔뚝 위에 4개의 시험 부위, 즉 각 팔뚝의 내부에 2개가 있었다. 2개의 부위는 류코렉틴 제제를 포함하는 젤로 처리하였고, 하나는 글리세린 (대조)으로 처리하였으며, 4번째는 처리하지 않고 두었다. 시험 부위에 처리의 할당은 교환되었다.

눈 주름 측정을 위한 시험 부위는 오른쪽 및 왼쪽 눈 (측면 안각) 주위의 주름 부위였다. 한쪽 면은 류코렉틴 제제를 포함하는 젤로 처리한 반면, 무작위화에 따라, 다른쪽 면은 처리하지 않고 두었다.

류코렉틴 제제를 포함하는 젤이 착색에 미치는 영향은 각 손 위의 하나의 선택된 검버섯에 대하여 분석되었다. 또한, 한쪽 손은 등 위에 젤로 처리하였고, 무작위화에 따라, 다른쪽 손은 처리하지 않고 두었다.

측정 및 처리의 시작 전에, 7일의 전처리 기간(preconditioning period)이 있었다. 이 기간 내 및 연구의 전체 기간 동안 스킨 케어 제품, 자외선 차단제 제품, 오일 또는 보습 피부 클렌징 제품, 및 피부병 치료제의 사용은 팔뚝, 양쪽 눈의 측면 안각 및 양쪽 손의 등에 허용되지 않았다. 또한, 자외선(UV light) (햇빛 또는 일광욕실(solarium))에 시험 부위를 집중적으로 노출시키는 것이 금지되었다. 기관에서 연구 기간 동안, 화장의 사용이 금지되었다.

처리는 3주의 기간 동안 집에서 피험자에 의해 하루에 2번 수행되었다. 상응하는 팔뚝 시험 부위에 약 2 mg/cm²의 양으로 제품을 적용하였다 (무작위화에 따라, 한쪽 시험 부위는 처리하지 않고 두었으며, 다른쪽 시험 부위는 대조로서 글세린으로 처리하였다). 또한, 류코렉틴 제제를 포함하는 젤을 얼굴의 한쪽 면의 측면 안각 및 한쪽 손의 등 (왼쪽 또는 오른쪽 - 무작위화에 따라)에 적용하였으며, 다른쪽 면은 처리하지 않고 두었다.

첫 번째 제품 적용의 시작 전 (t0) 및 처리의 3주 후 (t1)에 하기 매개변수를 측정하였다: 팔뚝 위의 피부 수분량 (수분측정기(Corneometer) CM825® 10 반복 측정); 팔뚝 위의 경피수분손실 (TEWL, DermaLab®, 3 반복 측정); 손등 위의 검버섯의 착색 (Siascope®, 1 측정, 멜라닌 함량); 및 3D in vivo 피부 측정 시스템 PRIMOS® Pico를 이용하여 측면 안각에서 하나의 선택된 눈 주름의 용량의 in vivo 측정 (3 반복 측정, 생성된 고 해상도 영상에 의해 계산된 mm³의 주름 용량).

올바른 제품 적용에 관한 피험자의 준수는 한 주의 제품 처리 후에 조사하였다.

피험자가 적어도 30분 동안 이러한 실내 기후 조건에 대해 이의 노출된 시험 부위와 함께 적응된 후, 모든 측정은 21.5℃ (± 1℃) 및 50% (± 5%) 상대 습도의 기후 통제실에서 수행되었다. t1 시점에서 측정 및 처리는 마지막 제품 처리 후 10-20 시간 발생하였다.

탈락자( Drop Outs )

탈락자는 없었다.

불편한 유해 피부 반응( Discomfort Adverse Skin Reactions )

불편한 유해 반응이 없었다.

결과

3% v/v의 류코렉틴 제제를 포함하는 젤로 처리된 피부는 하루에 2번 제품 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 상태와 비교하여 약 23%의 4명의 피험자에 대한 평균으로 피부 수분량의 증가를 나타내었다 (도 5).

젤로 처리된 피부는 하루에 2번 제품 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 시험 부위와 비교하여 약 14.5%의 4명의 피험자에 대한 평균으로 경피수분손실 (피부 장벽 기능의 개선)의 증가를 나타내었다 (도 6).

젤로 처리된 피부는 하루에 2번 제품 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 시험 부위와 비교하여 약 23%의 눈 주름 용량의 감소를 나타내었다 (도 7).

젤로 처리된 피부는 하루에 2번 처리하고 3주 후에 처리되지 않은 시험 부위와 비교하여 약 10.0%의 4명의 피험자에 대한 평균으로 착색 (멜라닌 함량)의 감소를 나타내었다 (도 8).

서열:

1. 연어 배아로부터 류코렉틴 폴리펩티드:

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH

2. 연어 백혈구로부터 류코렉틴 폴리펩티드:

SIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLPKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH

3. 연어로부터 류코렉틴-2 폴리펩티드:

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGNQFVVGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTMVCTH

4. 연어로부터 류코렉틴-3 폴리펩티드:

MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVYKSAVTMVCTH

<110> Aqua Bio Technology ASA <120> Methods for the production of a cosmetic composition comprising leukolectin and uses thereof <130> PIA01985EP <150> GB1110777.8 <151> 2011-06-24 <150> PCT/EP 2012/062252 <151> 2012-06-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 1 Met Arg Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 2 Ser Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn 20 25 30 Lys Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala 35 40 45 Ala Gly Leu Pro Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val 50 55 60 Gly Ala Asn Met Asp Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr 65 70 75 80 Val Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro 85 90 95 Gly Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val 100 105 110 Asn Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln 115 120 125 Asn Asn Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val 130 135 140 Ala Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr 145 150 155 160 Thr Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser 165 170 175 Asn Ile Pro Met Cys Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly 180 185 190 Arg Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 195 200 205 <210> 3 <211> 255 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 3 Met Arg Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asn Gln Phe Val Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asp Asp Thr Pro Phe Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly His Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Phe Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Asn Gly Trp Ser His Ile Asp Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Gly Gly Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255 <210> 4 <211> 255 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 4 Met Gly Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Tyr Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255

Claims (26)

1. 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는, 포유동물의 노화된 피부 또는 흉터가 있는 피부(scarred skin)의 미용 외모를 개선시키기 위한 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 얻거나 또는 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물:
   a) 최소량의 물에 연어 알류(eggs)를 현탁하는 단계;
   b) 상기 알류의 동시에 일어나고 빠른 부화를 유도하는 단계;
   c) 부화된 알류를 여과하여 부화액을 얻는 단계; 및
   d) 부화액을 여과하여 조성물을 얻는 단계로서, 상기 부화액을 여과하는 단계는 적어도 다음의 단계를 포함한다:
   (i) 적어도 5 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 부화액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계;
   (ii) 0.30-0.60 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (i)의 여과액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계;
   (iii) 단계 (ii)의 여과액 내 물을 약학적으로 허용가능한 완충액으로 교환하는 단계;
   (iv) 적어도 80kDa의 배제 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iii)으로부터 얻어진 용액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계; 및
   (v) 0.15-0.30 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iv)의 여과액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계를 포함하며, 상기 여과액은 상기 조성물을 제공한다.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 알류의 부화가 95% 이상의 배아에 대해 2시간 미만 내에 완료되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 얻거나 또는 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물:
   a') 최소량의 물에 연어 알류를 현탁하는 단계;
   b') 상기 알류의 동시에 일어나고 빠른 부화를 유도하는 단계;
   c') 부화된 알류를 여과하여 부화액을 얻는 단계; 및
   d') 부화액을 여과하여 조성물을 얻는 단계로, 상기 부화액을 여과하는 단계는 적어도 다음의 단계를 포함한다:
   (i') 적어도 5 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 부화액을 여과하는 단계;
   (ii') 단계 (i')의 여과액을 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 모으는 단계;
   (iii') 단계 (ii')의 용출액 내 물을 약학적으로 허용가능한 완충액으로 교환하는 단계; 및
   (iv') 0.15-0.30 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iii')로부터 얻어진 용액을 여과하고 여과액을 모으는 단계로, 상기 여과액은 상기 조성물을 제공한다.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 알류의 부화가 95% 이상의 배아에 대해 2시간 미만 내에 완료되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 4항에 있어서, 0.30-0.60 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (i')의 여과액을 여과하고 여과액을 모으는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 4항에 있어서, 단계 (ii')는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
   (a) 이온 교환 컬럼에 여과액을 로딩하는 단계;
   (b) 20mM Tris-HCl, pH 8.5를 포함하는 세척 용액으로 컬럼을 세척하는 단계;
   (c) 용출 완충액 또는 용매를 이용하여 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용출하는 단계; 및
   (d) 단계 (c)의 용출액을 모으는 단계.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 이온 교환 컬럼이 DEAE (디에틸아미노에틸) 컬럼인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 7항에 있어서, 상기 용출 완충액이 50mM NaCl을 더 함유하는 세척 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 2항에 있어서,
    a) 단계 (i)에서 여과기의 공극 크기는 5-15 ㎛이고;
    b) 단계 (ii)에서 여과기의 공극 크기는 0.35-0.55 ㎛이며;
    c) 단계 (iv)에서 여과기의 배제 크기 80-120kDa이며; 및/또는
    d) 단계 (v)에서 여과기의 공극 크기는 0.22 ㎛인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 4항에 있어서,
    a) 단계 (i')에서 여과기의 공극 크기는 5-15 ㎛이며; 및/또는
    b) 단계 (iv')에서 여과기의 공극 크기는 0.22 ㎛인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 6항에 있어서, 상기 0.30-0.60 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기의 공극 크기는 0.35-0.55 ㎛인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제 2항에 있어서, 단계 (iii)은 희석여과를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 제 4항에 있어서, 단계 (iii')는 희석여과를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
15. 삭제
16. 제 1항에 있어서, 상기 개선은 주름, 잔주름, 과착색, 느슨함, 건조 피부, 스케일링 피부 및/또는 경피수분손실의 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
17. 제 1항에 있어서, 상기 동물에서 피부의 미용 외모의 개선은 흉터의 미용 외모의 개선을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
18. 제 17항에 있어서, 흉터는 상처 또는 선(striae)의 결과인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
19. 제 17항에 있어서, 흉터는 여드름 흉터인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
20. 제 18항에 있어서, 선은 위축선(striae atrophicae), 피부 파열선(striae vergetures), 튼살(striae distensae), 피부 열선(striae cutis distensae), 임신선(striae gravidarum), 리네아 아트로피카(lineae atrophicae) 또는 리네아 알비칸테(linea albicante)인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
21. 제 17항에 있어서, 흉터는 피부 치유의 확산 또는 성숙 단계인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
22. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부에 국소 투여용인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
23. 제 1항의 조성물에서, 상기 조성물은 제품, 물질 또는 장치 위에 코팅, 주입 또는 화학 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
24. 다음의 단계를 포함하는, 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 조성물을 제조하는 방법:
    a) 최소량의 물에 연어 알류를 현탁하는 단계;
    b) 상기 알류의 동시에 일어나고 빠른 부화를 유도하는 단계;
    c) 부화된 알류를 여과하여 부화액을 얻는 단계; 및
    d) 부화액을 여과하여 조성물을 얻는 단계로서, 상기 부화액을 여과하는 단계는 다음의 단계를 포함한다:
    (i) 적어도 5 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 부화액을 여과하고, 여과액을 모으는 단계;
    (ii) 단계 (i)로부터의 여액에 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계로서 다음의 단계를 포함한다:
    (A) DEAE (디에틸아미노에틸) 컬럼에 여과액을 로딩하는 단계;
    (B) 10-50mM Tris-HCI, pH 7-9를 포함하는 세척 용액으로 컬럼을 세척하는 단계;
    (C) 10-500mM NaCl 또는 KCl을 더 함유하는 세척 용액을 포함하는 용출 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용출하는 단계; 및
    (D) 단계 (C) 로부터 용출액을 모으는 단계,
    (iii) 단계 (ii)의 여과액 내 물을 약학적으로 허용가능한 완충액으로 교환하는 단계;
    (iv) 0.15-0.30 ㎛의 공극 크기를 가진 여과기를 이용하여 단계 (iii)으로 부터 얻은 용액을 여과하고 여과액을 모으는 단계를 포함하며, 상기 여과액은 상기 조성물을 제공한다.
    
25. 제 24항에 있어서, 상기 알류의 부화가 95% 이상의 배아에 대해 2시간 미만 내에 완료되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
26. 삭제

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